JPS60260522A - 遺伝子組換体が生産する生理活性物質の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子組換体よシ生産され、下記性質を有す
る生理活性物質の安定化法、詳しくは保存時、分離精製
、凍結乾燥などの操作を行なう際の遺伝子組換体が生産
する該生理活性物質の安定化法に関するものである。

本文記載の方法にニジ測定する場合、Ｔ、−Ｍ細胞に対
し２て細胞障害活性を有する。また、本文記載の方法に
よｌ）　Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植し
たＢＡＬＢ　／ｃマウスに投与した場合、その腫瘍部位
に出血性壊死反応を起こさせる。

本発明における生理活性物質とは、遺伝子組換体よシ得
られる蛋白質であって、後述のようにＬ−Ｍ細胞に対し
て細胞障害活性を有し、マウスＭｅｔｈ　Ａ　Ｓａｒｃ
ｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ　／　ｃマウスに投与
した場合、腫瘍部位に出血性の壊死反応を起こさせる性
質を有する。また、上記の性質の外に、１’＋　ｖｉｔ
ｒｏで正常細胞にはほとんど有害な作用をおよほさない
という特徴をもつ。さらに、本文中で示されるように該
生理活性物質は、ヒト遺伝子に由来するものである。詳
しくはウツギの腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと略す。）の
アミノ酸配列構造をもとにヒト染色体遺伝子よシ、通常
の遺伝子組換操作の手法を使って取り出したＤＮＡを用
いて、人工的に新規のＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを組み
込んで作成した遺伝子組換体よシ産生される蛋白質であ
る。

ヒトＴＮＦ様物質と考えられる該生理活性物質は、本来
ヒトが備えている蛋白質であ々ことから考えて、安全性
があシ効果も高い制癌剤として期待のもてる物質である
。

従来から、遺伝子組換体が生産する目的の蛋白質を分離
精製するには種々の困難があることが知られている。特
に該生理活性物質を制ガン剤として広く安全に使用する
ためには、分離精製することが重要である。また溶液あ
るいは凍結状態で長期保存したり、凍結乾燥を行なうこ
とは、該生理活性物質を大量に工業的に製造する際に必
須の操作である。とζろが本発明者らは、高純度の骸生
理活性物質溶液を保存したり、凍結あるいは凍結乾燥を
行なうと、活性が著しく低下することを見いだした。一
方、抗腫瘍性蛋白質の安定化についての報告は特開昭５
８−１７４３３０　、５９−２０２２５　、５９−３９
８２９　、５９−５９６２５などがあるが、遺伝子組換
体が生産する抗腫瘍性蛋白質の安定性および安定化につ
いて検討した報告はない。このような現状では、その制
ガン効果にもかかわらず、高純度にもかか゛わらず、高
純度の該生理活性物質を効率よく安定的に工業的規模で
提供することは不可能である。

本発明者らは、該生理活性物質の安定化のために鋭意研
究を重ねた結果、アルブミンまたはゼラチンを添加する
と長期保存しても、また分離精製、凍結乾燥などの操作
を行なっても、該生理活性物質の活性が保持されること
を見いだした。本発明は、この知見に基づくものである
。

本発明は、遺伝子組換体よシ生産され、下記性質を有す
る生理活性物質に、アルブミンまたはゼラチンを添加す
ることを特徴とする該生理活性物質の安定化法である。

本文記載の方法によシ測定する場合、Ｌ−Ｍ細胞に対し
て細胞障害活性を有する。ま九、本文記載の方法によｐ
　Ｍａｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに投与した場合、その腫瘍部位に出血性
壊死反応を起こさせる。

本発明に用いられる生理活性物質は少なくとも下記のア
ミノ散配列を含む蛋白質である。

Ｓｅｒ　８ｅｒ　８ｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　８
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＶａｌＡｌａ　Ｈｉｓ
　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　
Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｒ
ｐ　Ｌａｕ　Ａａｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ
　ＡｌａＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＡｓｎＧｉｎ
　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　８ｅｒ　Ｇｌｕ　
Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕｉｌｅ　Ｔｙｒ　８ｅ
ｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｇｉｎ　ＧｌｙＯｙ＊　Ｐｒｏ　８ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｈ
ｉｓ　ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈ
ｒＩＩｓ　８ｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　
８ｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　ＬｙｓｖａＩ　Ａｓ
ｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　８ｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ
　８ｅｒ　Ｐｒｏ　０ｙｓＧＩＧ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔ７ｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　
ＩＩｓ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＶａｌＰｈ
ｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＧｌｙ　Ａｓｐ　
Ａｒｇ　Ｌｅｕ　８ｅｒ　Ａｌａσｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓ
ｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ
　Ｐｈｅ　ＡｌａＧｌｕ　８ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇ鳳ｎ　Ｖ
ａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｌ
ａＬｅｕ なお、上記配列は下記の略号のＬ−アミノ酸からなり、
配列の左から右への方向はＮ末端から。

末端への方向を示すものである。

Ｏｙｓ：ｉティン残基 Ｇｌｎ：グルタミン残基 ＡＳＰ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏ　：ゾロリン残基 Ｔｙｒ　：チロシン残基 Ｖａｌ　：ノ々リン、残基 Ｉ、ｙｓ　：リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 ＡＳｎ　：アスパラギン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 ｐｈｅ　：　フェニルアラニン残基 Ｇｌｙニゲリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 ８ｅｒ　：セリン残基 Ｔｈｒ　：スレオニン残基 １１ｅ　：イソロイシン残基 Ｔｒｐ　：　）リゾトファン残基 Ａｒｇ　：アルギニン残基 本発明に用いられる遺伝子組換体は少なくとも下記のＤ
ＮＡ配列を含むものである。

ＴＯＡ　ＴＯＴ　ＴＯＴ　ＯＧＡ　ＡＯＯＯＯＧ　ＡＧ
Ｔ　ＧＡＯＡＡＧ　ＯＯＴ　ＧＴＡＧＯＯＯＡＴ　ＧＴ
Ｔ　ＧＴＡ　ＧＯＡ　ＡＡＯＯＯＴ　ＯＡＡ　ＧＯＴ　
ＧＡＧ　ＧＧＧＯＡＧ　ＯＴＯＯＡＧ　ＴＧＧ　ＯＴＧ
　ＡＡＯＯＧＯＯＧＧ　０００　ＡＡＴ　ＧＯＯＯＴＯ
ＯＴＧ　Ｇｏｏ　ＡＡＴ　ＧＧＯＧＴＧ　ＧＡＧ　ＯＴ
Ｇ　ＡＧＡ　ＯＡＴ　ＡＡＯＯＡＧ　ＯＴＧ　ＧＴＧ　
ＧＴＧ　ＯＯＡ　ＴＯＡ　ＧＡＧ　ＧＧＯＯＴＧ　ＴＡ
Ｏ０ＴＯＡＴＯＴＡＯＴｏｏ　ＯＡＧ　ＧＴＯＯＴＯＴ
ＴＯＡＡＧ　ＧＧＯＯ人ＡＧＧＯＴＧＧ　Ｃｏｏ　ＴＯ
ＯＡＯＯＯＡＴ　ＧＴＧ　ＯＴＯＣＴＣＡＯＯＯＡＯＡ
ＯＯＡＴＧ　ＡＧＯＯＧＯＡＴＯＧｏｏ　ＧＴＯＴｏｏ
　ＴＡＯＯＡＧ　ＡＯＯＡＡＧＧＴＯＡＡＯＯＴＯＯＴ
ＯＴＯＴ　Ｇｏｏ　ＡＴＯＡＡＧ　ＡＧＯ０００ＴＧＯ
ＯＡＧ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＯＯＯＯＡ　ＧＡＧ　ＧＧ
Ｇ　ＧＯＴ　ＧＡＧ　ＧＯＯＡＡＧｏｏｏ　ＴＧＧ　Ｔ
ＡＴ　ＧＡＧ　ｐｏ　ＡＴＯＴＡＴ　ＯＴＧ　ＧＧＡ　
ＧＧＧ　ＧＴＯＴＴＯＯＡＧ　ＯＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ
　ＧＧ’Ｉ’　ＧＡＯＯＧＡ　ＯＴＯＡＧＯＧＯＴＧＡ
Ｇ　ＡＴＯＡＡＴ　ＯＧＧ　００（３ＧＡＯＴＡＴ　Ｃ
ＴＣＧＡＯＴＴＴ　Ｇｏ。

ＧＡＧ　ＴＯＴ　ＧＧＧ　ＯＡＧ　ＧＴＯＴＡＯＴＴＴ
　ＧＧＧ　ＡＴＯＡＴＴ　ＧＯＯ（ＩＴＧ なお、上記ＤＮＡ配列は下記の略号を使用し、配列の左
から右への方向は５′から３′への方向を示すものであ
る。

Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基 ０：２′−デオキシシチジル散残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基 ７　Ｔ″７°′ｖ＠！ｌ！ｉ 次に、該生理活性物質遺伝子のようにして得ることがで
きる。

１、７々クテリオフア一ジλ／ウサギ染色体遺伝子ライ
ブラリーとノセクテリオファージλ／ヒト染色体遺伝子
ライブラリーは、ハーノ々−ド大学生化学および分子生
物学部（７Ｄｉｖｉｎ口ｙ　Ａｖｅａｕｅ　、　Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ　。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　０２１３８　、　Ｕ、　
８．Ａ、　）のＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ教授よシ得るこ
とができる。これらのライブラリーは次の方法によって
作ることができる。（Ｃａｌ　Ｉ　＋　１Ｓ　ｅｐ、　
６８７（１９７Ｂ）参照〕 （１）　ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサギあ
るいはヒトのすい臓、を凍結粉末にし、ＲＮＡの蛋白成
分を分解処理し、沈澱によってウサギあるいはヒトの高
分子ＤＮＡを得る。

（２）　この高分子ＤＮＡは遺伝子座位をランダムに切
るために、部分的に分解する。

（３）得られたＤＮＡ断片から分子量分画によって、１
５から２０キロ塩基対（ｋｂ）の大きさの断片を得る。

（４）得られたＤＮＡ断片をλＱｈａｒｏｎ　３０フア
ージベクターを用いてクローン化する。

（５）　得られたベクターを、ｒＤＮＡを含む感染性の
ファージ粒子にｉｎ　ｖｉｔｒｏで組み入れ、上記のウ
サギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリーを得る。

龜　参考例１で得られたウサギＴＮＦのｃＤＮＡは、ｐ
、Ｗ、Ｊ、　Ｒｉｇｂｙ　ラのニックトランスレーショ
ン法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１３　、　ｐ、
　２３７（１９７７）参照〕によッテ、Ｓａｐでラベル
化する。

３、　バクテリオファージス／ウサギ染色体遺伝子ライ
ブラリーとノ々クテリオファージλ／ヒト染色体遺伝子
ライブラリーのそれぞれを、ノ々クチリアの均一層の上
に密にプラークができるように植えつけ　１２ｐでう（
ルしたウサギＴＮＦのｃｌ）ＮＡとハイブリダイズさせ
てスクリーニングした。

４、　適当なりローンより、対応するＤＮＡを単離し、
制限酵素地図を作り、８ｏｕｔｈｅｒｎハイゾリダイズ
法（Ｅ、Ｍ、　８ｏｕｔｈｅｒｎ　、　Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、　、　９８　、　ｐ、　５０３（１９５７
）参照〕によって解析する。

ウサギＴＮＦと該生理活性物質の遺伝子を含む制限酵素
地図された断片を、プラスミドベクター中に導入し塩基
配列を解析する。

５、　ウサ＝Ｎ　ＴＮＦのｃＤＮＡとウサギＴＮＦ遺伝
子の塩基配列を比較して、ウサギＴＮＦ遺伝子のエクソ
ン（ウサ−ＪｐＴＮＦのアミノ酸配列をコーＰする塩基
配列）とイントロン（ウサ＝Ｎ　ＴＮＦのアミノ酸配列
をコードしない塩基配列）を決定する。

６、　そして、ウサｄＰＴＮＦ遺伝子と該生理活性物質
の遺伝子を比較して、該生理活性物質のエクソンとイン
トロンを決定する。

７、　ウサギＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除しエクソ
ンを結合することによって得られた塩基配列よシ決めら
れるウサギＴＮＦのアミノ酸配列は、ウサ４　ＴＮＦの
ｅＤＮＡの塩基配列よシ決められる同アミノ酸配列と一
致することで確認される。

８、　次に、該生理活性物質遺伝子のイントロンを削除
しエクソンを結合することによって得られた塩基配列よ
シ該生理活性物質のアミノ酸配列が決められる。該生理
活性物質のアミノ酸配列は、ウサギＴＮＦのアミノ酸配
列と部分的に一致することで確認される。

９、　その後、該生理活性物質をコードするＤＮＡをｉ
ｎマ１ｔｒｏで修飾し、適当な表現ベヒクルに導入し、
そのＤＮＡを含む組換ＤＮＡを作成する。

１０、このようにして得られた該生理活性物ｊＸはその
成熟型で、セリンから始まる１５５個のアミノ酸残基を
持つ。一方、その前記列としてシグナルペプチドを持つ
・ 各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由によシ、アミノ酸配列を変えることなく、
塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成された
人工のＤＮＡに置換えることも可能である。

該生理活性物質はまた、細胞内で未成熟形態（ゾレまた
はプレプロペプチド）で産生された成熟過程（プロセシ
ング）によシ中間体を経由して成熟した該生理活性物質
となることが推定される。

該生理活性物質のこのような未成熟形態は、該生理活性
物質遺伝子の塩基配列から推定することができる。未成
熟形態及び中間体の該生理活性物質をコードする遺伝子
を含む該生理活性物質遺伝子もまた、天然のまたは人工
的ＤＮＡを用いて組換を行うことができる。

これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
人ＴＧ）を成熟おるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ遺
伝子の５′端に導入することである。このようにするこ
とにより、適当なゾロモータによって合成されるｍＲＮ
Ａから成熟あるいは未成熟あるいは中間体の生理活性物
質が産生される。この様にＮ末端に付加されたメチオニ
ン残基は宿生によっては自然に除去される。

また別の形態としては、シグナル配列と呼ばれる疎水性
に富んだ配列を付加することによシ、宿主細胞の外また
はグラム陰性細菌においては、ペリプラズムと呼ばれる
部分へ、分泌させることも可能である。

また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するペプチドと該生理活性物質との融合
ペプチドを形成するが、この場合は化学的または酵素的
に切断するか、もしくは該生理活性物質の主たる活性に
変化がなければ、そのまま用いることができる。

このように得られた該生理活性物質遺伝子を、正しく転
写、翻訳が行われるような配列においてプロモーター等
の５′領域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物
細胞中で複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得
、との組換遺伝子によって細菌または高等生物細胞を形
質転換し、この形質転換体を増殖せしめ、該生理活性物
質遺伝子を発現せしめることにより該生理活性物質を得
ること、ができる。

宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはＥ。

ｃｏｌｌ　Ｋ　１２株の種々の変異株、例えばＨＢ　１
ｏ　１　（ＡＴＯＯ３３６９４）、（３６０ＯＫ　（Ａ
ＴＯｏ　３３９５５）、Ｄｉ２１０、Ｒ，ＲＩ（ＡＴＯ
Ｏ３１３４３）、ＭＯ１０６１、ＬＥ　３９２　（ＡＴ
ＯＯ３３５７２）、ＪＭＩＯＩ　（ＡＴ００３３８７６
）、ＪＭ８３、ＪＭ１０３、：Ｘ１７７６（ＡＴＯＯ３
１２４４）などが用いられる。

大腸菌を宿主とする場合のベクターとしては、ｐＢ几３
２２、ｐＢＦＬ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＵｏ　８　、
ｐＵｏ　９、ｐＭＢ　９　（Ａ、ＴＣＯ３７０１９）、
ｐＪＢ８　（ＡＴ００３７０７４）、ｐＫＣ７（ＡＴＴ
０３７０８４　）等のプラミスドあるいはλｇ’ｓ　λ
Ｂ１シャロン４Ａのようなλファージ、Ｍ１３ファージ
などが用いられる。

大腸菌の菌体中・に該生理活性物質を産生させるために
、大腸菌の遺伝子またはファージ遺伝子のプロモーター
が使用される。このようなプロモーターとして、好適に
はラクトース分解酵素（ＬＡＯ）のプロモーター及びそ
のＵＶ５変異、ペニシリナーゼ（ＢＬＡ）、）リプトフ
ァン合成酵素（Ｔ几Ｐ）のプロモーター、λファー、り
のＰＬプロモーターあるいはトリプトファン合成酵素と
、ラクトース分解酵素　□の融合プロモーターであるＴ
ＡＯプロモーター等が用゛いられる。

枯草菌を宿主とする場合にはＢＤ１７０株（ＡＴＯＯ３
３６０８）、ＢＲ１５１株（ＡＴ００３３６７７）、Ｍ
１１１２株（ＡＴＯ０３３７１２）などが用いられ、ベ
クターとしてはｐ０１９４　（ＡＴ００３γ０３４）、
ｐＵＢｌｌｏ　（ＡＴＯＯ３７０１５）、ｐ８Ａ２１０
０（ＡＴ００３７０１４）、ｐＥ１９４などのプラスミ
ドなどが用いられる。

枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵５１１Ｅ（ＯＡＴ）やベ
ニシリナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロ
モーターが用いられる。

酵母を宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
エ（８ａｃａｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｊｓｅａ
ｅ　）のＲＨ２１８株（ＡＴ００４４０７６）、８ＨＹ
１株（ＡＴＯＯ４４７６９）、５ＨＹ３株（ＡＴ００４
４７７１）、Ｄ１３１Ａ株、４８３株、８３０株などが
用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐ１３（ＡＴＯＯ
３７１１５）、ｙｇｐ　６、ＹＲｐ７、ＹＩｐ５などの
シラスミドが用いられる。

酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ　
）、トリプトファン合成酵素（ＴＲＰ）、ホスホグリセ
レートキナーゼ（ＰＧＫ）、チトクロームＢ　（ＯＯＢ
）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる。

以上のようにして作成した遺伝子組換体微生物を通常の
方法で大量に培養した後、目的とする該生理活性物質を
産生させる。次いで、微生物菌体！　除去後の培養液、
もしくは菌体の破砕抽出液を集め、該生理活性物質原料
を得る。

このようにして生産された該生理活性物質原料は、通常
の生化学的分離精製方法を組合せて分離精製される。そ
のよりなものとして、たとえば、硫酸アンモニウムによ
る塩析法、陰イオン父換樹脂によるイオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過法、電気泳動法などが挙げられる
。これらの方法を組合せて、分離精製工程を進めて精製
度を上げていくと、該生理活性物質は次第に不安定とな
る。たとえば比活性（１■の総蛋白質中に含まれる該生
理活性物質の活性、活性の単位は後述）５０万単位／′
ｍｇまで精製した該生理活性物質試料は、実施例に示す
ように非常に不安定である。比活性がこれより低い該生
理活性物質試料も程度の差はあるが、保存したシ、凍結
、凍結乾燥などの操作により、その活性が低下する。本
発明の対象となるものは、このように精製度が上がり不
安定となった該生理活性物質であシ、溶液および粉末の
いずれでもよいが、特に該生理活性物質を含有する溶液
である。

本発明で用いられる該生理活性物質を含有する溶液のｐ
ｉ（は５〜１０に保たれていることが好ましく、適当な
緩衝液で調整されていることがよシ好ましい。そのよう
な緩衝液としては、たとえば、リン酸緩衝液、トリス〔
トリス（〕・イドロキシメチル）アミノメタン〕−塩酸
緩衝液などが挙げられる。目的によっては塩を加える場
合もある。用いられる塩としては、塩化ナトリウム、塩
化カリウムなどがあり、その濃度は目的によって決定さ
れる。たとえば、注射用として用いる場合には、塩化ナ
トリウムを０．１５Ｍになるように加え等張液とする。

本発明で用いられるアルブミンとしては、たとえば、ウ
シアルブミン、ヒトアルブミンなどがあけられる。いず
れも安定化効果に大差はないが、注射用製剤として用い
る場合には、ヒトアルブミンが好ましい。これらのアル
ブミンは、公知の方法にしたがって精製されたものを使
用する。

本発明で用いられるゼラチンは、公知の方法にしたがっ
て精製されたものを使用し、分子量の範囲は特に限定さ
れないが、なるべく均一な成分であることが好ましい。

アルブミンおよびゼラチンの添加濃度は、該生理活性物
質を含有する溶液１ｄあたり１μｖ以上、よシ好ましく
は１０μｍ以上、さらに好ましくは１００μｍ以上であ
る。添加濃度をさらに大きくしても、安定化効果を増大
させるものではなく、上限は常識的、経済的観点から決
められ、同溶液ＩＭｌあたシ５０■である。なお、該生
理活性物質を含有する粉末に添加する場合の、アルブミ
ンおよびゼラチンの添加量は、同粉末を溶解した際に、
上記の溶液濃度になるように選ばれる。

添加方法は特に限定されないが、たとえば、アルブミン
およびゼラチン粉末を直接該生理活性物質含有溶液に添
加する方法、あらかじめ同粉末を水あるいは適当な緩衝
液に溶解して添加する方法、または同粉末を該生理活性
物質含有粉末と混合せしめて添加する方法があげられる
。添加時期は、分離精製過程であっても、製剤化工程で
あってもよい。

アルブミンおよびゼラチンを共に添加する方法もまた本
発明の方法に含まれる。その場合、両物質の合計量が、
先に述べた添加濃度および量になるように調整すればよ
い。

このようにアルブミンまたは／およびゼラチンを添加し
た該生理活性物質を含有する溶液は、溶液状態のままア
は０〜３０℃、よシ好ましくは０〜１０℃で保存あるい
は分離精製、製剤化操作をすることが好ましい。また、
同溶液を凍結状態で保存する場合は０℃以下、よシ好ま
しくは一２０℃以下とすることが望ましい。本発明にお
けるアルブミンまたは／およびゼラチンを添加した該生
理活性物質を含有する溶液では、溶液状態または凍結状
態での保存中あるいは分離精製、製剤化操作中にも該生
理活性物質の活性は保持される。

まえ、本発明の方法は、凍結乾燥操作に対しても有効で
ある。すなわち、該生理活性物質を含有する溶液を常法
によシ凍結乾燥を行なうと（特に高純度の場合）、その
活性は低下するが、同溶液にアルブミンまたは／および
ゼラチンを添加することによって該生理活性物質の活性
は低下しない。

また、凍結乾燥後にアルブミンまたは／およびゼラチン
を添加してもよい。粉末状態での保存は、室温あるいは
室温以下が好ましい。

本発明によって得られた精製生理活性物質の約３００単
位は、後述のＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ坦癌マウス
を胆癌る生理活性評価において（＋）の活性を示した。

更に、マウ禽結腸癌Ｑｏｌｏｎ２６で胆癌させたＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスに本生理活性物質の精製物を投与した場合
、対象群（生理食塩水投与群）に比して有意の差を持っ
て、癌増殖抑制および退縮効果が認められた。また培養
を３７℃で７２時間で行なう以外は、後述のＬ−Ｍ細胞
に対する細胞障害活性評価と同様な実績方法で、各種ヒ
ト癌細胞に対する活性の評価をおこなった。用いた細胞
は、ＫＢ細胞（鼻咽喉癌）、ＰＣ−８細胞（肺癌）、比
較対照細胞として正常細ｌ！！（ヒト胎児腎細胞、ヒト
胎児包皮細胞）であつ九、その結果、正常細胞には、は
とんど細胞障害活性が認められなかったにもかかわらず
、癌細胞には強い細胞障害活性が認められた。

次に、本発明を実施するにあたって、行なう評、優男法
について以下に詳細を述べる。

１）　ｉｎ　ｖｉｖｏ活性測定（Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａｒ
ｃｏｍａ坦癌マウスを胆癌る活性測定） ｉｎ　ｖｉｖｏ法としては、たとえば、Ｏａｒｓｗｅｌ
ｌ　らの方法、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃｅｄ、　８
ｃｉ、　［１８ム、　７２（１９７５）３６６６があげ
られる。

、本発明者らが用いている方法＃′ｉ、これを改良した
ものであり、移植したＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａに
よる腫瘍を該生理活性物質が壊死させる効果を測定する
ものである。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの下部皮肉
に２Ｘ１０１個のＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を
移植する。

７日後、移植したａｍの大きさが、直！７〜８■となシ
、出血性壊死などがなく良好幸血行状態にあ、るマウス
を選び、尾静脈よル生理食塩水で希釈した０、５　ｄの
該生理活性物質試料を注射し、２４時間後に次の判定基
準によシ判定を行なう。

（−）二変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 、（替）：中程度の出血性壊死（移植ガン表面の真中か
ら５０Ｘ以上にわたって壊死）（＊）：顕著な出血性壊
死（移植ガンの中央部が重度に壊死し、周囲のガン組織 がわずかに残った状態） ２）　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性掬定（Ｉ、−Ｍ、１１Ｂ胞
を用いる活性測定） 臘マＩｒｏ法による該生理−活性物質活性測定は、たと
えは、Ｒｕｆｆ　（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　Ｖｏｌ、
　１１　、　ｅｄ、　ｂｙ　Ｂ。

Ｐｉｃｋ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　
Ｙ、　（１９８Ｇ）２３５　）、あるいａ　（Ｊ、　１
ｍｍｕｎｏ１．、１２６（１９８１）１２７Ｇ　）の方
法があけられる。

本発明者らが用いている方法は、これらを改良　□し九
ものであシ、該生理活性物質がＬ−Ｍ＠胞（アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、００Ｌ１．２）
を殺す効果を測定するものである。

すなわち、順次培地で希釈した該生理活性物質試料０・
１ｄとｉｏｓ個／ｄの濃度のＩ、　−Ｍ細胞の培地ｍ濁
＆０．１ｍを９６穴の組織培養用マイクロプレート（フ
ロー・うＩラトリー社）に加える。培地はＩＯＶ／ＶＸ
のクシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシ
ャル培地（その組　は、たとえは、「組織培養」中井順
之助他編修、物書書店、１９６７年に記載されている）
を用いる。マイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む生
気中、３７℃で４８時間培養する。培養終了後、２０％
グルタルアルデヒド水溶液２０μｔを加え細胞を固定す
る。

固定後、マイクロプレート全洗浄、乾燥して、０．０５
％メチレンブルー溶液を０．１−加え、生き残った細胞
を染色する。余分なメチレンゾル−を洗い流し乾燥した
後、残ったメチレンブルーを３％埴耐酸溶液抽出し、そ
の６６５ｎｍにおける吸光度をタイターデック・マルチ
スキャン（フロー・ラボラトリ−社）で測定する。この
吸光度は、生き残った＃ｌ胸数に比例する６該生理活性
物質試料を加えない対照の吸光度の５０％の像に相当す
る該生理活性物質の希釈率を、グラフあるいは計算によ
ってめ、その希釈率を単位（Ｕ）　／　ｄと建義する。

以下、本発明における該生理活性物質のｉｎ　ｖｉｔｒ
。

う　活性は、参考例１と２を除いては、すべてこの単位
で表示される。

なお、参考例１と２におけるＬ細胞障害活性の測定法は
、上記の方法と次の点で異なる。すなわち、Ｌ−Ｍ細胞
のかわシにＬ−９２９細胞を用いること、培地にＩ　Ｖ
／Ｖ％のウシ胎児血清と５μ？／１ｔｔｌのアクナノマ
イシンＤを含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培
地を用いること、培養時間を４８時間のかわりに２１時
間とすること、が異なる。

本発明の方法によれは、制癌剤として期待される該生理
活性物質を溶液、凍結、凍結乾燥状態での保存や、分離
ａ製、製剤化操作の際にもその活性は保持されるので、
高純度の該生理活性物質を効率よく安定的に工業的規模
で提供することが可能となる。また、安定化剤としてヒ
トアルブミンまたはゼラチンを用いる場合には、人体に
投与しても安全で、該生理活性物質を制癌剤として用い
る際にきわめて有利である。

以下に参考例および実施例によって本発明を詳細に記す
。

本発明の実施にあたり、組換ＤＮＡの作毀、組換体の微
生物への導入は、特に断わらない限シ下記の実験書に従
って実施した。

（１）　高木康敬輌著　遺伝子操作マニュアル、講談社 （２）高木康敬編著　遺伝子操作実験法、ｉｌＩ職社（
３）　Ｔ、　Ｍａｎｌａｔｉｓ　、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔａ
ｃｈ、Ｊ、８ｄｍｂｒｏｏｋ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｌ
ｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　８ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｖ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）（４）　Ｒａｙ　Ｗ
ｕら、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１
０１巻Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（米国）刊参考
例および実施例中で用いられる略号ＭＯＰＩ９　：モル
フオリノゾロパン硫酸ＬＢ培地：ルリアーペルタニ培地 ＤＭ８０　ニジメチルスルフオキシド ＰＦＵ　：　′ｊラーク・フォーミング単位ＥＤＴＡ　
：エチレンジアミン四酢酸 ８Ｄ８　：　ドデシル硫酸ナトリウム ＢＲＩ、　：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−ＤＭＴ
　ニジメトキシトリチル Ｉａｃ　：ラクトース Ｔｒｉｓ　：　）　リス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンＸＡＲ−５：Ｘ線フィルム（イーストマン・コダッ
ク社、米国） ｌｘｓｓａ　：　０．１ＳＭＪＪｌ化ナトリウム＋　０
．ｏｔｓ　Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ２Ｘ８８０　：　０．３０Ｍ塩化ナトリウム＋０．０３
０Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ３Ｘ８８０　：　０．４５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０４
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ５ＸＳ８０　：　０．７５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０７
５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７ ６Ｘ８８０　：　０．９０Ｍ塩化ナトリウＡ＋０．０９
０Ｍクエン酸ナトリクム、ｐＨ７ ＦＤ８８　：　５０％脱イオン化フォルムアミド＋５×
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　＋　５　Ｘ　８８　Ｐｌｉｆ　
＋　０　、１％８Ｄ８　＋　１００μｇ／ｄ変性ウシ胸
ｊＩＩＤＮＡ デンハルト溶液：１１中にフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ　
）　２００■、ポリビニルピロリドン２ＧＧｍ＋９とウ
シ血清アルブミンｚｏｏ　ＷＩｇを含む水溶液 ８８ＰＨ：　０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋１０ｍＭリン
ｗｔ二水素ナトリウム＋１　ｍＭ　ＢＤＴＡ　、ｐＨ７
，４８Ｍ：１１中に塩化ナトリウム５．８ｆ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物２　ｆ　、　ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ
Ｉ　（ｐＨ７，５）５０−と２Ｘセラチン５−を含むフ
ァージ保存培地 ＮＺブロス：１ｆ中ＫＮＺアミン（フムコーシエフィー
ルド・ケミカル・デピイジョン・オブ・クラフト社、米
国）ｉ　ｏ　ｒＸｉ化ナトナトリウム５ｆ酸マグネシウ
ム・７水和物２ｔを含む培地 ＩＰＴＧ：イソプロビルチオガラクトシドｘ　−ｇａｌ
　：　５−ジブロモ−４−クロロ−３−インドリルガラ
クトシド ＴＡＲ：　０．０４Ｍ　Ｔｒｉａ−酢ｒＭ（１）Ｈ８，
０）−０，００２ＭＤＴＡ ｂｐ：塩基対 参考例１ 工程１（ウサギ血清ＴＮＦの取得） 雌ウサギ（体重２．５〜３．０＃）にホルマリンにて死
菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃ
ｎｅｓ　（Ｏｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍｐａｒｖｕ
ｍ　、ウェルカム社、英丙）５０〜を耳静脈より注射し
た。該ウサギに８日後再度１００μｔのエンドトキシン
（大腸菌０２６二Ｂ６由来のりポプリサツカライド、デ
ィフコ社、米国）を耳静脈よシ注射し、２時間後に心臓
より全採血した。採取した血液に１００ｄ当ｐ　１００
単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５．００Ｏｒｐ
ｍで３０分間冷却遠心操作を行ない、血球および不溶固
型物を除去した。

４０羽のウサギより、血清ＴＮＦ３ｘ１０４単位／ｙｔ
ｌの力価を有する血漿２．４１が得られた。

工程２（血清ＴＮｌｉ’の部分精製） 工程１で得た血漿２．４ｔにセライ）２４ＩＰを加え、
１時間攪拌した後濾過した。濾液に１．２ｔの０．０４
Ｍ　）リス−塩酸緩衛液（ｐＨ７，８）を加えた後、０
．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍ　）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，８）で充分に平衡化したＤＩ３ＡＢセ
ファロースＯＩ、−６Ｂ（７アルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムに添加した。０．０４Ｍ　）リス−塩酸緩
衝液で洗滌後、０．１８Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
４Ｍ　）リスー塩峻緩衝液（ｐＨ７，２）を用いて流出
した。Ｌ細胞障害活性を示す画分を、限外濾過により濃
縮した。次いで０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５　ｍ
　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化したセファク
リル８−２００（ファルマシア社、スウェーデン）めカ
ラムに該濃縮液を添加し、同緩衝液にてゲル濾過を行っ
た。活性区分は限外濾過によプ濃縮し３．５×１０ｓ単
位を回収した。蛋白定量に基く比活性は１８×１０・単
位／７１９であった。

工程３（抗ＴＮＦ抗体） 血清よシ得たＴＮＦを工程２の如く部分精製しフロイン
トの完全アジュ／々ンドを１：ｌで混合し１２週令の雄
ＢＡＬＢ１０マウスの背部皮下に注射した。

２週後、及び４週後にこの操作を繰返し、更に１週後に
全採血し、その血清を取得した。

この血清をＬ細胞障害活性を測定する培地中に終濃ＦＩ
ＬＳＯＯ倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得
たＴＮＦのＬ細胞障害活性を測定したところ、Ｌ細胞障
害活性は認められなかった。ここに得たマウス血清は、
ウサギ血清ＴＮＦに対する抗体（抗ＴＮＦ抗体と称する
）を含むものと結論できた。

工程４（ＴＮＦ産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｍ　（Ｏｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ　、ウェルカム社、英
国）を静脈内投与し、７日後に気管切開し、肺を生理食
塩水で洗滌することによシ浮遊性細胞を得た。この細胞
を生理食塩水で洗−後１．１０％牛脂児血清（フロー・
うｆう）　ＩＪ−社、米国）を含むＲＰＭＩ　１５４Ｇ
　（フロー・ラダラトリー社、米国）を培地とし、炭酸
ガス５％含有空気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベー
ターにて、３７℃で培養した。培養器を２コに分け、一
方には大腸菌由来のエンドトキシン（大腸菌０２６：Ｂ
６由来のりポプリサツカライド、ディフコ社、米国）を
１０μｔ／−となるように添加し、一方には同量の滅菌
水を添加した。エンドトキシンを添加した培養上清にＬ
細胞障害活性が出現し７時間で最高値に達した。この活
性は、抗ＴＮＦ抗体で消去されたが、正常マウス血清で
は消去されなかった。

一方、エンドトキシンを添加しなかった細脂培養上清に
はＬ細胞障害活性は認められなかった。

工程５（ＴＮＦの分子量） 工程４における細胞培養においてエンドトキシンと共に
放射性Ｌ−（器Ｓ〕メチオニン（１３０００Ｊ／ｍｍｏ
ｔ、アマージャム社、英国）を１ｍ０ｉ／ｄ　となるよ
うに添加して培養を行った。培養上清を［、ａｅｍｍｌ
ｉの方法（Ｌａｅｍｍ目、　Ｕ、　Ｋ、　（１９７０年
）７’Ｊａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２２７巻６８
０〜６８５頁〕に従ってＳＤ８ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により解析した。ゲル濃度は１２．５％となる
ように調製した。泳動後エンハンスにュー・イングラン
ド・ヌクレアー社、米国）により処理し、乾燥後、Ｘ線
フィルム（フジＲＸ、富士写真フィルム）に密着露光せ
しめｆｃ。

エンドトキシン存在下に培養した培養上清に、分子量約
１７５００の物質の生成が認められた。

また工程４における細胞培養の上清を、上記と同様に８
Ｄ８ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、２．
５％ＮＰ４０（カルビオケム社、米国）で１時間、水中
で２時間振とう後、各泳動レーンを切断分離し、泳動方
向に直角に２鴻巾にスライスした。各スライス断片をＬ
細胞と共に培養するこ督　とにより、Ｌ細胞障害性を調
べた。エンドトキシン存在下に培養上清を展開したレー
ンの分子量約１７５００の位置にＬ細胞障害性が認めら
れ、その他の位置には活性は認められなかった。

工程６　（ｍＲＮＡの取得） 工程４と同様な細胞培養において工／トドキシンを添加
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
滌細胞）を集めた。細胞質ＲＮＡおよびその中からのｍ
ＲＮＡの抽出は下記の如くＯｈｉｒｇｗｉｎらの条件（
Ｏｈｉｒｇｗｉｎ　、　Ｊ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　、　
。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８巻５２９４負（１９７
９年）〕に従って行った６ｍ胞３Ｘ１０’個に対し、４
ｄの４Ｍグアニジンチオシアネート溶液を加え、ホモジ
ナイザー（ＡＭ−７、日本精製製作所）にて破砕した。

残渣を遠心除去後、２．４１の塩化セシウムを溶解し、
あらかじめ２．５−の５．７Ｍ塩化セシウム、０．１Ｍ
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，ｓ）２入れであるポリアロマー
テニープへ静かに重層した。

ベックマン８Ｗ４１０−ター（ベックマン社、米国）を
用いて２０℃３００００回転にて１２時間、超遠心分離
を行った後、上清を除き、ペレットを１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（５ｍＭ　ＥＤＴＡ　％　”％ＳＤＳを含有
する）ｘｄｌｃて溶解した。この溶液を１−のクロロホ
ルム−１−ブタノール（４：１）混液で抽出し、水層に
０．０５溶積の２Ｍ酢酸ナトリウムと、２．５容積のエ
タノールを加え、−２０℃で２時間以上放置してＲＮＡ
を沈澱させた。遠心にて沈澱を集め、乾燥させたのち滅
菌水５００μｔに溶解して、細胞質孔ＮＡ溶液を得た。

上記細胞質ＲＮＡ　ｉ液を６８℃、２分間加熱後急冷し
、５００μｔの２倍濃度の１０ｍＭ）リスＢＤＴＡ緩衝
液ｐＨ７，４（１ｍＭ　ＢＤＴＡ、　０．１％ＢＤＢ及
び０．５Ｍ塩化リチウムを含む）を加え、２００■のオ
リゴ（ｄＴ）−セルロース（ＢＲＬ社、米国）カラムに
展開、１倍濃度の上記ノ々ソファ−１０−で洗浄、溶出
緩衝液（１０ｍＭ　）　’）スー塩酸ｐｉ４７．４　；
　１　ｍＭ　ＥＤ　ＴＡ％　０．”％ＳＤ８を含む）２
ｍｌで溶出した。溶出液に０．０５容積の酢酸ナトリウ
ム、２．５容積のエタノールを加えて一２０℃冷却にて
沈澱せしめた。沈澱を遠心にて集め、再度同様にオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムに吸着する画分を集めた。紫
外吸収スペクトル分析によシ、８５μｔのｍＲＮＡを回
収した。

工程７　（ｍＲＮＡのサイズ分ｍｉ　）工程６と同様に
して得たｍＲＮＡ８８０μｍを２５０μｔの水に溶解し
、５−２５％直線シヨ糖密度勾配置。

ｄに重層した。ショ糖密度勾配は、５および２５％のシ
ョ糖を各々含むトリス緩衝液（２５ｍＭ）！ｊス塩酸ｐ
ｎ　７．２．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％８Ｄ８を含有する
）を用い、ｌ８００５７０グラジエンター（イスコ社、
米国）により作製した。

ペック？　７　ＳＷ４１　Ｔｉを用い、４℃４００００
回転、１２時間の超遠心を行ったのち、分画回収装置（
ベックマン社、米国）によシ各４００μｔノ分ｍを回収
した。各分画はエタノール沈澱し、遠心後滅菌水に溶解
した。

工程８　（ｍＲＮＡの翻訳実験） アフリカッメガエル卵母細胞によるｍＲＮＡの翻訳は、
実験誉（例えば寺岡宏、五木幹列、日中兼太部、蛋白質
、核酸、酵素、臨時増刊、遺板子操作、６０２貞１９８
１年）に依った。アフリカッメガエルは、浜松生物教材
より得た。実施例５で得た分画ｍＲＮＡを１μ２／μｔ
になるように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり、５
０μｔずつを微量注入し、１Ｉｌｖ／−の牛血清アルブ
ミンを含有するＢａｒｔｈ溶液（７，５ｍＭ）リス塩酸
ｐＨ７，６，８８ｍＭ食塩、１ｍＭ塩化カリ、０．３３
ｍＭ硝酸カルシウム、０．４１ｍＭ塩化カルシウム、０
．８２ｍＭ硫酸マグネシウム、２．４ｍＭ重炭酸ナトリ
ウム、１８Ｕ／−ペニシリンＧ１１８μｆ／−ストレプ
トマイシンを含有する）中で２４時間培養した。培養液
のまま卵母細胞をつぶし、遠心後、上清のＬ細胞障害性
を測定した。沈降定数１６８付近において、Ｌ細胞障害
活性が最高値を与えた。またこの活性は工程３で得た抗
ＴＮ？抗体によシ消去されたが正常マウス血清では消去
されなかった。

工程９（形質転換体の取得） 工程５で得た分画ｍＲＮＡを５μｔを用い、実験書（１
）９７頁以降に従って二重鎖ＤＮＡを調整した。逆転写
酵素はライフサイエンス社（米国）のものを使用した。

二重鎖ＤＮＡを、３．５％ゲル濃度のポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にて分画し、長さ約１０００〜２０００
塩基対（以下塩基対をｂｐと略す）の自分３３０　ｎｆ
を得喪。この画分７ｎｆを用い同上の実験書に従い、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（
ＢＲＬ社）を用いてデオキシＣ鎖をつなぎ、同様１ｃｐ
ｓ１１部位にデオキシＧ鎖をつないだシラスミドｐＢＲ
３２２５６ｎｆ　ドアニールせしめた。アニール後の混
合物を用いて大腸菌Ｂ、　ｃｏｌｉｋ−１２株（ＨＢ　
１０１　、　ＡＴＯＯ３３６９４）を形質転換し、１２
０００株の形質転換体を得た。

工程１０（ＴＮＦの部分アミノ酸配列）工程２で部分精
製したＴＮＦを、工程５におけると同様に８Ｄ８ポリア
クリルアミＰゲル電気泳動によシ精製した。一部をクマ
シー・ブリリアント・ブルー染色し、分子量約１７００
０の位置にある／センＰをゲルから切出し、１％重炭酸
アンモニウムにより抽出した。５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’単位の
’ｒＮＦを使用し、蛋白として約１８０μｆを回収した
。

このうち１５０μｔｆ、１％重炭儀アンモニウム７５μ
ＰＫ溶解、ＴＰＯＫ　）リプシン（ワーシントン・バイ
オケミカル社、米国）を３μｔを添加し、３７℃、４時
間インキュベートした。反応液をコスモシール５ＣＢ（
牛丼化学）を担体とする高速液体クロマトグラフィーに
よ部分画し、トリプシン消化断片を得た。

上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトリプシ
ン消化断片は、次に、セファデックスＧ２５のカラムで
′脱塩し、凍結乾燥後、アミノ酸シークエンスアナライ
ザー・モデル４７０Ａ（アプライド／々イオシステム社
、米国）を用いＲ，Ｍ、　Ｈｅｗｉｃｋらの方法（Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　２５６巻７９９０−７９９
７頁、１９８１年）に準じて、Ｎ末端より工ｒマン分解
を行った。

各ステップにおいて遊離してくるフェニルチオヒダント
インアミノ酸は、高速液体クロマトグラフ　２イーモデ
ル８Ｐ８１００（スペクトラフィジックス社、米国）を
用い、ゾルノセックスＯＤＳ　（デュ・ボン社、米国）
をカラムとして、常法により分析した。この結果、ＴＮ
ＦのＮ末端側からのアミノ酸配列は下□　記の通りであ
った。

８ｅｒ　人ム　（３ｅｒ　Ａｒｇ　んム　Ｌｅｕ　８ｅ
ｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ａ／ａ　Ｈｉｓ　ＶＬｔｖａｔ　Ａ／ａ　Ａｓ
ｎ　Ｐｒｏ　Ｇ／ｎ　Ｖｇａｂｓ　Ｇ々Ｇ／ｎ　Ｌｅｕ
　Ｇｈ′ またトリプシン消化断片のうちの１つは、そのＮ末端よ
シ下記のアミノ酸配列であった。

Ｇｔｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｔｕ　ＧＡｕ　Ａｔ、ａ　
Ｇｔｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　ｈｌａ工程１１（オリ♂ＤＮ
Ａゾローブの合成）工程１０で得たＴＮＦのアミノ酸配
列から推定されるｍＲＮ人の塩基配列に対し、相補的な
、オリｆＤＮＡを合成した。合成方法は、Ｉｔｏらが既
に発表している改良リン酸トリエステル法（ｌ（、Ｉｔ
ｏ　ｅｔａｌ、　Ｎｕｅｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄａ　Ｒｅｓ
、　１０巻１７５５〜１７６９頁、１９８２年）により
行った。

アミノ酸配列から推定される１２８１３［類のオリゴＤ
ＮＡを５グループに別け、各々１６．１６，３２゜３２
．３２Ｗ１類の混合物として合成した。

表１に本発明の新規生理活性物質のアき゛）酸配列の一
部と、これに基く５種類の合成オ！ｊ：ｒＤＮ人のゾロ
ーゾの塩基配列を示す。各々を常法に従って脱保謙し、
０−５Ｏ（ファルマシア社、スウェーデン）を用いるカ
ラム′クロマトグラフィー、７Ｍ尿素を含むｚｏＮポリ
アクリルアミドゲル電気泳動及び、ＤＢ５２（ワット７
７社、米国）カラムクロマトグラフイーにより精製し、
０．１ｍＭ）リスＢＤＴＡ緩衝液に対し、透析した。

各々の精製オリゴＤＮＡを常法によりＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（）々イオラツドラボラトリーズ社、米国
）および７−３２Ｐ−アデノシントリリン酸を用いて放
射性ラベルし、、　ＤＢ５２カラムによシ精製した。各
々、約３Ｘ１０”ｃｐｍ／μ？の放射能が導入された。

工程１２（オＩＪ　＝ｒヌクレオチドの検定）工程６に
従って得たＴＮＦ産生細胞のｍＲＮＡをグリオキザール
及びジメチルスルフオキシドの存在下に５０℃６０分間
処理したのち、１．１％アガロースゲル電気泳動により
分画した。分画されたｍＲＮＡを、電気泳動式トランス
ファープロティング装置（）々イオラツドラがラドリー
ズ社、米国）を用いて、メーカーのマニュアルに従い、
移動せしめた。次いで、この膜上のｍＲＮＡと、５ｘｓ
ｓ。

及び１５０μｔ／ｙｄの変性サケ精子ＤＮＡを含む５×
！　デンＩ・ルト溶液で６５℃、２時間処理したのち、
放射性標識したオリノＤＮＡをＩ　Ｘ　１０’　ｃｐｍ
／寥、５×ＳＳａ溶液を含む５×デンハルト溶液で５０
℃、　２時間処理した。次いでこの膜を５ＸＳ８０で室
温、４０℃、５０℃、６０℃で順次洗滌し、Ｘｌｌ１！
フィルムＸＡＲ−５に対し露光せしめた。この結果Ｘ　
ｔｎＲＮ人と最も強くハイブリダイズするオリ＝ｒ　Ｄ
ＮＡは、ＭＪであって、ＭＪ混合中にｍＲＮＡと完全に
相補的な配列を有するオリ：／　ＤＮＡが含まれている
ことが判明した。

工程１３（ＴＮＦ遺伝子のクローニング）工程９で得た
形質転換体を実験誉（２）　ｌ　ｓ　２頁の方法に従っ
てセル四−スフィルター上に移し、そのＤＮＡと、工程
１２で選択された放射性標識オリ＝ｒ　ＤＮＡ　（ＭＪ
　）とを工程１２と同様の条件でハイブリダイズせしめ
た（コロニー・ハイブリダイゼーション）。強くハイブ
リダイズする株４９個を選び更にフィルター上に固定し
て再度コロニーノ・イブリダイゼーションを実施し、９
個を選んだ。

この９個の株から、実験１ｔ（１）６頁の迅速シラスミ
ド分離法に従って各々約５μＶのシラスミＰを取得した
。このシラスミドを制限酵素Ｐｓｉ　ｌ　、　Ｔａｑ　
ｔ。

Ｒ１１１ｌ　、　Ｐｖｕ　Ｉｆ　（いずれもＢＲＬ社）
を用い、メーカーのマニュアルに従って切断し、１％ア
ガロースゲル電気泳動で、各々の酵素による切断片の長
さを比較した。

この結果、９株すべてが、約ｓｏ　ｂｐのＰｖｕ　ＩＩ
とＲｓａ　ｌによる断片を有し、８株がＲＩＩａＩによ
る約２００　ｂｐの断片を有し、共通の配列を有するこ
とが示唆された。第１図に制限酵素による解析結果を図
示する。

また、このうち７株をｌＯμｔ／ｗｌのテトラサイクリ
ンを含む２ｄのＬ培地中で培養し、遠心にて集めた菌体
を２ｄの生理食塩水中で超音波によシ破砕し、遠心上清
のも細胞障害活性を測定したところ、表２に示す如く、
Ｌ細胞障害活性を示した。

またこの活性は抗ＴＮＦ抗体により消去され、正常マウ
ス血清では消去されなかった。従ってこの９株すべてが
ＴＮＦ遺伝子を含むシラスミドを有していることが示さ
れた。

表２　各種形質転換体によるＬ細胞障害活性工程１４（
ＴＮＦ遺伝子の塩基配列の決定）シラスミドｐＢ２−７
、およびｐＲ４−８を含有する大腸菌株を、１０μｆ／
１１１１のテトラサイクリ／を含有するＭ９培地〔実験
書（３）　４４０頁）ｉｔ中で培養した後、実験（３）
９０頁の方法に従ってシラスミドを単離し、各々約１５
０μｔｆ得た。

各々の塩基配列をマキサムーギルノ々−ト法（Ｍａｘａ
ｍ　ｅｔ、　ａｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　５５巻４９０頁１９８０年、人ｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）に従って決定した。また、この
塩基配列と工程９で決定された部分アミノ酸配列の一致
により、ＴＮＦ蛋白の全構造が解明された。

工程１５ シラスミＦ’ｐＲ１２の組み変え体を用いてｐ、、ｃｏ
ｌｉ内でｌａｃをプロモーターとしてＴＮＦを発現させ
ることを目的にシラスミドの構築を行つ九。第２図を示
す様［１０μｔのシラスミｒｐｉ’ｔ１２　ｔ　ｓ　ｏ
ユニットのＡｐａ　ｌ　（ＢＲＬ社）で３７℃で２時間
消化し、４％の２リアクリルアミドグル上の電気泳動で
約６３０ｂｐ断片を単離した。約ｌμｔの断片がゲルか
ら電気泳動溶出した。工程ｌＯと同様の方法によって図
示の２個のデオキシオリザヌクレオチド即ち、５’−Ｇ
ＡＴＯＯＡＴＧＴＯＡＧＯＴＴＯＴＯＧＧＧＯＯ−３’
と５′−０ＧＡＧＡＡＧＯＴＧＡＯＡＴＧ−３’　（第
２図）とを合成し、実験書（３）　１２２頁に従って約
１００　ｐｍｏｌｅの各デオキシオリゴヌクレオチｒの
５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン
酸化した。反応終了液をフェノールを用いて抽出し、さ
らにクロロフォルム抽出した後、オリゴマーを０．５μ
ｆの約６３０塩基対のＡｐａ　Ｉ断片と合せてエタノー
ル沈澱した。

実験書（１）３７頁に従がって１０ユニツトの　Ｔ４Ｄ
ＮＡＩＪガーゼで前記の断片を４℃で１夜反応させ結合
した。反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニツトの
ＢａｍＨＩで３７℃３時間消化し、４％の？リアクリル
アミド上の電気泳動にかけ、約６７０　ｂｐの断片を電
気泳動溶出により回収した。市販のシラスミドｐｕａ−
ｓ（Ｐ−Ｌ）Ｓイオケミカル社、カタログ番号４９１６
、米国）１μＶをＢａｍＨＩで消化してフェノール抽出
、クロロフォルム抽出、エタノール沈澱をして調製した
ベクター０．５μ２に約６７０ｂｐのＴＮＦの全構造遺
伝子を含む両端がＢ　ａｍ　Ｈエサイトを持った断片を
−Ｔ、　ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。実験誉（４
）、２０頁に従がって、Ｂ、　ｃｏｌ　ｉ　ＪＭＩＯＩ
（ＡＴＯＯ３３８７６）を形質転換してＩ　ＰＴＧ及び
ｘ−ｇａＬを含む寒天培地が約２００個の白色コロニー
を得た。これらのトランスフォーマント１００個からシ
ラスミドＤＮＡを調製し、ＢａｍＨＩで消化したところ
、１５個が目的の約６７０　ｂｐのＢａｍＨＩ断片を含
んでいた。さらに、挿入の方向を調べるために、上記１
５個のシラスミＰをそれぞれ１ケ所しか認識部位がない
ＢｃｏＲＩ　（ｐＵｏ−８上に認識部位がある）とｐｖ
ｕｌ［（約６７０ｂｐの断片上に認識部位がある）を用
いて消化し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用
いて調べたところ、７個のプラスミドから目的の約１４
０ｂｐの断片が確認され、ｐＵＯ−ｓ上の７ＡＣプロモ
ーターから順方向であることが判明した。

塩基配列の解析によシ、この７個のプラスミドは同一で
、ｔａｃプロモーター、合成りＮＡ及びｃＤＮＡ　。

間の結合部に所望のヌクレオチド配列を有することが確
認された。

□　工程１６ シラスミドｐＲ１７を用いて、Ｂ、ｃｏｌｉ内でｔａｃ
ＵＶ５プロモーターとしてＴＮＦを直接発現させること
を目的にプラスミドの構築を行った。第３図に示す様Ｋ
ＩＯμ２のプラスミドｐＲ１７ｆ　１０ユニツトのＡｐ
ａ　Ｉ　（ＢＲＬ社）で３７℃２時間消化し、４％のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で約６３０　ｂｐの断片
を単離した。約ｌμｔの断片がゲルから電気泳動溶出し
た。工程１０と同様の方法によって図示の２個のデオキ
シオリゴヌクレオチド即ち、５′−ＡＡＴＴＯＡＴＧＴ
ＯＡＧＯＴＴＯＴＯＧＯＧＯＯ−３’と５′−０ＧＡＧ
ＡＡＧＯＴＧＡＯＡＴＧ　−３’とを合成し、実験書（
３）１２２頁に従って約１００　ｐｍｏｌｅの上記２種
のデオキシオリゴヌクレオチドの５′末端をＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。、反応終了
液をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロフォルム
抽出した後、先に得たｐＲｌ　７のＡｐａｌ消化断片（
約６３０ｂｐ）ｏ、ｓμｍと合わせてエタノール沈澱し
た。実験書（１）３７頁に従ってｌＯユニットのＴ４リ
ガーゼで４℃１夜反応させ、結合せしめた。反応後、反
応液をエタノール沈澱し、２０ユニツトのＥｃｏＲＩで
３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミドゲル上
の電気泳動によシ約６７０ｂｐ　の断片を電気泳動によ
り回収した。

シラスミドｐＯＰ９５−１５は、フラーの方法（Ｆ。

ｐｕｌ　ｌｅｒ　、　Ｇｅｎｅ　、　１９巻４２頁〜５
４頁１９８２年）に従う　って調製した。

ｐＯＰ９５−１５の１μりをＥＣ０ＲＩで消化してフェ
ノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱をして
調製したベクター０．５μｍと、上記の如く合成デオキ
シオリゴヌクレオチドと、ＴＮＦ遺伝子を結合して得た
約６７０ｂｐの断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合した。実験書（４）、２０頁に従って、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴＯＯ３３８７６）を形質
転換してＩ　ＰＴＯ及びｘ−ｇａｔを含む寒天培地上に
約１５０個の白色コロニーを得た。

これらのコロニー１００個からフラスミｒ　ＤＮＡを調
製し、ＥｃｏＲＩで消化したところ１２個が、目的の約
６７０ｂｐのＢｃｏＲ１断片を有していた。さらに挿入
の方向ｔＸべるために上記１２個のシラスミドをＰｖｕ
ｌとｐｓｉ）を用いて消化し、１．５％アガロースゲル
電気泳動を用いて調べたところ、４個のプラスミドから
目的の約１２８０　ｂｐ及び２６００　ｂｐの断片が確
認され、ｔａＣＵｖ５プロモーターから順方向にＴＮＦ
遺伝子が接続されていることが判明した。

塩基配列の解析によシ、この４個のシラスミドは同一で
、ムｃＵＶ５プロモーター、合成デオキシオリゴヌクレ
オチｒ１及びｃＤＮＡが正しく結合さレテイルコとが確
認された（ｐＴＮＦ−４ａｃＵＶ５−１と命名する）。

工程１７（大腸菌の生産するＴＮＦの精製）工程１６で
得られたシラスミドを含有する大腸菌株を１００μｆ／
ｒｔｔｌのアンピシリンを含有するＬ培地５０ｄで１夜
培養し、５ｔの同上の培地に移して更に３時間培養した
。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（８ｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｑｏ、米国）を終濃度１　
ｍＭになる様に添加し、更に６時間培養を続けたのち冷
却し、遠心分離によシ菌株を集めた。工程１３における
と同様に菌体を０．０４Ｍ　）リス−塩酸緩衝＃　（ｐ
Ｈ７−８）　５を中で超音波破砕し、菌体蛋白溶液を得
た。この溶液は５ｘｉｏ’単位／ｌのＬ細胞障害活性を
示した。

この溶液を工程２と同様に精製を行った結果１．２Ｘ１
Ｇ’単位のＴＮＦを得た。このものの比活性は６．８　
Ｘ　１０７単位／ηであつ九。

工程１８　（Ｍｅｔｈ　Ａ　ｐａｒｃｏｍａ坦癌マウス
を胆癌る活性評価） 工程１７で得られたＴＮＦを、本文中記載の呻ｖｉｖｏ
法によってその活性を評価した。

また、試料投与後２０日１に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめた。

以上の方法によシ測定した、大腸菌の生産するＴＮＦの
活性を表３に示す。

表　３ 対照　５　５０００　ｏ／ｓ 生理食塩水 完治率：完全に癌が退縮したマウス数／実験マウス数参
考例２ 工程１（シラスミドｐＲ１８、ｐＨ２−７、ｐＨ２−２
のＨ，ｃｏｌｉ　Ｋ１２　、ＭＯ１０６１株への形質転
換）参考例１で得た、上記３種のフラスミ）＋１を常法
に従ってＥ、　ｃｏｌｌ　Ｋｌ　２　、　ＭＯｌ　０６
１株へ形質転換した。

詳しくはＥｃｏｌｉ　Ｋ１２　、　ＭＯ１０６１株のコ
ロニーをＬＢ培地を用いて、５５０ｎｍの吸光度が０．
３になるまで培養した。該培養液５０−を集菌した後、
２５−の１０　ｍＭ　ｎｂｃｔを含む１０ｍＭ　ＭＯＰ
８　（ｐＨ７，０）溶液で洗浄し、次いで５０ｍＭ　０
ｎＯＬ１．１０ｍＭ　Ｒｂｃｔヲ含ｊｒ　Ｏ，ＩＭ　Ｍ
ＯＰ８　（ｐＨ６，５）　ＫＷヒＪ１ｍ　Ｌ７’Ｌ。

該懸濁液を３０分間氷冷し、遠心した後、上清を除去し
、３０　＃ｔＯＤＭ８０および５０　ｍＭ　０ａＯＪ４
と１０ｍＭＲｂ０ｔを含む０．ＩＭ　ＭＯＰ８（１）Ｈ
６，５）　Ｏ混合液中に懸濁させた。該懸γ局液を２０
３μｔずつ分注し、前述のシラスミドＤＮＡ溶液１０μ
ｔをそれぞれに加えた。

該混合液をそれぞれ３０分間氷冷した後、４４℃で６０
秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかじめ３７℃
に温めておいた５ｄのＬＢ培地を加えた。この溶液を３
７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心し、上
清を除去し、細胞ペレットを得た。該細胞ペレットにＬ
Ｂ培地を加え、攪拌した後、懸濁液とした。該Ｗ濁液を
、３０１１ｆ／ｄのテトラサイクリンを含むＬＢＢ天プ
レートにまき、３７℃で１夜培養を行なった。その結果
シラスミ）ｐＲ１８、ｐＨ２−７とｐＨ２−２からそれ
ぞれテトラサイクリン耐性形質転換菌のコロニーが得ら
れた。

工程２（１）Ｂ２−７とｐＢ１ＢＢラスミドＤＮＡの調
製） 工程五で得られたシラスミ）’Ｉ）Ｂ２−７とｐＨ１８
の形質転換体を、下記の粗大の方法に従って培養し、プ
ラスミドを増幅させた。次いで得られ象形質転換体を集
菌し、破砕したのち、シラスミドＤＮＡを精製した。〔
実験書３．８８−９６頁〕す表わち、ＬＢ培地に、それ
ぞれの艙質転換体を植菌し、漱しく振とうしながら３７
℃で培養し友。

次いで、この工程をくシかえして形質転換体を増殖させ
更にシラスミドを増幅させた。次に得られた形質転換体
の培養液を４℃に冷却ｉがら、４．０００　Ｇで１０分
間遠心を行ない、上清を除去した。

氷冷８ＴＢ　（０，１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）と１　ｍＭ　、　ＥＤＴ
Ａ　）の１０〇−を用いて洗浄し、続いて１０ｍＭ）！
ｊスス−酸緩衝液（ｐｉ（ｓ、ｏ　）中に２０１９７−
のリゾチームを含む水溶液を用いて細胞を破壊した。得
られた粘性液体を超遠心チューブに移し入れ、２５．０
０Ｏｒｐｍ　３０分間４℃で遠心を行なってＤＮＡ溶液
を得た。

該ＤＮＡ溶液の容量を測った後、該溶液五−当シに、固
体の塩化セシウム１ｆを加え、塩化セシウムが完全に溶
けるまで、ゆつくシと注意深く攪拌し元、該塩化セシウ
ム水溶液の１０ｄ毎に、１０１１９７ｍのエチジウムブ
ロマイド水溶液０．８−を加えた。この結果、該溶液の
最終比重は１．５５ｆ／ｌｌｊ、エチジウムブロマイド
の最終濃度は約６００μｆ／ｍｌとなった。

紋塩化セシウム水溶液を適当な遠心チューブに移し、空
隙に軽パラフィンオイルを加え、２０℃で３６時間、４
５．００Ｏｒｐｍの遠心を続けると上層に線状の微生物
由来ＤＮＡと環状シラスミドＤＮＡの開環したもの、下
層に閉環状のプラスミドＤＮＡがくる。下部のＤＮＡの
／センドをチューブの横に注射針をさしこんで採取しガ
ラスチューブに移した。

エチジウムブロマイドを除去し、水層をＴＢＢ衝液に透
析した。シラスミドＤＮＡ溶液をＲ１１（ａｓｅ処理し
、等量の飽和フェノール溶液で抽出した。水層をあらか
じめ０１１％８Ｄ８を含むＴＢＢ衝液（ＰＨ８，０）で
平衡化したノマイオゲル（Ｂ！ｏｇｅｌ　）Ａ−１５０
（／々イオラツｒ社：米国）に付し九。ＤＮＡを洗い込
み、活性区分を取得する為に０．１％８Ｄ８を含むＴＢ
緩緩衝液液溶出した。分画液をエタノールで沈澱させ、
精製したプラスミＰＤＮ人を得た。

上記の方法によシ、精製ｐＨ２−７ゾラスミドＤＮＡが
２５０μｔ％ｐＢ１８プラスミｒＤＮ人が１３４μを得
られた。

工程３゛（精製ｐＢ２−７とｐＨ１８プラスミｒ　ＤＮ
Ａのニックトランスレーション） 工程２で得られた精製シラスミ）’ＤＮＡ４０μｔを制
限酵素ｐａｔ　ｌで消化分解し、次いで４％アクリルア
ミ）１１ゲルを用いる電気泳動にかけた。

電気泳動後、染色を行ない２．６μｔ（計算値６μｔの
４３％）の目的とするノ々／Ｐを切出し丸。、２．６μ
ｔの中の５００　ａｔの該切出断片を用いて、Ｔ。

Ｍａｎｌａｔｉｍらの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　Ｕ８Ａｅ７２１１８４（１９７
４）　）　Ｋ従ってニックトランスレーションを行なっ
た。ニックトランスレーションは市販キラ）（ＢＲＬ社
、米国）を用いた。２５μｔの反応で放射化したｄＯＴ
Ｐを８０　ｐｍｏｌｅ用いた。（４０００ｉ／ｍｍｏｌ
ｅの場合） まず下記混合溶液を調製した。

２．５μｔ　溶液Ａ（αＮＴＰ溶液） ２６５μｔ　溶液Ｂ　（ｓｏｏｎｔのＤＮＡ、すなわち
Ｐｓｔ’ｌ　４ンサート） ５μｔ　α−”Ｐ−ｄＯＴＰ（３２０００！／ｍｍｏｌ
ｅ）１．３１１１　ｄＯＴＰ　（６５ｐｍｏｌｅ　、　
５０　ｐｍｏｌｅ　／　ＡｔｄＣＴＰ） １１．２μｔ　溶液Ｅ（Ｈ意０） 計２２．５μｔ この２２．５　ｌｉｔの溶液に、２．ｓｐｔの溶液０（
ＤＮａｓｅｌ、ＤＮＡポリメラーゼＩ）を加え、１５℃
６０分反応させた。

次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液）を加え反応を停止させた
。更に、キャリヤー、ＬＲＮＡを加えエタノール沈澱を
２回行ない、次いで５００μｔの水に溶解した。比活性
は、９　、３　Ｘ　１　Ｇ’　ｃｐｍ／１１ｆＤＮＡで
あった。工程２で得られた精製ｐＲ１８を用いて、同様
に上記の方法に従ってニックトランスレーションを行な
った。比活性は７Ｘ１０’ｃｐｍ／μｆＤＮＡであった
。

工程４　（１）８１ＢのＲｅａｌ断片取得）８０μ２の
ＰＲ１ｇプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｒ１工■で消化し
、４％アクリルアミド電気泳動に付した。下記の目的と
するインサートのパンｒを切出しＢＮＤカラムを用いて
精製した。

約６４０ｂｐ　３．７７μｔ　（回収率ｓｚ！Ｘ）約１
７５　ｂｐ　１．７７　ｌｉｔ　（回収率５０％）この
約６４０ｂｐのインサートをｐＲｌＢの３′断片（１）
Ｒｌｇの３′側の翻訳されない部分を意味する）、約１
７５ｂｐのインサートをｐＲ１８ｃｆｒ　ｃｐＲｌＢの
コード部分）と命名した。

更に上記方法に於いてｌｓａ　ｌの代ゎシにＰｓｔ　ｌ
とＭｓｔｌを用いて消化したところ、約４５０ｂｐ、　
３．６５μｆ（回収率６０％）を得た。このインサート
はｐＲｌＢの５′断片と命名し九。

工程５（染色体肢生理活性物質遺伝子の単離）工程３で
得られたｓ２Ｐラベル化シラスミドｐＢ２−フィンサー
トをハイブリダイズ用プローブとして用い、Ｑｈａｒｏ
ｎ　４　ＡのＥＣ０ＲＩ切断サイト（Ｂｌａｔｔｎｅｒ
らの方法８ｃｉｅｎｃｅ　１９６１６１　（１９７？）
　）にヒトＤＮＡとｐｊｃｏＲＩで切断した断片（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ、　ａｌ、　０ｅｌｌ　１５６８７
（１９７８）　〕を組込んで作成した／々クラリオファ
ージＱ１１ａｒｏＨ４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーの１０”コのプラークをスクリーニングした。その方
法としてＢｅｎｔｏｎと］）ａｖｉｓらのゾラークハイ
プリダイズ法（Ｂｅｎｔｏｎ　ａｎｄ　１）ａｖｉｓ　
５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６　１８０（１９７７））を用
いた。

出発培養液中の、？クテリオファージの総てが、該生理
活性物質を作成する為に８要な遺伝子材料を含んでいる
とは限らないので、ウサギＴＮＦの遺伝子に相補的な配
列を持つプローブを用いた。

目的とする遺伝子を含むファージプラークは、放射活性
を有するプローブとハイブリダイズすることによシ、そ
の放射能活性を測定することによって見つけることが出
来る。このようにして９つのハイブリダイズプラークが
、該ライブラリーから得られた。

方法と条件は次の通シ、 ｌ）　ゾラーク数：〜ｔｘｘｏ６ゾラーク（〜４Ｘ１０
４プラーク／φ１５０ｍプレート×２５） ２）ニトロセルロースフィルターへノ転写：（Ｂｅｎｔ
ｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ　、　８ｃｉｅｎｃｅ、　１
９６　、１８０　（１９７７）参照〕 ３）ハイブリダイズ：　１．２５　Ｘ　１０’　ｃｐｍ
／ｘｉの参考例１工程３で得た１１１Ｂ２−フインサー
トプローゾを加え、４２℃、　１９．５時間 ４）洗い：　２ＸＳ８０−０．１％８Ｄ８を用いて室温
で１０分間洗いを４回、続いてＩ　Ｘ８８０−０．１％
８ＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ５）　露光：　ＸＡＲ−Ｒ、−８０’Ｃ１２枚の増感紙
、３′９時間 上記スクリーニングで１２の候補株が得られた。

二次スクリーニングを行なった結果、９個がポジティブ
のクローンを含み、１個はまだポジティブの可能性があ
った。二次スクリーニングプレートからポジティブプラ
ークおよび可能性のあるプラークをひろい、三次スクリ
ーニングを行った結果９個がポジティブであった。この
９ｇのプラークについて４次スクリーニングを行ない、
目的の断片を含む９つのノ々クラリオファージ９つを、
それぞれＨＧＩ〜ＨＧ９と命名した。

工程６（ウサギ染色体ＴＮＦ遺伝子の単離）本質的には
、工程５に述べた方法と同様に行なった。すなわちＥＣ
ｏＲＩで切断したＤＮＡを用い−２て作成した１０６個
のＱｈａｒｏｍ　４Ａ／ウサウサ色体遺伝子ライブラリ
ーバクテリオファージのプラークを検索した。

ウサギ染色体遺伝子を含む２つのノ々クラリオファージ
株（ＲＧ−１、ＲＧ−２）が得られた。

工程７（ヒトクローンのサザンプロット解析）工程５で
得られたＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７のバクテリオフ
ァージを用いて、それぞれＤＮＡを次の方法に従って得
た。

６Ｘ１０”個のＥｃｏＨＬＦ１３９２を１８ｒｄｌの８
Ｍ中に懸濁し、そこにバクテリオファージＨ’ａ−ａの
３Ｘ１０”ＰＦＵを加え、３７０℃で２０分間吸着を行
なった。

次いで得られた混合液を３ｔのＮＺゾロスに加え、３７
℃、２３時間攪拌培養した。次いで６０ｒｄのクロロホ
ルムを該混合液に加えて、３０分間攪拌した。最終濃度
ＩＭとなるように混合液中に塩化す）　ＩＪウムを加え
た後１５分間放置した。次いで遠心操作を行なった。次
いで、分子量約６０００のポリエチレングリコールをポ
リエチレングリコールの濃度１０％（Ｗ／Ｖ）になるよ
うに加えて、４℃、２２時間放置した。次いでノ々クラ
リオファージは遠心操作を行なって採取した。得られ九
ノ々クテリオファージを８Ｍの２８−に１ａ？１！シ、
次いでクロロホルムを等量論えた。ｉルテツクスミキサ
ーで３０秒間混合した後、遠心して水層を集め、その全
量をＳＭで３０ｔ／にした。これに２６．４ｆの塩化セ
シウムを加え、静かに溶解した後、超遠心（４５０００
ｒｐｍ２０時間）でファージのノ々ンＰを採取した。１
０ｍＭ塩化ナトリウムと塩化マグネシウム１０ｍＭを含
む５０ｍＭ）リス緩衝液（１）Ｈ８，０）に透析した後
、それぞれの最終濃度が２０ｍＭ、　５０μｔ　／ｙｘ
ｌ　＊　０−５９１；となるようにＥＤＴＡ、プロテイ
ナーゼに、８Ｄ８を加え、６５℃で１時間処理した。次
にフェノール、フェノール：クロロホルム＝１　：　１
、／ロロホルムで各１回ずつ抽出し、得られた水層を１
　ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，
０）で透析した。この溶液の紫外線吸光度測定した結果
、ノ々クテリオファージＨＧ−３の純粋なりＮＡが得ら
れたことが確認された。

／セクテリオファージＨＧ−３のＤＮＡを調製するため
に用いられた方法と本質的に同じ方法を応用することに
より、／々クテリオファー？）ＨＧ−６とＨＧ−７のＤ
ＮＡを得た。

このようにしてＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７、ＤＮＡ
を各々２９２０μ？、　１１００μ？、　８１９μｔを
得た。次いでサザン法（Ｅ、Ｍ、　８ｏｕｔｈｅｒｎ、
　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　、　、　９−８５０３　
（１９７５）　）に従って、以下の実験条件でこれらの
ＤＮＡのサザンゾロッテイングを行なった。

１）　ＤＮＡ： ＨＧ−３８２５０９ ＨＧ−６９３５１Ｆ ＨＧ−７−６８５ｎｆ ２）各種制限酵素による分解： ＢａｍＨＩ　１０単位、ＥｃｏＲＩ　１Ｇ単位。

Ｂａｆｆ１ＨＩ　１０単位十ＢｃｏＲＩ　１０単位Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ　１０単位 ＨｉｎｄＩＩＩ　１０単位十ＥｃｏＲＩ　１Ｇ単位Ｐｖ
ｕＩＩ　１０単位、３７℃　３時間３）電気泳動： ０．８％アガロースゲル ＡＢ ２８Ｖ、　ｉｓ、ｓ　ａｒ間 ４）　ニトロセルロースフィルターへノ転写：（Ｅ、Ｍ
、　８ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、　
、　９８５０３（１９７５）参照〕 ５）プレハイブリダイズ： ３０ｄ　ＦＤ８８ ４２℃　６時間 ６）ハイブリダイズ： １）ＲｌＢの５′−断片（Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｐｍ／ａ
＃　、工程４にて調製したもの）を含む３０ｓｌ　ＦＤ
８８４２℃、１４時間 ７）洗い： ２ＸＳ８Ｃ１−０，１Ｘ　ＳＤＳを用いて室温で１０分
間洗いを４回、続いてｌ　Ｘ５８０−０．１％８Ｄ８を
用いて５０℃で３０分間洗いを２回 ８）露光： ＡＲ−５ 一８０℃、２枚の増感紙　１４時間 ハイブリダイズの結果は、表４に示す。

以下余白 工程８（ウサギクローンのサザンプロット解析）工程７
において、ＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７のかわシにＲ
Ｇ−１，ＲＧ−２の／々クテリオファージのそれぞれを
用いる以外社、同様の操作によってサザンプロット解析
を行なった。その結果、ＲＧ−１およびＫＧ−２をＢ　
ａｍＨＩ　、　ＢｃｏＲＩ　、　ＢｇｔＩＩ　、　Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ＋ＢｃｏＲＩのそれぞれで
分解して得られた断片と、ｐＲｌＢの５′断片およびｐ
Ｈ２−フィンサートとはいずれも単一ノ々ンＰにハイブ
リダイズした。これは、ｐＲｌ　８の５′断片およびｐ
Ｈ２−フィンサートとハイブリダイズしたどちらの断片
もＴＮＦをコーＰする全塩基配列を含むことを示す。

工程９（ヒト染色体の該生理活性物質を含む）々クチリ
アクローンの構築） 工程５において得られ九ＨＧ−３のＤＮＡを、：［、ａ
ｎｄｙらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１３．
　ｐ、　２１３４　（１９７４）　）によって得た。こ
のＨＧ−３のＤＮＡ３ａμｆ　ｔ−ＢｃｏＲＩの８０単
位によって３７℃で３時間分解した。分解物は１％低融
点アガロマースゲル（条件＝１×ＴＡＰ、　２０Ｖ、　
１４．５時間）ニテ電気泳動Ｌｌ。２．９ｋｂのパンＰ
をアガロースゲルより、Ｔ、Ｍ闘ｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ＯｌｏｎＩｎｇ、　０ｏｌｄ　８ｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

ｐ、　３７７　（１９８２）　）の方法で単離した。詳
しくは、２．９　ｋｂのノ々ンド部位を切り出したゲル
を６５℃で１５分間加熱し九、さらに、この２．９　ｋ
ｂの長さを持つＢｃｏＲＩ分解ＨＧ−３ＩＩＴ片（以後
、これｔ−［１（Ｇ−３／ＨｃｏＲＩ　２．９　ｋｂ断
片」と略することが多い）を、とけたゲルよりフェノー
ルで３回、エーテルで３回抽出、酢酸アンモニウムを含
むエタノールで沈澱して回収する。仁のようにして、６
３７μ？　（収率３０）のＨＧ−３／ＨｃｏＲＩ　２．
９　ｋｂ断片を得た。

上記断片２２５　ｎｆとＲＣＯＲＩ分解ｐＵＯ１３（Ｊ
。

Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　１０１．　ｐ、　２Ｇ（１９８３））を
、２．５単位のＴ４リガーゼを用いて結合した。

Ｂ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２のＪＭ８３株に上で得られた結
合ＤＮＡを形質転換した。詳しくは、Ｌ　ｃｏｌｉ　Ｋ
１２のＪＭ８３株をＬＢ培地中で、培養ゾロムの５５０
ｎｍｌＣおける吸光度が０．３になるまで培養した。５
０ｍの増殖したＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２のＪＭ８３株を
集め２５Ｍ１の１０ｍＭ　ＭＯＰ８（ｐＨ７，０）−１
０ｍＭＲｂＣ１ｔで洗い、２５−の０．Ｉ　Ｍ　ＭＯＰ
８　（ｐＨ６，５）−５０ｍＭ　０ａＯＬｚ−１０ｍＭ
　Ｒｂ０ｔ中にＷＡ？Ｉｉｌ、た。この懸濁液２ｏ３ｐ
Ｌに、１０　ｎｔの上記結合ＤＮＡを含むｌＯμｔの水
溶液を加えた。この混合物を水中にて３０分分間中し、
４０℃で６０分間加熱した。その後すぐに、あらかじめ
３７℃にしておいたＬＢブロスの５ゴに、加熱した混合
物を加え、３７℃で１時間培養した。

得られた培養ゾロスを遠心し上清を除去した。遠沈した
細胞にＬＢ培地を加えてほぐし、３０μｔ／−のアンピ
シリンと４０μｔ／ｗｅのＸ−ｇａｔｆ含むＬＢプレー
トに植菌した。インサートを含むプラスミドが導入され
たＢ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２のＪＭ８３株のコロニーは
白色であるが、プラスミドのみが導入された株のコロニ
ーは緑色であった。得られた白色コロニーは再び、３０
μｆ／ｄのアンピシリンと４０μｆ　／ｌｄｌ　ＯＸ　
−ｇａｔを含むＩ、Ｂプレートに確認のため植菌した。

上で得られた白色コロニーよシ、１０個のコロニーを選
び、ＨｏｌｍｅｓとＱｕｉｇｌｅｙの迅速解析法（Ａｎ
ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１１４．　ｐ、　３９３（１９
８１）　）を用いてスクリーニングした。

詳しくは、それぞれのコロニーを３０μｆ／１ｔｔｌ　
のアンぜシリンを含むＬＢ培地で一夜培養する。増殖し
た細胞を集め、２〜／ｄリゾチーム−５０ｍＭグルコー
ス−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ−２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＯＬ
　（ｐｉｔｓ、ｏ）中に崗濁した。このＳ清液を室温で
５分間おき、ｚｏｏａｔの０．２Ｎ　Ｎａ０）１−１％
８Ｄ８を加えた。ゆっくり攪拌したのち、この懸濁液ｔ
−２分間室温にお　□いた。続いて、１５０μｔの３Ｍ
酢酸す）　１７ウム（ｐＨ５，２）を加え、１０分間−
２０℃におき、１５分間遠心してその上清を得た。この
上清に９００　ｍ　’の冷たいエタノ−、ルを加え、５
分間遠心してその沈澱を得た。得られた沈澱を７０％エ
タノールで　゛洗い、乾燥してプラスミドＤＮＡを得た
。この方法　′を用いて、１０種のプラスミドを得た。

それぞれのシラスミ）’　ＤＮＡ　／ｆｉ、ｌ　ＯｍＭ
　Ｔｒｉｓ　−ｏ、１ｍＭ　ＢＤＴＡ　（ＰＨ８，０）
に浴わし、ＢｃｏＲＩで分解し、制限酵素解析のために
電気泳動に供した。制限−酵素分解と電気泳動の条件は
以上の通シである。

制限酵素分解ニブラスミドＤＮＡ溶液二上で得られたも
のの５分の１量、３１単位のＥｃｏＩもＩ３７℃、１．
５時間。

電気泳動：１％アガロースゲル、ＩＸＴＡＥ、１２０Ｖ
、２時間 上記の制限酵素解析によって、１０塊のクローンのうち
８種が目的のものであることが示された。

すなわち、この８種のクローンは２．９　ｋｂの断片を
持っていた。８種の目的のクローンのうち、１つを選び
Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＪＭ８３　（ｐＨＧＥ）株（
ＡＴＯＯ３９６５６）と名づけだ。

続いて、工程２と同じ操作（たたしｐＢ２−７とｐＲｌ
　８のかわりにＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２のＪＭ８３　
（ｐＨＧＥ）株を用いた）によって、１．８９■のｐＨ
ＧＥ　ＤＮＡを得た。

工程１０　（ＥｃｏＲＩ分解ＲＧ−１のサブクローニン
グ）工程６において得られた３０μ２のＲＧ−１をＥｃ
ｏＲＩによって分解した。得られた各種断片の混５　合
物より、工程９と同じ操作（ただし上記各種断片の混合
物と０．８％の低融点アガロースゲルを用いた）によっ
て、約３．５ｋｂの長さを持つ断片を調製した。この断
片とＨＣＯＲＩで分解したｐＵＯ１３を、工′程９と同
じ操作（ただしＢｃｏＲＩ分解ＨＧ−３断片（２，９ｋ
ｂ　）のかわシに上記ＢｃｏＲＩ分解断片（ａ、５ｋｂ
）を用いた）によって、結合した。

Ｂ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２のＪＭ８Ｂ株への形質転換、
バクテリアクローンのスクリーニング、クローンＤＮＡ
の分解と電気泳動け、工程９と同じ操作（たたし上記結
合ＤＮＡ断片を用い九）によって行った。得られたクロ
ーンはＢ、　ｃａｌｌ　Ｋ１２のＪＭ８３　（ｐｕｏｇ
）株（ＡＴＯＯ３９６５５）と名づけた。

続いて、工程２と同じ操作（ただしＦｒ、　ｃｏ　１ｉ
Ｋ１２　ＪＭ８３（ｐＲＧＢ）株をｐＢ２−７と９１’
Ｌ−１８のかわシに用いた）によって、ｐＲＧＢ　ＤＮ
Ａを１．７０■調製した。

工程１１　（ｐＨＧＥプラスミドＤＮＡの制限酵素地図
） 工程９で得られたｐＨＧＢ　ＤＮＡの制限酵素地図を、
Ｍａｎｉａｔｌｓの方法〔Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｏｌｏ
ｎｌｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　９８　（１９８２）　）によっ
て行った。

その方法と条件は以下の通シである。

１）　ＥｃｏＲＩによる９ＨＧＥ　ＤＮＡの分解：　ｔ
ｇ、ｅμｍのｐＨＧＥ、　６４単位のＥｃｏＲＩ、　３
７℃、２時間２）エタノール沈澱 ３）　溶解：　１ｉｉｃｏ几工分解ｐＨＧＢが１μｔ／
ｌｄの溶液になるように蒸留水を加える。

４）％種制限酵素による分解：１μｔの上記ＥｃｏＲＩ
分解ｐ　ＨＧＥ　＋制限酵素＝５単位のＰｖｕＩＩ、　
５単位のＰｖｕＩＩ　＋　１０単位の几ｓａＩ、１０単
位のＲｓａＩ、　４単位のＭｓｔＩＬ　３単位のＡｖａ
Ｉ、　９単位のＰｓｔＩ。

３７℃、２時間 ５）電気泳動：２％アガロースゲル、ｔｘＴＡＬ２８Ｖ
、　１４．５時間 ６）　ニトロセルロースフィルターへの転写：　Ｅ、Ｍ
。

５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、
　９８．　ｐ、　５０３（１９７５）参照７）第一回プ
レハイゾリダイズ：　３０ａｌ　ＦＤ８８＊４２℃、６
時間 ８）　第一回ハイブリダイズ：　ｐＲｌＢ　（工程４で
得られたもの）の５′断片（５ｘ　１０’　ｃｐｍ　／
ｙｄ！　）を含む３０１１ＬＩＦＤ８８．４２℃、６時
間９）洗い＝２ＸＳ８０　０．１９Ｉ、８Ｄ８を用いて
里温で１０分間洗いを４回、続いてｌＸ８８０−０．１
％８Ｄ８を用いて５０℃で３０分間洗いを２回１０）　
ｇ光：　ＸＡＲ−５、−８０℃、２枚の増感紙１７．５
時間 １１）　洗い：　０．５Ｍ　ＮａＯＨ−１，５Ｍ　Ｎａ
０ｔで１分間、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１，５Ｍ　Ｎａ０
ｔで１分間、ａｘｓｓｃで１分間 １２）霧光：露光時間を１９時間とした以外は、上記１
０）と同じ操作 １３）　第３回プレハイブリダイズ＝フ）と同じ１４）
　第一回ハイブリダイズ：１）Ｂ２−フィンサート（工
程３で得られたもの）、４２℃、１６．５時間 １５）　洗い：９）と同じ １６）　１１１元：露光時間を１９．５時間とした以外
は、上記１０）と同じ操作 １７）　洗い：　１１）と同じ １８）真先：露光時間を２０時間とした以外は、上記１
０）と同じ操作 １９）　第３回プレハイブリダイズ：７）と同じ２０）
　第３回ハイゾリダイズ：　ｐＲ１８（工程４で得られ
たもの）の３′断片（４，５°Ｘ　１０’ｃｐｍ／−）
、４２℃、１５時間 ２１）　洗い：９）と同じ ２２）　露光＝ｌＯ）と同Ｂ 史に第４図に示したような制限酵素で切断し、制限酵素
地図を作製した。

制限酵素地図解析の結果を第４図に示した。

工程ｔ２（ｐｍｏｎプラスフラドＤＮＡ＃ｌｓ！酵素地
図）工程１１と同じ方法をｐ　ＨＧＢプラスミドＤＮＡ
のかわりにｐＲＧＢプラスミド“ＤＮＡを用いて、工程
１１で得られたｐＲＧＢの制限酵素解析を行った。得ら
れたｐＲＧＥ　ＤＮＡの制限酵素地図を第５図に示した
。

工程１３（ウサギＴＮＦ遺伝子と該生理活性物質遺伝子
の塩基配列の決定） 工程９で得られたＢ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＪＭ８３　
（ｓ）ＨＧＢ）株と工程１０で得られたＥ、　ｃｏｌｉ
　Ｋ１２　ＪＭ８３（ｐＲＧＥ）株に工程２と同様と操
作を行なった。そして、それぞれ１５０　μｆｆ）　ｐ
ＲＧＦｆシラスミドＤＮＡとｐ　ＨＧＥプラスミドＤＮ
Ａを得た。

ｐＲＧＦｉとＰＨＧＥの塩基配列はＭａｘｉｍ　−Ｇ　
１ｌｂｅｒｔ法（Ｍａｘａｍ　ｅｔ　＋　ａｌ、、　−
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ、Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５５．
　ｐ−４９０（１９８０）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　）によって決定した。

参考例１で決定したｐＲ−１８の塩基配列と、上で決し
たｐ　ＲＧＥの塩基配列を比較して、φす４ＴＮＦ遺伝
子の構造（エクソンとイントロン等）を解明した。ｐＲ
ＧＨＤＮ人インサートの構造は第５図に示した。続いて
、り　ＲＧＢとｐＨＧＢの塩基配列を比較して、相同性
とイントロン・エクソン境界付近の配列の相同性と類似
性を調べた。その結果該生理活性物質遺伝子の構造（エ
クソンとイントロン等）を解明した。該生理活性物質遺
伝子の構造を第４このようにして得られた、ウサ−ＴＮ
Ｐと該生理活性物質をコードする塩基配列を下に示す。

この塩基配列において、上の行はウサギＴＮＦ　ｔ−コ
ードする塩基配列（川を、下の行は該生理活性物質をコ
ードする塩基配列（６）を示す。

ＲＴＯＡ　ＧＯＴ　ＴＯＴ　ＯＧＧ　ＧＯＯＯＴＧ　Ａ
ＧＴ　ＧＡＨＴＯＡ　ＴＯＴ　ＴＯＴ　ＯＧＡ　ＡＯＯ
ＯＯＧ　ＡＧＴ　（）ＡＲＧＯＡ　ＡＡＯＣＯＧ　ＯＡ
Ａ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＯＧＯＯＡＨＧＯＡ　ＡＡＯＣＯ
Ｔ　ＯＡＡ　ＧＯＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＯＡＲ’ＧＯＧ
　ＡＡＯＧｏｏ　ＯＴＧ　ＯＴＧ　ＯＧＯＡＡＯＧＧＨ
ＧＯＯＡＡＴ　ＧＯＯＣＴＣ−ＯＴＧ　ＧＯＯＡＡＴ　
ＧＧＲＯＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＯＯＧ　ＧＯＯＧＡＯ
ＧＧＧ　ＯＴＨＯＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＯＯＡ　ＴＯ
Ａ　ＧＡＧ　ＧＧＯＯＴＲＯＴＯＴＴＯＡＧＯＧＧＴ　
ＯＡＡ　ＧＧＯＴＧＯＯＧＨＯＴＯＴＴＯＡＡＧ　ＧＧ
ＯＯＡＡ　ＧＧＯＴＧＯＣ０ＲＯＡＯＡＣＴ　ＧＴＯＡ
ＧＯＯＧＯＴＴＯＧＯＯ’ＧＴＨＯＡＯＡＯＯＡＴＯＡ
ＧＯＯＧＯＡＴＯＧＯＯＧＴ１’Ｌ　ＯＴＯＯＴＯＴＯ
Ｔ　ＧＯＯＡＴＯＡＡＧ　ＡＧＯ００ＨＯＴＯＣＴＣＴ
ＯＴ　ＧＯＯＡＴＯＡＡＧ　ＡＧＯ００ＲＧＡＧ　ＧＯ
Ｔ　ＧＡＧ　０００　ＡＴＧ　Ｇｏｏ　ＴＧＧ　ＴＡＨ
ＧＧＧ　ＧＯＴ　ＧＡＧ　Ｇｏｏ　ＡＡＧ　０００　Ｔ
ＧＧ　ＴＡＲＧＴＯＴＴＯＯＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　Ａ
ＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＨＧＴＯＴＴ（３０ＡＧ　ＯＴＧ　
ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＲＯＡＧ　ＯＯＴ　ＧＡ
Ｇ　ＴＡＯＯＴＧ　ＧＡＯＯＴＴ　ＧＯＨＯＧＧ　ＣＯ
ＯＧＡＯＴＡＴ　ＣＴＣＧＡＯＴＴＴ　ＧＯＲＧＧＧ　
ＡＴＯＡＴＴ　Ｇｏｏ　０ＴＧＨＧＧＧ　ＡＴＯ・　Ａ
７Ｔ　Ｇｏｏ　０ＴＧＯＡＡＧ　ＯＯＴ　ＯＴＡ　Ｇｏ
ｏ　ＯＡＯＧＴＡ　ＧＴＡＯＡＡＧ　ＯＯＴ　ＧＴＡ　
ＧＯＯＯＡＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡＯＯＴＯＯＡＧ　ＴＧＧ
　ＯＴＧ　ＡＧＯＯＡＧ　０ＧＴＧ　ＯＴＣＯＡＧ　Ｔ
ＧＧ　ＯＴＧ　ＡＡＯＯＧＯ０ＧＧＯＡＴＧ　ＡＡＧ　
ＯＴＯＡＯＧ　ＧＡＯＡＡＯ０ＡＧＯＧＴＧ　ＧＡＧ　
ＯＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＡＡＯ０ＡＧＧ　ＴＡＯＯＴ
ＯＡＴＯＴＡＯＴＯＯＯＡＧ　ＧＴＴＧ　ＴＡＯＣＴＣ
ＡＴＯＴＡＯＴｏｏ　ＯＡＧ　ＧＴＯＯＴｏｏ　・・・
　ＴＡＯＧＴＧ　ＯＴＯＣＴＣＡＣＴＯＴｏｅ　ＡＯＯ
ＯＡＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣＯＴＯＡＯＯＯＴｏｏ　ＴＡＯ
ＯＯＧ　ＡＡＯＡＡＧ　ＧＴＯＡＡＯＯＴｏｅ　ＴＡＯ
ＯＡＧ　ＡＯＯＡＡＧ　ＧＴＯＡＡＯＯＴＧＯＯＡＯＯ
ＧＧ　ＧＡＧ　ＡＯＯ０００ＧＡＧ　′ＯＴＧＯＯＡＧ
　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＯＯＯＯＡ　ＧＡＧ′、ＯＧＡＧ
　０００　ＡＴＯＴＡＯＯＴＧ　ＧＧＣＧＧＯＴ　ＧＡ
Ｇ　Ｃｏｏ　ＡＴＯＴＡＴ　ＯＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＧｏ
　０ＧＧ　ＣＴＣＡＧＯＡＯＯＧＡＧ　ＧＴＯＡＡＯｏ
　０ＧＡ　ＣＴＣＡＧＯＧＯＴ　ＧＡＧ　ＡＴＯＡＡＴ
ＯＧＡＧ　ＴＯＯＧＧＧ　ＯＡＧ　ＧＴＯＴＡＯＴＴＴ
ＯＧＡＧ　ＴＯＴ　ＧＧＧ　ＯＡＧ　ＧＴＯＴＡＯＴＴ
Ｔ工程１４ （オリビデオキシヌクレオチドの合成）コハク酸残基を
介して約２μＭのデオキシ　ヌクレオチドが結合してい
るポリスチレン樹脂２０■を、上下にステンレススチー
ル族のフィルターのついた５００ｍ容量の反応容器に装
填した。樹脂は１Ｍ臭化亜鉛ジクロルメタン−イソプロ
パツール溶液（ｓｓ：１５）で処理してジメトキシトリ
チル（ＤＭＴ）保護基を除き、ジクロルメタン−インプ
ロａｅ）−ル（８５：１５）、次いでジメチルフォルム
アミド、ピリジン史にアセトニトリルで洗浄し、窒素気
流で乾燥した。次いで採種ヌクレオチドジエステル（２
０μＭ）およヒ、メシチレンスル７オニルニトロトリア
ゾール（６０μＭ）の乾燥ピリジン溶液２００μｔを加
えた。４５０℃で２０分間反応せしめた後、反応液を除
去し、乾燥ピリジンで樹脂洗浄後、ピリジン中の無水酢
酸で未反応の残漬を保論啼　した。この、脱保護及び縮
合のサイクルを繰シ返して、所望のオリゴデオキシヌク
レオチＰを合成した。合成終了後、樹脂をと９出し、保
護基除去および樹脂からの切断反応、樹脂との分離処理
をしたのち、精製を行った。上記のオリノデオキシヌク
レオチＰの合成および精製は伊東ら（Ｎａｃ。

ａｃ、　Ｒｅｓ、　１０巻１７５５頁（１９８２）　）
の方法に従って実施した。このようにして下記の如きオ
リゴデオキシヌクレオチドが得られた。

１　）　５’−ＡＴＴＯＡＴＧＴＯＡＴＯＴＴＯＴＯＧ
ＡＡＯＯＣＣＧＡＧＴＧＡＯＡＡ−３’工程１５ （＃生理活性物質の遺伝子を含むＭ１３ｍｐ９−ＨＧｇ
の調製） フラスミｒ　ｐＨＧＥ（１０１ｉｔ）をＦｉｃｏＲＩ（
２０ｕ）で消化し、１％の低融点アガロースゲル電気泳
動の後２．９　ｋｂの７２グメントを切出し溶出した。

この７ラグメントをＭ１３ｍｐ９ファージの複製型（ｒ
ｅｐｌｉｃａｔｉｖｅｆｏｒｍ）のＢｃｏＲＩフラグメ
ント中へ挿入した。

ＥｃｏＲＩフラグメントを挿入されたＤＮＡはＢＲＩ、
社の手引書（Ｕｓｅｒ　ｍａｎｕａｌ　／Ｍｌ　３ｍｐ
　７　ｃｌｏｎｉｎｇ　／’Ｄｊｄｅｏｘｙｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ、　１９８０　）に従いＢ、　ｃｏｌｉ　Ｊ
Ｍ１０３を形質転換した。生成物をＭ１３ｍｐ９−ＨＧ
Ｂと命名した。

工程１６ （Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＥ−重鎖ＤＮＡとプリーターＥ３
−４を用いる、イントロン３の除去） Ｍ１３ｍｐ９−ＨＧＢ　Ｉｆ鎖ＤＮＡ　１ｉＢＲＬ社使
用者のｓｅｑｕｅｎｃｌｎｇ、　１９８０　）に従って
調製された。工程１４で調製されたオリビデオキシヌク
レオシＦ４）３’−ＡＯＡＴＯＧＧＧＴＡ（３ＡＡＯＡ
ＴＯＧＴＴＴ圓弘ＧＴＴＯＧＡＯＴ　−５’をイントロ
ン３のプリーターとして用いた。イントロン３のプリー
ターをＥ３−４と命名した。

プリーターＥ３−４は、除去されるべきイントロン３の
前方（即ちエキソン３）、及び後方（即ちエキソン４）
に対し相補的な配列を有している。

イントロン３の除去はＷａ　１１　ａｃｅらの方法（８
ｃｅｅｎｃｅ　。

２０９；１３９６（１９８０）〕に従い、次の如く行っ
た。

Ｂ３−４　（１０４ｎｆ、　１５　ｐｍｏｌｅ）は、Ｔ
４キナーゼ（ｔｏｓ単位）およびＡＴＰ　（３ｍＭ　）
を用いてリン酸化され、鋳型Ｍｌ　３ｍｐ　９−ＨＧＢ
　（１，６５μ？、　０．５ｐｍｏｌｅ）に加えられた
。反応混合物は６５℃、６５分間加熱し、５分間室温に
冷却し、更に氷水中で冷却した。各０．４ｍＭのｄＡＴ
Ｐ　、　ｄＯＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＴＴＰおよび
ＡＴＰ溶液に対し、クレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏ
ｗｆｌａｇｍｅｎｔ　）　５単位、Ｔ４リガーゼｌＯ単
位を含むＨｉｎ緩衝液！：Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃ、
　Ａｃ、　Ｒｅｓ、　９巻３６４７頁（１９８１年）〕
、１１０ｍＭリス−塩＃Ｒ（ｐＨ７，２）、２　ｍＭ　
ＭｇＯ１意及び１ｍＭメルカプトエタノールを含む溶液
を加えた。反応混合物（最終容量５０μｔ）を４℃で３
０分間及び室温で３０分間、インキュ（−トした。オリ
ゴヌクレオチドをゾライマーとして二重鎖合成されたＤ
ＮＡ　ｌｌ″ｔ、　ＢＲＬ社の使用者の手引（Ｕｓｅｒ
　ｍａｎｕａｌ　／Ｍｌ　３ｍｐ　７．０１ｏｎｉｎｇ
　／　ｂｉｄｅｏｘｙ’ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　１９
８０　（に従って、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３に感染
せしめた。このようＫして得られたゾラークを、ＹＴプ
レ２ト（Ｊ＋Ｈ，ｍ１ｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｅｓ、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　（１９７２年）４３３頁〕に移した。得られた
コロニーを、３２ＰラベルされたＥ３−４と５５℃、２
時間の条件でハイブリダイズさせた。イントロン除去工
程の結果得られる各種生成物の内から、所望の配列を有
するＤＮＡを得るためのプリータとして、ここでは、プ
リーターＢ５−４それ自身を利用した。かくしてプリー
ターＢ５−４がノ・イブリダイズするコロニーを得、更
にファージを取得した。

得られたファージをプレートにまき、得られたゾラーク
をＹＴプレートに移した。ここで再びＵｐで放射ラベル
したＥ３−４と５５℃、２時間ハイブリダイズせしめた
。強くノ・イブリダイズするクローンから、ファージＤ
ＮＡを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が完全
に除去されているファージを選択し九。このようなファ
ージの１つをｍｐ９−ＨＧＲΔ３−１と命名した。

工程１７ （ｐＨＴＮＦ−１ａｃ　ＵＶ５−２の構築）ｍｐ　９−
ＨＧＢΔ３−１の複製型（ｒｅｐｌｊｃａｔｕｉｅ　ｆ
ｏｒｍ　）をＢｃｏＲＩで切断し、電気泳動によシ単離
した。この断片をＥｃｏＲＩで切断したｐＢＲ３２７に
挿入し、プラスミドｐＨＧＢΔ３−１を得た。

以下ニｉ　ラスミ）’　ｐＨＧＥΔａ−１を用い、１ａ
ｃＵＶ５をプロモーターとして該生理活性物質を大腸菌
中で、直接発現させることのできるシラスミドの構築を
示す。この構築方法は第７図に示される。

まず１０μｔのシラスミドｐＨＧＢΔ３−１なｌＯ単位
の人マ１工とＦｌｃｏＲＩ　（ＢＲＬ社、米国）と３７
℃、２時間切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
目的フラグメントを単離した。約１μｔの断片がグルよ
シ回収された。工程１４と同じように第７図に示される
２種のオリノデオキシヌクレオチＰ即ち ダＡＡＴＴＯＡＴＧＴＯＡＴＯＴＴＯＴＯＧＡＡＯＯ−
ａ’　及び鵠　ＴＯＧＧＧＧＴＴＯＧＡＧＡＡＧＡＴＧ
ＡＯ人ＴＧ−３’を合成した。次いで（文献（３）　１
２２頁の方法に従いこの２本のオリゴヌクレオチド（約
１００ｐｍ１００ｐの５′端をリン酸化した。反応後、
フェノール・クロロホルムで抽出した。かくして得られ
た合成オリゴマーと、上記で得られたｐ　ＨＧＨΔ３−
１のＡｖａ）−Ｅｃｏ几Ｉ断片とを混合し、エタノール
沈澱した後、文献（１）３７真の方法に従って１（）単
位のＴ４リガーゼを用い４℃１夜で結合せしめた。反応
終了後、混合物はエタノール沈澱し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により目的断片を単離した。

プラスミドｐＯＰ９５−１５はＦ、　Ｆｕｌｌｅｒの方
法（Ｇｅｎｅ　１９巻４２〜５４負（１９８２年）〕に
より調製した。

ｐＯＰ９５−１５　（Ｄ　１　μｔをＥｃｅＲＩ　”ｔ
’消化り、テア＄ノール抽出、クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱をして調製したベクター０．５μｔと、上記
の如く得た断片を、’ｒ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
した。実験＊（４）、２０頁に従って、Ｂ、　ｃｏｌｌ
　ＪＭＩ　０１　（Ａ’ｌ’００３３８７６）を形質転
換して１　ｍＭ　ＩＰＴＧ及び０．００４％（Ｗ／Ｖ　
）　ｘ−ｇａＬを含む寒天培地上に約１００個の白色コ
ロリーを得た。

これらの形質転換体からシラスミドＤＮＡを調整し、Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、目的のｐｉｃｏＲＩ断　片を有する
プラスミド全同定した。史にこれらのプラスミドをＰｖ
ｕｌとＰｓｔｌで消化して１．５アガロースゲル電気泳
動を行った結果的１０８０ｋｂ及び約２６００ｋｂの断
片を有し、ｔａｃ　ＵＶ５プロモーターの下流に正しく
該生理活性物質遺伝子が接続されているシラスミドを選
択した。

塩基配列を決定したところ、２コのシラスミドにおいて
、合成オリゴヌクレオチＰ及び染色体由来のＤＮＡが正
しく接続されていることが示された得られたプラスミド
をｐＨＴＮＦ−ｔａｃＵＶ５−２と命名した。

９ＨＴＮＦ　−１ａｃ　ＵＶ５−２を含有する大腸菌を
、通常の培地で培養した。生成物の該生理活性物質の活
性を測定したところ、ｐＴＮＦ−ｔａｃＵＶ５−１　（
ウサギＴＮＦを発現する）を含有する大腸菌の生産物と
同様の活性を示すことが判明した。

参考例３ 参考例２における工程１から１４に従って調整されたプ
ラスミドｐＨＧＢとオリゴヌクレオチドｌ−４を用いて
、ｐＨＴＮＴ　−Ｌａｃ　ＵＶ　５−１をＩＩＩ整する
方法を第６図に示し友。

実施例１、 参考例３で調製した遺伝子組換体ｐＨＴＮＦ−１ａｃＵ
Ｖ５−１を含有する大腸菌を、通常の方法で培養した。

次いで目的とする該生理活性物質が生産されるよう誘導
操作を行ない、さらに培養を行なって該生理活性物質を
含有する大腸菌を得た。遠心分離によシ菌体を集め、該
菌体を０．０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）　
１１中で超音波破砕し、該生理活性物質を含む菌体抽出
溶液を得た。この溶液は４．５Ｘ１０’Ｕ／Ｌｌノ活性
’を示り、、比活性ｉ３．０Ｘ１０’Ｕ／ＩＩｖであっ
た。

次いで該抽出溶液を、０．０４Ｍ　）　リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で十分平衡化したＤｇＡＥ−セファロ
ースｃＬ−６Ｂ（ファルマシア社、スウェーデン）のカ
ラムに、冷加した。０．０４Ｍ　）　ＩＪスス−酸緩衝
液（ｐＨ８−０）で洗浄後、０．ＩＭｊｌｊｉ化す）　
ＩＪウム會含む０．０４Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
ｓ、ｏ　）を用いて溶出した。活性画分を限外ろ過によ
シ濃動して、比活性４．ＯＸ　１０’　Ｕ／１＋９の粗
精製溶液を得た。

該粗精製溶液を、０．１５Ｍ塩化す）　ＩＪウムを含む
５　ｍＭリン酸緩衝液（１）Ｈ７，４）で平衡化したセ
ファ□　クリル８−２００（ファルマシア社、スウェー
デン）のカラムに添加し、同級＠液にてゲルろ過を行な
った。活性画分を限外ろ過により濃縮して比活性７．０
Ｘ１０’Ｕ／ηのｎ４＆！該生理活性物質溶液を得た。

この精製溶液より、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５
　ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＨ７，４）を希釈液として用
いて、１２０Ｕ／−の活性を有する該生理活性物質溶液
を調製し以下の実験に供した。

該溶液に各種製置のヒト血清アルブミンおよびウシ血清
アルジミンを添加し、４℃で保存し、経時的（２日、７
日、３０日日月に、本明細書中に記載したｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏおよびｉｎマｉマＯ評価法で残存活性を測定した。

ｉｎマＩｒｏ法の場合は、得られた測定値より残存活性
率（％）を算出した。結果は他の実施例の結果と共に表
５に示す。また第８図にヒト血清アルブミンの各種添加
濃度に対する７日間保存後の残存活性重金しめす。なお
、ｉｎ　ｖｌｖｏ評価の場合は、該処理溶液を限外ろ過
濃縮装置。ミニモ・ジュールＮＭ−３，（旭化成工業社
、フナコシ薬品販売）にて２０倍濃縮し、１匹当たシ０
．５ｄを尾静脈に投与し、投与後２４時間目の壊死の程
度を５匹１群で観察した。

実施例２ 実施例１と同様の活性濃度を有する該生理活性物質溶液
１に調製し、各糧濃度のヒト血清アルブミンを添加し、
凍結（−７０Ｃ）と融解を繰り返しく１回、３回）、そ
の残存活性をｉｎ　ｖ口ｒｏ評価法で測定した。また、
該溶液を一７０’Ｃに凍結後、凍結乾燥機で凍結乾燥を
行ない、次いで、該凍結乾燥品を１週間室温で放置後、
滅菌蒸留水を加えて溶解し、残存活性率をｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ評！でめた。なお、該凍結乾燥品は、実施例１と同
様にｉｎ　ｖｉｖｏ評価を行ない、制癌効果に９いても
確認をした。結果を表５に示す。

実施例３ 実施例１と同様な方法で、アルジミンの代ゎ夛にゼラチ
ンを用いてその安定化効果も調べた。結果を表５に示す
。

実施例４ 実施例２と同様な方法で、アルジミンの代わりにゼラチ
ンを用いてその安定化効果も詞ぺた。結果を表５に示す
。

比較例 実施例１と同様の活性濃度を有する該生理活性物質溶液
に、通常の生理活性物質の溶液安定化剤としてよく知ら
れている各種アミノ酸、金属塩類およびキレート剤を添
加し、４℃で７日間保存後の残存活性率をｉｎマロｒｏ
評価によりめた。結果を表６に示す。

以上の実施例、比較例から明らかなように、本発明の安
定化法によれは、溶液状態での保存、凍結融解、凍結乾
燥などの操作時において、該生理活性物質の活性を安定
的に保持することが可能であり、該生理活性物質製造時
の精製工程、製剤化工程ガどへの応用はもちろんのこと
、製品化した際の製品安定化をも保証するものである。

以下余白 表　６　比較例

【図面の簡単な説明】

第１図は、ウサギＴＮＦの遺伝子上含有するゾジスミド
の制限酵素切断地図を示す。第２図は、ｐＴＮＦ−１ａ
ｃ−１１の調製方法を示すフローシートであり、第３図
は、ｐＴＮＦ　−１ａｃＵＶ５−１１の調製方法を示す
フローシートである。第４図は、本発明の生理活性物質
遺伝子の構造を示す。第５図は、ウサ４？ＴＮＦ遺伝子
の構造を示す。第６図は、ｐＨ’Ｉ’ＮＦ−１ａｃＵＶ
５−１０詞染方法を示す７０−シートであシ、第７図′
は、ｐＨＴＮＦ　−１ａｃＵＶ５−２の調製方法を示す
フローシートである。ｗ、８図はヒト血清アルブミンの
添加１度に対する、４℃で７日間保存後の該生理活性物
質の残存活性率との関係を示すグラフである。 特許出願人　旭化成工業株式会社 第７図 ？’ＶＬＩｕ 第８図 じトｍ済アルグミン細１１ノｋ　（７ｑ／ｍＬ）手続補
正書（自発） 昭和５９年９月ｌ？日 □ 特許庁長官志　賀　学　殿　・□ ζ Ｌ　事件の表示　昭和５９年特許願第１１５４９６号、
　゛　、 λ　発明の名称　 １、 遺伝子組換体が生産する生理活性物質の安定化法ａ　補
正をする者　□　゛　□ 事件との関係　特許出願人　゛ 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号　、。 屯　補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ５、補正の内容 Ｄ）　明細書第１頁第１８行〜１９行［化法に関するも
のである。−一一一一本文記載の方法により」′を「化
法、に関す□るものである。すなわちその性質とは、本
文記載の方法により」と訂正する。 （２）同書第３頁第１８行〜１９行「高純度にもか　、
かわらず、」、を削除する。 （３）図書−４頁第１０行〜１１行「質の安定化法であ
る。−一一一一本文記載の方法により」を［質の安定化
法である。すなわちその性質とは、本文記載の方法によ
り」と訂正する。　、箔引　同書第、１２−第８行「宿
生」を「宿主」と訂　□。 ゛　正する。　、 司書同頁第１５行「開始」を「開始」と訂正（６）　同
書第２５頁第５行［Ｈａｒｂｏｖ　Ｊをｒ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｊと訂正する。 ″（７）′　同書第３０頁第５行ｒＲＰＭＩ　１５４０
　ＪをＰＭＩ　１６４０　Ｊと訂正する。 司書第３６頁第７行ｒ　Ｅ、ｃｏｌｉＫ−１２株」をｒ
　Ｅ、ｃｎｌｉ　Ｋ−１２株」と訂正する。 （９）　同書第４３頁下から第５行「実験（３）」を「
実験書（３）」と訂正する。 （ｌＯ）同書第５９頁第１０行［Ｃｈａｒｏｍ　Ｊを［
ＣｈａｒｏｎＪと訂正する。 （１１）同書同頁第１９行ｒＥｃｏｌｉＪを［Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　Ｊと訂正する。 （１２）同書第６６頁第１７行「ブロム」を「ブロス」
と訂正する。 （１８）同書第６８頁第１７行「溶わし」を「溶かし」
と訂正する。 （１４）同書第８０頁第１６行「ｒｅｐｌｉｃａｔｕｉ
ｅ　Ｊをｒ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ　Ｊと訂正する。 以上 り 手続補正書（自発） 昭和６０年２月６日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１１５４９６号 ２、発明の名称 遺伝子組換体が生産する生理活性物質の安定化法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号４、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ５、補正の内容 （１ン　明細書第７頁第３行ｒＴＧＧ　ＣＣＣ・・・」
をｒＴＧＣＣＣＣ・・・」に訂正する。 （２）同第７頁第４行ｒＡＴＧ　ＡＧＣ・・・」を「Ａ
ＴＣＡＧＣ・・・」に訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 遺伝子組み換え体により生産され、ＬＭ細胞に対して細
   胞障害活性を有し、かつＭｅｔｈ　Ａ　Ｓａｒｃｏｍａ
   癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合に
   その腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性質を有す
   る生理活性物質に、アルブミンまたはゼラチンを添加す
   ることを特徴とする該生理活性物質の安定化法