JPH0926424A - 重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキット - Google Patents
重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキットInfo
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- JPH0926424A JPH0926424A JP8154101A JP15410196A JPH0926424A JP H0926424 A JPH0926424 A JP H0926424A JP 8154101 A JP8154101 A JP 8154101A JP 15410196 A JP15410196 A JP 15410196A JP H0926424 A JPH0926424 A JP H0926424A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 重症筋無力症診断のための改良された免疫化
学的アッセイ系を提供すること。 【解決手段】 重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自己抗体を
検出する方法であって、重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自
己抗体を含むと疑われる試料を固相結合ＡＣｈＲととも
にインキュベートする；および該インキュベートにより
ＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターを測
定する；の各工程を含み、該ＡＣｈＲがＴＥ６７１系の
細胞に由来することを特徴とする方法。
学的アッセイ系を提供すること。 【解決手段】 重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自己抗体を
検出する方法であって、重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自
己抗体を含むと疑われる試料を固相結合ＡＣｈＲととも
にインキュベートする；および該インキュベートにより
ＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターを測
定する；の各工程を含み、該ＡＣｈＲがＴＥ６７１系の
細胞に由来することを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は重症筋無力症（ｍｙ
ａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）の診断のための免疫
化学的アッセイ法に関するものである。
ａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）の診断のための免疫
化学的アッセイ法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】重症筋無力症は自己免疫病の一つであ
る。該疾患にかかった患者は、神経筋接合部のアセチル
コリン受容体上の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対す
る自己抗体を生成する。該自己免疫応答は、神経筋伝達
を損なう。該神経筋伝達減損が、該疾患の特徴である筋
肉の弱化および易疲労性の原因となる。
る。該疾患にかかった患者は、神経筋接合部のアセチル
コリン受容体上の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対す
る自己抗体を生成する。該自己免疫応答は、神経筋伝達
を損なう。該神経筋伝達減損が、該疾患の特徴である筋
肉の弱化および易疲労性の原因となる。
【０００３】参照によりここに含めるものとする、米国
特許第４，２０２，８７５号およびＲＥ３０，０５９号
に於いて、重症筋無力症の診断のための生化学的アッセ
イ法が示されている。
特許第４，２０２，８７５号およびＲＥ３０，０５９号
に於いて、重症筋無力症の診断のための生化学的アッセ
イ法が示されている。
【０００４】上記特許によるアッセイ法は、重症筋無力
症患者の血清由来の受容体タンパク質に対する自己抗体
と複合体を形成している標識アセチルコリン受容体タン
パク質の、抗ヒト免疫グロブリンとの免疫沈降を含む。
使用されるアセチルコリン受容体タンパク質（ａｃｅｔ
ｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ，以下“ＡＣｈＲ”とする）は、哺乳類筋肉の粗抽出
液の一部である。該アッセイ法におけるＡＣｈＲの標識
は、粗抽出液中の該タンパク質に、放射性標識したナジ
ャ・ナジャ・シアメンシス毒（Ｎａｊａｎａｊａ ｓｉ
ａｍｅｎｓｉｓｔｏｘｉｎ）やアルファ−ブンガロトキ
シンなどのクラーレ様神経毒素を結合させることにより
行なう。上記毒素は、該タンパク質上のアセチルコリン
結合部位に結合することによってＡＣｈＲと複合体を形
成する。
症患者の血清由来の受容体タンパク質に対する自己抗体
と複合体を形成している標識アセチルコリン受容体タン
パク質の、抗ヒト免疫グロブリンとの免疫沈降を含む。
使用されるアセチルコリン受容体タンパク質（ａｃｅｔ
ｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ，以下“ＡＣｈＲ”とする）は、哺乳類筋肉の粗抽出
液の一部である。該アッセイ法におけるＡＣｈＲの標識
は、粗抽出液中の該タンパク質に、放射性標識したナジ
ャ・ナジャ・シアメンシス毒（Ｎａｊａｎａｊａ ｓｉ
ａｍｅｎｓｉｓｔｏｘｉｎ）やアルファ−ブンガロトキ
シンなどのクラーレ様神経毒素を結合させることにより
行なう。上記毒素は、該タンパク質上のアセチルコリン
結合部位に結合することによってＡＣｈＲと複合体を形
成する。
【０００５】上述の特許で述べられているアッセイ法
は、商業的使用が広く行なわれ、現状では重症筋無力症
の診断で推奨されるアッセイ法であるが、多くの欠点も
含んでいる。上記アッセイで用いられるＡＣｈＲの望ま
しい素材は、ヒトの切断された足の筋肉である。該組織
は、供給量が少なく、多くの法的な難点のため、入手可
能な場合でも商業的使用のために得ることが困難であ
る。さらに、該タンパク質は健康な、切断されていない
組織でさえ非常に低濃度でしか存在しておらず、また、
切断された組織から該タンパク質を含む筋肉の粗抽出液
を分離する前に不可避的に該タンパク質の実質的なタン
パク質分解反応が起こるため、アッセイに適当なＡＣｈ
Ｒは組織から非常に少量にしか得ることができない。他
の、より豊富な、ＡＣｈＲのための哺乳動物筋肉源も入
手可能である；しかし、これらの他の筋肉源は、ヒトの
足筋肉源における、少量しか得られないことやタンパク
質分解などの欠点を完全に解消するわけではなく、より
重要なことには、ヒトＡＣｈＲに対するヒト自己抗体が
他の哺乳動物由来ＡＣｈＲと低頻度でしか交叉反応しな
い（例えば、ヒト足筋肉ＡＣｈＲの典型的な代用物であ
る、除神経ラット筋肉由来ＡＣｈＲの場合には、わずか
に２．１％程度まで）ため、非ヒト供給源由来ＡＣｈＲ
は該アッセイにはより適していない。
は、商業的使用が広く行なわれ、現状では重症筋無力症
の診断で推奨されるアッセイ法であるが、多くの欠点も
含んでいる。上記アッセイで用いられるＡＣｈＲの望ま
しい素材は、ヒトの切断された足の筋肉である。該組織
は、供給量が少なく、多くの法的な難点のため、入手可
能な場合でも商業的使用のために得ることが困難であ
る。さらに、該タンパク質は健康な、切断されていない
組織でさえ非常に低濃度でしか存在しておらず、また、
切断された組織から該タンパク質を含む筋肉の粗抽出液
を分離する前に不可避的に該タンパク質の実質的なタン
パク質分解反応が起こるため、アッセイに適当なＡＣｈ
Ｒは組織から非常に少量にしか得ることができない。他
の、より豊富な、ＡＣｈＲのための哺乳動物筋肉源も入
手可能である；しかし、これらの他の筋肉源は、ヒトの
足筋肉源における、少量しか得られないことやタンパク
質分解などの欠点を完全に解消するわけではなく、より
重要なことには、ヒトＡＣｈＲに対するヒト自己抗体が
他の哺乳動物由来ＡＣｈＲと低頻度でしか交叉反応しな
い（例えば、ヒト足筋肉ＡＣｈＲの典型的な代用物であ
る、除神経ラット筋肉由来ＡＣｈＲの場合には、わずか
に２．１％程度まで）ため、非ヒト供給源由来ＡＣｈＲ
は該アッセイにはより適していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】免疫化学的アッセイに
適当なヒト筋肉ＡＣｈＲの供給量に制限があることによ
り、上記特許で示された筋肉粗抽出液を用いた免疫沈降
アッセイによる以外の、ヒト血清中の重症筋無力症関連
自己抗体のアッセイを行なうことは、実際的ではない。
ヒト筋肉ＡＣｈＲと実質的に同程度にヒト筋肉ＡＣｈＲ
に対するヒト自己抗体と反応する、より豊富なＡＣｈＲ
源が容易に入手できることは、固相法および酵素結合性
イムノソルベントアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩ
ＳＡ）などの、重症筋無力症診断のための、他のより感
度の高い免疫アッセイ法を実行可能にするであろう。
適当なヒト筋肉ＡＣｈＲの供給量に制限があることによ
り、上記特許で示された筋肉粗抽出液を用いた免疫沈降
アッセイによる以外の、ヒト血清中の重症筋無力症関連
自己抗体のアッセイを行なうことは、実際的ではない。
ヒト筋肉ＡＣｈＲと実質的に同程度にヒト筋肉ＡＣｈＲ
に対するヒト自己抗体と反応する、より豊富なＡＣｈＲ
源が容易に入手できることは、固相法および酵素結合性
イムノソルベントアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩ
ＳＡ）などの、重症筋無力症診断のための、他のより感
度の高い免疫アッセイ法を実行可能にするであろう。
【０００７】重症筋無力症患者の筋肉の弱さの重症度
は、患者の血清中の抗ＡＣｈＲ抗体濃度と密接に関連し
ているわけではない。これは恐らく、これらの抗体が伝
達を減損させる多様で複雑な機構（抗原による免疫調製
による受容体数の減少、補体媒介集中性分解、結合した
抗体によるＡＣｈＲ機能の直接的低下）、および、神経
筋伝達の性質（伝達を確実にするための大きな安全係数
を持つ“全か無か”の形式で起こる）、および、低下し
た神経筋伝達を補うために体内で行なわれ得る複雑な適
応機構（アセチルコリン放出の増加、神経筋接合部領域
の増大）に主によるものであろう。
は、患者の血清中の抗ＡＣｈＲ抗体濃度と密接に関連し
ているわけではない。これは恐らく、これらの抗体が伝
達を減損させる多様で複雑な機構（抗原による免疫調製
による受容体数の減少、補体媒介集中性分解、結合した
抗体によるＡＣｈＲ機能の直接的低下）、および、神経
筋伝達の性質（伝達を確実にするための大きな安全係数
を持つ“全か無か”の形式で起こる）、および、低下し
た神経筋伝達を補うために体内で行なわれ得る複雑な適
応機構（アセチルコリン放出の増加、神経筋接合部領域
の増大）に主によるものであろう。
【０００８】重症筋無力症患者においては、自己抗体は
ＡＣｈＲの多様な領域上の多様なエピトープに結合す
る。これらの領域のひとつは、“主要免疫原領域”と呼
ばれる。この領域はＡＣｈＲのアルファ−サブユニット
の細胞外表面上に位置する。これらの領域の別のもの
は、アセチルコリン（以下“ＡＣｈ”）結合部位であ
り、これもまたアルファ−サブユニット上に位置してい
る。平均的な重症筋無力症患者では、約半分の抗ＡＣｈ
Ｒ自己抗体が主要免疫原領域に対するものである。主要
免疫原領域に結合する自己抗体は抗原による免疫調製を
引き起こし、生体内で補体を固定することができ、それ
によってＡＣｈ受容体数を減少させる。ＡＣｈ結合部位
に対する抗体は、非常に低濃度で、神経筋伝達における
ＡＣｈＲ機能を即時に低下させるのに極めて効果的であ
ると考えられる。重症筋無力症患者の血清中の全抗ＡＣ
ｈＲ抗体濃度だけでなく、ＡＣｈＲの主要免疫原領域お
よびＡＣｈ結合部位に対する、これらの抗体の一部を測
定することが可能となることは、有用であろう。
ＡＣｈＲの多様な領域上の多様なエピトープに結合す
る。これらの領域のひとつは、“主要免疫原領域”と呼
ばれる。この領域はＡＣｈＲのアルファ−サブユニット
の細胞外表面上に位置する。これらの領域の別のもの
は、アセチルコリン（以下“ＡＣｈ”）結合部位であ
り、これもまたアルファ−サブユニット上に位置してい
る。平均的な重症筋無力症患者では、約半分の抗ＡＣｈ
Ｒ自己抗体が主要免疫原領域に対するものである。主要
免疫原領域に結合する自己抗体は抗原による免疫調製を
引き起こし、生体内で補体を固定することができ、それ
によってＡＣｈ受容体数を減少させる。ＡＣｈ結合部位
に対する抗体は、非常に低濃度で、神経筋伝達における
ＡＣｈＲ機能を即時に低下させるのに極めて効果的であ
ると考えられる。重症筋無力症患者の血清中の全抗ＡＣ
ｈＲ抗体濃度だけでなく、ＡＣｈＲの主要免疫原領域お
よびＡＣｈ結合部位に対する、これらの抗体の一部を測
定することが可能となることは、有用であろう。
【０００９】上述の特許によるアッセイ法は、筋肉ＡＣ
ｈＲのＡＣｈ結合部位に結合する、放射性標識した毒素
と、筋肉ＡＣｈＲとを結合させることにより該タンパク
質を高比活性で標識することによっている。上記アッセ
イ法では、結合部位およびその近傍領域が毒素によって
遮断され、それによって結合部位のエピトープ、および
その近傍の他のエピトープが自己抗体による結合を受け
られなくなるため、前記特許のアッセイ法では、ＡＣｈ
結合部位に対する自己抗体を特異的にアッセイすること
は不可能であった。ここに示す本発明は、実際的な目的
では、ヒト筋肉ＡＣｈＲと免疫学的に区別できず、容易
に単離できる、多量のＡＣｈＲの供給源の発見に基づ
き、自己抗体の結合によってＡＣｈＲ上の一部のエピト
ープが遮断されない免疫アッセイ法を実行可能にする。
従って、本発明によれば、診断が可能である、患者血清
中の抗ＡＣｈＲ自己抗体の全濃度のみでなく、患者の疾
患のより詳しい解析や疾患の治療法計画の基礎の改善を
可能とするような、ＡＣｈＲの病理的に特徴的な部位に
対するこれらの抗体の一部を測定することが可能とな
る。
ｈＲのＡＣｈ結合部位に結合する、放射性標識した毒素
と、筋肉ＡＣｈＲとを結合させることにより該タンパク
質を高比活性で標識することによっている。上記アッセ
イ法では、結合部位およびその近傍領域が毒素によって
遮断され、それによって結合部位のエピトープ、および
その近傍の他のエピトープが自己抗体による結合を受け
られなくなるため、前記特許のアッセイ法では、ＡＣｈ
結合部位に対する自己抗体を特異的にアッセイすること
は不可能であった。ここに示す本発明は、実際的な目的
では、ヒト筋肉ＡＣｈＲと免疫学的に区別できず、容易
に単離できる、多量のＡＣｈＲの供給源の発見に基づ
き、自己抗体の結合によってＡＣｈＲ上の一部のエピト
ープが遮断されない免疫アッセイ法を実行可能にする。
従って、本発明によれば、診断が可能である、患者血清
中の抗ＡＣｈＲ自己抗体の全濃度のみでなく、患者の疾
患のより詳しい解析や疾患の治療法計画の基礎の改善を
可能とするような、ＡＣｈＲの病理的に特徴的な部位に
対するこれらの抗体の一部を測定することが可能とな
る。
【００１０】マクアリスター（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ）
ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２０、２０６−２１２
（１９７７）は、ヒト小脳髄芽細胞腫由来の、ＴＥ６７
１、サブラインＮｏ．２と呼ばれる細胞系の確立を報告
した。上記およびそれと同等のＡＣｈＲ産生細胞系を本
明細書では“ＴＥ６７１系”と呼ぶ。
ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２０、２０６−２１２
（１９７７）は、ヒト小脳髄芽細胞腫由来の、ＴＥ６７
１、サブラインＮｏ．２と呼ばれる細胞系の確立を報告
した。上記およびそれと同等のＡＣｈＲ産生細胞系を本
明細書では“ＴＥ６７１系”と呼ぶ。
【００１１】シアピン（Ｓｙａｐｉｎ）ら、Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３１、３６５−３７７（１９８
２）は、ＴＥ６７１系細胞は哺乳類神経ニコチン性アセ
チルコリン受容体を有するものとして特徴づけた。本分
野では、上記受容体タンパク質は、重症筋無力症自己抗
体が反応するＡＣｈＲとは免疫学上実質的に異なる（す
なわち、低い免疫学的交叉反応性を有する）と考えられ
ている（すなわち、神経性ＡＣｈＲと筋肉性ＡＣｈＲに
対する抗体は互いにほとんど、あるいは完全に交叉反応
性を持たないと考えられている）（パトリック（Ｐａｔ
ｒｉｃｋ）とスタルカップ（Ｓｔａｌｌｃａｐ）、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）
７４、４６８９（１９７７）；スワンソン（Ｓｗａｎｓ
ｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８０、４５３２（１９８３）；スミス
（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
５、２７２６（１９８５））。
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３１、３６５−３７７（１９８
２）は、ＴＥ６７１系細胞は哺乳類神経ニコチン性アセ
チルコリン受容体を有するものとして特徴づけた。本分
野では、上記受容体タンパク質は、重症筋無力症自己抗
体が反応するＡＣｈＲとは免疫学上実質的に異なる（す
なわち、低い免疫学的交叉反応性を有する）と考えられ
ている（すなわち、神経性ＡＣｈＲと筋肉性ＡＣｈＲに
対する抗体は互いにほとんど、あるいは完全に交叉反応
性を持たないと考えられている）（パトリック（Ｐａｔ
ｒｉｃｋ）とスタルカップ（Ｓｔａｌｌｃａｐ）、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）
７４、４６８９（１９７７）；スワンソン（Ｓｗａｎｓ
ｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８０、４５３２（１９８３）；スミス
（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
５、２７２６（１９８５））。
【００１２】ｍＡｂ３５と呼ばれるものを含む、筋肉Ａ
ＣｈＲの主要免疫原領域に対するラットモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマが、ツアルトス（Ｔｚａ
ｒｔｏｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６、８６
３５−８６４５（１９８１）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９、１８８（１
９８２）によって示されている。筋肉ＡＣｈＲに対する
モノクローナル抗体を分泌する、ｍＡｂ６４と呼ばれる
ものを含む他のハイブリドーマも開発されている（ツア
ルトス（Ｔｚａｒｔｏｓ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ，１０、２３５−２５３（１９８６））。
ＣｈＲの主要免疫原領域に対するラットモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマが、ツアルトス（Ｔｚａ
ｒｔｏｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６、８６
３５−８６４５（１９８１）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９、１８８（１
９８２）によって示されている。筋肉ＡＣｈＲに対する
モノクローナル抗体を分泌する、ｍＡｂ６４と呼ばれる
ものを含む他のハイブリドーマも開発されている（ツア
ルトス（Ｔｚａｒｔｏｓ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ，１０、２３５−２５３（１９８６））。
【００１３】
【課題を解決するための手段】ＴＥ６７１系細胞上のＡ
ＣｈＲが、免疫アッセイにおける実際的目的において、
ヒト筋肉ＡＣｈＲと免疫学的に区別できず、上記特許で
示された重症筋無力症のための免疫沈降アッセイにおい
て、切断されたヒト脚部筋肉由来のヒト筋肉ＡＣｈＲと
実質的に同様に機能することが、予期せず、現在明らか
になっている。
ＣｈＲが、免疫アッセイにおける実際的目的において、
ヒト筋肉ＡＣｈＲと免疫学的に区別できず、上記特許で
示された重症筋無力症のための免疫沈降アッセイにおい
て、切断されたヒト脚部筋肉由来のヒト筋肉ＡＣｈＲと
実質的に同様に機能することが、予期せず、現在明らか
になっている。
【００１４】しかしながら、ヒト脚部筋肉由来ＡＣｈＲ
とは異なり、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲは実質的に
無限量、比較的高濃度で容易に入手可能であり、筋肉供
給源由来ＡＣｈＲでの混入につながるタンパク質分解や
他の要素による不均質性および不純性が実質的に回避で
きる。
とは異なり、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲは実質的に
無限量、比較的高濃度で容易に入手可能であり、筋肉供
給源由来ＡＣｈＲでの混入につながるタンパク質分解や
他の要素による不均質性および不純性が実質的に回避で
きる。
【００１５】上記発見により、重症筋無力症診断のため
の本質的な改良免疫化学的アッセイ系が実行可能とな
る。
の本質的な改良免疫化学的アッセイ系が実行可能とな
る。
【００１６】すなわち本発明は、重症筋無力症関連抗Ａ
ＣｈＲ自己抗体を検出する方法であって、重症筋無力症
関連抗ＡＣｈＲ自己抗体を含むと疑われる試料を固相結
合ＡＣｈＲとともにインキュベートする；および該イン
キュベートによりＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗
体のタイターを測定する；の各工程を含み、該ＡＣｈＲ
がＴＥ６７１系の細胞に由来することを特徴とする方法
を提供する。好ましくは、ＡＣｈＲのエピトープのサブ
セットに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターは、該
エピトープのサブセットに結合するエピトープ遮断物質
の存在下でＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタ
イターと、エピトープ遮断物質の非存在下でＡＣｈＲに
結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターとを比較するこ
とにより測定される。
ＣｈＲ自己抗体を検出する方法であって、重症筋無力症
関連抗ＡＣｈＲ自己抗体を含むと疑われる試料を固相結
合ＡＣｈＲとともにインキュベートする；および該イン
キュベートによりＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗
体のタイターを測定する；の各工程を含み、該ＡＣｈＲ
がＴＥ６７１系の細胞に由来することを特徴とする方法
を提供する。好ましくは、ＡＣｈＲのエピトープのサブ
セットに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターは、該
エピトープのサブセットに結合するエピトープ遮断物質
の存在下でＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタ
イターと、エピトープ遮断物質の非存在下でＡＣｈＲに
結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターとを比較するこ
とにより測定される。
【００１７】本発明はまた、重症筋無力症関連抗ＡＣｈ
Ｒ自己抗体用の血清の固相イムノアッセイのための基質
であって、ＴＥ６７１系の細胞から得られるＡＣｈＲと
複合された固体支持体を含む基質を提供する。
Ｒ自己抗体用の血清の固相イムノアッセイのための基質
であって、ＴＥ６７１系の細胞から得られるＡＣｈＲと
複合された固体支持体を含む基質を提供する。
【００１８】さらに本発明は、重症筋無力症関連抗ＡＣ
ｈＲ自己抗体用の血清の固相イムノアッセイによる重症
筋無力症の診断のためのキットであって、液体を保持す
るウエルおよびＴＥ６７１系の細胞から得られるＡＣｈ
Ｒと複合された固体支持体を含む基質を含むキットを提
供する。
ｈＲ自己抗体用の血清の固相イムノアッセイによる重症
筋無力症の診断のためのキットであって、液体を保持す
るウエルおよびＴＥ６７１系の細胞から得られるＡＣｈ
Ｒと複合された固体支持体を含む基質を含むキットを提
供する。
【００１９】
【発明の実施の形態】一つの局面において、本発明は重
症筋無力症診断のための、前述の特許に示されたアッセ
イおよび方法における改良を含むものである。これらの
改良点は、筋肉粗抽出液中のＡＣｈＲを用いず、ＴＥ６
７１系細胞由来ＡＣｈＲを使用するところにある。
症筋無力症診断のための、前述の特許に示されたアッセ
イおよび方法における改良を含むものである。これらの
改良点は、筋肉粗抽出液中のＡＣｈＲを用いず、ＴＥ６
７１系細胞由来ＡＣｈＲを使用するところにある。
【００２０】前述のように、上記特許のアッセイおよび
その方法は、重症筋無力症患者の血清中の抗ＡＣｈＲ自
己抗体を結合した標識ＡＣｈＲの免疫沈降による。ＡＣ
ｈＲの標識は、放射性標識、望ましくは 125Ｉ標識を施
した。ＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位に高親和的に結合する
クラーレ様神経毒素で行なう。ＡＣｈＲを標識するのに
用いられるクラーレ様毒素は、コブラや海蛇のような多
種の有毒爬虫類動物に見出される、天然に存在するタン
パク質である。
その方法は、重症筋無力症患者の血清中の抗ＡＣｈＲ自
己抗体を結合した標識ＡＣｈＲの免疫沈降による。ＡＣ
ｈＲの標識は、放射性標識、望ましくは 125Ｉ標識を施
した。ＡＣｈＲのＡＣｈ結合部位に高親和的に結合する
クラーレ様神経毒素で行なう。ＡＣｈＲを標識するのに
用いられるクラーレ様毒素は、コブラや海蛇のような多
種の有毒爬虫類動物に見出される、天然に存在するタン
パク質である。
【００２１】多くの上記毒素が単離され、配列が決定さ
れている。例えば、カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）、
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５２、１５９−２１２（１
９７９）参照。標識に望ましい毒素は、カールソン、前
出に示されている、いわゆる“長神経毒（ｌｏｎｇｎｅ
ｕｒｏｔｏｘｉｎ）”である。最も望ましいのは、ブン
ガルス・マルチシンクタス（Ｂｕｎｇａｒｕｓ ｍｕｌ
ｔｉｃｉｎｃｔｕｓ）由来のアルファ−ブンガロトキシ
ンである。
れている。例えば、カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）、
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５２、１５９−２１２（１
９７９）参照。標識に望ましい毒素は、カールソン、前
出に示されている、いわゆる“長神経毒（ｌｏｎｇｎｅ
ｕｒｏｔｏｘｉｎ）”である。最も望ましいのは、ブン
ガルス・マルチシンクタス（Ｂｕｎｇａｒｕｓ ｍｕｌ
ｔｉｃｉｎｃｔｕｓ）由来のアルファ−ブンガロトキシ
ンである。
【００２２】別の局面においては、本発明は、ＴＥ６７
１系細胞を培養することにより、ヒト血清中の抗ＡＣｈ
Ｒ自己抗体の免疫アッセイによる重症筋無力症診断に適
当なＡＣｈＲを産生する方法、および、ＴＥ６７１系細
胞培養液から上記免疫アッセイに使用するのに適当な上
記ＡＣｈＲの調製液を得る方法に関するものである。
１系細胞を培養することにより、ヒト血清中の抗ＡＣｈ
Ｒ自己抗体の免疫アッセイによる重症筋無力症診断に適
当なＡＣｈＲを産生する方法、および、ＴＥ６７１系細
胞培養液から上記免疫アッセイに使用するのに適当な上
記ＡＣｈＲの調製液を得る方法に関するものである。
【００２３】ＴＥ６７１系細胞の培養、および、同培養
液からのＡＣｈＲ調製液の回収は、以下の実施例に示
す。
液からのＡＣｈＲ調製液の回収は、以下の実施例に示
す。
【００２４】本明細書における“ＴＥ６７１系細胞”と
は、（ｉ）亜系（ｓｕｂｌｉｎｅ）Ｎｏ．２培養液、お
よび寄託番号ＣＲＬ８８０５としてＡＴＣＣに寄託され
ている該亜系の培養液を含む、あらゆるＴＥ６７１細胞
系培養液由来の細胞；あるいは（ｉｉ）（ｉ）で規定し
たあらゆる培養液の二次培養液の細胞；あるいは（ｉｉ
ｉ）（ｉ）あるいは（ｉｉ）で規定したあらゆる細胞の
突然変異体を意味する；上記細胞（（ｉ）、（ｉｉ）お
よび（ｉｉｉ）のもの）は免疫アッセイにおける実際的
な目的で、ヒト筋肉ＡＣｈＲと免疫学上実質的に同等の
ＡＣｈＲを産生するものとする。“二次培養液”とは、
ある培養液の細胞から培養した培養液（原培養液（ｓｏ
ｕｒｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ））あるいは、問題となる二
次培養液と原培養液との間の二次培養の回数に関わら
ず、原培養液のあらゆる二次培養液を意味する。“ＴＥ
６７１系細胞”の定義（ｉ）および（ｉｉ）で規定され
る細胞の突然変異体は、天然に生じる変異体、あるい
は、継代の繰り返し、化学的処理、照射、細胞融合、形
質転換、形質導入、細胞核への核酸のマイクロインジェ
クション等の人為的介入による変異体を含む。
は、（ｉ）亜系（ｓｕｂｌｉｎｅ）Ｎｏ．２培養液、お
よび寄託番号ＣＲＬ８８０５としてＡＴＣＣに寄託され
ている該亜系の培養液を含む、あらゆるＴＥ６７１細胞
系培養液由来の細胞；あるいは（ｉｉ）（ｉ）で規定し
たあらゆる培養液の二次培養液の細胞；あるいは（ｉｉ
ｉ）（ｉ）あるいは（ｉｉ）で規定したあらゆる細胞の
突然変異体を意味する；上記細胞（（ｉ）、（ｉｉ）お
よび（ｉｉｉ）のもの）は免疫アッセイにおける実際的
な目的で、ヒト筋肉ＡＣｈＲと免疫学上実質的に同等の
ＡＣｈＲを産生するものとする。“二次培養液”とは、
ある培養液の細胞から培養した培養液（原培養液（ｓｏ
ｕｒｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ））あるいは、問題となる二
次培養液と原培養液との間の二次培養の回数に関わら
ず、原培養液のあらゆる二次培養液を意味する。“ＴＥ
６７１系細胞”の定義（ｉ）および（ｉｉ）で規定され
る細胞の突然変異体は、天然に生じる変異体、あるい
は、継代の繰り返し、化学的処理、照射、細胞融合、形
質転換、形質導入、細胞核への核酸のマイクロインジェ
クション等の人為的介入による変異体を含む。
【００２５】免疫アッセイにおける実質的目的で、ある
ＡＣｈＲがヒト筋肉ＡＣｈＲを免疫学上実質的同等であ
ることを確実にするための方法は実施例ＩＩに示されて
いる。一般的には、ヒト血清中の抗ヒト筋肉ＡＣｈＲ抗
体が、問題となるＡＣｈＲと高度な交叉反応性（少なく
とも５０％程度まで）を有するかどうかという規準は確
認される。規準が得られるか否かは、ヒト筋肉ＡＣｈＲ
と問題のＡＣｈＲの双方を、いずれかのＡＣｈＲ上の抗
原決定基に対して反応すると知られている一群のモノク
ローナル抗体で試験することによって確認される；も
し、モノクローナル抗体に対応する抗原決定基の全て、
あるいはほぼ全て（すなわち、１０分の９以上）が上記
試験の結果双方のＡＣｈＲ上に存在するとすれば、免疫
アッセイにおける実際的目的では、二つのＡＣｈＲは免
疫学上区別できない（すなわち、実質的に同等である）
と結論することができる。上記の免疫学上区別できない
２種のＡＣｈＲを特徴づける、高度のモノクローナル抗
体の交叉反応性はまた、前述の特許で述べられている免
疫沈降アッセイにおける標識毒素に対する親和性の相違
などの、あらゆる既知の非免疫学的要素についての補正
後、ヒト筋肉ＡＣｈＲの免疫アッセイで決定された血清
試料の抗ＡＣｈＲ抗体の力価がＴＥ６７１系細胞由来Ａ
ＣｈＲの力価に比べ、わずか２５％（不可避の実験上の
不確実性により若干の変動がある）しか大きくないであ
ろうということを示唆する。二種のＡＣｈＲで決定され
た抗ＡＣｈＲ抗体の力価の相関は、上記特許による免疫
沈降アッセイで決定された力価と実施例ＩＩに示される
力価を、抗ＡＣｈＲ抗体力価が少なくとも一桁以上の範
囲の少なくとも１０種の血清について比較することによ
って確実に確かめることが可能である。
ＡＣｈＲがヒト筋肉ＡＣｈＲを免疫学上実質的同等であ
ることを確実にするための方法は実施例ＩＩに示されて
いる。一般的には、ヒト血清中の抗ヒト筋肉ＡＣｈＲ抗
体が、問題となるＡＣｈＲと高度な交叉反応性（少なく
とも５０％程度まで）を有するかどうかという規準は確
認される。規準が得られるか否かは、ヒト筋肉ＡＣｈＲ
と問題のＡＣｈＲの双方を、いずれかのＡＣｈＲ上の抗
原決定基に対して反応すると知られている一群のモノク
ローナル抗体で試験することによって確認される；も
し、モノクローナル抗体に対応する抗原決定基の全て、
あるいはほぼ全て（すなわち、１０分の９以上）が上記
試験の結果双方のＡＣｈＲ上に存在するとすれば、免疫
アッセイにおける実際的目的では、二つのＡＣｈＲは免
疫学上区別できない（すなわち、実質的に同等である）
と結論することができる。上記の免疫学上区別できない
２種のＡＣｈＲを特徴づける、高度のモノクローナル抗
体の交叉反応性はまた、前述の特許で述べられている免
疫沈降アッセイにおける標識毒素に対する親和性の相違
などの、あらゆる既知の非免疫学的要素についての補正
後、ヒト筋肉ＡＣｈＲの免疫アッセイで決定された血清
試料の抗ＡＣｈＲ抗体の力価がＴＥ６７１系細胞由来Ａ
ＣｈＲの力価に比べ、わずか２５％（不可避の実験上の
不確実性により若干の変動がある）しか大きくないであ
ろうということを示唆する。二種のＡＣｈＲで決定され
た抗ＡＣｈＲ抗体の力価の相関は、上記特許による免疫
沈降アッセイで決定された力価と実施例ＩＩに示される
力価を、抗ＡＣｈＲ抗体力価が少なくとも一桁以上の範
囲の少なくとも１０種の血清について比較することによ
って確実に確かめることが可能である。
【００２６】ＡＴＣＣに寄託番号ＣＲＬ８８０５として
寄託されている、ＴＥ６７１系亜系２の培養細胞のＡＣ
ｈＲは、免疫アッセイにおける実際的目的では、ヒト筋
肉ＡＣｈＲと免疫学上区別できない。実際、第１図でプ
ロットされたデータに示されるように、毒素に対する親
和性の相違で補正した後（実施例ＩＩ参照）、上記培養
細胞由来ＡＣｈＲとヒト脚部筋肉由来ＡＣｈＲに関す
る、ヒト血清中の抗ＡＣｈＲ自己抗体の交叉反応性は、
実験的誤差内で、ほぼ１００％であり；これら二種の供
給源由来のＡＣｈＲは、重症筋無力症患者の同疾患の診
断の為の血清の免疫アッセイで交換可能である。
寄託されている、ＴＥ６７１系亜系２の培養細胞のＡＣ
ｈＲは、免疫アッセイにおける実際的目的では、ヒト筋
肉ＡＣｈＲと免疫学上区別できない。実際、第１図でプ
ロットされたデータに示されるように、毒素に対する親
和性の相違で補正した後（実施例ＩＩ参照）、上記培養
細胞由来ＡＣｈＲとヒト脚部筋肉由来ＡＣｈＲに関す
る、ヒト血清中の抗ＡＣｈＲ自己抗体の交叉反応性は、
実験的誤差内で、ほぼ１００％であり；これら二種の供
給源由来のＡＣｈＲは、重症筋無力症患者の同疾患の診
断の為の血清の免疫アッセイで交換可能である。
【００２７】本発明はさらに、ＴＥ６７１系細胞由来Ａ
ＣｈＲを抗原として用いる、ヒト筋肉ＡＣｈＲに対する
自己抗体の固相免疫アッセイを含む。抗ＡＣｈＲ自己抗
体に関する免疫アッセイは、これまではヒト筋肉ＡＣｈ
Ｒを十分量得ることが極めて困難であり、それに付随す
る高コストのために実行不可能であったが、ＴＥ６７１
細胞由来ＡＣｈＲの有効性により、容易に行なえるよう
になる。固相免疫アッセイは、固相免疫アッセイ分野で
既知の方法に従い、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲを用
いて行なう。
ＣｈＲを抗原として用いる、ヒト筋肉ＡＣｈＲに対する
自己抗体の固相免疫アッセイを含む。抗ＡＣｈＲ自己抗
体に関する免疫アッセイは、これまではヒト筋肉ＡＣｈ
Ｒを十分量得ることが極めて困難であり、それに付随す
る高コストのために実行不可能であったが、ＴＥ６７１
細胞由来ＡＣｈＲの有効性により、容易に行なえるよう
になる。固相免疫アッセイは、固相免疫アッセイ分野で
既知の方法に従い、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲを用
いて行なう。
【００２８】固相免疫アッセイの“基質”は、免疫アッ
セイ分野で既知の多くの方法のいずれかによって、ＡＣ
ｈＲを固体支持体に共有結合的あるいは非共有結合的に
結合させることによって作製する。同分野で知られてい
る固相支持体のうちで使用し得るものは、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポ
リメタクリレート、ポリアクリルアミド、ＡＣｈＲを付
着させることのできる他の合成重合体物質、ガラス、ニ
トロセルロース、セルロース、およびアガロース製のも
のである。固相支持体は、例えばある種のアガロース物
質（例えば、米国ニュージャージー州ピスカタウエイ、
ファルマシア社のセファクリルＳ−５００）などで形成
されているような“マクロポア（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕ
ｓ）”ゲル型支持体も可能である。固相支持体は、極小
球あるいはビーズ（例えば“ラテックス”ビーズ）など
の極小顆粒の形態、あるいは、微量遠心チューブなどの
チューブの内壁、マイクロタイタープレートあるいはミ
リタイタープレートのウエルも可能である。ＡＣｈＲを
付着させた固相支持体は、本分野で理解されているよう
に、ＡＣｈＲで占められていない支持体上の部位を遮断
することによりバックグラウンドを低下させるために適
当な洗浄および材料とのインキュベーションを行なった
後、また、ＡＣｈＲ上のあるエピトープを遮断する物質
（クラーレ様神経毒素、低分子コリン作動性リガンド、
あるいは抗体など）と随意のプレインキュベーションを
行なった後、実施例ＩＩＩで示されているように、ある
いは本分野で理解されているように、血清あるいは、よ
り一般的には適当な緩衝液によるその希釈液とともにイ
ンキュベートする。随意に、ＡＣｈＲ結合固相支持体と
のインキュベートに先立ち、血清（あるいは希釈液）を
ある種の物質（クラーレ様神経毒素、低分子量コリン作
動性化合物、あるいは抗体）と、血清中のあらゆる自己
抗体がＡＣｈＲ上のあるエピトープに結合することと外
的に競合するのに十分な濃度で混合することもできる。
使用され得る上記エピトープ遮断物質によって遮断され
ないＡＣｈＲ上のエピトープに対する血清中の自己抗体
はＡＣｈＲに結合するであろう。本分野で理解されてい
るように適当な洗浄を行なった後、次に、標識抗自己抗
体、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の標識したＡタン
パク質、あるいは検出のために標識されており、自己抗
体には結合するが上記系の他の物質には有意には結合し
ないようなタンパク質などの物質とインキュベートする
ことにより、ＡＣｈＲに結合する自己抗体を検出する。
セイ分野で既知の多くの方法のいずれかによって、ＡＣ
ｈＲを固体支持体に共有結合的あるいは非共有結合的に
結合させることによって作製する。同分野で知られてい
る固相支持体のうちで使用し得るものは、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポ
リメタクリレート、ポリアクリルアミド、ＡＣｈＲを付
着させることのできる他の合成重合体物質、ガラス、ニ
トロセルロース、セルロース、およびアガロース製のも
のである。固相支持体は、例えばある種のアガロース物
質（例えば、米国ニュージャージー州ピスカタウエイ、
ファルマシア社のセファクリルＳ−５００）などで形成
されているような“マクロポア（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕ
ｓ）”ゲル型支持体も可能である。固相支持体は、極小
球あるいはビーズ（例えば“ラテックス”ビーズ）など
の極小顆粒の形態、あるいは、微量遠心チューブなどの
チューブの内壁、マイクロタイタープレートあるいはミ
リタイタープレートのウエルも可能である。ＡＣｈＲを
付着させた固相支持体は、本分野で理解されているよう
に、ＡＣｈＲで占められていない支持体上の部位を遮断
することによりバックグラウンドを低下させるために適
当な洗浄および材料とのインキュベーションを行なった
後、また、ＡＣｈＲ上のあるエピトープを遮断する物質
（クラーレ様神経毒素、低分子コリン作動性リガンド、
あるいは抗体など）と随意のプレインキュベーションを
行なった後、実施例ＩＩＩで示されているように、ある
いは本分野で理解されているように、血清あるいは、よ
り一般的には適当な緩衝液によるその希釈液とともにイ
ンキュベートする。随意に、ＡＣｈＲ結合固相支持体と
のインキュベートに先立ち、血清（あるいは希釈液）を
ある種の物質（クラーレ様神経毒素、低分子量コリン作
動性化合物、あるいは抗体）と、血清中のあらゆる自己
抗体がＡＣｈＲ上のあるエピトープに結合することと外
的に競合するのに十分な濃度で混合することもできる。
使用され得る上記エピトープ遮断物質によって遮断され
ないＡＣｈＲ上のエピトープに対する血清中の自己抗体
はＡＣｈＲに結合するであろう。本分野で理解されてい
るように適当な洗浄を行なった後、次に、標識抗自己抗
体、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の標識したＡタン
パク質、あるいは検出のために標識されており、自己抗
体には結合するが上記系の他の物質には有意には結合し
ないようなタンパク質などの物質とインキュベートする
ことにより、ＡＣｈＲに結合する自己抗体を検出する。
【００２９】望ましくは、標識抗自己抗体を検出に使用
する。典型的には、標識抗自己抗体は、標識されたポリ
クローナル抗ヒトＩｇＧと規定されるであろう。しかし
ながら、抗ヒトＩｇＧ１あるいは抗ヒトＩｇＭなどのポ
リクローナルサブクラス特異的抗イムノグロブリン、あ
るいは、一定のクラスあるいはサブクラスに特異的では
ない抗ヒトイムノグロブリンも使用し得る。検出のため
に使用する抗血清は、典型的にはヤギ、ウサギ、ラッ
ト、あるいは、マウスであるが、他の非ヒト哺乳類も供
給源として使用可能である。
する。典型的には、標識抗自己抗体は、標識されたポリ
クローナル抗ヒトＩｇＧと規定されるであろう。しかし
ながら、抗ヒトＩｇＧ１あるいは抗ヒトＩｇＭなどのポ
リクローナルサブクラス特異的抗イムノグロブリン、あ
るいは、一定のクラスあるいはサブクラスに特異的では
ない抗ヒトイムノグロブリンも使用し得る。検出のため
に使用する抗血清は、典型的にはヤギ、ウサギ、ラッ
ト、あるいは、マウスであるが、他の非ヒト哺乳類も供
給源として使用可能である。
【００３０】固相免疫アッセイがＥＬＩＳＡである場合
には、抗ヒト免疫グロブリン、Ｓ．アウレウスのＡタン
パク質、あるいは抗ＡＣｈＲ自己抗体に結合する物質の
標識は、酸あるいはアルカリホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼ、あるいは、ベータ−ガラクトシダーゼなどの
酵素であって、検出は、本分野で知られているように、
酵素標識によって触媒される反応によって産生される産
物を用いて行なう。
には、抗ヒト免疫グロブリン、Ｓ．アウレウスのＡタン
パク質、あるいは抗ＡＣｈＲ自己抗体に結合する物質の
標識は、酸あるいはアルカリホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼ、あるいは、ベータ−ガラクトシダーゼなどの
酵素であって、検出は、本分野で知られているように、
酵素標識によって触媒される反応によって産生される産
物を用いて行なう。
【００３１】固相免疫アッセイがＥＬＩＳＡでなく、抗
免疫グロブリン、Ｓ．アウレウスＡタンパク質、あるい
は、他の物質上に標識が存在する場合には、標識は通常
酵素とは異なるものとなるであろう。上記非酵素標識
は、放射性元素、クロモフォアあるいはフルオロフォ
ア、およびビオチンを含む；これら各々の標識各々の検
出法は、本分野で知られている他の使用可能な標識と同
様に、本分野で既知である。 125Ｉ標識が望ましい。
免疫グロブリン、Ｓ．アウレウスＡタンパク質、あるい
は、他の物質上に標識が存在する場合には、標識は通常
酵素とは異なるものとなるであろう。上記非酵素標識
は、放射性元素、クロモフォアあるいはフルオロフォ
ア、およびビオチンを含む；これら各々の標識各々の検
出法は、本分野で知られている他の使用可能な標識と同
様に、本分野で既知である。 125Ｉ標識が望ましい。
【００３２】別の方法では、抗ＡＣｈＲ自己抗体が結合
し、非標識抗自己抗体も結合しているＡＣｈＲは、標識
したＳ．アウレウスＡタンパク質をともにインキュベー
ションし、Ａタンパク質上の標識を検出することによっ
て検出する。Ａタンパク質上の標識は、上記の、あるい
は本分野で知られている他の酵素あるいは別のいかなる
標識も可能である。
し、非標識抗自己抗体も結合しているＡＣｈＲは、標識
したＳ．アウレウスＡタンパク質をともにインキュベー
ションし、Ａタンパク質上の標識を検出することによっ
て検出する。Ａタンパク質上の標識は、上記の、あるい
は本分野で知られている他の酵素あるいは別のいかなる
標識も可能である。
【００３３】本発明の別の局面は、ＡＣｈＲ上のエピト
ープの多様なサブセットに結合する上記自己抗体の分画
の力価によって、重症筋無力症患者の抗ＡＣｈＲ自己抗
体を解析する方法である。本方法は、患者血清に対する
４種の固相免疫アッセイのうち少なくとも２種のアッセ
イを行なうことを含むものであり、その４種の免疫アッ
セイは次の点を除いては実質的に同等である：一つは、
ＡＣｈＲのみが結合している固相を用いるもの；一つ
は、血清試料とのインキュベーションの前に、あるいは
同時に、主要免疫原領域に対するモノクローナル抗体
（ｍＡｂ ３５など）とインキュベートしたＡＣｈＲが
結合した固相を用いるもの；一つは、血清試料とのイン
キュベーションに先立つか、あるいは同時にクラーレ様
神経毒素とインキュベートしたＡＣｈＲが結合した固相
を用いるもの；および、一つは、血清試料とのインキュ
ベーションに先立つか、あるいは同時に、ＡＣｈ結合部
位に強く結合するが、神経毒素のように近傍領域を遮断
しないような低分子量化合物（例えば、カルバミルコリ
ンなどのニコチン性コリン作動性化合物）とインキュベ
ートしたＡＣｈＲが結合した固相を用いるもの。ＡＣｈ
Ｒのみを用いたアッセイは、ＡＣｈＲ上のエピトープに
対する全自己抗体の力価についての情報を与える。主要
免疫原領域に対するモノクローナル抗体を用いたアッセ
イは、ＡＣｈＲの主要免疫原領域の外側のエピトープに
対する自己抗体の力価に関する情報を与える。クラーレ
様神経毒素を用いたアッセイは、ＡＣｈ結合部位、およ
び毒素によって遮断された近傍部位の外側のエピトープ
に対する自己抗体の力価に関する情報を与える。最後
に、ＡＣｈ結合部位に結合する低分子量化合物を用いた
アッセイは、ＡＣｈ結合部位自体に対する自己抗体の力
価に関する情報を与える。通常これらのアッセイでは、
エピトープ遮断物質とＡＣｈＲとのインキュベーション
は、遮断物質と血清試料とを化合させることによって行
なわれ、遮断物質と同じエピトープに結合すると考えら
れる血清中のほぼ全ての自己抗体が結合する際に外的に
競合するために、試料中十分に高濃度で、遮断物質を免
疫アッセイ基質（すなわち、ＡＣｈＲが結合した固相支
持体）とインキュベートする。
ープの多様なサブセットに結合する上記自己抗体の分画
の力価によって、重症筋無力症患者の抗ＡＣｈＲ自己抗
体を解析する方法である。本方法は、患者血清に対する
４種の固相免疫アッセイのうち少なくとも２種のアッセ
イを行なうことを含むものであり、その４種の免疫アッ
セイは次の点を除いては実質的に同等である：一つは、
ＡＣｈＲのみが結合している固相を用いるもの；一つ
は、血清試料とのインキュベーションの前に、あるいは
同時に、主要免疫原領域に対するモノクローナル抗体
（ｍＡｂ ３５など）とインキュベートしたＡＣｈＲが
結合した固相を用いるもの；一つは、血清試料とのイン
キュベーションに先立つか、あるいは同時にクラーレ様
神経毒素とインキュベートしたＡＣｈＲが結合した固相
を用いるもの；および、一つは、血清試料とのインキュ
ベーションに先立つか、あるいは同時に、ＡＣｈ結合部
位に強く結合するが、神経毒素のように近傍領域を遮断
しないような低分子量化合物（例えば、カルバミルコリ
ンなどのニコチン性コリン作動性化合物）とインキュベ
ートしたＡＣｈＲが結合した固相を用いるもの。ＡＣｈ
Ｒのみを用いたアッセイは、ＡＣｈＲ上のエピトープに
対する全自己抗体の力価についての情報を与える。主要
免疫原領域に対するモノクローナル抗体を用いたアッセ
イは、ＡＣｈＲの主要免疫原領域の外側のエピトープに
対する自己抗体の力価に関する情報を与える。クラーレ
様神経毒素を用いたアッセイは、ＡＣｈ結合部位、およ
び毒素によって遮断された近傍部位の外側のエピトープ
に対する自己抗体の力価に関する情報を与える。最後
に、ＡＣｈ結合部位に結合する低分子量化合物を用いた
アッセイは、ＡＣｈ結合部位自体に対する自己抗体の力
価に関する情報を与える。通常これらのアッセイでは、
エピトープ遮断物質とＡＣｈＲとのインキュベーション
は、遮断物質と血清試料とを化合させることによって行
なわれ、遮断物質と同じエピトープに結合すると考えら
れる血清中のほぼ全ての自己抗体が結合する際に外的に
競合するために、試料中十分に高濃度で、遮断物質を免
疫アッセイ基質（すなわち、ＡＣｈＲが結合した固相支
持体）とインキュベートする。
【００３４】上で示唆したように、固相免疫アッセイの
基礎は、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲが共有結合ある
いは非共有結合で複合体を作る基質物質である。これら
のＡＣｈＲが結合した固相基質もまた、本発明の一部で
ある。これらの基質は、ある抗原に対する抗体に関する
固相免疫アッセイに適当な方法で、固相支持体に抗原を
付着させるための、本分野で既知のいずれかの方法で調
製する。
基礎は、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲが共有結合ある
いは非共有結合で複合体を作る基質物質である。これら
のＡＣｈＲが結合した固相基質もまた、本発明の一部で
ある。これらの基質は、ある抗原に対する抗体に関する
固相免疫アッセイに適当な方法で、固相支持体に抗原を
付着させるための、本分野で既知のいずれかの方法で調
製する。
【００３５】ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲは、重症筋
無力症診断のためのキットの作製を容易にする。該キッ
トもまた、本発明に含まれる。該キットは、ＴＥ６７１
系細胞由来ＡＣｈＲおよび、本発明による基質を調製す
るためにＡＣｈＲが付着し得る固相支持体を含む。任意
に、該キットは、本発明による基質を含むことができる
（すなわち、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲが既に付着
している、固相支持体）。本発明のキットはまた、抗Ａ
ＣｈＲ自己抗体に関する患者血清の固相免疫アッセイに
必要な他の要素、例えば、抗ＡＣｈＲ自己抗体によるＡ
ＣｈＲの部分への結合を遮断するリガンドあるいはモノ
クローナル抗体（キットが、自己抗体が結合するＡＣｈ
Ｒ上の部位を解析するアッセイに使用される場合）、緩
衝液、検出のために標識された抗ヒトＩｇＧ、および実
施例ＩＩＩに示される他の構成要素、および、固相免疫
アッセイ分野で理解される他の構成要素なども含むこと
ができる。
無力症診断のためのキットの作製を容易にする。該キッ
トもまた、本発明に含まれる。該キットは、ＴＥ６７１
系細胞由来ＡＣｈＲおよび、本発明による基質を調製す
るためにＡＣｈＲが付着し得る固相支持体を含む。任意
に、該キットは、本発明による基質を含むことができる
（すなわち、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲが既に付着
している、固相支持体）。本発明のキットはまた、抗Ａ
ＣｈＲ自己抗体に関する患者血清の固相免疫アッセイに
必要な他の要素、例えば、抗ＡＣｈＲ自己抗体によるＡ
ＣｈＲの部分への結合を遮断するリガンドあるいはモノ
クローナル抗体（キットが、自己抗体が結合するＡＣｈ
Ｒ上の部位を解析するアッセイに使用される場合）、緩
衝液、検出のために標識された抗ヒトＩｇＧ、および実
施例ＩＩＩに示される他の構成要素、および、固相免疫
アッセイ分野で理解される他の構成要素なども含むこと
ができる。
【００３６】本発明は、以下の実施例で、より詳細に示
される。
される。
【００３７】
【実施例】実施例Ｉ ＴＥ６７１系細胞の培養 哺乳動物細胞の培養に関する、本分野で既知のいかなる
技術も、ＴＥ６７１系細胞の培養に使用し得る。
技術も、ＴＥ６７１系細胞の培養に使用し得る。
【００３８】ＴＥ６７１細胞を培養する望ましい方法
は、３７℃で、９０％空気、１０％ＣＯ2 である大気中
で、１０％ウシ胎児血清を含む、イスコフ（Ｉｓｃｏｖ
ｅ）が修飾したダルベッコの最小必要培地（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ′ｓ ｍｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅ
ｄｉｕｍ）（米国カリフォルニア州サンタアナ、アービ
ン・サイエンティフイック社）を用いるものである。
は、３７℃で、９０％空気、１０％ＣＯ2 である大気中
で、１０％ウシ胎児血清を含む、イスコフ（Ｉｓｃｏｖ
ｅ）が修飾したダルベッコの最小必要培地（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ′ｓ ｍｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅ
ｄｉｕｍ）（米国カリフォルニア州サンタアナ、アービ
ン・サイエンティフイック社）を用いるものである。
【００３９】微小体積は、１．５ｍｌ培地中３×１０5
細胞のイノキュラムを用いて、３５ｍｍ培養皿で培養す
る。３日後に培地を交換し、６日目あるいは７日目に最
適のＡＣｈＲ量を得る。
細胞のイノキュラムを用いて、３５ｍｍ培養皿で培養す
る。３日後に培地を交換し、６日目あるいは７日目に最
適のＡＣｈＲ量を得る。
【００４０】大量培養では、プラスチック製ローラーボ
トル（米国カリフォルニア州オックスナルド、ファルコ
ン・ラブウエア、ベクトン−ディキンソン社）が使用さ
れる。８５０ｃｍ2 ボトルの場合には、培地１５０ｍｌ
に３×１０7 細胞を注入する；１７５０ｃｍ2 ボトルの
場合では、培地３００ｍｌに６×１０7 細胞を注入す
る。培地は５日目に交換し、９日目から１０日目に、Ａ
ＣｈＲ収量は最適となる。
トル（米国カリフォルニア州オックスナルド、ファルコ
ン・ラブウエア、ベクトン−ディキンソン社）が使用さ
れる。８５０ｃｍ2 ボトルの場合には、培地１５０ｍｌ
に３×１０7 細胞を注入する；１７５０ｃｍ2 ボトルの
場合では、培地３００ｍｌに６×１０7 細胞を注入す
る。培地は５日目に交換し、９日目から１０日目に、Ａ
ＣｈＲ収量は最適となる。
【００４１】実施例ＩＩ ＴＥ６７１系細胞由来アセチルコリン受容体の単離およ
び解析と、免疫沈降アッセイにおける該受容体の使用 ＡＣｈＲは、典型的には、一度に８５０ｃｍ2 ローラー
ボトル６個から７個分の培養液から単離されてきたが、
はるかに多量の培養液を同時に、容易に操作することが
可能である。以下の方法は、ＴＥ６７１系サブラインＮ
ｏ．２の細胞培養液からＡＣｈＲを単離する際に通常用
いたものであり、細胞試料は、寄託番号ＣＲＬ８８０５
として、ＡＴＣＣに寄託されている：実施例Ｉに述べた
ように培養し、９日目あるいは１０日目の各々８５０ｃ
ｍ2ボトルの培養液に、２５ｍｌの回収緩衝液（ｈａｒ
ｖｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ）（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１
０ｍＭ、Ｎａ- リン酸緩衝液、１０ｍＭ、ＮａＮ3 、１
５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、２ｍＭ
ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライ
ド）、１５ｍＭ ＩＡＡ（ヨード酢酸）、および５ｍＭ
ベンズアミジン、ｐＨ７．５）を加える、次に、細胞が
プラスチックから離れるまでボトルを激しく振盪する。
緩衝液および細胞を氷上のボトルに集め、ローラーボト
ルをさらに１００ｍｌの回収緩衝液でボトルからボトル
へすすぎ、残りとともにプールする。次に、ポリトロン
ホモジナイザーを用い、泡が生じる直前のスピードで１
５秒間細胞を破壊する。膜と他の粒子を、ホモジュネー
トをベックマンＴｉ５０．２ローター（米国カリフォル
ニア州パロアルト、ベックマン・インストルメント社、
スピンコ部門）で４℃、４５，０００ｒｐｍ（３０２，
０００×ｇ）で３０分間遠心することによって集める。
典型的には、８５０ｃｍ2 ボトルあたり、１．５ｍｇの
ペレットが回収される。ペレットは、４倍量の抽出緩衝
液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
５ｍＭ ＥＧＴＡ（エチレングリコール、ビス−（２−
アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢
酸）、５ｍＭ ＩＡＡ、５ｍＭ ベンズアミジン、２ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ、２％トリトンＸ−１００、ｐＨ７．５）
中に置き、ポリトロンで１５秒間おだやかに懸濁する。
４℃で緩やかに振盪して３０分間抽出した後、調製液を
上と同様に遠心する。上清は典型的には、８５０ｃｍ2
ボトルあたりおよそ６．６×１０-11 モルの収量で、約
１．１×１０-8ＭのＡＣｈＲを含む。比較となる刻んだ
筋肉組織の粗抽出液では、ＡＣｈＲは約２×１０-10 Ｍ
から２×１０-9Ｍ、一般的には１×１０-9以下しか含ま
ない。
び解析と、免疫沈降アッセイにおける該受容体の使用 ＡＣｈＲは、典型的には、一度に８５０ｃｍ2 ローラー
ボトル６個から７個分の培養液から単離されてきたが、
はるかに多量の培養液を同時に、容易に操作することが
可能である。以下の方法は、ＴＥ６７１系サブラインＮ
ｏ．２の細胞培養液からＡＣｈＲを単離する際に通常用
いたものであり、細胞試料は、寄託番号ＣＲＬ８８０５
として、ＡＴＣＣに寄託されている：実施例Ｉに述べた
ように培養し、９日目あるいは１０日目の各々８５０ｃ
ｍ2ボトルの培養液に、２５ｍｌの回収緩衝液（ｈａｒ
ｖｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ）（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１
０ｍＭ、Ｎａ- リン酸緩衝液、１０ｍＭ、ＮａＮ3 、１
５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、２ｍＭ
ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライ
ド）、１５ｍＭ ＩＡＡ（ヨード酢酸）、および５ｍＭ
ベンズアミジン、ｐＨ７．５）を加える、次に、細胞が
プラスチックから離れるまでボトルを激しく振盪する。
緩衝液および細胞を氷上のボトルに集め、ローラーボト
ルをさらに１００ｍｌの回収緩衝液でボトルからボトル
へすすぎ、残りとともにプールする。次に、ポリトロン
ホモジナイザーを用い、泡が生じる直前のスピードで１
５秒間細胞を破壊する。膜と他の粒子を、ホモジュネー
トをベックマンＴｉ５０．２ローター（米国カリフォル
ニア州パロアルト、ベックマン・インストルメント社、
スピンコ部門）で４℃、４５，０００ｒｐｍ（３０２，
０００×ｇ）で３０分間遠心することによって集める。
典型的には、８５０ｃｍ2 ボトルあたり、１．５ｍｇの
ペレットが回収される。ペレットは、４倍量の抽出緩衝
液（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
５ｍＭ ＥＧＴＡ（エチレングリコール、ビス−（２−
アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢
酸）、５ｍＭ ＩＡＡ、５ｍＭ ベンズアミジン、２ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ、２％トリトンＸ−１００、ｐＨ７．５）
中に置き、ポリトロンで１５秒間おだやかに懸濁する。
４℃で緩やかに振盪して３０分間抽出した後、調製液を
上と同様に遠心する。上清は典型的には、８５０ｃｍ2
ボトルあたりおよそ６．６×１０-11 モルの収量で、約
１．１×１０-8ＭのＡＣｈＲを含む。比較となる刻んだ
筋肉組織の粗抽出液では、ＡＣｈＲは約２×１０-10 Ｍ
から２×１０-9Ｍ、一般的には１×１０-9以下しか含ま
ない。
【００４２】免疫沈降アッセイは、ＴＥ６７１細胞ある
いは切断したヒト脚部由来筋肉のいずれかの２％トリト
ンＸ−１００抽出液（本実施例中で前述）から２ｎＭの
ＡＣｈＲを用いて、実質的に前述の特許に示された方法
で、４５人の患者の血清に対して行なった。ＴＥ６７１
細胞抽出液中のＡＣｈＲ濃度は、アッセイ緩衝液（１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝
液、１０ｍＭ ＮａＮ3、０．５％トリトンＸ−１０
０、ｐＨ７．５）で希釈し、２ｎＭに下げた。使用した
筋肉抽出液はまれなものであり、ＡＣｈＲ濃度は約２ｎ
Ｍであり、希釈せずに使用した。より典型的には、筋肉
抽出液中のＡＣｈＲ濃度は、顕著により低いはずであ
り、標準的な方法（例えば、アミコン濃縮機（米国マサ
チューセッツ州ダンバース、アミコン社））によって、
ＡＣｈＲ濃度が２ｎＭに達するまで増加させる。
いは切断したヒト脚部由来筋肉のいずれかの２％トリト
ンＸ−１００抽出液（本実施例中で前述）から２ｎＭの
ＡＣｈＲを用いて、実質的に前述の特許に示された方法
で、４５人の患者の血清に対して行なった。ＴＥ６７１
細胞抽出液中のＡＣｈＲ濃度は、アッセイ緩衝液（１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝
液、１０ｍＭ ＮａＮ3、０．５％トリトンＸ−１０
０、ｐＨ７．５）で希釈し、２ｎＭに下げた。使用した
筋肉抽出液はまれなものであり、ＡＣｈＲ濃度は約２ｎ
Ｍであり、希釈せずに使用した。より典型的には、筋肉
抽出液中のＡＣｈＲ濃度は、顕著により低いはずであ
り、標準的な方法（例えば、アミコン濃縮機（米国マサ
チューセッツ州ダンバース、アミコン社））によって、
ＡＣｈＲ濃度が２ｎＭに達するまで増加させる。
【００４３】ＡＣｈＲは、リン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７−７．５中 125Ｉ標識アルファ−ブンガロトキシン
濃度を４ｎＭとした 125Ｉ標識アルファ−ブンガロトキ
シン溶液２マイクロリットル量とＡＣｈＲ溶液を混合
し、次に、得られた溶液を４℃で４時間インキュベート
することによって標識した。
Ｈ７−７．５中 125Ｉ標識アルファ−ブンガロトキシン
濃度を４ｎＭとした 125Ｉ標識アルファ−ブンガロトキ
シン溶液２マイクロリットル量とＡＣｈＲ溶液を混合
し、次に、得られた溶液を４℃で４時間インキュベート
することによって標識した。
【００４４】分析は、試験される各々の血清をアッセイ
緩衝液で多種に希釈し、三重に行なった。補充用正常ヒ
ト血清を、各試料に加え、最終反応混合液中の血清が全
部で５マイクロリットルになるようにした。希釈の目的
は、試験する血清由来抗ＡＣｈＲ自己抗体の濃度を、ア
ッセイで測定可能な範囲、望ましくは、アッセイ溶液中
の標識ＡＣｈＲの１０−２０％が抗ＡＣｈＲ自己抗体に
結合されている範囲内にすることである。行なう希釈は
様々であろうが、血清試料が結合するアッセイ溶液中の
標識ＡＣｈＲの濃度、および、重症筋無力症患者血清中
の抗ＡＣｈＲ自己抗体がおよそ１５００ｎＭまで高くな
り得るという事実を考慮に入れて決定される。補充正常
血清は各試料の免疫グロブリンの全濃度がほぼ等しくな
るように加える。
緩衝液で多種に希釈し、三重に行なった。補充用正常ヒ
ト血清を、各試料に加え、最終反応混合液中の血清が全
部で５マイクロリットルになるようにした。希釈の目的
は、試験する血清由来抗ＡＣｈＲ自己抗体の濃度を、ア
ッセイで測定可能な範囲、望ましくは、アッセイ溶液中
の標識ＡＣｈＲの１０−２０％が抗ＡＣｈＲ自己抗体に
結合されている範囲内にすることである。行なう希釈は
様々であろうが、血清試料が結合するアッセイ溶液中の
標識ＡＣｈＲの濃度、および、重症筋無力症患者血清中
の抗ＡＣｈＲ自己抗体がおよそ１５００ｎＭまで高くな
り得るという事実を考慮に入れて決定される。補充正常
血清は各試料の免疫グロブリンの全濃度がほぼ等しくな
るように加える。
【００４５】各々の試験血清の各々を希釈した３つの試
料のそれぞれは、１００マイクロリットルの標識ＡＣｈ
Ｒ溶液（２ｎＭ）と結合させ、結合は、４℃で一晩イン
キュベートした。次に、１００マイクロリットルのヤギ
抗ヒトＩｇＧ（血清５マイクロリットル中の全てのＩｇ
Ｇを沈降させるのに十分な濃度で）を加え、得られた溶
液を４℃で３０分間インキュベートし、全てのヒト血清
ＩｇＧを沈降させた。１ｍｌのアッセイ緩衝液を加えた
後、溶液を２０℃で２分間１０，０００×ｇで遠心し
た。上清を吸引し、ペレットを２回、各回１ｍｌのアッ
セイ緩衝液でボルテックスをかけて洗浄した後２分２０
℃で１０，０００×ｇで遠心し、上清を吸引した。最後
に、ペレット中の 125Ｉを標識的方法で、ガンマー計数
によって決定した。
料のそれぞれは、１００マイクロリットルの標識ＡＣｈ
Ｒ溶液（２ｎＭ）と結合させ、結合は、４℃で一晩イン
キュベートした。次に、１００マイクロリットルのヤギ
抗ヒトＩｇＧ（血清５マイクロリットル中の全てのＩｇ
Ｇを沈降させるのに十分な濃度で）を加え、得られた溶
液を４℃で３０分間インキュベートし、全てのヒト血清
ＩｇＧを沈降させた。１ｍｌのアッセイ緩衝液を加えた
後、溶液を２０℃で２分間１０，０００×ｇで遠心し
た。上清を吸引し、ペレットを２回、各回１ｍｌのアッ
セイ緩衝液でボルテックスをかけて洗浄した後２分２０
℃で１０，０００×ｇで遠心し、上清を吸引した。最後
に、ペレット中の 125Ｉを標識的方法で、ガンマー計数
によって決定した。
【００４６】５マイクロリットルの正常血清を用いて得
られたブランク量は、各試料から決定される量から減じ
た。
られたブランク量は、各試料から決定される量から減じ
た。
【００４７】本実施の結果は、第１図に示している。図
では、ヒト脚部筋肉ＡＣｈＲで決定した、抗ＩｇＧによ
って沈降し得る抗ＡＣｈＲ抗体の血清濃度の対数を、Ｔ
Ｅ６７１細胞由来ＡＣｈＲで決定した同じ濃度の対数の
関数としてプロットしている。各々の試料におけるこれ
ら２つの濃度の同一性の相違は、アッセイ法での実験的
な誤り、および、ヒト筋肉由来ＡＣｈＲと結合したアル
ファ−ブンガロトキシンの解離定数（１．８×１０-10
Ｍ、ルーキー（Ｌｕｋｙ）およびモルガン−ヒュース
（Ｍｏｒｇａｎ−Ｈｕｇｈｅｓ）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．，
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３７７，６１（１９８１））と、Ｔ
Ｅ６７１系サブラインＮｏ．２細胞由来ＡＣｈＲと結合
しているアルファ−ブンガロトキシンの解離定数（１．
４×１０-9Ｍ、シアピン（Ｓｙａｐｉｎ）ら、前出）と
の間の報告されている相違によって説明される。本実験
の結果により、ヒト筋肉由来ＡＣｈＲに対する血清自己
抗体は、ＴＥ６７１細胞由来ＡＣｈＲと７０％以上の交
叉反応性を有すること、および、免疫アッセイにおける
実際的目的では、二種の供給源由来ＡＣｈＲは相互換的
に使用可能である。
では、ヒト脚部筋肉ＡＣｈＲで決定した、抗ＩｇＧによ
って沈降し得る抗ＡＣｈＲ抗体の血清濃度の対数を、Ｔ
Ｅ６７１細胞由来ＡＣｈＲで決定した同じ濃度の対数の
関数としてプロットしている。各々の試料におけるこれ
ら２つの濃度の同一性の相違は、アッセイ法での実験的
な誤り、および、ヒト筋肉由来ＡＣｈＲと結合したアル
ファ−ブンガロトキシンの解離定数（１．８×１０-10
Ｍ、ルーキー（Ｌｕｋｙ）およびモルガン−ヒュース
（Ｍｏｒｇａｎ−Ｈｕｇｈｅｓ）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．，
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３７７，６１（１９８１））と、Ｔ
Ｅ６７１系サブラインＮｏ．２細胞由来ＡＣｈＲと結合
しているアルファ−ブンガロトキシンの解離定数（１．
４×１０-9Ｍ、シアピン（Ｓｙａｐｉｎ）ら、前出）と
の間の報告されている相違によって説明される。本実験
の結果により、ヒト筋肉由来ＡＣｈＲに対する血清自己
抗体は、ＴＥ６７１細胞由来ＡＣｈＲと７０％以上の交
叉反応性を有すること、および、免疫アッセイにおける
実際的目的では、二種の供給源由来ＡＣｈＲは相互換的
に使用可能である。
【００４８】二つの供給源由来のＡＣｈＲが、少なくと
も免疫アッセイの目的では、免疫学上同等であるという
結論をさらに支持するものとして、ヒト脚部筋肉由来Ａ
ＣｈＲとＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲとのモノクロー
ナル抗体を用いた比較により、ＴＥ６７１細胞由来ＡＣ
ｈＲ上にも存在しない脚部筋肉由来ＡＣｈＲ上のいかな
る抗原決定基も同定できなかった。
も免疫アッセイの目的では、免疫学上同等であるという
結論をさらに支持するものとして、ヒト脚部筋肉由来Ａ
ＣｈＲとＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲとのモノクロー
ナル抗体を用いた比較により、ＴＥ６７１細胞由来ＡＣ
ｈＲ上にも存在しない脚部筋肉由来ＡＣｈＲ上のいかな
る抗原決定基も同定できなかった。
【００４９】実施例ＩＩＩ ヒト筋肉アセチルコリン受容体に対する血清自己抗体の
ための固相免疫アッセイにおけるＴＥ７６１系細胞由来
アセチルコリン受容体の使用 （Ａ）ＡＣｈＲが付着した固相の調製 実施例ＩＩで述べた方法に引きつづき、ただし、ペレッ
トの体積に比較して、４倍の抽出緩衝液ではなく、８倍
量を用い、ＴＥ６７１系サブラインＮｏ．２の細胞培養
液から、７５ｍｌのＡＣｈＲのトリトンＸ−１００抽出
液が得られ、その試料は、寄託番号ＣＲＬ８８０５とし
てＡＴＣＣ寄託している。抽出液のＡＣｈＲは、次に、
リンドストロム（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ）ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ７４Ｃ、４３２−
４５９（１９８１）の以下に示す方法により、毒素−ア
ガロースでアフィニティーによって精製した：およそ
５．９×１０9 Ｍ ＡＣｈＲを含むトリトンＸ−１００
抽出液を、毒素−アガロースの３ｍｌのカラム（セファ
ロースＣ１４Ｂ（米国ニュージャージー州ピスカタウエ
イ、ファルマシア社）１ｍｌあたり０．５ｍｇナジャナ
ジャシアメンシス毒ＩＩＩ）を４２ｍｌ／ｈｒの速度
で、４℃で一晩再循環させた。（明らかに毒素に対して
低アフィニティーである、ＴＥ６７１ＡＣｈＲの改良さ
れた結合は、おそらく、５−１０ｍｇ／ｍｌの毒素を含
むアフィニティカラムを用いて得られたものであろ
う。）次にカラムを１０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．５中０．１％トリトンＸ−１００ １０ｍｌで
洗浄した。ＡＣｈＲの溶出は、溶出緩衝液（０．１％ト
リトンＸ−１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＮａＮ3 、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）
中１Ｍカルバミルコリンを用いて、３ｍｌの独立のアリ
コートで、４℃において８時間、次に１８時間、そして
最後に３６時間再循環させる。３つの溶出液は、次に混
合し、カルバミルコリンを除くために溶出緩衝液に対し
て４℃で透析した。上記の条件で、０．４４ｎｍｏｌｅ
加えたうち、０．２２６ｎｍｏｌｅが結合し、全部で
０．１０１ｎｍｏｌｅが１３．８ｎＭ溶液８．１ｍｌに
溶出した。
ための固相免疫アッセイにおけるＴＥ７６１系細胞由来
アセチルコリン受容体の使用 （Ａ）ＡＣｈＲが付着した固相の調製 実施例ＩＩで述べた方法に引きつづき、ただし、ペレッ
トの体積に比較して、４倍の抽出緩衝液ではなく、８倍
量を用い、ＴＥ６７１系サブラインＮｏ．２の細胞培養
液から、７５ｍｌのＡＣｈＲのトリトンＸ−１００抽出
液が得られ、その試料は、寄託番号ＣＲＬ８８０５とし
てＡＴＣＣ寄託している。抽出液のＡＣｈＲは、次に、
リンドストロム（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ）ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ７４Ｃ、４３２−
４５９（１９８１）の以下に示す方法により、毒素−ア
ガロースでアフィニティーによって精製した：およそ
５．９×１０9 Ｍ ＡＣｈＲを含むトリトンＸ−１００
抽出液を、毒素−アガロースの３ｍｌのカラム（セファ
ロースＣ１４Ｂ（米国ニュージャージー州ピスカタウエ
イ、ファルマシア社）１ｍｌあたり０．５ｍｇナジャナ
ジャシアメンシス毒ＩＩＩ）を４２ｍｌ／ｈｒの速度
で、４℃で一晩再循環させた。（明らかに毒素に対して
低アフィニティーである、ＴＥ６７１ＡＣｈＲの改良さ
れた結合は、おそらく、５−１０ｍｇ／ｍｌの毒素を含
むアフィニティカラムを用いて得られたものであろ
う。）次にカラムを１０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７．５中０．１％トリトンＸ−１００ １０ｍｌで
洗浄した。ＡＣｈＲの溶出は、溶出緩衝液（０．１％ト
リトンＸ−１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＮａＮ3 、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）
中１Ｍカルバミルコリンを用いて、３ｍｌの独立のアリ
コートで、４℃において８時間、次に１８時間、そして
最後に３６時間再循環させる。３つの溶出液は、次に混
合し、カルバミルコリンを除くために溶出緩衝液に対し
て４℃で透析した。上記の条件で、０．４４ｎｍｏｌｅ
加えたうち、０．２２６ｎｍｏｌｅが結合し、全部で
０．１０１ｎｍｏｌｅが１３．８ｎＭ溶液８．１ｍｌに
溶出した。
【００５０】ＡＣｈＲ濃度は、 125Ｉ標識アルファ−ブ
ンガロトキシン（リンドストロムら、前出）で標識した
ＡＣｈＲの免疫沈降によってアッセイする。アッセイ
は、ウサギ、マウス、あるいはラットなど由来ポリクロ
ーナル抗ＡＣｈＲ抗血清、高血清力価の抗ＡＣｈＲ自己
抗体を有する重症筋無力症患者由来血清、あるいは、ｍ
Ａｂ３５やｍＡｂ６４などの抗ＡＣｈＲモノクローナル
抗体を用いて、行ない得る。
ンガロトキシン（リンドストロムら、前出）で標識した
ＡＣｈＲの免疫沈降によってアッセイする。アッセイ
は、ウサギ、マウス、あるいはラットなど由来ポリクロ
ーナル抗ＡＣｈＲ抗血清、高血清力価の抗ＡＣｈＲ自己
抗体を有する重症筋無力症患者由来血清、あるいは、ｍ
Ａｂ３５やｍＡｂ６４などの抗ＡＣｈＲモノクローナル
抗体を用いて、行ない得る。
【００５１】精製したＡＣｈＲは、ミリポアミリタイタ
ー−ＨＡ９６ウエル濾過プレート（米国マサチューセッ
ツ州ベッドフォード、ミリポア社、カタログ番号ＳＴＨ
Ａ０９６ＮＳ）のウエルに、３０マイクロリットルのア
リコートを４℃で一晩作用させることによって結合させ
た（一つのウエルあたり４００ｆｍｏｌｅ以上のＡＣｈ
Ｒが結合可能である）。過剰の結合は、５０マイクロリ
ットルの抑制緩衝液（ｑｕｅｎｃｈ ｂｕｆｆｅｒ）
（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％トゥィ
ーン２０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＮ
3 、１０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．５）を加え、
２時間４℃で放置することにより抑制した。全ての液体
は、ミリポアミリタイター真空ホルダー（ミリポア社、
カタログ番号ＸＸ２８０９６００）を用いて除去した。
次に、試験血清資料（抑制緩衝液で適当に３０マイクロ
リットルに希釈）を各ウエルに加え、４℃で４時間放置
した。上述のように液体を除去した後、ウエルを３００
マイクロリットルの抑制緩衝液で２度洗浄した。次に
125Ｉ標識した。アフィニティー精製したヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ（抑制緩衝液中１×１０-8Ｍの溶液３０マイクロリ
ットル）をウエルに加え、２時間４℃で放置した。この
液体を除去し、３００マイクロリットルの抑制緩衝液で
二度洗浄した後、フィルターに穴をあけてウエルから取
りだし（ミリポアフィルターパンチを用いる。ミリポア
社カタログ番号ＸＸ２８０９６２０）、標準的方法でガ
ンマ計数を行なうため、ガンマーカウンターに入れた。
抑制緩衝液で希釈した正常ヒト血清を対照として用い、
試験試料中の抗ＡＣｈＲ自己抗体のＡＣｈＲへの結合を
示す、ガンマ線放出値は、試験試料について得られた値
から、固有の正常血清値を減じることによって得られ
る。本アッセイを用いて得られたデータは、第２図に示
しており、縦軸はガンマ線放出の１分あたりのカウント
（ｃｐｍ）の単位、横軸はアッセイした試験血清のマイ
クロリットルの単位である。
ー−ＨＡ９６ウエル濾過プレート（米国マサチューセッ
ツ州ベッドフォード、ミリポア社、カタログ番号ＳＴＨ
Ａ０９６ＮＳ）のウエルに、３０マイクロリットルのア
リコートを４℃で一晩作用させることによって結合させ
た（一つのウエルあたり４００ｆｍｏｌｅ以上のＡＣｈ
Ｒが結合可能である）。過剰の結合は、５０マイクロリ
ットルの抑制緩衝液（ｑｕｅｎｃｈ ｂｕｆｆｅｒ）
（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％トゥィ
ーン２０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＮ
3 、１０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．５）を加え、
２時間４℃で放置することにより抑制した。全ての液体
は、ミリポアミリタイター真空ホルダー（ミリポア社、
カタログ番号ＸＸ２８０９６００）を用いて除去した。
次に、試験血清資料（抑制緩衝液で適当に３０マイクロ
リットルに希釈）を各ウエルに加え、４℃で４時間放置
した。上述のように液体を除去した後、ウエルを３００
マイクロリットルの抑制緩衝液で２度洗浄した。次に
125Ｉ標識した。アフィニティー精製したヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ（抑制緩衝液中１×１０-8Ｍの溶液３０マイクロリ
ットル）をウエルに加え、２時間４℃で放置した。この
液体を除去し、３００マイクロリットルの抑制緩衝液で
二度洗浄した後、フィルターに穴をあけてウエルから取
りだし（ミリポアフィルターパンチを用いる。ミリポア
社カタログ番号ＸＸ２８０９６２０）、標準的方法でガ
ンマ計数を行なうため、ガンマーカウンターに入れた。
抑制緩衝液で希釈した正常ヒト血清を対照として用い、
試験試料中の抗ＡＣｈＲ自己抗体のＡＣｈＲへの結合を
示す、ガンマ線放出値は、試験試料について得られた値
から、固有の正常血清値を減じることによって得られ
る。本アッセイを用いて得られたデータは、第２図に示
しており、縦軸はガンマ線放出の１分あたりのカウント
（ｃｐｍ）の単位、横軸はアッセイした試験血清のマイ
クロリットルの単位である。
【００５２】正常ヒトＩｇＧをＡＣｈＲの換わりにウエ
ルに加え、正常ヒトＩｇＧに結合した 125Ｉ標識抗ヒト
ＩｇＧからのガンマ線放射を測定するものを標準とし
て、上述のように得られたガンマ線放出データから、自
己免疫ＩｇＧのグラム数あるいはモル数／患者血清のリ
ットル数、の単位で、重症筋無力症患者血清中のＡＣｈ
Ｒに対する自己抗体濃度を計算することができる。結果
はまた、実施例ＩＩで示した免疫沈降アッセイを用いて
得られる値に標準化することも可能である。ＡＣｈＲに
結合する自己抗体を検出するために抗ＩｇＧのみを用い
るのでなく、標識したサブクラス特異的な血清も使用で
き、それによって、自己抗体のサブクラスの寄与が決定
される。
ルに加え、正常ヒトＩｇＧに結合した 125Ｉ標識抗ヒト
ＩｇＧからのガンマ線放射を測定するものを標準とし
て、上述のように得られたガンマ線放出データから、自
己免疫ＩｇＧのグラム数あるいはモル数／患者血清のリ
ットル数、の単位で、重症筋無力症患者血清中のＡＣｈ
Ｒに対する自己抗体濃度を計算することができる。結果
はまた、実施例ＩＩで示した免疫沈降アッセイを用いて
得られる値に標準化することも可能である。ＡＣｈＲに
結合する自己抗体を検出するために抗ＩｇＧのみを用い
るのでなく、標識したサブクラス特異的な血清も使用で
き、それによって、自己抗体のサブクラスの寄与が決定
される。
【００５３】明らかに、ミリタイタープレートウエルに
結合しているＡＣｈＲのおよそ半数は、 125Ｉ標識アル
ファ−ブンガロトキシンに結合する能力を保持してい
る。従って、ＡＣｈＲ結合部位あるいはその近傍に対す
る、患者血清中の自己抗体分画は、血清について２種の
免疫アッセイを行なうことによって決定される：一つは
上述のものであり、もう一方では、ウエルに結合してい
るＡＣｈＲを、過剰量のアルファ−ブンガロトキシン
（あるいは類似の毒素）、あるいは、カルバミルコリン
などの低分子量コリン作動性リガンドを含む血清試料と
ともにインキュベートし、毒素あるいはコリン作動性リ
ガンド結合部位に、実質的に上記部位に結合する血清中
のあらゆる自己抗体が結合する際に外的に競合させるも
のである。上記二種のアッセイの結果から、毒素あるい
はコリン作動性リガンドによってＡＣｈＲに対する結合
を阻害される自己抗体分画が決定可能である；この分画
は、ＡＣｈ結合部位、あるいはその近傍に対する自己抗
体分画である、あるいは、ほぼそうであると言える。同
様に、ＡＣｈＲの主要免疫原領域に対する自己抗体分画
は、ラットモノクローナル抗体ｍＡｂ３５などの、ＡＣ
ｈＲの主要免疫原に対する過剰量のモノクローナル抗体
と混合した血清とともに、ウエルに結合したＡＣｈＲを
インキュベートすることにより、ＡＣｈＲとの結合を阻
害された分画を決めることによって決定できる。
結合しているＡＣｈＲのおよそ半数は、 125Ｉ標識アル
ファ−ブンガロトキシンに結合する能力を保持してい
る。従って、ＡＣｈＲ結合部位あるいはその近傍に対す
る、患者血清中の自己抗体分画は、血清について２種の
免疫アッセイを行なうことによって決定される：一つは
上述のものであり、もう一方では、ウエルに結合してい
るＡＣｈＲを、過剰量のアルファ−ブンガロトキシン
（あるいは類似の毒素）、あるいは、カルバミルコリン
などの低分子量コリン作動性リガンドを含む血清試料と
ともにインキュベートし、毒素あるいはコリン作動性リ
ガンド結合部位に、実質的に上記部位に結合する血清中
のあらゆる自己抗体が結合する際に外的に競合させるも
のである。上記二種のアッセイの結果から、毒素あるい
はコリン作動性リガンドによってＡＣｈＲに対する結合
を阻害される自己抗体分画が決定可能である；この分画
は、ＡＣｈ結合部位、あるいはその近傍に対する自己抗
体分画である、あるいは、ほぼそうであると言える。同
様に、ＡＣｈＲの主要免疫原領域に対する自己抗体分画
は、ラットモノクローナル抗体ｍＡｂ３５などの、ＡＣ
ｈＲの主要免疫原に対する過剰量のモノクローナル抗体
と混合した血清とともに、ウエルに結合したＡＣｈＲを
インキュベートすることにより、ＡＣｈＲとの結合を阻
害された分画を決めることによって決定できる。
【００５４】細胞系の寄託 ＴＥ６７１細胞系（サプラインＮｏ．２）、ハイブリド
ーマ系ｍＡｂ３５（モノクローナル抗体ｍＡｂ３５を産
生する）およびｍＡｂ６４（モノクローナル抗体ｍＡｂ
６４を産生する）の培養液は、１９８６年１月６日に先
立ち、特許手続の目的のための微生物寄託に関するブダ
ペスト協定および、その下に公布された規約に基づき、
米国メアリーランド州ロックビル、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され
た。ＴＥ６７１細胞培養液は、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ
８８０５を与えられている。ハイブリドーマｍＡｂ３５
の培養液はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８８５７を与えられて
いる。ハイブリドーマｍＡｂ６４は、ＡＴＣＣ寄託番号
ＨＢ８９８７を与えられている。これら３つの培養液全
ての試料は、産業財産局あるいは法的にそれらを入手す
る資格を与えられている他の部局から入手することが可
能になるであろう。
ーマ系ｍＡｂ３５（モノクローナル抗体ｍＡｂ３５を産
生する）およびｍＡｂ６４（モノクローナル抗体ｍＡｂ
６４を産生する）の培養液は、１９８６年１月６日に先
立ち、特許手続の目的のための微生物寄託に関するブダ
ペスト協定および、その下に公布された規約に基づき、
米国メアリーランド州ロックビル、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され
た。ＴＥ６７１細胞培養液は、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ
８８０５を与えられている。ハイブリドーマｍＡｂ３５
の培養液はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８８５７を与えられて
いる。ハイブリドーマｍＡｂ６４は、ＡＴＣＣ寄託番号
ＨＢ８９８７を与えられている。これら３つの培養液全
ての試料は、産業財産局あるいは法的にそれらを入手す
る資格を与えられている他の部局から入手することが可
能になるであろう。
【００５５】本発明は、ここに幾つかの特異的例ととも
に述べられているが、この分野に携わる者は、本発明の
本質の範囲内で多くの修飾および変法を考えつくであろ
う。これらの修飾法および変法は、ここに述べ、請求さ
れるように、本発明の範囲内である。
に述べられているが、この分野に携わる者は、本発明の
本質の範囲内で多くの修飾および変法を考えつくであろ
う。これらの修飾法および変法は、ここに述べ、請求さ
れるように、本発明の範囲内である。
【図１】 図１は、上記特許に示された血清抗ＡＣｈＲ
自己抗体の免疫沈降アッセイ法における、ヒト脚部筋肉
由来ＡＣｈＲとＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲの実質的
な同等性を示している。図は、 125Ｉ標識アルファ−ブ
ンガロトキシンで標識したヒト脚部筋肉ＡＣｈＲを用い
た上記免疫沈降アッセイで決定した４５人の重症筋無力
症患者血清中の抗ＡＣｈＲ自己抗体濃度（ｎＭ単位）の
対数（１０を底とする）を、同じ血清中の抗ＡＣｈＲ自
己抗体濃度を、ヒト脚部筋肉ＡＣｈＲをＴＥ６７１系細
胞由来ＡＣｈＲに換えた以外は上記と同様のアッセイ法
で決定したもの（ｎＭ単位）の対数（１０を底とする）
の関数として示したグラフである。
自己抗体の免疫沈降アッセイ法における、ヒト脚部筋肉
由来ＡＣｈＲとＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲの実質的
な同等性を示している。図は、 125Ｉ標識アルファ−ブ
ンガロトキシンで標識したヒト脚部筋肉ＡＣｈＲを用い
た上記免疫沈降アッセイで決定した４５人の重症筋無力
症患者血清中の抗ＡＣｈＲ自己抗体濃度（ｎＭ単位）の
対数（１０を底とする）を、同じ血清中の抗ＡＣｈＲ自
己抗体濃度を、ヒト脚部筋肉ＡＣｈＲをＴＥ６７１系細
胞由来ＡＣｈＲに換えた以外は上記と同様のアッセイ法
で決定したもの（ｎＭ単位）の対数（１０を底とする）
の関数として示したグラフである。
【図２】 図２は、ＴＥ６７１系細胞由来ＡＣｈＲを固
相結合抗原とし、12 5Ｉ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを抗原結
合自己抗体の検出に用いた、多数の重症筋無力症患者の
血清抗ＡＣｈＲ自己抗体の免疫アッセイのデータを示し
ている。
相結合抗原とし、12 5Ｉ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを抗原結
合自己抗体の検出に用いた、多数の重症筋無力症患者の
血清抗ＡＣｈＲ自己抗体の免疫アッセイのデータを示し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 596086505 10010 Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ ｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 92037，Ｕｎｉｔｅ ｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
Claims (9)
- 【請求項１】 重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自己抗体を
検出する方法であって、重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自
己抗体を含むと疑われる試料を固相結合ＡＣｈＲととも
にインキュベートする；および該インキュベートにより
ＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターを測
定する；の各工程を含み、該ＡＣｈＲがＴＥ６７１系の
細胞に由来することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 ＡＣｈＲのエピトープのサブセットに結
合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターが、該エピトープ
のサブセットに結合するエピトープ遮断物質の存在下で
ＡＣｈＲに結合した抗ＡＣｈＲ自己抗体のタイターと、
エピトープ遮断物質の非存在下でＡＣｈＲに結合した抗
ＡＣｈＲ自己抗体のタイターとを比較することにより測
定される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】 エピトープ遮断物質がクラーレ様神経毒
素、ニコチン様アセチルコリンリガンド、および、抗Ａ
ＣｈＲ自己抗体のＡＣｈＲ部分への結合を遮断するモノ
クローナル抗体から選択される、特許請求の範囲第２項
記載の方法。 - 【請求項４】 エピトープのサブセットがアセチルコリ
ン結合部位を含み、エピトープ遮断物質がアルファ−ブ
ンガロトキシンまたはカルバミルコリンである、特許請
求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】 エピトープのサブセットがＡＣｈＲの主
要免疫原領域を含み、エピトープ遮断物質がＡＴＣＣ受
託番号ＨＢ８８５７により寄託されているハイブリドー
マ細胞株から得ることができる抗体ｍＡｂ３５である、
特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項６】 重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自己抗体用
の血清の固相イムノアッセイのための基質であって、Ｔ
Ｅ６７１系の細胞から得られるＡＣｈＲと複合された固
体支持体を含む基質。 - 【請求項７】 ＡＣｈＲがＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８８
０５により寄託されているＴＥ６７１系サブラインＮ
ｏ．２の細胞から得られるものであることを特徴とす
る、特許請求の範囲第６項記載の基質。 - 【請求項８】 チューブの内壁の一部、あるいは、ミリ
タイターまたはマイクロタイタープレートのウエルの一
部である、特許請求の範囲第６項記載の基質。 - 【請求項９】 重症筋無力症関連抗ＡＣｈＲ自己抗体用
の血清の固相イムノアッセイによる重症筋無力症の診断
のためのキットであって、液体を保持するウエルおよび
ＴＥ６７１系の細胞から得られるＡＣｈＲと複合された
固体支持体を含む基質を含むキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US816383 | 1986-01-06 | ||
| US06/816,383 US4789640A (en) | 1986-01-06 | 1986-01-06 | Assays for myasthenia gravis |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62500859A Division JP2573636B2 (ja) | 1986-01-06 | 1987-01-05 | 重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0926424A true JPH0926424A (ja) | 1997-01-28 |
| JP2636824B2 JP2636824B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=25220450
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62500859A Expired - Fee Related JP2573636B2 (ja) | 1986-01-06 | 1987-01-05 | 重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキット |
| JP8154101A Expired - Fee Related JP2636824B2 (ja) | 1986-01-06 | 1996-06-14 | 重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキット |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62500859A Expired - Fee Related JP2573636B2 (ja) | 1986-01-06 | 1987-01-05 | 重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキット |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4789640A (ja) |
| EP (1) | EP0255537B1 (ja) |
| JP (2) | JP2573636B2 (ja) |
| AT (1) | ATE109569T1 (ja) |
| AU (1) | AU602883B2 (ja) |
| CA (1) | CA1287797C (ja) |
| DE (1) | DE3750317T2 (ja) |
| DK (1) | DK172659B1 (ja) |
| WO (1) | WO1987004251A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008039472A (ja) * | 2006-08-02 | 2008-02-21 | Kanazawa Univ | 胸腺腫合併重症筋無力症の診断方法 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8822552D0 (en) * | 1988-09-26 | 1988-11-02 | Dow Chemical Nederland | Polymer polyol dispersions process for making them & polyurethane foams prepared using such polyol dispersions |
| USH1212H (en) | 1988-09-29 | 1993-07-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Generic detection with a receptor-based fiber optic sensor |
| US6489357B1 (en) | 1998-06-04 | 2002-12-03 | University Of Puerto Rico | Tobacco cembranoids block the expression of the behavioral sensitization to nicotine and inhibit neuronal acetylcholine receptors |
| DE60045577D1 (de) * | 1999-07-05 | 2011-03-10 | Leuven K U Res & Dev | Von willebrand-faktor-aktivitätsnachweis |
| CA2505125A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-27 | Sheldon P. Rothenberg | Assay for autoantibodies to folate receptors |
| US7807378B2 (en) * | 2005-12-29 | 2010-10-05 | Industrial Technology Research Institute (Itri) | Method of diagnosing myasthenia gravis and kits therefor |
| WO2009131435A1 (en) * | 2008-04-23 | 2009-10-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Linker containing bungarotoxin and a binding peptide |
| GR1007341B (el) | 2010-04-21 | 2011-07-05 | ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ (κατά ποσοστό 40%), | Διαγνωστικος προσδιορισμος |
| CN111676282B (zh) * | 2020-01-13 | 2022-05-06 | 中南大学湘雅医院 | G0s2基因在检测重症肌无力患者病情和治疗情况中的应用 |
| CN111693693B (zh) * | 2020-06-29 | 2022-03-04 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 人体液中肌炎、重症肌无力自身抗体检测试剂盒及方法 |
| CN116773804B (zh) * | 2022-10-19 | 2026-02-10 | 陕西脉元生物科技有限公司 | 一种检测AChR阻断型抗体的试剂盒、检测方法与应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US30059A (en) * | 1860-09-18 | Improvement in machine-gearing | ||
| US4033722A (en) | 1975-08-08 | 1977-07-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Assay for myasthenia gravis |
| US4078049A (en) * | 1977-02-28 | 1978-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Acetylcholine assay |
| US4202875A (en) * | 1978-03-20 | 1980-05-13 | The Salk Institute For Biological Studies | Receptor for biochemical assay system |
| US4518527A (en) * | 1983-08-16 | 1985-05-21 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Polypeptides related to the pre-acetylcholine receptor-α of the electric organ of Torpedo californica |
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1986
- 1986-01-06 US US06/816,383 patent/US4789640A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-01-05 JP JP62500859A patent/JP2573636B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-01-05 DE DE3750317T patent/DE3750317T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-01-05 AT AT87900919T patent/ATE109569T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1987-01-05 AU AU69396/87A patent/AU602883B2/en not_active Ceased
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- 1987-09-04 DK DK198704628A patent/DK172659B1/da not_active IP Right Cessation
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1996
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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