JP2573636B2 - 重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキット - Google Patents

重症筋無力症のための改良アッセイ法とその用途のための基質およびキット

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Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は重症筋無力症（myasthenia gravis）の診断
のための免疫化学的アツセイ法に関するものである。
〔発明の背景〕
重症筋無力症は自己免疫病の一つである。該疾患にか
かつた患者は、神経筋接合部のアセチルコリン受容体上
の抗原決定基（epitope）に対する自己抗体を生成す
る。該自己免疫応答は、神経筋伝達を損なう。該神経筋
伝達減損が、該疾患の特徴である筋肉の弱化および易疲
労性の原因となる。
参照によりここに含めるものとする、米国特許第4,20
2,875号およびRE30,059号に於いて、重症筋無力症の診
断のための生化学的アツセイ法が示されている。
上記特許によるアツセイ法は、重症筋無力症患者の血
清由来の受容体タンパク質に対する自己抗体と複合体を
形成している標識アセチルコリン受容体タンパク質の、
抗ヒト免疫グロブリンとの免疫沈降を含む。使用される
アセチルコリン受容体タンパク質（acetylcholine rece
ptor protein,以下“AChR"とする）は、哺乳類筋肉の粗
抽出液の一部である。該アツセイ法におけるAChRの標識
は、粗抽出液中の該タンパク質に、放射性標識したナジ
ヤ・ナジヤ・シアメンシス毒（Naja naja siamensis fo
xin）やアルフア−ブンガロトキシンなどのクラーレ様
神経毒素を結合させることにより行なう。上記毒素は、
該タンパク質上のアセチルコリン結合部位に結合するこ
とによつてAChRと複合体を形成する。
上述の特許で述べられているアツセイ法は、商業的使
用が広く行なわれ、現状では重症筋無力症の診断で推奨
されるアツセイ法であるが、多くの欠点も含んでいる。
上記アツセイで用いられるAChRの望ましい素材は、ヒト
の切断された足の筋肉である。該組織は、供給量が少な
く、多くの法的な難点のため、入手可能な場合でも商業
的使用のための得ることが困難である。さらに、該タン
パク質は健康な、切断されていない組織でさえ非常に低
濃度でしか存在しておらず、また、切断された組織から
該タンパク質を含む筋肉の粗抽出液を分離する前に不可
避的に該タンパク質の実質的なタンパク質分解反応が起
こるため、アツセイに適当なAChRは組織から非常に少量
にしか得ることができない。他の、より豊富な、AChRの
ための哺乳動物筋肉源も入手可能である；しかし、これ
らの他の筋肉源は、ヒトの足筋肉源における、少量しか
得られないことやタンパク質分解などの欠点を完全に解
消するわけではなく、より重要なことには、ヒトAChRに
対するヒト自己抗体が他の哺乳動物由来AChRと低頻度で
しか交叉反応しない（例えば、ヒト足筋肉AChRの典型的
な代用物である、除神経ラツト筋肉由来AChRの場合に
は、わずかに2.1％程度まで）ため、非ヒト供給源由来A
ChRは該アツセイにはより適していない。
免疫化学的アツセイに適当なヒト筋肉AChRの供給量に
制限があることにより、上記特許で示された筋肉粗抽出
液を用いた免疫沈降アツセイによる以外の、ヒト血清中
の重症筋無力症関連自己抗体のアツセイを行なうこと
は、実際的ではない。ヒト筋肉AChRと実質的に同程度に
ヒト筋肉AChRに対するヒト自己抗体と反応する、より豊
富なAChR源が容易に入手できることは、固相法および酵
素結合性イムノソルベントアツセイ（enzyme−linked i
mmnosorbent assay;ELISA）などの、重症筋無力症診断
のための、他のより感度の高い免疫アツセイ法を実行可
能にするであろう。
重症筋無力症患者の筋肉の弱さの重症度は、患者の血
清中の抗AChR抗体濃度と密接に関連しているわけではな
い。これは恐らく、これらの抗体が伝達を減損させる多
様で複雑な機構（抗原による免疫調製による受容体数の
減少、補体媒介集中性分解、結合した抗体によるAChR機
能の直接的低下）、および神経筋伝達の性質（伝達を確
実にするための大きな安全係数を持つ“全か無か”の形
式で起こる）、および、低下した神経筋伝達を補うため
に体内で行なわれ得る複雑な適応機構（アセチルコリン
放出の増加、神経筋接合部領域の増大）に主によるもの
であろう。
重症筋無力症患者においては、自己抗体はAChRの多様
な領域上の多様なエピトープに結合する。これらの領域
のひとつは、“主要免疫原領域”と呼ばれる。この領域
はAChRのアルフア−サブユニツトの細胞外表面上に位置
する。これらの猟奇の別のものは、アセチルコリン（以
下“ACh"）結合部位であり、これもまたアルフアーサブ
ユニツト上に位置している。平均的な重症筋無力症患者
では、約半分の抗AChR自己抗体が主要免疫原領域に対す
るものである。主要免疫原領域に結合する自己抗体は抗
原による免疫調製を引き起こし、生体内で補体を固定す
ることができ、それによってACh受容体数を減少させ
る。ACh結合部位に対する抗体は、非常に低濃度で、神
経筋伝達におけるAChR機能を即時に低下させるのに極め
て効果的であると考えられる。重症筋無力症患者の血清
中の全抗AChR抗体濃度だけでなく、AChRの主要免疫原領
域およびACh結合部位に対する、これらの抗体の一部を
測定することが可能となることは、有用であろう。
上述の特許によるアツセイ法は、筋肉AChRのACh結合
部位に結合する、放射性標識した毒素と、筋肉AChRとを
結合させることにより該タンパク質を高比活性で標識す
ることによつている。上記アツセイ法では、結合部位お
よびその近傍領域が毒素によつて遮断され、それによつ
て結合部位のエピトープ、およびその近傍の他のエピト
ープが自己抗体による結合を受けられなくなるため、前
記特許のアツセイ法では、ACh結合部位に対する自己抗
体を特異的にアツセイすることは不可能であつた。ここ
に示す本発明は、実際的な目的では、ヒト筋肉AChRと免
疫学的に区別できず、容易に単離できる、多量のAChRの
供給源の発見に基づき、自己抗体の結合によつてAChR上
の一部のエピトープが遮断されない免疫アツセイ法を実
行可能にする。従つて、本発明によれば、診断が可能で
ある、患者血清中の抗AChR自己抗体の全濃度のみでな
く、患者の疾患のより詳しい解析や疾患の治療法計画の
基礎の改善を可能とするような、AChRの病理的に特徴的
な部位、に対するこれらの抗体の一部を測定することが
可能となる。
マクアリスター（McAllister）ら、Int.J.Cancer20、
206−212（1977）は、ヒト小脳髄芽細胞腫由来の、TE67
1、サブラインNo.２と呼ばれる細胞系の確立を報告し
た。上記およびそれと同等のAChR産生細胞系を本明細書
では“TE671系”と呼ぶ。
シアピン（Syapin）ら、Brain Research231、365−37
7（1982）は、TE671系細胞は哺乳類神経ニコチン性アセ
チルコリン受容体を有するものとして特徴づけた。本分
野では、上記受容体タンパク質は、重症筋無力症自己抗
体が反応するAChRとは免疫学上実質的に異なる（すなわ
ち、低い免疫学的交叉反応性を有する）と考えられてい
る（すなわち、神経性AChRと筋肉性AChRに対する抗体は
互いにほとんど、あるいは完全に交叉反応性を持たない
と考えられている）（パトリツク（Patrick）とスタル
カツプ（Stallcap）、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）7
4、4689（1977）；スワンソン（Swanson）ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.（U.S.A.）80、4532（1983）；スミス（Smi
th）ら、J.Neuroscience5、2726（1985））。
mAb35と呼ばれるものを含む、筋肉AChRの主要免疫源
領域に対するラツトモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマが、ツアルトス（Tzartos）ら、J.Biol.Che
m.256、8635−8645（1981）およびProc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.79、188（1982）によつて示されている。筋肉ACh
Rに対するモノクローナル抗体を分泌する、mAb64と呼ば
れるものを含む他のハイブリドーマも開発されている
（ツアルトス（Tzartos）ら、J.Neuroimmunology,10、2
35−253（1986））。
〔発明の概要〕
TE671系細胞上のAChRが、免疫アツセイにおける実際
的目的において、ヒト筋肉AChRと免疫学的に区別でき
ず、上記特許で示された重症筋無力症のための免疫沈降
アツセイにおいて、切断されたヒト脚部筋肉由来のヒト
筋肉AChRと実質的に同様に機能することができ、予期せ
ず、現在明らかになつている。
しかしながら、ヒト脚部筋肉由来AChRとは異なり、TE
671系細胞由来AChRは実質的に無限量、比較的高濃度で
容易に入手可能であり、筋肉供給源由来AChRでの混入に
つながるタンパク質分解や他の要素による不均質性およ
び不純性が実質的に回避できる。
上記発見により、重症筋無力症診断のための本質的な
改良免疫化学的アツセイ系が実行可能となる。
〔図面の簡単な説明〕
第１図は、上記特許に示された血清抗AChR自己抗体の
免疫沈降アツセイ法における、ヒト脚部筋肉由来AChRと
TE671系細胞由来AChRの実質的な同等性を示している。
図は、125I標識アルフア−ブンガロトキシンで標識した
ヒト脚部筋肉AChRを用いた上記免疫沈降アツセイで決定
した45人の重症筋無力症患者血清中の抗AChR自己抗体濃
度（nM単位）の対数（10を底とする）を、同じ血清中の
抗AChR自己抗体濃度を、ヒト脚部筋肉AChRをTE671系細
胞由来AChRに換えた以外は上記と同様のアツセイ法で決
定したもの（nM単位）の対数（10を底とする）の関数と
して示したグラフである。
第２図は、TE671系細胞由来AChRを固相結合抗原と
し、125I標識ヤギ抗ヒトIgGを抗原結合自己抗体の検出
に用いた、多数の重症筋無力症患者の血清抗AChR自己抗
体の免疫アツセイのデータを示している。
〔発明の詳細な説明〕
一つの局面において、本発明は重症筋無力症診断のた
めの、前述の特許に示されたアツセイ法および方法にお
ける改良を含むものである。これらの改良点は、筋肉粗
抽出液中のAChRを用いず、TE671系細胞由来AChRを使用
するところにある。
前述のように、上記特許のアツセイおよびその方法
は、重症筋無力症患者の血清中の抗AChR自己抗体を結合
した標識AChRの免疫沈降による。AChRの標識は、放射性
標識、望ましくは125I標識を施した、AChRのACh結合部
位に高親和的に結合するクラーレ様神経毒素で行なう。
AChRを標識するのに用いられるクラーレ様毒素は、コブ
ラや海蛇のような多種の有毒爬虫類動物に見出される、
天然に存在するタンパク質である。
多くの上記毒素が単離され、配列が決定されている。
例えば、カールソン（Karlsson）、Handbook of Experi
mental Pharmacology52、159−212（1979）参照。標識
に望ましい毒素は、カールソン、前出に示されている、
いわゆる“長神経毒（long neurotoxin）”である。最
も望ましいのは、ブンガルス・マルチシンクタス（Bung
arus multicinctus）由来のアルフア−ブンガロトキシ
ンである。
別の局面においては、本発明は、TE671系細胞を培養
することにより、ヒト血清中の抗AChR自己抗体の免疫ア
ツセイによる重症筋無力症診断に適当なAChRを産生する
方法、および、TE671系細胞培養液から上記免疫アツセ
イに使用するのに適当な上記AChRの調製液を得る方法に
関するものである。
TE671系細胞の培養、および、同培養液からのAChR調
製液の回収は、以下の実施例に示す。
本明細書における“TE671系細胞”とは、（ｉ）亜系
（subline）No.２培養液、および寄託番号CRL8805とし
てATCCに寄託されている該亜系の培養液を含む、あらゆ
るTE671細胞系培養液由来の細胞；あるいは（ii）
（ｉ）で規定したあらゆる培養液の二次培養液の細胞；
あるいは（iii）（ｉ）あるいは（ii）で規定したあら
ゆる細胞の突然変異体を意味する；上記細胞（（ｉ），
（ii）および（iii）のもの）は免疫アツセイにおける
実際的な目的で、ヒト筋肉AChRと免疫学上実質的に同等
のAChRを産生するものとする。“二次培養液”とは、あ
る培養液の細胞から培養した培養液（原培養液（source
culture））あるいは、問題となる二次培養液と原培養
液との間の二次培養の回数に関わらず、原培養液のあら
ゆる二次培養液を意味する。“TE671系細胞”の定義
（ｉ）および（ii）で規定される細胞の突然変異体は、
天然に生じる変異体、あるいは、継代の繰り返し、化学
的処理、照射、細胞融合、形質転換、形質導入、細胞核
への核酸のマイクロインジエクシヨン等の人為的介入に
よる変異体を含む。
免疫アツセイにおける実質的目的で、あつAChRがヒト
筋肉AChRを免疫学上実質的同等であることを確実にする
ための方法は実施例IIに示されている。一般的には、ヒ
ト血清中の抗ヒト筋肉AChR抗体が、問題となるAChRと高
度な交叉反応性（少なくとも50％程度まで）を有するか
どうかという基準は確認される。基準が得られるか否か
は、ヒト筋肉AChRと問題のAChRの双方を、いずれかのAC
hR上の抗原決定基に対して反応すると知られている一群
のモノクローナル抗体で試験することによつて確認され
る；もし、モノクローナル抗体に対応する抗原決定基の
全て、あるいはほぼ全て（すなわち、10分の９以上）が
上記試験の結果双方のAChR上に存在するとすれば、免疫
アツセイにおける実際的目的では、二つのAChRは免疫学
上区別できない（すなわち、実質的に同等である）と結
論することができる。上記の免疫学上区別できない２種
のAChRを特徴づける、高度のモノクローナル抗体の交叉
反応性はまた、前述の特許で述べられている免疫沈降ア
ツセイにおける標識毒素に対する親和性の相違などの、
あらゆる既知の非免疫学的要素についての補正後、ヒト
筋肉AChRの免疫アツセイで決定された血清試料の抗AChR
抗体の力価がTE671系細胞由来AChRの力価に比べ、わず
か25％（不可避の実験上の不確実性により若干の変動が
ある）しか大きくないであろうということを示唆する。
二種のAChRで決定された抗AChR抗体の力価の相関は、上
記特許による免疫沈降アツセイで決定された力価と実施
例IIに示される力価を、抗AChR抗体力価が少なくとも一
桁以上の範囲の少なくとも10種の血清について比較する
ことによつて確実に確かめることが可能である。
ATCCに寄託番号CRL8805として寄託されている、TE671
系亜系２の培養細胞のAChRは、免疫アツセイにおける実
際的目的では、ヒト筋肉AChRと免疫学上区別できない。
実際、第１図でプロツトされたデータに示されるよう
に、毒素に対する親和性の相違で補正した後（実施例II
参照）、上記培養細胞由来AChRとヒト脚部筋肉由来AChR
に関する、ヒト血清中の抗AChR自己抗体の交叉反応性
は、実験的誤差内で、ほぼ100％であり；これら二種の
供給源由来のAChRは、重症筋無力症患者の同疾患の診断
の為の血清の免疫アツセイで交換可能である。
本発明はさらに、TE671系細胞由来AChRを抗原として
用いる、ヒト筋肉AChRに対する自己抗体の固相免疫アツ
セイ法を含む。抗AChR自己抗体に関する免疫アツセイ
は、これまではヒト筋肉AChRを十分量得ることが極めて
困難であり、それに付随する高コストのために実行不可
能であつたが、TE671細胞由来AChRの有効性により、容
易に行なえるようになる。固相免疫アツセイは、固相免
疫アツセイ分野で既知の方法に従い、TE671系細胞由来A
ChRを用いて行なう。
固相免疫アツセイの“基質”は、免疫アツセイ分野で
既知の多くの方法のいずれかによつて、AChRを固体支持
体に共有結合的あるいは非共有結合的に結合させること
によつて作製する。同分野で知られている固相支持体の
うちで使用し得るものは、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリメタクリレー
ト、ポリアクリルアミド、AChRを付着させることのでき
る他の合成重合体物質、ガラス、ニトロセルロース、セ
ルロース、およびアガロース製のものである。固相支持
体は、例えばある種のアガロース物質（例えば、米国ニ
ュージャージー州ピスカタウエイ、フアルマシア社のセ
フアクリルＳ−500）などで形成されているような“マ
クロポア（macroporous）”ゲル型支持体も可能であ
る。固相支持体は、極小球あるいはビーズ（例えば“ラ
テツクス”ビーズ）などの微小顆粒の形態、あるいは、
微量遠心チューブなどのチューブの内壁、マイクロタイ
タープレートあるいはミリタイタープレートのウエルも
可能である。AChRを付着させた固相支持体は、本分野で
理解されているように、AChRで占められていない支持体
上の部位を遮断することによりバツクグラウンドを低下
させるために適当な洗浄および材料とのインキユベーシ
ヨンを行なつた後、また、AChR上のあるエピトープを遮
断する物質（クラーレ様神経毒素、低分子コリン作動性
リガンド、あるいは抗体など）と随意のプレインキユベ
ーシヨンを行なつた後、実施例IIIで示されているよう
に、あるいは本分野で理解されているように、血清ある
いは、より一般的には適当な緩衝液によるその希釈液と
ともにインキユベートする。随意に、AChR結合固相支持
体とのインキユベートに先立ち、血清（あるいは希釈
液）をある種の物質（クラーレ様神経毒素、低分子量コ
リン作動性化合物、あるいは抗体）と、血清中のあらゆ
る自己抗体がAChR上のあるエピトープに結合することと
外的に競合するのに十分な濃度で混合することもでき
る。使用され得る上記エピトープ遮断物質によつて遮断
されないAChR上のエピトープに対する血清中の自己抗体
はAChRに結合するであろう。本分野で理解されているよ
うに適当な洗浄を行なつた後、次に、標識抗自己抗体、
スタフイロコツカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）由来の標識したＡタンパク質、あるいは検出のた
めに標識されており、自己抗体には結合するが上記系の
他の物質には有意には結合しないようなタンパク質など
の物質とインキユベートすることにより、AChRに結合す
る自己抗体を検出する。
望ましくは、標識抗自己抗体を検出に使用する。典型
的には、標識抗自己抗体は、標識されたポリクローナル
抗ヒトIgGと規定されるであろう。しかしながら、抗ヒ
トIgG1あるいは抗ヒトIgMなどのポリクローナルサブク
ラス特異的抗イムノグロブリン、あるいは、一定のクラ
スあるいはサブクラスに特異的ではない抗ヒトイムノグ
ロブリンも使用し得る。検出のために使用する抗血清
は、典型的にはヤギ、ウサギ、ラツト、あるいは、マウ
スであるが、他の非ヒト哺乳類も供給源として使用可能
である。
固相免疫アツセイがELISAである場合には、抗ヒト免
疫グロブリン、S.アウレウスのＡタンパク質、あるいは
抗AChR自己抗体に結合する物質の標識は、酸あるいはア
ルカリホスフアターゼ、ペルオキシダーゼ、あるいは、
ベータ−ガラクトシダーゼなどの酵素であつて、検出
は、本分野で知られているように、酵素標識によつて触
媒される反応によつて産生される産物を用いて行なう。
固相免疫アツセイがELISAでなく、抗免疫グロブリ
ン、S.アウレウスＡタンパク質、あるいは、他の物質上
に標識が存在する場合には、標識は通常酵素とは異なる
ものとなるであろう。上記非酵素標識は、放射性元素、
クロモフアオあるいはフルオロフオア、およびビオチン
を含む；これら各々の標識各々の検出法は、本分野で知
られている他の使用可能な標識と同様に、本分野で既知
である。125I標識が望ましい。
別の方法では、抗AChR自己抗体が結合し、非標識抗自
己抗体も結合しているAChRは、標識したS.アウレウスＡ
タンパク質をともにインキユベーシヨンし、Ａたんぱく
質上の標識を検出することによつて検出する。Ａタンパ
ク質上の標識は、上記の、あるいは本分野で知られてい
る他の酵素あるいは別のいかなる標識も可能である。
本発明の別の局面は、AChR上のエピトープの多様なサ
ブセツトに結合する上記自己抗体の分画の力価によつ
て、重症筋無力症患者の抗AChR自己抗体を解析する方法
である。本方法は、患者血清に対する４種の固相免疫ア
ツセイのうち少なくとも２種のアツセイを行なうことを
含むものであり、その４種の免疫アツセイは次の点を除
いては実質的に同等である；一つは、AChRのみが結合し
ている固相を用いるもの；一つは、血清試料とのインキ
ユベーシヨンの前に、あるいは同時に、主要免疫源領域
に対するモノクローナル抗体（mAb 35など）とインキユ
ベートしたAChRが結合した固相を用いるもの；一つは、
血清試料とのインキユベーシヨンに先立つか、あるいは
同時にクラーレ様神経毒素とインキユベートしたAChRが
結合した固相を用いるもの；および、一つは、血清試料
とのインキユベーシヨンに先立つか、あるいは同時に、
ACh結合部位に強く結合するが、神経毒素のように近傍
領域を遮断しないような低分子量化合物（例えば、カル
バミルコリンなどのニコチン性コリン作動性化合物）と
インキユベートしたAChRが結合した固相を用いるもの。
AChRのみを用いたアツセイは、AChR上のエピトープに対
する全自己抗体の力価についての情報を与える。主要免
疫原領域に対するモノクローナル抗体を用いたアツセイ
は、AChRの主要免疫原領域の外側のエピトープに対する
自己抗体の力価に関する情報を与える。クラーレ様神経
毒素を用いたアツセイは、ACh結合部位、および毒素に
よつて遮断された近傍部位の外側のエピトープに対する
自己抗体の力価に関する情報を与える。最後に、ACh結
合部位に結合する低分子量化合物を用いたアツセイは、
ACh結合部位自体に対する自己抗体の力価に関する情報
を与える。通常これらのアツセイでは、エピトープ遮断
物質とAChRとのインキュベーシヨンは、遮断物質と血清
試料とを化合させることとによつて行なわれ、遮断物質
と同じエピトープに結合すると考えられる血清中のほぼ
全ての自己抗体が結合する際に外的に競合するために、
試料中十分に高濃度で、遮断物質を免疫アツセイ基質
（すなわち、AChRが結合した固相支持体）とインキュベ
ートする。
上で示唆したように、固相免疫アツセイの基礎は、TE
671系細胞由来AChRが共有結合あるいは非共有結合で複
合体を作る基質物質である。これらのAChRが結合した固
相基質もまた、本発明の一部である。これらの基質は、
ある抗原に対する抗体に関する固相免疫アツセイに適当
な方法で、固相支持体に抗原を付着させるための、本分
野で既知のいずれかの方法で調製する。
TE671系細胞由来AChRは、重症筋無力症診断のための
キツトの作製を容易にする。該キットもまた、本発明に
含まれる。該キツトは、TE671系細胞由来AChRおよび、
本発明による基質を調製するためにAChRが付着し得る固
相支持体を含む。任意に、該キツトは、本発明による基
質を含むことができる（すなわち、TE671系細胞由来ACh
Rが既に付着している、固相支持体）。本発明のキツト
はまた、抗AChR自体抗体に関する患者血清の固相免疫ア
ツセイに必要な他の要素、例えば、抗AChR自己抗体によ
るAChRの部分への結合を遮断するリガンドあるいはモノ
クローナル抗体（キツトが、自己抗体が結合するAChR上
の部位を解析するアツセイが使用される場合）、緩衝
液、検出のために標識された抗ヒトIgG、および実施例I
IIに示される他の構成要素、および、固相免疫アツセイ
分野で理解される他の構成要素なども含むことができ
る。
本発明は、以下の実施例で、より詳細に示される。
実施例Ｉ TE671系細胞の培養 哺乳動物細胞の培養に関する、本分野で既知のいかな
る技術も、TE671系細胞の培養に使用し得る。
TE671細胞を賠償する望ましい方法は、37℃で、90％
空気、10％CO2である大気中で、10％ウシ胎児血清を含
む、イスコフ（Iscove）が修飾したダルベツコの最小必
要培地（Dulbecco′s minimal essential medium）（米
国カリフオルニア州サンタアナ、アービン・サイエンテ
イフイツク社）を用いるものである。
微小体積は、1.5ml培地中３×105細胞のイノキュラム
を用いて、35mm培養皿で培養する。３日後に培地を交換
し、６日目あるいは７日目に最適のAChR量を得る。
大量培養では、プラスチツク製ローラーボトル（米国
カリフオルニア州オツクスナルド、フアルコン・ラブウ
エア、ベクトン−デイキンリン社）が使用される。850c
m2ボトルの場合には、培地150mlに３×107細胞を注入す
る;1750cm2ボトルの場合では、培地300mlに６×107細胞
を注入する。培地は５日目に交換し、９日目から10日目
に、AChR収量は最適となる。
実施例II TE671系細胞由来アセチルコリン受容体の単離および解
析と、免疫沈降アツセイにおける該受容体の使用 AChRは、典型的には、一度に850cm2ローラ−ボトル６
個から７個分の培養液から単離されてきたが、はるかに
多量の培養液を同時に、容易に操作することが可能であ
る。以下の方法は、TE671系サブラインNo.２の細胞培養
液からAChRを単離する際に通常用いたものであり、細胞
試料は、寄託番号CRL8805として、ATCCに寄託されてい
る： 実施例１に述べたように培養し、９日目あるいは10日
目の各々850cm2ボトルの培養液に、25mlの回収緩衝液
（harvest buffer）（100mM NaCl、10mM Na−リン酸緩
衝液、10mM NaN3、15mM EDTA（エチレンジアミン四酢
酸）、2mM PMSF（フエニルメタンスルホニルフルオライ
ド）、15mMIAA（ヨード酢酸）、および5mMベンズアミジ
ン、pH7.5）を加える、次に、細胞がプラスチックから
離れるまでボトルを激しく振盪する。緩衝液および細胞
を氷上のボトルに集め、ローラーボトルをさらに100ml
の回収緩衝液でボトルからボトルへすすぎ、残りととも
にプールする。次に、ポリトロンホモジナイザーを用
い、泡が生じる直前のスピードで15秒間細胞を破壊す
る。膜と他の粒子を、ホモジユネートをベツクマンTi5
0.2ローター（米国カリフオルニア州パロアルト、ベツ
クマン・インストルメント社、スピンコ部門）で４℃、
45,000rpm（302,000×ｇ）で30分間遠心することによつ
て集める。典型的には、850cm2ボトルあたり、1.5mgの
ペレツトが回収される。ペレツトは、４倍量の抽出緩衝
液（10mMリン酸ナトリウム、5mM EDTA、5mM EGTA（エチ
レングリコール、ビス−（２−アミノエチルエーテル）
−N,N,N′,N′−四酢酸）、5mM IAA、5mM ベンスアミジ
ン、2mM PMSF、２％トリトンＸ−100、pH7.5）中に置
き、ポリトロンで15秒間おだやかに懸濁する。４℃で緩
やかに振盪して30分間抽出した後、調製液を上と同様に
遠心する。上清は典型的には、850cm2ボトルあたりおよ
そ6.6×10-11モルの収量で、約1.1×10-8ＭのAChRを含
む。比較となる刻んだ筋肉組織の粗抽出液では、AChRは
約２×10-10Ｍから２×10-9Ｍ、一般的には１×10-9以
下しか含まない。
免疫沈降アツセイは、TE671細胞あるいは切断したヒ
ト脚部由来筋肉のいずれかの２％トリトンＸ−100抽出
液（本実施例中で前述）から2nMのAChRを用いて、実質
的に前述の特許に示された方法で、45人の患者の血清に
対して行なつた。TE671細胞抽出液中のAChR濃度は、ア
ツセイ緩衝液（100mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム緩衝
液、10mM NaN3、0.5％トリトンＸ−100、pH7.5）で希釈
し、2nMに下げた。使用した筋肉抽出液はまれなもので
あり、AChR濃度は約2nMであり、希釈せずに使用した。
より典型的には、筋肉抽出液中のAChR濃度は、顕著によ
り低いはずであり、標準的な方法（例えば、アミコン濃
縮機（米国アサチユーセツツ州ダンバース、アミコン
社））によつて、AChR濃度が2nMに達するまで増加させ
る。
AChRは、リン酸ナトリウム緩衝液、pH7−7.5中125I標
識アルフア−ブンガロトキシン濃度を4nMとした125I標
識アルフア−ブンガロトキシン溶液２マイクロリツトル
量とAChR溶液を混合し、次に、得られた溶液を４℃で４
時間インキユベートすることによつて標識した。
分析は、試験される各々の血清をアツセイ緩衝液で多
種に希釈し、三重に行なつた。補充用正常ヒト血清を、
各試料に加え、際夕反応混合液中の血清が全部で５マイ
クロリツトルになるようにした。希釈の目的は、試験す
る血清由来抗AChR自己抗体の濃度を、アツセイで測定可
能な範囲、好ましくは、アツセイ溶液中の標識AChRの10
−20％が抗AChR自己抗体に結合されている範囲内にする
ことである。行なう希釈は様々であろうが、血清試料が
結合するアツセイ溶液中の標識AChRの濃度、および、重
症筋無力症患者血清中の抗AChR自己抗体がおよそ1500nM
まで高くなり得るという事実を考慮に入れて決定され
る。補充正常血清は各試料の免疫グロブリンの全濃度が
ほぼ等しくなるように加える。
各々の試験血清の各々を希釈した３つの試料のそれぞ
れは、100マイクロリツトルの標識AChR溶液（2nM）と結
合させ、結合は、４℃で一晩インキユベートした。次
に、100マイクロリツトルのヤギ抗ヒトIgG（血清５マイ
クロリツトル中の全てのIgGを沈降させるのに十分な濃
度で）を加え、得られた溶液を４℃で30分間インキユベ
ートし、全てのヒト血清IgGを沈降させた。1mlのアツセ
イ緩衝液を加えた後、溶液を20℃で２分間10,000×ｇで
遠心した。上清を吸引し、ペレツトを２回、各回1mlの
アツセイ緩衝液でボルテツクスをかけて洗浄した後２分
20℃で10,000×ｇで遠心し、上清を吸引した。最後に、
ベレツト中の125Iを標準的方法で、ガンマー計数によつ
て決定した。
５マイクロリツトルの正常血清を用いて得られたブラ
ンク量は、各試料から決定される量から減じた。
本実験の結果は、第１図に示している。図では、ヒト
脚部筋肉AChRで決定した、抗IgGによつて沈降し得る抗A
ChR抗体の血清濃度の対数を、TE671細胞由来AChRで決定
した同じ濃度の対数の関数としてプロツトしている。各
々の試料におけるこれら２つの濃度の同一性の相違は、
アツセイ法での実験的な誤り、および、ヒト筋肉由来AC
hRと結合したアルフア−ブンガロトキシンの解離定数
（1.8×10-10M、ルーキー（Luky）およびモルガン−ヒ
ユース（Morgan−Hughes）、Ann.N.Y.,Acad.Sci.377、6
1（1981））と、TE671系サブラインNo.２細胞由来AChR
と結合しているアルフア−ブンガロトキシンの解離定数
（1.4×10-9Ｍ、シアピン（Syapin）ら、前出）との間
の報告されている相違によつて説明される。本実験の結
果により、ヒト筋肉由来AChRに対する血清自己抗体は、
TE671細胞由来AChRと70％以上の交叉反応性を有するこ
と、および、免疫アツセイにおける実際的目的では、二
種の供給源由来AChRは相互換的に使用可能である。
二つの供給原由来のAChRが、少なくとも免疫アツセイ
の目的では、免疫学上同等であるという結論をさらに支
持するものとして、ヒト脚部筋肉由来AChRとTE671系細
胞由来AChRとのモノクローナル抗体を用いた比較によ
り、TE671細胞由来AChR上にも存在しない脚部筋肉由来A
ChR上のいかなる抗原決定基も同定できなかつた。
実施例III ヒト筋肉アセチルコリン受容体に対する血清自己抗体の
ための固相免疫アツセイにおけるTE761系細胞由来アセ
チルコリン受容体の使用 （Ａ）AChRが付着した固相の調製。
実施例IIで述べた方法にひきつづき、ただし、ペレツ
トの体積に比較して、４倍の抽出緩衝液ではなく、８倍
量を用い、TE671系サブラインNo.２の細胞培養液から、
75mlのAChRのトリトンＸ−100抽出液が得られ、その試
料は、寄託番号CRL8805としてATCC寄託している。抽出
液のAChRは、次に、リンドストロム（Lindstrom）ら、M
ethods in Enzymology74C、432−459（1981）の以下に
示す方法により、毒素−アガロースでアフイニテイーに
よつて精製した： およそ5.9×109M AChRを含むトリトンＸ−100抽出液
を、毒素−アガロースの3mlのカラム（セフアロースC14
B（米国ニュージヤージー州ピスカタウエイ、フアルマ
シア社）1mlあたり0.5mgナジヤナジヤシアメンシス毒II
I）を42ml/hrの速度で、４℃で一晩再循環させた。（明
らかに毒素に対して低アフイニテイーである、TE671ACh
Rの改良された結合は、おそらく、５−10mg/mlの毒素を
含むアフイニテイカラムを用いて得られたものであろ
う。）次にカラムを10nMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.
5中0.1％トリトンＸ−100 10mlで洗浄した。AChRの溶出
は、溶出緩衝液（0.1％トリトンＸ−100、100mM NaCl、
10mM NaN3、10mM リン酸ナトリウム、pH7.5）中1Mカル
バミルコリンを用いて、3mlの独立のアリコートで、４
℃において８時間、次に18時間、そして最後に36時間再
循環させる。３つの溶出液は、次に混合し、カルバミル
コリンを除くために溶出緩衝液に対して４℃で透析し
た。上記の条件で、0.44n mole加えたうち、0.226n mol
eが結合し、全部で0.101n moleが13.8nM溶液8.1mlに溶
出した。
AChR濃度は、125I標識アルフア−ブンガロトキシン
（リンドストロムら、前出）で標識したAChRの免疫沈降
によつてアツセイする。アツセイは、ウサギ、マウス、
あるいはラツトなど由来ポリクローナル抗AChR抗血清、
高血清力価の抗AChR自己抗体を有する重症筋無力症患者
由来血清、あるいは、mAb35やmAb64などの抗AChRモノク
ローナル抗体を用いて、行ない得る。
精製したAChRは、ミリポアミリタイター−HA96ウエル
過プレート（米国マサチユーセツツ州ベツドフオー
ド、ミリポア社、カタログ番号STHAO96NS）のウエル
に、30マイクロリツトルのアリコートを４℃で一晩作用
させることによつて結合させた（一つのウエルあたり40
0 mole以上のAChRが結合可能である）。過剰の結合
は、50マイクロリツトルの抑制緩衝液（quench buffe
r）（３％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.2％トウイー
ン20、100mM NaCl、10mM NaN3、10mMリン酸ナトリウムp
H7.5）を加え、２時間４℃で放置することにより抑制し
た。全ての液体は、ミリポアミリタイター真空ホルダー
（ミリポア社、カタログ番号XX2809600）を用いて除去
した。次に、試験血清試料（抑制緩衝液で適当に30マイ
クロリツトルに希釈）を各ウエルに加え、４℃で４時間
放置した。上述のように液体を除去した後、ウエルを30
0マイクロリツトルの抑制緩衝液で２度洗浄した。次
に、125I標識した、アフイニテイー精製したヤギ抗ヒト
IgG（抑制緩衝液中１×10-8Ｍの溶液30マイクロリツト
ル）をウエルに加え、２時間４℃で放置した。この液体
を除去し、300マイクロリツトルの抑制緩衝液で二度洗
浄した後、フイルターに穴をあけてウエルから取りだし
（ミリポアフイルターパンチを用いる、ミリポア社カタ
ログ番号XX2809620）、標準的方法でガンマ計数を行な
うため、ガンマ−カウンターに入れた。抑制緩衝液で希
釈した正常ヒト血清を対照として用い、試験試料中の抗
AChR自己抗体のAChRへの結合を示す、ガンマ線放出値
は、試験試料について得られた値から、固有の正常血清
値を減じることによつて得られる。本アツセイを用いて
得られたデータは、第２図に示しており、縦軸はガンマ
線放出の１分あたりのカウント（cpm）の単位、横軸は
アツセイした試験血清のマイクロリツトルの単位であ
る。
正常ヒトIgGをAChRの換わりにウエルに加え、正常ヒ
トIgGに結合した125I標識抗ヒトIgGからのガンマ線放射
を測定するものを標準として、上述のように得られたガ
ンマ線放出データから、自己免疫IgGのグラム数あるい
はモル数／患者血清のリツトル数、の単位で、重症筋無
力症患者血清中のAChRに対する自己抗体濃度を計算する
ことができる。結果はまた、実施例IIで示した免疫沈降
アツセイを用いて得られる値に標準化することも可能で
ある。AChRに結合する自己抗体を検出するために抗IgG
のみを用いるのでなく、標識したサブクラス特異的な血
清も使用でき、それによつて、自己抗体のサブクラスの
寄与が決定される。
明らかに、ミリタイタープレートウエルに結合してい
るAChRのおよそ半数は、125I標識アルフア−ブンガロト
キシンに結合する能力を保持している。従つて、ACh結
合部位あるいはその近傍に対する、患者血清中の自己抗
体分画は、血清について２種の免疫アツセイを行なうこ
とによつて決定される：一つは上述のものであり、もう
一方では、ウエルに結合しているAChRを、過剰量のアル
フア−ブンガロトキシン（あるいは類似の毒素）、ある
いは、カルバミルコリンなどの低分子量コリン作動性リ
ガンドを含む血清試料とともにインキユベートし、毒素
あるいはコリン作動性リガンド結合部位に、実質的に上
記部位に結合する血清中のあらゆる自己抗体が結合する
際に外的に競合させるものである。上記二種のアツセイ
の結果から、毒素あるいはコリン作動性リガンドによつ
てAChRに対する結合を阻害される自己抗体分画が決定可
能である；この分画は、ACh結合部位、あるいはその近
傍に対する自己抗体分画である、あるいは、ほぼそうで
あると言える。同様に、AChRの主要免疫原領域に対する
自己抗体分画は、ラツトモノクローナル抗体mAb35など
の、AChRの主要免疫原に対する過剰量のモノクローナル
抗体と混合した血清とともに、ウエルに結合したAChRを
インキユベートすることにより、AChRとの結合を阻害さ
れた分画を決めることによつて決定できる。
細胞系の寄託 TE671細胞系（サブラインNo.２）、ハイブリドーマ系
mAb35（モノクローナル抗体mAb35を産生する）およびmA
b64（モノクローナル抗体mAb64を産生する）の培養液
は、1986年１月６日に先立ち、特許手続の目的のための
微生物寄託に関するブダペスト協定および、その下に公
布された規約に基づき、米国メアリーランド州ロツクビ
ル、アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（ATCC）に寄託された。TE671細胞培養液は、ATCC寄託
番号CRL8805を与えられている。ハイブリドーマmAb35の
培養液はATCC寄託番号HB8857を与えられている。ハイブ
リドーマmAb64は、ATCC寄託番号HB8987を与えられてい
る。これら３つの培養液全ての試料は、産業財産局ある
いは法的にそれらを入手する資格を与えられている他の
部局から入手することが可能になるであろう。
本発明は、ここに幾つかの特異的例とともに述べられ
ているが、この分野に携わる者は、本発明の本質の範囲
内で多くの修飾および変法を考えつくであろう。これら
の修飾法および変法は、ここに述べ、請求されるよう
に、本発明の範囲内である。

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】重症筋無力症関連抗AChR自己抗体を検出す
    るためのイムノアッセイ法であって、重症筋無力症関連
    抗AChR自己抗体を含むと疑われる試料を、AChRと放射性
    同位体で標識したクラーレ様神経毒素との複合体と接触
    させる；および 前記接触により生じた放射性複合体に結合した抗AChR自
    己抗体の量を測定する； の各工程を含み、該AChRがTE671系の細胞に由来するこ
    とを特徴とする改良方法。
  2. 【請求項２】クラーレ様神経毒素が125Iで標識されてい
    る、特許請求の範囲第１項記載のイムノアッセイ法。
  3. 【請求項３】クラーレ様神経毒素がアルファ−ブンガロ
    トキシンである、特許請求の範囲第２項記載のイムノア
    ッセイ法。
  4. 【請求項４】AChRがTE671系サブラインNo.2の細胞の培
    養物またはその二次培養物に由来する、特許請求の範囲
    第３項記載のイムノアッセイ法。
  5. 【請求項５】AChRが、ATCC受託番号CRL8805により寄託
    されている培養物またはその二次培養物に由来する、特
    許請求の範囲第４項記載のイムノアッセイ法。
  6. 【請求項６】重症筋無力症関連抗AChR自己抗体を検出す
    る方法であって、 AChRと放射性同位体で標識したクラーレ様神経毒素との
    複合体を調製する； 該複合体を重症筋無力症関連抗AChR自己抗体を含むと疑
    われる試料とともにインキュベートして、重症筋無力症
    関連抗体を該複合体と結合させる； 抗イムノグロブリンを加えることにより抗体と結合した
    該複合体を沈殿させる； および 沈殿物の放射活性を測定する； の各工程を含み、該AChRがTE671系の細胞に由来するこ
    とを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】AChRが、ATCC受託番号CRL8805により寄託
    されている培養物またはその二次培養物に由来する、特
    許請求の範囲第６項記載の方法。
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