DK173517B1 - Murint afledt hybridomacellelinie for human, pluripotent granulocytkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), monoklonalt antisto - Google Patents

Description

i DK 173517 B1

Den foreliggende opfindelse angår murint afledt hybridomacellelinie for human, pluripotent granulocytko-lonistimulerende faktor (hpG-CSF, monoklonalt antistof, der specifikt kan binde med hpG-CSF, immunologisk frem-5 gangsmåde til isolering af biologisk aktivt hpG-CSF og immunologisk fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af hpG-CSF. Især angår opfindelsen monoklonale antistoffer fremstillet ved hjælp af nye hybridomacellelinier (som eksemplificeret ved A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C.

10 HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C:C.

HB-8961 og A.T:C:C. HB-8962), som specifikt reagerer med hæmatopoietiske vækstfaktorer, og anvendelse af disse antistoffer ved isolation af hæmatopoietiske vækstfaktorer ved affinitetsrensningsteknikker, ved tests til på-15 visning af hæmatopoietiske vækstfaktorer og ved immunologiske fremgangsmåder til undersøgelse af sådanne vækstfaktorer. Specielt angår opfindelsen monoklonale antistoffer, der reagerer specifikt med human, pluripotent, granulocytkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) fra 20 naturlige kilder og rekombinantkilder.

Det humane bloddannende (hæmatopoietiske) system erstatter mange forskellige hvide blodlegemer, (herunder neutrofiler, makrofager og basofiler/mastceller), røde blodlegemer (erythrocytter) og koagulationsfremkaldende 25 celler (megakaryocytter/blodplader). Man har anslået, at gennemsnitsmandens hæmatopoietiske system danner i størrelsesordenen 4,5 x 1011 granulocytter og erythrocytter hvert år, hvilket svarer til en årlig udskiftning af hele kropsvægten. Dexter, et al., BioEssays, 2, 154-158 30.(1985).

Det formodes, at små mængder af visse hæmatopoietiske vækstfaktorer er årsag til differentieringen af et lille antal stamceller i de mange forskellige blodcelle- 2 DK 173517 B1 linier til den overvældende store proliferation af disse linier og til den endelige differentiering af færdige blodlegemer ud fra disse linier. På grund af, at de hæ-matopoietiske vækstfaktorer er til stede i overordent-5 ligt små mængder, har påvisningen og identifikationen af disse faktorer bygget på en række tests, som hidtil kun har kunnet skelne mellem de forskellige faktorer på basis af stimulerende virkninger på dyrkede celler under kunstige betingelser. Som et resultat heraf har man dan-10 net et stort antal navne til betegnelse af et meget mindre antal faktorer. Som eksempel på den resulterende forvirring er udtrykkene IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF og PSF alle acronymer, som nu formodes at kunne henføres til en enkelt murin, hæmatopoietisk vækstfak-15 tor. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985).

Anvendelsen af genetiske rekombinantteknikker har bragt nogen orden i dette kaos. F.eks. har man fundet aminosyre- og DNA-sekvenserne for humant erythropoietin, som stimulerer dannelsen af erythrocytter. (Se Lin, of-20 fentliggjort PCT-ansøgning nr. 85/02610, offentliggjort 20. juni 1985.) Rekomblnantmetoder har også været anvendt i isolation af cDNA for en human granulocyt-makro-fagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) og human makrofag-specifik kolonistimulerende faktor (CSF-1). [Se, Lee, et 25al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)♦ 82, 4360-4364 (1985);

Wong, et al., Science, 228, 810-814 (1985) og Kowasaki, et al., Science, 230, 291-196 (1985).]

En human hæmatopoietisk vækstfaktor, kaldt human, pluripotent, kolonistimulerende faktor (hpCSF) eller 30 pluripoietin, har vist sig at være til stede i kulturmediet for en human blærecarcinomacellelinie betegnet 5637 og deponeret under restriktive betingelser ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som 3 DK 173517 B1 A.T.C.C. deponering nr. HTB-9. hpCSF'et oprenset for denne cellelinie har været angivet at stimulere proliferation og differentiering af pluripotente forældrecel-ler, der fører til dannelse af alle de væsentligste 5 blodcelletyper ved tests ved anvendelse af humane ben-marvsforældreceller. Welte, et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA). 82, 1526-1530 (1985).

Indledende undersøgelser viser, at faktoren identificeret som hpCSF hovedsagelig har granulocytkoloni-10 stimulerende virkning under de første 7 dage ved en human CFU-GM-test.

En anden faktor, betegnet human CSF-β, har også været isoleret fra human blærecarcinomacellelinie 5637, og denne faktor har været beskrevet som en kompetitor 15 for murin 125I-mærket, granulocytkolonistimulerende faktor (G-CSF) for binding til WEHI-3B D+-celler ved en do-sis-responsrelation, identisk med relationen for ikke-mærket murint G-CSF [Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985)). Denne dosis-responsrelation var tidligere 20 rapporteret som værende enestående for ikke-mærket murint G-CSF og ikke til stede ved sådanne faktorer som M-CSF, GM-CSF og 11-3 [Nicola, et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA), 81, 3765-3769 (1984)]. Se også, Metcalf, et al.. Leukemia Research, Vol. 9, No. 5, side 521-527 25(1985). CSF-β og G-CSF er også enestående blandt CSF’er-ne, idet de er fælles om evne til i høj grad at fremkalde differentiering af WEHI-3B D+-celler. Nicola, et al.. Immunology Today, 5, 76-80 (1984). Ved høje koncentrationer stimulerer G-CSF blandede granulocyt-30makrofagkolonidannende celler ([Nicola, et al., (1984) supra], hvilket er konsistent med de indledende resultater, der viser tilstedeværelsen af granulocyt-, mono-cyt, blandede granulocyt-/monocyt og eosinofile kolonier 4 DK 173517 B1 (CFU-GEMM) efter 14 dages inkubation af humane benmarvs-kulturer med fipCSF. Det har også været beskrevet, at CSF-p stimulerer dannelse af neutrofile granulocytkolo-nier ved tests, ved hvilke der anvendtes muse-benmarvs-5 celler, en egenskab som har været kriterium for identifikation af in faktor som en G-CSF. På basis af disse ligheder har humant CSF-β været identificeret som G-CSF (granulocytkolonistimulerende faktor). Se Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985).

10 På basis af deres fælles egenskaber ser det ud til, at det humane CSF-β ifølge Nicola, et al., supra, og hpCSF'et ifølge Welte, et al., supra, er den samme faktor, som korrekt kunne betegnes som en human, pluri-potent, granulocytkolonistlmulerende faktor (hpG-CSF).

15 I den samtidigt verserende US-patentansøgning med serie nr. 768.959 indleveret 23. august 1985 og tilhørende ansøgeren af nærværende ansøgning på "fremstilling af pluripotent, granulocytkolonistlmulerende faktor" og herved inkorporeret ved henvisning, beskrives nye rekom-20 binant fremstillede polypeptider med en del eller hele den primære strukturform og en eller flere af de biologiske egenskaber for human, pluripotent, granulocytsti-mulerende faktor. Der beskrives også DNA-sekvenser, der koder for sådanne polypeptider, transformerede værts-25 celler, der koder for sådanne polypeptider, og fremgangsmåder til fremtilling af sådanne faktorer ved re-kombinantmetoder.

Den nuværende forskning rettet mod hybridoma-teknikker til fremtilling af tumorcellelinier, som vil 30 fremstille stærkt specifikke monoklonale antistoffer mod et udvalgt antigenmateriale, er af interesse som baggrund for opfindelsen. Fremgangsmåder til fremstilling af monoklonale antistoffer er i almindelighed velkendte 5 DK 173517 B1 indenfor dette fagområde. Typiske beskrivelser af disse fremgangsmåder kan findes i wands, J.R., og Zurawski, V.R., Gastroenterology 80:225 (1981); Marshak-Rothstein, et al., J. Immunol. 122-2491 (1979); og Oi, V.T. og L.A.

5 Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid," Mishell, B.B. og S.M. Shiigi (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco: W.H. Freeman Publishing, 1979 og Goding, "Antibody Poduction by Hybridomas", J. of Immunol. Meth. 39, 285-308 (1980). Kort sammenfattet 10 fremkalder man fusion af lymfocytter, fjernet fra miltceller fra et dyr, der i forvejen er Injiceret med antigenet af interesse, med myelomaceller under tilstedeværelse af polyethylenglycol. Tusinder af hybridmyeloma-celler dannes ved fusionen. Supernatanten fra dyrkningen 15 af hver hybridomacellekultur testes på forekomsten af den ønskede antistofaktivitet. Når en sådan aktivitet findes i supernatanten af en cellekultur, klones den ved hjælp af begrænsende fortyndinger, og klonerne testes individuelt for supernatantaktivitet.

20 Monoklonale antistoffer dannet ved hybridomame- toder har på grund af deres immunologiske egenskabers stærkt specifikke natur været foreslået til anvendelse som diagnostiske reagenser, terapeutiske midler og midler til affinitetsrensning af specifikt krydsreaktive 25 antigenproteiner fra råmaterialer. Se f.eks. Trends in Biotechnology, Vol. 3, No. 7 (July, 1985) og U.S. patenterne nr. 4.465.624, 4.514,505 og 4.514.507. I US patent nr. 4.504.586 omhandles monoklonale antistoffer rettet mod kolonistimulerende faktor, underklasse nr. 1 30.(CSF-1), hvilke antistoffer produceres af en murin afledt hybridomacellelinie.

Skønt der eksisterer et væsentligt behov for specifikke monoklonale antistoffer til anvendelse ved på- 6 DK 173517 B1 visning, isolation, rensning og undersøgelse af hæmato-poietiske vækstfaktorer, såsom human, pluripotent, gra-nulocytkolonistimulerende faktor, findes der ingen rapporter om succesfuld anvendelse af hybridomametoder til 5 opnåelse af monoklonale antistoffer for hpG-CSF.

Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes der for første gang en murin afledt hybridomacellelinie, der er ejendommelig ved, at den i sit vækstmedium er i stand til at danne et monoklonalt antistof af en under-10 type valgt blandt IgM, IgGj^, IgG2a IgG2b °9 1^3, der specifikt kan binde med hpG-CSF, men ikke CSF-1, ved en antigen/antistofreaktion. Som eksempel tilvejebringes ifølge den foreliggende opfindelse de nye murinafledte hybridomacellelinier, A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C.

15 HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C:C.

HB-8961 og A.T.C.C. HB-8962, der hver som en komponent af supernatanten fra deres vækst i kultur danner et monoklonalt antistof, der reagerer specifikt med hpG-CSF. Hybridomacellelinierne A.T.C.C. HB-8957, 20 A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, A.T.C.C. HB-8961 og A.T.C.C. HB-8962 findes deponeret ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852.

Den foreliggende opfindelse angår også et mono-25 klonalt antistof, der er ejendommeligt ved, at det er dannet af en cellelinie, der i sit vækstmedium kan danne et monoklonalt antistof af en undertype valgt blandt IgM, igG]^, IgG2a, lgG2b og IgG3, der specifikt kan binde med hpG-CSF, men ikke CSF-1, ved en antigen/antistof-30 reaktion.

Ved udøvelsen af den foreliggende opfindelsen fremstilles en hybridtumorcellelinie ved anvendelse af en immunologisk standardmetode som beskrevet i Oi og 7 DK 173517 B1

Herzenberg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", supra og Goding, "Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth. 39 (1980) 285-308. Miltceller fra mus, hyper-immuniseret med naturligt hpG-CSP smeltes sammen med en 5 musemyelomacellelinie under tilstedeværelse af poly-ethylenglycol. Supernatanten for dyrkningen af hver hy-bridomacellekultur testes for forekomsten af den ønskede antistofaktivitet. En udvalgt hybridomacelle klones til propagering af en cellelinie, som danner et antistof i 10 dens kultursupernatant, hvilket antistof har en stærkt specifik anti-hpG-CSF-aktivitet.

Monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes ved immunologiske fremgangsmåder til affinitetsrensning og isolation af hpG-CSF (og andre hæmato-15 poietiske vækstfaktorer, som kan have fælles eller beslægtede epitoper) ud fra naturlige kilder eller rekom-binantkilder. Følgelig angår opfindelsen også en immunologisk fremgangsmåde til isolation af biologisk aktivt hpG-CSF fra en biologisk væske på basis af en selektiv 20 immunologisk reaktion med et antistof, der er specifikt for hpG-CSF, ejendommelig/ ved, at den omfatter at man anvender et monoklonalt antistof af en undertype valgt blandt IgM, IgG1# IgG2a, IgG2b og lgG3, der specifikt kan binde med hpG-CSF, men ikke CSF-1, ved en anti-25 gen/ant is tof reaktion. Ved en sådan fremgangsmåde ville et udvalgt antistof blive immobiliseret (f.eks. på en kolonne), og materialet ville blive bragt i kontakt med det immobiliserede antistof. hpG-CSF eller antigent beslægtet materiale ville binde til antistoffet og deref-30 ter blive elueret fra det immobiliserede antistof i en i høj grad renset form. Antistoffer ifølge opfindelsen kan også anvendes alene eller sammen med andre antistoffer eller polyklonale antistoffer ved immunologiske frem- 8 DK 173517 B1 gangsmåder (RIA’er, ELISA'er og lignende) til kvantitativ bestemmelse af hpG-CSF. Følgelig angår opfindelsen også en immunologisk fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af hpG-CSF i en biologisk væske på basis af en 5 eller flere selektive immunologiske reaktioner med et antistof, der er specifikt for hpG-CSF, ejendommelig ved, at den omfatter at man anvender et eller flere mo-noklonale antistoffer af undertyper valgt blandt IgM,

IgG1, IgG2a, lQG2b og lgG3, der specifikt kan binde med 10 hpG-CSF, men ikke CSF-l, ved en antigen/antistofreak-tion. Antistoffer ifølge opfindelsen kan også være nyttige in vivo til binding af hpG-CSF eller beslægtede faktorer i tilfælde af overproduktion af sådanne fakto rer. Andre aspekter af den foreliggende opfindelsen vil 15 fremgå af den følgende detaljerede beskrivelse.

De følgende eksempler illustrerer udøvelsen af opfindelsen ved fremstilling af en række forskellige hybridomacellelinier, herunder A.T.C.C. HB-8957, A.T.C.C. HB-8958, A.T.C.C. HB-8959, A.T.C.C. HB-8960, 20A.T.C.C. HB-8961 og A.T.C.C. HB-8962, isolationen af antistoffer mod hpG-CSF og forstærkningen og karakteriseringen af de monoklonale antistoffer.

Nærmere betegnet er eksempel 1 rettet mod stimulering af en murin vært til fremstilling af polyklonale 25serumantistoffer mod hpG-CSF, fusion af miltceller med myelomaceller og screening, kloning og dyrkning af hy-bridomaceller og isolation af monoklonale antistoffer derfra. Eksempel 2 angår karakteriseringen af de således fremstillede monoklonale antistoffer ved ELISA- og RIA-30 tests og kompetitive inhiberings- og neutralisationstests og forøgelsen af udbytterne af monoklonale antistoffer ved ascites-metoden. I eksempel 3 beskrives fremgangsmåder til isolation og rensning af hpG-CSF ved 9 DK 173517 B1 anvendelse af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen. I eksempel 4 beskrives fremgangsmåder til kvantitativ bestemmelse af hpG-CSF ved anvendelse af testmetoder med anvendelse af antistoffer ifølge opfindel-5 sen.

Eksempel 1 A. Fremstilling af polyklonal serum.

10 BALB/C-mus blev hver injiceret med hpG-CSF oprenset ved HPLC fra human blærecarcinomacellelinie nr. 5637 (subklon 1A6) ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1(b) i US-patentansøgning med serienummeret 768.959. Materialet 15 blev renset med en C4 HPLC-kolonne til mere end 85%' s renhed og havde en koncentration på ca. 60 yg/ml i en opløsning indeholdende 50% propanol og 100 mM ammoniumacetat (pH 7). Hver af 10 mus blev indledningsvis givet multiple subkutane injektioner, der i alt udgjorde ca.

20 0,1 ml af en inoculant (7,2 yg hpG-CSF pr. mus) omfattende 1,2 ml af hpG-CSF-opløsningen, som var koncentreret til 0,6 ml ved hurtig vakuumbehandling og dernæst blandet ved ultralydsbehandling med 0,6 ml af BACTO-Freund's fuldstændige adjuvans H37 Ra (DIFCO 3113-60).

25 18 Dage senere fik musene hver multiple subkutane injektioner til forstærkning af de tidligere givne injektioner i en mængde, der i alt udgjorde ca. 0,15 ml af en inoculant (7,2 yg hpG-CSF pr. mus) omfattende 1,2 ml af hpG-CSF-opløsningen koncentreret til 0,75 ml og blandet 30med 0,75 ml af Freund's ufuldstændige adjuvans (BACTO 0639-60-6 fra DIFCO).

Fire dage senere tappede man blod fra musene, og deres sera blev screenet ved RIA for dannelse af anti- 10 DK 173517 B1 hpG-CSF-antistoffer. hpG-CSF anvendt ved serumtesten omfattede ca. 0,5 ml af 80%'s rent hpG-CSF i en koncentration på ca. 100 jig/ml i en opløsning omfattende 100 mM ammoniumsulfat og 50% propanol, som var koncentreret 5 4 gange. 250 μΐ af den ovennævnte opløsning koncentrere des til 150 μΐ og blandedes med 5 ml 50 mM C03"2/HC03“;l-puffer (pH 9,2). 50 μΐ af dette materiale blev dernæst anbragt i hver brønd i en plade med 96 brønde og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur natten over ved 4°C. En 10 blokerende forbindelse omfattende 50% bovint serumalbumin (BSA) inkuberedes i 30 minutter i brøndene. Testse-rum fortyndet i forholdene 1:5, 1:25, 1:625 og 1:3125 og kontrolserum (ikke inoculeret) i forhold på 1:5 og 1:25 anbragtes i brøndene med 50 μΐ pr. brønd og inkuberedes 15 i 2 timer ved stuetemperatur. Brøndene blev dernæst vasket tre gange ved anvendelse af "Wash-solution" [(Kirke-guard & Perry Laboratories, (KPL) Gaithersburg, Maryland)]. Kaninantimus igG-antistof mærket med 125l anbragtes dernæst således, at det gav ca. 199.000 counts 20 pr. minut pr. 50 μΐ brønd og inkuberedes i 1,5 timer ved stuetemperatur. Brøndene blev dernæst vasket 5 gange med "Wash-solution", og deres radioaktivitet bestemtes med en y-tæller.

21 Drge efter forstærkningsinjektionen gav man 5 25 mus, som ved RIA viste sig at danne anti-hpG-CSF-anti-stoffer, en tredje injektion. Musene blev immuniseret med samme materiale som under deres forstærkningsinjektion, men de fik ca. 10 μg hpG-CSF pr, mus.

11 DK 173517 B1 B. Cellefusion

Ved hybridomafremstillingsmetoden sønderdeles miltene fra de inoculerede mus til suspension af anti-5 hpG-CSF-antistofdannende lymfocytter. Disse miltceller fusioneres med celler fra en SP2/0-myelomacellelinie til dannelse af hybridceller. Milt- og myelomacellernes cellemembraner fusionerer og omgiver først et fælles cytoplasma med to eller flere kerner. Adskillige dage efter 10 fusionen af cellemembranerne fusionerer kernerne, og de bliver i stand til at udføre synkron mitose. Idet disse fusionerede celler deler sig, tabes et varierende antal kromosomer fra begge fusionspartnerne, indtil hybridcellelinierne stabiliserer sig. Et hypoxanthin-amino-15 pterin-thymidin (HAT)-medium hindrer SP2/0:SP2/0-hybri-der dannet under hybridisationsmetoden eller ikke-fusio-nerede SP2/0-celler i at vokse, mens milt:miltcellehy-brider eller ikke-fusionerede milceller i almindelighed vil dø efter to uger i kulturen. Kun SP2/0:milthybrid-20 celler vil således overleve i kulturen.

3 Dage efter den anden booster-inoculering blev musene aflivet ved cervical dislocation og dyppet i 70% ethanol. Musenes milte blev fjernet aseptisk og anbragt i sterile Petri-skåle på is indeholdende DMEM (Dulbec-25 co's modificerede Eagle's medium, katalog nr. 320-1885, parti nr. 18K3252 fra GIBCO) suppleret med penicil-lin-G-streptomycinopløsning (en "IX”-opløsning), i det følgende betegnet "1XPS"-opløsning (katalog nr. 9366 fra .Irvine Scientific) omfattende 100 enheder penicillin G 30 og 100 pg streptomycin pr. ml. Fedtvæv, der sad fast på miltene, blev fjernet, og miltene blev vasket to gange med DMEM indeholdende 2XPS (200 enheder penicillin G og 12 DK 173517 B1 200 yg streptomycin pr. ml) og anbragt i en steril "stomacher "-sæk på is. Til sækken sattes en opløsning omfattende DMEM - 2XPS. Miltene blev sønderdelt i et "stomacher "-apparat og dernæst filtreret gennem fire lag ste-5 rilt gaze ned i 50 ml centrifugerør. Sækken og filtrene blev vasket med indtil 40 ml af en opløsning omfattende DMEM-2XPS-opløsning. Cellerne blev dernæst centrifugeret i 10 minutter ved 1000 omdrejninger pr. minut i en IEC NH-SII-centrifuge (Damon/IEC Division), og supernatanten 10 blev forsigtigt suget bort. Cellerne blev dernæst vasket to gange med en opløsning omfattende DMEM-2XPS og en gang med DMEM uden additiver. Cellerne blev dernæst re-suspenderet i DMEM.

Myelomaceller (SP2/0) blev dyrket i HBlOl-medium 15 indeholdende 1XPS og 1% foetalt, bovint serum (FBS) (Irvine Scientific katalog nr. 3000, parti nr. 209608, varmeinaktiveret), og man lod dem vokse i den logaritmiske vækstfase i 3 dage. SP2/0-Cellerne blev høstet ved pellettering i en IEC NH-SII-centrifuge ved 1000 opm i 20 10 minutter. Cellerne blev vasket i DMEM-opløsning og dernæst suspenderet i DMEM-opløsning.

Miltcellerne blev dernæst forenet med myelomacel-lerne i et 50 ml centrifugerør i et mængdeforhold på 4:1 og centrifugeret i 10 minutter ved 1000 opm, og superna-25 tanten blev suget bort. Pillen blev dernæst anbragt i et 37eC varmt vandbad under et dække. Polyethylenglycol (molvægt 1500, M.A. Bioproducts, katalog nr. 17-780Z, parti nr. 4J030) blev smeltet og dernæst blandet i et én til én forhold på basis af volumen med DMEM-opløsning 30.til opnåelse af en 50%'s opløsning. PEG-opløsningen blev dernæst sat til cellerne ved den følgende fremgangsmåde.

I løbet af det første minut tilsattes 1,0 ml af den 50%'s PEG-opløsning. I løbet af det andet minut omrørtes 13 DK 173517 B1 opløsningen forsigtigt ved anvendelse af en pipette, der omrørtes konstant med en cirkelformet bevægelse, men undgik at røre siderne og bunden af rørene. I løbet af det tredje minut tilsattes 1,0 ml af en opløsning omfat-5 tende dmem, 10% FCS og 1XPS. I løbet af det fjerde minut tilsattes der igen 1,0 ml af den samme opløsning. I løbet af det femte og sjette minut tilsattes 8,0 ml af den samme opløsning. Blandingen blev dernæst centrifugeret ved 1000 opm i 10 minutter på IEC NH-SII-centrifugen.

10 Supernatanten i centrifugerøret blev suget bort, og cellerne blev forsigtigt resuspenderet i 100 til 150 ml af et medium omfattende DMEM med 10% FBS og 1XPS. Cellesuspensionen blev dernæst udpladet i en mængde på 0,1 ml suspension pr. brønd i ca. 800 brønde på 8½ 96 brøndes 15 plader, som var forækvilibreret i en C02-inkubator. Pladerne blev dernæst returneret til en C02-inkubator med en C02-indhold på ca. 7% ved 37*0.

En dag senere blev 100 μΐ HAT-medium i DMEM og 10% FBS sat til hver brønd. På den anden dag blev 100 pi 20 brugt medium suget bort fra hver brønd og erstattet med 100 μΐ frisk HAT-medium i DMEM med 10% FBS. Denne procedure blev gentaget på 2., 4., 7. og 11. dagen. På 14. dagen fjernedes 100 μΐ brugt medium fra hver brønd og erstattedes med 100 μΐ HT-medium omfattende 1,36 mg/dl 25 hypoxanthin og 0,76 mg/dl thymidin. Denne procedure blev gentaget på 18., 22., og 26. dagen. På 28. dagen blev kulturen tilført et fuldstændigt medium omfattende DMEM med 10% FBS. Kulturerne blev dernæst igen tilført dette fuldstændige medium to gange om ugen. På 17. dagen blev 30 brøndene screenet for dannelse af immunoglobulin ved anvendelse af anti-muse-IgG-antistoffer. RIA- og ELISA-tests viste, at ca. 260 ud af 800 brønde var signifikant positive for muse IgG.

DK 173517 B1 14

Eksempel 2 A. Indledende karakterisering af monoklonale antistoffer.

5

En ELISA-test udførtes til påvisning, af hvilke kloner, der dannede anti-hpG-CSP-antistoffer. Brønde i 96 brøndes plader blev belagt ved anbringelse af ca. 50 μΐ af en opløsning indeholdende 100 ng 90% rent hpG-CSF 10 som blev fortyndet med 50 mM C03“2/HCC>3_pufferopløsning (pH 9,2) ved stuetemperatur i 2 timer og dernæst sat til hver af bakkernes brønde og inkuberet natten over ved 4°C. Brøndene blev dernæst behandlet med en 5% BSA-blo-keringsopløsning, som inkuberedes i 30 minutter.

15 Supernatanter fra hybridomakulturerne blev for tyndet i PBS-opløsning (pH 7,0) indeholdende 1% BSA og dernæst inkuberet mod de belagte brønde i 2 timer ved stuetemperatur. Brøndene blev dernæst vasket 3 gange med "Wash Solution" og dernæst behandlet med peberrodsper-20 oxidase mærket anti-muse-IgG-antistof (BMB nr. 605-250) ved 1:300 fortynding i 1,5 timer. Brøndene blev dernæst vasket 5 gange med "Wash Solution" og peroxidasesubstrat ABST (KPL) tilsattes i en mængde på 50 yl pr. brønd. Den optiske tæthed ved 414 nm blev dernæst aflæst for brøn-25 dene ved hjælp af et Titertek Multiscan (Flow Labs,

McLean, VA)-spektrofotometer). 23 af brøndene (nr. 3, 4, 5, 20, 21, 28, 35, 37, 39, 40, 58, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98, 151, 182 og 231) viste sig at reagere signifikant med de reducerede hpG-CSF.

30. Formel kloning af hybridomacellerne opnået fra de positive brønde udførtes ved fortynding af cellerne i yderligere brønde i et sådant forhold, at der var ca. en celle pr. tre brønde. Generelt gav formel kloning fra en 15 DK 173517 B1 aktiv brønd formelle kloner, som viste sig at være sub-kloner af den samme hybridomacelle, men i adskilllige tilfælde fremkom der forskellige klonpopulationer, der udviste andre antistofundertyper og reaktionsegenskaber.

5 Subkloner for den samme brønd mærkedes med et bogstav (f.eks. mærkedes kloner opnået fra brønd 4 med 4A, 4B, osv.).

En ELISA-test udførtes til bestemmelse af de mo-noklonale antistoffers reaktivitet overfor naturligt 10 hpG-CSP og reduceret naturligt hpG-CSF. Supernatanten opnået fra brønde, der viste sig at danne antistoffer, der kunne reagere med hpG-CSP, blev testet over for både naturligt hpG-CSF og naturligt hpG-CSP, som var denatureret med SDS/mercaptoethanol. Antistoffer fra klonerne 15 reagerede over for begge materialer med omtrent samme specificitet, hvilket antyder at antistofferne kan være specifikt reaktive med antigene epitoper, primært fastlagt ved proteinets kontinuerlige aminosyresekvenser (primærstrukturen).

20 B. Reaktivitet af monoklonale antistoffer over for mammal hpG-CSP og rekombinant-hpG-CSF.

I dette eksempel udførtes fastfase-RIA- og -ELI-25 SA-tests til måling af reaktiviteten af hybridomasuper-natanter, opnået fra de aktive brønde, med mammal hpG-CSF og rekombinant E. coli dannet hpG-CSF. I alle tilfælde undtagen et reagerede monoklonalt antistofmateriale, der reagerede med mammal dannet (naturligt) hpG-30 CSF, ligeså godt med rekombinant dannet hpG-CSP. Dette tilfælde omfatter subklonerne 35B, 35D og 351, som dannede antistoffer, der var signifikant mindre reaktive med rekombinantmaterialet end med det mammal afledte materiale ved direkte bindingstest.

16 DK 173517 B1 C. Screening for antistofundertyper.

I dette eksempel blev formelle kloner, opnået fra de 23 brønde, der oprindeligt viste sig at være aktive, 5 screenet ved ria til bestemmelse af deres antistofundertype. 96 brøndes bakker blev behandlet med kanin-anti-mus-immunoglobulinantistoffer med forskellige undertypespecificiteter . Anti-muse-immunoglobulinantistofferne omfattede kanin-anti-muse-IgGj^ (MILES Laboratories, Na-10 perville, IL, 64-360-1), kanin-anti-muse-IgG2a (MILES, 64- 361-1), kanin-antl-muse-IgG2b (MILES, 64-362-1), kanin-anti-muse-IgG3 (MILES, 64-363-1), kanin-anti-mu-se-IgM (MILES, 64-365-1) og kanin-anti-muse-IgG (MILES, 65- 157-2). Hver brønd blev belagt med 50 μΐ af anti-mu-15 se-immunoglobulinantistofopløsningen i en C03~2/HC03“ (pH 9,6)-pufferopløsning omfattende ca. 0,5 pg antistof og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur og natten over ved 4eC. Brøndene blev dernæst blokeret ved inkubation med en 5% BSA-opløsning i 30 minutter. Hver brønd blev 20 dernæst inkuberet med hybridomavævskultursupernatant i 2 timer ved stuetemperatur og vasket tre gange med ’’Wash Solution". De brønde, der havde været behandlet med anti-IgG-antistof, blev dernæst inkuberet i 1,5 timer med 50 yl pr. brønd af 12®I-kanin-anti-muse-IgG-anti-25 stof, mens brøndene, der var behandlet med anti-IgM, dernæst blev inkuberet i 1,5 timer med 50 yl pr. brønd af 125I-kanin-anti-muse-IgM-antistof. Brøndene blev dernæst vasket fem gange med "Wash Solution" og talt i en .y-tæller. Resultaterne af analysen af de oprindelige 23 30 kloner viste, at 2 brønde (nr. 37 og 182) standsede syntese af IgG, 1 brønd viste igG-positiv, men udviste ikke reaktivitet ved tidlig screening mod hpG-CSF (nr.

17 DK 173517 B1 58), 15 brønde viste positiv for lgG1 (nr. 4C, 5, 28, 39, 40, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98 og 231). En subklon af en af disse, nr. 5d, viste sig at reagere med både anti-IgG3- og anti-IgM-antistoffer. 4 Brønde var 5 positive for lgG2a-dannelse (nr. 3, 4A, 21 og 151), og 1 brønd for IgG2b-^annelse (nr· 35).

D. Neutralisation af hpG-CSF-aktivitet målt ved 3H-thy-midinoptagelse.

10 I dette eksempel testedes monoklonale antistoffer opstået mod hpG-CSF for evnen til at neutralisere hpG-CSF's biologiske virkning til stimulering af inkorporeringen af 3H-thymidin i humane benmarvsceller. Til test-15 ningen af neutralisationen af 3H-thymidinoptagelse inkuberedes rekombinant- eller naturligt hpG-CSF med forskellige koncentrationer af antistoffer ifølge opfindelsen ved 4eC i 12 timer. Opløsningerne blev dernæst sat til ikke-adhærente humane benmarvsceller med lav densi-20 tet og behandlet ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 7 i den samtidigt verserende US-patentansøgning nr.

768.959. Antistofferne fra klonerne 20A, 35B, 39B, 40A, 61D, 63D, 75A og 151K testedes blandt andet, idet antistofferne fra klon nr. 75A var de mest effektive til 25 neutralisation af hpG-CSF virkning på 3H-thymidinopta-gelsen, og idet alle de ovennævnte antistoffer viste forskellige grader af neutraliserende virkning på 3H-thymidinoptagelsen, bortset fra antistofferne dannet af klon nr. 35B.

18 DK 173517 B1 E. Neutralisation af hpG-CSF-aktivitet, målt ved induktion af celledifferentiering.

I dette eksempel testedes antistoffer dannet 5 over for hpG-CSF for evnen til at neutralisere hpG-CSF's evne til at inducere differentiering af den murine mye-lomonocytiske leukæmicellelinie WEHI-3B D+. Forskellige koncentrationer af antistofferne fremstillet ifølge opfindelsen (for klonerne nr. 20A, 39B, 40A, 61D, 63D og 10 75A) blev inkuberet med hpG-CSF ved 4eC i 12 timer. Opløsningerne sattes dernæst til WEHI-3B D+-celler i en agarsuspension ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 7 i den samtidigt verserende US-patentansøgning nr.

768.959. Antistofferne dannet af klon nr. 40A, 61D og 15 75A udviste evne til at blokere differentiering. Idet disse monoklonale antistoffer havde forskellige udfældende egenskaber over for hpG-CSF, kan det faktum, at nogle blokerer den differentieringsinducerende evne af hpG-CSF, mens andre ikke gør, ikke forklares simpelt på 20 basis af affinitetsstyrken. Det er værd at lægge mærke til, at monoklonalt antistof dannet af klon 75A ikke kun hæmmede differentiering af WEHI-3B D+-celler, men også inhiberede cellevækst, hvilket antyder, at det kan krydsreagere med en murin vækstfaktor, der secerneres 25 af WEHI-3B D+-celler, og kan have antiproliferative virkninger uafhængigt af dets evne til at binde hpG-CSF.

DK 173517 B1 19 F. Epitop karakterisering.

I dette eksempel udførte kompetitive bindingsundersøgelser ved anvendelse af 125l-mærket antistof fra 5 klonerne 75A og 151K og immumobiliseret rekombinant dannet hpG-CSF. Ved disse undersøgelser lod man antistoffer fra andre kloner konkurrere mod 75A- og 151K-radiomærke-de monoklonale antistoffer bundet til rekombinant dannet hpG-CSF. Efter inkubation og vaskning ved fremgangsmå-10 der, der er velkendte indenfor dette fagområde, blev tælling af radioaktivitet udført til bestemmelse af, i hvilket omfang enten 75A-dannet antistof eller l51K-dan-net antistof var fortrængt fra hpG-CSF'et.

Resultaterne af disse tests viser, at antistoffer 15 dannet af klonerne nr. 63D, 75A og 151K kan have overlappende dele af en fælles antigen epitop på hpG-CSF-protelnet. Resultaterne viser også, at antistofferne dannet af klonerne 4C, 28A og 35B viser sig reaktive med en epitop eller epitoper af hpG-CSF-protein, for hvilke 20 de 75A- og 151K-dannede antistoffer ikke er specifikt reaktive. Resultaterne antyder også, at hpG-CSF-bin-dingsegenskaberne af antistofferne dannet af klonerne 40A og 61D kan skelnes fra bindingsegenskaberne af antistofferne dannet af klonerne 4C, 28A, 35B, 75A og 151K.

20 DK 173517 B1 G. Egenskaber af antistoffer fra deponerede repræsentative cellelinier.

Repræsentative nye hybridomacellelinier, der kan 5 danne monoklonale antistoffer, der er repræsentative for antistofferne tilvejebragt ifølge den foreliggende opfindelse er deponeret ved American Type Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, HD 20852. Disse cellelinier svarer til cellelinierne dannet under den formel-10 le kloningprocedure på følgende: klon 4C (A.T.C.C. HB-8962, klon 28A (A.T.C.C. HB-8957), klon 35B (A.T.C.C.

HB-8960), klon 63D (A.T.C.C. HB-6958), klon 75A (A.T.C.C. HB-8959) og klon 151K (A.T.C.C. HB-8961).

Egenskaberne af antistofferne dannet af disse kloner er 15 sammenfattet i den følgende tabel 1.

21 DK 173517 B1 31 &1- i i i + + + •n 1“ &

I W

Qj 'Ή o u P 4>

•h +J

W ni < n in i i i + + +

<0 r-M

on +

Q

oo

on Q Q Q Q

3 S Z I +2

C H O SS

*H w

P s 3 W •H

i—I "1 m s

P CQ

p + 3 >i C P O + + «DXSfOZZ I +|+ + 55 E1 ε I 3 s; s;

OO

r—

f—I

Φ Λ Cr> <0 -.-i É-t i—i P + + + + + +

Cn 3 C -P *H (t Ό Z C •H

CQ -H

i—I

O

υ + + +i + + +

-P

w p

S

iw Ό 3 (1) Λ « $ 0) r- ^ ΟΊ -- r- μ Ή

& O O U o o U

>, t? Cl tJi tp tj! -P HIMHHHHH C

O) ε

•H

P

O

04 • w

' P X

Z <1> CJ < « P < « w

c rr oo m m m ίο N η ΰ ifl Q

H «- Z

22 DK 173517 B1 H. Forøgelse af antistofudbytter ved ascites-metoden.

Til opnåelse af et mere koncentreret antistof end det, der dannes i vævskultur, blev de monoklonale anti-5 stoffer ifølge den foreliggende opfindelse forstærket ved ascites-metoden, der er beskrevet generelt i Kenneth, et al .^( red.), Monoclonal Antibodies, Hvbridomas: A New Dimension i Biological Analysis, s. 403, New York:

Plenum Press (1981). Ved denne fremgangsmåde forbehand-10 les mus med 0,5 ml pristan (2,6,19,14-tetramethylpenta-decan, opnået fra Aldrich Chemical Co.) injiceret i deres bughuler ved hjælp af standardstørrelse 25- eller 27-kanyler. Pristanbehandling muliggør vækst af tumor- « celler i en ascitesform i bughulen. Efter 1-2 uger, 15 injiceres ca. 106 hybridomaceller i serumfrit Dulbecco’s modificerede eagles-medium (DMEM) (Irvine Scientific Co.) eller HB101 (Hanna Biologicals, Berkely, Cal.) i musenes bughuler. Sættet af injektioner udføres på mus for hver af klonerne.

20 Ca. 1-3 uger efter injektionen af hybridomacel- lerne udvandt man ascitesvæske fra musenes bughuler ved at lave små snit i huden og udpipettere væsken. Ascites-væsken blev klaret ved centrifugering og dernæst fros-set. Ascitesvæskeantistoffer kan renses yderligere fra 25 ascitesvæskealbumin ved fældning med 45% ammoniumsulfat og protein A-sepharosechromatografi.

23 DK 173517 B1

Eksempel 3

Isolation og rensning af hæmatopoietiske vækstfaktorer.

5 Den foreliggende opfindelse gør det ved dens til vejebringelse af stærkt specifikke og reaktive anti-hpG-CSF-monoklonale antistoffer muligt for første gang at isolere hpG-CSP og hæmatopoietiske vækstfaktorer fra fermenteringskulturer og fra naturlige mammale kilder 10 ved affinitetsrensningsmetoder, der er velkendte indenfor teknikken. Kort fremstillet ville foretrukne isolationsmetoder involvere immubilisering af et antistof ifølge opfindelsen på en fast bærer (f.eks. en chroma-tografisk kolonne), kontakt af den hpG-CSF- eller hæma-15 topoietisk faktorholdige væske med det immobiliserede antistof og derefter eluering af renset hpG-CSF eller hæmatopoietisk vækstfaktor fra immunkompleksforbindelsen med antistoffet. Ved justering af det bestemte antistof, der anvendes, kan rensningsmetoden muliggøre isolation 20 af naturligt hpG-CSF i dens korrekte foldede form fra ukorrekt foldet eller denatureret hpG-CSF. Analoger af hpG-CSF og specifikke antigene epitoper af hæmatopoietiske vækstfaktormolekyler kunne Isoleres og undersøges.

25 Eksempel 4

Kvantitativ bestemmelse af hæmatopoietiske væskstfakto- rer.

30 Den foreliggende opfindelse muliggør på grund af dens tilvejebringelse af stærkt specifikke anti-hpG-CSF-monoklonale antistoffer også nye fast- eller væske- 24 DK 173517 B1 fasetests til kvantitativ bestemmelse af hpG-CSF og hæ-matopoietiske væskstfaktorer i en flydende prøve, ved hvilke der anvendes mere end et antistof. Fastfasetests ville typisk omfatte, at man: 5 (1) bringer væsken i kontakt med et første, immo- biliseret antistof, der reagerer med en første antigendeterminant af hpG-CSF i væsken til dannelse af et immunologisk kompleks af hpG-CSF og det første antistof; (2) bringer komplekset dannet i trin (1) i kon-10 takt med et andet antistof, der reagerer med en anden antigendeterminant af hpG-CSF end den første antigendeterminant til dannelse af et immunologisk kompleks af hpG-CSF og det andet antistof, og (3) kvantitativt bestemmer mængden af det andet 15 antistof bundet til det immunologiske kompleks dannet i trin (2).

Kompetitive væskefastetests ville involvere mærkning af hpG-CSF og fældning af samme med et eller flere antistoffer ifølge opfindelsen. Kvantitativ bestemmelse 20 af ikke-mærket hpG-CSF eller beslægtede faktorer kunne dernæst udføres ved kompetitiv binding. Sådanne testmetoder ville fortrinsvis omfatte to af de ovenfor beskrevne monoklonale antistoffer, men de kan også udføres ved anvendelse af et af de monoklonale antistoffer og et 25 antistof mod hpG-CSF afledt af et polyklonalt serum.

Talrige modifikationer og variationer ved udøvelse af opfindelsen forventes at fremgå for fagfolk ud fra den foregående beskrivelse af foretrukne udførelsesformer af opfindelsen. Følgelig er opfindelsen kun begræn-30set ved kravene.

Claims (10)

1. Murin afledet hybridomacellelinie, kendetegnet ved, at den 1 sit vækstmedium er i stand til at danne et monoklonalt antistof af en undertype valgt blandt IgM, lgGlf lgG2a, IgG2b 09 IgG3 ' der sPeci“ 5 fikt kan binde med hpG-CSF, men ikke CSF-1, ved en antigen/antistofreaktion.

2. Hybridomacellelinie ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den vælges blandt cellelinierne A.T.C.C. HB-8957, HB-8958, HB8959, HB-8960, HB-8961 og

10 HB-8962.

3. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det er dannet af en cellelinie, der i sit vækstmedium kan danne et monoklonalt antistof af en undertype valgt blandt IgM, IgGj^ IgG2a, IgG2b °9 Ι9σ3» der speci- 15 fikt kan binde med hpG-CSF, men ikke CSF-1, ved en antigen/antistofreaktion.

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 3, kendetegnet ved, at cellelinien vælges blandt cellelinierne A.T.C.C. HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960,

20 HB-8961 og HB-8962.

5. Monoklonalt antistof ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at det kan neutralisere evnen af hpG-CSF til at inducere differention af WEHI-3B D+-celler i en kultur.

6. Monoklonalt antistof ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at det er i stand til neutralisere evnen af hpG-CSF til at stimulere benmarvscel-lers thymidinoptagelse.

7. Immunologisk fremgangsmåde til isolation af 30 biologisk aktivt hpG-CSF fra en biologisk væske på basis af en selektiv immunologisk reaktion med et antistof, DK 173517 B1 der er specifikt for hpG-CSF, kendetegnet ved, at den omfatter at man anvender et monoklonalt antistof af en undertype valgt blandt IgM, IgG^, lgG2a, IgG2b og IgG3, der specifikt kan binde med hpG-CSF, men 5 ikke CSF-1, ved en antigen/antistofreaktion.

8. Immunologisk fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof er dannet af en cellelinie valgt blandt cellelinierne A.T.C.C. HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 og

10 HB-8962.

9. Immunologisk fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af hpG-CSF i en biologisk væske på basis af en eller flere selektive immunologiske reaktioner med et antistof, der er specifikt for hpG-CSF, kende- 15tegnet ved, at den omfatter at man anvender et eller flere monoklonale antistoffer af undertyper valgt blandt IgM, IgGj, IgG2a, x9G2b °9 I9G3' der specifikt kan binde med hpG-CSF, men ikke CSF-1, ved en antigen/antistofreaktion .

10. Immunologisk fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof dannes af en cellelinie valgt blandt cellelinierne A.T.C.C. HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 og HB-8962.