JPH0745519B2 - ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子に対するモノクローナル抗体及び該抗体を用いる方法 - Google Patents
ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子に対するモノクローナル抗体及び該抗体を用いる方法Info
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- JPH0745519B2 JPH0745519B2 JP61506316A JP50631686A JPH0745519B2 JP H0745519 B2 JPH0745519 B2 JP H0745519B2 JP 61506316 A JP61506316 A JP 61506316A JP 50631686 A JP50631686 A JP 50631686A JP H0745519 B2 JPH0745519 B2 JP H0745519B2
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/243—Colony Stimulating Factors
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、一般に、生物学的液体からの造血成長因子
（hematopoietic growth factor）の単離及び定量的検
出のための免疫学的操作において利用される物質及び方
法に関する。詳しくは、本発明は、新規ハイブリドーマ
細胞株（A.T.C.C.HB−8957、A.T.C.C.HB−8958、A.T.C.
C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、A.T.C.C.HB−8961及び
A.T.C.C.HB−8962によって例示されるもの）により産生
され造血成長因子と特異的に反応するモノクローナル抗
体、並びにアフィニティー精製技術による造血成長因子
の単離、造血成長因子の検出アッセイ及びこのような成
長因子の研究のための免疫学的技術におけるこれら抗体
の用途に関する。更に詳しくは、本発明は、天然及び組
換え体由来のヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子
（hpG−CSF）と特異的に反応するモノクローナル抗体に
関する。
（hematopoietic growth factor）の単離及び定量的検
出のための免疫学的操作において利用される物質及び方
法に関する。詳しくは、本発明は、新規ハイブリドーマ
細胞株（A.T.C.C.HB−8957、A.T.C.C.HB−8958、A.T.C.
C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、A.T.C.C.HB−8961及び
A.T.C.C.HB−8962によって例示されるもの）により産生
され造血成長因子と特異的に反応するモノクローナル抗
体、並びにアフィニティー精製技術による造血成長因子
の単離、造血成長因子の検出アッセイ及びこのような成
長因子の研究のための免疫学的技術におけるこれら抗体
の用途に関する。更に詳しくは、本発明は、天然及び組
換え体由来のヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子
（hpG−CSF）と特異的に反応するモノクローナル抗体に
関する。
ヒト血液形成（造血）系は、様々な白血球（好中球、マ
クロファージ及び好塩基球／肥満細胞を含む）、赤血球
（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨核球／血小
板）を補給する。平均的ヒト男性の造血系は毎年顆粒球
及び赤血球を4.5×1011個のオーダーで産生すると見積
られており、この量は全体重を１年で入れ替えた量に相
当する。デクスターら，バイオエッセイズ，第２巻，第
154−158頁,1985年〔Dexter et al.,BioEssays,2,154−
158（1985）〕参照。
クロファージ及び好塩基球／肥満細胞を含む）、赤血球
（エリスロサイト）及び凝血形成細胞（巨核球／血小
板）を補給する。平均的ヒト男性の造血系は毎年顆粒球
及び赤血球を4.5×1011個のオーダーで産生すると見積
られており、この量は全体重を１年で入れ替えた量に相
当する。デクスターら，バイオエッセイズ，第２巻，第
154−158頁,1985年〔Dexter et al.,BioEssays,2,154−
158（1985）〕参照。
ある造血成長因子は、少量で少数の前駆“幹細胞”から
様々な血液細胞系への分化、これらの系の著しい増殖、
及びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的分化の原因
をなしていると考えられている。造血成長因子は極端に
少量で存在しているため、これら因子の検出及び確認は
アッセイの仕方に依存していたが、現在までのところで
は人口的条件下での培養細胞への刺激作用に基づき様々
な因子の中から区別し得るにすぎなかった。その結果、
多数の名称が非常に少数の因子を表示するために用いら
れてきた。例えば、このような混乱のために、IL−３、
BPA、マルチ−CSF、HCGF、MCF及びPSFという用語が用い
られているが、これらはすべて単一のマウス造血成長因
子に該当すると現在では考えられている。メトカーフ，
サイエンス，第229巻、第16−22頁,1985年 〔Metcalf,Science,229,16−22（1985）〕。
様々な血液細胞系への分化、これらの系の著しい増殖、
及びこれらの系からの成熟血液細胞の最終的分化の原因
をなしていると考えられている。造血成長因子は極端に
少量で存在しているため、これら因子の検出及び確認は
アッセイの仕方に依存していたが、現在までのところで
は人口的条件下での培養細胞への刺激作用に基づき様々
な因子の中から区別し得るにすぎなかった。その結果、
多数の名称が非常に少数の因子を表示するために用いら
れてきた。例えば、このような混乱のために、IL−３、
BPA、マルチ−CSF、HCGF、MCF及びPSFという用語が用い
られているが、これらはすべて単一のマウス造血成長因
子に該当すると現在では考えられている。メトカーフ，
サイエンス，第229巻、第16−22頁,1985年 〔Metcalf,Science,229,16−22（1985）〕。
組換え遺伝子工学の利用により，この混乱から一定の秩
序を見出すことができた。例えば、赤血球産生を促進す
るヒトエリスロポエチンのアミノ酸及びDNA配列が明ら
かにされた（リン（Lin）,1985年６月20日公開のPCT公
開出願第85/02610号明細書参照）。組換え方法は、ヒト
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）
及びヒトマクロファージ特異的コロニー刺激因子（CSF
−１）に関するcDNAの単離のためにも利用された〔リー
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（USA），第82巻，第4360−436
4頁、1985年（Lee,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A），82,4360−4364（1985）、ウオン（Wong）ら、サイ
エンス，第228巻、第810−814頁（1985）、およびコワ
サキ（Kowasaki）ら、サイエンス，第230巻，第291−29
6頁（1985）〕。
序を見出すことができた。例えば、赤血球産生を促進す
るヒトエリスロポエチンのアミノ酸及びDNA配列が明ら
かにされた（リン（Lin）,1985年６月20日公開のPCT公
開出願第85/02610号明細書参照）。組換え方法は、ヒト
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）
及びヒトマクロファージ特異的コロニー刺激因子（CSF
−１）に関するcDNAの単離のためにも利用された〔リー
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（USA），第82巻，第4360−436
4頁、1985年（Lee,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A），82,4360−4364（1985）、ウオン（Wong）ら、サイ
エンス，第228巻、第810−814頁（1985）、およびコワ
サキ（Kowasaki）ら、サイエンス，第230巻，第291−29
6頁（1985）〕。
ヒト多分化能性コロニー刺激因子（hpCSF）又はプルリ
ポエチン（pluripoietin）と称されるヒト造血成長因子
は、A.T.C.C.寄託番号HTB−９としてアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、米国、メリーランド
州、ロックビルに制限的条件下で寄託されたヒト膀胱癌
細胞株5637の培地中に存在していることが示された。こ
の細胞系から精製されたhpCSFは、ヒト骨髄前駆細胞を
用いたアッセイにおいて、すべての主な血液細胞型の産
生につながる多分化能性前駆細胞の増殖及び分化を促進
することが報告された。ウエルト（Welte）ら、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（USA）、第82巻、第1526−1530頁（198
5）。
ポエチン（pluripoietin）と称されるヒト造血成長因子
は、A.T.C.C.寄託番号HTB−９としてアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、米国、メリーランド
州、ロックビルに制限的条件下で寄託されたヒト膀胱癌
細胞株5637の培地中に存在していることが示された。こ
の細胞系から精製されたhpCSFは、ヒト骨髄前駆細胞を
用いたアッセイにおいて、すべての主な血液細胞型の産
生につながる多分化能性前駆細胞の増殖及び分化を促進
することが報告された。ウエルト（Welte）ら、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（USA）、第82巻、第1526−1530頁（198
5）。
予備研究では、hpCSFと確認された因子がヒトCFU−GMア
ッセイにおいて最初の７日間にわたり主に顆粒球コロニ
ー刺激活性を有することが示されている。
ッセイにおいて最初の７日間にわたり主に顆粒球コロニ
ー刺激活性を有することが示されている。
ヒトCSF−βと称される別の因子も、ヒト膀胱癌細胞株5
637から単離されており、未標識マウス顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−CSF）の場合と同一の容量応答関係でWEH
I−3BD+細胞との結合性に関しマウス125I−標識Ｇ−CSF
の競合体であるとして記載されていた〔ニコラら、ネー
チャー、第314巻、第625−628頁（Nicola,et al.,Natur
e,314,625−628（1985））〕。この用量応答関係は未標
識マウスＧ−CSFに対して独特であると既に報告されて
おり、Ｍ−CSF、GM−CSF、I1−３のような因子では生じ
得ない〔ニコラら、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（USA）、第81
巻、第3765−3769頁（1984）。更に、メトカーフら、リ
ューケミア・リサーチ、第９巻、第５号、第521−527
頁、1985年（Leukemia Research,Vol.9,No.5,pp521−52
7（1985））参照。CSF−β及びＧ−CSFは、それがWEHI
−3BD+細胞の分化を誘導する高い能力を有していること
から、CSF類の中では同様に独特である〔ニコラら、イ
ムノロジー・トゥデー、第５巻、第76−80頁（1984）
（Immunology Today,5,76−80（1984））〕。高濃度で
は、Ｇ−CFSは混合顆粒球−マクロファージコロニー形
成細胞を刺激するが〔ニコラら、1984年、同上〕、この
ことは予備結果がヒト骨髄培養物とhpCSFとの14日間の
インキュベート後、顆粒球性、単球性、混合顆粒球性／
単球性及び好酸球性のコロニー（CFU−GEMM）の出現を
示していることと一致する。CSF−βもマウス骨髄細胞
を用いたアッセイにおいて好中性顆粒球性コロニーの形
成を促進するとして記載されていたが、このような性質
は因子をＧ−CSFとして確認するための基準となってい
たものである。これらの類似性に基づき、ヒトCSF−β
はＧ−CSF（顆粒球性コロニー刺激因子）と同一である
ことが確認された。ニコラら、ネーチャー、第314頁、
第625−628頁、1985参照。
637から単離されており、未標識マウス顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−CSF）の場合と同一の容量応答関係でWEH
I−3BD+細胞との結合性に関しマウス125I−標識Ｇ−CSF
の競合体であるとして記載されていた〔ニコラら、ネー
チャー、第314巻、第625−628頁（Nicola,et al.,Natur
e,314,625−628（1985））〕。この用量応答関係は未標
識マウスＧ−CSFに対して独特であると既に報告されて
おり、Ｍ−CSF、GM−CSF、I1−３のような因子では生じ
得ない〔ニコラら、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（USA）、第81
巻、第3765−3769頁（1984）。更に、メトカーフら、リ
ューケミア・リサーチ、第９巻、第５号、第521−527
頁、1985年（Leukemia Research,Vol.9,No.5,pp521−52
7（1985））参照。CSF−β及びＧ−CSFは、それがWEHI
−3BD+細胞の分化を誘導する高い能力を有していること
から、CSF類の中では同様に独特である〔ニコラら、イ
ムノロジー・トゥデー、第５巻、第76−80頁（1984）
（Immunology Today,5,76−80（1984））〕。高濃度で
は、Ｇ−CFSは混合顆粒球−マクロファージコロニー形
成細胞を刺激するが〔ニコラら、1984年、同上〕、この
ことは予備結果がヒト骨髄培養物とhpCSFとの14日間の
インキュベート後、顆粒球性、単球性、混合顆粒球性／
単球性及び好酸球性のコロニー（CFU−GEMM）の出現を
示していることと一致する。CSF−βもマウス骨髄細胞
を用いたアッセイにおいて好中性顆粒球性コロニーの形
成を促進するとして記載されていたが、このような性質
は因子をＧ−CSFとして確認するための基準となってい
たものである。これらの類似性に基づき、ヒトCSF−β
はＧ−CSF（顆粒球性コロニー刺激因子）と同一である
ことが確認された。ニコラら、ネーチャー、第314頁、
第625−628頁、1985参照。
これらの共通の性質に基づくと、ニコラらの上記のヒト
CSF−β及びウェルトらの上記のhpCSFは適切にはヒト多
分化能性顆粒球コロニー刺激因子（hpG−CSF）と称され
る同一の因子であるらしい。
CSF−β及びウェルトらの上記のhpCSFは適切にはヒト多
分化能性顆粒球コロニー刺激因子（hpG−CSF）と称され
る同一の因子であるらしい。
引用により本明細書に組入れられる“多分化能性顆粒球
コロニー刺激因子の産生”に関する1985年８月23日に出
願された共同所有かつ同時係属中の米国特許出願第768,
959号明細書において、ヒト多分化能性顆粒球コロニー
刺激因子の一次構造コンホーメーションの一部もしくは
全部及びその生物学的性質のうち１つ以上を有する新規
組換え産生ポリペプチド類が開示されている。このポリ
ペプチド類をコードするDNA配列、このポリペプチド類
をコードする形質転換宿主細胞及び組換え法によるこの
因子の合成方法も開示されている。
コロニー刺激因子の産生”に関する1985年８月23日に出
願された共同所有かつ同時係属中の米国特許出願第768,
959号明細書において、ヒト多分化能性顆粒球コロニー
刺激因子の一次構造コンホーメーションの一部もしくは
全部及びその生物学的性質のうち１つ以上を有する新規
組換え産生ポリペプチド類が開示されている。このポリ
ペプチド類をコードするDNA配列、このポリペプチド類
をコードする形質転換宿主細胞及び組換え法によるこの
因子の合成方法も開示されている。
本発明の背景に関して重要なことは、選択された抗原物
質に対して高度に特異的なモノクローナル抗体を産生す
る腫瘍細胞株を製造するためのハイブリドーマ技術に対
して向けられている最近の研究である。モノクローナル
抗体産生技術は当該技術分野において一般に周知であ
る。これらの操作の代表的解説は、ワンズ，ジェイ・ア
ール及びツラウスキー，ブイ・アール，ガストロエンテ
ロロジー，第80巻，第225頁,1981年〔Wands,J.R.,and Z
urawski,V.R.,Gastroenterology 80:225（1985）〕、マ
ーシャク−ロートシュタインら，ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー，第122巻，第2491頁,1979年〔Marshak−Rot
hstein,et al.,J.Immunol.122:2491（1979）、オイ，ブ
イ・ティー及びエル・エー・ヘルツェンベルグ，“免疫
グロブリン産生ハイブリッド”、ミッシェル，ビー・ビ
ー及びエス・エム・シイギ（編集）、細胞免疫学におけ
る選択される方法、サンフランシスコ：ダブリュー・エ
ッチ・フリーマン、パブリッシング,1979年〔Oi,V.T.an
dL.A.Herzenberg,“Immunoglobulin Producing Hybri
d,"Mishell,B.B.and S.M.Shiigi（eds.）Selected Meth
ods in Cellular Immunology,San Francisco:W.H.Freem
an Publishing,1979〕、およびゴーディング，“ハイブ
リドーマによる抗体産生",ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッド，第39巻，第285−308頁,1980年〔God
ing,“Antibody Production by Hybridomas",J.Immuno
l.Meth.39,285−308（1980）〕でみることができる。簡
単に要約すると、所望抗原を予め注射した動物の脾臓か
ら摘出されるリンパ球は、ポリエチレングリコールの存
在下でミエローマ細胞と融合するように誘導される。多
数の“ハイブリッド”ミエローマ細胞が融合により産生
される。各々の“ハイブリドーマ”細胞培養物の増殖液
の上澄は望ましい抗体活性の存在に関して試験される。
このような活性が一つの細胞培養上澄中に存在する場合
には、限界希釈法によりクローニングされ、クローンは
上澄活性について個別に試験される。
質に対して高度に特異的なモノクローナル抗体を産生す
る腫瘍細胞株を製造するためのハイブリドーマ技術に対
して向けられている最近の研究である。モノクローナル
抗体産生技術は当該技術分野において一般に周知であ
る。これらの操作の代表的解説は、ワンズ，ジェイ・ア
ール及びツラウスキー，ブイ・アール，ガストロエンテ
ロロジー，第80巻，第225頁,1981年〔Wands,J.R.,and Z
urawski,V.R.,Gastroenterology 80:225（1985）〕、マ
ーシャク−ロートシュタインら，ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー，第122巻，第2491頁,1979年〔Marshak−Rot
hstein,et al.,J.Immunol.122:2491（1979）、オイ，ブ
イ・ティー及びエル・エー・ヘルツェンベルグ，“免疫
グロブリン産生ハイブリッド”、ミッシェル，ビー・ビ
ー及びエス・エム・シイギ（編集）、細胞免疫学におけ
る選択される方法、サンフランシスコ：ダブリュー・エ
ッチ・フリーマン、パブリッシング,1979年〔Oi,V.T.an
dL.A.Herzenberg,“Immunoglobulin Producing Hybri
d,"Mishell,B.B.and S.M.Shiigi（eds.）Selected Meth
ods in Cellular Immunology,San Francisco:W.H.Freem
an Publishing,1979〕、およびゴーディング，“ハイブ
リドーマによる抗体産生",ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッド，第39巻，第285−308頁,1980年〔God
ing,“Antibody Production by Hybridomas",J.Immuno
l.Meth.39,285−308（1980）〕でみることができる。簡
単に要約すると、所望抗原を予め注射した動物の脾臓か
ら摘出されるリンパ球は、ポリエチレングリコールの存
在下でミエローマ細胞と融合するように誘導される。多
数の“ハイブリッド”ミエローマ細胞が融合により産生
される。各々の“ハイブリドーマ”細胞培養物の増殖液
の上澄は望ましい抗体活性の存在に関して試験される。
このような活性が一つの細胞培養上澄中に存在する場合
には、限界希釈法によりクローニングされ、クローンは
上澄活性について個別に試験される。
それらの免疫学的性質の高度に特異的な性質から、ハイ
ブリドーマ技術に従って製造されるモノクローナル抗体
は、診断試薬、治療剤及び粗製源からの特異的交叉反応
性抗原タンパク質のアフィニティー精製用試薬としての
用途が提案された。例えば、トレンズ・イン・バイオテ
クノロジー，第３巻，第７号,1985年７月 〔Trends in Biotechnology,Vol.3,No.7（July,198
5）〕並びに米国特許第4,465,624号、第4,514,505号及
び第4,514,507号明細書参照。
ブリドーマ技術に従って製造されるモノクローナル抗体
は、診断試薬、治療剤及び粗製源からの特異的交叉反応
性抗原タンパク質のアフィニティー精製用試薬としての
用途が提案された。例えば、トレンズ・イン・バイオテ
クノロジー，第３巻，第７号,1985年７月 〔Trends in Biotechnology,Vol.3,No.7（July,198
5）〕並びに米国特許第4,465,624号、第4,514,505号及
び第4,514,507号明細書参照。
ヒト多分化能性顆粒球コロニー刺激因子のような造血成
長因子を検出、単離、精製及び研究するために使用され
る特異的モノクローナル抗体の実質的必要性が存在する
にもかかわらず、hpG−CSFに対するモノクローナル抗体
を得る上でハイブリドーマ技術の適用が成功したという
報告はなかった。
長因子を検出、単離、精製及び研究するために使用され
る特異的モノクローナル抗体の実質的必要性が存在する
にもかかわらず、hpG−CSFに対するモノクローナル抗体
を得る上でハイブリドーマ技術の適用が成功したという
報告はなかった。
簡単な要約 本発明は、抗原／抗体反応によりヒト多分化能性顆粒球
コロニー刺激因子と特異的に免疫反応するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を初めて提供す
る。実例として、本発明は新規なマウス由来ハイブリド
ーマ細胞株を即ちA.T.C.C.HB−8957、A.T.C.C.HB−895
8、A.T.C.C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、A.T.C.C.HB
−8961及びA.T.C.C.HB−8962を提供するが、これらは各
々その増殖した培地の上澄の成分としてhpG−CSFと特異
的に反応するモノクローナル抗体を産生するものであ
る。ハイブリドーマ細胞株たるA.T.C.C.HB−8957、A.T.
C.C.HB−8958、A.T.C.C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、
A.T.C.C.HB−8961及びA.T.C.C.HB−8962は、米国メリー
ランド州20852、ロックビール、パークローンドライブ1
2301,アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に寄託されている。
コロニー刺激因子と特異的に免疫反応するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を初めて提供す
る。実例として、本発明は新規なマウス由来ハイブリド
ーマ細胞株を即ちA.T.C.C.HB−8957、A.T.C.C.HB−895
8、A.T.C.C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、A.T.C.C.HB
−8961及びA.T.C.C.HB−8962を提供するが、これらは各
々その増殖した培地の上澄の成分としてhpG−CSFと特異
的に反応するモノクローナル抗体を産生するものであ
る。ハイブリドーマ細胞株たるA.T.C.C.HB−8957、A.T.
C.C.HB−8958、A.T.C.C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、
A.T.C.C.HB−8961及びA.T.C.C.HB−8962は、米国メリー
ランド州20852、ロックビール、パークローンドライブ1
2301,アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に寄託されている。
本発明の実施に際し、ハイブリッド腫瘍細胞株は、オイ
及びヘルツンベルグ，“免疫グロブリン産生ハイブリッ
ド",同上並びにコーディング，“ハイブリドーマによる
抗体生産",ジャナール・オブ・イムノロジカル・メソッ
ド，第39巻,1980年，第285−308頁に記載されているよ
うな標準的免疫学的技術を用いて製造される。天然hpG
−CSFで高度免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、ポ
リエチレングリコールの存在下でマウスミエローマ細胞
系と融合される。各“ハイブリドーマ”細胞培養増殖物
の上澄は、望ましい抗体活性の存否に関して試験され
る。選択されたハイブリドーマ細胞は、その培養上澄中
に高度に特異的な抗hpG−CSFをもつ抗体を産生する細胞
株を増やすためにクローニングされる。
及びヘルツンベルグ，“免疫グロブリン産生ハイブリッ
ド",同上並びにコーディング，“ハイブリドーマによる
抗体生産",ジャナール・オブ・イムノロジカル・メソッ
ド，第39巻,1980年，第285−308頁に記載されているよ
うな標準的免疫学的技術を用いて製造される。天然hpG
−CSFで高度免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、ポ
リエチレングリコールの存在下でマウスミエローマ細胞
系と融合される。各“ハイブリドーマ”細胞培養増殖物
の上澄は、望ましい抗体活性の存否に関して試験され
る。選択されたハイブリドーマ細胞は、その培養上澄中
に高度に特異的な抗hpG−CSFをもつ抗体を産生する細胞
株を増やすためにクローニングされる。
本発明のモノクローナル抗体は、天然又は組換え体から
のhpG−CSF（及び共通の又は類似のエピトープをもつ他
の造血成長因子）のアフィニティー精製及び単離のため
の免疫学的操作において用いられる。このような操作に
おいて、選択され抗体は（例えばカラムに）固定され、
供給源物質は固定された抗体と接触せしめられる。hpG
−CSF又は抗原的に類似の物質は、抗体と結合し、その
結果高度に精製された形で固定抗体から溶離せしめられ
る。本発明の抗体は、hpG−CSFの定量的検出用免疫学的
操作（RIA、ELISAその他）において、単独で用いられる
か又は互いに組合わせてもしくはポリモノクローナル抗
体と一緒に用いられる。本発明の抗体は、hpG−CSF又は
類似因子の過剰産生時にこのような因子と結合させると
いうイン・ビボでの利用性をも有している。本発明の他
の面は、下記の詳細な説明を考慮すれば明らかとなるで
あろう。
のhpG−CSF（及び共通の又は類似のエピトープをもつ他
の造血成長因子）のアフィニティー精製及び単離のため
の免疫学的操作において用いられる。このような操作に
おいて、選択され抗体は（例えばカラムに）固定され、
供給源物質は固定された抗体と接触せしめられる。hpG
−CSF又は抗原的に類似の物質は、抗体と結合し、その
結果高度に精製された形で固定抗体から溶離せしめられ
る。本発明の抗体は、hpG−CSFの定量的検出用免疫学的
操作（RIA、ELISAその他）において、単独で用いられる
か又は互いに組合わせてもしくはポリモノクローナル抗
体と一緒に用いられる。本発明の抗体は、hpG−CSF又は
類似因子の過剰産生時にこのような因子と結合させると
いうイン・ビボでの利用性をも有している。本発明の他
の面は、下記の詳細な説明を考慮すれば明らかとなるで
あろう。
詳細な説明 下記の諸例は、A.T.C.C.HB−8957、A.T.C.C.HB−8958、
A.T.C.C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、A.T.C.C.HB−89
61、A.T.C.C.HB−8962をはじめとするいくつかのハイブ
リドーマ細胞株の製造、hpG−CSFに対する抗体の単離、
並びにモノクローナル抗体の増幅及び特徴に関する本発
明の実施面について説明するものである。
A.T.C.C.HB−8959、A.T.C.C.HB−8960、A.T.C.C.HB−89
61、A.T.C.C.HB−8962をはじめとするいくつかのハイブ
リドーマ細胞株の製造、hpG−CSFに対する抗体の単離、
並びにモノクローナル抗体の増幅及び特徴に関する本発
明の実施面について説明するものである。
更に詳しくは、例１は、hpG−CSFに対するポリクローナ
ル血清抗体の産生に向けたマウス宿主の刺激、脾臓細胞
とミエローマ細胞との融合、ハイブリドーマ細胞のスク
リーニング、クローニング及び増殖、並びにそれからの
モノクローナル抗体の単離に関する。例２は、ELISA及
びRIAアッセイ、並びに競合的阻害及び中和アッセイに
よる産生されるモノクローナル抗体の特徴づけ、腹水法
によるモノクローナル抗体収量の増幅に関する。例３
は、本発明のモノクローナル抗体の使用によるhpG−CSF
の単離及び精製のための操作について記載する。例４
は、本発明の抗体を用いたアッセイ技術の適用によるhp
G−CSFの定量的検出操作について記載する。
ル血清抗体の産生に向けたマウス宿主の刺激、脾臓細胞
とミエローマ細胞との融合、ハイブリドーマ細胞のスク
リーニング、クローニング及び増殖、並びにそれからの
モノクローナル抗体の単離に関する。例２は、ELISA及
びRIAアッセイ、並びに競合的阻害及び中和アッセイに
よる産生されるモノクローナル抗体の特徴づけ、腹水法
によるモノクローナル抗体収量の増幅に関する。例３
は、本発明のモノクローナル抗体の使用によるhpG−CSF
の単離及び精製のための操作について記載する。例４
は、本発明の抗体を用いたアッセイ技術の適用によるhp
G−CSFの定量的検出操作について記載する。
例１ A.ポリクローナル血清の製造 BALB/Cマウスの各々に、米国特許出願第768,959号明細
書の例１（ｂ）の操作に従いヒト膀胱癌細胞株5637（サ
ブクローン1A6）からHPLCにより精製されたhpG−CSFを
注射した。この物質は純度85％以上までC4HPLCカラムで
精製され、50％プロパノール及び100mM酢酸アンモニウ
ムからなる溶液（pH7）中において約60μg/mlの濃度を
有していた。10匹のマウスに各々、hpG−CSF溶液1.2ml
からなる接種原のうち総量で約0.1ml（マウス１匹当た
りhpG−CSF7.2μｇ）をまず複数箇所に皮下注射した
が、この溶液は高速減圧により0.6mlまで濃縮され、次
いでBACTO−フロイント完全アジュバンドH37Ra（DIFCO
3113−60）0.6mlと超音波処理により混合されたもので
ある。18日後、マウスに各々、0.75mlまで濃縮されかつ
フロイント不完全アジュバンド（DIFCO社製BACTO 0639
−60−６）0.75mlと混合されたhpG−CSF溶液1.2mlから
なる接種原のうち総量で約0.15ml（マウス１匹当たりhp
G−CSF7.2μｇ）を複数箇所に皮下追加免疫注射した。
書の例１（ｂ）の操作に従いヒト膀胱癌細胞株5637（サ
ブクローン1A6）からHPLCにより精製されたhpG−CSFを
注射した。この物質は純度85％以上までC4HPLCカラムで
精製され、50％プロパノール及び100mM酢酸アンモニウ
ムからなる溶液（pH7）中において約60μg/mlの濃度を
有していた。10匹のマウスに各々、hpG−CSF溶液1.2ml
からなる接種原のうち総量で約0.1ml（マウス１匹当た
りhpG−CSF7.2μｇ）をまず複数箇所に皮下注射した
が、この溶液は高速減圧により0.6mlまで濃縮され、次
いでBACTO−フロイント完全アジュバンドH37Ra（DIFCO
3113−60）0.6mlと超音波処理により混合されたもので
ある。18日後、マウスに各々、0.75mlまで濃縮されかつ
フロイント不完全アジュバンド（DIFCO社製BACTO 0639
−60−６）0.75mlと混合されたhpG−CSF溶液1.2mlから
なる接種原のうち総量で約0.15ml（マウス１匹当たりhp
G−CSF7.2μｇ）を複数箇所に皮下追加免疫注射した。
４日後、マウスから採血し、それらの血清を抗−hpG−C
SF抗体の産生に関してRIAでスクリーニングした。血清
アッセイで用いられたhpG−CSFは、４回濃縮された、10
0mM硫酸アンモニウム及び50％プロパノール含有溶液中
約100μg/mlの濃度でかつ純度80％のhpG−CSF約0.5mlで
あった。上記溶液250μｌを濃縮し、50mMCO3 2-／HCO3 1-
緩衝液5ml（pH9.2）と混合した。この物質50μｌを次い
で96ウェルトレー中の各ウェルに供し、室温で２時間及
び４℃一夜インキュベートした。５％牛血清アルブミン
（BSA）からなる阻止（ブロッキング）化合物をウェル
中で30分間インキュベートした。1:5、1:25、1:625及び
1:3125の比で希釈された試験血清並びに1:5及び1:125の
比で希釈されたコントロール（非接種）血清を50μl/ウ
ェルの量でウェル中に加え、室温で２時間インキュベー
トした。次いでウェルをウォッシュ・ソリューション
（Wash Solution）〔カークガード・アンド・ペリー・
ラボラトリーズ（Kirkeguard＆Perry Laboratories,KP
L），ゲイザースバーグ，メリーランド州〕を用いて３
回洗浄した。125Iで標識されたウサギ抗マウスIgG抗体
を次いで約199,000カウント／分/50μｌウェルとなるよ
うに加え、室温で1.5時間インキュベートした。次いで
ウェルをウォッシュ・ソリューションで５回洗浄し、そ
れらの放射能をガンマカウンターで計測した。
SF抗体の産生に関してRIAでスクリーニングした。血清
アッセイで用いられたhpG−CSFは、４回濃縮された、10
0mM硫酸アンモニウム及び50％プロパノール含有溶液中
約100μg/mlの濃度でかつ純度80％のhpG−CSF約0.5mlで
あった。上記溶液250μｌを濃縮し、50mMCO3 2-／HCO3 1-
緩衝液5ml（pH9.2）と混合した。この物質50μｌを次い
で96ウェルトレー中の各ウェルに供し、室温で２時間及
び４℃一夜インキュベートした。５％牛血清アルブミン
（BSA）からなる阻止（ブロッキング）化合物をウェル
中で30分間インキュベートした。1:5、1:25、1:625及び
1:3125の比で希釈された試験血清並びに1:5及び1:125の
比で希釈されたコントロール（非接種）血清を50μl/ウ
ェルの量でウェル中に加え、室温で２時間インキュベー
トした。次いでウェルをウォッシュ・ソリューション
（Wash Solution）〔カークガード・アンド・ペリー・
ラボラトリーズ（Kirkeguard＆Perry Laboratories,KP
L），ゲイザースバーグ，メリーランド州〕を用いて３
回洗浄した。125Iで標識されたウサギ抗マウスIgG抗体
を次いで約199,000カウント／分/50μｌウェルとなるよ
うに加え、室温で1.5時間インキュベートした。次いで
ウェルをウォッシュ・ソリューションで５回洗浄し、そ
れらの放射能をガンマカウンターで計測した。
追加免疫注射の21日後、抗hpG−CSF抗体の産生がRIAで
検出された５匹のマウスに３回目の注射を行なった。マ
ウスを追加免疫注射の場合と同一の物質で免疫し、hpG
−CSF約10μg/マウスを投与した。
検出された５匹のマウスに３回目の注射を行なった。マ
ウスを追加免疫注射の場合と同一の物質で免疫し、hpG
−CSF約10μg/マウスを投与した。
B.細胞融合 ハイブリドーマ産生操作において、接種マウスの脾臓細
胞を破壊して、抗hpG−CSF抗体産生リンパ球を懸濁させ
る。これらの脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞株由来細
胞と融合させ、ハイブリッド細胞を形成させる。脾臓及
びミエローマ細胞の細胞膜は、融合し、最初は２個以上
の核を含む共通の細胞質を囲っている。細胞膜融合の数
日後、核は融合し、同期有糸分裂し得るようになる。こ
れらの融合細胞が分裂すると、双方の融合相手の不定数
の染色体はハイブリッド細胞系が安定化するまで消失す
る。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（HA
T）培地はハイブリッド形成操作により産生されるSP2/
0:SP2/0ハイブリッド又は未融合SP2/0細胞が増殖するこ
とを防止するが、一方脾臓：脾臓細胞ハイブリッド又は
未融合脾臓細胞は通常培養の２週間後に死滅する。した
がって、SP2/0:脾臓ハイブリッド細胞のみが培地中で生
存することになる。
胞を破壊して、抗hpG−CSF抗体産生リンパ球を懸濁させ
る。これらの脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞株由来細
胞と融合させ、ハイブリッド細胞を形成させる。脾臓及
びミエローマ細胞の細胞膜は、融合し、最初は２個以上
の核を含む共通の細胞質を囲っている。細胞膜融合の数
日後、核は融合し、同期有糸分裂し得るようになる。こ
れらの融合細胞が分裂すると、双方の融合相手の不定数
の染色体はハイブリッド細胞系が安定化するまで消失す
る。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（HA
T）培地はハイブリッド形成操作により産生されるSP2/
0:SP2/0ハイブリッド又は未融合SP2/0細胞が増殖するこ
とを防止するが、一方脾臓：脾臓細胞ハイブリッド又は
未融合脾臓細胞は通常培養の２週間後に死滅する。した
がって、SP2/0:脾臓ハイブリッド細胞のみが培地中で生
存することになる。
二回目の追加免疫接種後３日目にマウスを頸部脱臼によ
って死亡させ、70％エタノールに浸漬させた。マウス脾
臓を腹側から摘出し、ペニシリンＧ−ストレプトマイシ
ン溶液（“１×”溶液）が補給されたDMEM（ダブルベッ
コ修正イーグル培地，カタログNo.320−1885,GIBCO社ロ
ットNo.18K3252）を入れた氷上の無菌ペトリ皿中に移し
た。この液は以後“１×PS"溶液〔アービン・サイエン
ティフィック社（Irvine Scientific）カタログNo.936
6〕と称され、1ml当たりペニシリンG100単位及びストレ
プトマイシン100μｇを含有する。脾臓に付着した脂肪
組織を除去し、脾臓を２×PS（1ml当たりペニシリンG20
0単位及びストレプトマイシン200μｇ）含有DMEMで２回
洗浄し、氷上の無菌ストマッチャーバッグ（Stomacher
bag）に入れた。バッグにDMEM−２×PS含有溶液を加え
た。脾臓をストマッチャー装置で破壊し、次いで無菌ガ
ーゼ４層に通して過し、50ml遠心管に入れた。バッグ
及びフィルターをDMEM−２×PS溶液からなる溶液40ml以
内で洗浄した。次いで細胞をIEC NH−SII遠心分離機
〔ダモン/IEC・ディビジョン（Damon/IEC Division）で
1000rpmで10分間遠心分離し、上澄を静かに吸引した。
次いで細胞をDMEM−２×PSからなる溶液で２回及び添加
剤なしのDMEMで１回洗浄した。しかる後細胞をDMEMに再
懸濁した。
って死亡させ、70％エタノールに浸漬させた。マウス脾
臓を腹側から摘出し、ペニシリンＧ−ストレプトマイシ
ン溶液（“１×”溶液）が補給されたDMEM（ダブルベッ
コ修正イーグル培地，カタログNo.320−1885,GIBCO社ロ
ットNo.18K3252）を入れた氷上の無菌ペトリ皿中に移し
た。この液は以後“１×PS"溶液〔アービン・サイエン
ティフィック社（Irvine Scientific）カタログNo.936
6〕と称され、1ml当たりペニシリンG100単位及びストレ
プトマイシン100μｇを含有する。脾臓に付着した脂肪
組織を除去し、脾臓を２×PS（1ml当たりペニシリンG20
0単位及びストレプトマイシン200μｇ）含有DMEMで２回
洗浄し、氷上の無菌ストマッチャーバッグ（Stomacher
bag）に入れた。バッグにDMEM−２×PS含有溶液を加え
た。脾臓をストマッチャー装置で破壊し、次いで無菌ガ
ーゼ４層に通して過し、50ml遠心管に入れた。バッグ
及びフィルターをDMEM−２×PS溶液からなる溶液40ml以
内で洗浄した。次いで細胞をIEC NH−SII遠心分離機
〔ダモン/IEC・ディビジョン（Damon/IEC Division）で
1000rpmで10分間遠心分離し、上澄を静かに吸引した。
次いで細胞をDMEM−２×PSからなる溶液で２回及び添加
剤なしのDMEMで１回洗浄した。しかる後細胞をDMEMに再
懸濁した。
ミエローマ細胞（SP2/0）を１×PS及び１％牛胎児血清
（FBS）（アービン・サイエンティフィック社カタログN
o.3000、ロットNo.209608、加熱不活化）含有HB101培地
中で増殖させ、対数増殖相中で３日間培養した。SP2/0
細胞をIECNH−SII遠心分離機で1000rpmで10分間ペレッ
ト化することにより回収した。細胞をDMEM溶液で洗浄
し、次いでDMEM溶液に懸濁した。
（FBS）（アービン・サイエンティフィック社カタログN
o.3000、ロットNo.209608、加熱不活化）含有HB101培地
中で増殖させ、対数増殖相中で３日間培養した。SP2/0
細胞をIECNH−SII遠心分離機で1000rpmで10分間ペレッ
ト化することにより回収した。細胞をDMEM溶液で洗浄
し、次いでDMEM溶液に懸濁した。
次いで脾臓細胞を50ml遠心管中ミエローマ細胞と4:1の
比で混合し、1000rpmで10分間遠心分離し、上澄を吸引
した。しかる後ペレットをフード付37℃水浴中に入れ
た。ポリエチレングリコール〔分子量1500、エム・エー
・バイオプロダクツ（M.A.Bioproducts），カタログNo.
17−780Z,ロットNo.4J030）を融解し、DMEM溶液と1:1の
容量比で混合し、50％溶液をつくった。次いで、PEG溶
液を下記操作に従い細胞に加えた。最初の１分間におい
て、50％PEG溶液1.0mlを加えた。次の１分間では、溶液
をピペットで静かに撹拌し、円状の動きで一定に撹拌し
たが、但し管の側部又は底部に触れることは避けた。次
の１分間では、DMEM、10％FCS及び１×PSからなる溶液1
mlを加えた。次の１分間では、同一溶液1.0mlを再び加
えた。次の２分間では、同一溶液8.0mlを再び加えた。
次いで混合物をIEC NH−SII遠心分離機で1000rpmで10分
間遠心分離した。遠心管中の上澄を吸引し、細胞を10％
FBS及び１×PS含有DMEMからなる培地100〜150mlに静か
に再懸濁した。次いで細胞懸濁液をCO2インキュベータ
ーで予め平衡化された8.5個の96ウェルプレート上の約8
00個のウェル中に懸濁液0.1ml/ウェルの割合で加えた。
しかる後プレートを約７％CO2含有の37℃のCO2インキュ
ベーターに戻した。
比で混合し、1000rpmで10分間遠心分離し、上澄を吸引
した。しかる後ペレットをフード付37℃水浴中に入れ
た。ポリエチレングリコール〔分子量1500、エム・エー
・バイオプロダクツ（M.A.Bioproducts），カタログNo.
17−780Z,ロットNo.4J030）を融解し、DMEM溶液と1:1の
容量比で混合し、50％溶液をつくった。次いで、PEG溶
液を下記操作に従い細胞に加えた。最初の１分間におい
て、50％PEG溶液1.0mlを加えた。次の１分間では、溶液
をピペットで静かに撹拌し、円状の動きで一定に撹拌し
たが、但し管の側部又は底部に触れることは避けた。次
の１分間では、DMEM、10％FCS及び１×PSからなる溶液1
mlを加えた。次の１分間では、同一溶液1.0mlを再び加
えた。次の２分間では、同一溶液8.0mlを再び加えた。
次いで混合物をIEC NH−SII遠心分離機で1000rpmで10分
間遠心分離した。遠心管中の上澄を吸引し、細胞を10％
FBS及び１×PS含有DMEMからなる培地100〜150mlに静か
に再懸濁した。次いで細胞懸濁液をCO2インキュベータ
ーで予め平衡化された8.5個の96ウェルプレート上の約8
00個のウェル中に懸濁液0.1ml/ウェルの割合で加えた。
しかる後プレートを約７％CO2含有の37℃のCO2インキュ
ベーターに戻した。
１日後、DMEM及び10％FBS含有HAT培地100μｌを各ウェ
ルに加えた。２日目、消費された培地100μｌを各ウェ
ルから吸引し、10％FBS含有DMEM中の新鮮HAT培地100μ
ｌと交換した。この操作は、２日目、４日目、７日目及
び11日目に繰返した。14日目、消費された培地100μｌ
を各ウェルから除去し、ヒポキサンチン1.36mg/dl及び
チミジン0.76mg/dl含有HT培地100μｌと交換した。この
操作を18日目、22日目及び26日目に繰返した。28日目、
培養物に10％FBS含有DMEMからなる完全培地で栄養補給
した。培養物にしかる後この完全培地で週２回再度栄養
補給した。17日目、抗マウスIgG抗体を用いて、免疫グ
ロブリンの産生に関して、各ウェルをスクリーニングし
た。RIA及びELISAアッセイでは、800ウェル中の約260が
マウスIgGに関して有意に陽性であった。
ルに加えた。２日目、消費された培地100μｌを各ウェ
ルから吸引し、10％FBS含有DMEM中の新鮮HAT培地100μ
ｌと交換した。この操作は、２日目、４日目、７日目及
び11日目に繰返した。14日目、消費された培地100μｌ
を各ウェルから除去し、ヒポキサンチン1.36mg/dl及び
チミジン0.76mg/dl含有HT培地100μｌと交換した。この
操作を18日目、22日目及び26日目に繰返した。28日目、
培養物に10％FBS含有DMEMからなる完全培地で栄養補給
した。培養物にしかる後この完全培地で週２回再度栄養
補給した。17日目、抗マウスIgG抗体を用いて、免疫グ
ロブリンの産生に関して、各ウェルをスクリーニングし
た。RIA及びELISAアッセイでは、800ウェル中の約260が
マウスIgGに関して有意に陽性であった。
例２ A.モノクローナル抗体の初期的特徴 ELISAアッセイは、抗hpG−CSF抗体を産生するクローン
の検出のために行なった。50mMCO3 2-／HCO3 -緩衝液（pH
9.2）で希釈した90％純度のhpG−CSF100ngを含む溶液約
50μｌを96ウェルトレーの各ウェルに加え、室温で２時
間、４℃で一夜インキュベートすることによって被覆し
た。しかる後ウェルを５％BSA阻止溶液で処理し、30分
間インキュベートした。
の検出のために行なった。50mMCO3 2-／HCO3 -緩衝液（pH
9.2）で希釈した90％純度のhpG−CSF100ngを含む溶液約
50μｌを96ウェルトレーの各ウェルに加え、室温で２時
間、４℃で一夜インキュベートすることによって被覆し
た。しかる後ウェルを５％BSA阻止溶液で処理し、30分
間インキュベートした。
ハイブリドーマ培養物の上澄を１％BSA含有PBS溶液（pH
7.0）で希釈し、次いで被覆ウェルに加えて室温で２時
間インキュベートした。しかる後ウェルをワッシュ・ソ
リューションで３回洗浄し、1:300希釈の西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（BMB No.605−25
0）で1.5時間処理した。ウェルを次いでウォッシュ・ソ
リューションで５回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質ABTS
（KPL）を50μl/ウェルの割合で加えた。ウェルをティ
テルテック・マルチスキャン（Titertek Multiscon）ス
ペクトロフォトメーター〔フロー・ラブス（Flow Lab
s），マクリーン，バージニア州〕で414nmの吸光度の値
について読んだ。ウェルのうちの23個（No.3,4,5,20,2
1,28,35,37,39,40,58,61,63,64,66,68,72,74,75,98,15
1,182及び231）は還元hpG−CSFと顕著に反応することが
見出された。
7.0）で希釈し、次いで被覆ウェルに加えて室温で２時
間インキュベートした。しかる後ウェルをワッシュ・ソ
リューションで３回洗浄し、1:300希釈の西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（BMB No.605−25
0）で1.5時間処理した。ウェルを次いでウォッシュ・ソ
リューションで５回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質ABTS
（KPL）を50μl/ウェルの割合で加えた。ウェルをティ
テルテック・マルチスキャン（Titertek Multiscon）ス
ペクトロフォトメーター〔フロー・ラブス（Flow Lab
s），マクリーン，バージニア州〕で414nmの吸光度の値
について読んだ。ウェルのうちの23個（No.3,4,5,20,2
1,28,35,37,39,40,58,61,63,64,66,68,72,74,75,98,15
1,182及び231）は還元hpG−CSFと顕著に反応することが
見出された。
陽性ウェルから得たハイブリッド細胞の正式なクローニ
ングは、ウェル３個当たり細胞約１個となるような割合
で他のウェルを使って細胞を希釈することにより行なっ
た。通常、活性ウェルからの正式なクローニングでは正
式なクローンを産生し、この正式なクローンは同一のハ
イブリドーマ細胞のサブクローンとなっていたようであ
るが、数例の場合において異なる抗体サブタイプ及び反
応性を示す異なるクローン群を発現していた。同一ウェ
ルから得られるサブクローンを文字で標識した（例え
ば、ウェル４から得られるクローンを4A、4B等のように
標識した）。
ングは、ウェル３個当たり細胞約１個となるような割合
で他のウェルを使って細胞を希釈することにより行なっ
た。通常、活性ウェルからの正式なクローニングでは正
式なクローンを産生し、この正式なクローンは同一のハ
イブリドーマ細胞のサブクローンとなっていたようであ
るが、数例の場合において異なる抗体サブタイプ及び反
応性を示す異なるクローン群を発現していた。同一ウェ
ルから得られるサブクローンを文字で標識した（例え
ば、ウェル４から得られるクローンを4A、4B等のように
標識した）。
ELISAアッセイは、天然hPG−CSF及び還元された天然hpG
−CSFに対するモノクローナル抗体の反応性を調べるた
めに行なった。hpG−CSFと反応する抗体を産生すること
が判明したウェルから得られる上澄を、天然hpG−CSF及
びSDS/メルカプトエタノールで変性された天然hpG−CSF
の双方に対して試験した。クローンからの抗体はほぼ同
等の特異性で双方の物質と反応したが、このことは抗体
がタンパク質のアミノ酸連続配列（一次構造）から主に
決定される抗原性エピトープと特異的に反応しているこ
とを示唆している。
−CSFに対するモノクローナル抗体の反応性を調べるた
めに行なった。hpG−CSFと反応する抗体を産生すること
が判明したウェルから得られる上澄を、天然hpG−CSF及
びSDS/メルカプトエタノールで変性された天然hpG−CSF
の双方に対して試験した。クローンからの抗体はほぼ同
等の特異性で双方の物質と反応したが、このことは抗体
がタンパク質のアミノ酸連続配列（一次構造）から主に
決定される抗原性エピトープと特異的に反応しているこ
とを示唆している。
B.哺乳動物及び組換え体hpG−CSFに対するモノクローナ
ル抗体の反応性 この例において、活性ウェルから得られるハイブリドー
マ上澄の反応性を測定するための固相RIA及びELISAアッ
セイは、哺乳動物hpG−CSF及び組換え大腸菌（Escheric
hia coli）産生hpG−CSFに関して行なわれた。１つのケ
ースを除いてすべての場合に、哺乳動物産生は（天然）
hpG−CSFと反応したモノクローナル抗体は組換え体産生
hpG−CSFとも十分に等しく反応した。例外のケースと
は、直接結合アッセイにおいて哺乳動物由来物質よりも
組換え物質の方が著しく低くしか反応しない抗体を産生
するサブクローン35B、35D及び35Iを用いた場合であっ
た。
ル抗体の反応性 この例において、活性ウェルから得られるハイブリドー
マ上澄の反応性を測定するための固相RIA及びELISAアッ
セイは、哺乳動物hpG−CSF及び組換え大腸菌（Escheric
hia coli）産生hpG−CSFに関して行なわれた。１つのケ
ースを除いてすべての場合に、哺乳動物産生は（天然）
hpG−CSFと反応したモノクローナル抗体は組換え体産生
hpG−CSFとも十分に等しく反応した。例外のケースと
は、直接結合アッセイにおいて哺乳動物由来物質よりも
組換え物質の方が著しく低くしか反応しない抗体を産生
するサブクローン35B、35D及び35Iを用いた場合であっ
た。
C.抗体サブタイプに関するスクリーニング この例において、始めから活性であることがわかってい
る23個のウェルから得た正式なクローンを、それらの抗
体サブタイプの決定のためにRIAでスクリーニングし
た。96ウェルトレーを異なるサブタイプ特異性のウサギ
抗マウス免疫グロブリン抗体が処理した。抗マウス免疫
グロブリン抗体としては、ウサギ抗マウスIgG1〔マイル
ス・ラボラトリーズ（MILES Laboratories），ナパービ
ル，イリノイ州,64−360−１〕、ウサギ抗マウスIgG2a
（マイルス,64361−１）ウサギ抗マウスIgG2b（マイル
ス,64−362はい）、ウサギ抗マウスIgG3（マイルス,64
−363−１）、ウサギ抗マウスIgM（マイルス,64−365−
１）及びウサギ抗マウスIgG（マイルス,65−157−２）
があった。各ウェルを、抗体約0.5μｇ含有CO3 2-／HCO3
-（pH9.6）緩衝液中の抗マウス免疫グロブリン抗体溶液
50μｌで被覆し、室温で２時間及び４℃で一夜インキュ
ベートした。次いでウェルを５％BSA溶液で30分間イン
キュベートすることによりブロッングした。しかる後各
ウェルをハイブリドーマ組織培養上澄と室温で２時間イ
ンキュベートし、ウォッシュ・ソリューションで３回洗
浄した。抗IgG抗体で処理したウェルを125I−ウサギ抗
マウスIgG抗体50μl/ウェルで1.5時間インキュベート
し、一方抗IgMで処理したウェルを125I−ウサギ抗マウ
スIgM抗体50μl/ウェルで1.5時間インキュベートした。
次いでウェルをウォッシュ・ソリューションで５回洗浄
し、ガンマカウンターで計測した。オリジナルの23個の
クローンの分析結果は、２つのウェル（No.37及び182）
がIgG合成を停止し、１つのウェルがIgG陽性であるもの
の初期スクリーニングでhpG−CSFとの反応性がなく（N
o.58）、15のウェルがIgG1に関し陽性である（No.4C、
５、28、39、40、61、63、64、66、68、72、74、75,98
及び231）ことを示している。これらのうち１つのサブ
クローンは、抗IgG3及び抗IgMの双方の抗体と反応する
ことが判明した。４つのウェルはIgG2a産生に関し陽性
であり（No.3、4A、21及び151）、１つのウェルはIgG2b
産生に関し陽性であった（No.35）。
る23個のウェルから得た正式なクローンを、それらの抗
体サブタイプの決定のためにRIAでスクリーニングし
た。96ウェルトレーを異なるサブタイプ特異性のウサギ
抗マウス免疫グロブリン抗体が処理した。抗マウス免疫
グロブリン抗体としては、ウサギ抗マウスIgG1〔マイル
ス・ラボラトリーズ（MILES Laboratories），ナパービ
ル，イリノイ州,64−360−１〕、ウサギ抗マウスIgG2a
（マイルス,64361−１）ウサギ抗マウスIgG2b（マイル
ス,64−362はい）、ウサギ抗マウスIgG3（マイルス,64
−363−１）、ウサギ抗マウスIgM（マイルス,64−365−
１）及びウサギ抗マウスIgG（マイルス,65−157−２）
があった。各ウェルを、抗体約0.5μｇ含有CO3 2-／HCO3
-（pH9.6）緩衝液中の抗マウス免疫グロブリン抗体溶液
50μｌで被覆し、室温で２時間及び４℃で一夜インキュ
ベートした。次いでウェルを５％BSA溶液で30分間イン
キュベートすることによりブロッングした。しかる後各
ウェルをハイブリドーマ組織培養上澄と室温で２時間イ
ンキュベートし、ウォッシュ・ソリューションで３回洗
浄した。抗IgG抗体で処理したウェルを125I−ウサギ抗
マウスIgG抗体50μl/ウェルで1.5時間インキュベート
し、一方抗IgMで処理したウェルを125I−ウサギ抗マウ
スIgM抗体50μl/ウェルで1.5時間インキュベートした。
次いでウェルをウォッシュ・ソリューションで５回洗浄
し、ガンマカウンターで計測した。オリジナルの23個の
クローンの分析結果は、２つのウェル（No.37及び182）
がIgG合成を停止し、１つのウェルがIgG陽性であるもの
の初期スクリーニングでhpG−CSFとの反応性がなく（N
o.58）、15のウェルがIgG1に関し陽性である（No.4C、
５、28、39、40、61、63、64、66、68、72、74、75,98
及び231）ことを示している。これらのうち１つのサブ
クローンは、抗IgG3及び抗IgMの双方の抗体と反応する
ことが判明した。４つのウェルはIgG2a産生に関し陽性
であり（No.3、4A、21及び151）、１つのウェルはIgG2b
産生に関し陽性であった（No.35）。
D.3H−チミジン取込みにより測定されるhpG−CSF活性の
中和 この例において、hpG−CSFに対するモノクローナル抗体
を、ヒト骨髄細胞中への3H−チミジンの取込みを促進す
るhpG−CSFの生物学的活性の中和能力に関して試験し
た。3H−チミジン取込み中和に関して試験するために、
組換え又は天然hpG−CSFを本発明の様々な濃度の抗体と
一緒に４℃で12時間インキュベートした。次いで溶液を
低密度非付着性ヒト骨髄細胞に加え、同時係属米国特許
出願第768,959号明細書の例７に記載された方法に従い
操作した。様々ある中で、No.20A、35B、39B、40A、61
D、63D、75A及び151Kのクローン由来の抗体を試験した
ところ、クローンNo.75Aの抗体は3H−チミジン取込みに
おけるhpG−CSFの作用を最も有効に中和し、上記抗体の
すべてが3H−チミジン取込み作用を様々な度合で中和し
たが、但しクローンNo.35Bから産生される抗体は例外で
あった。
中和 この例において、hpG−CSFに対するモノクローナル抗体
を、ヒト骨髄細胞中への3H−チミジンの取込みを促進す
るhpG−CSFの生物学的活性の中和能力に関して試験し
た。3H−チミジン取込み中和に関して試験するために、
組換え又は天然hpG−CSFを本発明の様々な濃度の抗体と
一緒に４℃で12時間インキュベートした。次いで溶液を
低密度非付着性ヒト骨髄細胞に加え、同時係属米国特許
出願第768,959号明細書の例７に記載された方法に従い
操作した。様々ある中で、No.20A、35B、39B、40A、61
D、63D、75A及び151Kのクローン由来の抗体を試験した
ところ、クローンNo.75Aの抗体は3H−チミジン取込みに
おけるhpG−CSFの作用を最も有効に中和し、上記抗体の
すべてが3H−チミジン取込み作用を様々な度合で中和し
たが、但しクローンNo.35Bから産生される抗体は例外で
あった。
E.細胞分化誘導により測定されるhpG−CSF活性の中和 この例において、hpG−CSFに対する抗体を、マウス骨髄
単球白血病細胞系WEHI−3B D+の分化を誘導するhpG−CS
Fの効力を中和する能力に関して試験した。本発明に従
い（クローンNo.20A、39B、40A、61D、63D及び75Aか
ら）産生される様々な濃度の抗体をhpG−CSFと一緒に４
℃で12時間インキュベートした。次いで溶液を、同時係
属米国特許出願第768,959号明細書の例７に記載された
方法に従い、寒天懸濁液中のWEHI−3B D+細胞に加え
た。クローンNo.40A、61D及び75Aから産生される抗体
は、分化阻止能を示した。これらのモノクローナル抗体
はhpG−CSFに対して異なる沈降能を有していることか
ら、あるものはhpG−CSFの分化誘導能を阻止し一方他の
ものは阻止しないという事実は親和性の強さのみによっ
て説明することができない。特に、クローン75Aから産
生されるモノクローナル抗体はWEHI−3B D+細胞の分化
を阻止したのみならず細胞増殖をも阻止したということ
は、このモノクローナル抗体はWEHI−3B D+細胞から分
泌されるマウス成長因子と交叉反応しかつhpG−CSFに結
合するその効力とは別に抗増殖作用を有することを示唆
している。
単球白血病細胞系WEHI−3B D+の分化を誘導するhpG−CS
Fの効力を中和する能力に関して試験した。本発明に従
い（クローンNo.20A、39B、40A、61D、63D及び75Aか
ら）産生される様々な濃度の抗体をhpG−CSFと一緒に４
℃で12時間インキュベートした。次いで溶液を、同時係
属米国特許出願第768,959号明細書の例７に記載された
方法に従い、寒天懸濁液中のWEHI−3B D+細胞に加え
た。クローンNo.40A、61D及び75Aから産生される抗体
は、分化阻止能を示した。これらのモノクローナル抗体
はhpG−CSFに対して異なる沈降能を有していることか
ら、あるものはhpG−CSFの分化誘導能を阻止し一方他の
ものは阻止しないという事実は親和性の強さのみによっ
て説明することができない。特に、クローン75Aから産
生されるモノクローナル抗体はWEHI−3B D+細胞の分化
を阻止したのみならず細胞増殖をも阻止したということ
は、このモノクローナル抗体はWEHI−3B D+細胞から分
泌されるマウス成長因子と交叉反応しかつhpG−CSFに結
合するその効力とは別に抗増殖作用を有することを示唆
している。
F.エピトープの特徴 この例において、競合的結合試験はクローン75A及び151
K由来の125I標識抗体並びに固定された組換え体産生hpG
−CSFを用いて行なわれた。これらの試験において、他
のクローン由来の抗体は、組換え体産生hpG−CSFに結合
した75A及び151K放射線標識モノクローナル抗体に対し
て競合することができた。当該技術分野で周知の操作法
に従いインキュベート及び洗浄した後、75A産生抗体又
は151K産生抗体がhpG−CSFから離脱された量を調べるた
めに放射線計測を行なった。
K由来の125I標識抗体並びに固定された組換え体産生hpG
−CSFを用いて行なわれた。これらの試験において、他
のクローン由来の抗体は、組換え体産生hpG−CSFに結合
した75A及び151K放射線標識モノクローナル抗体に対し
て競合することができた。当該技術分野で周知の操作法
に従いインキュベート及び洗浄した後、75A産生抗体又
は151K産生抗体がhpG−CSFから離脱された量を調べるた
めに放射線計測を行なった。
これらのアッセイの結果では、クローンNo.63D、75A及
び151Kから産生される抗体がhpG−CSFタンパク質上にお
いて共通抗原エピトープの重複部分を有することを示し
ている。しかも結果は、クローンNo.4C、28A及び35Bか
ら産生される抗体は75A及び151K産生抗体が特異的に反
応しないhpG−CSFタンパク質のエピトープ又はエピトー
プ群と反応するらしいことを示している。更に結果は、
クローン40A及び61Dから産生された抗体のhpG−CSF結合
性がクローン4C、28A、35B、75A及び151Kから産生され
る抗体のそれとは異なることを示唆している。
び151Kから産生される抗体がhpG−CSFタンパク質上にお
いて共通抗原エピトープの重複部分を有することを示し
ている。しかも結果は、クローンNo.4C、28A及び35Bか
ら産生される抗体は75A及び151K産生抗体が特異的に反
応しないhpG−CSFタンパク質のエピトープ又はエピトー
プ群と反応するらしいことを示している。更に結果は、
クローン40A及び61Dから産生された抗体のhpG−CSF結合
性がクローン4C、28A、35B、75A及び151Kから産生され
る抗体のそれとは異なることを示唆している。
G.寄託された代表的細胞株由来の抗体の性質 本発明により提供される抗体類を代表するモノクローナ
ル抗体を産生し得る代表的な新規ハイブリドーマ細胞株
は、米国メリーランド州、ロックビル、パークローン・
ドライブ、12301 MD20852、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託済である。これらの細胞系
は、正式のクローニング操作中に開発された細胞系に下
記のように対応する。クローン4C（A.T.C.C.HB−896
2）、クローン28A（A.T.C.C.HB−8957）、クローン35B
（A.T.C.C.HB−8960）、クローン63D（A.T.C.C.HB−895
8）、クローン75A（A.T.C.C.HB−8959）及びクローン15
1K（A.T.C.C.HB−8961）。これらのクローンから産生さ
れる抗体の性質は下記第１表に要約されている。
ル抗体を産生し得る代表的な新規ハイブリドーマ細胞株
は、米国メリーランド州、ロックビル、パークローン・
ドライブ、12301 MD20852、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託済である。これらの細胞系
は、正式のクローニング操作中に開発された細胞系に下
記のように対応する。クローン4C（A.T.C.C.HB−896
2）、クローン28A（A.T.C.C.HB−8957）、クローン35B
（A.T.C.C.HB−8960）、クローン63D（A.T.C.C.HB−895
8）、クローン75A（A.T.C.C.HB−8959）及びクローン15
1K（A.T.C.C.HB−8961）。これらのクローンから産生さ
れる抗体の性質は下記第１表に要約されている。
H.腹水法による抗体収量の増幅 組織培養で産生されたものよりも高濃度の抗体を得るた
め、本発明のモノクローナル抗体を、ケンネスら（編
集）、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的
分析の新しい次元、第403頁、ニューヨーク、プレナム
・プレス、1981年〔Kenneth,et al.,（eds）,Monoclona
l Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biologi
cal Analysis,p.403,New York:Plenum Press（1981）〕
に一般的に記載された腹水法によって増幅させた。この
操作法に従い、25または27ゲージ針で腹腔内に注射する
ことにより、プリスタン〔2,6,19,14−テトラメチルペ
ンタデカン、アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chem
icol Co.）製〕0.5mlでマウスを処置した。プリスタン
処理は、腹腔内において腹水型の腫瘍細胞を増殖させ
る。約１〜２週間後、無血清ダルベッコ修正イーグル培
地（DMEM）（アービン・サイエンティフィック社）又は
HB101〔ハンナ・バイオロジカルス（Hanna Biological
s），バークレー，カリフォルニア州〕中の約106個のハ
イブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注射する。各々のク
ローンに関する一連の注射をマウスで行なう。
め、本発明のモノクローナル抗体を、ケンネスら（編
集）、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的
分析の新しい次元、第403頁、ニューヨーク、プレナム
・プレス、1981年〔Kenneth,et al.,（eds）,Monoclona
l Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biologi
cal Analysis,p.403,New York:Plenum Press（1981）〕
に一般的に記載された腹水法によって増幅させた。この
操作法に従い、25または27ゲージ針で腹腔内に注射する
ことにより、プリスタン〔2,6,19,14−テトラメチルペ
ンタデカン、アルドリッチ・ケミカル社（Aldrich Chem
icol Co.）製〕0.5mlでマウスを処置した。プリスタン
処理は、腹腔内において腹水型の腫瘍細胞を増殖させ
る。約１〜２週間後、無血清ダルベッコ修正イーグル培
地（DMEM）（アービン・サイエンティフィック社）又は
HB101〔ハンナ・バイオロジカルス（Hanna Biological
s），バークレー，カリフォルニア州〕中の約106個のハ
イブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注射する。各々のク
ローンに関する一連の注射をマウスで行なう。
ハイブリドーマ細胞の注射後約１〜３週目に、皮膚に小
さな傷をつけ液体をピペットで取出すことにより、腹水
をマウス腹腔内から採取した。腹水を遠心分離及び次い
で凍結により清澄化した。腹水抗体は、45％硫酸アンモ
ニウムでの沈降及びプロテインＡ−セファロースクロマ
トグラフィーによって腹水アルブミンから更に精製する
ことができる。
さな傷をつけ液体をピペットで取出すことにより、腹水
をマウス腹腔内から採取した。腹水を遠心分離及び次い
で凍結により清澄化した。腹水抗体は、45％硫酸アンモ
ニウムでの沈降及びプロテインＡ−セファロースクロマ
トグラフィーによって腹水アルブミンから更に精製する
ことができる。
例３ 造血成長因子の単離及び精製 高度に特異的かつ高度に反応性の抗hpG−CSFモノクロー
ナル抗体を用いることにより、本発明では初めて当該技
術分野で周知のアフィニティー精製操作により発酵培養
物及び天然哺乳動物源からhpG−CSF及び造血成長因子を
単離することができる。簡単に述べると、好ましい単離
操作では、本発明の抗体を固体支持体（例えば、クロマ
トグラフィー用カラム）に固定化し、hpG−CSF又は造血
因子含有液体を固定抗体と接触させ、しかる後抗体との
免疫複合結合体から精製されたhpG−CSF又は造血成長因
子を溶離させる。使用される特定の抗体を調整すること
により、不正確に折重ねられた又は変性されたhpG−CSF
から正確に折重ねられた構造をもつ天然hpG−CSFを単離
することができる。hpG−CSFの場合と同様に、単離しか
つ研究することができた。
ナル抗体を用いることにより、本発明では初めて当該技
術分野で周知のアフィニティー精製操作により発酵培養
物及び天然哺乳動物源からhpG−CSF及び造血成長因子を
単離することができる。簡単に述べると、好ましい単離
操作では、本発明の抗体を固体支持体（例えば、クロマ
トグラフィー用カラム）に固定化し、hpG−CSF又は造血
因子含有液体を固定抗体と接触させ、しかる後抗体との
免疫複合結合体から精製されたhpG−CSF又は造血成長因
子を溶離させる。使用される特定の抗体を調整すること
により、不正確に折重ねられた又は変性されたhpG−CSF
から正確に折重ねられた構造をもつ天然hpG−CSFを単離
することができる。hpG−CSFの場合と同様に、単離しか
つ研究することができた。
例４ 造血成長因子の定量的検出 高度に特異的な抗hpG−CSFモノクローナル抗体を用いる
ことにより、本発明では、２個以上の抗体を用いて液体
サンプル中のhpG−CSF及び造血成長因子の定量的検出用
の新規な固相又は液相アッセイを可能にすることもでき
る。固相アッセイは典型的には下記の工程からなる： （１）液体中でhpG−CSFの第一抗原決定基と反応する第
一の固定抗体に液体を接触させて、hpG−CSF及び第一抗
体の免疫学的複合体を形成し、（２）第一抗原決定基以
外のhpG−CSFの抗原決定基と反応する第二の抗体に工程
（１）で形成された複合体を接触させて、hpG−CSFと第
二抗体の免疫学的複合体を形成させる。次いで（３）工
程（２）で形成された免疫学的複合体に結合した第二抗
体の量を定量する。
ことにより、本発明では、２個以上の抗体を用いて液体
サンプル中のhpG−CSF及び造血成長因子の定量的検出用
の新規な固相又は液相アッセイを可能にすることもでき
る。固相アッセイは典型的には下記の工程からなる： （１）液体中でhpG−CSFの第一抗原決定基と反応する第
一の固定抗体に液体を接触させて、hpG−CSF及び第一抗
体の免疫学的複合体を形成し、（２）第一抗原決定基以
外のhpG−CSFの抗原決定基と反応する第二の抗体に工程
（１）で形成された複合体を接触させて、hpG−CSFと第
二抗体の免疫学的複合体を形成させる。次いで（３）工
程（２）で形成された免疫学的複合体に結合した第二抗
体の量を定量する。
液相競合アッセイでは、hpG−CSFを標識しておき、それ
を本発明の１個以上の抗体で沈降させる。未標識hpG−C
SF又は類似因子の定性は次いで競合的結合方式で行なう
ことができる。かかるアッセイ操作では好ましくは上記
モノモノクローナル抗体を２種用いるが、しかしながら
１種のモノクローナル抗体及びhpG−CSFに対するポリク
ローナル血清由来抗体を用いても行なわれる。
を本発明の１個以上の抗体で沈降させる。未標識hpG−C
SF又は類似因子の定性は次いで競合的結合方式で行なう
ことができる。かかるアッセイ操作では好ましくは上記
モノモノクローナル抗体を２種用いるが、しかしながら
１種のモノクローナル抗体及びhpG−CSFに対するポリク
ローナル血清由来抗体を用いても行なわれる。
本発明の実施に際して多数の改良及び変更は、その好ま
しい態様の前記記載に基づき当業者であれば考え得るこ
とが予想される。従って、下記の特許請求の範囲に示さ
れるような限定のみが本発明になされるべきである。
しい態様の前記記載に基づき当業者であれば考え得るこ
とが予想される。従って、下記の特許請求の範囲に示さ
れるような限定のみが本発明になされるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭62−130698（ＪＰ，Ａ)
Claims (9)
- 【請求項１】ヒト膀胱癌細胞株5637（A.T.C.C.HTB−
９）より得ることができ、SDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動における分子量18,000および等電点5.5である
顆粒球コロニー刺激活性を有するヒト多分化能性顆粒球
コロニー刺激因子と、抗原／抗体反応により結合し得る
モノクローナル抗hpG−CSF抗体であって、更に骨髄細胞
による3H−チミジン取込みを促進するhpG−CSFの効力、
およびWEHI−3BD+細胞の分化を誘導するhpG−CSFの効力
の少なくとも一つを中和する活性を有する前記モノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項２】モノクローナル抗体がIgG1及びIgG2aから
なる群より選択されるサブタイプのものである、請求の
範囲１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】モノクローナル抗体がA.T.C.C.HB−8958、
HB−8959及びHB−8961からなる細胞株の群から選択され
る細胞株によって産生される、請求の範囲１記載のモノ
クローナル抗体。 - 【請求項４】ヒト膀胱癌細胞株5637（A.T.C.C.HTB−
９）より得ることができ、SDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動における分子量18,000および等電点5.5である
顆粒球コロニー刺激活性を有するヒト多分化能性顆粒球
コロニー刺激因子と、抗原／抗体反応により結合し得る
モノクローナル抗hpG−CSF抗体であって、更に骨髄細胞
による3H−チミジン取込みを促進するhpG−CSFの効力、
およびWEHI−3BD+細胞の分化を誘導するhpG−CSFの効力
の少なくともひとつを中和する活性を有する前記モノク
ローナル抗体との１以上の選択的免疫反応に基づき、生
物学的液体から生物学的活性hpG−CSFを単離する方法。 - 【請求項５】モノクローナル抗体がIgG1及びIgG2aから
なる群より選択されるサブタイプのものである、請求の
範囲４記載の方法。 - 【請求項６】モノクローナル抗体がA.T.C.C.HB−8958、
HB−8959及びHB−8961からなる細胞株の群より選択され
る細胞株によって産生される、請求の範囲４記載の方
法。 - 【請求項７】ヒト膀胱癌細胞株5637（A.T.C.C.HTB−
９）より得ることができ、SDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動における分子量18,000および等電点5.5である
顆粒球コロニー刺激活性を有するヒト多分化能性顆粒球
コロニー刺激因子と、抗原／抗体反応により結合し得る
モノクローナル抗hpG−CSF抗体であって、更に骨髄細胞
による3H−チミジン取込みを促進するhpG−CSFの効力、
およびWEHI−3BD+細胞の分化を誘導するhpG−CSFの効力
の少なくともひとつを中和する活性を有する前記モノク
ローナル抗体との１以上の選択的免疫反応に基づき生物
学的液中のhpG−CSFを定量的に検出する方法。 - 【請求項８】モノクローナル抗体がIgG1及びIgG2aから
なる群より選択されるサブタイプのものである、請求の
範囲７記載の方法。 - 【請求項９】モノクローナル抗体がA.T.C.C.HB−8958、
HB−8959及びHB−8961からなる細胞株の群より選択され
る細胞株によって産生される、請求の範囲７記載の方
法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80675585A | 1985-12-09 | 1985-12-09 | |
| US806755 | 1985-12-09 | ||
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