DK174869B1 - Liposomale formuleringer med et høj antineoplastisk middel/lipid forhold - Google Patents

Description

DK 174869 B1

Den foreliggende opfindelse angår formuleringer og metoder til fremstilling af liposomer, som indeholder antineoplastiske midler med høje medikament-lipid-vægtforhold. De omhandlede formuleringer er generelt lige så gode eller bedre end det tilsvarende medikament i fri form med hensyn til effektivitet, 5 men samtidig udviser de en lavere toxicitet. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne liposomer, som har enestående frigivelseskarakteristika, ligesom opfindelsen angår en analysemetode til bestemmelse af frie og indesluttede antineoplastiske midler, såsom doxorubicin, i et liposom-præparat. Nærmere bestemt angår opfindelsen anvendelse 10 af sådanne liposomer med høje medikament-lipid-forhold sammen med to-xiske ioniserbare antineoplastiske midler, såsom doxorubicin, vinblastin, vin-cristin, 5-fluoruracil (5-FU), daunorubicin, epirubicin, mitoxanthron, og cyclophosphamid.

15 Doxorubicin er et hyppigt anvendt antineoplastisk medikament, som hører til anthracyclin-klassen af antibiotika produceret af svampen Streptomyces peucetius. Doxorubicin har været anvendt imod en række forskellige former for tumorer, leukæmi, sarcoma og brystcancer. De toxicitetsformer, som er iagttaget med de sædvanligvis indgivne doser af doxorubicin (såvel som an-20 dre neoplastiske midler), omfatter myelosuppression, alopecia, mucositis, og gastrointestinal toxicitet, herunder søsyge, opkastninger, og anorexi. Den mest alvorlige doxorubicin-toxicitet er en kumulativ dosisafhængig urreversibel cardiomyopati, som fører til kogenstivt hjertesvigt hos 1-10% af de patienter, som modtager doser på over 550 mg pr. kvadratmeter legemesareal.

25 Disse toxiciteter er en alvorlig begrænsning af den kliniske anvendelighed af antineoplastiske midler såsom doxorubicin.

Liposomer er fuldstændigt lukkede lipid-dobbeltmembraner, som indeholder et indesluttet væskevolumen. Liposomerne kan være unilamellare vesikler 30 (som besidder et enkelt membran-dobbeltlag) eller multilamellare vesikler (løg-lignende strukturer, som er karakteristiske ved flere membrandobbeltlag, der er separeret fra hinanden af vandige lag). Dobbeltlaget er sammensat af to lipid-monolag, som har en hydrophob "hale"-region og en 2 DK 174869 B1 hydrophil "hoved'-region. Strukturerne af membran-dobbeltlaget er sådan, at de hydrophobe (ikke-polære) "haler" i lipid-monolagene orienterer sig imod midten af dobbeltlaget, mens de hydrophile "hoveder" orienterer sig imod den vandige fase.

5

Den oprindelige liposom-fremstilling beskrevet af Bangham et al. (J. Mol.

Biol., 1965, 13.238-252) involverer, at man suspenderer phospholipider i et organiske opløsningsmiddel, som derefter afdampes til tørhed, hvorved der efterlades en phospholipid-film på reaktionsbeholderens inderside. Derefter 10 tilsættes en passende mængde af en vandig fase, og blandingen får lov af "kvælde op", hvorefter de resulterende liposomer, som består af multilammel-lare vesikler (MLV'er), dispergeres ad mekanisk vej. Denne præparation danner basis for udviklingen af de små sonikerede unilamellare vesikler som er beskrevet af Papahadjopoulos et al. (Biochim. Biophys, Acta., 1967, 15 135:624-638). og store unilamellare vesikler.

De teknikker, som anvendes til at producere store unilamellare vesikler (LUV'er), såsom inddampning i omvendt fase, infusionsprocedurer og deter-gent-fortrinding, kan også anvendes til fremstilling af liposomer. En oversigt 20 over disse og andre metoder til fremstilling af liposomer kan findes i bogen "Liposomes", Marc Ostro (red.), Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, kapitel 1; se også Szoka, Jr., et al., (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467). En særligt foretrukken metode til dannelse af LUV'er er beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US 87/00238 med titlen "Extrusion Technique for 25 Producing Unilamellar Vesicles". Vesikler fremstillet ved denne teknik benævnt LUVETer, ekstruderes under tryk igennem et membranfilter. Vesikler-ne kan også ekstrudere igennem et 200 nm filter. Sådanne vesikler kendes som VET 2oo'er. Man kan udsætte LUVETer for mindst en frysnings- og optøningscyklus, inden man gennemfører ekstruderingen. Denne procedure er 30 beskrevet af Mayer et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1985, 817:193-196 i en artikel benævnt "Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles"; sådanne vesikler kendes som FATMLV'er.

DK 174869 B1 3

Andre teknikker, som kan anvendes til fremstilling af vesikler, omfatter de teknikker, hvor der dannes modfase-inddampningsvesikler (REV), se US patentskrift nr. 4.235.871. En anden klasse af liposomer, som kan anvendes, består af de liposomer, som har en i det væsentlige ensartet fordeling af op-5 løste stoffer i lamellarne. Denne klasse af liposomer benævnes som stabile plurilamellare vesikler (SPLV) som defineret i US patentskrift nr. 4.552.803, og klassen inkluderer de monofase-vesikler, som er beskrevet i US patent-skrift nr. 4.588.578, samt frosne og optøede multilamellare vesikler (FATMLV) som beskrevet ovenfor.

10

En række forskellige steroler og disses vandopløselige derivater, såsom cho-lesterol-hemisuccinat, har været anvendte til fremstilling af liposomer, se især US patentskrift nr. 4.721.612. I den publicerede PCT-ansøgning nr. WO 85/00968 er beskrevet en fremgangsmåde, hvormed man kan reducere toxi- 15 citeten af medikamenter ved at indkapsle disse i liposomer, som består af a-tocopherol og visse derivater deraf. Også en række forskellige tocopheroler og deres vandopløselige derivater har været anvendt til dannelse af liposomer, se PCT-publikation nr. WO 87/02219 med titlen "Alpha Tocopherol-Based Vesicles" 20 I et liposom-baseret system til afgivelse af et medikament er et bioaktivt middel, såsom et lægemiddel, indesluttet i liposomerne, som derefter indgives til patienten under behandling. I denne sammenhæng kan henvises til US patentskrifterne nr. 3.993.754, nr. 4.145.410, nr. 4.235.871, nr.4.224.179, nr.

25 4.522.803 og nr. 4.588.578. Hvis det bioaktive middel er lipophilt, kan det alternativt forbinde sig med lipid-dobbeltlaget. I forbindelse med den foreliggende opfindelse skal udtrykket "indeslutning" opfattes som omfattende såvel medikamentet i liposomets væskevolumen som medikamentet forbundet med lipid-dobbeltlaget.

Som det er blevet fastslået af forskellige forskere, kan en cancer-terapi, som gør brug af antineoplastiske midler, i mange tilfælde forbedres betydeligt, hvis man indkapsler det antineoplastiske middel i liposomer ved anvendelse 30 DK 174869 B1 4 af traditionelle metoder i stedet for at indgive det frie medikament direkte i patientens krop; se f.eks. Forssen et al., (1983), Cancer Res. 43:546; og Ga-bizon et al., (1982), Cancer Res. 42:4734. En passiv inkorporering af sådanne midler i liposomer kan ændre deres antitumor-aktivitet, udskillelseshastig-5 heden og vævsfordeling og toxicitet i sammenligning med direkte administration; se f.eks. Rahman et. al., (1982), Cancer Res. 42:1817; Rosa, et al., (1982) i "Transport in Biomembranes: Model Systems and Reconstitution", R. Antoline et al. (red.), Raven Press, New York. 243-256; Rosa, et al., (1983), Pharmacology, 26:221;Gabizon et al. (1983), Cancer Res. 43:4730; Forssen 10 et al., supra; Gabizon, et al., supra; og Olson et al.,(1982), Br. J. Cancer Clin.

Oncol., 18:167. Ved at anvende liposomer med forskellig sammensætning og størrelse har man fundet tegn på, at den akutte og kroniske toxicitet af doxorubicin kan svækkes ved at rette medikamentet bort fra målorganer. F.eks. er det kendt, at cardiotoxiciteten af de to anthracyclin-antibiotika daunorubicin 15 og doxorubicin og af deres farmaceutisk acceptable derivater og salte kan reduceres på signifikant måde gennem passiv liposom-indkapsling; se f.eks. Forssen et al., supra; Olson et al., supra; og Rahman et al., supra. Denne puffer-indvirkning på toxiciteten synes først og fremmest at opstå ud fra en reduceret akkumulering i hjertet med tilknyttet reduktion af cardiotoxiciteten 20 (Rahman et al., 1980, Cancer Res. 40:1532; Olson et al., supra; Herman et al., 1983, Canser Res. 43:5427; og Rahman et al., 1985, Cancer Res. 45:796). En sådan toxicitet er normalt dosis-begrænsende for fri doxorubicin (Minow et al., 1975, Cancer Chemother. Rep. 6:195). Ved at inkorporere meget toxiske antineoplastiske midler i liposomer kan man også reducere risi-25 koen for, at personer, som er involveret i midlernes administration, bliver udsat for midlernes virkning.

Selvom de ovennævnte undersøgelser klart viser, at liposomalt indkapslet doxorubicin har en potentiel anvendelsesmulighed, har man hidtil ikke rådet 30 over en kommercielt acceptabel liposomalpræparation. F.eks. har mange af disse formuleringer et tvivlsomt farmaceutisk potentiel som følge af problemer knyttet til stabiliteten, indeslutningseffektiviteten, opskaleringspotentialet og omkostningerne ved de anvendte lipider. Desuden er man stødt på pro- • DK 174869 B1 5 blemer, der har relation til den effektivitet, med hvilken medikamenterne ind-kapsles. Sådanne problemer har ledsaget de hidtil anvendte passive indeslutningsmetoder.

5 Store multilamellare vesikler (MLV'er) (Gabizon et al., 1982, supra.) store unilamellare vesikler (LUV'er) og små (sonikerede) unilamellare vesikler (SUV'er) (Gabizon et al., 1983, supra., Shinizawa et al., 1981, Acta. Med. Okayama, 35:395) har været anvendt sammen med lipid-sammensætninger, hvori der har været inkorporeret varierende mængder af positivt ladede og 10 negativt ladede lipider ud over phosphatidylcholin (PC) og cholesterol. Variationerne i lipid-sammensætningen udspringer først og fremmest af kravene til indeslutning af doxorubicin, eftersom systemer, der kun indeholder positive eller neutrale lipider, udviser en ringe indeslutningseffektivitet og et lavt forhold imellem medikament og lipid (Gabizon et al., 1983, supra.; og Shinoza-15 wa et al., supra.). I liposomer, der indeholder negativt ladede lipider, sådom cardiolipin, er det muligt at opnå højere forhold imellem medikament og lipid som følge af en tilknytning af det positivt ladede doxorubicin til det negativt ladede lipid. De resulterende præparater er imidlertid af svingende kvalitet, idet de udviser variationer med hensyn til vesikelstørrelse og overfladelad-20 ning. Også typen og mængden af det fornødne lipid er prohibitive størrelser som følge af de økonomiske overvejelser.

Endnu et problem, som man støder på i forbindelse med de hidtil kendte liposomer indeholdende et antineoplastisk middel, er, at der ikke er nogen af 25 de kendte liposomale doxorubicin-formuleringer, der fuldt ud tilfredsstiller fundamentale stabilitetskrav. Retentionen af doxorubicin i et liposomalt præparat måles sædvanligvis i timer, hvorimod der ved farmaceutiske anvendelser sædvanligvis kræves stabiliteter på 1 år eller derover. Desuden er den kemiske stabilitet af lipid-komponenterne tvivlsom som følge af det høje ind-30 hold af meget umættede lipider, såsom cardiolipin. Blandt de øvrige problemer kan nævnes de høje omkostninger, som er knyttet til negativt ladede lipider, og opskaleringsproblemerne. På grund af den kendsgerning, at doxorubicin har amphipatisk natur er forbindelsen i stand til at trænge igennem 6 DK 174869 B1 dobbeltlagsmembraner, hvilket gør liposompræparaterne ustabile som følge af en udsivning af medikamentet fra vesiklerne (Gabizon et al., 1982, supra.; RAhman et al., 1985, supra.; og Ganapathi et al., 1984, Bioche,. Pharmacol., 33:698).

5 I de ovenfor beskrevne undersøgelser anvendte man lipider til at nedsætte toxiciteten af det indesluttede medikament, idet man forøgede lipid-indholdet i formuleringerne for at bibringe medikamentets toxicitet en stødpudeeffekt.

Det har nu overraskende vist sig, at et lavt lipidindhoid (et forøget vægtfor-10 hold imellem medikament og lipid) faktisk nedsætter toxiciteten mest effektivt.

Dette forhold er ikke tidligere blevet omtalt som følge af begrænsninger med hensyn til den mængde doxorubicin, som kan indkapsles ved anvendelse af passive indeslutningsmetoder (metoder, som ikke gør brug af en transmembran-pH-gradient-ladningsmekanisme), hvilket forøger den mæng-15 de lipid, som er nødvendig for at indeslutte den samme mængde medikament.

Mayer et al. fandt, at de problemer, som er knyttet til en effektiv liposomal indkapsling af det antineoplastiske middel, kan afhjælpes ved at anvende 20 transmembran-ion-gradienter (se international patentansøgning nr. PCT/US86/01102). Ud over at inducere doxorubicin-optagelsen virker sådanne transmembran-gradienter også på den måde, at de forøger retentionen af medikamentet i liposomerne. Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes forbedrede puffer-sammensætninger, som kan anvendes med det 25 formål at oplade liposomerne på effektiv måde ved anvendelse af transmembran-ion-gradienter, især transmembran-pH-gradienter, og at tilbageholde det indkapslede middel.

Liposomerne i sig selv har i tidligere kliniske forsøg med mennesker vist sig 30 ikke at have nogen signifikant toxicitet, når de er blevet indgivet intravenøst; se Richardsom et al., 81979), Br. J. Cancer 40:35; Ryman et al., (1983) i "Targeting of Drugs" G. Gregoriadis et al. (redO, side 235-248, Plenum, N.Y.; Gregoriadis G., (1981), Lancet 2:241, og Lopez-Berestein et al., (1985) J.

DK 174869 B1 7

Infect. Dis., 151:704. Det er rapporteret, at liposomerne overvejende koncentrerer sig i de reticuloendothelial-organer, der er afgrænset af sinusformede kapillarer, eksempelvis lever, milt og knoglemarv og de bliver phatocytoseret af de phagocytiske celler, som er til stede i disse organer.

5

Anvendelsen af liposomer til administration af antineoplastiske midler har rejst problemer med hensyn til såvel indkapslingen af medikamentet som indeslutningseffektiviteten, ligesom der er problemer med at få medikamentet frigivet under terapien. Med hensyn til indkapslingen har der været et vedva-10 rende behov for at forøge indeslutningseffektiviteten, således at man begrænser den lipid-ladning, som patienten udsættes for under terapien, til en minimum. En høj indeslutningseffektivitet betyder desuden, at der kun går en ringe mængde af medikamentet tabt under indkapslingsprocessen, hvilket er en væsentlig fordel, når man har at gøre med de kostbare medikamenter, 15 som for tiden anvendes ved cancer-terapi. Med hensyn til frigivelsen af medikamentet har mange antineoplastiske midler, såsom doxorubicin, vist sig at blive frigjort meget hurtigt fra de traditionelle liposomer efter indkapslingen.

En sådan hurtig frigivelse begrænser de fordelagtige virkninger af liposom-indkapslingen og accelererer frigivelsen af medikamentet til kredsløbet, hvil-20 ket frembringer toxicitet og derfor generelt er uønsket. Forskere inden for området har derfor kontinuerligt udfoldet bestræbelser på at finde metoder til at reducere frigivelseshastigheden af antineoplastiske midler og andre medikamenter fra liposomer.

25 Ud over disse problemer med indkapsling og frigivelse er det et alt overskyggende problem at finde en kommercielt acceptabel metode til at tilvejebringe liposomer, som indeholder antineoplastiske midler, der er acceptable for lægen. Selvom produktionen og ladningen af liposomer på basis af behov er en acceptabel procedure, når der skal gennemføres forsøg, er det generelt en 30 utilfredsstillende procedure ved selve den kliniske behandling. Der er således et signifikant og vedvarende behov for metoder, hvormed liposomer med eller uden indkapslede medikamenter kan transporteres, opbevares og gene- 8 DK 174869 B1 relt bevæges igennem konventionelle kommercielle distributionskanaler uden at lide nogen væsentlig overlast.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en indkapslingsprocedure, 5 som gør brug af transmembran-pH-gradienter, som overstiger de behov, som har relation til såvel effektoptimering som farmaceutiske problemer, og hvor der anvendes en formulering med et vægtforhold imellem medikament og lipid, som reducerer toxiciteten af det færdige lægemiddel. Den resulterende liposom-formulering som indeholder et antineoplastisk middel, er særdeles 10 alsidig, eftersom ladningsprocessen ikke er begrænset til nogen bestemt li-pid-sammensætning, liposom-størrelse eller ladning. Man kan anvende prisbillige lipider, og man kan let opnå indeslutningseffektiviteter på omkring 100% for et stort antal forskellige lipid-sammensætninger og vesikelstørrel- ser. Desuden kan man opnå vægtforhold imellem medikament og lipid på 15 over ca. 0,1:1 og op til ca. 3,0:1, hvilket er højere end for de hidtil kendte formuleringer (hvorved man nedsætter lipid-ladningen), og også opskalerin-gen forenkles. En anden enestående fordel ved denne pH-styrede optagelsesproces er, at der opnås en reduktion af den hastighed, hvormed medikamentet frigives fra liposomerne, i sammenligning med liposomer med et pas-20 sivt indesluttet middel. Denne reducerede frigivelseshastighed af det indesluttede bioaktive middel fremkaldes af det puffersystem, som anvendes i præparationerne. Det frigivelses-inhiberende puffer- eller stødpudesystem tilbageholder således midlet i liposomerne.

25 Ifølge et anden aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes en analyseprocedure til bestemmelse af frie og liposom-associerede antineoplastiske midler (eksempelvis doxorubicin, daunorubicin og epirubicin) i liposomale præparationer. Som følge af disse medikamenters høje toxiciteter er det nyttigt at foretage en kvantitativ bestemmelse af niveauet af det fri medikament, 30 hvis et sådant er til stede i præparatet. F.eks. tillader proceduren, at man påviser frit medikament i mængder fra under ca. 55% til ca. 95% af den totale mængde af medikamentet i liposom-systemerne. Den omhandlede analyse- DK 174869 B1 9 metode kræver ikke anvendelse af materialer eller udstyr, som ikke er almindeligt forekommende på laboratoriet eller i den kliniske praksis.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en liposom-sammensætning, 5 som omfatter et antineoplastisk middel og et lipid, fortrinsvis et phospholipid såsom EPC eller cholesterol, og hvori liposomerne har en transmembran-ion-gradient, fortrinsvis en pH-gradient. Liposomerne har et forhold imellem medikament (antineoplastisk middel) og lipid, som er mellem ca. 0,1:1 og ca.

3:1, fortrinsvis mellem ca. 0,3:1 og 3:1. Liposomerne indeholder en frigivel-10 sesinhiberende pufferkombination, såsom citronsyre/natriumcarbonat, citron-syre/natrium-bis-phosphat eller natriumcarbonat/kaliumsulfat-HEPES. Det antineoplastiske middel kan f.eks. være valgt blandt anthracycliner såsom doxorubicin, daunorubicin, eller epirubicin, vinca-alkaloider såsom vinblastin eller vincristin, purin eller pyrimidin-derivater såsom 5-fluoruracil, alkyle-15 ringsmidler såsom mitoxanthron, mechlorethamin-hydrodhlorid eller cyclophosphamid, antineoplastiske antibiotika såsom mitomycin eller bleomycin. Liposomerne kan indeholde phospholipider, såsom ægge-phosphatidylcholin ("EPC"), hydrogeneret soja-phosphatidylcholin, distea-roylphosphatidylcholin, dimyristoylphosphatidylcholin, distearoylphosphati-20 dylcholin eller diarachidonoylphosphatidylcholin, og de kan desuden indeholder cholesterol ,f.eks. i et molforhold på omkring 55:45 phospholi-pid/cholesterol. Desuden kan liposomerne indeholde α-tocopherol. Liposomerne kan have en størrelse på mellem ca. 30 nm og ca. 2 pm, og fortrinsvis er deres diameter fra ca. 100 til ca. 300 nm, når der er tale som store unila-25 mellare vesikler. De kan indeholde omkring 50-200 mg/ml lipid, især omkring 90-110 mg/ml lipid. Indeslutningen af det antineoplastiske middel i liposomerne er af en størrelsesorden fra ca. 50 til ca. 100%, fortrinsvis fra ca. 90 til ca. 100%, især fra ca. 98 til ca. 100%. Disse liposomer kan være store uni-lamellare vesikler, og de kan være homogene eller unimodale med hensyn til 30 størrelsesfordelingen. Liposomerne kan administreres intravenøst til en patient. Farmaceutiske præparater, som indeholder antineoplastiske midler indesluttede i liposomerne sammen med farmaceutisk acceptable bærerstoffer eller fortyndingsmidler, er en anden udførelsesform for den foreliggende op- 10 DK 174869 B1 findelse. De omhandlede liposom-sammensætninger kan anvendes til at behandle eller stabilisere en neoplastisk sygdom eller de kan anvendes profylaktisk til at forhindre, at en neoplastisk sygdom bryder ud eller vender tilbage. En sammensætning ifølge opfindelsen foreligger eksempelvis som et tre-5 komponentsystem. Når det antineoplastiske middel er doxorubicin, består trekomponentsystemet af tomme liposomer i en sur opløsning med en pH-værdi på omkring 4,0, en basisk opløsning og selve det antineoplastiske middel. Den sure opløsning er en eddikesyrepuffer, en oxalsyrepuffer, en ravsyrepuffer eller fortrinsvis en vandig citronsyrepuffer. Den basiske opløs-10 ning er fortrinsvis natriumcarbonat. Vægtforholdet imellem medikament og lipid er mellem ca. 0,1:1 og ca. 3:1.

De omhandlede liposom-sammensætninger kan fremstilles ved, at man først danner liposomerne i et første vandigt medium, fortrinsvis en puffer, hvorefter 15 man gør mediet surt eller basisk, idet der herved etableres en pH-gradient.

De resulterende liposomer, som er gjort sure eller basiske, blandes derefter med det antineoplastiske middel, såsom doxorubicin.

Liposomerne ifølge opfindelsen kan dehydratiseres, enten forud for eller efter 20 etableringen af transmembran-pH-gradienten. Liposomerne kan være store unilamellare vesikler, og de kan være sammensat af langkædede mættede lipider. Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til bestemmelse af det frie antineoplastiske middel i et liposom-præparat ifølge opfindelsen (en analysemetode). Denne metode involverer, eksempel-25 vis for doxorubicin, at man måler et absorbans-differential, fortrinsvis ved omkring 600 nm, før og efter at liposomerne i præparatet er blevet alkalinise-ret og solubiliseret. Nærmere bestemt måles absorbansen af de doxorubicin-holdige liposomer ved omkring 600 nm. Liposom-præparatet gøres derefter basisk, og absorbansen måles på ny ved 600 nm. Derefter solubiliseres lipo-30 somerne, og absorbansen måles på ny ved 600 nm. De alkaliniserede liposomer sammenlignes derefter med et farvekort, ud fra hvilket det procentvis indhold af det indkapslede middel kan bestemmes. I det følgende forklares opfindelsen nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser indvirk- DK 174869 B1 11 ningen af inkubationstemperaturen på optageisen af fjernt ladet doxorubicin i EPC/cholesterol (molforhold 55:45) liposomer. Liposomerne blev fremstillet i 300 mM citronsyre (pH 4,0) og ekstruderet igennem et polycarbonatfilter med en porestørrelse på 200 nm. Inden tilsætningen af doxorubicin blev den eks-5 terne liposomopløsning indstillet til pH 7,8 med natriumhydroxid. Der sattes doxorubicin (3,0 mg/ml) til liposomerne (11,0 mg lipid/ml), hvorefter der blev ekvilibreret ved 21 °C (lukkede firkanter), 37 °C (åbne cirkler) og 60 °C (lukkede cirkler).

10 Fig. 2 er en grafisk afbildning, som illustrerer frigivelseskarakteristika for lipo- somalt doxorubicin (EPC/cholesterol 55:45 molmol, vægtforhold mellem medikament og lipid på 29 + 2/100) indeholdende 300 mM citrat, dialyseret imod en puffer med pH 4,0 ved 37 °C (åbne cirkler) og pH 7,5 ved 37 °C (lukkede cirkler).

15

Fig. 3 er en grafisk afbildning, som viser den citrat-doxorubicin-vekselvirkning, der er et resultat af blandingsforsøg ved forskellige citrat-pH-værdier. Det antal mM doxorubicin, som forbliver i opløsning efter centrifugering, afsættes som funktion af citrat-pH-værdien: 4 mM doxorubicin blan-20 det ved 60 °C og derefter afkølet til 25 OC (lukkede kvadrater); 4 mM doxorubicin blandet ved 25 °C (åbne kvadrater); 20 mM doxorubicin blandet ved 60 °C og derefter afkølet til 25 °C (lukkede cirkler) og 4 mM doxorubicin blandet med 20 mM HEPES og 150 mM NaCI ved 25 °C til sammenligning (åbne cirkler).

25

Fig. 4 viser absorbansspektre mellem 400 og 700 nm for doxorubicin ved pH

7,5 (a) og pH 10,5 (b).

Fig. 5 viser en sammenligning imellem forholdet fri/total doxorubicin og ab-30 sorbansforholdet ved 600 nm før og efter tilsætning af Triton X-100 til alkali-niseret liposomalt doxorubicin. De lukkede cirkler viser aktivt indesluttet doxorubicin, og de åbne cirkler viser passivt indesluttet doxorubicin.

12 DK 174869 B1

Fig. 6 er en grafisk afbildning, som viser frigivelsen af vineristin fra HSPC/cholesterol (åbne cirkler), DSPC/cholesterol (lukke kvadrater) og EPC/cholesterol (lukkede cirkler) liposom-systemer under dialysebetingelser 5 ved 37 °C.

Fig. 7 er en grafisk afbildning, som viser indvirkningen af temperaturen på optagelsen af 5-fluoruracil ("FU"). Temperaturstigningen δΤ er fra 21 °C til 60 °C.

10

Endelig viser fig. 8 en grafisk afbildning af indvirkningen af en ekstern puffer på FU-frigivelsen ved 37 °C.

Den foreliggende opfindelse demonstrerer en effektiv indeslutning af anti-15 neoplastiske midler i liposomer, som udviser en transmembran-pH-gradient, der kan resultere i et forhold mellem medikament og lipid, som er signifikant højere end i hidtil anvendte liposomale systemer. Liposomerne i de beskrevne formuleringer demonstrerer desuden en reduceret hastighed af medikamentfrigivelsen. Opfindelsen involverer liposomale formuleringer til an-20 vendelse som medikament-bærende systemer, som indeslutter medikamenter såsom de antineoplastiske midler doxorubicin, vineristan og 5-fluoruracil.

Disse systemer kan anvendes til at nedbringe de toxiske virkninger af de anvendte antineoplastiske midler.

25 Som omtalt ovenfor kan liposomerne ifølge opfindelsen fremstilles ved en hvilken som helst kendt metode, men de dannes fortrinsvis i overensstemmelse med procedurerne beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US86/01102. Denne teknik muliggør en ladning af liposomer med ioni-serbare antineoplastiske midler, hvorved man opnår indre koncentrationer, 30 som er betydeligt højere end medikamentets opløselighed i vandig opløsning ved neutral pH og/eller koncentrationer, som er højere end de koncentrationer, der kan opnås ved passiv indeslutning. Ved den foretrukne teknik tilvejebringes en transmembran-ion-gradient (pH-gradient) igennem liposo- DK 174869 B1 13 mernes membraner, hvorefter det antineoplastiske middel anbringes i lipo-somerne ved hjælp af pH-gradienten. Transmembran-pH-gradienten tilvejebringes ved at skabe en koncentrationsgradient for en eller flere ladede specier (eksempelvis Na+, Cl', K*, Li+, OH' og især H+) tværs igennem liposom-5 membranerne. Disse ion-gradienter styrer optagelsen af ioniserbare bioaktive forbindelser (medikamenter) igennem membranerne. I forbindelse med den foreliggende opfindelse anvender man fortrinsvis transmembran-H+-gradienter (pH-gradienter).

10 Typisk hydratiserer man en tørret film af lipidet, som skal anvendes, ved hjælp af en vandig opløsning. Denne hydratisering gør brug af et første vandigt medium, såsom destilleret vand (eksempelvis USP vand til injektionsbrug) eller en vandig puffer. Når der skal påfyldes kationiske medikamenter, kan en sådan vandig puffer eksempelvis være en relativt sur puffer.

15 En sådan puffer er eksempelvis baseret på citronsyre, ravsyre, eddikesyre eller oxalsyre. Sådanne puffere anvendes bedst ved pH-værdier på omkring 3,5-4,5. Når der er tale om at fylde liposomerne med medikamenter som doxorubicin, daunorubicin, epirubicin eller vineristin, har det vist sig mest ønskeligt at anvende 300 nrcM citronsyre ved omkring pH 4,0 som det første hydra-20 tiseringsmedium, hvilket gør liposomernes indersider sure. Citronsyre er blevet identificeret som den pufferopløsning, som bedst er i stand til at fremkalde en optagelse af disse medikamenter i liposomerne. Andre pufferholdige saltopløsninger kan inkluderes i denne blanding, når den justeres til omkring pH 4,0. Sådanne pufferholdige saltopløsninger omfatter phosphatpufferhol-25 digt saltvand ("PBS"), tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid ("trispuffere"), N-2-hydroxyethyl piperazin-N’-2-ethansulfonsyre ("HEPES"), gly-cin-puffere og glutaminsyre, justeret til relativt sure pH-værdier.

På lignende måde kan anioniske antineoplastiske midler fyldes på liposomer, 30 som har et relativt basisk indre. En sådan påfyldning sker i respons til den basiske pH-gradient, som påføres ved at udskifte de oprindelige medium med et mere surt medium. Når man eksempelvis påfylder 5-fluoruracil, er det første medium fortrinsvis relativt basisk, eksempelvis en vandig opløsning 14 DK 174869 B1 såsom en puffer med en pH-værdi på omkring 6,0-11,0, især en pH-værdi på omkring 9,6. F.eks. kan man anvende 300 mM natriumcarbonat ved en pH-værdi på omkring 9,6. Man kan også anvende andre basiske vandige opløsninger. såsom opløsninger af natriumhydroxid eller natrium-bis-phosphat.

5

Liposomerne, som indkapsler det første vandige medium, har således en første koncentration af en eller flere specier. Disse liposomer dannes ved en teknik, som favoriserer dannelsen af MLVer, og de har fortrinsvis en diameter på omkring 400 nm eller derover. Liposomerne kan derefter ekstruderes 10 igennem et filter i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne LUVET-procedure (Cullis et al.). Ved denne teknik ledes liposomerne under tryk igennem et eller flere (stablede) retlinede eller bugtede filtre af polycarbonat. Liposomerne kan ledes igennem filtersystemet et antal gange, hvorved de ekstruderes. Herved opstår en population af liposomer med en homogen 15 størrelsesfordeling som beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US86/00238.

Når først liposomerne er blevet indstillet på en passende størrelsesfordeling, kan man udskifte det ydre medium ved at ændre dette til et nyt eksternt me-20 dium, som har en anden koncentration af en eller flere ladede specier (eksempelvis H+-ioner), idet mediet f.eks. kan ændres til et relativt basisk eller et relativt surt medium. Udskiftningen af det eksterne medium kan foretages ved at ændre den eksterne pH-værdi, hvilket eksempelvis i tilfældet med doxorubicin, daunorubicin eller epirubicin gøres ved at tilsætte en basisk opløs-25 ning, såsom natriumcarbonat, med en pH-værdi på omkring 11,0 eller med en pH-værdi, som er tilstrækkelig til at resultere i en endelig pH-værdi på omkring 7,5-8,3, især pH 7,8. Når der er tale om vineristin, anvender man fortrinsvis natrium-bis-phosphat med en pH-værdi på omkring 6,8-7,2, fortrinsvis pH 7,0, eller med en pH-værdi, som er tilstrækkelig til at resultere i en 30 endelig pH-værdi på omkring 7,1. Andre basiske opløsninger, som kan anvendes, omfatter natriumbicarbonat, natrium-bis-phosphat, natriumhydroxid og kaliumphosphat. En sådan procedure skaber koncentrationsgradienten.

Når der er tale om 5-fluoruracil, ændres det eksterne medium til et relativt DK 174869 B1 15 surt medium, f.eks. ved hjælp af en puffer, såsom kaliumsulfat, 150 mM HE-PES eller H2SO4 med en pH-værdi på omkring 6,5-8,5, tilsat i en tilstrækkelig mængde til at gøre præparationen relativt sur, fortrinsvis omkring pH 7,0.

Andre relativt sure opløsninger, som kan anvendes i forbindelse med FU, 5 omfatter HCI og H3PO4 til en ønsket pH-værdi på omkring 7,0. Andre metoder, som kan anvendes til at ændre det ydre medium, er gel-filtrering (eksempelvis ved anvendelse af en Sephadex-kolonne, som forinden er blevet ekvilibreret med det nye medium), centrifugering, dialyse eller dermed beslægtede teknikker. Denne transmembran-pH-gradient vil bevirke, at me-10 dikamentet fyldes i liposomerner, således at forholdet imelem de frie vesikler og det tilknyttede medikament afspejler eller er større end det forhold, som kan forudsiges ved forholdet [H+] ind/[H+] ud. Der forbliver en ion-gradient hen over liposom-membranerne, også efter at ladningen er tilendebragt.

15 Ud over påfyldning af et enkelt antineoplastisk middel kan den omhandlede pH-gradient-påfyldningsmetode også anvendes til påfyldning af flere anti-neoplastiske midler, enten samtidigt eller sekvensvis, i liposomerne. Endvidere kan de liposomer, som fyldes med de ioniserbare antineoplastiske midler, i sig selv forinden fyldes med andre neoplastiske midler eller andre medika-20 menter ved anvendelse af konventionelle passive indkapslingsteknikker (eksempelvis ved at inkorporere medikamentet i den puffer, ud fra hvilken liposomerne fremstilles). Eftersom de på konventionel måde påfyldte materiale ikke behøver at være ioniserbare, indebærer denne metode en høj grad af fleksibilitet med hensyn til fremstilling af liposom-indkapslede "medikament-25 blandinger" til anvendelse i forbindelse med cancer-terapi. Disse "medikament-blandinger" kan også omfatte to eller flere populationer af liposomer (som indeslutter de samme eller forskellige antineoplastiske midler), eller de kan indeholde forskellige lipid-formuleringer eller omfatte forskellige vesi-kelstørrelser. Sådanne "blandinger" kan indgives med henblik på at opnå en 30 større terapeutisk effektivitet og sikkerhed, en forlænget frigivelse af medikamentet og en mere målrettet frigivelse af medikamentet.

16 DK 174869 B1

Med hensyn til at reducere frigivelseshastigheden af et ioniserbart anti-neoplastisk middel eller et andet ioniserbart biologisk aktivt middel fra lipo-somer har det overraskende vist sig, at transmembran-pH-gradienten også i mærkbar grad kan reducere frigivelseshastigheden tværs over liposom-5 membranerne. Liposomerne er således ekstremt stabile, hvad angår frigivelsen af deres indhold. Den reducerede hastighed, hvormed medikamentet frigives, frembringes af puffervirkningen i det indre af liposomerne, d.v.s. at koncentrationerne af en ladet specie, såsom H*-ioner (d.v.s. en pH-gradient), på indersiden og ydersiden af liposomerne. F.eks. vil en høj indre pufferka-10 pacitet, som kræver en større indstrømning af kationer (såsom det anti-neoplastiske middel) for at sænke pH-gradienten, føre til længere retentionstider. Når først den indre pufferkapacitet er udtømt, vil frigivelseshastigheden af det antineoplastiske middel (eksempelvis doxorubicin) endvidere blive forøget. En fyldning af liposomerne med medikamentet kræver, at man 15 justerer ion-koncentrationen af liposomernes eksterne medium på en sådan måde, at der dannes et kemisk potential hen over liposom-membranen. Hvis den pågældende ion er en hydrogen-kation, kan man foretage en sådan justering ved at ændre pH, hvilket man gør ved at tilsætte en opløsning med en relativt sur eller relativt basisk pH-værdi. Som tidligere anført påvirkes frigi-20 velseshastigheden for det bioaktive middel af den valgte puffer. Bestemte puffer-kombinationer (imellem det interne og det eksterne vandige medium) har vist sig at forøge optagelsen og reducere frigivelsen af liposomernes indhold. F.eks. har det for medikamenterne doxorubicin, epirubicin og daunoru-bicin vist sig, at de mest egnede puffer-kombinationer med hensyn til retenti-25 on af liposom-indholdet er kombinationer af citronsyre og natriumcarbonat.

Når der er tale om vineristin, er den mest egnede puffer-kombination en kombination af citronsyre og natrium-bis-phosphat. Med hensyn til 5-FU foretrækkes en kombination af natriumcarbonat og natriumhydroxid eller en kombination af på den ene side natriumcarbonat og på den anden side 30 kaliumsulfat og HEPES.

Doxorubicin-retentionen i EPC-cholesterol (55:45) vesikler, som udviser en pH-gradient, kan forøges ved anvendelse af citrat/carbonat-puffersystemer, DK 174869 B1 17 således at der over 24 timer ved 37 °C observeres en medikament-frigivelse på under ca. 5%. Dette vesikel-indesluttede doxorubicin viser sig også at være stabilt over for serum-komponenter, idet mindre end 5% doxorubicin frigives i løbet af 24 timer, når der er tale om vesikler, som er inkuberet ved 37 5 °C i 95% frisk humant serum. I associationsforsøg, hvor doxorubicin blev inkuberet med HEPES-puffer ved pH 7,5 og med citrat-puffere (natriumcitrat) ved pH-værdier på ca. 4,0-7,5, viste det sig, at citratet vekselvirker med doxorubicin under dannelse af et bundfald, mens dette ikke er tilfældet med HEPES-puffer. En sådan puffer-kombination, d v s. citrat/carbonat, reducerer 10 frigivelseshastigheden af medikamentet fra liposomerne. Man kan anvende andre puffer-kombinationer, der reducerer frigivelseshastigheden, såsom oxalsyre/kaliumphosphat eller ravsyre/natriumbicarbonat, men man foretrækker citronsyre-natriumcarbonat eller citronsyre/natrium-bis-phosphat.

15 Liposomerne bliver derefter inkuberet for at lette indkapslingen (over 37 °C, fortrinsvis omkring 60 °C for doxorubicin og Fu), idet inkubationens længde kan afhænge af temperaturen. Daunorubicin, epirubicin og metoxanthron kan inkuberes ved 25 °C. Det ioniserbare antineoplastiske middel kan ligeledes opvarmes til den samme temperatur, hvorefter de to komponenter kan blan-20 des. Liposom-medikament-suspensionen inkuberes yderligere, hvorefter den resulterende opløsning har en endelig pH-værdi på omkring 6,9-8,3, fortrinsvis omkring 7,7-7,8. En sådan inkubation ved forhøjede temperaturer foretrækkes af hensyn til en effektiv påfyldning af doxorubicin i cholesterol-holdige liposomer. Opløsningen bliver derefter fortyndet efter behov med ek-25 sempelvis fysiologisk saltvand, hvorefter den administreres.

Der findes andre egnede metoder til blanding af medikamentet med puffere og liposomer. F.eks. kan man først anvende saltvand til at suspendere medikamentet, hvorefter man kan sætte den dannede suspension til liposomerne, 30 som har en transmembran-pH-gradient. Endvidere kan medikamentet sættes til liposomerne samtidigt med, at man justerer pH-værdien, hvorved man skaber den nævntes gradient. I afhængighed af det antineoplastiske middel 18 DK 174869 B1 og andre tilstedeværende farmaceutiske komponenter kan det være nødvendigt at anvende andre blandingsmetoder.

Den omhandlede transmembran-pH-metode kan anvendes sammen med 5 praktisk talt et hvilket som helst antineoplastisk middel, som kan eksistere i ioniserbar tilstand når det opløses i et passende vandigt medium (eksempelvis organiske forbindelser, som indeholder en aminogruppe, der kan protoni-seres). Disse midler kan indeholde primære, sekundære, tertiære eller kva-ternære aminogrupper som en lipophilgruppe, og de bør ikke sprede pH-gra-10 dienten. Midlet børe være relativt lipophilt, således at det kan indgå i liposom-membranerne. Som eksempler på antineoplastiske midler, som kan indkaps-les i liposomer ved denne metode, og som derfor kan anvendes ifølge opfindelsen kan nævnes anthracycliner såsom doxorubicin, daunorubicin, mito-xanthron og epirubicin, antineoplastiske antibiotika såsom mitomycin og 15 bleomycin, vinca-alkaloider såsom vinblastin og vineristin, mechlorethamin-hydrochlorid samt purin og pyrimidin-derivater såsom 5-fluoruracil (se Goodman og gilman (red.), "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 6. udgave, MacMillan & Co., 1980, side 1249-1314.

20 Med henblik på at bestemme, hvorvidt et ioniserbart antineoplastisk middel vil kunne indkapsles i liposomer som respons til en transmembran-pH-gradient, fremstilles EPC-holdige liposomer (omkring 1,0 mM EPC) med en 3H-DPPC tracer og med et relativt surt eller relativt basisk indre medium, såsom 300 mM citronsyre med en pH-værdi på omkring 4.0. Disse liposomer 25 ekstruderes omkring 10 gange igennem to filtre med porestørrelse 100 nm ved LUVET-proceduren hvorefter den eksterne pH-værdi justeres til en relativt basisk eller relativt sur pH-værdi, eksempelvis omkring pH 11,0 ved hjælp af natriumcarbonat. Efter dannelse af pH-gradienten blandes midlet, som skal indkapsles i liposomerne, og som er mærket med en radioaktiv isotop af 30 midlet, med liposomerne til en koncentration på omkring 200 μΜ (for hver 1,0 mM lipid, der er anvendt). Liposomerne separeres fra det fri, ikke-indesluttede middel på G50-M Sephadex minikolonner ved 500 x g i 3 minutter og anbringes i 13 x 100 mm rør, hvorefter der foretages en radioaktiv op- DK 174869 B1 19 tælling i en scintillationstæller. Optagelsen af medikamentet i nmol pr. pmol lipid afbildes derefter som funktion af inkubationstiden. Under disse betingelser optages hele den forhånden værende mængde doxorubicin (100%) i li-posomerne.

5 Når der er tale om doxorubicin, kan man anvende kommercielt tilgængelige former, såsom pulverformige, faste og methyl-p-hydroxybenzosyre-holdige former (Adriamycin R.D.F., Adria Laboratories, INC. Columbus, Ohio) ved udøvelse af opfindelsen. Når man anvender den form, der indeholder methyl-10 p-hydroxybenzosyre, kan man tilsætte en vandig opløsning, såsom saltvand, hvorved der opnås en suspension. Denne suspension blandes med liposo-merne, som har den omhandlede transmembran-pH-gradient tværs over deres dobbeltmemebraner. En sådan blanding ved 60 °C i omkring 10 minutter resulterer i en indkapsling i doxorubicin på over ca. 98%.

15

Lipider, som kan anvendes i de omhandlede liposom-formuleringer, omfatter phospholipider, såsom phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidinsyre (PA), phosphatidylinositol (PI), sphingomyelin (SPM) og lignende, enten ale-20 ne eller i kombination. Phospholipiderne kan være syntetiske, eller de kan være afledt fra naturlige kilder, såsom æg eller soja. Man kan også anvende phospholipiderne dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) og dimy-ristoylphosphatidylglycerol (DMPG). I en foretrukken udførelsesform anvender man ægge-phosphatidylcholin (EPC) og cholesterol i et molært forhold 25 der fortrinsvis er 55:45. Ifølge andre udførelsesformer kan man anvende distearoylphosphatidylcholin (DSPC), dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) eller hydrogeneret soja-phosphatidylcholin (HSPC) i et molært forhold på 55:45 sammen med cholesterol. På lignende måde kan man anvende dimy-ristolyphosphatidylcholin (DMPC) og diarachidonoylphosphatidylcholin 30 (DAPC). Som følge af de forhøjede overgangstemperaturer (Tc) for lipider såsom DSPC (Tc ca. 65 °C), DPPC (Tc ca. 45 °C) og DAPC (Tc ca. 85 °C) vil man fortrinsvis opvarme sådanne lipider til en temperatur på omkring deres 20 DK 174869 B1

Tc-temperaturer eller lidt derover (eksempelvis omkring 5 °C derover) for at fremstille disse liposomer.

Liposomerne kan også indeholde andre steroid-komponenter, såsom po-5 lyethylenglycol-derivater af cholesterol (PEG-cholesteroler), copostanol, cho-lestanol eller cholestan, eller de kan indholde α-tocopherol. De kan også indeholde organiske syre-derivater af steroler såsom cholesterol-hemisuccinat (CHS) og lignende. Organiske syre-derivater af tocopheroler kan også anvendes som liposom-dannende ingredienser, såsom a-tocopherol-hemi-10 succinat (THS). Såvel CHS- som THS-holdige liposomer og deres tris-saltformer kan generelt fremstilles ved en hvilken som helst kendt metode til fremstilling af liposomer, som indeholder disse steroler. Der kan især henvises til fremstillingsprocedurerne beskrevet i US patentskrift nr. 4.721.612 og i den internationale patentansøgning nr. PCT/US87/02219. Liposomerne 15 kan desuden indeholde glycolipider.

Ifølge den foreliggende opfindelse er den anvendte lipid-koncentration fortrinvis omkring 50-200 mg/ml, især omkring 90-110 mg/ml, men der kan være tale om en hvilken som helst lipid-koncentration, som strækker sig fra hvad 20 der er kendt som den kritiske koncentration af miceller og op til omkring 40 vægt-% i vandig opløsning. De vægtforhold imellem medikament og lipid, som anvendes ifølge opfindelsen, kan være så høje som omkring 3:1, for de medikamenter, som indkapsles gennem en transmembran-pH-gradient, især for doxorubicin, er forholdet imellem medikament og lipid fortrinsvis mellem 25 ca. 0,1:1 og ca. 3:1, især omkring 0,3:1. Dette forhold kan variere i overensstemmelse med lipid-formuleringen og vesikel-størrelsen, således om det vil blive beskrevet i det følgende. For vineristin er vægtforholdet imellem forbindelsen og det anvendte lipid mellem ca. 0,01:1 og ca. 1:1, fortrinsvis mellem ca. 0,1:1 og ca. 0,29:1.

30

En variation af vægtforholdet imellem medikamentet og lipidet for vesikler, der indeholder 300 mM citrat (pH 4,0), mellem ca. 1:10 og ca. 1:3 har ikke nogen indvirkning på effektiviteten med hensyn til indkapsling af doxorubicin.

DK 174869 B1 21 Værdier på omkring 100% indkapsling kan opnås i dette område, og der frigives under ca. 5% medikament i løbet af 24 timer ved disse vægtforhold imellem vægtforhold og lipid. Indkapslingseffektiviteten aftager imidlertid signifikant, hvis man forøger begyndelsesforholdet imellem medikament og lipid op 5 over ca. 1:2, og de herved opnåede vesikler udviser også en forøget frigivelseskinetik med hensyn til doxorubicin. Indkapslingseffektiviteten påvirkes ikke væsentligt af vesikelstørrelsen, af vægtforholdet mellem medikament og lipid inden for det foretrukne område eller af lipid-sammen-sætningen, eftersom man kan opnå indkapslingseffektiviteter på omkring 10 100% for vesikler, hvis størrelse ligger mellem ca. 100 nm og ca. 1.4 nm, for vægtforhold imellem medikament og lipid på mellem ca. 0,1:1 og ca. 0,3:1 og for lipid-sammensætninger, som indeholder neutrale, negativt ladede eller mættede phospholipider såvel som varierende mængder cholesterol.

15 Frigivelsesegenskaberne for doxorubicin in vitro viser en afhængighed af li-pid-sammensætningen. De præparater, der indeholder cholesterol, var mere resistente med hensyn til frigivelsen af medikamentet, og de præparater, som indeholder cholesterol og ægge-phosphatidylglycerol, udviste en frigivelse af medikamentet, som lå imellem resultaterne for de præparater, der kun inde-20 holdt EPC, og de præparater, der indeholdt EPC/cholesterol.

Doxorubicin administreret i liposomerne ifølge opfindelsen har vist sig at være af mindre toxicitet end doxorubicin indgivet i fri form. Den toxikologiske evaluering af liposomalt doxorubicin i mus viste en stigning på 2,3 gange i de 25 akutte LDso-værdier under et signifikant mindre vægttab. De tilsyneladende LD50-værdier hos mus var afhængige af lipid-sammensætningen. LDsq-værdien for liposomalt doxorubicin stiger, når liposomernes cholesterol-indhold forøges fra 0 til omkring 45 mol-%, eller når lipid-formuleringen inkluderer DSPC.

30

Den akutte toxicitet af liposomalt doxorubicin var relativt ufølsomt over for vesikelstørrelsen i diameterområdet fra omkring 0,15 til omkring 1,4 pm, og den udviste et svagt fald ved værdier under ca. 150 nm.

22 DK 174869 B1 Sådanne variabler som liposomernes overfladeladning og størrelse påvirker ikke den akutte toxicitet af liposomalt doxorubicin i væsentlig grad, hvilket er tilfældet med lipid-sammensætningen. Desuden bevirker anvendelsen 5 DSPC/cholesterol en dramatisk forøgelse af LDso-værdien (til over 200 mg/kg), som er henholdsvis 4 og 10 gange så stor som den LDso-værdi, der observeres for EPC/cholesterol som henholdsvis indkapslet og frit medikament. Sådanne formuleringer har også meget lave akkumuleringsniveauer i hjerte-, lunge- og nyrevæv. Hvis vægtforholdet imellem medikament og lipid 10 forøges, har dette en dramatisk indvirkning på den fordelagtige påvirkning af doxorubicin-toxiciteten. Tidligere undersøgelser har ikke påvist denne effekt, hvilket skyldes begrænsningerne i doxorubicin-indkapslingen som følge af de tidligere anvendte indkapslingsteknikker. Selvom en sådan indkapsling af medikamentet fører til, at det optages af leveren, har man ikke observeret 15 nogen tilfælde af akutte leverskader.

Effektiviteten af liposomale formuleringer af antineoplastiske medikamenter ifølge opfindelsen, som har varierende lipid-sammensætning, varierende li-posom-størrelse og varierende forhold imellem medikament og lipid, blev 20 testet på DBA/2-hunmus ved anvendelse af L1210-lymphoid-leukæmi-modellen. Antitumor-effekterne af henholdsvis det frie medikament og lipo-somal-formuleringerne blev analyseret ved anvendelse af denne model. Dyrene modtog den maksimale dosis af liposomal-formuleringerne, som kunne tolereres (MTD), og man målte deres forøgede overlevelsestid (ILS) i forhold 25 til ikke-behandlede kontroldyr og sammenlignede de målte værdier med ILS-værdier svarende til frit doxorubicin.

I tilfældet med vineristin viser det sig, at man ved at knytte medikamentet til liposomer gør medikamentet mindre toxisk end den tilsvarende frie forbindel-30 se, og desuden bliver forbindelsen effektiv over for ascites L1210 tumorlinien, hvor den tilsvarende frie forbindelse ikke udviser nogen effektivitet.

DK 174869 B1 23

Man kan anvende flere forskellige metoder til at fremstille liposomerne ifølge opfindelsen. F.eks. kan man anvende multilamellare vesikler (ML-Ver), stabile plurilamellare vesikler (SPLV'er) eller modfase-inddampningsvesikler (REVer). Fortrinsvis bliver sådanne MLV’er ekstruderet igennem filtre, som 5 danner LUV’er med størrelser, der afhænger af filterporestørrelsen. Man anvender polycarbonatfiltre med porestørrelser på 30, 50, 60, 100, 200 eller 800 nm. Ved denne metode, som også er beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/W086/00238, kan man lede liposom-suspensionen gentagne gange igennem ekstruderingsanordningen, hvilket resulterer i en popu-10 lation af liposomer med homogen størrelsesfordeling. F.eks. kan man foretage filtreringen igennem et retlinet membranfilter (et Nuxleopore polycarbonat-filter) eller et filter med ikke-retlinet passage (f.eks. et Nucleopore membrafil-filter med en porestørrelse på 0,1 pm fremstillet af blandede celluloseestere), eller man kan anvende en alternativ størrelsesreduktionsteknik, såsom ho-15 mogenisering. Liposomerne ifølge opfindelsen kan have en diameter på mellem ca. 30 nm og ca. 2 pm, og man foretrækker liposomer på en størrelse på mellem ca. 50 og ca. 300 nm, fortrinsvis mellem ca. 60 og ca. 300 nm, især mellem ca. 100 og ca. 300 nm. Dette størrelsesområde omfatter liposomer, som kan være MLV'er, SPLV'er eller LUV’er. I den foreliggende opfindelse 20 foretrækker man liposomer, som er unilamellare liposomer med en størrelse på omkring 100-300 nm. Sådanne liposomer er LUV’er. Størrelsesområdet for SUV'er er omkring 25-50 nm.

Når man anvender lipider, som har en krystallinsk Tc-temperatur fra gel- til 25 væsketilstand på over omgivelsestemperatur, kan man anvende en ekstrude-ringsanordning, som er forsynet med en opvarmet kappe (termokappe). En sådan anordning tjener til at forøge temperaturen af liposom-suspensionen, hvilket tillader en ekstrudering af disse LUV’er. Lipider, som kan anvendes sammen med en termokappe-omgivet ekstruderingsanordning, kan eksem-30 pelvis være DSPC, DPPC, DMPC og DAPC. Disse lipider kan kombineres med cholesterol i eksempelvis et molforhold på 55:45. Liposomer, som indeholder DSPC, vil blive ekstruderet ved omkring 65 °C, DPPC ved omkring 45 °C og DAPC ved omkring 85 °C, eller ca. 5 °C over lipidets Tc-værdi. Det er 24 DK 174869 B1 en yderligere fordel ved den foreliggende opfindelse, at der kan dannes LUVer, som gør bruge af disse lipider med en Tc-temperatur på over omgi-velsestemperaturen. De tidligere anvendte teknikker, hvormed man anvendte sådanne lipider til dannelse af små vesikler, involverede en sonisk behand-5 ling, som førte til SUVer (størrelsesområde omkring 25-50 nm).

De store unilamellare vesikler ifølge opfindelsen, som består af langkædede mættede vesikler, har en størrelse på omkring 60-300 nm. Disse LUVer kan indkapsle et bioaktivt middel, såsom et antineoplastisk middel. Anvendelsen 10 LUVET-systemet med langkædede mættede lipider kan resultere i LUVer med en homogen størrelsesfordeling, som kan være en unimodal distribution af vesikler. I nærværende ansøgning er en homogen population af vesikler en population, som er sammensat af liposomer med i det væsentlige samme størrelse og som kan have en Gauss-fordeling af partikelstørrelse. En sådan 15 population siges også at være af ensartet størrelsesfordeling, og den kan være unimodal med hensyn til størrelsen. Udtrykket "unimodal" refererer til en population, som har en snæver polydispersitet af partikelstørrelser, og partiklerne er af enkelt "mode".

20 En population af liposomer er unimodal, hvis det ved måling ved kvasie-lektriske lysspredningsmetoder viser sig, at populationen har en Gauss-fordeling, og hvis et andengrads polynomium giver en god tilnærmelse til den naturlige logaritme til autokorrelationsfunktionen af en prøve (Koppel, 1972, J. Chem. Phys., 57:4814). Jo bedre denne tilnærmelse er, jo bedre er målet 25 for unimodalitet. Tætheden af denne tilnærmelse kan bestemmes ud fra, hvor tæt værdien af chi kvadratet (chi2) af prøven er på værdien 1,0, en chi2-værdi på 2,0 eller derunder indikerer, at der er tale om en unimodal population.

Man kan anvende andre størrelsesreduktionsteknikker ved den praktiske ud-30 øvelse af opfindelsen. F.eks. kan man med gode resultater anvende homogeniserings- eller formeringsteknikker. Sådanne teknikker kan føre til liposomer, som er homogene eller unimodale med hensyn til størrelsesfordelingen.

DK 174869 B1 25

Under fremstillingen af liposomerne kan man anvende organiske opløsningsmidler til at opløse lipiderne. Egnede organiske opløsningsmidler er sådanne som har en række forskellige polariteter og dielektriske egenskaber, og som solubiliserer lipider. Som eksempler på sådanne opløsningsmidler 5 kan man nævne chloroform, methanol, dimethylsulfoxid (DMSO), methy-lenchlorid og opløsningsmiddelblandinger såsom benzen/methanol (70:30).

Som et resultat heraf dannes opløsninger (blandinger, hvori komponenterne er ensartet fordelt), som indeholder lipiderne. Opløsningsmidlerne vælges på basis af deres biokompatibilitet og under hensyn til lav toxicitet og ringe 10 brændbarhed.

En udførelsesform ifølge opfindelsen er et trekomponentbehandlingssystem i form af et liposomalt antineoplastisk middel, der gør det muligt at indeslutte midlet på det kliniske ønskelige sted. Når det pågældende medikament er 15 doxorubicin, vineristin eller et andet neoplastisk middel, som vil trænge ind i liposomer som respons til en transmembran-pH-gradient, når liposomernes indre reagerer surt, er systemets første komponent (kolbe 1) liposomer i sur opløsning, f.eks. i en citronsyrepuffer (30 mmol, pH 3,8-4,2, fortrinsvis pH

4,0). Den anden komponent (kolbe 2) er en base, fortrinsvis en natrium-20 carbonat- eller natrium-bis-phosphatopløsning i en koncentration på 0,5 M, pH 11,5. Den tredje komponent (kolbe 3) er det udvalgte antineoplastiske middel. Det ovennævnte behandlingssystem kan tilvejebringes i form af et system med tre hætteglas, af hvilke det første indeholder liposomerne i surt medium, mens det andet indeholder basen. Endelig indeholder det tredje 25 hætteglas det udvalgte antineoplastiske middel (f.eks. doxorubicin). Når medikamentet er en forbindelse, som trænger ind i liposomerne som respons til en transmembran-gradient, når liposomernes indersider er relativt basiske (såsom 5-FU), er systemets første komponent liposomer i en relativt basisk puffer (såsom natriumcarbonat, pH 6,8-11,0, fortrinsvis pH 9,6). Den anden 30 komponent er en relativt sur opløsning, f.eks. 150 mM kaliumsulfat/150 mM HEPES-puffer, pH 7,4. Den tredje komponent udgøres af det antineoplastiske middel. Efter dannelse af en pH-gradient tværs over liposomerne (ved blanding af indholdet af det første og det andet hætteglas) kan man 26 DK 174869 B1 opvarme liposomerne inden man blander dem med medikamentet. Når der er tale om doxorubicin, vineristin og FU, har det vist sig at være fordelagtige, at man opvarmer liposomerne til omkring 60 °C. Forbindelserne daunorubicin, epirubicin, mitoxanthron og vineristin lader sig på effektiv måde indkapsle i 5 liposomer ved 25 °C.

Når man anvender det ovenfor beskrevne hætteglas-system til indkapsling af doxorubicin, kan man blande komponenterne umiddelbart inden anvendelsen i overensstemmelse med den følgende metode: natrimcarbonatopløsningen 10 fra hætteglas 2 sættes til liposomerne i hætteglas 1. Den resulterende blanding opvarmes til en forhøjet temperatur (eksempelvis et vandbad ved 60 °C) i omkring 5-10 minutter. Den kombinerede carbonat- og liposomopløsning sættes derefter til hætteglas 3, som indeholder det antineoplastiske middel (doxorubicin) og lactose. Indholdet af hætteglasset blandes ved kraftig om-15 rystning, hvorefter det opvarmes til en forhøjet temperatur (eksempelvis 60 °C) under kraftig omrystning hvert femte minut under opvarmningen. Den resulterende suspension af medikament-holdige liposomer fortyndes derefter med normalt saltvand eller 5% dextrose. Den endelige opløsning har en pH-værdi på 6,9-8,0, og den har fortrinsvis en pH-værdi på 7,5.

20 Når der er tale om fremstilling af liposomer indeholdende vineristin, kan man anvende den ovenfor beskrevne procedure, idet man dog kan ændre på blandingsrækkefølgen. F.eks. kan man blande vineristin med liposomerne ved sur pH (pH 4,0), hvorefter man etablerer pH-gradienten ved tilsætning af 25 en relativt basisk opløsning.

Opfindelsen angår også en analysemetode til analysering af det antineoplastiske middel, hvor man bestemmer mængderne af frit og liposom-indkapslet antineoplastisk medikament i liposomale præparater, hvilket gøres 30 på basis af en pH-afhængig spektralanalyse (eksempelvis infrarød, ultraviolet eller synlig). Ved en pH-værdi på omkring 7,0 udviser doxorubicin eksempelvis en maksimal absorbans ved 489 nm, hvorimod der ved basisk pH (omkring 10,0) observeres absorbans-toppe ved 550 og 592 nm (fig. 4). Koncen- DK 174869 B1 27 trationen af fri doxorubicin i liposomale systemer kan således bestemmes ved at overvåge absorbansen ved 600 nm efter at have gjort det ekstravisiku-lære medium (det liposomale "bad") basisk ved hjælp af en base, såsom natriumhydroxid (absorbans-differential). En sådan procedure inducerer en 5 spektral forskydning af frit doxorubicin og ikke-liposomalt indkapslet doxorubicin, eftersom lipid-dobbeltlaget er i stand til at isolere det indkapslede doxorubicin fra det eksterne basiske medium. Den resulterende O.D.6oo‘Værdi afspejler derfor mængden af ikke-indkapslet doxorubicin i præparationen. De totale doxorubicin-koncentrationer bestemmes derefter kvantitativt ved, at 10 man gentager målingen efter solubilisering af liposomerne (d.v.s. brydning af liposomerne) ved en hvilken som helst velkendt metode f.eks. med Triton X-100 (hvorved man udsætter hele mængden af doxorubicin for de basiske omgivelser). Absorbansforholdet målt ved 600 nm er direkte proportionalt med det procentvise indhold af frit doxorubicin i ves i kel-præparationer som 15 bestemt ved standard-kolonne chromatografi. Mængderne af ikke-indkapslet medikament bestemmes som forholdet imellem den absorbans, som opnås efter alkalinisering med NaOH, divideret med den absorbans, som observeres i nærværelse af Triton X-100 (måling af et absorbans-differential).

20 Den spektroskopiske analyse af liposomale doxorubicin-præparationer blev sammenlignet med kolonnechromatografiske metoder, som direkte måler det frie og det vesikel-associerede medikament, for at opnå korrelation imellem værdierne for absorbans-forholdene og de faktiske forhold imellem fri DOX og total DOX over et bredt område af indkapslingseffektiviteter. Eftersom 25 pH-gradienter inducerer optagelsen af doxorubicin i liposomer, således at [DOX]in<j/(DOX]u<rforhold afspejler [H+]ind/[H+]Ud-forhold, anvendte man EPC/cholesterol-liposomer, som udviser pH-gradienter (sure inderside) af forskellig styrke, til at konstruere liposomsystemer med indkapslingseffektiviteter på 10-99%. Fig. 5 viser, at det ovenfor beskrevne absorbansfor-30 hold ved 600 nm nøjagtigt repræsenterer forholdt imellem fri og total doxorubicin i vesikel-præparationerne over hele det undersøgte område for ind-kapslingseffektiviteterne. Den spektroskopiske analysemetode blev også kompletteret på EPC-liposomer, hvori doxorubicin var blevet passivt indkaps- 28 DK 174869 B1 let under vesikel-dannelsen, for at sikre, at disse resultater ikke var specifikke for liposomalt doxorubicin opnået ved aktiv indkapsling. Fig. 5 (det åbne symbol) viser, at absorbansforholdet ved 600 nm for denne prøve udviser korrelation i forhold til værdien for fri/total doxorubicin opnået ved kolonne 5 chromatografi.

De absorbans-karakteristika, som kendetegner den spektrale forskydning, gør det også muligt at bedømme den relative mængde af fri doxorubicin i liposom-præparationer visuelt. Selvom den sådan analyse kun er kvalitativ, 10 er det muligt at påvise forekomsten af 5% frit medikament, og man observerer en farveændring for systemer, som udviser et indhold af frit medikament på over 15%.

Eftersom liposomalt doxorubicin kan bedømmes visuelt ved denne procedu-15 re, uden at man behøver at anvende specielt videnskabeligt udstyr, kan man kontrollere prøverne umiddelbart inden anvendelse in vivo, således at man kan bestemme, hvorvidt der er farlige niveauer af det frie medikament er til stede.

20 Anvendeligheden af den spektrofotometiske analysemetode i forbindelse med et antineoplastisk medikament kan bestemmes ved, at man overvåger de spektrale forskydninger af absoptionstoppene som en funktion af pH i "bad"-opløsningen. Liposomerne, som indeholder medikamentet kan derefter brydes, hvorpå det frigivne medikament kan måles i det samme område, 25 f.eks. i det synlige, det ultraviolette eller det infrarøde område, forskellen i absorption kan bestemmes kvantitativt, som beskrevet for doxorubicin-prøven ovenfor, hvorefter det procentvise indhold af frit medikament i prøven kan beregnes.

30 Ifølge et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse omfatter systemet med 3 hætteglas endvidere et fjerde hætteglas, som indeholder en indikatoropløsning for indkapslingen, som anvendes ved den spektrofotomettriske analyse ifølge opfindelsen, f.eks. alkaliniserende midler, såsom 0,1N natri- DK 174869 B1 29 umhydroxid (NaOH), som tester indkapslingen af doxorubicin. En prøve (0,5 ml) af den fortyndede liposomale doxorubicin-præparation indeholdt i hætteglas 3 sættes til NaOH-opløsningen, hvorefter den resulterende farve sammenlignes med et farvekort. Alternativt kan man aflæse absorbansen af den 5 resulterende opløsning spektrofotometrisk. I afhængighed af graden af indkapsling vil reaktionen imellem doxorubicin og natriumhydroxid resulterer i en rød til blå farve. Graden af rød eller blå farve afhænger af indkapslingen.

Det skal forstås, at den foreliggende opfindelse ikke er begrænset til det fo-10 reslåede pakningssystem, men at man også kan anvende alternative systemer, såsom flerkammer-paknings- og blandingsanordninger og -teknikker, under opnåelse af tilsvarende resultater.

Liposomerne, som dannes ved proceduren ifølge opfindelsen, kan lyophilise-15 res elfler dehydratiseres på forskellige trin af dannelsesprocessen. F.eks. kan man lyophilisere lipid-filmen efter fjernelse af opløsningsmidlet, men før tilsætning af medikamentet. Alternativt kan man lyophilisere lipid-medikament-filmen, inden man hydratiserer liposomerne. En sådan dehydratisering kan gennemføres ved, at man eksponerer lipidet eller liposomerne for at reduce-20 ret tryk, hvorved man fjerner hele mængden af opløsningsmiddel anvendt ved suspenderingen. Liposomerne kan dehydratiseres i nærværelse af hy-drophilt middel i overensstemmelse med procedurerne beskrevet i de internationale patentansøgninger nr. PCT/US86/01102 og nr. PCT/US86/01103 samt i US patentskrift nr. 4.229.360. Alternativt (eller i tilslutning hertil) kan 25 man ogsådehydratisere den hydratiserede liposom-præparation ved at anbringe den i et omgivende medium i flydende nitrogen og nedfryse den, inden man foretager dehydratiseringstrinnet. En sådan dehydratisering efter forudgående frysning kan gennemføres i nærværelse af et eller flere beskyttelsesmidler, såsom sukkerarter, i præparationen i overensstemmelse med tek-30 nikken beskrevet i patentansøgning nr. PCT/US86/01103. Ved hjælp af sådanne teknikker forøger man præparationernes langtidsholdbarhed og stabilitet. F.eks. kan det liposomle antineoplastiske middel blandes med en sukkeropløsning i et vægtforhold mellem sukker og lipid på omkring 0,5:1-50:1, 30 DK 174869 B1 fortrinsvis omkring 20:1. Efter rehydratisering opretholder sådanne liposomer i det væsentlige hele den påfyldte mængde af antineoplastisk middel, når der er tale om liposomer, som har været ledt igennem filtre med porestørrelser på 100 og 200 nm. Ifølge en foretrukken udførelsesform er sukkerartet man-5 nitol eller en blanding af mannutol, glucose og lactose i et vægtforhold på 2:1:1. Efter rehydratisering i destilleret vand bliver præparationen fortrinsvis opvarmet i 10 minutter til en temperatur på eksempelvis 60 °C. Man kan anvende andre egnede metoder til dehydratisering af de ovenfor omtalte lipo-som-præparationer. Endvidere kan man dehydratisere liposomerne uden 10 forudgående frysning.

Når først liposomerne er blevet dehydratiseret, kan de opbevares over længere tidsperioder, indtil de skal anvendes. Den korrekte opbevaringstemperatur vil afhænge af liposomernes lipid-formulering og de indkapslede ma-15 terialers temperaturfølsomhed. F.eks. er forskellige antineoplastiske midler varmelabile, og dehydratiserede liposomer, som indeholder sådanne forbindelser, bør derfor opbevares under køleskabsbetingelse, eksempelvis ved omkring 4 °C, således at midlets styrke ikke går tabt. For sådanne midler gælder det endvidere, at dehydratiseringsprocessen fortrinsvis gennemføres 20 ved lave temperaturer i stedet for ved stuetemperatur.

Når de dehydratiserede liposomer skal anvendes, foretager man en rehydratisering ved simpelthen at sætte en vandig opløsning, eksempelvis destilleret vand eller en passende puffer, til liposomerne, hvorefter man lader dem re-25 hydratisere. Man kan resuspendere liposomerne i den vandige opløsning ved forsigtigt at omryste denne. Rehydratiseringen kan foretages ved stuetemperatur eller ved en anden temperatur, som er velegnet under hensyntagen til liposomerne og disses indhold. Hvis det antineoplastiske middel, som skal indgives, er inkorporeret i liposomerne med et højt vægtforhold imellem me-30 dikament og lipid forud for dehydratiseringen, og hvis der ikke ønskes nogen yderligere ændringer i sammensætningen, kan man anvende de rehydratise-rede liposomer direkte i cancer-terapien ved at følge kendte procedurer til administration af liposom-indkapslede medikamenter. Alternativt kan man, DK 174869 B1 31 hvis man anvender de ovenfor beskrevne transmembran-pH-gradient-procedurer, inkorporerer ioniserbare antineoplastiske midler i de rehydratise-rede liposomer lige inden indgivelsen. I forbindelse med denne metode kan den koncentrationsgradient, som anvendes til at frembringe transmembran-5 pH-gradienten, tilvejebringes enten før dehydratiseringen eller efter rehydra-tiseringen, idet man anvender de ovenfor beskrevne teknikker til udskiftning af det eksterne medium. F.eks. kan liposomer med høje forhold imellem medikament og lipid dehydratiseres, inden man etablerer transmembran-pH-gradienten, idet de eksempelvis kan dehydratiseres fra deres første eksterne 10 medium. Efter rehydratisering kan man etablere pH-gradienten ved at blande liposomerne med det andet eksterne medium, som har en relativt sur eller en relativt basisk pH-værdi. Det antineoplatiske middel kan blandes med liposomerne enten samtidig med eller efter etablering af pH-gradienten.

15 I de tilfælde, hvor liposomerne dehydratiseres efter at der er tilvejebragt en transmembran-pH-grandient, kan man rehydratisere liposomerne ved at blande dem med en vandig opløsning med neutral pH-værdi.

Hvis man f.eks. anvender det ovenfor beskrevne tilfælde, hvor der benyttes 20 liposomer, der som det første eksterne medium indeholder en citronsyrepuffer, vil rehydratiseringstrinnet forløbe ved, at man tilsætter natriumcarbonat og det antineoplastiske middel, der eksempelvis kan være doxorubicin. Hvis man rehydratiserer liposomer, som allerede indeholder basen (eksempelvis natriumcarbonat), og som derfor allerede har en transmembran-pH-gradient, 25 tilsætter man vand eller en anden neutral vandig opløsning sammen med doxorubicin. Endelig skal det anføres, at rehydratiseringen i det tilfælde, hvor man har dehydratiseret liposomer, som har en transmembran-pH-gradient, og som indeholder doxorubicin, forløber under anvendelse af vand eller en anden vandig opløsning. Alternativt kan man om ønsket tilsætte et andet an-30 tineoplastisk middel.

Liposomerne, som indeholder antineoplastiske midler, og de farmaceutiske formuleringer deraf ifølge opfindelsen kan anvendes terapeutisk på dyr (her- 32 DK 174869 B1 under mennesker) til behandling af infektioner eller tilstande, som kræver: (1) gentagne indgivelser, (2) vedvarende afgivelse af medikamentet i dettes bioaktive form eller (3) nedsat toxicitet under opretholdelse af en passende effektivitet i sammenligning med det tilsvarende frie medikament. Sådanne 5 tilstande omfatter (men er ikke begrænset til) neoplasma-former, eksempelvis af den type, som kan behandles med antineoplastiske midler.

Den måde, hvorpå man vælger at administrere liposomerne, som indeholder antineoplastiske midler, og de farmaceutiske formuleringer deraf, kan be-10 stemme de steder og de celler i organismen, hvor forbindelsen skal afgives. Liposomerne ifølge opfindelsen kan administreres alene, men generelt vil man administrere liposomerne blandet med et farmaceutisk bærerstof, som er udvalgt med hensyn til den påtænkte indgivelsesvej og sædvanlig farmaceutisk praksis. Præparationerne kan injiceres parenteralt, f.eks. intravenøst.

15 til parenteral administration kan de eksempelvis anvendes i form af en steril vandig opløsning, som kan indeholde andre opløste stoffer, f.eks. en tilstrækkelig mængde salte eller glucose til at gøre opløsningen isotonisk. Do-xorubicin-liposomerne kan f.eks. indgives som en 60 minutters intravenøs infusion i en dosering på mindst ca. 20 mg/m2. De kan også anvendes til pe-20 ritoneal udvaskning eller intrathecal administration via injektion. Desuden kan de administreres subkutant, f.eks. på et sted, hvor der forekommer lymfeknude-metastaser. Andre anvendelser, som afhænger af egenskaberne af det pågældende præparat, vil være nærliggende for fagmanden.

25 Med hensyn til oral indgivelse kan de liposomale antineoplastiske medikament-formuleringer ifølge opfindelsen anvendes i form af tabletter, kapsler, pastiller, dragéer, pulvere, sirupper, eliksirer, vandige opløsninger og suspensioner eller lignende. Når der er tale om tabletter, kan man anvende bærerstoffer valgt blandt lactose, natriumcitrat og phosphorsyresalte. I tabletter 30 anvender man desuden ofte forskellige disintegrerende midler, såsom stivelse, og smørende midler, såsom magnesiumstearat, natriumlaurylsulfat og talkum. Til oral administration i form af kapsler kan man som nyttige fortyndingsmidler anføre lactose og polyethylenglycoler med høj molekylvægt. Når DK 174869 B1 33 der kræves vandige suspensioner til oral indgivelse, kombineres den aktive bestanddel med emulgerings- og suspenderingsmidler. Om ønsket kan man tilsætte sødemidler og/eller aromastoffer.

5 Til topisk indgivelse kan de liposomale antineoplastiske formuleringer ifølge opfindelsen inkorporeres i egnede dosisformer, såsom geler, olier, emulsioner og lignende. Sådanne præparationer kan administreres ved direkte påføring, eksempelvis i form af en creme, en pasta, en salve, en gel, en lotion eller lignende.

10

Med hensyn til administration til mennesker i forbindelse med kurativ, remissiv, retardiv eller profylaktisk behandling af neoplastiske sygdomme vil den ansvarlige læge fastlægge en passende dosering af det neoplastiske middel til en given patient, og denne dosering kan forventes at variere under hensyn 15 til patientens alder, vægt og respons samt under hensyn til arten og sværhedsgraden af patientens sygdom. Doseringen af medikamentet i liposomal form vil generelt svare til den dosering, som anvendes for det tilsvarende fri medikament. I nogle tilfælde kan det imidlertid være nødvendigt at indgive doser, som falder uden for disse grænser.

20

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 25 1,0 ml 150 mM citronsyre, pH 4,0, sattes til 200 mg EPC/cholesterol (molfor hold 1:1) i et reagensglas. Glassets indhold blev omrørt i 5 minutter for at dispergere opløsningen homogent og tilvejebringe MLV'er. Prøven blev overført til et kryogent hætteglas med en kapacitet på 2,0 ml, og glasset blev nedsænket i flydende nitrogen i 2 minutter, hvorefter det blev opvarmet til 40 30 °C i et vandbad, indtil prøven var fuldstændigt smeltet. Denne frysnings- optønings-cyklus blev gentaget 7 gange under kortvarig blanding af prøven umiddelbart før frysningen. Herved dannedes FATMLV'er. Prøven blev derefter ekstruderet 7 gange igennem polycarbonatfiltre med en porestørrelse på 34 DK 174869 B1 0,2 μιτι i overensstemmelse med LUVET-proceduren. Den resulterende prøve blev fortyndet 2 gange med ikke-pufferholdigt 0,85% saltvand. Liposo-mopløsningen blev forvarmet til 60 °C i 5 minutter og derefter over ført til et hætteglas indeholdende findelt doxorubicin (22,2 mg DOX/100 mg lipid) og 5 pulveriseret natriumcarbonat (3,75 mg/22,2 mg DOX). Prøven blev opvarmet til 60 °C i 5 minutter, hvorunder den blev omrørt periodevist.

EKSEMPEL 2 10 Man fulgte proceduren fra eksempel 1, idet man anvendte 300 mM citronsyre (pH 4,0) og en lipid-koncentration på100 mg/ml. Liposomerne blev ikke fortyndet med saltvand, hvorimod der som fortyndingsmiddel tilsattes natriumbi-carbonat. Herved kom den ydre pH-værdi op på omkring 8,0 inden doxorubi-cin-tilsætningen.

15 EKSEMPEL 3

Liposomer, som var i stand til aktivt at indkapsle doxorubicin, blev fremstillet ved at hydratisere en EPC-film (tørret ud fra CHCI3 og anbragt under kraftigt 20 vacuum i 12 timer) i en 300 mM citronsyrepuffer (pH 4,0). Herved opnåedes en endelig lipid-koncentration på 100 mg/mf. De dannede MLV'er blevfrosset og optøet 5 gange, og de blev ekstruderet 5 gange igennem polycarbonat-filtre med en porestørrelse på 0,2 pm i overensstemmelse med LUVET-teknikken. Liposomerne blev derefter indstillet til en pH-værdi på 7,5 med 1,0 25 M Na2C03 og inkuberet med doxorubicin i 5 minutter ved 60 °C.

De liposomer, som på passiv måde indkapslede doxorubicin, blev fremstillet ud fra de ovennævnte materialer, idet man suspenderede doxorubicin i en puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCI, pH 7,5) indtil en koncentration på2,0 30 mM doxorubicin inden lipid-hydratiseringstrinnet. Liposomerne blev frosset og optøet og derefter ekstruderet som beskrevet ovenfor. Den aktive indkapsling af doxorubicin blev opnået ved at fremstille vesikler i en puffer ved pH 4,0, forøge den ydre pH-værdi til 7,5 ved hjælp af 1,0 M Na2C03 og inku- DK 174869 B1 35 berer vesiklerne (20 mM lipid) med doxorubicin (10 mg lipid/ml) i 5 minutter ved 60 °C.

For at bestemme liposom-præparationernes indkapslingseffektivitet foretog 5 man en spektrofotometrisk overvågning af frit og liposom-indkapslet doxorubicin, idet man anvendte et Shimadzu UV-160 spektrofotometer på følgende måde: de liposomale doxorubicin-prøver blev fortyndet med 20 mM HEPES og 250 mM NaCI (pH 7,5) til opnåelse af omtrentlige doxorubicin-koncentrationer på 0,05-0,10 mM. Man foretog følgende målinger i den an-10 givne rækkefølge: (1) absorbansen af den fortyndede prøve ved 600 nm blev justeret til 0, (2) prøven blev gjort basisk til pH 10,5 ved hjælp af 1,0 N NaOH (0,02 ml/1,0 ml prøve) og absorbansen ved 600 nm blev registreret i løbet af 2 minutter, (3) spektrofotometeret blev indstillet på 0 over for en 0,2% Triton X-100 opløsning og (4) absorbansen af den liposomale doxorubicin-prøve, 15 hvortil der var sat Triton X-100 (0,02 ml 20% Triton X-100/1,0 ml prøve efter vægt) blev bestemt ved 600 nm. Forholdet imellem frit og totalt doxorubicin blev beregnet som absorbansen ved 600 nm efter tilsætning af NaOH divideret med absorbansen efter tilsætning af Triton X-100.

20 For at sætte den pH-afhængige spektral respons-teknik i relation til de faktiske niveauer af frit og indkapslet medikament bestemte man indholdet af ve-sikel-indkapslet doxorubicin på følgende måde; en lille prøve af den liposomale doxorubicin-opløsning blev ledt igennem Sephadex G-50 gelkolonner ekvilibreret med 20 mM HEPES og 150 mM NaCI (pH 7,5) for at 25 separere det frie medikament fra de liposom-associerede medikament. Det liposom-holdige elueringsmiddel såvel som prøver af de oprindelige opløsninger blev analyseret for phospholipid og doxorubicin ved henholdsvis phosphoranalyse og optiske densitet ved 480 nm som tidligere beskrevet af Mayer et al., (1986), Biochim Biophys. Acta., 857:123.

Den ovenfor beskrevne procedure blev gentaget under anvendelse af EPC/cholesterol (molforhold 5545), 10 mg pr. ml totalt lipid.

30 DK 174869 B1 36 EKSEMPEL 4

Man anvendte de i eksempel 3 benyttede materialer og procedurer, idet man anvendte en citronsyrepuffer med en pH-værdi på henholdsvis 4,2, 5,2, 5,7, 5 6,7 og 7,2. Tegningens fig. 5 viser, at absorbansforholdet (Abs. 600

NaOH/Abs. 6oo efter Triton X-100) nøjagtig repræsenterer forholdet imellem fri og total doxorubicin i vesikel-præparationerne over en fuldstændig interval af indkapslingseffektiviteter.

10 EKSEMPEL 5

Man anvendte de i eksempel 3 beskrevne materialer og procedurer, idet man bestemte indkapslingseffektiviteten af liposom-indkapslet doxorubicin ved sammenligning af den farve, som opnåedes ved at sætte en prøve (0,2 ml) af 15 liposomerne til 1,0 N NaOH, med et farvekort.

EKSEMPEL 6 200 mg EPC/cholesterol (molforhold 55:45) blev tørret til en tynd film ud fra 20 chloroform under reduceret tryk ved 37 °C i 12 timer. Der tilsattes 1,0 ml citronsyre (150 mM ved pH 4,0), og filmen blev suspenderet. De resulterende MLV'er blev frosset og optøet 7 gange på samme måde som i eksempel 1, hvorefter de blev ekstruderet 5 gange igennem et 200 nm polycarbonatfilter ved anvendelse af LUVET-proceduren. Størrelsesfordelingen af de resulte-25 rende liposomer blev bestemt ved kvasielektrisk lysspredning (QELS), og den generelle morphologi blev observeret ved elektronmikroskopi. Der sattes sterilt saltvand (1,0 ml) til den ekstruderet vesikelopløsning, hvilket gav en total lipid-koncentration på 100 mg/ml. Liposomernes ydre pH-værdi blev indstillet til 7,5 ved hjælp af 1,0 N NaOH. Denne liposomopløsning (1,0 ml) 30 blev sammen med 22 mg pulveriseret doxorubicin (som indeholdt Na2C03) i et vægtforhold på 1 mg til 6 mg doxorubicin) opvarmet til 60 °C i 3 minutter under lejlighedsvis omrystning.

DK 174869 B1 EKSEMPEL 7 37

Man anvendte de i eksempel 6 beskrevne materialer og procedurer til at bestemme stabiliteten af liposom-doxorubicin-præparationerne in vitro. Frigivel-5 seseksperimenterne blev foretaget på følgende måde: liposom-prøver, som var fortyndet 10 gange, blev dialyseret i 24 timer imod 1000 volumener 20 mM HEPES og 150 mM NaCI (pH 7,5) ved 37 °C. Efter et tidsrum på 1,2, 4, 8, 10 og 24 timer efter præparationen udtog man røver på 150 μΙ, hvori man bestemte indholdet af indkapslet doxorubicin.

10 EKSEMPEL 8

Man anvendte de i eksempel 3 beskrevne materialer og procedurer med den undtagelse, at vesiklerne blev ledt igennem filtre med en porestørrelse på 1,0 15 pm, og at man bestemte prøvernes serum-stabilitet. Den fortyndede lipo-somale doxorubicin-prøve blev fortyndet med 20 volumener friskt humant serum og inkuberet ved 37 °C. Efter 1, 2, 4, 8, 12, og 24 timers forløb blev vesiklerne udfældet ved centrifugering ved 500 x g i 5 minutter og vasket 2 gange med 20 mM HEPES og 150 mM NaCI ved pH 7,5. Derefter analysere-20 de man for phospholipid og doxorubicin som tidligere beskrevet.

EKSEMPEL 9

Indkapslingseffektiviteten af doxorubicin-liposomer blev analyseret på føl-25 gende måde:

Efter fuldførelse af indkapslingsproceduren ifølge eksempel 6 fortyndede man 20 μΙ af doxorubicin-liposomeme til 200 μ! ved hjælp af 20 mM HEPES og 150 mM NaCI (pH 7,5). En prøve af dette fortyndede materiale (20 μΙ) 30 blev analyseret for lipid-phosphat ved proceduren beskrevet af Bartlett, J.

Biol. Chem. 1959, 234:466-268. En anden prøve på 20 μΙ af den fortyndede præparation blev udtaget og anbragt i et reagensglas, hvortil der sattes 1,0 ml 1% (w/w) Triton x-100. Prøven blev opvarmet i vandbad ved 40 °C i 2 mi- 38 DK 174869 B1 nutter, hvorefter de blev blandet ved omrystning. Prøvens absorbans blev aflæst ved hjælp af et spektrofotometer ved 480 nm. Prøveaflæsningerne blev sammenlignet med en standardkurve over doxorubicin-prøver, som indeholdt kendte mængder af midler, der var blevet fortyndet med 1,0 ml Triton 5 X-100.

Man fremstillede Sephadex G-50 kolonner (medium kvalitet) med en kapacitet på 1,0 ml, som forinden var blevet kvældet med en gel i 20 mM HEPES og 150 mM NaCI (pH 7,5). Kolonnerne blev centrifugeret ved 500 x g i 3 mi-10 nutter, hvorefter man foretog en fornyet centrifugering for at pakke kolonnerne. Doxorubicin-liposom-prøver (150 pi af de 10 gange fortyndede prøver) blev overført til kolonnerne, hvorefter der tilsattes 50 μΙ puffer. Der centrifugeredes med 3000 omdrejninger pr. minut i 5 minutter. Der blandedes ved omrystning, indtil elueringsmidlet var homogent. Prøver på 25 μΙ blev udtaget og 15 analyseret for phosphat og doxorubicin som beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 10

Man anvendte de i eksempel 2 beskrevne materialer og procedurer, og de 20 resulterende liposomer blev klargjort til injektion ved blanding med sterilt fysiologisk saltvand, således at man kunne indgive en 5 mg dosis i 0,2 ml væske.

DBA/2-mus, som vejede 18-20 g, blev opdelt i grupper på6 til 10 dyr. Disse 25 mus modtog intraperitoneale injektioner (0,5 ml) indeholdende 1,5 x 106 L1210 tumor-celler. Behandlingen blev påbegyndt 24 timer efter tumorinjektionen, og den blev givet via den laterale halevene. Dyrene blev behandlet med liposomalt doxorubicin på basis af den gennemsnitlige legemsvægt,

Musene blev vejet dagligt. Man noterede overlevelsestiden (i dage) og be-30 regnede de gennemsnitlige overlevelsestider.

Den ovenfor beskrevne procedure blev gentaget, idet behandlingen foregik med EPC/cholesterol og DSPC/cholesterol, begge i et molforhold på 55:45, DK 174869 B1 39 og med liposomal-doxorubicin. Man foretog også en kontrolbehandling med sterilt saltvand og en kontrolbehandling med tomme (doxorubicin-fri) liposo-mer.

5 EKSEMPEL 11 IDso-undersøgelser, hvorunder man sammenlignede frit doxorubicin med liposomalt doxorubicin, blev gennemført på følgende måde: 10 CD-1-mus med en gennemsnitlige legemsvægt på 20-25 g blev opdelt i grupper på 6-10 dyr. doxorubicin blev solubiliseret i sterilt injicerbart saltvand til opnåelse af en dosis med et volumen på 200 μΙ. Doserne blev administreret via injektion gennem halevenen, og der anvendtes et dosisniveau på 10 mg/ kg legemsvægt. Efter injektionen blev legemsvægten og dødelighe-15 den registreret i løbet af henholdsvis 7 og 14 dage.

På lignende måde injiceredes mus med liposomalt doxorubicin fremstillet i overensstemmelse med eksempel 5, idet man anvendte EPC/cholesterol i et molforhold på55:45, og idet man anvendte reagenser med USP-renhed. Man 20 fortyndede liposomerne for at administrere en passende dosis af doxorubicin som beskrevet ovenfor, og fortyndingerne blev foretaget med sterilt saltvand.

På samme måde som beskrevet ovenfor injiceredes mus med et totalt volumen på 200 μΙ igennem halevenen, hvilket svarede til effektive doser på 10 mg/kg legemsvægt. Efter injektionen blev legemsvægten og dødeligheden 25 registreret over henholdsvis 7 og 14 dage.

Den ovenfor beskrevne procedure blev gentaget, idet man administrerede frit doxorubicin i doser på 15, 20, 25, 30 og 40 mg pr. kg legemsvægt.

30 Den ovenfor beskrevne procedure blev gentaget med liposomalt doxorubicin i mængder på 20, 30, 40, 50, 60 og 80 mg/kg legemsvægt.

DK 174869 B1 40 EKSEMPEL 12

EPC/cholesterol (vægtforhold 2,1:1) blev dispergeret i 150 mM citronsyre (pH

4,0) til opnåelse af en puffer med et indhold af totalt lipid på 200 mg/ml. De 5 resulterende MLV'er blev frosset og optøet 7 gange under blanding ved omrystning forud for hvert nedfrysningstrin. De resulterende FATMLV'er blev ekstruderet 5 gange igennem 2 filtre med en porestørrelse på 0,2 pm, som var anbragt ovenpå hinanden, til frembringelse af VET2ooér. Liposomerne blev derefter fortyndet 2 gange med ikke-pufferholdigt saltvand, hvorefter 10 pH-værdien blev indstillet til 7,5 med 1 N NaOH. Den ækvivalent, som svarede til 1,0 ml liposomer før pH-justeringen, blev sat til 133 mg doxorubi-cin/lactose og 3,7 mg Na2C03, som befandt sig i et tilsmeltet hætteglas (kapacitet 20 ml). Såvel liposomerne som det doxorubicin-holdige hætteglas blev opvarmet til 60 °C i 5 minutter, inden disse bestanddele blev blandet.

15 Efter blandingen blev liposomerne opvarmet til 60 °C i 5 minutter under manuel omrystning hvert minut. Blandingen blev derefter afkølet til stuetemperatur. En prøve af blandingen (50 μΙ) blev udtaget og fortyndet til 0,5 ml med 20 mM HEPES og 150 mM NaCI (pH 7,5). En prøve heraf (150 μΙ) blev overført til en 1,0 ml Sephadex G-50 kolonne som tidligere beskrevet. Indholdet af 20 phosphat og doxorubicin blev bestemt kvantitativt som tidligere beskrevet i såvel elueringsmidlet som i de oprindelige prøver.

EKSEMPEL 13 25 VET2oo-prøver blev fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 12, idet man anvendte EPC/EPG/cholesterol (molforhold 0,95:0,05:1,0) i en mængde på 200 mg total lipid i 150 mM citronsyre (pH 4,0). Prøverne blev fortyndet 2 gange med ikke-pufferholdigt saltvand, hvorefter liposomernes ydre pH-værdi blev justeret til 7,5 med 1,0 N NaOH. Efter inkubation af dette 30 præparat i 5 minutter ved 60 °C satte man en prøve heraf (3,5 ml) til 70 mg doxojrubicin, som indeholdt 11,7 Na2C03- Prøven blev omrystet lejlighedsvis, mens den blev inkuberet ved 60 °C i 5 minutter.

DK 174869 B1 EKSEMPEL 14 41

En film bestående af hydrogeneret soja-PC (HSPC) og cholesterol (HSPC/cholesterol-vægtforhold 2,4:1, 400 mg totalt lipid) blev hydratiseret 5 med 4,0 ml 300 mM citronsyre ved pH 4,0, hvorved der dannedes MLV'er.

Denne opløsning blev ekstruderet 5 gange igennem et filter med en porestørrelse på 0,2 pm. Man satte en lille mængde natriumbicarbonat til de ekst4mderede liposomer for at justere pH-værdien til 8,5 +/- 0,2. Et hætteglas, som indeholdt 10 mg doxorubicin sammen med liposomeme, blev for-10 varmet til 60 °C i 3 minutter. En prøve (0,5 ml) af liposomerne blev sat til hætteglasset, som indeholdt doxorubicin, og efter manuel omrystning blev blandingen inkuberet i 15 minutter ved 60 °C. Den i eksempel 5 beskrevne farve-test indikerede, at indkapslingseffektiviteten var over 95%.

15 EKSEMPEL 15

Man fremstillede MLV'er ud fra EPC/cholesterol (vægtforhold 2,4:1) og 300 mM citronsyre/250 mM lacytose, pH 4,0, hvorved man opnåede 100 mg totalt lipid pr. ml blanding. Disse MLV’er blev ekstruderet 5 gange igennem et 20 Gelman 0,2 pm eksklusionsfilter (filter med bugtede kanaler). En prøve (1,0 ml) af disse liposomer blev anbragt i et 9 ml Kimax reagensglas og tørret under vakuum i 48 timer. For at rehydratisere præparationen satte man 950 pi vand til denne.

25 EKSEMPEL 16

Liposomal-doxorubicin-præparationernes frigivelseskarakteristika blev bestemt på følgende måde: 30 EPC/cholesterol (molforhold 55:45) blev tørret ud fra chloroform til dannelse af en tynd film på indersiden af en rundbundet kolbe med en kapacitet på 500 ml (400 mg totalt lipid). Filmen blev hydratiseret med 4,0 ml 300 mM citronsyre (pH 4,0), hvorved er dannedes MLV'er. Disse MLV’er blev ekstruderet 42 DK 174869 B1 igennem to sammenlagte 0,22 μιη Nucleopore membrafil-filtre, hvorefter man ekstruderede blandingen 10 gange igennem et 0,1 μιη Nucleopore membra-fil-filter (med bugtede kanaler). Til 1,0 ml af det resulterende filtrat sattes 275 μΙ 1M Na2C03, hvorved man hævede den eksterne pH-værdi til 8,3. En prøve 5 (0,6 ml) blev opvarmet til 60 X i 3 minutter, og en 10 mg prøve af doxorubi cin fik samme behandling. Liposom-prøven blev sat til de 10 mg doxorubicin og opvarmet til 60 X i 5 minutter. Derefter blev prøven opdelt i to dele. Den ene del blev fortyndet to gange med 30 mM HEPES og 150 mM NaCI (pH 7,5). Den anden del blev fortyndet ti gange med 300 mM citronsyre (pH 4,0).

10 Begge prøver blev anbragt i dialyseposer og dialyseret ved 37 °C imod 1 000 volumener af deres respektive puffere. Efter 1 times forløb udtog man en prøve på 150 μΙ, som blev analyseret for doxorubicin og lipid-phosphat som tidligere beskrevet efter passage ned igennem en 1,0 ml Sephadex-kolonne ekvilibreret med den respektive puffer.

15

Den ovenfor beskrevne procedure blev gentaget under udtagelse af prøver fra dialyseposerne efter 2, 4, 8, 12 og 24 timer.

Man gentog også den ovennævnte procedure ved anvendelse af liposomer 20 bestående af EPC, cholesterol og alpha-tocopherol (55:45:1).

EKSEMPEL 17

Vekselvirkningen imellem doxorubicin og citrat blev bedømt på følgende må-25 de:

Ved 25 X satte man doxorubicin til 0,5 ml 20 mM HEPES og 15 mM NaCI-puffer, pH 7,5, hvorved man opnåede en 4 mM doxorubicin-opløsning. Prøven blev centrifugeret til opsamling af et eventuelt bundfald, og supernatan-30 ten blev analyseret for doxorubicin ved spektrofotometriske metoder som tidligere beskrevet.

DK 174869 B1 43

Man gentog den ovennævnte procedure under anvendelse af de følgende puffere: 300 mM Na-citrat, pH 4,0; 300 mM Na-citrat, pH 5,0; 300 mM Na-citrat, pH 6,0; og 300 mM Na-citrat, pH 7,5.

5 Resultaterne er vist grafisk på fig. 3, som er en grafisk afbildning af den cit-rat-doxorubicin-vekselvirkning, som er et resultat af blandingsforsøg foretaget ved varierende citrat-pH-værdier. Den mængde doxorubicin (mM), som bliver tilbage i opløsningen efter centrifugering, afsættes som funktion af citrat-pH-værdien: 4 mM doxorubicin, blandet ved 60 °C og derefter afkølet til 25 X 10 (lukkede kvadrater); 4 mM doxorubicin blandet ved 26 °C (åbne kvadrater); 20 mM doxorubicin blandet ved 60 °C og derefter kølet til 25 °C (lukkede cirkler); og 4 mM doxorubicin blandet med 20 mM/HEPES og 150 mM NaCI ved 25 X til sammenligning (åben cirkel).

15 EKSEMPEL 18

Man fulgte de i eksempel 17 beskrevne procedurer under iagttagelse af de følgende temperaturbetingelser under blandingen: 60 X i 5 minutter efterfulgt af en afkøling til 25 X og 60 X i 5 minutter efterfulgt af en afkøling til 25 20 °C under anvendelse af 20 mM doxorubicin.

Resultaterne er vist grafisk på fig. 3, som er en afbildning af den citrat-doxorubicin-vekselvirkning, som opstår ved at foretage blandingsforsøg under varierende citrat- og pH-værdier. Den mængde doxorubicin (mM), som 25 forbliver tilbage i opløsningen efter centrifugering, afsættes som funktion af citrat-pH-værdien: 4 mM doxorubicin, blandet ved 60 X og derefter afkølet til 25 X (lukkede kvadrater); 4 mM doxorubicin blandet ved 25 X (åbne kvadrater); 20 mM doxorubicin blandet ved 60 X og derefter afkølet til 25 X (lukkede cirkler); og 4 mM doxorubicin blandet med 20 mM/HEPES og 150 30 mM NaCI ved 25 X til sammenligning (åben cirkel).

DK 174869 B1 44 EKSEMPEL 19 EPC og cholesterol {molforhold 55:45), totalt 100 mg lipid pr. ml puffer, blev tørret til en tynd film på den indre væg af en reaktionsbeholder, hvorefter 5 man foretog en hydratisering med 300 mM citrat, pH 4,0. De resulterende MLV'er blev reduceret i størrelse ved 10 passager igennem et 0,22 pm Nucleopore membrafil-filter. En lille mængde natriucarbonat (1,0 mg) sattes til de resulterende liposomer med det formål at justere den ydre pH-værdi til 8,3. Suspensionen blev inkuberet ved 60 X i 10 minutter. Man satte doxoru-10 bicin til disse liposomer til opnåelse af 29 + 2 mg doxorubicin pr. 100 mg total lipid, hvorefter man inkuberede suspensionen ved 60 °C i 10 minutter. Denne, liposomale doxorubicin-suspension blev administreret til mus i overensstemmelse med proceduren angivet i eksempel 10.

15 EKSEMPEL 20

Man anvendte de i eksempel 19 angivne procedurer og materialer, idet man yderligere, efter at have reduceret liposomernes størrelse ved at lede suspensionen ti gange igennem et 0,1 pm Nucleopore membrafil-filter, ledte 20 suspension ti gange igennem to på hinanden anbragte 0,1 pm Nucleopore membrafi I-filtre. En bestemmelse af LDsofor den resulterende liposomale doxorubicin-suspension blev foretaget som beskrevet i eksempel 10.

EKSEMPEL 21 25

Liposomer, som indeholdt DSPC, blev fremstillet ved at hydratisere en lipid-film (tørret ud fra methylenchlorid i 12 timer under kraftigt vakuum) i 300 mM citronsyre, pH 4,0, til opnåelse af 100 mg totalt lipid pr, ml citronsyreopløsning. De resulterende MLV'er blev frosset og optøet syv gange 30 i flydende nitrogen og derefter opvarmet i adskillige minutter til 60 °C. Derefter ekstruderedes fem gange igennem polycarbonatfiltre (porestørrelse 0,2 pm) under anvendelse af en LUVET-ekstruderingsanordning forsynet med termokappe. Den ydre pH-værdi af disse ekstruderede liposomer blev deref- DK 174869 B1 45 ter indstillet til pH 7,8 ved hjælp af natriumhydroxid. Denne liposomopløsning blev derefter opvarmet til 60 °C i 3 minutter, hvorpå den blev kombineret med doxorubicin i et forhold mellem medikament og lipid på 0,25:1. Opløsningen opvarmedes til 60 °C i 5 minutter under omrystning. Det ikke-indkapslede 5 doxorubicin blev udtaget fra præparationen ved at lede 150 ml af denne gennem en Sephadex G-50-kolonne (1 ml) ekvilibreret med pufferholdigt saltvand. Denne procedure resulterede i en indkapslingseffektivitet på over 95%.

EKSEMPEL 22 10

Man anvendte de i eksempel 21 benyttede materialer og procedurer, idet pH-værdien af de resulterende liposomer blev indstillet til 8,0 ved hjælp af 1,0 M natriumcarbonat og opretholdt ved 60 °C.

15 EKSEMPEL 23

De ifølge eksempel 22 anvendte procedurer og materialer blev benyttet påny, idet man anvendte 100 mg/ml DPPC/cholesterol (molforhold 55:45 i et endeligt vægtforhold mellem medikament og lipid på 0,20).

20 EKSEMPEL 24 DBA/2-hunmus, som vejede 18-22 g, blev opdelt i grupper på 6-10 dyr og podet via intraperitoneale injektioner med 1,5x106 L1210 tumor-celler su-25 spenderet i 0,5 ml RPMI 1640. Denne L1210 cellelinie blev opretholdt ved serievis passage af ascites-væske eller som frossen (flydende N2) kultur.

Uden behandling udvikler musene en ascitisk tumor på 2-5 g i løbet af 7 til 8 dage, og i sådanne tilfælde udviste de en overlevelsestid på 8 til 10 dage.

Man anvendte liposomer fremstillet i overensstemmelse med eksempel 22.

30 Behandlingen blev iværksat en dag efter tumor-injektionen, og den blev givet som en enkelt intravenøs dosis via den laterale halevene. Dyrene blev behandlet med frit eller liposomalt doxorubicin i en mængde på 5 mg/kg doxorubicin. Kontrolgrupperne blev behandlet med enten sterilt saltvand eller 46 DK 174869 B1 tomme liposomer i en lipid-dosis ekvivalent med den dosis, som blev indgivet med den højeste dosis liposomalt doxorubicin. Musene blev vejet på dagen forud for tumor-injektionen, og dyrenes vægt blev noteret dagligt, indtil det første dødsfald indtraf i en gruppe. Overlevelsestiden blev registreret i dage 5 efter tumor-injektionen. De gennemsnitlige overlevelsestider og den statistiske signifikans af resultaterne blev bestemt under anvendelse af en to-sidet Wilcoxon’s rækkeanalyse (randomiseret forsøg med to grupper).

Det ovenfor beskrevne blev gentaget med henholdsvis 10, 20, 30 og 40 10 mg/kg frit og liposomalt doxorubicin.

EKSEMPEL 25

Man fremstillede liposomer efter de samme procedurer som beskrevet i ek-15 sempel 2. Når man anvendte P388-leukæmi-modellen, injicerede man tumorceller (1x105-celler i 0,1 ml suspension) intraperitonealt i CDF-1-hunmus.

Dagen efter tumor-podningen blev musene behandlet med liposomalt doxorubicin (5 mg/kg pr. dosis) via injektion i halevenen. Doseringen blev beregnet i overensstemmelse med gennemsnitsvægten i hver gruppe, idet man 20 vejede dyrene på dag 0 (dagen for tumor-injektionen) og på dag 5. Dødsfaldene blev registreret dagligt.

Den ovennævnte procedure blev repeteret på dosisniveauerne 10 og 20 mg/kg.

25

Den ovenfor beskrevne procedure blev gennemført ved, at musene blev injiceret med enten saltvand, tomme liposomer eller doxorubicin via haleinjektion.

30 EKSEMPEL 26 DK 174869 B1 47

Man fremstillede liposomer i overensstemmelse med metoderne fra eksempel 2, idet man anvendte EPC/cholesterol (molforhold 55:45). Mere end 98% 5 af medikamentet blev indkapslet af liposomerne.

Shinogi-hanmus (25-40 g, 9 dyr i hver gruppe) blev injiceret subkutant med 1x105 SC-115-celler opnået fra en primær tumor i tidligere podede mus. Tumorvæksten blev overvåget ved palpering, og tumorerne blev målt ved hjælp 10 af en skydelære. Efter vækst af tumoren til 0,5-2,0 g (tumorvægt = [bredde2 x længde]/2, målinger i mm) fik musene indgivet en liposomal doxorubicin-dosis på 13 mg/kg intravenøst med intervaller på syv dage (3 injektioner med den angivne dosering). Tumorvæksten blev målt tre gange om ugen i 50 dage efter den første behandling eller indtil tumorvægten oversted 9 g, på hvil-15 ket tidspunkt dyret blev aflivet. De til behandlingen anvendte doser var baseret på dyrenes begyndelsesvægt inden tumor-indpodningen.

Den ovennævnte procedure blev gentaget, idet dyrene fik indgivet saltvand og tomme liposomer (indgivet i en dosis ækvivalent til den dosis, som svare-20 de til en liposomal doxorubicin-dosis på 13 mg/kg).

Den ovenfor beskrevne procedure blev gentaget på et dosisniveau på 3,25 mg/kg og 6,5 mg/kg for frit og liposomalt doxorubicin.

25 Resultaterne viser en dosisafhængig inhibering af tumorvæksten, som er induceret af frit og liposomalt doxorubicin.

EKSEMPEL 27 30 Man fremstillede liposomer ved at hydratisere en film af DSPC/cholesterol (molforhold 55:45) i 300 mM citronsyrepuffere (pH 4,0) under omrystning.

Disse MLV'er (100 mg totalt lipid/ml puffer) blev ekstruderet ti gange igennem polycarbonatfiltre med en porestørrelse på 200 nm i en til 60 °C opvarmet 48 DK 174869 B1 LUVET-anordning forsynet med termokappe. Liposomeme blev sat til en opløsning af 1 mg/ml vineristinsulfat (Oncovin, kan fås fra Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN) med henblik på at opnå et vægtforhold imellem medikamentet og det totale lipidindhold på omkring 0,17:1. Hertil sattes en tilstrækkelig 5 mængde 1, 0 M Na2HP04 til at bringe opløsningens pH op på omkring 7,0. Prøverne blev derefter opvarmet til 60 °C i 10 minutter, hvorefter medikamentet blev indkapslet i liposomeme, som udviste en indkapslingseffektivitet på over 98%.

10 Den ovenfor beskrevne procedure blev gentaget under anvendelse af EPC/cholesterol og HSPC/cholesterol.

Retensionen af medikamentet blev målt ved 21 °C og 37 °C under dialyse i 20 mM HEPES, og 150 mM NaCI, pH 7,5 (dialysat). Den efterfølgende tabel 15 1 viser karakteristika for optagelsen af vineristin for systemerne EPC/- cholesterol, HSPC/cholesterol og DSPC/cholesterol, idet der anvendtes vin-cristin fra forskellige kilder, nærmere bestemt vineristin fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Oncovin og Eli Lilly & Co. (Indianapolis, IN).

20 Ved dialyse viste det sig, at HSPC/cholesterol- og DSPC/cholesterol-liposomerne taber under 10% af det indkapslede vineristin (fig. 6).

EKSEMPEL 28 25 Man færdiggjorde de dosis-respons-baserede overlevelsesstudier ved at injicere liposom-indkapslet vineristin via den laterale halevene til DBA/2J-hunmus (18-22 gram, 10 mus pr. gruppe) i mængder på 0,2 ml, hvorefter man overvågede dødeligheden og den gennemsnitlige legemsvægt over 30 dage.

30 Antitumor-aktiviteten af frit og liposomalt vineristin blev bedømt ved anvendelse af en L121Q lymprocytisk leukæmi-model. DBA/2J-mus (6 mus pr. gruppe) blev injiceret intraperitonealt med 1 x 106 L1210-celler afledt fra asci-tes-væske fra en tidligere inficeret mus. Liposomalt vineristin, fremstillet i DK 174869 B1 49 overensstemmelse med eksempel 27, blev administreret intravenøst på forskellige tidspunkter efter tumor-indpodningen, og såvel dyrenes vægt som deres dødelighed blev noteret, 5 Det ovenstående eksempel blev gentaget ved indgivelse af fri vincristin og tomme liposomer.

EKSEMPEL 29

10 DSPC/cholesterol/vesikler (55:45) blev fremstillet ved ekstrudering 10 gange ved 60 °C gennem to polycarbonatfiltre med retlinet passage (0,2 pm Nucleopore) i 300 mM natriumcarbonat, pH 9,6 (justeret med 10% H2SO4) ved en lipid-koncentration på 100 mg/ml. Den eksterne puffer blev fjernet, og pH-gradienten blev etableret ved at lede vesiklerne ned gennem en G-50 15 Sephadex kolonne ekvilibreret med 150 mM K2SO4 og 20 mM HEPES, pH

7,4 Gusteret med NaOH). Disse vesikler blev inkuberet med 2 mM 5-fluoruracil (FU) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 60 minutter ved 21 °C, hvorefter inkubationstemperaturen blev hævet til 60 °C i 60 minutter. FU, som ikke var blev indkapslet, blev fjernet ved passage ned gennem en G-50 20 kolonne ekvilibreret med den eksterne puffer.

Fig. 7 demonstrerer optagelsen af FU som funktion af temperaturen. En inkubation af liposomerne ved 60°C bevirkede en kraftig forøgelse af FU-optagelsen. På fig. 7 afspejler delta T en temperaturstigning fra 21 til 60 °C.

25

De ovennævnte liposomer, som indeholdt FU, blev derefter ledt ned gennem en Sephadex G-50 kolonne ekvilibreret med 150 mM NaCI ved 37 eC. Der skete en re-ekvilibrering af 5-FU i overensstemmelse med pH-gradienten (fig.

8). Fig. 8 er en grafisk afbildning, som viser indvirkningen af den ydre puffer 30 på FU-frigivelsen ved 37 X.

50 DK 174869 B1

Liposomer, som indeholdt den oprindelige KaSCVpuffer, blev også erstattet som beskrevet ovenfor med 250 mM ammoniumacetat. Herved opnåedes en fuldstændig frigivelse af FU (fig. 8).

5 EKSEMPEL 30

15 mg ikke-phosphatidylcholin blev dispergeret i 2 ml 300 mM citronsyre, pH

4,0, hvorefter de resulterende MLV’er blev nedfrosset i flydende nitrogen og optøet i varmt vand (omkring 35 °C) i alt fem gange. Lipidet blev derefter eks-10 truderet 10 gange igennem to på hinanden anbragte polycarbonatfiltre, hvis porestørrelse var 100 nm, ved anvendelse af LUVET-proceduren. Man tilvejebragte en proton-gradient ved at lede vesiklerne igennem en Sephadex G-50 kolonne (fin kolonne, 1,5 cm x 10 cm), som på forhånd var blevet ekvi-libreret med 300 mM NaCI og 20 mM HEPES, pH 7,5. En prøve af de store 15 unilamellare vesikler, som illueredes fra kolonnen, blev fortyndet med 300 mM NaCI og 20 mM HEPES, pH 7,5, til en lipid-koncentration på 0,75 mg/ml i et totalt volumen på 2 ml. Derefter tilsattes 113 pg daunorubicin fra en stam-opløsning (5,64 mg/ml) i destilleret vand. Blandingen blev inkuberet ved stuetemperatur (25 °C), og med intervaller på 2, 10, 20, 30, 60 og 120 minutter 20 blev prøver på 100 μΙ centrifugeret igennem 1 ml "mikrokolonner" af Sephadex G-50 (fint) til fjernelse af eventuelt ikke-indkapslet daunorubicin fra vesiklerne. Koncentrationen af indkapslet daunorubicin blev bestemt ud fra ab-sorbansen ved 500 nm i et Shimadzu UV-265 spektrofotometer efter en solu-bilisering af vesiklerne i 1% Triton X-100. Lipidet blev bestemt kvantitativt ved 25 væskescintillationstælling under anvendelse af spor-niveauer af 3H-DPPC. I et overskud på over 98% skete der en indkapsling af daunorubicin, hvilket førte til et molært forhold mellem medikament og lipid på 1:5.

EKSEMPEL 31 30

Man anvendte de i eksempel 30 benyttede materialer og procedurer med den undtagelse, at man satte epirubicin (116 pg) til vesikel-suspensionen (2 ml) ud fra en stamopløsning (5,8 mg/ml). Epirubicin-optagelsen blev bestemt t 51 DK 174869 B1 kvantitativt ud fra absorbansen ved 500 nm efter solubilisering af vesiklerne i 1% Triton X-100. Vesiklernes indkapsning af epirubicin var over 98%, hvilket gav et molært forhold imellem medikament og lipid på 1:5.

5 EKSEMPEL 32

Man anvendte de ifølge eksempel 30 benyttede materialer og procedurer med den undtagelse, at man satte 103 pg mitoxanthron til vesikel-suspensionen (2 ml) ud fra en stamopløsning (2 mg/ml). Optagelsen af mito-10 xanthron blev bestemt kvantitativt ud fra absorbansen ved 670 nm efter solubilisering af vesiklerne i 2% Triton X-100. Vesiklernes indkapsling af mitoxanthron var over 98%, hvilket gav et forhold mellem medikament og lipid på 1:5.

15 EKSEMPEL 33

Man anvendte de i eksempel 30 beskrevne materialer og procedurer, idet man dog kombinerede cisplatin (200 μΜ) med liposom-suspensionen. Cisplatin viste sig ikke at blive akkumuleret i liposomerne under indvirkning af 20 transmembran-pH-gradienten.

Claims (44)

52 DK 174869 B1 P a t e n t k r a v:

1. Liposom-sammensætning, hvilken omfatter et lipidt dobbeltlag, et ioniser-5 bart antineoplastisk middel, hvori det antineoplastiske middel:lipid-forhold (w/w) er fra 0,1:1 til 3:1; og en pufferkombination omfattende et i forhold til liposomerne indre vandigt medium med én pH, og en i forhold til liposomerne ydre vandig opløsning med en anden pH, 10 således at der er en pH gradient over dobbeltlaget af liposomet, hvori det indre vandige medium, når det ioniserbare antineoplastiske middel er kationisk, er en citronsyrepuffer, og den første pH er mere sur end den anden pH, og hvori det indre vandige medium, når det ioniserbare inti-15 neoplastiske middel er anionisk, er en natriumcarbonatpuffer, og den første pH er mere basisk end den anden pH.

2. Liposom-sammensætning ifølge krav 1, hvori det antineoplastiske middel er et anthracyclin, et vinca-alkaloid, et purin- eller pyrimidin-derivat, et alkyle- 20 ringsmiddel eller et antibiotikum.

3. Liposom-sammensætning ifølge krav 2, hvori anthracyclinet er doxorubicin, daunorubicin eller epirubicin.

4. Liposom-sammensætning ifølge krav 2, hvori vinca-alkaloidet er vineristin eller vinblastin.

5. Liposom-sammensætning ifølge krav 2, hvori purin- eller pyrimidin-derivatetet er 5-fluoruraciL 30

6. Liposom-sammensætning ifølge krav 2, hvori alkyleringsmidlet er mito-xanthron. DK 174869 B1 53

7. Liposom-sammensætning ifølge et hvilket som helst af krav 1-6, hvori pufferkombinationen omfatter citronsyre/natriumcarbonat, citronsyre/natrium-bis-phosphat eller natriumcarbonat/kaliumsulfat.

8. Sammensætning ifølge krav 1 eller 2, hvori citronsyre/base kombinationen anvendes, når det antineoplastiske middel er vinca-alkaloid eller et anthra-cyclin og natriumcarbonat/kaliumsulfat kombinationen, når det antineoplastiske middel er et purin- eller pyrimidin-derivat.

9. Sammensætning ifølge krav 8, hvori citronsyre/natrium-bis-phosphat er brugt for vineristin, og citronsyre/natriumcarbonat kombinationen er brugt for doxorubicin, daunorubicin og epirubicin.

10. Liposom-sammensætning ifølge et hvilket som helst af krav 1-9, hvori 15 lipidet omfatter phospholipid.

11. Liposom-sammensætning ifølge krav 10, hvori phospholipidet omfatter æggephosphatidylcholin, distearoylphosphatidylcholin, hydrogeneret so-japhosphatidylcholin og dipalmitoyphosphatidylcholin. 20

12. Liposom-sammensætning ifølge krav 10 og 11, hvori lipidet endvidere omfatter cholesterol.

13. Liposom-sammensætning ifølge krav 12, hvori phospholipidet er i et 25 55:45 molforhold til cholesterol.

14. Liposom-sammensætning ifølge et hvilket som helst af krav 1-13, hvori liposomerne er 30 nm til 2 μιη i diameter.

15. Liposom-sammensætning ifølge hvilket som helst af krav 11-14, hvori liposomerne er store unilamellare liposomer. DK 174869 B1 54

16. Liposom-sammensætning ifølge krav 15, hvori liposomerne er fra 100 nm til 300 nm i diameter.

17. Liposom-sammensætning ifølge hvilket som helst af krav 1-16, hvori lipo-5 someme er homogene med hensyn til størrelsesfordelingen.

18. Liposom-sammensætning ifølge krav 1, hvori lipid-koncentrationen er mellem 90 og 110 mg/ml.

19. Liposom-sammensætning ifølge hvilket som helst af krav 1-18, hvori lipo- som-sammensætningen er dehydratiseret.

20. Liposom-sammensætning ifølge krav 1, hvori lipidet omfatter ægge-phosphatidylcholin, ægge-phosphatidylglycerol, distearolyphosphatidylcholin, 15 hydrogeneret sojaphospatidylcholin eller dipalmitoylphosphatidylcholin, det antineoplastiske middel er doxorubicin, forholdet imellem det antineoplastiske middel og lipidet er omkring 0,3:1, og den frigivelsesinhiberende puffersammensætning omfatter citronsyre/natriumcarbonat.

21. Liposom-sammensætning ifølge krav 1, hvori lipidet omfatter distea- roylphosphatidylcholin, det antineoplastiske middel omfatter 5-fluoruracil, forholdet mellem det antineoplastiske middel og lipidet er fra 0,1:1 til 3,0:1, og den frigørelsesinhiberende puffer omfatter natriumcarbonat/kaliumsulfat.

22. Liposom-sammensætning ifølge krav 1, hvori lipidet omfatter ægge- phospatidylcholin, det antineoplastiske middel omfatter daunorubicin, epiru-bicin eller mitoxanthron, forholdet imellem det antineoplastiske middel og lipidet er fra 0,1:1 til 3,0:1, end den frigørelsesinhiberende puffer omfatter cintronsyre/natriumcarbonat. 30

23. Liposom-sammensætning ifølge krav 1, hvori lipidet omfatter ægge-phosphatidylcholin, distearoylphosphatidylcholin eller hydrogeneret so-japhosphatidylcholin, det antineoplastiske middel omfatter vincristin, forholdet DK 174869 B1 55 imellem det antineoplastiske middel og lipidet er 0,1:1 to 3,0:1, og hvori den frigørelsesinhiberende puffer omfatter citronsyre/natrium-bis-phosphat.

24. Liposom-sammensætning ifølge et hvilket som helst af krav 20-23, hvori 5 lipidet endvidere omfatter cholesterol.

25. Liposomalt trekomponent-behandlingssystem, indeholdende et anti-neoplastisk middel, der omfatter en første vandig opløsning omfattende mindst et lipid suspenderet i vandig opløsning; en anden vandig opløsning 10 omfattende en relativt sur eller basisk opløsning; og mindst et antineoplastisk middel, hvori den første opløsning, den anden opløsning og det antineoplastiske middel er sammenblandet til at danne en liposom-sammensætning ifølge krav 1-24.

26. Liposomalt behandlingssystem, indeholdende et antineoplastisk middel ifølge krav 25, hvori pH i den første vandige opløsning er mellem 3,5 og 4,5.

27. Liposomalt behandlingssystem, indeholdende et antineoplastisk middel ifølge krav 25, hvori pH af den vandige opløsning er 4,0. 20

28. Liposomalt behandlingssystem, indeholdende et antineoplastisk middel ifølge krav 25, hvori den første vandige opløsning er citronsyre.

29. Liposomalt behandlingssystem, indeholdende et antineoplastisk middel 25 ifølge hvilket som helst af krav 25-28, hvori forholdet imellem det antineoplastiske middel og lipidet er fra større end 0,10:1 til 3:1.

30. System ifølge et hvilket som helst af krav 25-29, hvori pH af den første vandige opløsning er mellem 6,8 og 11,0 30

31. System ifølge krav 30, hvori pH er 9,6. DK 174869 B1 56

32. System ifølge et hvilket som helst af krav 25-31, hvori den første vandige opløsning omfatter natriumcarbonat.

33. System ifølge et hvilket som helst af krav 25-32 yderligere omfattende en 5 fjerde komponent omfattende en indfangningsindikatoropløsning.

34. Metode til bestemmelse af ikke-indfanget antineoplastisk middel i en lipo-sompræparation ifølge et hvilket som helst af krav 1-33 omfattende målinger af differentiel absorbance ved pH sensitive bølgelængder før og efter alkali- 10 sering eller forsuring.

35. Metode ifølge krav 34, hvori den differentielle absorbans måles ved sammenligning med et farvekort.

36. Metode til fremstilling af en liposom-sammensætning ifølge et hvilket som helst af krav 1-33, hvori liposomerne indføres via en transmembran pH-gradient omfattende trinnene: a) liposomformning i et først vandigt medie; 20 b) ændring af pH af det første vandige medium eksternt til liposomerne; og c) sammenblanding af produktet fra ovenstående trin b) med et ioniserbart antineoplastisk middel.

37. Metode ifølge krav 36, hvori trin b) og c) er kombineret. 25

38. Metode ifølge krav 36 eller 37, hvori den første vandige opløsning er citronsyre.

39. Metode ifølge krav 36 eller 37, hvori den anden vandige opløsning er re-30 lativt basisk.

40. Metode ifølge krav 39, hvori den basiske vandige opløsning er natriumcarbonat eller natrium-bis-phosphat. DK 174869 B1 57

41. Metode ifølge krav 36 eller 37, hvori den første vandige opløsning er na-triumcarbonat.

42. Metode ifølge krav 36 eller 37, hvori den anden vandige opløsning er re lativt sur.

43. Metode ifølge krav 42, hvori den relativt sure vandige opløsning er kali-umsulfat-HEPES eller svovlsyre. 10

44. Farmaceutisk sammensætning omfattende liposom-sammensætningen ifølge et hvilket som helst af krav 1-32 og en farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder.