DK175409B1 - Thermisk stabile og pH-stabile subtilisinanaloger og fremgangsmåder til fremstilling af disse - Google Patents

Description

DK 175409 B1 i

Opfindelsen angår fremgangsmåder til forbedring af den thermiske stabilitet og pH-stabiliteten af et Bacillus-subtilisin med en aminosyresekvens, der indeholder en Asn-Gly-sekvens.

5 Udtrykket subtillsin betegner en gruppe af ek- stracellulære alkaliske serin proteaser, der dannes af forskellige bacillusarter. Disse enzymer kaldes også Baclllus-serln-proteaser, Baclllus-substillsinforbin-delser eller bakterielle alkaliske proteaser.

10 Bacillus-subtlllsinmolekylerne består af en en kelt polypeptid kæde med enten 274 rester (for subtili-sin type Carlsberg dannet af Bacillus licheniformis og for subtilisin dannet af Baclllus-subtilis stamme DY) eller 275 rester (for sutilisin type BPN' dannet af 15 Bacillus amyloliquefaciens og aprA-genproduktet af Bacillus-subtilisin) . Til sammenligning af aminosyresek-venserne for subtilisin fra forskellige Bacillus-stammer anvendes sekvensen af subtilisin BPN1 som standard. På basis af en sammenligning af sekvenser, der giver den 20 højeste grad af homolog! mellem subtilisin Carlsberg og subtilisin BPN·, betegnes serinet ved den førstnævntes aktive sted f.eks som serin 221, skønt den findes ved position 220 af aminosyresekvensen. På samme måde kan position 220 af aminosyresekvensen af subtilisin 25 Carlsberg siges at svare til position 221 af subtilisin BPN*. Se f.eks. Nedkov et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537-1540 (1983).

Røntgenstrukturen af subtilisin BPN' (Wright, et al., Nature, 221, 235 (1969)) viste, at geometrien 30 af subtilisins katalytiske sted, der involverer Asp32,

His64 og Ser221, er næsten identisk med geometrien af mammale serinproteasers aktive sted (f.eks. chymo-trypsin), der involverer resterne Asp102, His57 og

I DK 175409 B1 I

I 2 I

I Ser195. De samlede forskelle mellem Bacillus serin- I I proteaser og mammale serinproteaser viser imidlertid at I I disse proteaser er to ubeslægtede familier af proteo- I I lytiske enzymer. I I 5 inden for familien af Bacillus-subtlllsln for- I I bindeiser er komplette aminosyresekvenser til rådighed I I for 4 subtilisin forbindelser: [Smith, et al., - I I J.Biol.Chem., 243, 21B4-2191 (1968)]; BPN·[Markland, et I I al., J. Biol.Chem., 242, 5198-5211 (1967)]; aprA- I I 10 genproduktet [stahl, et al., J.Bacteriol., 158, 411-418 I I (1984)]; og DY [Nedkov, et al., supra]. Subtilisin I

Carlsberg og subtilisin BPN' (af og til betegnet subti- . I I lisin Novo) adskiller sig ved 84 aminosyrer og en ek- I I strå rest i BPN’ (subtilin Carlsberg mangler en amino- I I 15 syre svarende til resten 56 i subtilisin BPN')· Smith et I I al. supra. Subtilisin DY har en længde på 274 aminosy- I

rer og adskiller sig fra subtilisin Carlsberg ved 32 I I aminosyrepostioner og fra subtilisin BPN' ved 82 ami- I I nosyreudskiftninger og l aminosyresletning (subtilisin I I 20 DY mangler en aminosyrerest svarende til resten 56 i I I subtilisin BPN'). Nedkov, et al., supra. Aminosyre- I

sekvensen af aprA-qenproduktet er 85% homologt med ami- I I nosyresekvensen af subtilisin BPN'. Stahl, et al., su- I I pra. Det ser således ud til, at der er en vidtstrakt I

25 homologi mellem aminosyresekvenserne for serinproteaser I I fra forskellige Bacillus-stammer. Denne homologi er I I fuldstændig i visse af molekylets regioner, især i de I I regioner, der spiller en rolle i den katalytiske meka- " I I nisme og ved substratbinding. Eksempler på sådanne ens I I 30 sekvenser er de primære og sekundære substratbindings- I I steder, henholdsvis I I Ser12^-Leu12^-Gly127-Gly128 og Tyr104 og sekvensen om- I I kring det reaktive serin (221) I I Asn218-Gly219-Thr220-Ser221-Met222-Ala223. I

3 DK 175409 B1

Subtilisinmolekylerne udviser nogle unikke stabilitetsegenskaber. De er ikke fuldstændigt stabile ved nogen pH værdi, skent de er relativt resistente mod denaturating med urinstof- og guanidinopløsninger, og 5 den enzymatiske aktivitet bevares i nogen tid, selv i en opløsning af 8 M urinstof. I opløsninger med en pH-værdi mindre end 4 taber subtilisin hurtigt og irreversibelt dets proteolytiske aktivitet. Gounaris, et al., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 35, 37 (1965), 10 viste, at syredeaktiveringen af subtilisin ikke skyldes en almen ladningseffekt, og fremsatte tanker om, at den skyldes andre ændringer i molekylet, såsom protonering af histidinresterne i den indre hydrofobe del af molekylet. I opløsning, ved en pH-værdi større 15 end 5, undergår Bacillus-serinproteaser gradvist irreversibel inaktivering med en hastighed, der øges med temperaturen og pH-værdien. Mekanismen ved denne inaktivering er ikke helt kendt, men der er tegn på, at autodigestion er ansvarlig i det mindste en del af en-20 zymustabiliteten i dette pH område.

Anvendelsen af proteaser ved industrielle processer, ved hvilke der kræves hydrolyse af proteiner, har været begrænset p.g.a. enzymets ustabilitet under anvendelsesbetingelserne. Inkorporering af trypsin i 25 tøjvaskemidler (f.eks. Bio-38, Schnyder; Schweiz) til lettelse af fjeneisen af proteinholdige farvestoffer havde således f.eks. en meget begrænset succes, som utvivlsomt var et resultat af enzymets ustabilitet under vaskebetingelserne. Det var først omkring 1960, efter 30 en indførelsen af anvendelsen af bakterielle alkaliske proteaser, som er mere forligelige med vaskemidler, at proteaser blev vidt anvendte indenfor vaskemiddelindustrien.

I DK 175409 B1 I

I 4 I

I Af praktiske grunde udføres mange Industrielle I

I processer ved temperaturer der ligger over stabilitets- I

I området for de fleste enzymer. Derfor er det rimeligt I

I at antage, at meget thermostabile proteaser ikke kun I

I 5 vil være hensigsmæssige for visse industrier, såsom I

I vaskemiddel- og skindafhåringsindustrien, som allere- I

I de kræver stabile proteaser, men at det også kan anven- I

des ved industrier, indenfor hvilke der anvendes kemi- I

I ske midler til hydrolyse af proteiner, f.eks. hydrolyse I

I 10 af vegetabilske og animalske proteiner til fremstilling I

I af suppekoncentrater. I

I Det skal imidlertid påpeges, at andre faktorer I

I end varme, såsom ekstreme betingelser med hensyn til I

pH, oxygen, og denatureringsmidler, kan have en afgø- I

I 15 rende virkning på begrænsning af anvendelsen af protea- I

I ser ved industrielle processer, skønt thermisk inakti- I

I vering er den vigtige enzyminaktiveringsmetode. Det er I

derfor ønskeligt at opnå proteaser, der er kendetegnet I

I ved forbedret stabilitet under anvendelsesbetingelser- I

20 ne indenfor forskellige industrier. Et sådant mål kan I

I opnås enten ved at søge efter nye, mere s'tabile I

I vildtype-enzymer eller ved stabilisering af allerede I

I kendte, eksisterende proteaser. I

I Selv om de alkaliske proteaser opnået fra Bacil- I

I 25 lus er mere forligelige med vaskemidler end pancreas- I

I proteaserne, er de stadig ikke ideele i alle henseen- I

I der. I

I løbet af de seneste mange år, har der været - I

store ændringer af vaskemiddelsammensætninger, især I

30 erstatning af phosphater med alternative buildere og I

I udviklingen af flydende vaskemidler til imødekommelse I

I af miljømæssige krav og forbrugerkrav. Disse ændringer I

skaber et behov for udskiftning af de traditionelle I

5 DK 175409 B1 vaskemiddelenzymer. Især er det blevet ønskeligt at anvende proteolytiske enzymer med større lagerstabilitet i flydende vaskemidler og stabilitet og aktivitet over større pH- og temperaturområder.

5 Ved en fremgangsmåde til fremstilling af modifi cerede subtilisinforbindelser til anvendelse i vaskemidler, som beskrevet i Europæisk patentansøgning nr.

130 756, identificeres mutationer i subtilisinet fra Bacillus amylollquefaciens (B. amyloliqruef aclens) ved 10 Tyr-1, Asp32, Asn135, Tyr104, Met222, Gly166, His64,

Gly169, Phe189, Ser33, Ser221, Tyr217, Glu156, og/eller Ala152 som givende ændret stabilitet, ændret konfor-mation eller havende ændringer i enzymets "processing".

I den forbindelse hævdes mutering af Met222 til Ala, 15 Cys (hvilken mutant også udviser et skarpere pH-optimum end vild-type forbindelsen) eller Ser at resultere i forbedret oxidationsstabilitet. Substitution af Gly166 med Ala, Asp, Glu, Phe, Hys, Lys, Asn, Arg eller Val synes at ændre enzymets kinetiske parametre. Der er 20 imidlertid ikke for nogle af mutationerne angivet, at de tilvejebringer analoger med større stabilitet ved højere temperaturer eller stabilitet over et bredere pH-område end vild-type enzymet.

Ved en anden fremgangsmåde fremgår det, at sub-25 tilisins pH-afhængighed kan ændres, Thomas,et al., Nature, 318, 375-376 (1985), ved udskiftning af Asp med Ser i Asp99-Gly108 i subtilisin BPN’. Denne udskiftning repræsenterer en ændring af en overfladeladning 14-15 Ångstrøm fra det aktive sted. Fremgangsmåden ifølge 30 Thomas, et al. viser imidlertid ikke tegn på en forbedring, hvor ingen ændring i overfladeladning opstår, som det er tilfældet hvor en uladet rest substitueres med en anden.

I DK 175409 B1 I

I I

I Det er nu blevet fundet, at man kan forbedre bå- I

I de den thermlske stabilitet og pH-stabiliteten for vis- I

I se Baclllus-subtllisiner ved en fremgangsmåde som oven- I

I for defineret, der er ejendommelig ved, at den omfatter I

I 5 udskiftning af en rest i den omtalte Asn-Gly-sekvens I

I med en anden aminosyrerest. Denne rest er foretrukket I

I asparaginylresten ved position 218 i aminosyresekvensen I

I for Bacillus-subtlllsin som vist på figur 1. En lignen- I

I de fremgangsmåde som ovenfor defineret og med samme I

I 10 formål er ejendommelig ved, at man sletter en rest i I

I denne Asn-Gly-sekvens. I

I Det bør bemærkes, at udtrykket "subtilisin'1 som I

I her anvendt refererer til den modne og udskilte form I

I for enzymet uden leader-sekvensen, der er fraspaltet I

I 15 det modne enzym før eller under udskillelsen. I

I Produkterne fra fremgangsmåderne ifølge opfin- I

I delsen har foretrukket en aminosyresekvens, i hvilken I

I ingen positioner omfatter en Asn-Gly-sekvens. I

I Mest foretrukket omfatter en position svarende I

20 til position 218 i aminosyresekvensen vist på figur 1 I

I ikke en asparaginylrest, men omfatter snarere en rest I

I fra en afvigende aminosyre og foretrukket fra en amino- I

syre valgt blandt serin, valin, threonin, cystein, glu- I

I tamin og isoleucin. Hvis erstatning af asparagin med - I

I 25 visse aminosyrer fører til vekselvirking med konforma- I

I tionen på det aktive sted (f.eks. på grund af sterisk I

I binding, der kan indføres på grund af nærvær af en aro- I

matisk aminosyre, eller ændringer i den tertiære struk- I

I tur, der eventuelt kan indføres ved nærvær af prolin), I

30 vii en substitution med sådanne aminosyrer normalt være I

I mindre foretrukket. Hvis på lignende måde en erstatning I

af asparagin med andre aminosyrer indfører ladede grup- I

I per (f.eks. asparaginsyre) i nærheden af det aktive I

7 DK 175409 B1 sted vil en sådan substitution heller ikke være attraktiv. En i øjeblikket foretrukket illustration af en analog fremstillet ifølge opfindelsen er en [Ser218]-analog af aprA-genproduktet. Andre udførelsesformer for 5 analoger fremstillet ifølge opfindelsen er sådanne, hvor Asn109 i subtilisin BPN' eller i aprA-genproduktet foretrukket erstattes med serin, og hvor glycinrester ved position 100 og/eller 219 erstattes af andre aminosyrerester. Denne opfindelse kan også omfatte 10 fremstilling af andre subtilisiner, i hvlilke der er sket substitution af Asn ved rest 62 eller af Gly ved rest 63 i subtilisin Carlsberg eller DY..

Et system til produktion af subtilisin ved hjælp af fremgangsmåder ifølge opfindelsen vil omfatte en 15 værtscelle, der selv omfatter nucleinsyre kodende for en som ovenfor omtalt analog af subtilisin. I en sådan celle kan den for subtilisin kodende nucleinsyre være kromosomal eller extrakromosomal. Værtscellen vælges foretrukket fra en stamme med defekter i udskilte pro-20 teaser, hvilket tillader en nem isolation af de analoge forbindelser.

Kort beskrivelse af tegningerne: 25 Fig. 1 viser skematisk ringsslutningen af Asn-

Gly-rester, som dem der findes ved positionerne 218 og 219 i subtilisin som angivet i tabel 1, til dannelsen af anhydroaspartylglycin, samt den basekatalyseret hydrolyse af dette.

30 Fig. 2 er et partielt restriktionskort for et aprA-gen, der indeholder et EcoRl-Kpnl-genfragment af Bacillus subtilis (B.subtilis) stamme QB127, og et partielt restriktions kort for aprA-genet og flankerende sekvenser.

I DK 175409 B1 I

I I

Fig. 3 er et partielt restriktionskort for I

I plasmid pAMBll. I

I Fig. 4 er et diagram, der viser stadierne ved I

I konstruktion af pAMB113, et plasmid der dirigerer syn- I

I 5 tese af [Ser]218-subtilisin fra B.subtlllsværtsceller. I

Fig. 5 er et partiel restriktionskort for pAMB30 I

I plasmid. I

I Baclllus-serinproteaser undergår irreversibel I

I 10 inaktivering i vandige opløsninger med en hastighed, I

der overvejende afhænger af temperaturen og pH-værdien. I

I Ved pH-værdier under 4 eller over 11 er inaktiverings- I

I hastigheden meget høj, medens den ved pH-værdier mellem I

I 4,5 og 10,5, skønt den er meget lavere, øges idet I

I 15 opløsningen bliver mere basisk. Subtilisin-deaktive- I

I ringshastigheden er i almindeligheden ved en hvilken I

I som helst pH-værdi højere, jo højere temperaturen er. I

I En konserveret Asn-Gly-sekvens ved postitionerne I

I 109-110 og især ved positionerne 218-219 af Bacillus I

I 20 substilisiner er heri identificeret som hovedfaktor for I

I disse forbindelsers pH-ustabilitet. Asn-Gly-sekvensen i I

I proteiner og peptider undergår let ringslutning under I

forskellige betingelser til dannelse af det cykliske I

I imid anhydroaspartylglycin [Bornstein, et al., Methods I

I in Enzymol., 47, 132-145 (1977)], som vist i fig. 1. I

I 25 Dette cykliske imid er følsomt for base-katalyseret hy- I

I drolyse, som fortrinsvis giver en ikke-nativ β- I

I aspartylpeptidbinding. Endvidere kan det cykliske imid I

I afledt af Asn-Gly tjene som et angrebspunkt for sped- I

I fik spaltning af subtilisin. Faktisk er den specifikke I

spaltning af proteiner ved Asn-Gly-bindinger med alka- I

I 30 lisk hydroxylamin blevet en almindelig praksis ved I

I fremstilling af proteinfragmenter med henblik på amino- I

I syresekvensering. [Bornstein, et al., supra]. I

DK 175409 B1 9

Dannelse af et cyklisk imid og/eller β-aspartylglycylpeptid ved Asn218-Gly219 1 subtilisin forudsiges at forårsage irreversibel inaktivering af enzymet. Denne forudsigelse er baseret på nærheden af det ustabile Asn-Gly-element med en reaktiv serinrest 5 ved position 221. En computeranalyse af proteinstrukturer førte til den antagelse, at omdannelsen af Asn218-Gly219 til enten anhydroaspatylglycyl eller til β-aspartyl-glycyl resulterer i en forskydning af sidekæden af Ser221 væk fra den stilling det må optage 10 for at enzymet er aktivt.

Til elimination af det ustabile element Ans218-Gly219 fra subtilisinmolekylet kan man udskifte Asn218 med en vilkårlig anden aminosyre end asparagin og/eller udskifte Gly219 med en vilkårlig anden amino-15 syre end glycin. På en lignende måde forventes modifikation af det ustabile Asn-Gly-element ved positionerne 109-110 at give fordele med hensyn til stabilitet af analogerne ifølge opfindelsen.

Den observerede uforanderlighed af subtilisiner 20 og subtilisinlignende enzymer med hensyn til Gly219 [f.eks. Cucumisin fra melonen Cucumis Melo L. var Prince, Kaneda, et al., J. Biochem., 95, 825-829 (1984); og proteinase K, en subtilisinlignende serinprotease fra fungusen Trltirachlum album, Jany et al., Biol. Chem.

25 Hoppe-Seyler, 366, 485-492 (1985)] og den antagelse, at sidekæden ved Gly219, hvis den var en vilkårlig anden rest end glycin, kunne interfere med bindingen af et substrat til enzymet, gør at udskiftningen af Asn218 i stedet for Gly219 i høj grad er ønsket til 30 fjernelse af den ustabile Asn218-Gly219-sekvens.

På basis af teoretiske betragtninger og registrering og analyse af sekvenseringsdata, udskiftedes I DK 175409 B1 I 10 H asparagin ved position 218 med serin ved den på nuvær- ende tidspunkt fortrukne udførelsesform ifølge opfin- delsen som beskrevet i de følgende eksempler. Denne udvælgelse var delvis baseret på den observation, at 5 aminosyresekvensen omkring det reaktive serin i cucumi- I sin. der er et subtilisin-lignende enzym fra melonfrug- ter, havde sekvensen Ser-Gly-Thr-Ser-Met (Kaneda, et al«, supra). Proteinase K har den samme sekvens omkring I det aktive sted. Jany et al., supra. Det skal imidler- 10 tid fremhæves, at valget af serin som substituent for I Asn218 ikke udelukker opnåelse af det samme mål, dvs.

elimination af det ustabile element Asn218-Gly219, ved udskiftning af asparagin ved position 218 med en anden aminosyre. Det foretrækkes, at en uladet alifatisk 15 aminosyre, såsom valin, threonin, cyctein, glutamin el- | ler isoleucin substituerer Asn218.

Bacillus-mikroorganlsmer præsenterer pga. af deres evne til at udskille væsentlige mængder af pro- I teiner og fordi de idag anvendes til fremstilling af 20 vaskemiddelproteaser en foretrukket vært til rekombi- nant fremstilling af [Ser218]-subtilisin ifølge opfin- I delsen. Idet de fleste Bacilli udskiller alkaliske og neutrale proteaser, foretrækkes det at foretage dan- I nelse af mutationer i generne for de endogene alkaliske I 25 og neutrale protease i B.subtilis,således at det mute- rede subtilisin kan dannes og udskilles af B.subtilis i I et medium, der er frit for andre proteaser. Der tilve- jebringes således ifølge opfindelsen mutantstammer af I B.subtilis, der er blokeret med hensyn til syntese af I 30 endogene proteaser, men som bevarer evnen til at synte- I tisere og udskille subtilisin analoger, såsom I [Ser218]-subtilisin.

I Som beskrevet mere detaljeret i det følgende vi- I ste det sig, at pH-stabiliteten og den termiske stabi- 11 DK 175409 B1

Iltet og stabiliteten 1 vaskemidler af [Ser218]-aprA-genprodukt-subtillsln er meget større end af vildtype-aprA-genproduktsubtlllsln.

Fremstillingen af en stabil subtilisinanalog 5 ifølge opfindelsen omfattede de følgende trin: 1. Isolation af det repræsentative subtilisingen aprA fra B.subtllls.

2. Kloning af aprA-genet på en vektor, der mu- 10 liggør udnyttelse af oligonucleotid-stedsdirige- ret mutagenese til opnåelse af de ønskede modifikationer.

3. Stedsdirigeret mutagenese og sekvensering af det resulterende DNA til bekræftelse af den ønskede 15 mutations forekomst.

4. Konstruktion af en ekspressionsvektor til at styre syntesen af det muterede enzym i B.subtilis.

5. Konstruktion af muterede B.subtilis-stammer, som 20 ikke syntetiserer subtilisin og neutral-protease.

6. Isolation af enzymet i det ekstracellulære vækstmedium og rensning af enzymet.

7. Bestemmelse af det isolerede produkts stabilitets- og aktivitetsegenskaber.

25 8. udførelse af metoder til indføjelse af genet, der koder for det forbedrede enzym, i kromosomet af en B. subtil is stamme, der i forvejen var imiteret til blokering af syntese af endogene pro-teaser.

30 I eksempel 1 isoleres aprA-genet, der koder for subtilisin, fra B.subtllls-qenomet. I eksempel 2 udsættes aprA-genet for stedsdirigeret mutagenese. I eksempel 3 konstrueres en ekspressionsvektor indeholdende

I DK 175409 B1 I

I 12 I

I det muterede aprA-gen. I eksempel 4 konstrueres to mu- I

I tant stammer af B.subtllls, som ikke danner påviselige I

I mængder ekstracellulære proteaser. I eksempel 5 bes- I

krives metoder til integration af et muteret aprA-gen i I

I 5 kromosomet af B.subtilis. I eksempel 6 isoleres og ren- I

ses vild-type- og mutant-aprA-subtllislner. I eksempel I

I 7-10 sammenlignes termostabiliten af [Ser218]-sub- I

tilisin med termostabiliteten af vlldtype-aprA-gen- I

I produktet og et kommercielt BPN'-produkt. I

I 10 I

Eksempel 1 I

I B.subtilis stamme QB127 (trpC2 leuA8 sacUh200) I

I [Lepesant, et al., Molec. Gen. Genet., 118, 135-160 I

I 15 (1982)] erhvervedes fra Bacillus Genetic Stock Center I

I ved Ohio State University, Columbus, Ohio. Denne stamme I

overproducerer ekstracellulære serin- og metalprotea- I

ser, a-amylase og levansucrase i forhold til isogene I

I sacU+ - stammer pga. sacU^200-mutationens pleiotrope I

I 20 virkning [Lepesant, et al., i Schlessinger, D., I

I ed., Micorbiology, 1976, Ammerican Society for Micro- I

I biology, Washington, D.C., s.65, (1976)]. Stamme QB127 I

I opfattedes således som en passende kilde for DNA til I

I isolation af aprA-qenet, der koder for subtilisin. I

I 25 Genom-DNA isoleredes fra celler af B.subtilis I

I stamme QB127 ved en kendt fremgangsmåde [Saito, et al., I

I Biochim. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)]. Renset I

I kromosomalt DNA digesteredes fuldstændigt med EcoRl- I

I restriktionsendonuclease. I

I 30 DNA-fragmenterne adskiltes på en agarosegel med I

I lavt smeltepunkt ved elektroforese, og fragmenterne i I

I 4,4 til 8,0 kilobaseområdet isoleredes ved en standard- I

I DNA-isolationsmetode som anbefalet af leverandøren I

13 DK 175409 B1 (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland). Disse fragmenter ligeredes til pCFM936 deponeret som nr. 53 413 ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, den 5 13. januar 1986, et Escherichia coli (E.coll) "walkaway"-plasmid, som udviser højere kopiantal ved forhøjede temperaturer, og som giver kanamycinresistens.

Vektoren digesteredes med EcoRI og dephosphory-leredes med alkalisk kalvetarmphosphatase inden lige-10 ringen.

Ligeringsprodukterne indførtes i E.coll C600 (tilgængelig som A.T.C.C. 23724 fra American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland), og kanamycin-resistente værtsceller udvalg-15 tes efter inkubation natten over på L-agar suppleret med 10 yg/ml kanamycin. Plasmid-DNA forstærkedes ved inkubationen af værtcellerne ved 42°C i fire timer. Kolonierne overførtes dernæst til nitrocellulosefiltre og behandledes ved en fremgangsmåde betegnet kolonihy-20 bridisering beskrevet af Grunstein, et al., Proc.Natl. Acad.Sci. (USA), 72, 3961 (1975).

En probe anvendtes til screening for kolonier, som indeholdt subtilisingenet på pCFM936. Proben [syntetiseret ved phosphitkemi-metoden ifølge Beaucage, 25 et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862 (1981)] havde nucleotidsekvensen (1) 5'GCGCAATCTGTTCCTTATGGC 31, der svarer til aprA-genproduktets aminoterminus (Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1184-1188, 30 (1984), Stahl, et al., J. Bacteriol., 158, 411-418 (1984). Der anvendtes en hybridiseringstemperatur på 55°C, og 5 positive kloner identificeredes ud af i alt 400. Plasmid-DNA'et fra en af de positive kolonier betegnedes pCFM936 apr2.

I DK 175409 B1 I

I 14 I

I Plasmidet pCFM936 apr2 digereredes med EcoRl I

I alene, med Hlndlll alene og med EcoRl og Hlndlll I

I sammen. Størrelserne af EcoRl-fragmenterne af subtili- I

s ingenet stemte med dem der er beskrevet i Stahl, et I

I 5 al., supra, men adskillige ellers ubeskrevne Hindm- I

steder opdagedes. Som beskrevet i eksempel 3 anvendtes I

I 2 af HindiII-stederne til genetisk manipulation af sub- I

I tilisingenet. I

I Det bestemtes, at et stort 6,5 kb EcoRl-fragment I

10 af B.subtilis QB127-genom-DNA bar aprA-genet, dets re- I

I gulatoriske sekvens og ubeslægtede flankerende sekvenser I

ved bekræftelse af, at restriktionsenzymdigesterings- I

I produkterne stemte overens med resultaterne reporteret I

I af Stahl, et al., supra. Det bekræftedes ved DNA- I

I 15 sekvensering ved anvendelse af dideoxykædeterminerings- I

metoden [Sanger, et al., J. Mol. Biol., 143, 161-178 I

I (1980)]. Et 3,0 kb EcoRl til Kpnl-underfragment af det I

6,5 kb EcoRl-fragment, som vist i fig. 2, viste sig I

I også at indeholde aprA-genet, dets regulatoriske sek- I

I 20 venser og ubeslægtede flankerende sekvenser. Skønt I

I Kpnl-EcoRI-fragmentet er beskrevet med en længde på I

I 2,5 kb i teksten af Stahl et. al., og i forklaringen I

til fig. 1 i denne, viste en sammenligning af størrel- I

I sen af sekvensen i fig. 1 og den afbillede sekvens af I

I 25 fragmentet i denne tekst, at Kpnl-EcoRI-fragmentet I

I også i Stahl, et al. er væsentligt større end 2,5 kb. I

I En kloningsvektor fra Baclllus-værtssystemet, I

I plasmid pAMBll, konstrueredes som følger. Plasmidet I

I pTG402 (Northern Regional Research Laboratories, United I

I 30 states Department of Agriculture, Peoria, Illinois, I

I stamme nr. NRRL B-15264) digesteredes delvis med Rsal I

I restriktionsendonuclease. Fragmenterne ligeredes til I

Ml3 mp!8 (tilgængelig fra Bethesda Research Laboratori- I

15 DK 175409 B1 es, Gaithersburg, Maryland som katalog nr. 8227SA), der 1 forvejen var digesteret med Hindi. Ligationsprodukterne indførtes i E.coll JM103 (tilgængelige fra Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey som katalog nr.

5 27-1545-01) ved transformation (Mandel, et al., J. Mol.

Blol., 53, 154, (1970)). Bacteriophage plaques sprøjtedes med 0,5M catechol (præpareret i destilleret vand) til påvisning af den funktionelle expression af xylE-genet opnået ud fra pTG402. xylE-Genet koder for cate-10 chol 2,3-dixoygenase og er nyttigt til påvisning af promotorer i mange forskellige organismer. Zukowski, et al., Proc. Natl. Åcad. Sci. (USA). 80, 1101-1105 (1983).

xylE-Genet overførtes dernæst som et 1,0 kb*s 15 EcoRI til Pstl-fragment til E.coli/B.subtllis plasmid phV33 (tilgængelig fra the American Type Culture Collection som A.T.C.C. 39217) [Primrose, et al.. Plasmid, 6, 193-201 (1981)] opnået fra R. Dedonder (Institut Pasteur, Paris, Frankrig). Dette pHV33-plasmid var i for-20 vejen digesteret med EcoRI og PstI, således at det xylE-holdlqe fragment, når det ligeredes i denne region, ville inaktivere et gen for ampicillinresistens.

Det resulterende plasmid pAMB21 indeholder et funktionelt xylE-gen i E.coll værtceller, men kræver tilføjel-25 se af en promotor til ekspression af xylE i B.subtillis værtceller. E.coll-cellerne indeholdende pAMB21 er resistente mod tetracyclin (15 ug/ml) og chloramphenicol (20 ug/ml), mens B. subtills-celler indeholdende pAMB21 kun er resistente mod chloramphenicol (5 ug/ml).

30 Bacteriophag lambda's toop-transskrlptlons ter- mineringssekvens overførtes dernæst fra plasmid pCFM936 (på et 400 basepar PstI til Bglll-fragment) til pAMB21's unikke Pstl-sted. Et syntetisk nucleotid I DK 175409 B1 I 16

I med sekvensen 5' GATCTGCA 3' konstrueredes til binding I

I af toop-fragmentets Bglll-yder punkt til Pstl-stedet i I

I vektoren pAMB21. Det resulterende plasmid betegnedes I

pAMB22 og havde egenskaber identiske med pAMB21, bort- I

5 set fra inkluderingen af en transskriptionsterminator. I

Dette pAMB22-plasmid er nyttigt til påvisning af stærke I

promotorer, der virker i B.subtills. I

I Det 1,4 kb EcoRI til Bglll-fragment af DNA I

H fra pAMB22,’der indeholder xylE og toop, isoleredes fra I

I 10 en agarose med lavt smeltepunkt efter elektroforese af I

H de restrikstionsenzymbehandlede fragmenter. Dette 1,4 I

kb stykke af DNA ligeredes til plasmid pBD64 (tligaen- I

I geligt fra Bacillus Genetic Stock Center, nr. 1E22), I

H der i forvejen var digesteret med EcoRI og BamHl. Det I

I 15 resulterende 5,3 kb plasmid, pAMBll, indeholder I

I M13mpl8's polylinkersekvens (EcoRI, SstI, Xmal, Sma, I

BamHl og Xbai) opstrøms for xylE-genet, der efterfølges I

af toop som vist i fig. 3. pAMBll-Plasmidet kan repli- I

H kere i B. subtilis og bibringer værtcellerne resistens I

20 mod chloramphenicol (5 yg/ml) og/eller kanamycin (5 I

yg/ml). I

I Som vist i fig. 4 klonedes det rensede EcoRI til I

I KpnI-fragment indeholdende aprA på pAMBll til dannelse I

I af pAMPlll. Ligationsprodukter indføjes i B.subtilis I

I 25 MI112 (arg-15 leuB thr5 recE4) (tilgængelig fra Bacil- I

lus Genetic Stock Center as Nr. 1A423) ved protoplast- I

I transformationsmetoden [Chang, et al., Mol. Gen. I

I Genet., 168, 111-115 (1979)]. B.subtilis MI112 uden I

plasmid-DNA har proteaseudskillende evne (Prt+-fæno- I

I 30 type), men de udskilte mængder subtilisin er temmelig I

I små. Chloramphenicol-resistente (Cmr) transformanter I

I overførtes til L-agarplader suppleret med 1,5% I

I (vægt/vol) skummetmælk og 5 yg/ml chloramphenicol, og I

inkuberedes dernæst ved 37°C . I

17 DK 175409 B1

Efter inkubationen natten over (omtrent 16 timer) ved 37°C dannede kolonier af MI112 indeholdende det nye rekombinante plasmid (betegnet pAMBlll) en klar ring omkring hver koloni. Ringene dannedes ved den pro-5 teolytiske virkning af subtilisin på caseinkomponenten i skummetmælket tilsat mediet. Mill2 indeholdende pAMBll-vektoren alene gav ingen synlige ringe efter 16 timer, skønt en svag ring tilsidst udvikledes efter 40 timer ved 37°C . Celler bærende pAMBlll adskilte sig 10 klart fra cellerne bærende pAMBll ved en forskel i ringstørrelsen. Kloningen af aprA-genet i en fuldt funktionel form vistes således at have medført produktion og udskillelse af store mængder subtilisin fra B.subtilis.

15

Eksempel 2

Som vist nærmere i fig. 4 digesteredes 3,0 kb EcoRI til Kpnl-genomfragment, hvis isolation er beskre-20 vet i eksempel 1, med Hindlll til dannelse af 3 fragmenter: (1) et 1,1 kb i EcoRI til HindIII-fragment bærende genetiske, regulatoriske sekvenser for aprA-gen-ekspression, genets "pre-pro"-region, der kræves til ekstracellulær udførsel af subtilisin, og DNA-sekvensen 25 der koder for det modne subtilisins første 49 aminosyrer; (2) et 1,1 kb Hindlll til HindIII-fragment bærende DNA-sekvenser, der koder for aminosyrerne 50-275 (carboxyl-terminus) af subtilisin sammen med en trans-criptionstermineringssekvens og 3'-ikke-kodende se-kvenser; og (3) et 0,8 kb Hindlll til Kpnl-fragment indeholdende 3 *-ikke-kodende sekvenser.

Dette 1,1 kb fragment flankeret af Hindlll-steder klonedes til det enkelte Hindlll i bakteriophag

I DK 175409 B1 I

I 18 I

Ml 3 mpl8 med henblik på DNA-sekvensering og stedsdiri- I

geret mutagenese. En af rekomblnanterne betegnet Ml 3 I

I mpl8 apr2 frembød enkeltstrenget template-DNA, der er I

I nødvendigt til stedsdirigeret mutagenese af aprA-genet. I

I 5 Den kodende region af aprA-genet sekvenseredes, I

I og. resultatet af denne sekvensering er vist i tabel li I

I det følgende. Det skal bemærkes, at den specifikke I

I identitet af leaderregionens første 5 codoner skyldes I

I den af Stahl, et al., supra, og Wong, et al., supra, I

I 10 givne sekvensinformation for aprA-genet, og det faktum, I

I at der er forskelle mellem codonsekvenserne ifølge I

I Stahl, et al., supra, og aminosyresekvenspositionerne I

I 84 og 85 kan være resultat af sekvenseringsfejl hos I

I forfatterne til Stahl, et al-, supra, artiklen eller I

I 15 kan være resultatet af en forskel i nucleotidsekvensen I

for de anvendte stammer. Stahl et al., supra beskriver I

I specifikt et codon GTT (koder for valin) ved aminosyre- I

I positionen 84, mens kodonet GTA (der også koder for va- I

I lin) fremgår af tabel 1. Stahl, et 1., supra, angiver I

I 20 også et kodon AGO (der koder for serin) ved aminosyre- I

I positionen 85 i modsætning til kodonet GCG (der koder I

I for alanin) i tabel 1. I

19 DK 175409 B1 TABEL 1 -105

fMet Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala GTG AGA AGC AAA AAA TTG TG G AT C AGC TTG TTG TTT GCG

5

Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala

TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCG TTC AGC AAC ATG TCT GCG

Gin Ala Ala Gly Lys Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val

CAG GCT GCC GGA AAA AGC AGT ACA GAA AAG AAA TAC ATT GTC

10

Gly Phe Lys Gin Thr Met Ser Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys

GGA TTT AAA CAG ACA ATG AGT GCC ATG AGT TCC GCC AAG AAA

Lys Aso Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly Lys Val Gin Lys Gin

AAG GAT G TT ATT TCT G AA AAA GGC GGA AAG GTT CAA AAG CAA

Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu Asp Glu Lys

TTT AAG TAT GTT AAC GCG GCC GCA GCA ACA TTG GAT GAA AAA

Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr Val

20 GCT GTA AAA G AA TTG AAA AAA GAT CCG AGC GTT GCA TAT GTG

-1 +1

Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gin Ser Val Pro

GAA GAA GAT CAT ATT GCA CAT GAA TAT GCG CAA TCT GTT CCT

10 25 Tyr Gly Ile Ser Gin Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gin

TAT GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG CCG GCT CTT CAC TCT CAA

20 30

Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser

GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA AAA GTA GCT GTT ATC GAC AGC

40 30 Gly Ile Asd Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly

GGA ATT GAC TCT TCT CAT CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA

50 60

Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gin Asd Gly GCA AGC TTC GTA CCT TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC 1 70

Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu

AGT TCT CAC GGT ACG CAT GTA GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT

I DK 175409 B1 I

I 20 I

I TABEL 1 (fortsat) I

I BO I

I Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val £la Pro Ser Ala Ser I

I 5 AAT AAC TCA ATC GGT GTT CTG GGC GTA GCG CCA AGC GCA TCA I

I 90 100 I

I Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gin I

I TTA TAT GCA GTA AAA GTG CTT GAT TCA ACA GGA AGC GGC CAA . I

I 110 I

I Tyr Ser Tm Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn I

I 10 TAT AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCC ATT TCC AAC I

I 120 130 I

I Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly I

AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT ACT GGT I

I 140 I

I 15 Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asd Lys Ala Val Ser Ser I

I TCT ACA GCG CTG AAA ACA GTC GTT GAC AAA GCC GTT TCC AGC I

I 150 I

I Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser I

I GGT ATC GTC GTT GCT GCC GCA GCC GGA AAC GAA GGT TCA TCC I

I 20 160 170 I

I Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser I

I GGA AGC ACA AGC ACA GTC GGC TAC CCT GCA AAA TAT CCT TCT I

I 180 I

I Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gin Arg Ala I

I ACT ATT GCA GTA GGT GCG GTA AAC AGC AGC AAC CAA AGA GCT I

I 25 190 200 I

I Ser Phe Ser Ser Ala Gly Ser Glu Leu Asd Val Met Ala Pro I

I TCA TTC TCC AGC GCA GGT TCT GAG CTT GAT GTG ATG GCT CCT I

I 210 I

I Gly Val Ser Ile Gin Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly I

I GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGC I

I 30 I

I 220 I

I Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly I

I GCT TAT AAC GGA ACG TCC ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC GGA I

I 230 240 I

I Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn I

I 35 GCA GCA GCG TTA ATT CTT TCT AAG CAC CCG ACT TGG ACA AAC I

I 250 I

I Ala Gin Val Arg Asd Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu I

I GCG CAA GTC CGT GAT CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTT I

21 DK 175409 B1 TABEL 1 (fortsat) 260 270 5 Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gin

GGA AAC TCT TTC TAC TAT GGA AAA GGG TTA ATC AAC GTA CAA

275

Ala Ala Ala Gin OC

GCA GCT GCA CAA TAA TAGTAAAAAGAAGCAGGTTCCTCCATACCTGCT

10 TCTTTTTATTTGTCAGCATCCTGATGTTCCGGCGCATTCTC

I DK 175409 B1 I

I 22 I

I Stedsdirigeret mutagenese udførtes ved en stan- I

I dardmetode. Norrander, et al., Gene. 26, 101-106 I

I (1983). Enkeltstrenget DNA fra Ml3 mpl8 apr2 anneales I

I til den mutagene primer. I

I 5 (2) 5' GGCGCTTATAGCGGAAC 3' I

I som syntetiseredes ved phosphitkemimetoden (Beaucage, I

I et al., supra). Den syntetiske primer var homolog med I

I codonerne for aminosyrerne 216 til 220 i subtilisin, I

I bortset fra en enkelt baseudskiftning i codonet for I

I 10 aminosyren 218 (AGC istedet for AAC). En sådan ændring I

I medførte den mutagene reaktion til indføjelse af et se- I

I rinkodon ved position 218 i stedet for det oprindelige I

I asparagincodon ved denne position. I

I Den syntetiske primer blev annealet til Ml3 mpl8 I

I *5 apr2-DNA ved 65°C inden den langsomt afkøledes til I

I stuetemperatur (ca. 22°C ). Dernæst fulgte polymerisa- I

I tion i 2 timer ved 15eC i en reaktionsblanding, der I

I bestod af 12,5 μΐ annealet DNA-opløsning, 2,5 μΐ lOmM I

I af hver af dATP, dGTP, dCTP og dGTP, 2,0 μΐ 12 mM ATP, I

I 20 ο,ΐ μΐ Klenow DNA-polymerase, 0,1 μΐ T4-DNA-ligase og I

I 13 μΐ sterilt, destilleret vand. Det resulterende I

I dobbeltstrengede, kovalent lukkede, cikulære DNA ind- I

I førtes i E.coli JM103 ved transfektion. I

I Bacteriophagplagues overførtes dernæst til Gene I

I 25 Screen hybridiseringsmembraner (New England Nuclear, I

I Beverley, Massachusetts).' Plagues, der indeholdt DNA I

I med den ønskede baseændring, identifiseredes ved hy- I

I bridisering med radioaktivt mærket (y-82P) syntetisk I

I oligonucleotid (2) anvendt til den mutagene primings- I

I 30 reaktion beskrevet ovenfor. Hybridiseringen udførtes I

I ved en sådan reaktionstemperater (52eC), at kun DNA- I

I bærende Ser218-mutationen ville hybridisere med det I

I syntetiske oligonucleotid. Forekomsten af Ser218-mu- I

23 DK 175409 B1 tationen i aprA-genet på DNA fra en enkelt, renset plaque betegnet Ml3 rnpl8 apr2 [Ser]218 bekræftedes ved DNA-sekvensering ved fremgangsmåden ifølge Sanger et al., supra.

5

Eksempel 3

Til ekspressionen af [Ser218]-subtilisin i B.subtilis, konstrueredes en egnet plasmidbærer ved 10 digestering af pAMBlll med Hindlll. Det 1,1 kb segment bærende det meste af aprA-genet blev fjernet ved religering af Hindlll-digestionsprodukter af pAMBlll ved en koncentration på ca. 1 yg/ml. Dette resulterede i dannelsen af pAMBUO som vist i fig. 4.

15 pAMBUO-Plasmidet bærer genetiske regulatoriske sekvenser til ekspression af subtilisingenet, "pre-pro"-re-gionen, der er nødvendig til sekretion af subtilisin, og DNA-sekvensen, der koder for den 3'-ikke-kodende region af modent subtilisin og det modne subtilisins før-20 s te 49 aminosyrer. pAMBUO syntetiserer ikke subtilisin, når det indføres i B.subtilis værtceller, idet det mangler DNA, der koder for aminosyrerne 50 til 275. Subtilisin syntiliseres kun efter indføjelse af resten af subtilisingenet, enten den native DNA-sekvens eller 25 en analog kodende sekvens som sekvensen, der koder for [Ser218]-subtilisin.

Dobbeltstrenget DNA fra M13 mp!8 apr2 [ser]218 digesteredes med Hindlll. Et 1,1 kb fragment bærende aprA-gensegmentet med Ser218-mutationen ligeredes der-30 næst til pAMBUO, som i forvejen var digesteret med Hindlll. Ligationsprodukterne indførtes i B.subtllls ved transformation som i eksempel 1 i det foregående. Ligation af 1,1 kb Hindlll fragmentet i den korrek- I DK 175409 B1 I 24

te orientering (som bekræftet ved DNA-sekvensering ved I

frangangsmåden Ifølge Sanger et al., supra) til ek- I

spression af det muterede gen resulterede i konst mk- I

tion af pAMBH3, et plasmid, som styrede syntese og se- I

I 5 kretion af [Ser218]-subtilisin fra B.subtilis værtcel- I

I ler. I

Eksempel 4 I

I 10 Idet de fleste Bacilli udskiller alkaliske I

og/eller neutrale proteaser til det omgivende vækst- I

medium, foretrækkes det at fremkalde mutationer i I

B.subtllls's gener for endogene alkaliske og neutrale I

I proteaser til blokering af syntese af disse, således at I

I 15 muterede subtilisengener, når de indføres i mutantcel- I

I len, kan danne muterede subtilisiner, som derefter vil I

I udskilles i et medium, der er frit for andre proteaser, I

med tendens til at påvirke isolation af intakte I

I subtilisinanaloger. To mutante B.subtilis stammer BZ24 I

20 og BZ25, der ikke danner påviselige mængder ektracellu- I

lære proteaser, konstrueredes på følgende måde. I

I Først konstrueredes en plasmidbærer, der var i I

I stand til at replikere i E.coll, men ikke i B.subtilis, I

hvis den ikke var integreret i B.subtills-kromosomet I

25 ved homolog rekombination, som følger. Plasmid pBD64 I

(Bacillus Genetic Stock Center, nr. 1E22) digesteredes I

I fuldstændigt med Hpall til dannelse af 3 fragmenter med I

I en størrelse på 2,95 kb, 1,0 kb og 0,75 kb. Disse frag- I

I menter ligeredes dernæst som en blanding til plasmid I

I 30 pBR322 (A.T.C.C. 37017), som i forvejen var digesteret I

I med ClAI. Ligationsprodukterne indføjes i E.coli C600 I

I (tilgængelig fra The American Type Culture Collection I

I som A.T.C.C. 23724) ved transformation (Mandel, et al., I

25 DK 175409 B1 J. Mol. Biol, 53/154 (1970)). Der udførtes selektion for celler, der var resistente mod chloramphenicol (20 yg/ml) og ampicillin (50 pg/ml). Plasmid DNA fra 12 tranformanter fremstilledes ved den alkaliske ekstrak-5 tionsmetode, (Birnboim, et al., Nudele Acids Res., 7, 1513-1523 (1979)), og digesteredes dernæst med Hindm og EcoRI i kombination til verificering af forekomsten af de(t) indføjede fragment(er). Et sådant plasmid, betegnet pAMB30, viste sig at bære 1,0 og 0,75 kb 10 Hpall-fragmenter af pBD64 i pBR322's Clal-sted. Disse fragmenter indeholdet chloramphenicol acetyltrasferase-genet (cat-genet), som er funktionelt i E.coll og B.subtllls. Digestering med Bqlll og separat med Sau3A bekræftede identiteten og orienteringen af cat-genet på 15 pAMB30 som vist i fig. 5.

Da pAMB30 mangler en replikationsstartsteds-sekvens, som er funktionel i B.subtilis, kan det ikke replikere som et autonomt replikon i B.subtllis-værtceller. På den anden side indeholder pAMB30 repli-20 kationsstartsstedet opnået ud fra pBR322, som er funktionelt i E.coli, hvorfor plasmidet kan propageres i E.coli værtceller. Plasmid pAMB30 er nyttigt på mindst 2 måder. For det første kan et DNA-fragment som indeholder et funktionelt replikationsstartsted i B.sub-25 tilis, påvises, når det klones på pAMB30, således at plasmidet autonomt vil replikere i den ekstrakromo-somale tilstand. For det andet kan plasmid pAMB30 integreres i genomet af B.subtilis ved et sted, hvor der er homologi mellem kromosomet og B.subtllls-DNA klonet på 30 pAMB30. En sådan begivenhed er tidligere vist gentagne gange (Haldenwang, et al., J.Bacteriol., 142, 90-98 (1980); Young, J.Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983)) ved anvendelse af plasmidbærere, der ligner, men ikke er identiske med pAMB30.

I DK 175409 B1 I

I 26 I

I Plasmid pAMB21 (beskrevet i eksempel 1) digeste- I

I redes med EcoRI og PstI til isolation af xylE-genet på I

I et 1,0 kb fragment. Fragmentet ligeredes til pAMB30, I

I som i forvejen var digesteret med EcoRI og PstI. Liga- I

I 5 tionsprodukterne indføjedes i coll C600 ved trans- I

I formation. Der udførtes selektion for chloramphenicol- I

I resistente (20 pg/ml) værtceller, som var følsomme over I

I for apicillin (50 yg/ml) pga af indføjelsen af xylE- I

I fragmentet af pAMB2l i det strukturelle gen for ampi- I

I 10 cillinresistence i pAMB30. Det resulterende plasmid, I

I PAMB30/21, har egenskaber, der er identiske med egen- I

skaberne for pAMB30, men har desuden et funktionelt I

I xylE-qen. I

I Plasmid pAMBUO, som bærer aprA-genet, som er I

I 15 udeladt af en region, der koder for det modne subtili- I

sins sidste 226 aminosyrer, digesteredes med EcoRI og I

I Kpnl. Det 1,9 kb B^ subtilis-DNA-fragment indeholdende I

I genetiske regulatoriske sekvenser for aprA-genekspres- I

I sion, "pre-pro"-regionen, DNA-sekvensen, der koder for I

20 det modne subtilisins første 49 aminosyrer, og 3'-ikke- I

kodende sekvenser, ligeredes til pAMB30/21, der i for- I

I vejen var digesteret med EcoRI og Kpnl. Ligationspro- I

dukterne indføjedes i coll C600 ved transformation. I

Plasmid-DKA fra adskillige transformanter isoleredes I

25 ved den alkaliske ekstraktions metode ifølge Birnboim, I

I et al., supra, og forekomsten af det indføjede 1,9 kb I

I fragment verificeredes ved digestering med et antal I

I restriktionsendonucleaser. Et sådant plasmid, betegnet I

I pAMB301, gemtes til yderligere anvendelse. I

I 30 B_^ subtilis stamme BGSC1A274 (Bacillus Genetic I

I Stock Center) bærer en mutation ved npr-locus og er I

I ude af stand til at danne ekstracellulær, neutral I

I protease. Plasmidet pAMB301 integreredes i genomet af I

27 DK 175409 B1 B.subtilis BGSC1A274 ved transformation af kompetente celler [spizizin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 44, 1072-1078 (1958)]. Der udførtes selektion for chloramphenicol-resistente (5 yg/ml) værtceller, som 5 dernæst med sterile tandstikkere overførtes til L-agar suppleret med 1,5% (v/w) skummemælkspulver og (5 y/ml) chloramphenicol. De celler, der ikke dannede en klar ring omkring kolonien, manglede evnen til at danne ek-stracellulære neutrale proteaser og serinproteaser 10 pga. kombinationen af npr-mutatlonen og den nyligt indførte aprA-mutation. aprA-Mutationen var en sletning af det modne subtilisins sidste 226 aminosyrer pga udskiftningen af vildtype aprA-genet med versionen med deletion båret på pAMB301. En sådan stamme betegnet BZ24 15 har Npr" Apr" Cmr fænotype, og danner således ikke påviselige ekstracellulære neutrale proteaser eller ek-stracellulære alkaliske proteaser og er resistent mod chloramphenicol i en mængde på 5 yg/ml. Southern blot-ning [Southern, J.Mol.Biol., 98, 503-517 (1975)] an- 20 vendtes til bekræftelse af sletningen i aprA-genet på kromosomet af B.subtilis BZ24. Dyrkning af B^ subtilis BZ24 i Antibiotic Medium nr. 3 (Penassay Broth, Difeo, Detroit, Michigan) uden antibiotikumselektion i ca. 32 generationer førte til isolation af en afledt stamme af 25 BZ24, i hvilken cat-genet, der giver chloramphenicolre-sistens i værtceller, tabtes pga. dets ustabilitet i BZ24-kromosomet. Et sådant fænomen er tidligere observeret ved lignende eksperimenter [Stahl, et al., J.Bacteriol., 158, 411-418 (1984)]. Et chloramphenicol-30 følsomt derivat af BZ24 betegnes BZ25. B^ subtilis BZ25 har en Npr" Apr"-fænotype, og danner således ikke påviselige ekstracellulære, neutrale proteaser eller ekstracellulære alkaliske proteaser. Southern blotning

I DK 175409 B1 I

I 28 I

I anvendtes til bekræftelse af sletning i aprA-genet på I

I kromosomet af B^ subtilis-B225. I

I Idet B.subtilis BZ25 ikke danner påviselige eks- I

I tracellulære, neutrale proteaser eller subtilisin, er I

I 5 den en nyttig værtsstamme til indføjelse af plasmid- I

I DNA, såsom pAMB113, til produktion af muterede subti- I

I lisiner, som kan udskilles til det omgivne vækstmedium I

frit for andre proteaser. I

I B^ subtilis BZ25 danner ikke påviselige ekstracel- I

I 10 lulære proteaser, når kultursupernatanter testes som I

I beskrevet nedenfor. B_;_ subtilis BZ25/pAMB113, som er I

I BZ25, der indeholder plasmid pAMB113 (indført ved I

I protoplasttransformationsmetoden ifølge Chang, et al., I

I supra) giver betydelige mængder af [Ser218]-subtilisin, I

15 når de dyrkede supernatanter testes som beskrevet. I

I Eksempel 5 I

I Integration af [Ser218]-subtilisingenet i kromo- I

I 20 somet af B^ subtilis blev antaget at tilvejebringe en I

I effektiv måde til forøgelse af dette mutantgens gene- I

tiske stabilitet. En sådan metode mildner også kravet I

I om chloramphenecol i fermateringsmediet, som ellers er I

I nødvendigt til frembringelse af selektivt tryk til be- I

I 25 vareise af plasmid-DNA i den ekstrakromosomale til- I

I stand. Derfor isoleredes [Ser218]-subtilisingenet sam- I

I mem med dets genetiske regulatoriske sekvenser og flan- I

I kerende DNA, der var homologt med EL subtilis kromoso- I

I met, fra en agarosegel med lavt smeltepunkt efter I

I 30 elektroforese af pAMB113, som var digesteret med EcoRI I

I og PstI i kombination. Det 4,0 kb EcoRI til Pstl-frag- I

I ment (vist i Figur 4) ligeredes dernæst til pAMB30 I

I (vist i Figur 5) som var digesteret med EcoRI og PstI i I

29 DK 175409 B1 kombination. Ligationsprodukterne indførtes i E. coli HB 101 (A.T.C.C. 33694) ved transformation. Der udførtes selektion for celler, der var resistente mod chloramphenicol (20 yg/ml). Plasmid DNA fra fire transforman-5 ter, som imødekom de ovennævnte kriterier, isoleredes ved den alkaliske ekstraktionsmetode ifølge Birnboim, et al., supra, og digesteredes dernæst med EcoRl og PstI i kombination. Alle fire plasmider indeholdt det 4,0 kb insert og den resterende 5,6 kb-del af pAMB30.

10 Et sådant plasmid betegnet pAMB302 oprensedes og bevaredes til yderligere anvendelse.

Gentagne forsøg på at integrere plasmidet pAMB302 i kromosomet af B. subtilis BZ25 ved kompetancemetoden [Spizizen, supra] var uden succes. Dette kan skyldes, 15 at BZ25-cellerne ikke blev kompetente ved den anvendte fremgangsmåde. Derfor indførtes pAMB302 i B. subtilis BZ25-celler ved protoplasttransformationsmetoden ifølge Chang, et al., supra. Dette formodes at være det første bevis på, at protoplasttransformationsmetoden 20 er succesfuld til opnåelse af integration af heterologt DNA i Bacillus. Dette resultat er særligt væsentligt, idet forsøgsstammer, i hvilke integration har været opnået, udvalgtes på basis af transformation ved kompetancemetoden. Stammer, som kan være ude af stand til at 25 blive kompetente, især industrielle stammer, som ikke udvalgtes på basis af transformation ved kompetancemetoden, kan derfor have større risiko for at være ude af stand til at blive kompetente.

Der udførtes selektion for chloramphenicol-30 resistente celler (5 yg/ml), som dernæst med sterile tandstikkere overførtes til L-agar suppleret med 1,5% (vægt/vol) skummetmælk og 5 pg/ml chloramphenicol. Cellerne inkuberedes natten over ved 37°C. Klare ringe med

I DK 175409 B1 I

I 30 I

I forskellige diametre observeredes omkring Cmr-kolonier. I

I Dette viser, at subtilisin dannedes og udskiltes af I

I disse celler. Man gjorde forsøg på at isolere plasmid- I

I DNA fra 8 af disse kolonier ved den alkaliske ekstrak- I

I 3 tionsmetode. Intet plasmid-DNA påvistes på agarosege- I

I ler, som blev farvet med ethidiumbromid (1 yg/ml) til I

I visualisering af DNA efter elektroforese. Fraværet af I

I ekstrakromosomal plasmid-DNA i Cmr-cellerne som danne- I

I de subtilisin, var et stærkt tegn på, at pAMB302 var I

I 10 integreret i kromosomet af B, subtilis. I

Adskillige kolonier resulterende fra dette eks- I

I periment isoleredes og betegnedes BZ28, BZ29, BZ30, I

I BZ31, BZ32 og BZ33. Hver stamme dyrkedes natten over I

I ved 37 eC under kraftig omrøring i hjerne- I

I 15 hjerteinfusions-medium (BHI, Difco) suppleret med 5 I

pg/ml chloramphenicol. Kultursupernatanterne testedes I

I for subtilisinaktivitet. B.subtilis stammerne BZ28, I

I BZ29, BZ30, BZ31, BZ32 og BZ33 dannede alle subtilisin I

I og udskilte det til det omgivende vækstmedium, idet I

I 20 nogle stammer dannede mere end andre. Mængden af subti- I

I lisin observéret i det flydende kulturmedium var direk- I

I te propational med størrelsen af ringen observeret på I

I skummemælks-L-agarpladerne. Idet subtilisinmængderne I

I udskilt af disse celler var forskellige, postuleredes I

I 25 det, at der enten integreredes multiple kopier af I

I pAMB302 i kromosomet, eller at der skete genamplifika- I

I tion [Young, J.Gen. Microbiol., 129, 1497-1512 (1983); I

I Albertini, et al., J.Bacterlol,, 162, 1203-1211 I

I (1985)]. I

DK 175409 B1 31

Eksempel 6 vildtype subtilisin fra BZ25/pAMBlll og [Ser218]-subtilisin fra BZ25/pAMB113 isoleredes og ren-5 sedes som følger. Hvert flydende kulturmedium centrifugeredes ved 15.000 g i 30 minutter, og proteinet i den klare supernatant fældedess med (NH4)2S04 (350 g pr. liter). Bundfaldet opsamledes ved centrifugering, filt-reredes efter triturering med 75% acetone og tørredes 10 under vakuum.

Til yderligere rensning af enzymet opløstes det tørrede bundfald i vand, opløsningen filtreredes og dialyseredes mod 0,02 M natriumphosphatpuffer ved pH

6,3. Den dialyserede opløsning ledtes gennem en kolonne 15 (2,5 x 15 cm) af carboxymethylcellulose med en hastighed på 2 ml pr. minut. Efter vask af kolonnen med 0,02 M natriumphosphat (pH 6,3) elueredes enzymet med den sammen puffer indeholdende 0,15 M NaCl. Topfraktionerne hældtes sammen, og proteinet fra fraktionerne indehol-20 dende enzymet, som identificeret ved en farveændring i en prøve af fraktionen blandet med succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid (Vega

Biochemicals), fældedes ved tilsætning af 2,5 volumener acetone. Bundfaldet opsamledes ved centrifugering og 25 opløstes dernæst i 0,005M calciumacetat (ca. 1 ml pr.

10 mg). Den resulterende opløsning dialyseredes ved 4°C mod vand, hvorefter den lyofilisedes.

Eksempel 7 30

Idet opfindelsen angår stabilisering af Bacil-lus-subtilis in udførtes en analyse af dets enzymstabilitet og en kvantificering.

I DK 175409 B1 I 32 I De fleste enzymer udtrykker kun deres biologiske aktivietet, dvs. katalyse af kemiske reaktioner inden I for et snævert pH- og temperaturområde. Desuden vil en-

I zymet selv under optimale betingelser kun bevare dets I

5 aktivitet, hvis polypeptidkæden er foldet på en måde,

der giver den såkaldte native konfirmation. Den nati- I

I ve form af et enzym er thermodynamisk mere stabil end I

I den denaturerede eller ufoldede form, i gennemsnit 10-15 I

kilokalorier pr. mol. Udfoldning af den native struktur I

10 sker ofte, når enzymet udsættes for ekstreme pH eller I

I temperaturværdier, eller for visse koncentrationer af I

kemikalier, såsom detergenter, urinstof og organiske I

I opløsningsmidler. Fjernelse af disse denatureringsmid- I

ler resulterer ofte i spontan genfoldning af peptidkæden I

15 til den native form og generhvervelse af den oprindelige I

enzymaktivitet. I

Irreversibelt tab af enzymaktivitet kan forekom- I

me pga. af spaltning af polypeptidkæden eller pga. mo- I

difikation af visse aminosyresidekæder, specielt hvis I

20 disse modifikationer ændrer den native form af enzymets I

aktive sted. Eksempler på sådanne modifikationer omfat- I

ter deamineringen af asparaginyl- og glutaminylrester, I

oxidationen af methionylrester og den hydrolytiske I

spaltning af cystein til dannelse af en thiocysteinrest I

25 og en dehydroalaninrest.Ifølge den foreliggende opfin- I

delse gives et yderligere eksempel i form af den irre- I

I versible inaktivering ved cyclisering af Ans-Gly- I

I sekvenser. I

I Når enzymfremstilling omfatter adskillige enzy- I 30 matiske former, som inaktiveres ved forskellige for- I hold, og/eller når inaktiveringsprocessen sker via en I række forskellige mekanismer, er inaktiveringskinetik- ken kompliceret. For de fleste enzympræparater følger 33 DK 175409 B1 inaktiveringen ved et passende pH-område og temperaturområde imidlertid en første ordens kinetik, dvs. at den resterende enzymaktivitet falder som en funktion af tiden ifølge en exponentielt aftagende kurve. Under disse 5 betingelser er enzymets halveringstid (T^) uafhængig af enzymets startkoncentration, og den kan beregnes ifølge udtrykket: 10 (t_-t.)ln2 T — * i 1/2 1ηΑ1~1ηΑ2 hvori Ax og A2 er enzymaktiviteterne til henholdsvis 15 tidspunktet og t2>

Alt andet lige vil halveringstiden for et enzym i opløsning almindeligvis være mindre ved højere temperaturer.

Til sammenligning af thermostabilieteten af 20 [Ser218]-aprA-qenprodukt-subtlllslnet med thermostabi-liteten af vildtype-aprA-genprodukt-subtilisinet og subtilisin BPN' (Sigma), fremstilledes opløsninger af disse enzymer (1 mg/ml) i 0,1 M natriumglycinatpuffer ved pH 10,0. Opløsningerne inkuberedes ved 52 °C og 25 delmængder (20 μΐ) blev udtaget til forskellige tidspunkter og blandet med 900 μΐ 0,2% caseinopløsning i 0,1M Tris puffer ved pH 8,30. Som en kontrol inkuberedes substratopløsningen (caseinopløsningen) med 20 μΐ enzympuffer. Caseinhydrolysen ved stuetemperatur afs-30 luttedes efter 15 minutter med tilsætning af 200 μΐ 10% trichloreddikesyre. Hydrolysatet skiltes fra det udfældede protein ved centrifugering, og dets ultraviolette-absorbans (UV-absorbans) ved 280 nm, måltes i sammen- I DK 175409 B1

I 34 I

ligning med kontrollen med et 8451A Diode Array Spec- trophot ometer, der kan fås fra Hewlett Packard. Sub- stratkoncentration var en sådan, at enzymaktiviteterne var ligefrem proportionale med UV-absorbanserne ved 280 5 nu angivet i tabel 2. I denne tabel repræsenterer vær- dierne i parenteserne de procentvise aktiviteter af startenzymaktiviteterne. Den sidste søjle i tabel 2 viser den beregnede halveringstid for de 3 enzymer, og det kan ses, at halveringstiden af det muterede 10 [ser218]-aprA-genprodukt er mere end tre gange større end for det naturlige aprA-genprodukt og subtilisin BPN' under de testede betingelser.

35 DK 175409 B1

S

Τ' + tn

-P c Q) T

4J >, ξ +J +J.

•H c if> r-* m Λ H jc η n is o I ^ -* ^

M

G, O <*> o* o*

w ° N (N "I

^ o d * Z Ί mi ^ e

Bl te jj O CN CN

‘f q. & cn m α a Ό ^ * · ' 5 SJ u O o o 4J > o , 4J fN ' TI fO ^ rH G ot> <#> <*>

-H -H ^ Vf D VO

> O ζ φ [— m en >; E w — —.

. Ti h -H

m g1 c & « ί ® s, c i η n vo ^ 3 _jj cn r- -<r en ss ! === 3 to ri

Ti c -ϊ Λ «-» P -Η oΦ ^

£ £ 0\ CN O

6 n I ® vo vo ω Ί ® E ~ ~ — P1 o n-, t· h n ve CN ' (D tv OO O C* j ξι ^ ^ S I; J O O o

PH ^ S *H

h m > CN ^ ^ ^ ω C £ ί « ί — '«*» 2 d ° 5 ° 3 ί b| 1 ^ 4Π !"J ti 7J.

*° 4J C Π CN CD

Λ w, . a\ η oi U 3 O <J\ rH σν <1) CO · · · .u o t- o .- -H cn rH o

•H

Λ

CO

-U «< Z

CD bl Cli

O <£ oJ CO

E W-I col M qJ \ c <u Si οι h

Si (U —" Qi ϋ) c*4 tn co >* ·η eg »η Η Ή

0j cn I -H

xj w Ό JJ

O 0) Η Δ u cn ·η 3 cu — > en I DK 175409 B1 I '36

Eksempel 8

Til bestemmelse af thermostabiliteten af subti- lisinforbindelser i tilstedeværelse af vaskemidler an- 5 vendtes det flydende tøjvaskemiddel ERA Plus (Procter & I Gamble) efter fortynding med vand (1:9) og fuldstændig inaktivering af den oprindelige proteaseaktivetet ved opvarming til 65°C i 30 minutter. Den resulterende vaskemiddelopløsnings pH-værdi var 7,50. Stabiliteterne 10 af [ser218]-aprA-qenproduktet/ yildtype-aprA-genproduk- tet og subtilisin BPNV (Sigma) testedes i vaskemidlet ved 45 6 C ved anvendelse af caseintesten og frem- gangsmåden beskrevet i eksempel 7. Resultaterne er vist i tabel 3, hvori enzymaktiveterne er udtrykt som pro- 15 centvise værdier af den oprindelige enzymaktivitet.

H Igen var halveringstiden for subtilisinanalogen ca. 3 gange større end for naturprodukterne under testbetin- I gelserne.

37 DK 175409 B1 s s ti ro +> -5 P tn 5 2 g g 1,5 ...

ry NU -P P -P

C C 0) (U W > mm 01 d o r- j <W · · ·

Λ νβ W fM

P' rt « i" 1 r k ^ AJ Λ . H «0 o«e <>e • <0 ·. m £ ® ® Ό ϊ Ή p' η n

rH

Ti V

> ϊ—i O

<U in

. tJ

ro 'ΰ i > -g *0 . fl B a> . g 0) > -r- P M & <*> oe <*>

Mm c n ^ N

P nf o ^ ao in uo Π > "τι

O +J H

U > nj Q· z Λ

P o, P

ω cq m cn w c ii c! 'H 33 .5 a 00 g m Μ -h „ £H -H 0> & <*» <*» <*> § Γί * “ g "n i A> °

S i. S

O > vw 0 5 « t S - * *· «5 g ° =

4J ep, O O O

® Ro - - P N w 'jj c

I—I M

-H

Λ (0 P < z ro Η o.

0 < qJ o B gi <31 u qJ c tu rtjj <u x: ω —* α <n H tn αο >,

<0 rH g-ϊ H

0) fs, P p ϋ 0 dJ H j3 p W -H 3

0. — > W

I DK 175409 B1 I 38

De i det foregående tabelerede resultater viser, H at [Ser218]-analogen af aprA-genproduktet udviser stør- re stabilitet end vildtype aprA-genproduktet og subti- lisin BPN' i ERA Plus, som ved en pH-værdi på 7,5 kan 5 beskrives som et kationisk til neutralt vaskemiddel, som mest sandsynligt er formuleret til at være forlige- ligt med inkorporering af vaskemiddelenzymer. Disse re- H sultater sikrer imidlertid ikke, at fSer2181-aprA-gen- produktet vil være forligeligt med alle gængse, kom- H 10 mercielle vaskemidler, f.eks. dem der er formuleret til udelukkelse af vaskemiddelenzymer, ved præliminære tests med en 2% {vægt/vol)opløsning af Tide, der kan beskrives som et anionlsk til neutralt vaskemiddel med en pH-værdi på mere end 8,5, de som udelukker vaskemid- 15 delenzymer i midlet, udviste subtilisin BPN' f.eks.

større stabilitet end vildtype- og [Ser218]-aprA-gen- produkterne.

H [Ser218l-aprA-genproduktet udviste imidlertid ved den I samme test større stabilitet end vlldtype-aprA-gen- 20 produktet. Skønt de forskellige relative aktiviteter af

I [Ser218]-aprA-genproduktet og subtilisin BPN' i ERA

Plus og Tide på nuværende tidspunkt ikke er forklaret, I antyder de eksperimentelle resultater på, at den rette I formulering af vaskemidler er en forudsætning for opti- 25 mal ydeevne af enzymer inkoporeret i sådanne midler.

I Det er vist klart, at [Ser218]-aprA-genproduktet kon- I sekvent har egenskaber der er meget bedre end egenska- berne for vildtype-aprA-genproduktet, og det formodes at analoger af subtilisin Carlsberg og BPN' ifølge den I 30 foreliggende opfindelse også vil have større stabilite- I ter end de tilsvarende vildtypeenzymer.

DK 175409 B1 39

Eksempel 9

Ved anvendelse af succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid (Vega Biochemicals) 5 som substrat og hastigheden for forøgelse af absorban-sen ved 405 nm pga. p-nitroanilinfrigivelse [Del Mar, et al., Anal. Biochem., 99, 316-320 (1979)] til måling af enzymaktiviteten bestemtes thermostabiliteterne af [Ser218]aprA, vildtype aprA og subtilisin BPN1 (Sigma) 10 i en 0,1 M natriumphosphatpuffer ved pH 7,5 som følger.

Enzymopløsninger med ca. 0,5 Ansonenheder pr. liter inkuberedes ved 40 °C og 50°C , og delmængder (20 μΐ) blev udtaget til forskellige tidspunkter og fortyndet i 180 μΐ iskold 0,1 M natriumphosphatpuffer 15 ved pH 7,5. 10 μΐ af den således fortyndede prøve blev blandet med 890 μΐ af ImM succinyl-L-analyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid i 0,1 M Tris HC1, pH 8,2, og absorbansen ved 405 nm måltes hvert 15. sekund i 5 minutter på et Hewlett Packard 8451A Diode 20 Array Spectrophotometer. Resterende enzymaktiviter efter forskellige inkubationstider er i tabel 4 og tabel 5 udtrykt som procentvise værdier af de tilsvarende startaktiviteter. Proceduren blev dernæst gentaget i en 0,1 M natriumphosphatpuffer ved pH 9,0, og resultaterne 25 er angivet i tabel 6 og 7.

I DK 175409 B1 I

I 40 I

I c! * I

i I

-i W I

I Ξ, in tf

Ό j- 4j 4J +J

I S S u ‘ O OO O I

I S “1 g > 3 ~ - I

I ^ iSi I

I fii * ^ I

I å & I

I ω > i

i S U -H C I

-U (U —' I iM ‘ X a» ofi m

Om CJ rn n

<Hpooon<H

--H a o r·»

> 4J <r (N

I rd . j3

I > s “ I

I ,c ** · I

I tj & c = 1 I

·* fc o· —· I n' Ξ 3 -Η Σ # «· »*

U Ή 4J Ρ» GO VC

I ^ R^1" mo oo<r(N I

I w ^ J-> Λ co

I g B* g 5 - · I

I £ <D c I

I H ^ 2 -5· I

I Μ I

I Si ° ϋ = I

I ί-1 -Η ω X *»<*>«*> I

I n n OJ CTN CO

I ^ ~ ® S <Λ 'ώ ^ I O) S 7j O' I CO ft Ϊ

I - η g- I

I r *H I

I m ^ -P

I «'5 -s C I

I -ri c ··* dfi &P H

4-> r-i >.'S O O O

<U -ri Jj o O O

I m c i m

I -H M/O I

I rH s w I -H 05 I Λ I <c tn

I m O

I £ < z I

I g < fli o I

I s oja = I

I β ml oj -» I M oj _ Q, oj «»>»·** Φ r-* I 0» rs , -* I u> u Ό j-ι O 0J H -3 I u cn -p 3 I CL — > cn DK 175409 B1

Al •O Ό ω -η

u . 4J

X 03 ·

3 03 0; Jj +) -P

V. C

P 0) -H _ ^ M C u ° ^ a · 5,3 η o c m n > · · · 03' CH ^ ή o tn t*· w (o < s Λ

Ml ft

§U

I 0) 03 > S ju ..c iJ 0) ,_) -Ή E us S S 5 5 2 e m p** cm ^ ft o Π rj tn ^ r> <0 Λ • & Ό CO 5 (13 > 5 > I Ij £* C · tn v § O c _ 3 -rH '1 - <70 a6 9ø ri: Ό p ti X »-H in w Μ n 11 ^ 00 rn h « S t? -so < o S 3 σ> b* ft c ^ ^ G r* ® Σ 2

Cn

t ΗI M

f*. 03 pj ° i! é Η1 Ή ®.ϊ * „ „ 2 +j tn m tj· w >_ <y t n co m m M2 jj r

0) ft IL

m ra g r! Ή -5 ** •W 5 44 fO " (0 · "1 g c <*><*>;*>

Μ -Η O O O

»5 c* 2 2 2 2 3 » ° r-H 03

•H

XI CD

(C O

U

O < Z

o u O, E am m < (0 03 % c x: α ω ·-.

μ ® ml a οι W 00 >» --4 -•o —3 e-> —i 03 IN I ..4 jj u jj 0 51 S Λ ir w Ij 3 ft - > w I DK 175409 B1 I 42 4-1 O) Ό

H . jj -H

Λί -u ? ta

'O * M g1 · +J 4J

o o -p c 4J

H J-ι ' Qj -H co m H Di 81 E ^ ifl ^ (n C M S O . . .

Φ W N > ·-( ΓΜ r-4

Bl Dl C H ^ W « < T3 X! I s* 0) ® Q, Ή I >.

jj 3 ·· C I

I n* 'H 'm

Ό <T( S «*· e*» I

f-l 5 CJ Ρ' σι o

-M^einoOrpfN

I > s ss

o ^ I

· Λ CD Qi I > ε ό

, 3 QJ I

I jj 'ΰ > -¾ ΰ c ·

I É ni o c I

ω ^ C -η ^ °* <*> °*

H H -u 35 »“· ·“* v I

g p «O

. g S H 3® I £ ® o c I gj ·Η m

I j? a ® C

I 3 g Ua! * * «*

u « cn cq I

I £ 3 «5 * ** 10

I ~ S -H

"1 >

»W 'J -H I

« Ti +> I

H 4-1 ι> i

o ” · I

-U 3 g C «* *> <*» I

H <u cq F··"* o o α I

4J ><SE O O O .

I jo1 Cn H Η H I

3 0 w° Λ

(B ·' I

4J " I

ro I

I c <£ 2 I

I g < sj o i I .s sja c

E-* rol « -4 I

tu — O· cn I

« co > ·η I

»0 i-4 6« »-4 I

CU <N i —i I

U tf XJ I

o « Η -O I

>- w -r4 3 I

Q· *— > yj I

A3 DK 175409 B1

•H

u +> (I) o) ...

•U tp 4J 4J +J

o ωΐ “! T rt. ' 0 · e o> ' ’ ’ μ o >,> <N o o

(¾ ' N H

C <* G (C

& a w£ 1 a I i m > c O) M *”< oø oø vø

Q. <D .. X Cl «?· CTI

5 55 ^

3 UO

' ft e Ό 4J O h (i in Η Λ > ft 3 fl' c O 0) .« #p «β df æ ί > Σ \o n r·'· > ft t>» (N «-»

ECO

s 3r " I s- · W y K 3 # g# «0

« 2 „ Λ X in ΙΟ H

< c C oo o m * ω h ‘H Ξ o> ^ m ^ < ° 5 £1 -H «w .

S) ®.C

r-, ' jj —i dø dø aø * 2 g, S <N ^ «3* S B; r} ?i e m k tfl tj o <D '> «Ν

» S H

“ S

¢^6= dø dø oø

Ti >, ··* o o o u λ S s 2 2 2 «i 1 S o ~ -1 -1

4J B H

-H

rH {J)

-H O

Λ 5 C 2 0 < SJ a 1 y c m ϋΙ <U ·-* _C 4) — ft (Λ £ W 00 >» —g

1TJ

01 rsi i ·*η J_l U *0 J-l O β» □ J3 u tn ^ 3 c. — ?* cn

I DK 175409 B1 I

I ,44 I

I Eksempel 10 I

I Til testning af [Ser218]-analogens pH-stabilitet I

I udførtes metoden ifølge eksempel 7 ved pH 4,8 og stue- I

I 5 temperatur, og resultaterne er vist i tabel 6. I

I Tabel 8 I

I Stabiliteten af [ser218]aprA-genproduktet mod Vildtype I

I 10 aprA-genproduktet i 0,1 M Natriumphosphatpuffer med pH I

I 4,8. I

I Protease 0 timer 4 dage Halveringstid I

I af enzymet (dage) I

I 15 [ser218]aprA 100 95% 44,0 I

I Vildtype aprA 100 47% 3,7 I

I Skønt den foreliggende opfindelse er beskrevet I

20 Ved hjælp af foretrukne udførelsesformer er det klart, I

I at fagmanden vil kunne komme på modifikationer og for- I

I bedringer. F.eks. forekommer sekvensen Asn-Gly andre I

I steder i subtilisinforbindelser, som f.eks. ved rester- I

I ne 109 og 110 i aprA-genproduktet og subtilisin BPN' og I

I 25 ved resterne 62 og 63 i subtilisin Carlsberg og subti- I

I lisin DY. Det forventes således, at substitution med I

I andre rester end Asn og Gly ved disse respektive steder I

I ligeledes kan forbedre stabiliteten. På samme måde for- I

I ventes forbedringer af stabiliteten, når sådanne sub- I

I 30 stitutioner udføres i andre enzymer, som har Asn-Gly- I

sekvenserne, og i andre proteiner omfattende denne sek- I

I vens. Endvidere forventes det, at en subtilisinanalog I

45 DK 175409 B1 ifølge opfindelsen har meget bedre egenskaber end vild-typesubtilisinforbindelser i vaskemidler, som f.eks. dem der er beskrevet i US patentskrift nr. 3,732,170, 3,749,671 og 3,790,482.

5 Endvidere udføres mange industrielle processer af praktiske grunde ved temperaturer, der ligger over stabilitetsområdet for de fleste enzymer. Derfor formodes det, at de thermostabile proteaser ifølge opfindelsen, skønt der er langt vægt på vaskemiddelanvendel-10 serne heri, ikke kun er fordelagtige indenfor indu-stier, såsom vaskemiddel- og skindafhåringsindustrien, indenfor hvilke der allerede kræves stabile proteaser, men også kan være nyttige indenfor industrier, ved hvilke der anvendes kemiske metoder til hydrolyse af 15 proteiner, f.eks. hydrolyse af vegetabilske og animalske proteiner til fremstilling af suppekoncentrater.

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til forbedring af den thermis- I I ke stabilitet og pH-stabiliteten af et Bacillus-sub- I I tilisin med en aminosyresekvens omfattende en Asn-Gly- I I sekvens, kendetegnet ved, at den omfatter I I 5 udskiftning af en rest i denne Asn-Gly-sekvens med en I I anden aminosyrerest. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kende- I I tegnet ved, at denne anden aminosyrerest er aspa- I I raginylresten ved positionen i aminosyresekvensen af I I 10 Bacillus-subtilislnet, der svarer til position 218 i I I aminosyresekvensen beskrevet i Tabel 1. I

3. Fremgangsmåde til forbedring af den thermiske I I stabilitet og pH-stabiliteten af et Bacillus-subtilisin I I med en aminosyresekvens omfattende en Asn-Gly-sekvens, I I 15kendetegnet ved, at man sletter en rest i I I denne Asn-Gly-sekvens. I