DK175465B1 - DNA-sekvens kodende for polypeptidet [Ala1]hpG-CSF, plasmider indeholdende sekvensen, hermed transformerede/transficerede værtsceller...... - Google Patents

Description

DK 175465 B1 i

Opfindelsen angår en DNA-sekvens, der ved ekspri-mering i en prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle koder for et polypeptidprodukt, der besidder i det mindste en del af den primære struktur og en eller flere af 5 de bioilogiske egenskaber for naturligt forekommende pluripotent granulocyt kolonistimulerende faktor (hpG-CSF). Opfindelsen angår yderligere et i sammenhæng med DNA-sekvensen relevant biologisk funktionelt plasmid eller viral DNA-vektor, en prokaryotisk eller eukaryo-10 tisk værtscelle, en fremgangsmåde til fremstilling af polypeptiden [Alal]hpG-CSF, dette polypeptid som ikke naturligt forekommende, et farmaceutisk præparat indeholdende polypeptidet og anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et lægemidel.

15 Det bloddannende (hæmatopoietiske) system hos mennesker nydanner en række hvide blodlegemer (deriblandt neutrofile, makrophager og basofile/mastceller), røde blodlegemer (erythrocyter) og størkningsfremmende celler (megakaryocyter/blodplader). Man har anslået, at 20 det hæmatopoietiske system hos en gennemsnitlig mandsperson producerer ca. 4,5 x 1011 granulocyter og ery-throcyter hvert år, hvilket svarer til en fornyelse af hele kroppens vægt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154 -158 (1985).

25 Man mener, at små mængder af visse hæmatopoieti ske vækstfaktorer er årsag til, at et lille antal "stamfaderceller " deler sig i en række blodcellelinier, at disse udbreder sig i så høj grad og til sidst uddifferentieres til fuldt udviklede celler i blodet. Da de 30 hæmatopoietiske vækstfaktorer er til stede i umådelig ringe mængde, har bestemmelser og identificering af disse faktorer hvilet på en række forsøg, som op til nu kun skelner mellem de forskellige faktorer baseret på

I DK 175465 B1 I

I I

I deres stimulerende virkning på cellekulturer under kun- I

I stige omstændigheder. Som et resultat af dette har man I

I frembragt et stort antal navne til betegnelse af et I

I langt mindre antal faktorer. Som et eksempel på den I

I 5 herskende forvirring kan man nævne, at betegnelserne I

I IL-3, BPA, multi-CSP, HCGF, MCGP og PSF er forskellige I

I navne, som man nu tror alle betegner samme hæmatopoieti- I

I ske vækstfaktor hos mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 I

I (1985). Se også Burgess et al., J. Biol. Chem. 252, I

I 10 1988 (1977), Das, et al., Blood, 58, 600 (1980), Ihle, I

I et al., J. Immunol,129, 2431 (1982), Nicola, et al., J. I

I Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf, et al., Int. J. I

I Cancer, 30, 773 (1982), og Burgess, et al., Int. J. I

I Cancer, 26, 647 (1980), angående forskellige vækstregu- I

I 15 lerende glycoproteiner hos mus. I

I Anvendelse af rekombinant genteknik har bragt en I

I vis orden 1 dette kaos. Por eksempel kender man nu til I

I aminosyre- og DNA-sekvenserne for human erythropoietin, I

I som stimulerer produktionen af erythrocyter. (Se Lin, I

I 20 PCT ansøgning nr. 85/02510, offentliggjort 20. juni I

I 1985). Man har også benyttet rekombinante fremgangsmå- I

I der til isolering af cDNA for en human granulocyt- I

I macrophag kolonistimulerende faktor. Se Lee, et al., I

I Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360-4364 (1985) og I

I 25 wong, et al., Science, 228, 810-814 (1985). Se også Yo- I

I kota, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070 I

I (1984), Pung, et al., Nature, 307, 233 (1984), og Gough, I

I et al., Nature, 309, 763 (1984) angående kloning af ge- I

I ner fra mus, såvel som Kawasaki, et al., Science, 230, I

I 30 291 (1985) angående human M-CSF. I

I Man har vist, at der findes en human hæmatopoie- I

I tisk vækstfaktor, kaldet human pluripotent koloni- I

I stimulerende faktor (hpCSP) eller pluripoietin i dyrk- I

DK 175465 B1 3 ningsmediet fra en human blærecarcinomcellelinie, kaldet 5637 og deponeret under restriktive omstændigheder hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som A.T.C.C. nr. HTB-9. Man har angivet, at phCSF, S oprenset fra denne cellelinie, vil stimulere udbredelse og differentiering af pluripotente stamfaderceller og derved medføre produktion af alle de vigtige blodcelletyper i forsøg, hvor man benytter udgangsceller fra menneskelig knoglemarv. Walte et al., Proc. Natl. Acad.

10 Sci. Ved rensning af phCSP benyttede man: (NH4)2S04 udfældning; anionbytterchromatografi (DEAE cellulose, DE 52); gelfiltrering (AcA54 søjle); og C18 omvendt fase højkapacitet væskechromatografi. Man angav, at et protein, der blev identificeret som phCSP og blev elueret i 15 den anden af to aktivitetstoppe i C18 reversfase HPLC-chromatografi, skulle besidde en molekylvægt (MW) på 18.000, bestemt ved hjælp af natriumdodecylsulphat (SDS)-polyacrylamid gelelektrophorese (PAGE) under anvendelse af farvning med sølv. Tidligere angav man, at 20 hpCSF skulle have et isoelektrisk punkt på 5,5 [welte, et al., J. Cell. Biochem., Supp. 9A, 116 (1985)] og en høj differentierende aktivitet for den myelomonocytiske leukæmicellelinie WEHI-3B D+ fra mus [welte, et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gale, 25 et al., eds., New Series, 28 (1985)]. Tidligere studier tyder på, at den faktor man identificerer som phCSF besidder overvejende granolycyt kolonistimulerende aktivitet i de første syv dage i et humant CFU-GM forsøg.

Man har endvidere fra den humane blærecarcinom-30 cellelinie 5637 isoleret en anden faktor, betegnet human CSF-β, som man beskriver som en konkurrent til 125I-mær-ket granulocyt kolonistimulerende faktor (G-CSF) fra mus med hensyn til binding til WEHI-3B D+ celler i en dosis- I DK 175465 B1 I i

respons vekselvirkning, der er identisk ved, hvad man I

finder ved ikke-mærket G-CSF fra mus [Nicola, et al., I

I Nature, 314, 625-628 (1985)]. Man har tidligere med- I

I delt, at denne sammenhæng mellem dosis og respons skulle I

I 5 være unik for ikke-mærket G-CSF fra mus, og ikke være I

I til stede hos sådanne faktorer som M-CSF, GM-CSF eller I

I multi-CSF [Nicola, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), I

I 81, 3765-3769 (1984)]. Blandt CSF'er indtager CSF-β og I

I G-CSF den særstilling, at de begge i høj grad er i stand I

I 10 til at inducere differentiering i WEHI-3B D+ celler. I

I Nicola, et al., Immunology Today, 5, 76-80 (1984). Ved I

I høje koncentrationer stimulerer G-CSF blandede granulo- I

I cyt/makrophag kolonidannende celler (Nicola, et al., I

I (1984) se ovenfor), hvilket stemmer med tidligere resul- I

I 15 tater, der tyder på, at der forekommer granulocytiske I

I monocytiske og blandede granulocytiske/monocytiske og I

I eosinophile kolonier (CFU-GEMMM) efter 14 dages inkube- I

I ring af humane knoglemarvskulturer med phCSF. Man har I

I også beskrevet CSF-β som stimulerende for dannelse af I

I 20 neutrofile granulocytkolonier i forsøg, hvor man benyt- I

I ter knoglemarvsceller fra mus, en egenskab, som man har I

I benyttet til identificering af en faktor som en G-CSF. I

I På basis af disse ligheder har man identificeret human I

CSF-β med G-CSF (granulocyt kolonistimulerende faktor). I

I 25 Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985). I

Det lader til, i betragtning af deres fælles I

I egenskaber, at human CSF-β ifølge Nicola, et al., se I

I ovenfor, og hpCSF ifølge welte, et al., se ovenfor, er I

den samme faktor, som man passende kan betegne som en I

I 30 human pluripotent granulocyt-koloni-stimulerende faktor I

I (hpG-CSF). Det ville være meget ønskeligt at kunne ka- I

I rakterisere og rekombinantproducere hpG-CSF på baggrund I

I af den meddelte evne hos G-CSF fra mus til fuldstændig I

DK 175465 B1 5 at undertrykke in vitro population af WEHI-3B D+ leukæmiceller ved "fuldstændig normale koncentrationer", og i betragtning af, at man har rapporteret, at urensede præparationer af G-CSF fra mus ved indsprøjtning kan un-5 dertrykke eksisterende transplanterede myeloid-leukæmier hos mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 (19Θ5). Se også Sachs, Scientific American, 284(1), 40-47 (1986).

Hvis hpG-CSF skulle vise sig at være terapeutisk betydningsfuld, og det bliver nødvendigt at kunne frem-10 stille det i kommercielle mængder, vil isolering fra cellekulturen næppe kunne tilvejebringe den nødvendige mængde materiale. For eksempel bør man lægge mærke til, at der synes at være restriktioner mod kommerciel udnyttelse af celler fra Human Tumor Bank, såsom blærecarci-15 nom-cellelinie 5637 fra mennesker (A.T.C.C. HTB9), som man har angivet som kilde for naturlige hpCSF-præpara-ter; Welte, et al., (1985), se ovenfor).

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en DNA-sekvens, der er ejendommelig ved at kode for [Ala1 jhpG-CSF.

20 Sådanne sekvenser kan omfatte: inkorporerede "fore trukne" kodoner til eksprimering ved udvalgte ikke-pat-tedyrs værtsceller, tilvejebringelse af gennemskæringssteder for endo-nuclease restriktionsenzymer; og tilvejebringelse af yderligere DNA-sekvenser anbragt før, in-25 deni eller efter omtalte sekvens, som gør konstruktionen af vektorer, der kan eksprimeres uden videre, lettere.

Denne polypeptidanalog til hpG-CSF afviger fra naturligt forekommende former, hvad angår identiteten af en amino-syrerest (dvs. en substitutionsanalog, hvori en af de 30 foreskrevne cysteinrester er erstattet med en anden rest); og der har nogle eller alle egenskaber tilfælles med de naturlige former.

En sådan DNA-sekvens ifølge opfindelsen omfatter sekvenser, der er nyttige til at sikre eksprimering i

I DK 175465 B1 I

I 6 I

I prokaryotiske eller eukaryotiske værtsceller af polypep- I

I tidprodukter med i det mindste en del af den primære I

I strukturelle konformation og en eller flere af de biolo- I

I giske egenskaber for naturligt forekommende pluri-potent I

I 5 granulocyt kolonistimulerende faktor, og den kan frem- I

I stilles ved fremgangsmåde ifølge Alton, et al., bffent- I

I liggjort PCT ansøgning WO 83/04053. I

I Opfindelsen tilvejebringer også det rensede og I

I isolerede polypeptidprodukt, der er ejendommeligt ved at I

I 10 være et produkt af eksprimering i prokaryotiske eller I

I eukaryotiske værter (f.eks. bakterier, gær eller dyrkede I

I celler fra planter, insekter og pattedyr) af DNA-se- I

I kvenser ifølge opfindelsen. I

I I denne sammenhæng er det biologisk funktionelle I

I 15 plasmid eller virale DNA-vektor ifølge opfindelsen ejen- I

I domme ligt ved at inkludere en DNA-sekvens ifølge opfin- I

I delsen; og en prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle I

I ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at være transfor- I

I meret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge op- I

I 20 findelsen på en sådan måde, at den kan eksprimere poly- I

I peptidproduktet ifølge opfindelsen. I

I Produktet fra typiske gærceller (f.eks. Saccaro- I

I myces cerevisiae) eller prokaryotiske værtsceller I

I [f.eks. Escherichia coli (E. coli)] er fri for associa- I

I 25 tion med noget som helst pattedyrsprotein. Produktet af I

I mikrobeeksprimering i verte-bratceller (f.eks. pattedyr I

I bortset fra mennesker og fugle) er fri for associering I

I med nogen som helst former for humane proteiner. Afhæn- I

I gig af den anvendte vært vil polypeptiderne ifølge op- I

I 30 findelsen kunne være glycosylerede med pattedyrs- eller I

I andre eukaryotiske carbohydrater eller kan være ikke- I

I glycosylerede. Polypeptider ifølge opfindelsen kan også I

I indeholde en start methionin aminosyrerest (ved stillin- I

I gen -1). I

DK 175465 B1 I

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstil- I

ling af polypeptidproduktet ifølge opfindelsen er ejen- I

dommeligt ved det i krav 10*s kendetegnende del angivne. I

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er I

5 ejendommelige ved at omfatte effektive mængder af poly- I

peptidproduktet ifølge opfindelsen eller fremstillet I

ifølge opfindelsen sammen med passende fortyndings- I

midler, adjuvanser og/eller bærere. Endelig er anvendel- I

sen af polypeptidproduktet ifølge opfindelsen rettet på I

10 fremstillet af et lægemiddel til hæmapoietisk terapi på I

pattedyr. I

Polypeptidprodukter ifølge opfindelsen kan mær- I

I kes, idet de associeres med en påviselig markørsubstans I

I (f.eks. radiomarkeres med 125I), hvorved der tilveje- I

I 15 bringes reagenser, der er nyttige ved bestemmelse af I

I tilstedeværelse og mængde af human hpG-CSF i vævsprøver I

I og i væskeformige prøver, såsom blod eller urin. I

I DNA-produkter ifølge opfindelsen kan også mærkes med på- I

I viselige markører, såsom radiomarkører og ikke-isotop I

I 20markører såsom biotin), og anvendes i DNA-hybridise- I

I ringsprocesser, så man kan lokalisere positionen for hu- I

I man hpG-CSF-genet og/eller positionen af en hvilken som I helst beslægtet genfamilie i et kromosomkort. De kan I også anvendes til identifikation af uregelmæssigheder I 25 vedrørende humant hpG-CSF-gen på DNA-niveauet og benyt- I tes som genmarkører til identifikation af nabostillede I gener og deres uregelmæssigheder.

I Polypeptidprodukter ifølge opfindelsen kan alene I eller kombineret med andre hæmatopoietiske faktorer el- I 30 ler medikamenter være nyttige ved behandling af hæmato- I poietiske afvigelser, såsom aplastisk anæmi. De kan og- I så være nyttige ved behandling af hæmapoletiske mangler forårsaget af chemoterapi eller af stråleterapi. Chan- DK 175465 B1 een for, at en knoglemarvstransplantation lykkes, kan f.

eks. forstærkes, hvis man tilfører hpG-CSF. Behandling med heling af brandsår og behandling af bakteriel for- H årsaget betændelse kan også forstærkes ved tilføring af H 5 hpG-CSF. Derudover kan hpG-CSF være nyttig ved behand- ling af leukæmi, idet det er publiceret, at den er i stand til at differentiere leukæmiceller. Welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985) og Sachs, se ovenfor.

10 Fagmanden vil, ved at læse følgende detaillerede beskrivelse, som illustrerer udførelsen af opfindelsen, i de for tiden foretrukne udførelsesformer, kunne se H adskillige aspekter og fordele ved opfindelsen.

Tegningen viser et delvis restriktionsendonucle- 15 ase kort over hpG-CSF-genet forsynet med pile til belys- H ning af strategien for sekvensering, som benyttes til opnåelse af den genomiske sekvens.

Ifølge opfindelsen har man isoleret og karakteri- seret DNA-sekvenser, der koder for hele polypeptidse- 20 kvensen i hpG-CSF eller dele deraf.

H De følgende Eksempler skal illustrere opfindelsen I og er især rettet på procedurer, der udføres inden iden- tifikation af hpG-CSF cDNA og genomiske kloner, proce- I durer, der fører til en sådan identifikation og til se- 25 kvensering, udvikling af ekspressionssystemer, baseret I på cDNA, genomiske og fremstillede gener og bekræftelse af eksprimering af hpG-CSF og lignende produkter i så- I danne systemer.

I Mere detailleret angår Eksempel 1 aminosyrese- 30 kventering af hpG-CSF. Eksempel 2 angår fremstilling af I et cDNA bibliotek til gennemsøgning for kolonihydridise- I ring. Eksempel 3 angår fremstilling af hybridiserings- I sonder. Eksempel 4 angår gennemsøgning for hybridise-

DK 175465 B1 I

9 I

I ring, identifikation af positive kloner, DNS-sekvense- I

I ring af en positiv cDNA klon og tilvejebringelse af in- I

I formation om den primære strukturelle konformation (ami- I

I nosyresekvens) af polypeptidet. Eksempel 5 angår iden- I

I 5 tificering og sekvensering af en genomisk klon, der ko- I

I der for hpG-CSF. Eksempel 6 angår konstruktion af et I

I fremstillet gen, der koder for hpG-CSF, hvori man anven- I

I der kodoner, der hører til E. coli. I

I Eksempel 7 angår fremgangsmåder til konstruktion I

I 10 af en E. coli transformationsvektor, der indeholder DNA, I

I der koder for hpG-CSF, anvendelse af denne vektor til I

I prokaryotisk eksprimering af hpG-CSF og analyse af egen- I

I skaberne af de rekombinante produkter ifølge opfindel- I

I sen. Eksempel 8 angår fremgangsmåder til konstruktion I

I 15 af en vektor, der indeholder DNA, der koder for den op- I

I finderiske analog til hpG-CSF, afledt fra en positiv I

I cDNA klon, anvendelse af vektoren til transfektion af I

I COS-1 celler og dyrkning af de transficerede celler. I

I Eksempel 9 angår fysiske og biologiske egenskaber af re- I

I 20 kombinante polypeptidprodukter beslægtet med et sådant I

I ifølge opfindelsen. I

I Eksempel 1 I

25 (A) Sekvensering udført ved litteraturbekendte frem- gangsmåder.

En prøve (3-4 pg, 85-90% ren SDS, sølvfarvning- PAGE) af hpG-CSF blev opnået fra Sloan Kettering insti- I 30 tute, New York, New York, den var isoleret og renset I ifølge Welte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, I 1526-1530 (1985).

I Den N-terminale aminosyresekvens i denne prøve af I hpG-CSF blev bestemt 1 et første forsøg ved mikrose- DK 175465 B1 k vens analyse under anvendelse af en AB407A gasfase se- kvensoopdeler (Applied Biosystems, Poster City, Califor- nia) til opnåelse af sekvensen, der vises i Tabel i ne- denfor. I Tabellerne I-IV benyttes enkeltbogstavsko- 5 der, "X" betyder en rest, som ikke kunne bestemmes helt sikkert, og rester angivet i parentes angiver mulighe- der.

TABEL I

10 1 5 10 15

K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q-(G,V,S)-G-L-X-X-X

Ved alle dele af det forsøg, hvis resultater gi- ves i Tabel I, var der et højt niveau for baggrundsstøj 15 til stede, et tegn på, at prøven indeholdt mange konta- minerende ingredienser, sandsynligvis kemiske rester stammende fra rensningen. Sekvensen er kun givet af re- I ferencegrunde.

Η I forsøg nr. 2 benyttede man en anden prøve (5-6 20 pg, ca. 95% ren) fra Sloan Kettering som ved forsøg nr.

1/ og man udførte sekvenseringen som ved forsøg nr. 1.

Denne prøve stammede fra det samme materiale, som blev I benyttet til opnåelse af fig. 4 i Welte, et al., Proc.

I Natl. Adac. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985). Resulta- 25 terne gives i Tabel il.

I TABEL II

I 1 5 10 15 20 I 30 T-P-L-G-P-A-S-(S)-L-P-Q-(S )-M-(L>-X-K-(R)-X-X-(R)-(L)-X- I Selvom man ved forsøg nr. 2 identificerede flere I rester, opnåede man ikke en tilstrækkelig lang sikkert

DK 175465 B1 I

11 I

identificeret sekvens, hvorfra man kunne konstruere et I

fornuftigt antal sonder til brug ved eftersøgning af I

hpG-CSP DNA. Man beregnede, at man i det mindste skulle I

bruge 1536 sonder, hvis an ved hjælp af sekvensen i Ta- I

5 bel II skulle isolere cDNA. Igen var kontaminering af I

prøven sandsynligvis årsag til dette. I

Derefter fremskaffedes en tredie prøve (3-5 pg, I

ca. 40% ren) fra Sloan Kettering som ovenfor. Man op- I

delte denne prøve ved SDS-PAGE og underkastede den elek- I

10 troblot i et forsøg på yderligere rensning. Sekvensana- I

lyse af denne prøve gav ingen data. I

(B) Sekvensopdeling ved reviderede fremgangsmåder I

15 Til opnåelse af en tilstrækkelig mængde rent ma- I

teriale, hvorpå man kunne udføre en tilstrækkelig nøjag- I

tig aminosyresekvensanalyse, tilvejebragte man celler I

fra blærecarcinomcellelinie 5737 (underklon 1A6), som de I

fremstilles hos Sloan-Kettering, fra Dr. E. Platzer. I

20 Cellerne blev først dyrket i Iscove's medium (GIBCO, I

Grand Island, New York) i småflasker til de flød sammen.

Derefter forsynede man dyrkningsmedierne med trypsin og podede dem i rulleflasker .(1½ småflasker/flaske), der hver indeholdt 25 ml forudbehandlet Iscove's medium un-25 der 5% C02. Cellerne blev dyrket natten over ved 37 °C og 0,3 rpm.

Cytodex-1 småkugler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) blev vasket og steriliseret ved følgende fremgangsmåde.

Man anbragte B g småkugler i en flaske og tilsatte 400 30 ml PBS. Man holdt småkuglerne i suspension, idet man I rystede blidt i tre timer. Man lod småkuglerne bund- I fælde, hældte PBS fra, rensede småkuglerne i PBS og til- I satte ny PBS. Småkuglerne blev autoklaveret i 15 minut- I DK 175465 B1 ter. Før anvendelse vaskede man småkuglerne 1 Iscove's medium plus 10% kalvefosterserum (FCS), før man tilsatte frisk medium plus 10% FCS til opnåelse af behandlede småkugler.

5 Man fjernede dyrkningsmedium, bortset fra 30 ml fra hver rulleflaske og tilsatte 30 ml frisk medium plus 10% FCS og 40 ml behandlede småkugler til flaskerne.

Flaskerne blev gennemboblet med 5% C02, og man sugede alle bobler bort. Man anbragte flaskerne i rulleanord- 10 ninger ved 3 rpm ½ time før man nedsatte hastigheden til 0,3 rpm. Efter tre timers forløb forsynede man yderli- gere en lille flaske med trypsin, og indholdet blev til- sat til alle rulleflaskerne, der indeholdt småkugler.

Når sammenflydningen havde nået 40-50%, vaskede 15 man kulturen i rulleflaskerne med 50 ml PBS og rullede I videre i 10 minutter, før man fjernede PBS. Cellerne blev dyrket i 48 timer i medium A [iscove's medium med I indhold af 0,2% FCS, 10“8M hydrocortison, 2 mM glutamin, I 100 enheder/ml penicillin og 100 pg/ml streptomycin].

20 Derefter indhøstede man supernatanten fra kulturen, idet man centrifugerede ved 3000 rpm i 15 minutter og lagrede

ved -70°C. Man tilsatte igen til kulturerne medium A

med indhold af 10% FCS og dyrkede i 48 timer. Dyrk- I ningsmediet blev kasseret, hvorefter man vaskede celler- 25 ne med PDS som ovenfor og dyrkede i 48 timer i medium A.

I Man indhøstede igen supernatanten og behandlede den som tidligere beskrevet.

I Man indkoncentrerede ca. 30 1 medium, der inde- I holdt 1A6 celler til ca. 2 1 på en Millipore Pellicon I 30 enhed, forsynet med to kassetter med afskæringer ved mo~ I lekylvægt 10.000, idet man filtrerede 200 ml pr. minut I og tilbageholdt ca. 1000 ml pr. minut. Koncentratet I blev diafiltreret mod ca. 10 1 50 mM Tris (pH 7,8) med DK 175465 B1 13 samme apparat og samme hastigheder. Det diafiltrerede koncentrat blev med en hastighed på 40 ml pr. minut påsat en én liter DE cellulosesøjle, bragt i ligevægt med 50 mM Tris (pH 7,8). Efter påsætning vaskede man søjlen 5 med samme hastighed med en liter 50 mM Tris (pH 7,8) og derefter med to liter 50 mM Tris (pH 7,8) tilsat 50 mM NaCl. Søjlen blev derefter i rækkefølge elueret med seks 1 liter portioner 50 mM Tris (pH 7,5), der indeholdt følgende koncentrationer af NaCl: 75 mM; 100 mM; 10 125 mM; 150 mM; 200 mM; og 300 mM. Man indsamlede fraktioner (50 ml) og sammenbragte de aktive fraktioner, som blev indkoncentreret til 65 ml på en "Amicon ultra-filtration stirred cell unit" forsynet med en YM5 mem-I bran. Dette koncentrat blev påsat en 2 liter AcA54 gel- I 15 filtreringssøjle, bragt i ligevægt med PBS. Gennemløbet I var 80 ml/time, og man indsamlede fraktioner på 10 ml.

I Aktive fraktioner blev sammenbragt og direkte påsat en I C4 "high performance liquid chromatography" (HPLC) I søjle.

I 20 Prøver, hvis rumfang var 125-850 ml, og som inde- I holdt 1-8 mg protein, hvoraf 10% var hpG-CSF, blev påsat I søjlen med en gennemstrømningshastighed på 1-4 ml/min.

I Efter påsætning og en første vask med 0,1 M ammoniumace- I tat (pH 6,0-7,0) i 80% 2-propanol med en gennemstrøm- I 25 ningshastighed på lml/minut. Man indsamlede 1 ml frak- I tioner og undersøgte for proteinindhold ved 220 nm, 260 I nm og 280 nm.

I Ved denne rensning blev fraktioner, der indholdt I hpG-CSF klart adskilt (som fraktionerne 72 og 73 ud af I 30 80) fra andre fraktioner, der indeholdt protein. Man I isolerede hpG-CSF (150-300 pg) af en renhed på.ca. 85 ± I 5% og med et udbytte på ca. 50%. Fra dette rensede ma- I teriale benyttede man 9 pg i forsøg nr. 4, en aminosy- I DK 175465 B1 resekvensanalyse, hvor man påsatte proteinprøven til en TFA-aktiveret glasfiberskive uden polybren. Man udførte sekvensanalysen med en AB 470A sekvensopdeler ved frem- gangsmåden ifølge Hewick, et al., J. Biol. Chem., 256, 5 7990-7997 (1981) og Lai (Anal. Chim. Acta, 163, 243-248 (1984). Resultaterne af forsøg nr. 4 vises i Tabel I III·

TABEL III

I 10

II 5 10 I

Thr- Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu -Pro- I 15 20 I 15 Gin- Ser - Phe - Leu - Leu - Lys -(Lys)- Leu -(Glu)-Glu- I 25 30 I Val- Arg - Lys - Ile -(Gin)- Gly - Val - Gly - Ala -Ala- 20 Leu “X — X — I forsøg nr. 4 opnåede man efter 31 gennemløb I (svarende til rest 31 i Tabel III) ingen yderligere sig- I nifikant oplysning om sekvensens forløb. Til opnåelse I 25 af en længere tydelig sekvens i et femte forsøg reduce- I rede man 14 yg hpG-CSF oprenset fra behandlet dyrknings- I medium med 10 yl β-mercaptoethanol i en time ved 45°C, I hvorefter man tørrede grundigt under vakuum. Proteinre- sten blev genopløst i 5% myresyre og påsat en polybren- I 30 behandlet glasfiberskive. Sekvensopdelingsanalysen blev I udført som ved forsøg nr. 4 ovenfor. Resultaterne fra I forsøg nr. 5 gives i Tabel IV:

DK 175465 B1 I

15 I

TABEL IV I

1 5 10 I

Thr- Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu- Pro- I

5 I

15 20 I

Gin- Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Glu- Gin- I

25 30 I

10 Val- Arg - Lys - Ile - Gin - Gly - Asp - Gly - Ala- Ala- I

35 40 I

Leu- Gin - Phe - Lys - Leu - Gly - Ala - Thr - Tyr- Lys- I

15 45 I

Val- Phe - Ser - Thr -(Arg)-(Phe)-(Met)- X- I

Aminosyresekvensen i Tabel IV var tilstrækkelig I

lang (44 rester) og nøjagtigt bestemt, at man derfra I

20 kunne konstruere sonder til opnåelse af hpG-CSP cDNA som I

I beskrevet nedenfor. I

Eksempel 2 I

I Blandt standardfremgangsmåder til isolering af I

I 25 relevante cDNA sekvenser findes en fremstilling af plas- I midbaserede cDNA "biblioteker", afledt fra revers tran- I skription af mRNA, der findes i donorceller udvalgt på basis af deres eksprimering af et udvalgt gen. Når man kender væsentlige dele af aminosyresekvensen af et be- I 30 stemt polypeptid, kan man benytte mærkede/ enkeltstren- I gede DNA sondesekvenser, der duplikerer en sekvens, som

I man antager findes i det relevante cDNA ved en DNA/DNA

I hybridiseringsprocedure, som man udfører på klonede ko- DK 175465 B1 pier af cDNA, som er blevet denatureret, så det forekom- mer på enkeltstrengsform. Weissman, et al., US patent nr. 4 394 443; Wallace, et al., Nucleic Acids Res., 6, 3543-3557 (1979), og Reyes, et al., Proc. Natl. Acad.

5 sci. (USA), 79, 3270-3274 (1982), og Jaye, et al.,

H Nucleic Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). Se også US

patent nr. 4 358 535, Falkow, et al., angående DNA/DNA

hybridiseringsprocedure ved diagnose; og Davis, et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial

Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, Ν.ΐ. (1980) siderne 55-58 og 174-176 angående H teknikken for koloni og plaquehybridisering.

Man ekstraherede al RNA fra ca. 1 g celler fra en blærecarcinomcellelinie 5637 (1A6) under anvendelse af 15 guanidiniumthiocyanat til kvantitativ isolering af ube- skadiget RNA. [Chirgwin, et al., Biochemistry, 18, I 5294-5299 (1979)].

I Den sterile vandige RNA opløsning indeholdt al RNA fra IA6 cellerne. For tilvejebringelse af messenger 20 rna alene ud fra opløsningen af total RNA lod man denne opløsning passere en søjle, der indeholdt oligodesoxy- I thymidylat [oligo(dT)] (Collaborative Research, Inc,,

Waltham, Massachusetts). Poly-adenylerede (poly-A+) endestykker, der er karakteristiske for messenger RNA, I 25 bindes til søjlen, hvorimod ribosom RNA elueres. Som et resultat af denne fremgangsmåde kunne man isolere ca. 90 I yg poly-adenyleret messenger RNA (poly-A+ mRNA). Det I isolerede poly-A+ messenger RNA blev forbehandlet med methylkviksølvhydroxid (Alpha Ventron, Danvers, Massa- I 30 chusetts) ved en slutkoncentration på 4 mM i fem minut- I ter ved stuetemperatur før anvendelse i en cDNA reak- I tion. Behandlingen med methylkviksølvhydroxid denatu- I rerer vekselvirkninger med messenger RNA, både internt DK 175465 B1 17 og med kontaminerende molekyler, som blokerer translation. Payvar, et al., J. Biol. Chem., 258, 7636-7642 (1979).

Ifølge Okayama-fremgangsmåden [Okayama, et al., 5 Molecular & Cellular Biology, 2, 161-170 (1982)] fremstillede man en cDNA bank, idet man benyttede mRNA, opnået fra IA6 celler. Man transformerede cDNA, idet man inkuberede i en værtsmikroorganisme E. coli K-12 stamme I HB101 til forøgelse af mængden.

I 10 I Eksempel 3 I Hybridiseringssonder, konstrueret på basis af den I terminale aminosyresekvens for hpG-CSP ifølge Tabel IV, I bestod af et sæt af 24 oligonucleotider, hver med en I 15 længde på 23 baser og med et indhold på tre inosinre- I ster. Sondeoligonucleotiderne blev franstillet ved I fremgangsmåden ifølge Caruthers, et al., Genetic I Engineering, 4, 1-18 (1982) og mærket med γ-32Ρ ATP, id- et de blev kinaseret med polynucleotidkinase. Sondeoli- I 20 gonucleotiderne, der svarede til messenger RNA for re- sterne 23-30 i sekvensen i Tabel IV, illustreres i Tabel i I V:

I TABEL V

I 25 I hpG-CSF sonder , 5' GC IGC ICC ^C ICC TTG GAT TTT3' H 30 Antagelsen af neutralitet for I-baserne var base- I ret på offentliggjorte arbejder af Takahashi, et al., I Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1931-1935 (1985) og I Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985).

DK 175465 B1 H Inosin kan imidlertid have en destabiliserende effekt, H hvis det baseparres med G eller T. Hos Takahashi, et H al., synes inosiner at besidde en neutral effekt, fordi de som gruppe i gennemsnit opnår næsten neutralitet 5 (f.eks. hvis tre med fordel parrer med C, og to ikke med H fordel parrer med T).

Til afprøvning af virkningen af baseparring mel- H lem I og G konstruerede man kontroleksperimenter ved hjælp af en N-myc gensekvens og klon. Sekvensen, der H 10 var udplukket fra N-myc genet, havde samme total indhold H af G og C ved de første to stillinger i hvert kodon, som var bestemt for hpG-CSF sonderne. N-myc prøvesonderne var af samme længde, indeholdt I i samme relative stil- linger og havde potentielt samme gennemsnitværdi for Tm 15 (62-66eC, idet de tre eller fire inosinrester, der fand- H tes, ikke blev talt med) som hpG-CSF sonderne.

Man konstruerede to grupper N-myc prøvesonder ved fremgangsmåden ifølge Caruthers, et al., se ovenfor.

Sæt I, som illustreret i Tabel vi, inkluderede: 1, en 20 23 mer med fuldstændig tilpasning; 2, i hvilken tre tredie-positions C er var erstattet med I'er under dan- I nelse af det værst mulige tilfælde ved tilsætning af I; I og 3, i hvilken fire tredie-positions C er var erstattet med I'er. Den anden gruppe testsonder var konstrueret, 25 så den repræsenterede én mere tilfældig fordeling af I inosinbasepar, hvorved man kunne opnå en baseparrende virkning, der i gennemsnit var neutral. Sæt II, som il- I lustreret i Tabel VI, inkluderede; 4, med indhold af to- I’er, der vil danne basepar med C og I med G; og 5, I 30 identisk med 4, idet der er tilsat et yderligere I:G ba- I separ.

DK 175465 B1 19

I TABEL VI

I 1. 5' CAC AAC TAT GCC GCC CCC TCC CC3' I 5 2. 5' CAC AAC TAT GCI GCC CCI YCI CC3' I 3. S' CAI AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3' I 4. 5' AAC GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3' I 10 I 5. 5* AAI GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3'

I Fem replikafiltre, der indeholdt N-myc DNA se- I

I kvenser og sekvenser fra DNA fra kyllingevæksthormon I

I 15 (som en negativ kontrol), blev ophedet i to timer ved I

I 80°C i en vakuumovn før hybridiseringen. Alle filtre I

I blev hybridiseret som beskrevet i Eksempel 4 for hpG-CSF I

I sonderne, med undtagelse af at hybridiseringsperioden I

kun var seks timer. Filtre blev vasket tre gange ved I

I 20 stuetemperatur og en gang ved^ 45°C, 10 minutter hver I

I gang. Filtrene blev kontrolleret med en Geigertæller. I

Filteret, der repræsenterede en N-myc sonde 3, I

I gav et meget svagt signal i forhold til de andre fire I

filtre med sonder og blev ikke vasket yderligere. Efter I

I 25 ti minutters vask ved 50 °C gav Geigertælleren følgende I

procentiske signal, idet sonde 1 sættes til 100%; sonde I 2 20%; sonde 3 (45°C), 2%; sonde 4 92%; og sonde 5 75%.

H Efter vask ved 55eC var procentværdierne: sonde 2 16%; I sonde 4 100%; og sonde 5 60%. En sluttelig vask ved 30 60eC gav følgende procentværdier: Sonde 2 1,6%; sonde 4 I 90%, og sonde 5 70%.

Således observerer man under tilstedeværelse af I tre I'er, som i sonderne 2 og 4 en op til 60-gange så DK 175465 B1 H stor forskel i signal, når man nærmer sig den teoretiske H værdi for Tm (I ikke inkluderet i beregningen) [baseret H på det værste tilfælde for baseparring med I (sonde 2)

og et relativt neutralt tilfælde med baseparring med I

H 5 (sonde 4)].

H De standardiseringsoplysninger, som man indvandt H ved N-myc prøvehybridiseringerne, blev udnyttet, når man H skulle vaske og kontrollere hpG-CFS hybridiseringen som H nedenfor til at vurdere, i hvor høj grad man kunne have H 10 tillid til resultaterne, når man benyttede en mindre H stringent vaskeprocedure.

Eksempel 4

Ved fremgangsmåden ifølge Hanahan, et al., J.

15 Mol. Biol. 166, 557-580 (1983) udspredte man bakterier, der indeholdt rekombinanter med cdna indsætningsstykker, som fremstillet 1 Eksempel 2 på 24 nitrocellulosefiltre (Mlllipore, Bedford, Massachusetts), anbragt på agarpla- der. Man inkuberede derefter pladerne til opnåelse af 20 ca. 150 000 kolonier, som blev replikaplattede på 24 an- H dre nitrocellulosefiltre. Man inkuberede replikafiltre- ne, indtil man opnåede adskilte kolonier. Bakterierne på filtrene blev lyserede på Whatman 3 MM papir, der var I næsten mættet med natriumhydroxid (0,5 M) i ti minutter 25 0g derefter plettet med Tris (1M) i to minutter, hvor- efter man plettede med Tris (0,5 M) med indhold af NaCl (1,5 M) i ti minutter. Når filtrene var næsten tørre, lod man dem opvarme i to timer ved 80eC i en vakuumovn, før de skulle hybridiseres med nucleinsyre. [Wahl, et I 30 al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 3683-3687 I (1979)] ; og Maniatis, et al., Cell, 81, 163-182 I (1976).

I Man forhybridiserede filtrene i to timer ved I 65°C i 750 ml 10 x Denhardt, 0,2% SDS og 6 x SSC. Man

DK 175465 B1 I

21 I

rensede filtrene i 6 x SSC og anbragte dem fire sammen, I

hvorefter man hybridiserede 14 timer i 6 x SSC og 10 x I

Denhardt. Der var ca. 15 ml opløsning i hybridiserings- I

beholderen med indhold af 50 x 106 cpm af 32P-mærket I

5 sonde (oligonucleotider). I

Efter hybridisering vaskede man filtrene tre ‘ I

gange i 6 x SSC (1 liter/vask) ved stuetemperatur, 10 I

minutter hver gang. Man vaskede filtrene to gange ved I

45eC i 15 minutter, en gang ved 50°C i 15 minutter og en I

10 gang ved 55°C i 15 minutter, idet man benyttede 1 liter I

6X SSC hver gang. Man autoradiograferede filtrene ved I

-70°C i to timer under benyttelse af en forstærkende I

skærm og Kodak XAR-2 film. På denne autoradiograf var I

der 40-50 positive signaler, deriblandt fem meget kraf- I

15 tige signaler. I

I Arealet, der indeholdt de stærkeste fem signaler I

I og yderligere fem positive signaler, blev skrabet fra I

I udgangspladerne og igen udplattet for en anden gennem- I

I søgning ved hjælp af samme sondeblanding og samme betin- I

I 20 gelser. Vaskhingen afveg, idet man vaskede ved høj tem- I

I peratur to gange ved 55°C i 15 minutter, og en gang ved I

60°C i 15 minutter. På baggrund af studiet af N-myc I

sonden i Eksempel 3 satte man slut vasketemperaturen I

I i den anden gennemsøgning i vejret, idet det kombinerede 25 smeltepunkt for de 24 23-mere var 60-68°C, som i N-myc sonderne. Umiddelbart efter den anden vask ved 55°C lod I man filtrene autoradiografere i fugtig tilstand. En I sammenligning af denne autoradiografi med en anden auto- I radiografi, optaget samme tidspunkt efter slutvasken ved I 30 60°C, viste at kun to af de ti afprøvede kloner ikke led I et kraftigt tab i signalstyrke, når man forøgede tempe- raturen fra 55-60°C. Man kunne senere vise, at disse to I kloner var af næsten identisk længde og besad næsten I DK 175465 B1 H samme mønster for restriktionsendonucleaser. Man ud- valgte en klon, betegnet Ppo2, til sekvensopdeling.

Man udførte sekvensopdelingen af den rekombinante H hpG-CSP cDNA klon Ppo2, opnået ved den ovennævnte frem- H 5 gangsmåde ved didesoxymetoden ifølge Sanger, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 5463-5467 (1977). M-13 strengen med enkeltstrenget DNA blev benyttet som klo- ningsvektor og leverede enkeltstrenget DNA skabeloner til de dobbeltstrengede cDNA kloner. Sanger, et al.

10 fremgangsmåden gav den sekvens, der vises i Tabel VII

sammen med den tilsvarende aminosyresekvens og en kom- H plementær streng i den region, der koder for polypep- I . tid.

I 23 I

DK 175465 B1 I

I o f c coo soo ooo nyo uch I

I w O O H C E* H C f woo >»C ti .COO I

I a,UU OOO OOO Ou O O t· t· C t> C ti I

I >«0 O 0)00 OOO OOO 300 CkOO I

I HOOHl wuo >iO O a ti C 0)4(4 I

I OOOgj H C t PiOO 0^4 .300 <00 I

I ~ 3 O O <1 0) O O 0)00 w O O 0)00 300 I

I 2 a ti C >iC t· *H<fr· 0)00 X3 ti C a ti c I

I 2 »400 |4<«Ρ 33 O O W C E-ι ΛΗ4 »4 p 2 I

I S OOO 0»0 0 0)00 uUO 3t<4 u O O I

I * u O O w O O >ιΟ O Q> O O a ti C JC O O I

I 2^ PtOO 44H Ut*< CO C t· >4 0 0 ti C H I

81 W H u O O H00 300 opy >>ou ooo I

+ fiUO m H < 0) Ei C ® & C HOO hOO I

E*4H >00 »400 *4 U O OOO O« O O I

I 52 «00 c4ei aoo ooo wuo o>«tic I

o r-ι o o oh< η o >>«f t· o ki o o o ω ου ©hoo I

o M<oo NOOO o>)4(i ιβΡιΟΟ totQ4d HQOO I

I 52 1 3 «£ H 300 MUp a ti C « fj *4 3 0 0 I

O M 2 E-i H < f >iC P HOO a S C I

o OOO OOO t· ti C «4 0 0 3300 »4 t* 2 I

S· COO 3<t< kl O O OlOO 300 3 00 I

H4h W?J< X300 kpy afiC I-J C t· I

H g OOO »4 ti 2 t* C t* ti t« C >400 OOO I

I 52 hou aoo «uo ooo ecti ooo I

.52 aHC >iO O HUO wCJO HCp WOO I

*J o >00 ufi< <00 aoo ooo aoo I

I H o ki c h noo «tic aoo wuo w o o I

I 52 δ o o >»< t· >ιθ o aoo aoo I

I 33 O é C P i4 C P O f C H C t· w C 64 CO ti < I

I C o OlO O 30 0 300 >iOO 300 tlOO I

O hOO a £ C a P c HOU i|M Hh4 I

t! g tiPC »400 »400 OOO »4 t· < M < &4 I

52 300 300 noo 300 «00 ><o o I

h52 a f c a ti c >iC t< a t« c >ipy hoo I

ug >4 0 0 >4 0 0 |4 2 ti »4 0 0 O ti C OOO I

I ίο 52 a <41» m aoo so o nt4 >»oo s c gi I

C 52 r-ι O O C ΛΖ t« 4 H C ti aoo HOO H 4 fi I

m COOh α P 2 OOO cn f C ooo ooo I

I kifiCB ki O O COO MOO « C t! 300 I

o aoo aoo h c t· H4t* hoo a e-i c I

< cnCt· OOO 3300 <400 »400 I

I 52 O« O O COO 300 >|<4 tj 3 00 (OOO

H U Μ ·Η C t* M C Ei a f «4 HOO ® tj C HOO

H g 13300 OOO >400 OOO »400 COO

I S2 aoo ooo aoo soo coo eoo C UOO OUOO O H O O o a ti C O H C ti OH4Ei

! ti t* C H CU O O (*>4 0 0 m»400 r* O O O ©OOO

300 ορό acti spy spo spo " <n a η «4 at4 hoo a P C a f* c a ti c H 10 H *4 O O »4 0 0 <00 |4 O O »4 0 0 »4 0 0 I 1 *uo>iOOHpoaoo300 aoo hoo a f« C hoo a ti c

Cfl ti <4 ooo >00 <00 »400

uooaticsoocop >iOO

aoo acti a f C h c t· hoo

CA<Ei COO »400 OOO OOO

aoo >iO O 300 UOO coo hoo hoo hc f aoo hc ti coo ooo ooo cnct· ooo DK 175465 B1 >,<& c ου κυρ u o o o o u hOU h 4 Eh >i4 H Bi 0 4 4 0 4

H O O U O U O Eh Eh 4 4 O O 2 O O

H 300 0)0 0 bOU H 4 O O O O

ΦΕη4 «UO Bh 2 4 O O O

H juo λΒη< mbh< |i o £5 4 < g

H 34&i «6i< HOO 4 4 O Bi o U

Ή < Bh HUO 4 Eh 4 Bi U Bi < Bi Bi H oou 4 oo >oo o o u 2 < o 34Eh bBi< 300 Bi 4 U C o u H 3 B< «UO H 4 Eh 4 O O Bi O 4

H OOU WBi< OOU U 4 Bi o o U

H way ntuo 900 U 4 O O Bi Bh Η 4I£h< ή U O Φ Bi 4 O O U 4 o 4 s; 4 &i 40U «-3 U O Bi O Bi BH 4 Bi H ocoo oaiuo oatuo 4 O u 4 o o H NH<B i»· JC &H 4 »OjCEi4 U 4 Eh o O 4 rs rtCIUO HBiB< HftB? U U Bi 4 o o 0 COO (QUO kuo U 4 4 Bi O 4 a H 4 Bh HUO 0) O U U o U O S 3 4i OUO 400 O 4 Bh Bh 4 Bh O 4 Eh o ftOO OOO c oa o 4 Bi 4 4 Bi

«W bpu KUO r-(4Bi O 4 H O O O

w Bh? 4 PiOO OOO O Eh O O O O

H aiuo JJOO 300 O Bi 4 o EH O

Η Η H Eh 4 OL) H 4 Φ ? 4 4 Ih O Eh O 4 Η H w 4 Bh S4B< JUO 4 4 Bh U Bh o

> b U O QUO O Bh 4 O Bh U 4 O O

jCUO HUO -H4EH O 4 Bh O O O

J H 4 Eh 400 (BOO O U §h O O Eh

tu Vi o O >iEh 4 Vi O O 4 Bi EH Bi Ei EH O

J3 U O HOO «ΟΟ 0*00 U 4 O O O

a BH4EH OOO Cfl Bh 4 O Eh 4 U O O O 4

H 4 «uo coo <000 -»OUO O O O O O

HUO rH 4 Eh H O O b U O 4 Bh O O O

Eh 4 O U OUO 400 Η Λ O O 4 O &i 4 o I 2%i £88 3S3 Sgu g a S g g

Pi Eh 4 Eh 4 &< >00 OUO H Eh O O O

QiUO OOO 900 400 4 Eh O O O

m 4 Bi b O O Φ ÉH 4 HOO Bi O Bi Bi O

400 PtOO JUO 400 UOOO<

I 400 COO HOO 9 Bi 4 Bh BH O o O

HOO «-Η 4 Bi 4 Eh 4 Φ Eh 4 O O Eh Eh Bi

400 OOO >00 JOO Bi li O O O

OHUOO^pO O >iO O 0400 4 O Ei 4 O

H 4 Eh 4 M « B< 4 tnHOO r*H 4 Eh H Bh O O Bi

H>00 H JUO HOOO H5QUO Bi O O Eh O

I αθ O 4 00 >4 Bh OOO Bi Bh Bh 4 O

»4Eh HUO HOO b O O 4 U O Eh |h

400 400 OOO 400 £h O O O O

300 O Eh 4 4 4 Bh 9 4 Bh 4 09 4 4 O

0) Eh 4 u O O HOO « Eh 4 4 O J-> 2 Bh tj

«300 PiOO 400 »400 Bh 4 CO 2 Eh O

COO 400 O O O H Eh 4 Eh O 4 4 rj H 4 EH HOO b o O 4 B· 2 Eh O 2 Eh 4 OUO 400 400 >00 4 O O Ei o 1 3 o U 4J o O 0»U O O O O Bi O 4 Eh Bi « Ei 4 Φ Ej 4 b o O b o O 0 0 0 4 0 4UU SG 4 Ei 400 400 Eh 4 Eh Eh En

25 I

DK 175465 B1 I

fr* < η < o o I

fri CJ < O < < U fri < < cj o

o cj cj < o cj I

fr· fri o cj 5 ft o o c o o o

O CJ O u u cj I

cj o o o o fr· fr* fri CJ fr· O fr« o m fr< o α o fr· o cj < p o

< O CJ CJ fri CJ

CJ U O fr« O %* CJ CJ CJ §i CJ fr· CJ fri fr· E* U fr« CJ < CJ CJ CJ <

fri O O CJ fri O

fr· cj α ti cj < λ cj fr· cj <. y cj

g fr· O CJ O < CJ

® o o fr· c o fr·

I o < O < CJ «C O

ii UCJCJOCJCJ

3 CJ CJ . CJ CJ CJ CJ

< CJ CJ fr· O fr*

. w CJ O < fr· O CJ

H < CJ CJ fr· fr* CJ

I > «£ < CJ fr· O < < cj cj ο α o j H H < o o

I u H CJ CJ CJ CJ CJ

w fri CJ CJ «ί fr· *<

{Q < fr» C <! CJ O

I rt* fri O CJ fr· CJ O

"· Æ < < fri O CJ

<3 cj cj cj fr cj

I fri CJ CJ fri CJ CJ

H U CJ fri fri < fri CJ CJ CJ fri fri I CJ < fri fri fri fri fri CJ CJ fri fri fr« U fri CJ fri fri fri I CJ CJ < fri CJ fri u cj cj fri fri α fri O < CJ O fri

I < O CJ CJ O CJ

< fri CJ fr· fri <

< CJ < CJ CJ CJ

I CJ fri *< fri fri fri

3 0 CJ «£ CJ CJ

< < 2 H fri O O CJ CJ CJ o < fri CJ CJ CJ <

CJ O fr* o < CJ

I < O O CJ CJ CJ

CJ O O fri CJ < CJ o o o o o I CJ < O CJ < fri

fri O CJ fri O CJ

CJ O O fri fri CJ

^— I DK 175465 B1 Η *5 o H < o o < e< u o cj

Eh E< o o

H E-I CJ

H o CJ

Η h o O E-· CJ o OM E< 0 3 0 < M < U O < .

H ^ CJ O <

H ^ O < CJ D

+j tj O El _ (O < E-i O *5 H O o u g V4 ti < o ® O < o E- <0

iL| H

C CJ B* Λ o U El

O CJ O

H <° μ < υ e* H > o cj o *« ^ O < C (1)

W

CJ Ei 2 -G - H W < Η E· 0 ^ H m o CJ tt η ·~~· ” c H 2 ! Ό C o u E^ JQ 2 ^ 0 0 4 ® < < O « ® O O O 3 g I O O C A Ti I O E< U . t? *< CJ EH < ^ I O O E· >| }j I O CJ O « m

o < < O W

Eh o < _ μ

O E* O ® M

Eh O E< “ £ · I C E* CJ Ώ ? I O CJ < Λ X, O < 2 C ^ '

I O CJ Μ (N +J

O O o l 05 I EH Η E. S n I CJ CJ E· M «.

C O S ·« Ή O < u *— O < c o o o O O Ε»

DK 175465 B1 I

27 I

De følgende karakteristika for sekvensen i Tabel I

Vil bør bemærkes. I 5'enden af sekvensen vises baser, I

der svarer til, hvad man finder i en poly G cdna sammen- I

binder. Derefter findes ca. fem baser (betegnet ”ΝΠ), I

5 hvis sekvens ikke kunne bestemmes nøjagtigt ved Sanger, I

et al. fremgangsmåden på grund af den lange G sekvens, I

der kommer umiddelbart forud. Sekvensen, der følger, I

udviser en serie af 12 kodoner, der koder for en del af I

en antagen ledersekvens for polypeptidet. På basis af I

10 korrespondens med den terminale aminosyresekvens i na- I

turligt isoleret hpCSF, beskrevet i Eksempel 1, er den I

første threoninrest i den antagne "færdige" form for I

hpG-CSF betegnet med +1. Derefter ses det, at færdig I

hpG-CSF omfatter 174 aminosyrerester, som vist. Efter I

15 "stop" kodonet (OP kodonet, TGA) forekommer omtrent 856 I

baser, der tilhører en ikke translateret 3' sekvens og I

en række A'er i poly A "halen". Unikke HgiAi og Apal I

restriktionsendonucleasesteder, så vel som to Stul ste- I

der (diskuteret nedenfor i forbindelse med konstruktion I

20 af et procaryotisk og eucaryotisk eksprimeringssystem) I

vises også i Tabel VII. Da der ikke findes asparaginre- I

I ster i polypeptidet, er der tilsyneladende ingen posi- I

I tioner, hvor man kan N-glycosylere. De understregede I

seks baser nær ved enden af den 3' ikke-translaterede I

I 25 sekvens repræsenterer et muligt polyadenyleringssted.

I Man bør bemærke, at begge de to yderligere cDNA

I kloner, identificeret ved hybridiseringsfremgangsmåden beskrevet ovenfor ud af total 450 000 kloner, ikke in- I kluderede DNA, der kodede for hele leader-sekvensen fra I 30 transkriptions-initieringsstedet og fremad. Alle tre I hpG-CSF kloner terminerede faktisk 5' regionen på nøjag- I tigt samme sted, et tegn på at den sekundære struktur i I det transkriberede mRNA i alvorlig grad hindrer dannel- I DK 175465 B1 Η H sen af cDNA hinsides dette sted. I praksis ville derfor en cDNA eksprimeringsscreening, som beskrevet hos Okaya- ma, et al., Mol. and Cell. Biol., 3, 280-289 (1983) og som blev benyttet til at isolere GM-CSF hos Wong, et 5 al., Science, 226, 810-814 (1985) uden videre ikke være benyttet til isolering af hpCSF DNA, da sådanne isole- ringssystemer almindeligvis er afhængig af tilstedevæ- reisen af transkriberet cDNA i fuld længde i de kloner, der bliver undersøgt.

10 Den ovenfor nævnte sekvens er ikke direkte i stand til at sikre direkte eksprimering af hpG-CSF i en mikrobevært. Til opnåelse af en sådan eksprimering skal hpG-CSF koderegionen forsynes med et initial ATG kodon og sekvensen skal anbringes i en transformationsvektor i 15 en position, hvor det kontrolleres af en passende promo- tor/regulator DNA sekvens. 1

Eksempel 5 I dette Eksempel benyttede man cDNA, der kodede I 20 for hpG-CSF som isoleret i det foregående Eksempel til I at gennemsøge en genomisk klon. Et phag λ menneskefo- I sterlever genomisk bibliotek [fremstillet ved fremgangs- måden ifølge Lawn, et al.. Cell, 15, 1157-1174 (1978) og opnået fra T. Maniatis] blev gennemsøgt ved hjælp af en I 25 haktranslateret sonde, bestående af to hpG-CSF fragmen- I ter, isoleret ved fordøjelse med HgiAI og Stul (HgiAl I til Stul, 649 basepar; Stul til Stul, 639 basepar).

I Ialt ca. 500 000 phager blev udplattet på 12 (15 cm) pe- I triskåle, og de dannede pletter blev udtaget derfra og I 30 sondehybridiseret ved hjælp af Benton/Davison fremgangs- I måden [Benton, et al., Science, 196, 180 (1977)]. Man I observerede ialt 12 positive kloner. Tre kloner (1-3), I der gav det stærkeste signal ved autoradiografi i en

DK 175465 B1 I

29 I

anden gennemsøgning, blev dyrket i 1 liter kulturer og I

afbildet ved fordøjelse med restriktionsenzymer og Sou- I

them blot under anvendelse af en radiomærket 24-mer I

oligonucleotid (kinaseret med y-^2p ATP) I

5 51CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3'. Afbildingsresultaterne vi- I

ste, at isolaterne 1 og 3 var identiske, og 2 indeholdt I

I 2000 yderligere baser 5'stillet til hpG-CSP genet. Der- I

I for benyttede man klon 2 til yderligere karakterisering. I

I Man fordøjede DNA fra klon 2 med Ri til frigivelse af et I

I ^ 8500 bp fragment med indhold af hpG-CSF, dette blev der- I

I efter underklonet i pBR322 og yderligere underkastet af- I

I bildning ved hjælp af fordøjelse med restriktionendonuc- I

I leaser, Southern Blot, Ml3 underkloning og sekvensopdel- I

I ing. Den opnåede sekvens vises i Tabel VIII. I

I DK 175465 B1 H o o o o o o o H o o o o o o o H >4 n n v tn to |s O O O ft * < ft ,4 ri O O U O 0 U U 3 0 o tf u o £. u ft « c ft o o o o, o b 3 υ Η ft o tf o wo o cu O O tf ft 81 O O H tf tf o o tf w < o u o

O U O O C O O \D a U

O ft ft O h tf O H S ft g 5 £ £ αυ ftiSo

H r ϋ ϋ U U (J tf iQCJ

O O ft O £ O U ^ U

^ftftOfttfOo < o η a m o u 2 O O ft tf μ u o 5 ft O ft O tf 3 ft u ouooclftoo tf tf o o w o u u U O tf ft n u o ft H U H o u >» < o u O ft tf u Η n o £

»451*00« S

O O tf ft tg ft u h

< O 0 H r-J U < G

uuo<<aoo

tf O O tf O .u o tf O

U U ft ft m « ft u o o u h a i x < ft u

Q ft ft O u O U

tf O O tf O ft 2 u ft tf o o u u tf o tf o tf o ft

h U tf tf O U ft O

L—i < y 2 u < cj tj ri O tf U O u u ft tj o 2 < o u o o >tftfoftutfft o u ft o < y δ „ tf ft ft O o O ft *J O ft ft ft O U tf o o tf o o 2 3

taOfttftfOOO

ft o u ft o u 2

ω o ft < ft < u o I

wftftoooft2 .* u u o o u S 2

„ tf o ft tf u u u I

E-> u o <i 2 < o g o < o ft u ft 2

H o o < o u o η I

o ft O tf ft u U

o ft < ft o o o I

UOUftOUft

o ft ft < u ft o I

ft ft o ft u o < I

H y o o o o o 3 I

H tf o < «t u o ft I

o o o 2 o o o I

tf tf O U O o o I

u o tf o o tf o I

u ft 2 u c u o I

tf o tf ft o 2 o I

tf o o o tf o 2 I

tf u ft o 2 u o I

u o o ft 2 o < I

o ο u λ 2 ft a I

u tf tf 2 u < u I

o o o tf o u o I

u ft o ft o o o I

tf tf O tf o tf u I

O ft O O O O ft I

tf a tf u o o ο I

o ft 2 ft o o ft I

UUUftftoU I

tf O O ft O O tf I

tf u u tf u ft cj I

tf u u 2tf I« o I

otfutfu oo I

oouo2ft2 I

u o u o ft S 3 I

ft ft tf tf O ft u I

tf ft U O O O O I

tf u ft < u tf < I

O U ft O O U tf I

I tf o ft a u ft 2 I

UOUftOUft I

I ft o tf ft u tf o ft I

ft ft U U O oo 4J O tf I

OUUft tfr-tuft o I

o U O O tflXtf u I

ufttfft 2 3 u o I

I tf o 2 ft ft «ft u I

y u u tf tf J u S I

< y Q O ftoajo tf I

u tf tf o u<N>,tf 2 I

I OUUft ft I ft 2 U I

UtfUO tf ft u u I

I uouo ft ai ft u I

31 I

DK 175465 B1 I

o o o o I

I o o o o o o

I ΟΟΟγΗΓΊΓ-) I

I 00 (Λ Η Η ^ Η I

I 3fr*0fr*00 40 I

I >oyofr*oo.o I

I o C 4 O O O O u p I (N rM < O 4 O O fr* fr« I 00 4004 00 I 30 4000 *0 I ·η< fr* < o o o* o I οο οοποαο

I 3< q o o o e« I

I 0) fr« 4 4 4 0 W <

I .JHOpUO>iO

I nu 4 0 4 0 «-· O I

I >.0 0004 00 I

I Ofr* 0040 3p

I nu οπού «S

I >.4 O fr« fr. O *J O

j 4 fri o 4 O * fr* 30 0400 0)0 I Ofr* 0040 Wfr* >juooo4au 30 00fr*P"«4 I 0)fr.u4poseu I Jou4t«4>«4 004004^0 rfr«4ooouo

0. fr« O O O O O 3 U I

w U u fri o o *n « fr*

_ g u o O O U JO

W 4 4 O O O 3 p z, CO U O O O « E«

I « '-t < o 4 4 4 o I

«1 o o fr* 4 4 o o

pooo p o o o 3 fr* ' I

rH u o fri o p 4 > u O CUO 000030 m so o o o o e> fr·

3 v fr o fr* 4 o ^ o I

»30 0040 30 I

uU 4U4U>-*4 OI O o 4 o fr* o o

Ofr« <04030

H U O p rj O 4 <”* 4 I

H 0)0 fr* 6« O O O O

> M< 004400 <0 O 0 4 0 0 *0

rHO p O fr* 4 O* O

J 40 6« O fr* O β O I

Ofr* 0 4 4 0 ·* 4

ω uO 0 0 0 4 MO I

w CL· O 404030

m >. O O 4 O 4 5^ O

® O fr. fr. fr« 4 O fr« I

. O O Ofr« 4 4 30 I

4 30 4 4 O U 0) fr*

0) fr* O fr* O O >-30 I

frt >3 0 fri 4 O O o n O I

O O O 4 4 0 ^ >* 4

u O in 3 o O O 4 tJ 4 I

CU0(*)4)fr*400U0 I

i-iuU iJO O fr* O >ι4 I

+ rowuooofr*fr' I

H4>i40 4 4 uU I

«j o <-)4fr*oo ry

IrHO 30400 fr* 4 4 0 ή 4 O O fr* 30

34 004fr*4 *h O

r-*4 C00 40 40 O O -* 4 O O 4 onfr«

CO OU O O O n>iU

ri 4 30400 Ofr« O O OLI fr* 4 fr* 4 o ^ O >3 O O O O 4 nfrtomoooo o >U<nr-.OfriOU o

U 4 4 O U fr* fr* O

roiQ4fr*uu o fr* 4 r-4 O O O O fr; O. O 4 O O O O 4

u O >i O E-ι O 4 O

fr* fr* r-< O 4 4 O O

3000004 fr* 0) fr* Q. fr* 4 O 4 fr*

J U 0) 4 4 O O O

3 4 4 0 O O fr* O

-*0>i00fr<0 fr* 4 0 r« O O O 4 4

u fr« O O O O 4 O

o) o c o o fr* o o t/1 4 *h 4 4 O O 4

O « O 00044 O

.-1--.4 0)0000 fr* i æ o r-t fr. fr. 4 4 o 0.OM4OOO 4

u O m O 4 O 4 O

fr*fr*>4400 t«

3 U >3 4 O O O O

« e σ» o o e« o fr* J O U O fr* o o o 3044404 4

0) fr. r-ι O O fr* O O

I DK 175465 B1 I

I 32 I

o O o O O I

o o O O O I

V m ve co I

H rH iH pH ιΗ * .Η I

UC<;<0 0 00 I

O >-h 2 o p-t O U 3 c I

y ου η 4 e! S ^ 3 I

S· ft V O pH > O < O O I

tt o Ql U ft rH -U O I

W < o < O <n o ft I

y 3 O <3 ft h * < I

y « F a o o 3 I

I 5 O O S U O o I

I $ Sg 5 S S g I

I § s s s p sy I

y<Nflj<juuo I

Ur'rHCJ n < O ft I

< < O £ O < ft I

I 9 y h < y s i

< < o» u < o I

U u a «c D o I

I 9 < < w y a I

< y 3 O *C O I

H < ft αι B o < I

y y j ft o 3 I

O ft w O O ft I

p-» o o £ o o < I

^ y eh E- < h 3 I

la y y o u o ft I

2 < ft u o ft o I

® o o a o ft < I

I f! y o o >, e-ι «c u I

I » < O O pH o O o I

O O O rH O O O < I

I ^ 2 £ 3 P y 3 I

— < ft 0) ft ft O

< y .j ft o o I

H ft ft 3 0 g ϋ I

M U O pH < ft ς*> I

μ y «; o o o o I

£ y < o o o o I

3 ft w O ft rf I

s y λ o o 3 I

_ ft y n o o 3 I

J < y a> u < < I

O o tn ft 3 u I

W y O 0) O O ft I

< < h e« o o I

m < O m < o <

*5 o >, o o o I

-tf« O < rH O ft O I

*** o o o δ o o I

_ < O 3 <4 O O I

ft O O pH 3 O - O I

ft < O O < «£ I

y y 3 o u 3 I

ft ft o) ft o S I

y u j o o rf I

< ft to o o 2 I

U < rH u ft ft I

ft ft < o ft o I

o o o c o o &» >-•30 U ® H < £h Ph

r^<Uft <c o O . ft ft I

•J U o 30 o < I

o c o ft o> ft (j u m

p»ph< u j o o ft I

O O O 3 0 < u I

30 O C) ft o o I

0» ft O JO ft Eh I

oy o >i o o ft I

<VU O pH o o c o ft ^JO O o O IN pH < <

< o ft CO H o o o I

CO U pH < CO o I

pH < O o O pH < < O O < n O O O o wtO 2 >!<OiO o

® o o ftftuo o I

W< 0 3 0 ft ft O I

oy ft e>fttt»o o I

HU ft J O rH ft O I

CUU O 4J o M < <

0)0 O £ ft u u o I

>> y < λ ft £ o ft I

O ft O 3 ft ft < O I

UO O o; ft nu ft I

«O ft JO £ o o I

W < y >iOft< o I

no ft rHOoJO ft I

0)0 O O O pH o S I

</)< ft o n o <4 O o I

30 ^ oo 01 O 0) ft O I

0) ft O W < £ ft ft

JO O 0) ft ft ft o I

<300 o Ή<αο ft I

von o O X O n < o I

fty y 30<3 o I

•β ft ft Φ ft O u o I

pH U O J O rH O O I

33 I

DK 175465 B1 I

O o O o o o o o I

o o O O o o o o

Ok o H in rn tj lo ko

r-1 IN IN IN IN IN IN IN

‘H< η ο p o η υ h I

au <oS<£t«<p I

uu η p h 2 u o h I

oj h 2 u u < u 2 < I

<eu H U O O U H O I

MU Η H O 4 Η H O I

4 0 H U 4 O 2 U 4 I

-» h < η ο o υ η υ I

4 H Η H U p Ο Η H I

> O U 4 U Η H O O I

3 0 H U U O U H O I

41 ί U Η H O U H O I

j u η h u 4 u h 4 I

<-» u 4 Η p u υ H o I

« El · Η O Η O O H U I

> o h 4 υ o o o 4 I

o >, p h o 4 eh u ο υ I

m »h O 4 H p U O H U

»h o o h u η h 4 ο o I

>* < O H 4 O U H O

»hu H H H o 4 4 u

uo 4 Η o 4 u 2 o I

«< q 4 4 o p q h I

rH U U U Η Η H Q U I

_ 4 o o o h 4 u o u I

c o η h 4 h 4 o u I

H O 4 U Η O O H O I

<0 4 u u u h 4 o u h I

ti D> U u u η o u p u

+j k. O υ h 4 4 o h u I

U 4 U U Η H O 4 H 4 I

o c o H U O H U H O I

rH 4 U O 2 Η H 4 4 I

Z. o u υ h 2 u u 2 q

41 u upuuuuu I

χ: h υ η υ υ o u o I

u Λ H 4 0 4 4 0 4 0 I

tit« 2 η η o h u h I

M rH U U U 4 O U O O I

M 4 0 u h 2 p h o u I

> H t« o o 2 h q h q I

0> O 4 u η u 4 o p

C/)HO«OOOUUOH I

.1 n>U Ot« U O C H O U I

M rHUVOU44UOpO I

M cur^wucjfuuép I

w oa>u«HOiUu<uout«

_ -<t x: e cuuo uuuu I

® Η O. H -H<U<H<Ut« I

^ «) υ ouohouuH I

2 »πυ«β0400 0 0Η I

40rHU000 HHH I

h OO 40044 H4H I

uUSHUOOOUO I

AU0JH4OHUOH

<uu«ju2oue->ou I

« H O tn O o H U O <4 U I

S4r-~H44UHOOH

ieu»Hauu4ouuu

rHUO'UUOOHOH

4 0 W040HUHO

>. H 4UOHUHCJH

rH o 344UU400

O O <UH2uCJU4U

CO «J00UUU04 rH 4 -Ht«0U0U<0

O U «J H O H <£ U U U

UU t* o 4 < o t< uu .CO 0>OOUHHU4

H 4 kiO<UOOOU

OU 4UOU HHHH

- n O k>U4H0 0 04

ft O >, < 2 u O 2 O O

O C o HH2oUU44 m *H 4 w p Η H U O O 2 rH o u «ohoo4 40

30 VJHHH4UOO

0> H rH0<U020U

JO ieHHUH4 4 0 «eu >o4H4 22h

»HU 30000 HOO

4 0 rH4 HOOH44

OH 0004 0 HOO

JHU 3002 H 4 OH

Λ U ΦΗ020 ΗΗΗ «ου •ju<2<<ueh »hu o φ u 2 2 u 2 o o

4O10.CHHOOHUO

«»UrHftHH4 0HUH

οι H kiUH0UH04 x 4 o>o<t«t«oou >« 2 C04HO4H44 rH U C0U4 2U00

oo »h4HOOOHO

30 ouoooooo

« H 3 O H 4 Η Eη Η H

jo «h4ho4oh

3 2 »J O Η O H 2 OH

rH< 0)HHHU2OH

I DK 175465 B1 I 34 o o o o o M o o o o r-

Η Γ» CO Ot Q O

<N γν <n m n

Et P Et Et g 5 o y tt tf o tf P 3 tf Ét υ ei o p

P tf Ρ P

o 3 o tf I <5 < 5 p I O 3 O o ft < p tt

< Ρ Ρ P

O Et P Et

Et §t tf tf I

tf υ P Et 3 tf < ft o 3 o |t O g P tf s s 8 a I S 3 S g y Et 3 o I 3 i i s

s S S g B

S « y u o

o < < o u I

H r o o P p o I

Η £ P Et Et Et tf I

o o o o §t 3 I

^ tf Et p tf p I

— o y < O H

O tf P Et P I

H g Ρ P Et tf

H Et ρ p tf y I

H U ft P U P I

^ ^ P Et tf Et I

Η ^ tf ρ ρ ρ p I

Ρ Ρ P Et Et I

, Ο o o υ 5

P Et u Et 3 I

I g g o p o I

W Et Et tf u p I

y p u Et Et I

CQ < tf O Et tf I

p u p p u I

> o u o < < I

* P < H 3 p I

p. p p u u < I

^ ^ Et p Et P I

< p p p o I

P tf Et Et p I

I g g p e« S i

ft p p o 3 I

P P Et tf P I

p p p 3 tf I

h p p 3 3 I

H Et p tf p u I

P tf p p p I

p p p 4 p I

P Et Et P tf I

ft ft. y P P I

|t p < < p I

Et Et p p tf I

tf P Et p P I

P p Et tf tf I

< tf p p p I

P P ft p tf I

P P |t p p I

Et Et y tf o I

p p p p p I

P P Et p p I

Ρ y P Et Et i

Et tf P p p I

P P Et p ρ I

P Ét Et tf Et I

tf ρ ρ ρ ρ I

O Et ρ p tf I

p p Et tf 3 I

P tf Ρ p Et I

tf ρ ρ ρ ρ I

P P tf p p I

P Et ρ ρ ρ I

Ρ P Et Et ρ I

P P P P Et I

y tf tf Et p I

tf tf ρ ρ ρ I

Et p ρ ρ o I

Η P Et tf tf I

Et tf Ρ P p I

|t tf ρ p tf I

Et tf p tf p I

Ρ P Et Ρ Ρ I

Et Et §t p Et I

y g Et p p I

< Et ρ p Et I

P P Et P P I

DK 175465 B1 I

35 I

Et restriktionsendonucleasekort (ca. 3,4 kb) for I

genomisk DNA, der indeholder hpG-CSF genet, vises i de- I

tailler i fig. 1. Restriktionsendonucleaserne i fig. 1 I

er: Ncol, N; PstI, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X; og I

5 κρη, K. Pilene under kortet viser den sekvenserings- I

strategi, man benytter for at opnå den genomiske se- I

I kvens. De indrammede regioner er sådanne, som man fin- I

I der i cDNA klonen og den punkterede åbne indramning re- I

I præsenterer en sekvens, der ikke findes i cDNA klonen, I

I 10 men er identificeret med blot med mRNA sonde. Man ud- I

I førte identifikationen af de kodende sekvenser, der fo- I

I reslås til exon én ved Northern blot analyse. En 24 mer I

I oligonucleotid sonde, 5'CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3', der I

I spændte over de antagne sammensplejsningsforbindelser I

I 15 for exonerne 1 og 2, blev hybridiseret med hpG-CSF mRNA I

I i Northern blot format. Det resulterende blot viser en I

I mRNA af samme størrelse (ca. 1650 bp), som man ser med I

en exon 2 oligonucleotidsonde. Dette resultat og evnen I

I til at dirigere eksprimering af hpG-CSF ud fra pSVGM- I

I 20 ppol vektoren (Eksempel 9) med Met initieringskodon, I

I vist i Tabel VIII, definerer de kodende sekvenser, der I

findes i exon 1. Exonerne 2-5 defineres ved de kodende I

I sekvenser, som man opnår i cdna klonen (Ppo2) fra hpG- I

I CSF genet (Tabel vil).

I 25 I Eksempel 6 (Reference)

Eksemplet angår præparering af et fremstillet I gen, der koder for hpG-CSF og omfatter kodoner til E.

coli.

I 30 I korthed anvendte man samme fremgangsmåde, som I vises i PCT publikation W083/04053, Alton, et al.

Generne blev konstrueret, idet man først samlede kompo- I nent oligonucleotider til multiple duplexer, som deref- I DK 175465 B1 ter blev samlet 1 tre adskilte sektioner. Disse sektlo- ner blev konstrueret, så de let kunne mangfoldiggøres, og efter fjernelse fra mangfoldiggørelsessystemet kunne samles 1 rækkefølge eller ved en ligering af mange frag- ^ menter til en passende ekspr1-meringsvektor.

Kontruktionen af sektionerne I, II og III illu- streres i tabellerne IX-XIV. Ved konstruktionen af sek- tion I, som Illustreret i Tabellerne IX og X, samlede 10 man oligonucleotiderne 1-14 til 7 duplexer (1 og 8; 2 og 9; 3 og 10; 4 og 11; 5 og 12; 6 og 13; og 7 og 14).

Man sammenbandt derefter de syv duplexer under dannelse af sektion I som vist i Tabel X. Man bør notere i for- bindelse med Tabel X, at sektion I indeholder opstrøms 15 en Xbal klæbende ende og nedstrøms en BamHI klæbende ende, der er nyttig til sammenbinding med mangfoldiggørelses- og eksprimeringsvektorer og til lig- ering til sektion II.

37 DK 175465 B1

TABEL IX

I 5

I EChpG-CSFDNA SECTION I

I CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA 1 I TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT 2 I XO CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG 3 I AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT 4 I GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA 5 I CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC 6 I TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG 7 l5 CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT 8 I GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT 9 I TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG 10 CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC 11 I TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG 12 I 20 ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG 13 I GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT 14 DK 175465 B1 H ooo o o u ouu ^B <oou æ π π

tf HUC5 HttC

o y o u o o

Eh tf E-ι < tf O O O O E* tf

f tf U U uO

e* tf u o ου H UU tf E* E* tf

t* < O U u O

^B o E-ι tf o E-i tf o O O

in O O r-i O U r- tf B

H py r-i O U r-l o u · E< tf σ\| o U ^-i| tf ε* H U O <hn < ml OO ^ IUO 3oh| H ,£-* < u o ioio u «ΝΙΟ u E< tf u o ' y y < f< u o tf E* tf E* t* tf ° jr· *5 o «f E-ι o < eh

**&<< o < E \o o O

Hf(< ΗϋΟ o o O U o u P <2 p O ^ < tf t* tf o u x y p !H 2 &4< < H o o u o „ py o u tf t· J E< tf tf £h tf E-t I ω o tf h ouo otfh

ntfE-j σ> tf E-i in u O

O Htf tf E* H tf E< ^ it! u u e< tf tf tf f U U Eh tf tf H En tf o o E« ξ! tf UO tf E< tf f4 ti tf E< tf tf f4 o u u o

E-· tf E-< tf O U

Η H

οϋΟ otfE-i o u O o O 03 2 N gu co tf E-ι 'f O U o tf El

O tf Eh tf Eh ηΕ< η E Q

Μου,ου oo om

fl QOWl E* < E-ttf OU

O tf H uo UO OU

I S mlOUOl tf E-i Eh tf W Up H tf r-l| tf f-l <N| tf

I . yp U O m I tf Eh r-ι u O

< tf E4 Estf tf fri H < I z P Pif4 ° E-ι tf o tf bi ouo &J r-i tf En r* E* tf nou cn e-i tf Y\ tf t! O o <-i tf E-ι h Ei <

y tfH ou tf e* tf^J

I tfE-iw tf E-ι UO o O 'il P y S if4 u u eh tf i-I|

Q< tf -Ql tf E-ι tf tMO U

Λ *{ XI U o u o o u y υ pu tf E4 ou w U o U O EH tf DK 175465 B1

I 39 I

I Som illustreret som i Tabellerne XI og XII i for- I

I bindelse med konstruktion af sektion II samlede man oli- I

I gonucleotiderne 15-20 i 8 dupiexer (15 og 23; 16 og 24; I

I 17 og 25; 18 og 26; 19 og 27; 20 og 28; 21 og 29; I

I 5 og 22 og 30). Derefter sammenbandt man disse 6 duplexer I

I til opnåelse af sektion II, som vist i Tabel XII. Som I

I yderligere vist i Tabel XII besidder sektion II opstrøms I

I en BamHl klæbende ende og nedstrøms en EcoRI klæbende I

I ende, der er nyttig til ligering til en mangfoldiggørel- I

I 10 sesvektor og til ligering til sektion I. Tæt ved ned- I

I strømsenden omfatter sektion II også et nedstrøms Sstl I

I sted, der er nyttig ved eventuel sammenbinding af sek- I

I tionerne II og ill. I

I i5 I

I TABEL XI I

I EChpG-CSFDNA SECTION II I

I 20 I

GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT 15 I

I TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC 16 I

I TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT 17 I

CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG 18 I

25 CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA 19 ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA 20 GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT 21 I ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG 22 GACAAG AAG AC AGCGG AGCCC ACGG 23 30 ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG 24 ACAG ACC AG AATGCAGTTG AG AC AGACA 25 I CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA 26 CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG 27 TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC 28 AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC 29 I AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC 30 I DK 175465 B1 I 40

O u O 0<B ©<B

© B < CM B < co B <

O U Ηϋϋ HUO

B < O O r*l O O

Eh< ©|< B <n| B<Ot| OU b2cm oo o o h||h 2 < o a cm u o ao b< <b o a a o o a ooo ©b< ot*< m b < «πao f»uo uohoohou

uu tffH <fH

<B <B B< ao^aooa tn|B 3 cni o a eh < nit· 3 b< <b a o a o o a

Eh < B < < t·

HH

o a o o t« < o B < a η» oa oao vo o o oi «jbhbc.hou o <b oo*o <b <£ w .. a o «jo a cm | uo 2 *r* t· < η o o o a eh U uo <f b< b * t* < uo uo oa

<HEH<B<<EH

j ao < b ao 2 b

H OOO o B < ' © < B © < B

w m B < os O U tn u O HUO h m pa EH< h < B cn Eh < J-j | ® η< uo oa uom - η < ao pacoioaco

< ao B< H < <n| <H

. b3 b2 o ja o ouoi CH tt < o o cmIeh < CM <ttro| a o f < a o cm|2 b

m H < ao < Eh OU

H M

o o a o b < o o a o o a Z CM Eh < CO o U Hl· U O Ot< o ao oa huo cm<b M oacn tt< tt< ou

B in U OCNIUO oa < B

a h|uo eh < oa op

W EH < B 3 o a < B

10 U O < B ml EH < 2 B

o a mu o cm| u o a o «c o a hio a < b o a

I Z I

O ooa o B < o <c B ©oo |X4 H EH < r~ U O m o U σ» B < W oa <B HOU HB< aao 2 b o o b 2 .

I UO UO OO <B

p O μ B < B < B < »Hg. uo uo uo x: < I b < b < < b ao<a oa ao b< u «I b < b < a o

DK 175465 B1 I

41 I

Endelig konstruerede man sektion III som vist i I

Tabellerne XIII og XIV. Med henblik på denne konstruk- I

tion samlede man oligonucleotiderne 31-42 i 6 duplexer I

(31 og 37; 32 og 38; 33 og 39; 34 og 40; 35 og 41; I

I 5 og 36 og 42). Man samroenligerede derefter de 6 duplexer I

I under dannelse af sektion III« som vist i Tabel XIV. I

I Som også vist i Tabel XIV omfatter sektion III opstrøms I

I en BamHI klæbende ende og nedstrøms en EcoRl klæbende I

I ende, nyttig til ligering i en mangfoldiggørelsesvektor I

I 10 og, i hvert fald når det drejer sig om EcoRl, i en ek- I

I sprimeringsvektor. Derudover besidder sektion II et op- I

I strøms SstI sted, nyttig ved eventuel ligering af sek- I

I tionerne II og III. I

I 15 TABEL XIII I

I ECHGpG-CSFDNA sektion III I

I 20 GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG 31 I

I CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG 32 I

I GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC 33 I AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG 34 I CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT 35 I 25 TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG 36 I AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG 37 I ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC 38 I TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA 39 I . ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC 40 I 30 CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG 41 I AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG 42 I 35 I DK 175465 B1

I 42 I

H o<^ o^<i

OUU cm U O

O O M

o o 4 h pi U O 4 E* 0| o o u u «e o o u o u 4 w

£4 H4 H

4 H CIO H

H 4 H 4 O U

oUU o<(4 o4H

inOU HUU H 4 H 4 Ή En 4 ©| Htf fi O O U O v 4 E-* o u aoi *-ih 4 H4

<NJ4 H n| niti 4 O O

n|4 η u u u o H u u p u u o H 4 H 4 U U <M|

U O H 4 4 H

0<t ouu OUU

^ U U ouu vo E-I 4

UU H t 4 HUU

. UUUUUO

> 4 H 4 H O U

H tj 4 Η H 4 «2 IH 4

X U U U U nu U

OO H 4 H 4

. H40U4H

UUUUUO

W o IH 4 o 4 Η o H 4

__ n|u U o\ O U m u U

® UU UU Ι-» u o

4 H 4 H O U

4 O O U O H 4 yuuuuu H 4 H H 4 H 4 O U U U H 4 M U o u o u u MUUH4H4

M

oH4 OUU OUU

Z cn 4 H eouo -3· u U

OH4r^(uu<-(UU

m UOn|. 4 Η 4H

H <h|uu O O ©I H 4 y nlo O n|U U n| H 4

W H 4 μ η H 4 U O

wuux»| H 4 h 4

O O tfl 4H 4H

44H«luUH4 o ouu ouu ouu

P4 h tf t r*H4 n4H

I « 4U UU h4§4 O4HH40Ur<l i u U H 4 U U Ό·

U U M UU mIH 4 I

ft H a, O U n|u U

J3 4 E| U O U U

U U m| H 4 H 4 I W ni HI4 H 4 43 DK 175465 B1

Xbal-BamHI fragmentet, dannt af sektion I, ligeres i en M13mpll phag vektor, åbnet med Xbal og BamHI.

Man genåbner derefter vektoren ved fordøjelse med BamHI og EcoRI, hvorefter man ligerer med BamHI-EcoRi frag-5 mentet, dannet af sektion II. På dette trin er sektionerne I og II blevet sammenbundet i den rigtige orientering. Derefter åbner man en anden Ml3mpll vektor ved hjælp af fordøjelse med BamHI og EcoRI og ligerer den derefter med BamHI-EcoRI fragmentet, dannet af sektion 10 III.

Man lader vektoren, der indeholder sektionerne I og II, fordøje med Xbal og Sstl. Ligeledes lader man vektoren, der indeholder sektion III, fordøje med Sstl og EcoRI. De mindste af de to fragmenter, der i begge 15 tilfælde dannes ved fordøjelsen, ligeres i et plasmid PCFM1156, som tidligere er åbnet med Xbal og EcoRI. Reaktionsproduktet er et eksprimeringsplasmid, der indeholder en kontinuert DNA sekvens, som vist i Tabel XV, og som koder for hele hpG-CSF polypeptidet med en amino-20 terminal methioninkodon (ATG) til initiering af translation i E. coli.

I DK 175465 B1 I

I 44 I

I 30 ti (0 30 3 t 30 af U f >,< I

0)6-1 OrH Uf Uf O f «4 <H U h3 I

JO O 4 JO JU 4U 4 0 4 0 O O I

I u f f ih Ή 4 Uf 3f 34 04 U4 I

OO OJ rot HO Of Of UO HU

Uf oo >0 40 JO JO 0« o 4 0 I

I uf oa 30 C 4 >if C O <0 4 (j»f I

0040) Of ri -H O ft 4 HU uo I

Uf 04 JO OO OO OO 40 40 I

I (Qf f>i 30 Uf CO 30 AJ o CPf I

r-l O O Ή rH 4 UO H4 Uf Uf uo I

40 OO OO Uf OO JO S 4 4o I

I Of OC 34 04 uf uf >,f co I

u04H<h4uo >i4 £ O Η O h4

ao oo oo ao ff f4 oo oo I

I >if ou oo uf so ao so υ o I

«Η O f Ή u O >iO Uf (04 Uf J3 f I

oo 4 m ao of jo 4 0 hu af I

I 34 4(0 (O f uf UO 30 30 <0 4 I

Uf 4 >i -h 4 UO J3 f Uf «Η 4 hu I

Jf 4 J S3 O Uf af JO OO 40 I

I 04 f CO O O uf 30 Uf 34 uf I

uO Ou >tO UO Uf £0 H< 0) o I

ao 04 Of uf jo f4 oo nf I

I >rHUf fH 30 30 >if O O 4J O (O f I

+ΛΟ f <0 Uf Uf rH o UO Uf rH O I

I f4 o> JO JO OO ao £4 40 I

I J Ha) O o o C 00)4 O O O ouf O >.f o co o uo I

I Uf N4H ΊΤ >|4 \o U u 00 DO oho NH4 rr c f w s 4 oo j 4 ao uf «-πo o Hoo rH a f

I n 4 43 UO Uf (0 f 30 C4 (0 4 I

f 4 rH >i4 rH O -u 4 Uf rH 4 rH O I

I 4 4 oo ff uo ao jo oo 40 I

I f 4 0 3 uf o<o so 34 ao 00 I

4 f U Λ O UO Uf rH 4 UO UO I

f oj f 4 ff hu 00 ff ao I

I 4 f a uf 00 C4 00 uf jo I

4 O >s Ή O UO Ή < u o rH f Uf I

f fo 40 ao 00 ao m u s4

I o 4 ra no uouf uf uf uf I

O 4 >. JhO rH f UO UO .CO ho

I 4 4J Of m 4 tflf Uf f 4 40 I

I O 03 30 >iO 30 UO Uf >,f I

OfU UfrHOUfrHf£OrHO

4 OJ JO OO JO m4 f 4 OO I

I 4 0 3 0) 4 3 f 0) f >if Uf C4 I

OfU >i4 Uf >iO rH O HU

I O OJ J 4 JO Uf OO 40 OO

I 4 f U 3 4 U f >,£· 34 Uf Uf I

I 4 fJ3 rH 4 UO HO rH 4 J= f £0 I 4 fa 00 uf 00 00 af f4

I 4 ou C4 Uf Uf 30 ao 00 I

I 40UrH<-H4rH0UfU4U0

I 4 4 u 00 ao 40 jo 40 ao I

I O 4c 30 >if 30 Uf Uf C4 I

I 4 <H uf rH o Uf rH o rH O H<

I f OO JO OO JO 40 40 OO I

I O O O O O U 4 030 OCO O C 4 O rH 4 030 I

rHUUfni-HOinUfr-<-Hd:C7\rH4rHUfnUf

I oa 40 jo 00 00 -η > o rH j o I

45 DK 175465 B1

o*t« u O

< O

3 O 0) b*

J O

Η bi «0 H

> O

σ>Ε-ι kl o < o kl o >i«< bi ti U t* 0) o 01 ti Ή < jj <0 E"l ίο >o 00 „ - t 53

O OO

U_| W 3 0

Φ H

> JO

* o mu

VO .C EH

J ·“·«*· f U *« En ” <u o « «*< ^ oo É< 3 0 t> 0» £h < JO < m £-> o 'i < < OB O C-· uti < Φ O <

01 Η H

«0 Eh ^ O O

iH U Γ'· kl O

< O Γ-» Pi o

•Η H CO

I® t* r-i <

> O O O

3 0 *0 E-*

rH O

J O < o Ή < 3 0 UH 0» 8*

> O JO

O O O Eh inn o -η <;

«η O O ή OB O

I DK 175465 B1 I

I 46 I

I Selv om man kan anvende en hvilken som helst pas- I

I sende vektor til at eksprimere dette DNA, kan man uden I

I videre konstruere eksprimeringsplasmidet pCFM1156 ud fra I

I et plasmid pCFM836, hvis konstruktion er beskrevet i EPO I

I 5 publiceret patentansøgning nr. 136 490. Man gennemskæ- I

I rer først pCFM836 med Ndel og afrunder enderne med Poll, I

I således at begge de eksisterende Ndel steder ødelægges. I

I Derefter lader man vektoren fordøje med Clal og Sadl, I

I så man fjerner en eksisterende polysammenbinder før lig- I

I 10 ering til en substitut polysammenbinder, som illustreret

I i Tabel XVI. Man kan konstruerer denne substitut poly- I

I sammenbinder ved fremgangsmåden ifølge Alton, et al., se I ovenfor. Kontrol af eksprimeringen i eksprimeringsplas-

I midet pCFM1156 foregår ved hjælp af en lambda promo- I

I 15 tor, som selv måske er under kontrol af et C1857 repres- I

I sor gen (såsom hvad der tilvejebringes i E. coli stamme I

I K12AHtrp). I

DK 175465 B1 I

M

Eh < 0£

< Eh O

UO O

u o w

< H

Eh < O U r«*

O U 'V

U O

Eh <

Eh <! rH

< £h 3

< EH rH <N

o u s o| ου <β EH *t a\ uil

Eh <3 m O U ov U O «* Ο O r*

H O U rH U O

> υ O <fl| Eh < *

I 3 EH £1 OU O

I EH UO £ I J Eh<-<Ehx|

I O U r-r < EH

I ω OUr-iEH<M

I eh < o ou ag,

I 03 < Eh C < Eh E

I Eh < -H 3 Eh (Tj I < < EH K Eh «ί CQj I Go » <e I b «£ η LD rH «£ Eh in I 3 Eh m >J «2 Eh r- I Eh < *J| Ej < 3 Eh «*C0| *t Eh . ·«

Η -H O U rH

O U «Η O U O

I OU ΌO UO £

I < EH zlu OU X

I o u z u o I o u 0\ U Ο «Η

3 Eh fN {" Eh < «I

Eh in < Eh > ou * ou <1

< EH M o U

I EH C to rH Hi Eh O

UOJQClOUr«

I Eh A X oJ U O

Hi 51 E< * < Η <N U Ο Ή

I' OUrHrHtfEHrH

I EH <£ U EH «£ IH

I H s «‘•Hi Eh <C Ό

I EHlSrHOlUOC

< EH (OIKI O U -n

O U rH EH SG

UO uh < Eh eh < in O U η I < EH rH o U VO 1 rH r-l I DK 175465 B1

I 48 I

Eksempel 7 (Reference) I

Dette Eksempel angår E. coll eksprimering af et I

H hpG-CSF polypeptid ved hjælp af en DNA sekvens, der ko- I

I der for [Met'1] hpCSF. Den anvendte sekvens var delvis I

syntetisk og delvis afledt fra cDNA. Den syntetiske I

I 5 sekvens benyttede kodoner egnet til E. coli. I

I Man fordøjede plasmidet Ppo2, der indeholdt hpG- I

I CSP genet vist i Tabel vil, med HgiAI og Stul under til- I

I vejebringelse af et ca. 645 basepar fragment, der inde- I

I holdt genet for færdig hpCSF (som vist i Tabel VII) med I

10 syv af ledersekvensens kodoner i 5' enden og ca. 100 ba- I

I separ i den ikke kodende 3'-ende. Fordøjelse med HgiAI I

tilvejebringer en 5' 4-base klæbende ende, der er iden- I

tisk med, hvad man får med PstI, og fordøjelse med Stul I

giver en lige ende. Dette medfører, at man uden videre I

I 15 kan indsætte fragmentet i Ml 3 mp8 (Rf) gennemskåret med I

I PstI, og med det ligeende-dannende restriktionsenzym I

I Hindi. Efter mangedobling i Ml3 lod man hpG-CSF DNA I

I udskære ved fordøjelse med Apal og BamHI, som henholds- I

I vis skærer ved Apal stedet, der indeholder kodonerne for I

I 20 resterne +3 til +5 i hpCSF og ved et BamHI sted "ned- I

I strøms" i forhold til Hindi stedet i Ml3 mp8 restrik- I

I tionssammenbinderen. For at man kunne opnå E. coli ek- I

sprimering af hpG-CSF polypeptidet, fremstillede man et I

I syntetisk fragment, som vist i Tabel XVII nedenfor. I

49 DK 175465 B1

TABEL XVII

5' - C TAG AAA AAA CCA AGG AGG TAA TAA ATA 3« - ttT TTT GGT TCC TCC ATT ATT TAT 5 Xbal -1 +1

Met Thr Pro Leu ATG ACA CCT CTG GGC C - 5' TAC TGT GGA GAC -3' A£al 10 I Som man kan se ved analyse af Tabel XVII, omfatt- I er sammenbinderen en Apal klæbende ende, kodoner, der

I koder for de første tre rester i aminoenden af hpG-CSP

I 15 (og som "genopretter" kodonerne, der koder for Thr1, I Pro2 og Leu3, og som blev udslettet ved Apal fordøjelse I af Ml3 DNA, beskrevet ovenfor, og under anvendelse af I kodoner, der fortrinsvis eksprimeres i E. coli), et I translationsinitierende ATG, en sekvens på 24 basepar, I 20 der tilvejebringer et ribosombindingssted og en Xbal I klæbende ende.

I Eksprimeringsvektoren, som man anvender til E.

I coli eksprimering, var den, der beskrives som pCFM536 i I EPO patentansøgning nr. 136 490, Morris, offentliggjort I 25 io. april 1985. (Se også A.T.C.C. 39934, E. coli JM103 I med indhold af pCFM536). Kort fortalt fordøjede man I plasmid pCFM536 med Xbal og BamHI. Man ligerede deref- I ter hpG-CSF fragmentet (Apal/BamHI) og sammenbinderen I (Xbal/ Apal), beskrevet ovenfor, under dannelse af et I 30 plasmid, der blev betegnet p536Ppo2.

I Man transformerede plasmid p536Ppo2 i en phag I modstandsdygtig variant af E. coli AM7 stammen, som tid- I ligere var blevet transformeret med plasmidet pMWl I DK 175465 B1 I 50

I (A.T.C.C. nr. 39933), der indeholdt et Cl857 gen. Man I

kontrollerede transformationen ved hjælp af markørgenet

H for antibiotisk modstand (amp), som bæres af stamfader- I

plasmidet pCFM536. Cellekulturer i LB urt (ampicillin I

. 5 50 yg 1 ml) blev opretholdt ved 26°C, og efter vækst af I

celler i kulturen til a600. 0,5, inducerede man hpCSF

I eksprimering, idet man forhøjede temperaturen af kultu- I

ren til 42°C i tre timer. Den sluttelige O.D. af kul- I

turen var A600 =1,2.

10 Man bestemte niveauet for eksprimering af hpG-CSF I

af de transformerede celler på en SDS-polyacrylamidgel, I

farvet med blå coomassifarve til at være 3-5% af total I

cellulær protein. I

Man indhøstede celler ved centrifugering ved 3500 I

I 15 g i 10 minutter på en JS-4,2 rotor. Man knuste celler i I

vand 25% (w/v), idet man lod opslæmningen passere tre gange gennem en French trykcelle ved 10.000 psi. Den sønderdelte cellesuspension blev centrifugeret ved 10.000 g i 15 minutter i en JA-20 rotor. Bundfaldet I 20 blev igen suspenderet i vand og solubiliseret med et I indhold på ca. 5 mg/ml total protein i 1% laurinsyre, 50 mM Tris, pH 8,7. Det solubiliserede materiale fra bund- faldet blev centrifugeret ved 15.000 g i ti minutter, og man satte CuSo4 op til en koncentration på 20 mM til su- 25 pernatanten. Efter en time påsatte man denne prøve en I C4 HPItC søjle til rensning ifølge fremgangsmåden i Ek- I sempel 1 (B) med korrektioner for rumfang og koncentra- I tion.

I Man udviklede en anden rensningsfremgangsmåde med 30 henblik på større mængder af hpG-CSF formuleret i en puffer, der indeholdt ikke-organisk materiale. Dette I materiale er egnet til in vivo studier. Man udsuspende- I rede 150 g cellepasta i ca. 600 ml 1 mM DTT og lod det

DK 175465 B1 I

51 I

fire gange passere gennem en Manton Gualln homogenisa- I

tor ved ca. 7000 psi. Den knuste cellesuspension blev I

centrifugeret ved 10.000 g 1 30 minutter, og man udsu- I

spenderede bundfaldet i 400 ml desoxycholat (DOC), 5 mM I

5 edta, 5 mM DTT, og 50 mM Tris, pH 9. Denne suspension I

blev sammenblandet i 30 minutter ved stuetemperatur og I

centrifugeret ved 10.000 g i 30 minutter. Man udsuspen- I

derede igen bundfaldet i ca. 400 ml vand og centrifuge- I

rede ved 10.000 g 1 30 minutter. Bundfaldet blev solu- I

10 biliseret i 100 ml 2% sarkosyl og 50 mM ved pH 8. Man I

tilsatte CuS04 op til 20 ym og holdt blandingen under I

omrøring 16 timer ved stuetemperatur, hvorefter man een- I

trifugerede ved 20.000 g i 30 minutter. Til supernatan- I

tan tilsatte man 300 ml acetone. Denne blanding blev I

15 anbragt på is i 20 minutter og derefter centrifugeret I

ved 5000 g i 30 minutter. Bundfaldet blev opløst i 250 ml 6 M guanidin og 40 mM natriumacetat ved pH 4 og påsat en 1200 ml G-25 søjle, bragt i ligevægt og drevet med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. Praktioner med indhold af 20 hpG-CSF (ca. 400 ml) blev sammenbragt og påsat en 15 ml I CM-cellulosesøjle, bragt i ligevægt med 20 mM natrium- I acetat ved pH 5,4. Efter påsætningen vaskede man søjlen

I med 60 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 25 mM

I natriumchlorid og derefter eluerede man søjlen med 200 I 25 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 37 mM natrium- I chlorid. 150 ml af dette gennemløb blev indkoncentreret I til 10 ml og påsat en 300 ml G-75 søjle, bragt i lige- I vægt og drevet med 20 mM natriumacetat og 100 mM natri- I umchlorid ved pH 5,4. Fraktioner med relevant indhold I 30 (35 ml) blev sammenbragt og filtersteriliseret. Slut- I koncentrationen af phG-CSF var 1,5 mg/ml, det var mere I end 95% rent som bestemt ved analyse på en gel og inde- I holdt mindre end 0,5 ng pyrogen pr. 0,5 mg hpG-CSF.

I DK 175465 B1 I 52

Indholdet af pyrogen blev bestemt under anvendelse af et I

Llmulus Amebocyte Lysate (LAL) prøveudstyr (M. A. Bio- I

products, Walkersville, Maryland). I

I 5 Eksempel 8 I

I dette Eksempel benyttede man et pattedyrscelle- I

eksprimeringssystem til at fastslå, om et aktivt poly- I

peptidprodukt ud fra phG-CSF DNA kunne eksprlmeres 1 og I

udskilles af pattedyrsceller (COS-1, A.T.C.C. CRL-1650). I

10 Systemet blev konstrueret, så det kunne tilvejebringe I

udskillelse af et polypeptid analogt til phGCSF ved eks- I

primering og udskillelse af en delvis syntetisk, delvis I

cDNA-afledt konstruktion, der kodede for [Ala1] hpG-CSF, I

hvor der foran var anbragt et leader polypeptid med en I

15 sekvens af aminosyrer es ter, som henføres til human G- I

-CSF ifølge Wong, et al., Sciense, 228, 810-815 (1985) I

og Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360- I

4364 (1985).

Eksprimeringsvektoren, som man anvendte til fore- I

I 20 løbige studier af eksprimering af polypeptidprodukter I

I ifølge opfindelsen, var en "shuttle"-vektor, der inkor- I

porerede både pBR322 og SV40 DNA, og som var blevet kon- I

strueret til autonom replikation både i E. coli og i I

pattedyrsceller, idet eksprimeringen i pattedyrsceller I

25 af indsat exogen DNA var under kontrol af en viral pro- I

motor/regulator DNA sekvens. Denne vektor, betegnet I

I pSVDM-19 i E. coli Hn 101, blev deponeret 23. august I

I 1985 hos American Type Culture Collection, 12301 Par- I

I klawn DRive, Rockville, Maryland, med nr. A.T.C.C. I

I 30 53241.

I Ved konstruktion af ekspressionsvektoren udførte I

I man følgende specifikke manipulationer. Man syntetise- I

I rede en DNA sekvens, der kodede for leader, som nævnt i I

53 DK 175465 B1

Tabel 20 nedenfor.

TABEL XX

5 -17

Hindlll Met Trp

5' “ A GCT TCC AAC ACC ATG TGG

3' - AGG TTG TGG TAC ACC

10 -10

Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val

CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG

GAC GTC TCG GAC GAC GAG AAC CCG TGA CAC

15 I “1+1 I Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Leu I GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC CTG GGC G -3' I CGG ACG TCG TAG AGA CGT GGG GAC -5' I 20 Apal I Som det ses af Tabel XX, omfatter sekvensen Hin- I ? 5 I dill og Apal klæbende ender og kodoner for de 17 amino- I syrerester, som man mener tilhører "leaderen" for human I GM-CSF. Derefter følger kodoner for en alaninrest, en I prolinrest og en leucinrest. Prolin- og leucinresterne I 30 duplikerer de aminosyrer, der findes ved positionerne +2 I og +3 i hpG-CSP, hvorimod alaninresten duplikerer den I første aminosyrerest (+1) i GM-CSP snarere end den før- I ste i hpG-CSF.

I Man havde konstrueret ombytningen af threonin I med alanin, idet det derved ville være lettere for den I DK 175465 B1 Η I 54

I aktuelle værtscelle at fjerne GM-CSF leaderpeptidet ved I

I cellemekanismer, normalt forbundet med udskillelse af I

I GM-CSF.

I Man fordøjede plasmid pSVDM-19 med Kpnl og ud- I

I 5 fyldte til lige ender med Klenow enzym. Derefter gen- I

nemskar man DNA med Hindlll. Det resulterende store I

I fragment blev kombineret og ligeret med Hindlll/Pvull I

I fragmentet, der er vist i Tabel VII (isoleret fra plas- I

mid Ppo2 som det næststørste fragment efter en Hindlll I

I 10 fordøjelse og en delvis fordøjelse med PvuII) under dan- I

I nelse af plasmid pSV-Ppol. Derefter ligerede man det I

I fremstillede GM-CSF leadersekvensfragment i Tabel VIII I

I i pSV-Ppol (efter at det var kløvet med Hindlll og Apal) I

til opnåelse af plasmid pSVGM-Ppol. I

I 15 Man transformerede calciumphosphatprecipitater I

I (1-5 yg) af plasmid pSVGM-Pol DNA i duplikat 60 mm pla- I

I der af COS-1 celler, i det væsentlige som beskrevet I

I ifølge Wigler, et al., Cell, 14, 725-731 (1978). Som I

kontrol transformerede man også plasmid pSVDM-19 i COS-1 I

20 celler. Man Indhøstede supernatanten over vævskulturen I

fem dage efter transficering og analyseredes for hpG-CSF I

aktivitet. Udbyttet af [Ala1]hpG-CSF fra kultursuperna- I

tanten var af størrelsesordenen 1-2,5 yg/ml. I

Efter den positive eksprimering af plasmidet I

pSVGM-Ppol, der koder for [Ala^hpG-CSF 1 COS-i celler, I

konstruerede man en anden vektor, som omfattede den hum- I

ane GM-CSF leadersekvens, men havde en kodon for en I

threoninrest (naturlig forekommende i position li I

hpG-CSF), der erstattede kodonet for alanin ved denne |

stilling. I korthed syntetiserede man et oligonucleotid I

30 (5' CAGCATCTCTACACCTCTGGG) til positionsrettet mutagenese I

(SDM). Man ligerede Hindlll - BamHl hpG-CSF fragmentet I

i pSVGM-Ppol i Ml3mpl0 med henblik på SDM. Det nysyn- I

55 DK 175465 B1 tetiserede hpG-CSF gen, der indeholdt en Thr kodon i position 1, blev isoleret ved spaltning med Hindlll og EcoRl. Derefter klonede man fragmentet i pSVDM-19, forberedt ved kløvning med de samme to restriktions-5 endonucleaser. Den resulterende vektor pSVGM-Ppo(Thr) blev transformeret i COS celler, og udbyttet af hpG-CSF målt i supernatanten fra kulturen lå i området 1-5 yg/ml.

Endelig anvendte man den genomiske sekvens, hvis 10 isolering beskrives i Eksempel 5, til at danne en ekspressionsvektor til eksprimering hpG-CSF i pattedyrsceller. Mere detailleret lod man pSVDM-19 fordøje med Kpnl og Hindlll og benyttede det store fragment i en firedobbelt legering med en syntetisk sammenbinder med Hindlll 15 og Ncol klæbende ender, som vist i Tabel XXI. Et Ncol -BamHl fragment, der indeholdt exon 1 isoleret fra pBR322 (8500 hpG-CSF), en genomisk subklon, og et BamHl - Kpbl fragment med indhold af exonerne 2-5, isoleret fra plasmid pBR322 (8599 hpG-CSF genomisk subklon). Den resul-20 terende ekspressionsvektor til pattedyrsceller, pSV/ghG-CSF producerede 1-2,5 pg/ml hpG-CSF fra transformerede COS celler.

TABEL XXI

25

Hindlll 5’AGCTTCCAACAC

AGGTTGTGGTAC5'

Ncol 30

I DK 175465 B1 I

I 56 I

I Eksempel 9 I

Eksemplet angår fysiske og biologiske egenskaber I

I af rekombinante polypeptidprodukter beslægtet med et så- I

I dant ifølge opfindelsen. I

I I

I 1. Molekylvægt I

Rekombinante hpG-CSF produkter fra E. coli eks- I

primering som i Eksempel 7 havde en tilsyneladende mole- I

kylvægt på 18,8 kD, bestemt ved hjælp af reducerende I

10 SDS-PAGE (som man ville vente ud fra de angivne amino- I

syrer i Tabel VII), hvorimod naturlige isolater renset I

I som i Eksempel 1 har en tilsyneladende molekylvægt på I

I 19,6 kD. En teori om tilstedeværelse af N-glycaner, as- I

I socieret med de naturlige isolater, kan afvises, da der I

15 mangler asparaginrester i primærsekvensen for hpG-CSF i I

Tabel VII, og som følge heraf konstruerede man en frem- I

I gangsmåde til at bestemme, om O-glycaner var ansvarlige I

I for forskelle i molekylvægt mellem de naturlige isolater I

I og de ikke-glycosylerede rekombinante produkter. Man I

20 behandlede ca. 5 yg af naturligt isolat med neuramini- I

I dase (Calbiochem, LaJolla, Californien), man udtog en I

I prøve på 0,5 pg og inkuberede resten med 4 mU 0-glycana- I

se (endo-x-n-acetylgalactoseaminidase, Genzyme, Boston, I

I Massachusetts) ved 37°C. Man udtog lige store portioner I

I 25 efter fc, 2 og 4 timers inkuberuring. Disse prøver blev I

I underkastet SDS-PAGE side om side med det rekombinante I

materiale, afledt fra E. coli. Efter behandling med I

neuraminidase ændredes den tilsyneladende molekylvægt af I

isolatet fra 19,6 kD tril 19,2 kD, hvad der kunne skyl- I

30 des, at en "sailic acidi! rest blev fjernet. Efter to I

timers behandling med O-glycanase ændredes molekylvægten I

til 18,8 kD - denne værdi er identisk med den tilsynela- I

dende molekylvægt af materialet, afledt fra E. coli. På I

57 DK 175465 B1 grund af carbohydratstrukturens følsomhed overfor neura-minidaser og O-glycanase, kan man foreslå følgende struktur for carbohydratkomponenten: N-acetyl-neuramin- syre-a(2-6)(galactose β(1-3) N-acetylgalactose-amin-R, 5 hvori R er serin eller threonin.

I 2. Optagelse af 3H-Thymldln I Man undersøgte induktion af vækst ved celledeling I for humane knoglemarvsceller, baseret på voksende inkor- I 10 porering af 3H-thymidin. Man underkastede human knogle- I marv fra sunde donorer en opdeling med hensyn til den- I sitet ved hjælp af Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharma- I cie) og udsuspenderede celler med lav densitet i I Iscove's medium (GIBCO), der indeholdt 10% kalvefoster- I 15 serum og glutamin pen-strep. Derefter inkuberede man I 2xl04 humane knoglemarvsceller med enten kontrolmedium I eller det rekombinante E. coli materiale fra Eksempel 7 I i plader med 96 fordybninger med flad bund ved 37°C, med I 5% CO2 i luften i to dage. Man foretog dobbeltanalyser I 20 og lod koncentrationen variere med en faktor 10.000.

I Kulturerne blev derefter holdt under pulsering i fire I timer med 0,5 μ Ci/fordybning 3H-thymidin (New England I Nuclear, Boston, Massachusetts). Man målte optagelsen I af 3H-thymidin som beskrevet hos Ventua, et al.. Blood,

I 25 781 (1983). Ved dette forsøg kan humane hpG-CSF

I isolater inducere inkorporering af 3H-thymidin i humane I knoglemarvsceller i et ca. 4-10 gange højere niveau end I ved anvendelse af kontrolsupernatanter. hpG-CSF mate-r I rialet, afledt fra E. coli, ifølge Eksempel 6, havde li- I 30 gnende egenskaber.

I Man udførte et andet studie over vækst ved celle- I deling af humane knoglemarvsceller, idet man anvendte et I dyrkningsmedium fra transficerede COS-1 celler ifølge

I DK 175465 B1 I

I 58 I

I Eksempel 9, og opnåede samme resultater, hvad der var et I

I tegn på, at det kodede polypeptidprodukt faktisk som ak- I

I tlvt materiale blev udskilt i dyrkningsmediet. I

I 5 3. Inducerlnq af differentiering i WEHI-3B D+ I

I Evnen hos rekombinant materiale afledt fra E. co- I

I li, til at inducere differentiering i den myelomonocy- I

tiske leukæmicellelinie WEHI-3B D+ fra mus, blev under- I

søgt i et halvfast agarmedium, som beskrevet i Metcalf, I

10 int. J. Cancer, 25, 255 (1980). Man inkuberede det re- I

kombinante hpG-CSF produkt og et kontrolmedium med ca. I

I 60 WEHI-3B D+ celler/fordybning ved 37°C med 5% C02 i I

I luften i syv dage. Man inkuberede prøverne i plader med I

I 24 fordybninger med flad bund og lod koncentrationen va- I

15 riere med en faktor 2000. Kolonierne blev opdelt som I

ikke-differentierede, delvis differentierede eller fuld- I

stændig differentierede, og man talte celler i kolo- I

nierne under mikroskop. Man fandt, at det rekombinante I

materiale fra E. coli inducerede differentiering. I

20 I

4. Analyser for CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM I

Man . fandt, at naturlige isolater af pluripotent I

human G-CSF (hpG-CSF) og det rekombinante pluripotente I

human G-CSF (rhpG-CSF) kunne få menneskelige knogle- I

25 marvsceller til at undergå celledeling og differentie- I

res. Disse aktiviteter blev målt ved CFU-GM [Broxmeyer, I

et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)] BFU-E og CFU-GEMM . I

assays [Lu, et al., Blood, 61, 250 (1983)] under anven- I

delse af ikke-sammenhængende knoglemarvsceller med lav I

50 densitet fra sunde frivillige mennesker. En sammenlig- I

ning af CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM biologiske aktiviteter I

under anvendelse af enten 500 enheder hpG-CSF eller I

rhpG-CSF vises i Tabel XXII nedenfor. I

DK 175465 B1 I 59 I Alle koloniforsøgene blev udført med ikke-sammen- I hængende knoglemarvsceller med lav densitet. Man under- I kastede humane knoglemarvsceller en densitetopdeling med I Ficoll-Hypague (densitet 1,077 g/cm3; Pharmacia). Man I 5 udsuspenderede cellerne med lav densitet i Iscove's mo- I dificerede Dulbecco's medium, der indeholdt kalvefoster- I serum og anbragte dem på Falcon vævskulturskåle (nr.

I 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) i 1½ time I ved 37eC.

I 10 I TABEL_XXII (Reference)

I _CFU-GM BFU-E CFR-GEMM

I 15 Kontrolmedium 0 ± 0 26 ±1 0±0 I Naturligt hpG-CSF 83 ±5,4 83 ±6,7 4±0 I rhpG-CSF 87 ±5 81 ±0,1 6±2 I Kontrolmediet bestod af Iscove's modificeret Dul- I 20 becco medium plus 10% FCS, 0,2 mM hæmin og l enhed re- I kombinant erythropoietin.

I Ved et CFU-GM assay udplattede man de pågældende I celler i et antal på l x 105 i 1 ml 0,3% agar dyrknings- I medium, der omfattede supplementeret McCoy's 5A medium I ^ og 10% varmeinaktiveret kalvefosterserum. Man gennem- I søgte kulturerne for kolonier (mere end 40 celler pr.

I sammenklumpning) og undersøgte morphologien den syvende I kulturdag. Antallet af kolonier vises som middelværdi I ± standardafvigelse, bestemt ud fra firedobbelte for- I 30 søg.

I Ved BFU-E og CFU-GEMM assays satte man celler (1 I x 105) til en 1 ml blanding af Iscove's modificeret Dul- I becco medium (Gibco), 0,8% methylcellulose, 30% kalve-

I DK 175465 B1 I

I 60 I

I fosterserum, 0,05 nM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM hemin I

I og 1 enhed rekombinant erythropoietin. Man inkuberede I

I skålene i en fugtig atmosfære, der indeholdt 5% C02 og I

I 5% 02· Man opnåede et lavt oxygentryk ved hjælp af en I

I 5 oxyreducer fra Herning Bioinstruments (Syracuse, N.Y.). I

I Man talte kolonier efter 14 dages lnkubering. Antallet I

I af kolonier vises som middelværdi ± standardafvigelse, I

I bestemt ved dobbeltforsøg. I

Man fandt, at alle kolonier, der blev dannet i I

I 10 CFU-GM assayet, var positive overfor chloracetatesterase I

I og negative overfor ikke specifik esterase (a-naphthyl- I

I acetatesterase), i overensstemmelse med, at kolonierne I

I er af granulocyttype, Man fandt, at både naturlig hpG- I

I CSF og rhpG-CSF havde en specifik aktivitet på ca. 1 x I

15 io8 U/mg rent protein, når det blev undersøgt ved vok- I

I sende fortynding i et CFU-GM assay. BFU-E og CFU-GEMM I

I data i Tabel XXII er repræsentative for tre adskilte ek- I

sperimenter, og resultaterne ligner data, man tidligere I

I har opgivet for naturlig hpG-CSF. Det er vigtigt at be- I

20 mærke sig, at rhpG-CSF er overordentlig ren og fri for I

I andre mulige vækstfaktorer fra pattedyr på grund af sin I

I frembringelse i E. coli. rhpG-CSF er således i stand I

I til at understøtte dannelse af blandede kolonier (CFU- I

GEMM), og BFU-E når det tilsættes under tilstedeværelse I

25 af rekombinant erythropoietin. I

5. Forsøg med cellebindinq I

Det er tidligere blevet meddelt, at WEHI-3B(D+) I

celler og humane leukæmiceller fra frisk diagnosticeret I

30 leukæmi vil binde 125l-mærket G-CSF fra mus, og at der I

kan foregå konkurrence om denne binding ved tilsætning I

af ikke-mærket G-CSF eller human CSF-Ø. Man afprøvede I

evnen hos naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF til at konkurrere I

DK 175465 B1 I

61 I

om binding af 125l-hpG-CSF til leukæmiceller fra menne- I

sker og mus. Man ioderede højrenset naturlig hpG-CSF I

(>95% ren, 1 yg) [Trejedor, et al.. Anal. Biochem., 127, I

143 (1982)], og man skilte det fra reaktanterne ved I

3 hjælp af gelfiltrering og ionbytterchromatografi. Den I

specifikke aktivitet af det naturlige 125l-hpG-CSF var I

omtrent yCi/yg protein. Man afprøvede WEHI-3B(D+) I

fra mus og to præparationer af periferale myeloide leu- I

kæmiceller fra menneskeblod (ANLL, én klassificeret som I

10 M4, en anden som M5B) for deres evne til at binde I

125I-hpG-CSF. I

Museleukæmicellerne og de frisk indsamlede humane I

periferal myeloide leukæmiceller fra blod blev vasket I

tre gange med PBS/1% BSA. Man inkuberede WEHI-3B(D+) I

15 celler (5 x 106) eller friske leukæmiceller (3 x 106) i I

dobbeltforsøg i PBS/1% BSA (100 yl) under fravær eller I

nærvær af forskellige koncentrationer (rumfang: 10 yl) I

ikke mærket hpG-CSF, rhpG-CSF eller GM-CSF og under til- I

stedeværelse af ^2^I-hpG-CSF (ca. 100.000 cpm eller 1 I

20 ng) ved 0°C, i 90 minutter. (Totalrumfang; 120 yl). Man I

udsuspenderede cellerne igen og anbragte dem som et lag I

over 200 yl iskold FCS i 350 yl plastcentrifugerør og I

centrifugerede dem (1000 g, 1 min.). Man indsamlede I

bundfaldet ved at skære enden af røret af og talte bund- I

25 faldet og supernatanten hver for sig i en gammatæller I

(Packard). I

Man bestemte specifik binding (cpm) som totalbinding under fravær af en konkurrent (gennemsnit af to forsøg) minus bindungen (cpm) under tilstedeværelse af 30 et 100 dobbelt overskud af ikke-mærket hpG-CSF (ikke specifik binding). Den ikke-specifikke binding var maksimal 2503 cpm for WEHI-3B(D+) celler, 1072 cpm for ANLL (M4) celler og 1125 cpm for ANLL (M5B) celler. Det før- I DK 175465 B1

I 62 I

I ste og det andet eksperiment blev udført på adskilte I

I dage med samme præparation af 125I-hpG-CSF, og forsøgene I

udviser indre konsistens med henseende til procentværdi- I

en af inhibition, opnået for 2000 enheder hpG-CSF. Data I

5 angives i Tabel XXIII nedenfor. I

63 DK 175465 B1 å

H

jZ i o o — c m h in 2 <#> ►4 *-3

SCS VD O

E CN r- fa r4 *Π O 1

JQ

ri 15 I p* m ^ c σ> oo S»· H 2

H J

H X) *H fe 00 es S3 H m o E es es »4

o H

H

n <

XI

E"l Ή r-^^- i o «t on o η m o oo o + c o r·» \o o co vo r*

Q H H

CP df ro w as co in es h o in o o oo ή h o oo m n ooeo h es h £ E vøvDiOO h ro σ' v£) ro

Qj · · · · · · *

U Φ H fS r-l CS CS CO

ooooooo o o o

H OOOOOO O O

g ooesooes o o V, · · · · · · O o es O es es es

—» OH

rH

·· ·· C fa ·· fa Φ er co fa σ» to u hu w HU·· u H h i U es H I fa

3 C U V I CUiOCO

X · O D fa O · « 3 fa U

c ω σ> h x: fa co o H ^5 i 0 *! C Id JC X C «J 2 txuHc u ω h 2 o

I DK 175465 B1 I

I 64 I

I Som angivet i Tabel XXIII udviste 125I-hpG-CSF I

I binding til WEHI-3B(D+) leukæmicellerne. Bindingen blev I

I dosisafhængigt inhiberet af umærket naturligt hpG-CSF I

I eller rhpG-CSF, men ikke af GM-CSF. Derudover observe- I

I 5 rede man binding af naturligt hpG-CSF til humane myelo- I

I monocytiske leukæmiceller (ANLL, M4). Bindingen til I

disse celler har en parallel i væskeformige kulturers I

I respons til naturlig hpG-CSF, idet de differentierer til I

fuldt udviklet macrophager, bedømt ud fra morphologien. I

I 10 Den manglende binding af naturlig 125I-hpG-CSF til mono- I

cytiske leukæmiceller fra en anden patient (ANLL, M5B) I

I kan skyldes, at visse leukæmiceller kan differentiere på I

I en anden måde eller mangle receptorer for hpG-CSF. Evnen I

af rhpG-CSF til at konkurrere med naturlig hpG-CSF om I

I 15 binding til naturlig 125l-hpG-CSF er et tegn på, at re- I

I ceptorerne genkender begge former i lige høj grad. I

I Disse forsøg, der demonstrerer bindingen af na- I

I turlig 125I—mærket hpG-CSF til leukæmiceller, har en I

I parallel i evnen hos naturlig hpG-CSF til at inducere I

I 20 granulocytisk og monocytisk differentiering af knogle- I

I marvsceller med lav densitet, opnået fra en patient med I

I akut promyelocytisk leukæmi (M3) og en anden patient med I

akut myeloblastisk leukæmi (M2). Celler fra de to pa- I

I tienter blev dyrket i fire dage enten i dyrkningsmedium I

I 25 alene eller under tilstedeværelse af 1 x 105 enheder I

I rhpG-CSF. Celler fra M3 kontrolmediet inkuberet alene I

her var stadig af promyelocyt-type; hvorimod celler, I

I dyrket under tilstedeværelse af rhpG-CSF udviste fuldt I

I udviklede celler af den myeloide type, deriblandt en I

I 30 metamyelocyt, en kæmpe båndform og segmenteret meutro- I

I philis og monocyt. For denne patient var opdelingen af I

I 100 celler i kontrolgruppen 100% promyelocyter, og af I

I rhpG-CSF behandlede celler 22% blastceller plus promye- I

DK 175465 B1 I 65 I locyter, 7% myelocyter, 35% metamyelocyter, 20% bånd- I former plus segmenterede neutrofile, 14% monocyter og 2% I macrophager. En Interessant kendsgerning er, at en af I de polymorphonucleære granulocyter stadig Indeholdt et I 5 dominerende auerlegeme, et tegn på, at 1 det mindste I denne celle repræsenterede en differentieret celle, der I hørte til leukæmiklonen. Celler fra den anden patient I med myeloblastisk leukæmi (M2) blev også dyrket fire I dage tander fravær eller tilstedeværelse af rhpG-CSF.

I 10 Ved gennemsyn af M2 celler, der var dyrket i mediet I alene, kunne man iagttage store "blastagtige" celler, af I hvilke nogle besad kerner. Visse af M2 cellerne diffe- I rentierede, når de blev behandlet med rhpG-CSF, til I fuldt udviklede segmenterede neutrophile med rest af au- I 15 erlegemer i centret af neutrophilen, et tegn på at der I var foregået differentiering i en celle, der tilhørte I leukæmiklonen. En opdeling af 100 celler, der var un- I dersøgt morphologisk, viste, at cellerne fra kontrol- I gruppen bestod af 100% blastceller. De celler, der var I 20 behandlet med rhpG-CSF, bestod af 43% blastceller, 1% I myelocyter, 15% metamyelocyter, 28% båndformer plus I segmenterede neutrophile, 2% promonocyter og 11% mono- I cyter. Man undersøgte også leukæmicellerne med henblik I på differentiering ved fire andre koncentrationer af I 25 rhpG-CSF (5 x 103, 1 x 104, 2,5 x 104 og 5 x 104 U/ml, I data ikke vist). Selv ved de lavest afprøvede koncen- I trationer af rhpG-CSF (5 x 103 U/ml) var der tydelig I differentiering (cellerne differentierede længere end I til myelocyter) af M3 (50%) og M2 (37%) leukæmicel- I 30 lerne.

I DK 175465 B1 I

I 66 I

I 6. Immunassay I

I Til fremstilling af polyklone antistoffer til I

brug i immunassay anvendte man som antigen pluripotent I

I G-CSF, oprenset fra human blærecarcinom cellelinie 5637 · I

I 5 (1A6), som fremstillet i Eksempel 1 (B). På basis af I

I sølvnitratfarvning af polyacrylamidgeler vurderede man I

I materialet til at være 85% rent. Man immuniserede seks I

I uger gamle Balb/C mus med mange subkutane injektioner af I

I antigenet. Antigenet blev udsuspenderet i PBs og emul- I

I 10 geret med lige så store rumfang af Freund's komplette I

I adjuvans. I

I Dosis var 5-7 yg antigen pr. mus pr. injektion. I

I 18 dage senere forstærkede man immuniseringen ved den I

I samme mængde antigen emulgeret med et lige så stort rum- I

15 fang af Freund’s ikke-komplette adjuvans. 4 dage senere I

I udtog man museserum til afprøvning for indhold af det I

I antistof, der var specifikt overfor human pluripotent G- I

I CSF. I

Man overtrak Dynatech Immulon II Removawell I

20 strips i holdere (Dynateck Lab., Inc., Alexandria, Vir- I

I ginia) med hpG-CSF 5 yg/ml i 50 mM carbonat-bicarbonat- I

I puffer, pH 9,2. Fordybninger i plader blev overtrukket I

I med 0,25 yg i et rumfang på 50 yl. Man inkuberede de an- I

I tigendækkede plader to timer ved stuetemperatur natten I

I 25 over ved 4°c. Man fradekanterede opløsningen og inkube- I

I rede pladerne 30 minutter med PBS med indhold af 5% BSA I

I for at blokere den reaktive overflade. Man fradekante- I

I rede denne opløsning og tilsatte enten fortyndet pre- I

I immunserum eller serum til afprøvning til fordybningerne I

I 30 og inkuberede to timer ved stuetemperatur. Sera blev I

I fortyndet med PBS, pH 7,0, med indhold af 1% BSA. Man I

I fradekanterede serumopløsningen og vaskede pladerne tre I

I gange med Wash Solution (KPL, Gaithersburg, Maryland). I

67 DK 175465 B1 /

Tilsatte ca. 200.000 cpm ioderet kanin-antimus IgG (NEN,

Boston, Massachusetts) i 50 yl PBS, pH 7,0, med indhold af 1% BSA til hver fordybning. Efter inkubering 1½ time ved stuetemperatur fradekanterede man denne opløs-5 ning og vaskede pladerne fem gange med wash solution.

Man fjernede fordybningerne fra holderen og talte dem i en Beckman 5500 gamma tæller. Højaktiv museserum viste mere end 12 gange større reaktivitet end det tilsvarende præ-immune serum ved en fortynding på 1:100.

10 Man bestemte de immunologiske egenskaber af E.

coli-afledt hpG-CSF ved reaktivitet over for højaktiv museserum, der var specifikt overfor pattedyrscelle afledt hpG-CSF. Man overtrak Immulon II Removawells med 0,25 yg 90% ren E. coli afledt protein i et rumfang på 15 50 μΐ og analyserede museserummet som beskrevet ovenfor.

Højaktive musesera udviste en 24 gange højere reaktivitet overfor materiale fra E. coli end de tilsvarende præ-immune sera ved en fortynding på 1:100.

20 7. In vivo bioassay

Man forbandt Alzet osmotiske pumper (Alzet Corp.,

Palo Alto, CA; Model 2001) til permanente katetere i den 25 højre halsåre og implanterede dem under huden på syv syriske guldhamstre. Fire af pumperne indeholdt en puffer [ 20 mM natriumacetat (pH 5,4) og 37 mM natriumchlorid] og 1,5 mg/ml E. coli-afledt hpG-CSF, hvorimod 3 kun indeholdt puffer. Pumpehastigheden var angivet til at 30 være 1 μΐ/time i op til syv dage. Tre dage efter anbringelsen af pumperne var middelantallet af granulocy-ter hos de fire behandlede hamstere seks gange højere end hos de tre kontrolhamstere (puffer), og samtidig med

I DK 175465 B1 I

I 68 I

I det forøgede antal af granulocyter var der en firedob- I

I ling i antallet af totale lymfocyter. Antallet af I

erythrocyter blev ikke ændret ved behandlingen. Disse I

resultater er et tegn på, at det rekombinante materiale I

5 producerer en specifik forstærkning af produktionen af I

I og/eller frigivelse af granulocyter hos et pattedyr. - I

I Den opfinderiske DNA-sekvens, som koder for en I

hpG-CSF polypeptidanalog, kan være nyttig i henseende I

I til den information, den leverer om aminosyresekvensen I

I 10 fra pattedyrsproteinet, som tidligere har været utilgæn- I

geligt, trods analyseforsøg på isolater af naturligt fo- I

rekommende produkter. DNA sekvensen Ifølge opfindelsen I

kan være egnet materiale til anvendelse som mærkede son- I

I der ved isolering af hpG-CSF og beslægtet protein, der I

I 15 kodes af human genomisk DNA, såvel som cDNA og genomiske I

I DNA sekvenser fra andre pattedyrsarter. DNA sekvensen I

kan også være nyttig ved forskellige andre fremgangsmå- I

I der for proteinsyntese (f.eks. i insektceller) eller i I

I genetisk terapi på mennesker og andre pattedyr. Man I

20 venter, at DNA sekvenser ifølge opfindelsen er nyttige I

ved udvikling af transgene pattedyrs-specier, som kan I

I tjene som eukaryotiske "værter" ved produktion af I

I hpG-CSF og hpG-CSF produkter i store mængder. Se i den- I

ne forbindelse Palmiter, et al., Science, 222 (4625), I

I 25 809-814 (1983). I

I Med relevans til polypeptidanalogen ifølge opfin- I

delsen kan nævnes rapporter om den immunologiske aktivi- I

I tet af syntetiske peptider, som i det væsentlige dupli- I

I kerer aminosyresekvenser, der findes i naturligt fore- I

I 30 kommende proteiner, glycoproteinér og nucleoproteiner. I

I Mere detailleret har man vist, at relativt lavmolekylære I

I polypeptider indgår i immunreaktioner, som med henseende I

I til varighed og udbredelse ligner immunreaktionerne af I

DK 175465 B1 I 69 I fysiologisk signifikante proteiner som virale antigener, I polypeptIdhormoner og lignende« Blandt immunreaktioner- I ne på sådanne polypeptider er inkluderet provokation af I dannelse af specifikke antistoffer i immunologisk aktive I i 5 dyr. Se f.eks. Lerner, et al., Cell, 23, 309-310 I (1981); Ross, et al.. Nature, 294, 654-656 (1981); I Walter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77, I 5197-5200 (1980); Lerner, et al., Proc. Natl. Acad.

I Sci. (USA), 78, 3403-3407 (1981); Walter, et al., Proc.

I 10 Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 4882-4886 (1981); Wong, et I al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 7412-7416 I (1981); Green, et al., Cell, 28, 477-487 (1982); Nigg, I et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 5322-5326 I (1982); Baron, et al., Cell, 28, 395-404 (1982); I 15 Dreesman, et al., Nature, 295, 185-160 (1982); og I Lerner, et al.. Scientific American, 248, nr. 2, 66-74 I (1983). Se også Kaiser, et al., Science, 223, 249-255 I (1984) hvad angår biologiske og immunologiske aktivite- I ter af syntetiske peptider, som med tilnærmelse deler I 20 den sekundære struktur med peptidhormoner, men muligvis I ikke har primær strukturel konformation tilfælles med I dem.

Claims (12)

1. 3. Genomisk DNA-sekvens ifølge krav 1. I
2. 4. DNA-sekvens ifølge krav l,kendeteg- I net ved, at den er kovalent associeret med en på- I viselig markørsubstans, især en radioaktiv markør. I
3. 5. Enkeltstrenget DNA-sekvens ifølge krav 4. I
4. 6. Biologisk funktionelt plasmid eller viral I I DNA-vektor, kendetegnet ved, at det inklu- I I derer en DNA-sekvens ifølge krav 1. I
5. 7. Prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle, I 20 kendetegnet ved, at den er transformeret I I eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 1 I på en sådan måde, at værtscellen kan eksprimere po- I I lypeptidproduktet [Ala1] hpG-CSF. I
6. 8. Prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle, I I 25 kendetegnet ved, at den er stabilt trans- I formeret eller transficeret med en DNA-vektor ifølge I krav 6. I
7. 9. Værtscelle ifølge krav 7 eller 8, k e η - I d e t g n e t ved, at værten er en pattedyrscelle. I
8. 30 I 71 DK 175465 B1
9. 10. Fremgangsmåde til fremstilling af polypep-tidet [Ala1]hpG-CSF,' kendetegnet ved, at 1 man under egnede næringsbetingelser dyrker prokaryo- tiske eller især eukaryotiske værtsceller, der er 5 transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 1 på en sådan måde, at de kan eksprimere det nævnte polypeptid, og at man isolerer det ønskede polypeptid fra ekspressionen af DNA-sekvensen. 11. [Ala1] hpG-CSF som ikke naturligt forekom-10 mende polypeptid, kendetegnet ved, at det er produkt af ekspression i en prokaryotisk eller især eukaryotisk værtscelle af en DNA-sekvens ifølge krav 1.
10. 12. Farmaceutisk præparat, kendeteg-15 n e t ved, at det omfatter en effektiv mængde af po- lypeptidet ifølge krav 11 og/eller fremstillet ifølge krav 10, og et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, adjuvans eller bærer.
11. 13. Farmaceutisk præparat ifølge krav 12, yder-20 ligere kendetegnet ved at være frit for association med noget som helst humant protein.
12. 14. Anvendelse af polypeptidet ifølge krav 11 til fremstilling af et lægemiddel til tilvejebringelse af hæmatopoietisk terapi på et pattedyr. 25