DK174980B1 - Isoleret polypeptid med egenskaber som hpG-CSF, DNA-sekvens kodende for dette, plasmider indeholdende sekvensen, hermed transformerede/transficerede værtsceller, fremgangsmåde til fremstilling af polypeptidet, farmaceutisk præparat med indhold deraf .... - Google Patents

Description

i DK 174980 B1

Opfindelsen angår isolerede polypeptider, DNA-sekvenser, der ved eksprimering i en prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle koder for sådanne polypeptider, biologisk funktionelle plasmider eller virale 5 vektorer inkluderende disse DNA-sekvenser, prokaryo-tiske eller eukaryotiske værtsceller transformeret hermed, fremgangsmåder til fremstilling af polypepti-derne, farmaceutiske præparater indeholdende polypep-tiderne og anvendelse af polypeptiderae til fremstil-10 ling af lægemidler til hæmatopoietisk terapi. De omhandlede polypeptider har i det mindste visse biologiske egenskaber til fælles med naturligt forekommende human pluripotent granulocyt kolonistimulerende faktor (herefter ofte forkortet hpG-CSF).

15 Det bloddannende (hæmatopoietiske) system hos mennesker nydanner en række hvide blodlegemer (deriblandt neutrofile, makrophager og basofile/mastceller), røde blodlegemer (erythrocyter) og størkningsfremmende celler (megakaryocyter/blodplader). Man har anslået, at 20 det hæmatopoietiske system hos en gennemsnitlig mandsperson producerer ca. 4,5 x 1011 granulocyter og erythrocyter hvert år, hvilket svarer til en fornyelse af hele kroppens vægt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154 -158 (1985).

Man mener, at små mængder af visse hænatopoieti- « 2 5 ske vækstfaktorer er årsag til, at et lille antal "stam-faderceller" deler sig i en række blodcellelinier, at 2 DK 174980 B1 disse udbreder sig i så høj grad og til sidst uddifferentieres til fuldt udviklede celler i blodet. Da de hæmatopoietiske vækstfaktorer er til stede i umådelig ringe mængde, har bestemmelser og identificering af » 5 disse faktorer hvilet på en række forsøg, som op til nu kun skelner mellem de forskellige faktorer, baseret på deres stimulerende virkning på cellekulturer under kunstige omstændigheder. Som et resultat af dette har man frembragt et stort antal navne til betegnelse af et 10 langt mindre antal faktorer. Som et eksempel på den herskende forvirring kan man nævne, at betegnelserne IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF og PSF er forskellige navne, som man nu tror alle betegner samme hæmatopoieti- ske vækstfaktor hos mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 15 (1985). Se også Burgess et al., j. Biol. Chem. 2-2, 1988 (1977), Das, et al., Blood, 58, 600 (1980), Ihle, et al., J. Immunol, 129, 2431 (1982), Nicola, et al., J.

Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf, et al., Int. J.

Cancer, 30, 773 (1982), og Burgess, et al., Int. J.

Cancer, 26, 647 (1980), angående forskellige vækstregu-20 lerende glycoproteiner hos mus.

Anvendelse af rekombinantgenteknik har bragt en vis orden i dette kaos. For eksempel kender man nu til aminosyre og DNA-sekvenserne for human erythropoietin, som stimulerer produktionen af erythrocyter. (Se Lin, 25 PCT ansøgning nr. 85/02510, offentliggjort 20. juni 1985). Man har også benyttet rekombinante fremgangsmåder til isolering af cDNA for en human granulocyt-macrophag kolonistimulerende faktor. Se Lee, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360-4364 (1985) og Wong, et al., Science, 228, 810-814 (1985). Se også Yo-kota, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070 (1984), Fung, et al., Nature, 307, 233 (1984), og Gough, et al.. Nature, 309, 763 (1984) angående kloning af ge- 3 DK 174980 B1 ner fra mus, såvel som Kawasaki, et al., Science, 230, 291 (1985) angående human M-CSF.

Man har vist, at der findes en human hæmatopoie-tisk vækstfaktor, kaldet human pluripotent kolonistimulerende faktor (hpCSF) eller pluripoietin i dyrkningsmediet fra en human blærecarcinomceIlelinie, kaldet 5637 og deponeret under restriktive omstændigheder hos American Type Culture Collection, Rockville, Mary-'land som A.T.C.C. nr. HTB-9· Man har angivet, at phCSF, I® oprenset fra denne cellelinie, vil stimulere udbredelse og differentiering af pluripotente stamfaderceller og derved medføre produktion af alle de vigtige blodcelle-typer i forsøg, hvor man benytter udgangsceller fra menneskelig knoglemarv. Welte et al., Proc. Natl. Acad.

15 Sci. USA 82 (1985), 1526-1530.

Ved rensning af phCSF benyttede man: (NH4)2S04 udfældning: anionbytterchromatografi (DEAE cellulose, DE 52); gelfiltrering (AcA54 søjle): og C18 omvendt fase højkapacitet væskechromatografi. Man angav, at et prot-2Q ein, der blev identificeret som phCSF og blev elueret i den anden af to aktivitetstoppe i C18 reversfase HPLC-chromatografi, skulle besidde en molekylvægt (MW) på 18.000, bestemt ved hjælp af natriumdodecylsulphat (SDS)-polyacrylamid gelelektrophorese (PAGE) under anvendelse af farvning med sølv. Tidligere angav man, at «, 25 hpCSF skulle have et isoelektrisk punkt på 5,5 [Welte, et al., J. Cell. Biochem., Supp. 9A, 116 (1985)] og en høj differentierende aktivitet for den myelomonocytiske leukæmicellelinie WEHI-3B D+ fra mus [Welte, et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gale, 30 et al., eds., New Series, 28 (1985)]. Tidligere studier tyder på, at den faktor man identificerer som phCSF besidder overvejende granolycyt kolonistimulerende aktivitet i de første syv dage i et humant CFU-GM forsøg.

4 DK 174980 B1

Man har endvidere fra den humane blærecarcinom-cellelinie 5637 isoleret en anden faktor« betegnet human CSF-β, som man beskriver som en konkurrent til 125I-mær-ket granulocyt kolonistimulerende faktor (G-CSF) fra mus 5 med hensyn til binding til WEHI-3B D+ celler i en dosis» respons vekselvirkning, der er identisk ved, hvad man finder ved ikke-mærket G-CSF fra mus [Nicola, et al..

Nature, 314, 625-628 (1985) ]· Man har tidligere med delt, at denne sammenhæng mellem dosis og respons skulle være unik for ikke-mærket G-CSF fra mus, og ikke være 10 til stede hos sådanne faktorer som M-CSF, GM-CSF eller multi-CSF [Nicola, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 3765-3769 (1984)]. Blandt CSF'er indtager CSF-β og G-CSF den særstilling, at de begge i høj grad er i stand til at inducere differentiering i WEHI-3B D+ celler.

15 Nicpla, et al.. Immunology Today, 5, 76-80 (1984). Ved høje koncentrationer stimulerer G-CSF blandede granulo-cyt/makrophag kolonidannende celler (Nicola, et al., (1984) se ovenfor), hvilket stemmer med tidligere resultater, der tyder på, at der forekommer granulocytiske 2o monocytiske og blandede granulocytiske/monocytiske og eosinophile kolonier (CFU-GEMMM) efter 14 dages inkube-ring af humane knoglemarvskulturer med phCSF. Man har også beskrevet CSF-β som stimulerende for dannelse af neutrofile granulocytkolonier i forsøg, hvor man benytter knoglemarvs celler fra mus, en egenskab, som man har 25 benyttet til identificering af en faktor som en G-CSF. * På basis af disse ligheder har man identificeret human CSF-β med G-CSF (granulocyt kolonistimulerende faktor).

Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985).

Det lader til, i betragtning af deres fælles 30 egenskaber, at human CSF-β ifølge Nicola, et al., se ovenfor, og hpCSF ifølge Welte, et al., se ovenfor, er den samme faktor, soro man passende kan betegne som en human pluripotent granulocyt-koloni-stimulerende faktor 5 DK 174980 B1 (hpG-CSF). Det ville være meget ønskeligt at kunne karakterisere og rekombinantproducere hpG-CSF på baggrund af den meddelte evne hos G-CSF fra mus til fuldstændig at undertrykke in vitro population af WEHI-3B D+ leu-5 kaaniceller ved "fuldstændig normale koncentrationer"» og i betragtning af» at man har rapporteret, at urensede præparationer af G-CSF fra mus ved indsprøjtning kan undertrykke eksisterende transplanterede myeloid-leukæmier hoe mus. Metcalf» Science, 229, 16-22 (1985)· Se også 10 Sachs, Scientific American, 284(1), 40-47 (1986).

Hvis hpG-CSF skulle vise sig at være terapeutisk betydningsfuld, og det bliver nødvendigt at kunne fremstille det i kommercielle mængder, vil isolering fra cellekulturen næppe kunne tilvejebringe den nødvendige mængde materiale. For eksempel bør man lægge mærke til, 15 at der synes at være restriktioner mod kommerciel udnyttelse af celler fra Human Tumor Bank, såsom blærecarci-nom-cellelinie 5637 fra mennesker (A.T.C.C. HTB9), som man har angivet som kilde for naturlige hpCSF-præpara-ter; Welte, et al., (1985), se ovenfor).

20 De i publikationerne af Welte et al. og af Nicola et al. (se ovenfor) beskrevne polypeptider, altså "naturprodukter isoleret fra cellelinien 5637 har imidlertid vist sig at være blandinger af polypeptider med henholdsvis 174 og 177 aminosyrerester, idet omtalte 25 cellelinie producerede to forskellige RNA'er kodende for sådanne. Disse naturprodukter omfatter en blanding af ca. 80% af 174-aminosyre typen og ca. 20% af 177-aminosyretypen, og sidstnævnte har kun en biologisk aktivitet på ca. 5% af førstnævnte. Det ville være en 30 fordel at have ren 174-aminosyretype til rådighed med sin større biologiske aktivitet end blandingen; publikationerne giver dog ingen vejledning til fagmanden i den henseende.

6 DK 174980 B1

Den omtalte fordel opnås imidlertid med det isolerede polypeptid ifølge opfindelsen, der er ejendommeligt ved, at det består af blot en del af eller af hele aminosyresekvensen 1-174 angivet i den nedenfor viste 5 Tabel VII, der a) besidder en eller flere af de biologiske egenskaber, der er typiske for naturligt forekommende human pluripotent granulocyt kolonistimulerende faktor (hpG-CSF) med sekvensen vist i nævnte Tabel VII; b) ikke er et naturligt forekommende polypeptid; og c) 10 er produktet af prokaryotisk eller eukaryotisk ekspression af en exogen DNA-sekvens.

Polypeptideme stammer fra eksprimering i proka-ryotiske/eukaryotiske værter (som bakterier, gær eller dyrkede celler fra planter, insekter og pattedyr) af exogene DNA-sekvenser, opnået ved genomisk eller cDNA-kloning eller ved syntese af gener. Produktet fra typiske gærceller (f.eks. Saccaromyces cerevisiae) eller prokaryotiske værtsceller [f.eks. Escherichia ooli (E. coli)] er fri for association med noget som helst pattedyr sprotein. Produktet af mikrobeekspriroering i verte- 20 bratceller (f.eks. pattedyr bortset fra mennesker og fugle) er fri for associering med nogen som helst former for humane proteiner. Afhængig af den anvendte vært vil polypeptideme ifølge opfindelsen kunne være glycosyle- .

rede med pattedyrs- eller andre eukaryotiske carbohy-25 drater eller kan være ikke-glycosylerede. Polypeptider ifølge opfindelsen kan også indeholde en start methionin aminosyrerest (ved stillingen -1).

Polypeptidprodukter ifølge opfindelsen kan mærkes, idet de associeres med en påviselig markørsubstans 30 (f.eks. radiomarkeres med 125I), hvorved der tilvejebringes reagenser, der er nyttige ved bestemmelse af tilstedeværelse og mængde af human hpG-CSF i vævsprøver og i væskeformige prøver, såsom blod eller urin. DNA- 7 DK 174980 B1 produkter ifølge opfindelsen kan også mærkes med påviselige markører, såsom radiomarkører og ikke-isotop markører såsom biotin), og anvendes i DNA-hybridiserings-processer, så man kan lokalisere positionen for human 5 hpG-CSF-genet og/eller positionen af en hvilken som helst beslægtet genfamilie i et kromosomkort. De kan også anvendes til identifikation af uregelmæssigheder vedrørende humant hpG-CSF-gen på DNA-niveauet og benyttes som genmarkører til identifikation af nabostillede 10 gener og deres uregelmæssigheder.

Den ovenfor omtalte exogene DNA-sekvens, altså DNA-sekvensen ifølge opfindelsen, der ved eksprimering i en prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle koder for et polypeptid ifølge opfindelsen, er ejendommelig ved, 15 at den er DNA-sekvensen vist i nævnte Tabel VII eller sekvensens komplementære strenge.

Foretrukne udførelsesformer for DNA-sekvensen ifølge opfindelsen ses i de relevante underkrav.

I sammenhæng med denne DNA-sekvens er det biolo-20 gisk funktionelle plasmid eller den virale DNA-vektor ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at det/den inkluderer en DNA-sekvens ifølge opfindelsen, og den proka-ryotiske eller eukaryotiske værtscelle ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den er stabilt transforme-25 ret med en DNA-vektor ifølge opfindelsen, eller udtrykt på en anden måde, med en DNA-sekvens ifølge opfindelsen på en sådan måde, at værtscellen kan eksprimeer poly- I

peptidproduktet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling 30 af det omhandlede polypeptidprodukt er ejendommelig ved at man under egnede næringsbetingelser dyrker prokaryo-tiske eller eukaryotiske værtsceller ifølge opfindelsen, og at man isolerer ønskede polypeptidprodukter fra 8 DK 174980 B1 ekspressionen af DNA-sekvensen, eller udtrykt på en anden måde ved, at man under egnede næringsbetingelser dyrker prokaryotiske eller eukaryotiske værtsceller, der er transformeret eller transficeret med en DNA-S sekvens som angivet i Tabel VII på en sådan måde, at de kan eksprimere polypeptidet, og at man isolerer ønskede polypeptidprodukter fra ekspressionen af DNA-sekvensen.

Polypeptidprodukter ifølge opfindelsen kan alene eller kombineret, med andre hæmatopoietiske faktorer el-10 ler medikamenter være nyttige ved behandling af hæmato-poietiske afvigelser, såsom aplastisk anæmi. De kan også være nyttige ved behandling af hæmapoietiske mangler forårsaget af chemoterapi eller af stråleterapi. Chancen for, at en knoglemarvstransplantation lykkes, kan f. eks. forstærkes, hvis man tilfører hpG-CSF. Behandling med heling af brandsår og behandling af bakteriel forårsaget betændelse kan også forstærkes ved tilføring af hpG-CSF. Derudover kan hpG-CSF være nyttig ved behandling af leukæmi, idet det er publiceret, at den er i stand til at differentiere leukæmiceller. Welte, et 20 al., Proc. Natl. Åcad. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985) og Sachs, se ovenfor.

I overenstemmelse hermed er det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen ejendommeligt ved, at det omfatter en effektiv mængde af et polypeptid ifølge op-25 findelsen eller af et polypeptid fremstillet ifølge opfindelsen og et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, adjuvans eller bærer. Det er foretrukket frit for association med noget som_ helst humant protein.

Endelig kan et omhandlet polypeptid anvendes iføl-30 ge opfindelsen til fremstilling af et lægemiddel til tilvejebringelse af hæmatopoietisk terapi på et pattedyr, eller til standsning af proliferation af leukæmiske celler.

9 DK 174980 B1

Fagmanden vil, ved at læ&e følgende detailierede beskrivelse, som illustrerer udførelsen af opfindelsen, i de for tiden foretrukne udførelsesformer, kunne se adskillige aspekter og fordele ved opfindelsen.

5 Tegningen viser et delvis restnktionsendonucle- ase kort over hpG-CSF-genet forsynet med pile til belysning af strategien for sekvensering, som benyttes til opnåelse af den genomiske sekvens.

Ifølge opfindelsen har man isoleret og karakteri-1Q seret DNA-sekvenser, der koder for hele polypeptidse-kvensen i hpG-CSF eller dele deraf.

De følgende Eksempler skal illustrere opfindelsen og er især rettet på procedurer, der udføres inden identifikation af hpG-CSF cDNA og genomiske kloner, procedurer, der fører til en sådan identifikation og til se-15 kvensering, udvikling af ekspressionssystemer,, baseret på cDNA, genomiske og fremstillede gener og bekræftelse af eksprimering af hpG-CSF og lignende produkter i sådanne systemer.

Mere detailleret angår Eksempel l aminosyrese-20 kventering af hpG-CSF. Eksempel 2 angår fremstilling af et cDNA bibliotek til gennemsøgning for kolomhydridise-ring. Eksempel 3 angår fremstilling af hybridiserings-sonder. Eksempel 4 angår gennemsøgning for hybridise-ring, identifikation af positive kloner, DNS-sekvense-25 ring af en positiv cDNA klon og tilvejebringelse af information om den primære strukturelle konformation (ami-nosyresekvens) af polypeptidet. Eksempel 5 angår identificering og sekvensering af en genomisk klon, der koder for hpG-CSF· Eksempel 6' angår konstruktion af et 2Q fremstillet gen, der koder for hpG-CSF, hvori man anven- der kodoner, der hører til E. coli.

Eksempel 7 angår fremgangsmåder til konstruktion af en E. coli transformationsvektor, der indeholder DNA, 10 DK 174980 B1 der koder for hpG-CSF, anvendelse af denne vektor til prokaryot i sk eksprimering af hpG—CSF og analyse af egenskaberne af de rekoxnbinante produkter ifølge opfindelsen. Eksempel 8 (reference) angår fremgangsmåder til 5 konstruktion af en vektor, der indeholder DNA kodende for en analog (ikke ifølge denne opfindelse) til hpG-CSF, afledt fra en positiv klon, anvendelse af vektoren til transfektion af COS-1 celler og dyrkning af de transficerede celler. Eksempel 9 angår fysiske og bio- 10 logiske egenskaber af de rekombinante polypeptidprodukter ifølge opfindelsen.

Eksempel 1 15 (A) Sekvensering udført ved litteraturbekendte fremgangsmåder·

En prøve (3-4 pg» 85-90% ren SDS, sølvfarvning-PAGE) af hpG-CSF blev opnået fra Sloan Kettering Institute, New York, New York, den var isoleret og renset 20 ifølge Welte, et al., proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985).

Den N-terminale aminosyresekvens i denne prøve af hpG-CSF blev bestemt i et første forsøg ved mikrose-kvensanalyse under anvendelse af en ΆΒ407Α gasfase se- 25 kvensoopdeler (Applied Biosystems, Foster City, California) til opnåelse af sekvensen, der vises i Tabel I nedenfor. I Tabellerne I-IV benyttes enkeltbogstavskoder, "X" betyder en rest, som- ikke kunne bestemmes helt sikkert, og rester angivet i parentes angiver mulighe- 30 der.

TABEL I

11 DK 174980 B1 1 5 10 15

K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q-(G, V, S)-G-L-X-X-X

5

Ved alle dele af det forsøg, hvis resultater gives i Tabel I, var der et højt niveau for baggrundsstøj til stede, et tegn på, at prøven indeholdt mange konta-minerende ingredienser, sandsynligvis kemiske rester stammende fra rensningen. Sekvensen er kun givet af referencegrunde .

I forsøg nr. 2 benyttede man en anden prøve (5-6 ug, ca. 95% ren) fra Sloan Kettering som ved forsøg nr.

1, og man udførte sekvenseringen som ved forsøg nr. 1.

Denne prøve stammede fra det samme materiale, som blev 15 benyttet til opnåelse af fig. 4 i Welte, et al., Proc.

Natl. Adac. Sci. (USA), 82, 1526-1530 (1985). Resultaterne gives i Tabel II.

TABEL II

20 1 5 10 15 20 T-P-L-G-P-A-S-(S)-L-P-Q-( s)-M-(L)-X-K-(R)-X-X-(R)-(L)-X- X (M)

Selvom man ved forsøg nr. 2 identificerede flere rester, opnåede man ikke en tilstrækkelig lang sikkert 25 ’ identificeret sekvens, hvorfra man kunne konstruere et fornuftigt antal sonder til brug ved eftersøgning af hpG-CSF DNA. Man beregnede, at man i det mindste skulle bruge 1536 sonder, hvis an ved hjælp af sekvensen i Tabel II skulle isolere cDNA. Igen var kontaminering af 30 prøven sandsynligvis årsag til dette.

Derefter fremskaffedes en tredie prøve (3-5 pg, ca. 40% ren) fra Sloan Kettering som ovenfor. Man op- delte denne prøve ved SDS-PAGE og underkastede den elek- troblot i et forsøg på yderligere rensning. Sekvensana lyse af denne prøve gav ingen data.

12 DK 174980 B1 5 (B) Sekvensopdeling ved reviderede fremgangsmåder

Til opnåelse af en tilstrækkelig mængde rent materiale, hvorpå man kunne udføre en tilstrækkelig nøjagtig aminosyresekvensanalyse, tilvejebragte man celler 10 fra blære carcinoracellelinie 5737 (underklon 1A6), som de fremstilles hos Sloan-Kettering, fra Dr. E. Platzer. Cellerne blev først dyrket i Iscove's medium (GIBCO,

Grand Island, Nevr York) i småflasker til de flød sammen. Derefter forsynede man dyrkningsmedierne med trypsin og 15 podede dem i rulleflasker (1½ småf lasker/flaske), der hver indeholdt 25 ml forudbehandlet Iscove's medium under 5% CO2· Cellerne blev dyrket natten over ved 37°C og 0,3 rpm.

Cytodex-l småkugler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) 20 blev vasket og steriliseret ved følgende fremgangsmåde.

Man anbragte 8 g småkugler i en flaske og tilsatte 400 ml PBS. Man holdt småkuglerne i suspension, idet man rystede blidt i tre timer. Man lod småkuglerne bundfælde, hældte PBS fra, rensede småkuglerne i PBS og til-25 satte ny PBS. Småkuglerne blev autoklaveret i 15 minut ter. Før anvendelse vaskede man småkuglerne i Iscove's medium plus 10% kalvefosterserum (FCS), før man tilsatte frisk medium plus 10% FCS til opnåelse af behandlede småkugler.

30 Man fjernede dyrkningsmedium, bortset fra 30 ml fra hver rulleflaske og tilsatte 30 ml frisk medium plus 10% FCS og 40 ml behandlede småkugler til flaskerne. Flaskerne blev gennemboblet roed 5% CO2» og man sugede alle bobler bort. Man embragte flaskerne i rulieanord-35 ninger ved 3 rpm % time før man nedsatte hastigheden til 0,3 rpm. Efter tre timers forløb forsynede man yderli- 13 DK 174980 B1 gere en lille flaske med trypsin, og indholdet blev tilsat til alle rulleflaskerne, der indeholdt småkugler.

Nar sammenflydningen havde nået 40-50%, vaskede man kulturen i rulleflaskerne med 50 ml PBS og rullede 5 videre i 10 minutter, før man fjernede PBS. Cellerne blev dyrket i 48 timer i medium A [iseove' s medium med indhold af 0,2% PCS, 10-®M hydrocortison, 2 mM glutamin, 100 enheder/ml penicillin og 100 pg/ml streptomycin]. Derefter indhøstede man supernatanten fra kulturen, idet 10 man centrifugerede ved 3000 rpm i 15 minutter og lagrede ved -70°C· Man tilsatte igen til -kulturerne medium A med indhold af 10% FCS og dyrkede i 48 timer. Dyrkningsmediet blev kasseret, hvorefter man vaskede cellerne med PDS som ovenfor og dyrkede i 48 timer i medium A.

15 Man indhøstede igen supernatanten og behandlede den som tidligere beskrevet.

Man indkoncentrerede ca. 30 1 medium, der indeholdt 1A6 celler til ca. 2 1 på en Millipore Pel 1 icon enhed, forsynet med to kassetter med afskæringer ved mo-20 lekylvægt 10.000, idet man filtrerede 200 ml pr. minut og tilbageholdt ca. 1000 ml pr. minut. Koncentratet blev diafiltreret mod ca. 10 1 50 mM Tris (pH 7,8) med samme apparat og samme hastigheder. Det diafiltrerede koncentrat blev med en hastighed på 40 ml pr. minut på-25 sat en én liter DE cellulosesøjle, bragt i ligevægt med 50 mM Tris (pH 7,8). Efter påsætning vaskede man søjlen med samme hastighed med en liter 50 mM Tris (pH 7,8) og derefter med to liter 50 mM Tris (pH 7,8) tilsat 50 mM NaCl. Søjlen blev derefter i rækkefølge elueret med 30 seks 1 liter portioner 50 mM Tris (pH 7,5), der indeholdt følgende koncentrationer af NaCl: 75 mM· 100 mM; 125 mM; 150 mM; 200 mM; og 300 mM. Man indsamlede fraktioner (50 ml) og sammenbragte de aktive fraktioner, som blev indkoncentreret til 65 ml på en "Amicon ultra-35 filtration stirred cell unit" forsynet med en YM5 membran. Dette koncentrat blev påsat en 2 liter AcA54 gel- 14 DK 174980 B1 filtreringssøjle, bragt, i ligevægt med PBS. Gennemløbet var 80 ml/time, og man indsamlede fraktioner på 10 ml. Aktive fraktioner blev sammenbragt og direkte påsat en C4 "high performance liquid chromatography" (HPLC) 5 søjle.

Prøver, hvis rumfang var 125-850 ml, og som indeholdt* 1-8 mg protein, hvoraf 10% var hpG-CSF, blev påsat søjlen med en gennemstrømningshastighed på 1-4 ml/min.

Efter påsætning og en første vask med 0,1 M amrooniumace-10 tat (pH 6,0-7,0) i 80% 2-propanol med en gennemstrømningshastighed på lml/minut. Man indsamlede 1 ml fraktioner og undersøgte for proteinindhold ved 220 nm, 260 nm og 280 nm.

Ved denne rensning blev fraktioner, der indholdt 15 hpG-CSF klart adskilt (som fraktionerne 72 og 73 ud af 80) fra andre fraktioner, der indeholdt protein. Man isolerede hpG-CSF (150-300 rø) af en renhed på ca. 85 t 5% og med et udbytte på ca. 50%. Fra dette rensede materiale benyttede man 9 yg i forsøg nr. 4, en aminosy-20 resekvensanalyse, hvor man påsatte proteinprøven til en TFA-aktiveret glasfiberskive uden polybren. Man udførte sekveneanalysen med en AB 470A sekvensopdeler ved fremgangsmåden ifølge Hewick, et al., J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1981) og Lai (Anal. Chim. Acta, 163, 243-248 25 (1984). Resultaterne af forsøg nr. 4 vises i Tabel III.

30 35

TABEL III

15 DK 174980 B1 1 5 10 5 Thr- pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu -Pro- 15 20

Gin- Ser - phe - Leu - Leu - Lys -(Lys)- Leu -(Glu)-Glu- 10 25 30

Val- Arg - Lys - Ile -(Gin)- Gly - val - Gly - Ala -Ala-

Leu -x - x - 15 I forsøg nr. 4 opnåede man efter 31 gennemløb (svarende til rest 31 i Tabel III) ingen yderligere signifikant oplysning om sekvensens forløb. Til opnåelse af en længere tydelig sekvens i et femte forsøg reducerede man 14 μg hpG-CSF oprenset fra behandlet dyrknings-20 medium med 10 μΐ β-mercaptoethanol i en time ved 45°Ci hvorefter man tørrede grundigt under vakuum. Proteinresten blev genopløst i 5% myresyre og påsat en polybren-behandlet glasfiberskive. Sekvensopdelingsanalysen blev udført som ved forsøg nr. 4 ovenfor. Resultaterne fra 25 forsøg nr. 5 gives i Tabel IV: 30 35

TABEL IV

16 DK 174980 B1 15 10

Thr- pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu- pro-5 15 20

Gin- Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Glu- Gln- 25 30 10 Val- Arg - Lys - ile - Gin - Gly - Asp - Gly - Ala- Ala- 35 40

Leu- Gin - phe - Lys - Leu - Gly - Ala - Thr - Tyr- Lys- 15 45

Val- phe - Ser - Thr -(Arg)-(phe)-(Met)- X-

Aminosyresekvensen i Tabel IV var tilstrækkelig lang (44 rester) og nøjagtigt bestemt« at man derfra 20 kunne konstruere sonder til opnåelse af hpG-CSF cDNA som beskrevet nedenfor.

Eksempel 2

Blandt standardfremgangsmåder til isolering af 25 relevante cDNA sekvenser findes en fremstilling af plas-midbaserede cDNA "biblioteker", afledt fra revers tran-skription af mRNA, der findes i donorceller udvalgt på basis af deres éksprimering af et udvalgt gen. Når man kender væsentlige dele af aminosyresekvensen af et be-30 sterat polypeptid, kan man benytte mærkede, enkeltstrengede DNA sondesekvenser, der duplikerer en sekvens, som man antager findes i det relevante cDNA ved en DNA/DNA hybrid!seringsprocedure, som man udfører på klonede kopier af cDNA, som er blevet denatureret, så det forekom-35 roer på enkeltstrengs form. Weissman, et al., US patent nr. 4 394 443; Wallace, et al., Nucleic Acids Res., 6, 17 DK 174980 B1 3543-3557 (1979), og Reyes, et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA), 79, 3270-3274 (1982), og Jaye, et al..

Nucleic Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). Se også US

patent nr. 4 358 535, Falkow, et al., angående DNA/DNA 5 hybridiseringsprocedure ved diagnose; og Davis, et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980) siderne 55-58 og 174-176 angående teknikken for koloni og plaquehybridisering.

10 Man ekstraherede al RNA fra ca. l g celler fra en blærecarcinomcellelinie 5637 (1A6) under anvendelse af guanidiniumthiocyanat til kvantitativ isolering af ubeskadiget RNA. [Chirgwin, et al.. Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)].

15 Den sterile vandige RNA opløsning indeholdt al RNA fra IA6 cellerne. For tilvejebringelse af messenger RNA alene ud fra opløsningen af total RNA lod man denne opløsning passere en søjle, der indeholdt oligodesoxy-thymidylat [oligo(dT)] (Collaborative Research, Inc., 20 Waltham, Massachusetts). Poly-adenylerede (poly-A+) endestykker, der er karakteristiske for messenger RNA, bindes til søjlen, hvorimod ribosom RNA elueres. Som et resultat af denne fremgangsmåde kunne man isolere ca. 90 pg poly-adenyleret messenger RNA (poly-A+ mRNA). Det 25 isolerede poly-A+ messenger RNA blev forbehandlet med methylkviksølvhydroxid (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts) ved en slutkoncentration på 4 mM 1 fem minutter ved stuetemperatur før anvendelse i en cDNA reaktion. Behandlingen med methylkviksølvhydroxid denatu-30 rerer vekselvirkninger med messenger RNA, både internt og med kontaminerende molekyler, som blokerer translation. Payvar, et al., J. Biol". Chem., 258, 7636-7642 (1979)·

Ifølge Okayama-fremgangsmåden [okayama, et al., 35 Molecular & Cellular Biology, 2, 161-170 (1982)] fremstillede man en cDNA bank, idet man benyttede mRNA, op- 18 DK 174980 B1 nået fra IA6 celler. Man transformerede cDNA, idet man inkuberede i en værtsraiXroorganisme E. coli K-12 stamme HB101 til forøgelse af mængden.

5 Eksempel 3

Hybridiseringssonder, konstrueret på basis af den terminale aminosyresekvens for hpG-CSF ifølge Tabel IV, bestod af et sæt af 24 oligonucleotider, hver med en længde på 23 baser og med et indhold på tre inosinre-10 ster. Sondeoligonucleotiderne blev fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Caruthers, et al.. Genetic Engineering, 4, 1-18 (1982) og mærket med «ρ-32ρ ATP, idet de blev kinaseret med polynucleotidkinase. Sondeoligonucleotiderne, der svarede til messenger RNA for re-15 sterne 23-30 i sekvensen i Tabel IV, illustreres i Tabel V:

TABEL V

20 hpG-CSF sonder 5' GC IGC ICC ATC ICC TTG §AT TTT3'

G C t C

Antagelsen af neutralitet for Ι-baserne var base-25 ret på offentliggjorte arbejder af Takahashi, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1931-1935 (1985) og

Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985).

Inosin kan imidlertid have en destabiliserende effekt, hvis det baseparres med G eller T· Hos Takahashi, et 30 al., synes inosiner at besidde en neutral effekt, fordi de som gruppe i gennemsnit opnår næsten neutralitet (f.eks. hvis tre med fordel parrer med C, og to ikke med fordel parrer med T).

Til afprøvning af virkningen af baseparring mel-35 lem I og G konstruerede man kontroleksperimenter ved hjælp af en N-myc gensekvens og klon. Sekvensen, der 19 DK 174980 B1 var udplukket fra N-myc genet, havde samme total indhold af G og C ved de første to stillinger i hvert kodon, som var bestemt for hpG-CSF sonderne. N-myc prøvesonderne var af samme længde, indeholdt I i samme relative stil-5 linger og havde potentielt samme gennemsnitværdi for Tm (62-66°C, idet de tre eller fire inosinrester, der fandtes, ikke blev talt med) som hpG-CSF sonderne.

Man konstruerede to grupper N-myc prøvesonder ved fremgangsmåden ifølge Caruthers, et al., se ovenfor.

10 Sæt I, som illustreret i Tabel VI, inkluderede: l, en 23 mer med fuldstændig tilpasning; 2, i hvilken tre tredie-positions C er. var erstattet med I'er under dannelse af det værst mulige tilfælde ved tilsætning af I· og 3, i hvilken fire tredie-positions C er var erstattet 15 med I'er. Den anden gruppe testsonder var konstrueret, så den repræsenterede en mere tilfældig fordeling af inosinbasepar, hvorved man kunne opnå en baseparrende virkning, der i gennemsnit var neutral. Sæt II, som illustreret i Tabel VI, inkluderede; 4, med indhold af 20 to I'er, der vil danne basepar med C og I med G; og 5, identisk med 4, idet der er tilsat et yderligere I:G basepar.

25 30 35

TABEL VI

20 DK 174980 B1 1. 5* CAC AAC TAT GCC GCC CCC TCC Cc3' 5 2- 5' CAC AAC TAT GCI GCC CCI YCI Cc3' - 3. 5‘ CAI AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3' 4. 5' AAC GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3' 10 5. 5' AAI GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3'

Fem replikafiltre, der indeholdt N-myc dna sekvenser og sekvenser fra DNA fra kyl Unge væksthormon 15 (som en negativ kontrol), blev ophedet i to timer ved 80% i en vakuuraovn før hybridiseringen. Alle filtre blev hybridiseret som beskrevet i Eksempel 4 for hpG-CSF sonderne, med undtagelse af at hybridiseringsperioden kun var seks timer. Filtre blev vasket tre gange ved 20 stuetemperatur og en gang ved 4510 minutter hver gang. Filtrene blev kontrolleret med en Geigertæller.

Filteret, der repræsenterede en N-myc sonde 3, gav et meget svagt signal i forhold til de andre fire filtre med sonder og blev ikke vasket yderligere. Efter 25 ti minutters vask ved 50% gav Geigertælleren følgende procentiske signal, idet sonde 1 sættes til 100%; sonde 2 20%; sonde 3 (45°C), 2%; sonde 4 92%; og sonde 5 75%.

Efter vask ved 55°C var procentværdierne: sonde 2 16%; sonde 4 100%; og sonde 5 80%. En sluttelig vask ved 30 60°C gav følgende procentværdier: Sonde 2 1,6%; sonde 4 90%, og sonde 5 70%.

Således observerer man under tilstedeværelse af tre I'er, som i sonderne 2 og 4 en op til 60-gange så stor forskel i signal, når man nærmer sig den teoretiske 35 værdi for Tm (I ikke inkluderet i beregningen) [baseret på det værste tilfælde for baseparring med I (sonde 2) 21 DK 174980 B1 og et. relativt neutralt tilfælde med baseparring med I (sonde 4)].

De standardiseringsoplysninger, som man indvandt ved N-myc prøvehybridiseringerne, blev udnyttet, når man 5 skulle vaske og kontrollere hpG-CFS hybridiseringen som nedenfor til at vurdere, i hvor høj grad man kunne have tillid til resultaterne, når man benyttede en mindre stringent vaskeprocedure.

10 Eksempel 4

Ved fremgangsmåden ifølge Banahan, et al., J.

Mol. Biol. 166, 557-580 (1983) udspredte man bakterier, der indeholdt rekombinanter med cDNA indsætningsstykker, som fremstillet i Eksempel 2 på 24 nitrocellulosefiltre 15 (Millipore, Bedford, Massachusetts), embragt på agarplader. Man inkuberede derefter pladerne til opnåelse af ca. 150 000 kolonier, som blev replikaplattede på 24 andre nitrocellulosefiltre. Man inkuberede replikafiltre-ne, indtil man opnåede adskilte kolonier. Bakterierne 20 på filtrene blev lyserede på Whatman 3 MM papir, der var næsten mættet med natriumhydroxid (0,5 M) i ti minutter og derefter plettet med Tris (1M) i to minutter, hvorefter man plettede med Tris (0,5 M) med indhold af NaCl (1,5 M) i ti minutter. Når filtrene var næsten tørre, 25 lod man dem opvarme i to timer ved 80¾ i en vakuumovn, før de skulle hybridiseres med nucleinsyre. [Wahl, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 3683-3687 (1979)] ; og Maniatis, et al., Cell, 81, 163-182 , (1976).

30 Man forhybridiserede filtrene i to timer ved 65°C i 750 ml 10 x Denhardt, 0.,2% SDS og 6 x SSC. Man r rensede filtrene i 6 x SSC og anbragte dem fire sammen, hvorefter man hybridiserede 14 timer i 6 x SSC og 10 x Denhardt. Der var ca. 15 ml opløsning i hybridiserings-35 beholderen med indhold af 50 x 106 cpra af 32P-mærket sonde (oligonucleotider).

22 DK 174980 B1

Efter hybridisering vaskede man filtrene tre gange i 6 x SSC (1 liter/vask) ved stuetemperatur, 10 minutter hver gang. Man vaskede filtrene to gange ved 45°C i 15 minutter, en gang ved 50¾ i 15 minutter og en 5 gang ved 55°C i 15 minutter, idet man benyttede 1 liter 6X SSC hver gang. Man autoradiograferede filtrene ved -70%· i to timer under benyttelse af en forstærkende skærm og Kodak XAR-2 film* på denne autoradiograf var der 40-50 positive signaler, deriblandt fem meget kraf-10 tige signaler.

Arealet, der indeholdt de stærkeste fem signaler og yderligere fem positive signaler, blev skrabet fra udgangspladerne og igen udplattet for en anden gennemsøgning ved hjælp af samme sondeblanding og samme betin-15 gelser. vaskningen afveg, idet man vaskede ved høj temperatur to gange ved 55% i 15 minutter, og en gang ved 60°C i 15 minutter. Pa baggrund af studiet af N-myc sonden i Eksempel 3 satte man slut vasketemperaturen \ i den anden gennemsøgning i vejret, idet det kombinerede 20 smeltepunkt for de 24 23-mere var 60-68%« som i N-myc sonderne, umiddelbart efter den anden vask ved 55% lod man filtrene autoradiografere i fugtig tilstand. En sammenligning af denne autoradiografi med en anden autoradiografi, optaget samme tidspunkt efter slutvasken ved 25 60%, viste at kun to af de ti afprøvede kloner ikke led et kraftigt tab i signalstyrke, når man forøgede temperaturen fra 55-60%· Man kunne senere vise, at disse to kloner var af næsten identisk længde og besad næsten samme mønster for restriktionsendonucleaser. Man ud-30 valgte en klon, betegnet Ppo2, til sekvensopdeling.

Man udførte sekvensopdelingen af den rekombinante hpG-CSF cDNA klon Ppo2, opnået ved den ovennævnte fremgangsmåde ved didesoxymetoden ifølge Sanger, et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 5463-5467 (1977). M-13 35 strengen med enkelt strenget DNA blev benyttet som kloningsvektor og leverede enkeltstrenget DNA skabeloner 23 DK 174980 B1 til de dobbelt strengede cDNA kloner. Sanger, et al. fremgangsmåden gav den sekvens, der vises i Tabel VII sammen med den tilsvarende aminosyresekvens og en komplementær streng i den region, der koder for polypep-5 tid.

10 15 20 25 30 35 24 DK 174980 B1 O E* 4 COU 3UU QUO hUO u 4 8*

W U O <-* 4 E* <H 4 6* hUO >i< 6* JCUU

λυυ ουο OOU hUU 8* E* 4 E* 4 8* >iCj o «υο ουο «υο so o cxup •H O U M rH E-I C nUO >ip U « 8* 4 n 4 6* C3UU « ** 4 8* PlUU UN *3 CJ o 4ou 3ou<1 nuu nuo huo »o o sou S α> e* < >ι4 6* ·η<^ tuu jc 6* 4 « e* 4 2 *3 0 0 *3 4 6* «UO 01 4 6* 04 8*4 (-3 8-14 2 o u o σ>ΰ u nuo u u o a e* 4 u u p

£ Wi u O nOU >iO O »OU «8*4 JCUO

3 04 U O 4 4 8* U 6* 4 014 8* i-3 U O 8*4 8*

S3 HhUO r*OU spu 300 >.0 0 O UO

S3 *-J=UO «98*4 «8*4 «8*4 r*OU v*UO

g 8*4 8* >OU 1-3 U O JUO OOU D.UO

S3 <0U O C 4 8* nou OUO t*UO o >t8* 4

S3 >H U O o r* 4 8* o>i48* O u U O o « o U O «Η O U

g r* 4 O U n O U O t-3 4 t* «hUO eo 01 4 8* HOOU

S3 ' 3 4 8* 30U u u O «0 8*4 «8*4 30U

S? «-*4 8* «-*4 8* >ι4 ζ HUO -η 4 8* «8*4 O OOU OOU 8*8*4 4 O U «UO *3 6* 4 _ Sn COU 348* n O O OiOU 3UO 30 0 H g r)<E* «8*4 f y U UOU «6*4 «Η 4 6*

H g OOO *3 6*4 8* 4 E* 8*8*4 *3 0 0 OOO

S3 ΉΟΟ nUO «OUO OUO C 4 8* OOO

, S3 «0 6*4 >iOU HUO HUO «Η48* hUU

g >OU U 8* 4 4 O U ø« U O OOO A O O

W O ui 4 8* mOU «8*4 «UO u O O n O O

_ S3 -C op >44 8* >OU H 8* 4 «OO «OO

® g 8*4 6* *4 4 8* U E* 4 «*4 6* W 4 8* «8*4

< S3 O.OU 3 U O 3 O U >.UO 3 p U «UO

„ S3 v*OU « E* 4 «8*4 HOU »8*4 ·-* E* 4 6* g 8*8*4 *3UO *3 U O OOU i-3 8* 4 «4 8*

S3 3 0 0 3 O U nOU 3 O U «OO >iO U

M S3 «8*4 «8*4 >i4 8* «8*4 >0 U r* u CJ

m S3 *3 U O *3 U O *3 4 8* *3 U O U 8* 4 OOO

M ^ •O S3 «0 4 8* M »up 3pu U8*4 >iU O 3 4 8* e2 <-* U O 4 JC 8* 4 <*4 8* »UO *H O U «Η 4 I*

~* Λ 4 0 0 -H ø. E* 4 OOU «8*4 OOU OOO

93 ^ CT

h u 8* 4 al «* U O COU »uo «48* 3 p u y »OU «OU «h4E* -h 4 8* <HOO «6*4

g «4 8* «4 6* OUO auo 4 O U *3 U O

g onuo COU 3 U O >i4 E* 300 «Π O O

Γ <-*-« 4 8* h 4 8* «8*4 r*OU »E*4 <H O O

g lauo OUO *300 OOU *300 400 2 aoo OOO «OOU 3 U O COU coo 4 i* o O o u u O o r* U O o » 8* 4 o«-*46* 0*48*

, 8*8*4 HAUO «400 in *3 O O Γ» O O O σι O O O

cpo COU <0 4 8* SOU 30U 300 oi « 8* 4 V E* 4 HU O «8*4 «8* 4 «8*4 H h3 U O *3 U O 4 O U *300 *3 0 0 *3 0 0 ' u U O >U O r*pu «OOO 300 «U O r* O U «0 8*4 HUO «8*4

«8*4 OOU >OU 4 O U *3 U O

u U O (X8* 4 3 O U COU >iO U

«OU «4 8* «8*4 r* 4 E* ** O O

«4 8* 400 *3 U O OOO OOU

(OUO ><U O 300 i-iUO COU

HUO r* O U *4t* »OU .-*4 6*

4 O U OOU OOU «4 8* OUO

25 DK 174980 B1 >i4Eh eOO UOO o o o o o o Ηΰϋ r-ι < Eh >,4 t· f O 4 < S tf uuu ooo t« t« < 4 o o 4 o o soo «>υο uoo t* 40000 0) t· 4 JC t· < 0)UU t· 4 4 o o o •joo ft §h 3 weh4 o t· < < h

3<H «0ti< Ηϋϋ < 4 o t< o O

H 3 t· HUU <Q ti 4 Eh U t· 4 £ pi ooo 4oo >00 O O O < < 5 3tfti U ti 4 300 ti 4 O 4 o o H 31· ωοο H 4 t· 4! o o tt o 4 000 WEH< ooo o 4 t· o o o

•UOO <000 300 O 4 O (9 ti M

0) Η < Ηϋϋ V Eh < O 0 0 4 0 4 S 4 t« 400 JOO Eh O ti ti < ti O C o O 0(1)0 0 o o o o < o o < u o (N i—i < E-f hj> J3 t· < β£Η< O 4 Eh O S tf

^ HOOO H ft ti 4 H ft f 4 O O EH 4 o O

% C O O <0 0 0 woo o 4 4 t< o 4 q H 4 EH HOt) 0)00 O O O O ei o +) OOO <00 W4Eh Η 4 H o 4 t< o ao o ooo coo o 4 tt 4 < f & uuu ViOO H<fi o 4 t· o o o *- t* f 4 ftOO ooo o t· o o o o

0)00 -UOO 300 O ti 4 o EH O

H HHO 0) t· 4 0) f < < Eh O t* O 4

Μ M 4 E< S 4 ti »3 0 0 4 4 ti O ti O

^ WiOO (OOO <0 f < o t· o < o o

ÆUO rH o O -H < E-1 O < f O O O

»3 ti 4 ti 4oo KOO O O ti O O ei

w u O O >it· 4 uoo 4 t· t· t« Ei ti O

-COO *H O O 0)00 ftOO o < o o o n E-i C ti OOO Uh< o t· 4 o o o o < < (OOO coo <000 9 ouu o o o o o

H O O H<Ei >H O O Ρ» u U O < H O O O

ti 400 OOO 400 HftUO 4 O ti 4 O

0) Eh 4 HOO H t· 4 COO t· O 4 o O

JS E-i 4 -COO <0 ti 4 H 4 t· Eh O O O Eh

ft En 4 fr· 4 t< >00 OOO t· f O O O

au O OOO 300 I0UO 4 EH o o o

01 4 H 1*0 0 0) ti 4 rH O O t· O ti ti O

400 ftOO >-3 0 0 400 0 0 0 0 4

(OOO COO HOO 3 Eh 4 t· t· O O O

Ηϋϋ Π 4 t <0 t· 4 0)ti4 O O Eh t· EH

400 OOO >00 JUO Eh Eh O O O

OrHOO 0 3 0 0 o >iO O o <0 O O 4 O EH 4 O

H <0 Eh 4 n 4)Eh 4 (ΛΗΟΟ -H 4 E* Eh Eh O O t·

H>OU HJOO HOOO HKOO ti O O EH O

aO O <0 0 0 >i4 Eh OOO t· Eh Eh 4 O

« 4 t< HOO HOO U O O 4 O O t· Eh

400 400 OOO 400 f O O O O

300 O Eh 4 <0 4 t· 3 4 t· 4 03 4 4 0

0) EH 4 k· O O HOO 0) EH 4 4 O 4J 4 t· O

JOO ftOO 400 »3 O O EH 4 CO 4 Eh O

COO (QUO 3*0 O H Eh 4 t· O 4 4 O

H 4 Eh rH O O ki O O <0 Eh 4 Eh o 4 Eh 4

OOO 400 400 >OU 4 O O Eh O

3 00 -UOO 0*0 O 0*0 0 Eh O 4 t· t· 0) Eh 4 O) Eh 4 u O O u o O 0 0 0 4 0 »300 S 4 Eh 400 400 ti 4 Eh Eh Eh 26 DK 174980 B1

< t· 4 O O

y* o s o < < cj 4 4 o o o o o < cj p e· e< cj cd 4 e α cj < o O o o u u o u o o c5 cj cj cj E·

Eh Ei o Ei o S

CJ Ei e· o o o t· cj cs 4 cj cj < O O O E4 o

CJ CJ C5 H CJ E

cj cj cd t· cj e o e e e u e CJ < cj o p 4

E CJ CJ C5 E CJ

E P CJ E CJ 4

id p E C5 4 CJ O

« E CJ p U 4 C5

+j P CJ E 4 P E

o 4 P 4 P 4 CJ

«Η P P P P P P

C5 C5 C5 C5 C5 O

4 P P E P E

H U P < E CJ C5

H 4 P P E E P

> 4 4 C5 E CJ 4 < Q o ο cj cj J H ^ < o o u E CJ CJ C5 C3 C5 E P O 4 E 4

CQ 4 E 4 4 C5 P

4 Ej P P E C5 P

4 4 4 E C5 O

Eh 4 P P P E P

E P P E P P

E O C5 E E 4

E C5 C5 P E E

P 4 E E E E

E CJ C5 E-* E E

P E P E E E

CJ O 4 E« C5 E

P P O E E P

Ei C5 4 C5 U E

4 C5 CJ CJ CJ CJ

4 E P E E 4

4 P 4 P P P

P E 4 E E E

4 CJ CJ 4 p O

4 4 4 4 E· Ei

CJ CJ C5 C5 C5 O

4 E· C5 C5 O 4

P P E P 4 P

4 CJ CJ C5 C5 O

C5 CJ CJ Ei CJ 4

C5 CJ CJ CJ CJ CJ

P 4 P P 4 E

E« CJ C5 Eh CJ O

C5 O C5 Ei E C5 27 DK 174980 B1 < o

< B

< u o < B u o u

B B

O O

E-ι U

O U

B O

O B

CJ O

Om E-<

0 3 O 4J

< W < u O < ^

B O O

O < O ° +J B O B _.

tf < B O *5 co '3 4J o υ o ε M H < O “ o < o b <5

n i H

^ < U B

O U B

o υ o ti M *0 M < O B .

> o o o £{ o < < ® 0)

►5 < U < S

u B 2 Λ - W < H H 0 7 « S g 3 ? ^ < S S S JQ « lj o O <! ® H < < o « g O O o 3 g O O < A ti OHO ^ t!

O U B >· iJ

O O O m *; w < < g, 3

B O < M

OBO 2 L_| BOB « £ < B O n 5 “ < 5 g * sas 2 * *<*·*· S u O rj £_, pH 'S.

< o < H ·« O < U l~' O < *c o o u

O O B

28 DK 174980 B1

De følgende karakteristika for sekvensen i Tabel VII bør bemærkes. I 5'enden af sekvensen vises baser, der svarer til, hvad man finder i en poly G cDNA sammenbinder. Derefter findes ca. fem baser (betegnet "N"), 5 hvis sekvens ikke kunne bestemmes nøjagtigt ved Sanger, et al. fremgangsmåden på grund af den lange G sekvens, der kommer umiddelbart forud. Sekvensen, der følger, udviser en serie af 12 kodoner, der koder for en del af en antagen ledersekvens for polypeptidet. på basis af 10 korrespondens med den terminale aminosyresekvens i naturligt isoleret hpCSF, beskrevet i Eksempel 1, er den første threoninrest i den antagne "færdige" form for hpG-CSF betegnet med +1. Derefter ses det, at færdig hpG-CSF omfatter 174 aminosyrerester, som vist. Efter 15 "stop" kodonet (OP kodonet, TGA) forekommer omtrent 856 baser, der tilhører en ikke translateret 3' sekvens og en række A’er i poly A "halen". Unikke HgiAi og Apal ' restriktionsendonucleasesteder, så vel som to Stul steder (diskuteret nedenfor i forbindelse med konstruktion 20 af et procaryotisk og eucaryotisk eksprimeringssystem) vises også i Tabel VII. Da der ikke findes asparaginre-ster i polypeptidet, er der tilsyneladende ingen positioner, hvor man kan N-glycosylere. De understregede seks baser nær ved enden af den 3’ ikke-translaterede 25 sekvens repræsenterer et muligt polyadenyleringssted.

Man bør bemærke, at begge de to yderligere cDNA kloner, identificeret ved hybridiseringsfremgangsmåden beskrevet ovenfor ud af total 450 000 kloner, ikke inkluderede DNA, der kodede for hele leader-sekvensen fra 30 transkriptions-initieringsstedet og fremad. Alle tre hpG-CSF kloner terminerede faktisk 5' regionen på nøjagtigt samme sted, et tegn på at den sekundære struktur i det transkriberede mRNA i alvorlig grad hindrer dannelsen af cDNA hinsides dette sted. I praksis ville derfor 35 en cDNA eksprimeringsscreening, som beskrevet hos Okayama, et al., Mol. and Cell. Biol., 3, 280-289 (1983) og 29 DK 174980 B1 som blev benyttet til at isolere GM-CSF hos Wong, et al., Science, 228, 810-814 (1985) uden videre ikke være benyttet til isolering af hpCSF DNA, da sådanne isole-ringssystemer almindeligvis er afhængig af tilstedevæ-5 reisen af transkriberet cDNA i fuld længde i de kloner, der bliver undersøgt.

Den ovenfor nævnte sekvens er ikke direkte i stand til at sikre direkte eksprimering af hpG-CSF i en mikrobevært. Til opnåelse af en sådan eksprimering skal 10 hpG-CSF koderegionen forsynes med et initial ATG kodon og sekvensen skal anbringes i en transformationsvektor i en position,, hvor det kontrolleres af en passende promo-tor/regulator DNA sekvens.

15

Eksempel 5 I dette Eksempel benyttede man cDNA, der kodede for hpG-CSF som isoleret i det foregående Eksempel til at gennemsøge en genomisk klon. Et phag λ menneskefo-20 sterlever genomisk bibliotek (fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Lawn, et al., Cell, 15, 1157-1174 (1978) og opnået fra T. Maniatis] blev gennemsøgt ved hjælp af en haktranslateret sonde, bestående af to hpG-CSF fragmenter, isoleret ved fordøjelse med HgiAI og Stul (HgiAI 25 til Stul, 649 basepar; Stul til Stul, 639 basepar).

Ialt ca. 500 000 phager blev udplattet på 12 (15 cm) petriskåle, og de dannede pletter blev udtaget derfra og sondehybridiseret ved hjælp af Benton/Davison fremgangsmåden (Benton, et al., Science, 196, 180 (1977)]. Man 30 observerede ialt 12 positive kloner. Tre kloner (1-3), der gav det stærkeste signal ved autoradiografi i en anden gennemsøgning, blev dyrket i 1 liter kulturer og afbildet ved fordøjelse med restriktionsenzymer og Southern blot under anvendelse af en radiomærket 24-mer 35 oligonucleotid (kinaseret med γ-32ρ ATP) 5'CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3 *· Afbildingsresultaterne vi- 30 DK 174980 B1 ste, at isolaterne 1 og 3 var identiske, og 2 indeholdt 2000 yderligere baser 5'stillet til hpG-CSF genet. Derfor benyttede man klon 2 til yderligere karakterisering.

Man fordøjede DNA fra klon 2 med RI til frigivelse af et 5 8500 bp fragment med indhold af hpG-CSF, dette blev der efter underklonet i pBR322 og yderligere underkastet afbildning ved hjælp af fordøjelse med restriktionendonuc-leaser, Southern Blot, M13 underkloning og sekvensopdeling. Den opnåede sekvens vises i Tabel VIII.

10 15 20 25 30 35 31 DK 174980 B1 o o o o o o o O O O O O O o Η N ΙΊ V tn SO (\

O O O Ei X 2 M JO

o o p o O O O 30 0 2 0 0 U U ti 4»Ei u y o At) P »ju E< O < O U O O C o o o 2 P o o o ^ < 2 3 o 2 w 4 U oo

OOOO CO O Ό 3 O

SO P P O Ή < U H « ^

O P H O O Ei I kJ O

Q O O uo <4! ej o o 3 P o js o o 5o

O P P O Ei< O O

2 O P O <3 O O 2 O O P 2 r-t O p 3

Ei O Ei O 2 p p o OOOO op o o 2200 UO o o O O < Ei AO o ti O H 2 O * o O g 8 3 3 £ S g s g

2 O O Ei *H O 2 O

0002 < o o o 4 O U 2 O JJ o 4 o

OOHEiMOEi O O

O O P O I X 2 p O

O Η P O O O O

2 o o < o P <

O 61 2 O O O S

2 o 2 o < o p

M O 2 2 O O El O

LJ 4 u 2 o 5 ο o [jorfoo o o p > s a s g g i li S B E 8 δ g g ►5 O Ei H ti O 0 2 0 0 2 0 O 4 3

td O Ei 2 2 O' O O

POOEI O O 2 £0 O Ei 2 ti 2 S 3 w Ei Ei O O O p 2 rfOOO O O 2 2

2 P Ei O O O O

„ 2 o El 2 o O o

Ei O O 4 2 2 O O

O 4 O £i O Ei 4 0 0 2 0 O O p

O l·* O 2 Ei O O

O Ei 2 Ei O O O

O O O E« O O P

O Η H 4 O P O

P f* 2 Ei 4 O O

P P O Ei O O 2 OOOO O 0-3 2 0 2 2 O O Ei

0 0 0 4 O O O

2 2 0 0 O O O

0 0 4 0 O 4 O

O Ei 4 O 4 O O

2 O 2 Ei O 2 O

2 0 0 0 2 O 2

4 O Ei O 2 O O

O O O Ei 4 O 4

0 0 0 2 2 Ei O

0 4 2 2 O 4 O

0 0 0 4 O O O

O Ei O E« O O O

2 2 0 2 O 2 O

O Ei O O O O P

4 0 2 0 O O O

O Ei 2 Ei O O p

O O O Ei Ei O O

2 O O E« O O 4

2 0 0 2 O H O

4 0 0 2 2 P O

0 2 0 2 O O O

OOOO 4 Ei 4

OOOO E< O O

^ H 4 2 O Ei O

2 Ei O O O O O

2 O Ei 2 O 2 2 O O Ei O O O 4 2 O Ei O O Ei 2 O O O Ei O O p

Pp2Ei O 20 Ei

Ei Ei O O Oc0x>O 4

O O O Ei 2 Ή 4) p O

OOOO 2 1X2 O

O Η 4 Ei 2 -30 o

2 O 2 Ei Ei « Ei O

0002 2 kJ O p 2000 Ei O O O 4 0240 o n >, 2 3

O O O E* Ei I kJ 2 O

0200 4 u O 3

OOOO t< 0) Ei O

32 .

DK 174980 B1 o o o o o o o o o o o o o >-ι r* rt

00 OS <-l Η Η H

α H O H O U < O

> o u u h o au

O C tf O U O U k Q

cn r-t «2 O < U O Es H

o a < o δ < ου 3 O < δ Q U uu •h< η < δ u au

0 O O O H O 4) U

3 < O Q O δ H ? « H <<«CU M < •J H O O O U >1 u

β U < O < U r-t O

>» O u u u < u δ

ϋ P O P < O SU

au δ H U u β> H

1 3 8 B S S ip

SU O < O O 01 O

4) H δ O ·< O (OH

»J u u o p < au 30 U O H O -H < «η u ·* p g au •J U U < H < >> < UU < O U < -* o jc H < o u u u δ α η o o u δ o 3 u

u O O H U O m 4) H

Λ 91 O OUUU J u j, ta < < o o u so

Z CO οδού 0) H

m ·-* < O < «< < *3 U

® OU H < < O H O

V O O U POUO (0 H

h r-ι u O H O O < > O

0 au u o o o sø

VM SO OOOO 4) H

W «Η O H < O *J O

•JU o u < o so u U < O < O <H<

au O < O H OO

ri (OH < O < U SO

S u u p p g < <-t <

JH 4) O Η Η δ O OP

> (fl< oo<< OU

au o < u o m u ή u p u h < au μ] < O HOHU au OH 0<<U *H< ω m u o o o < au m au < o < o au tf, >* u o < o < >s p

® r^o HHH< UH

O O O Η < i sp

< 30 <<uo a> H

4)H OHOO *J U

H >JU H *C O O o a o OU O < < O ·*τ >i < UU mso O O < J < au <no»H < O O uu ^ u U >JU O H O >1 <

χ: u ao o o O HH

H < >i3o<< uu

^au >J4 H O O JC U

IrHO SO < O p H < < O >-4<uoH au

S«C O O < H < -HU

-H < C O O 4 U < O

OO O O < ve a H

CO OU O O O m >1 O

S O < O O UH

OU 4) Η < H < O

Ή P iJUOUU < aHoaouoo u

>0 nrHU H O p U

U<<UUHH U

C U a<HUU u

H < rHUUOU H

ao «couoo <

up >· U H O < U

HH -· O 4 < U U

a H % 8 2 8 $ g

•JO a 4 4 O p U

a< <ouoh u

<-* U >» U U H U H

4 0 -π O O U 4 4

UH O O O p 4 U

4)0 COOHO O

(0 4 r-( 4 4 O O 4 oau o u u 4 4 u

<h-h< a>uouu H

»au γηηη<< u ao m<uuo <

uo au<0< U

HH >!<<<OU H

30 ,j<ooo u

4) Η σ» Ο O Η O H

•JU u O H O O o so <4<0< < 4IH <h O O H O o DK 174980 B1 5 "i —/ s

O O O O O

o o O O o « m vo r- co

H rH iH ι-t pH

O C A 3 0 O U O

O r-t 3 O pH u P 3< O O U H IJ E< H pH 3 5ί U O m > p 3 p p 0) P Q. O Eh h hj p

U1 3 01 4 P CM 0) H

O 3 P 3 0 H pH X < P 0) EH 3 P P 3 3 «J £h ti (4 E* < y ab j u υ 3 3 >i p ep u 3

A PH rH A p U

P HU P U P O

P pH P 3 0 p O

3 P P <U H KJ KJ

o cm a 3 jo o o

P f' rH CJ U 3 P S

3 3 P JS KJ A |h

P P Η < O H

< a au < u O U q 3 u p p < 3 o y <

3 U 3 P A KJ

3 Η « H U 3 P U J Η P u

P H w. U P H

^ P P JS U P <

o P Η Η < Η P

« y U O U U H

5 3 H up H U

® P O au H < f O POHH < u

Ih < O O rH P U U

O P O pH p P p < MH H H 3 P P 3

W 3 H a Η H U

3 U J H u u

Ht Η H 3 P P U

m U O Ή 3 H p

LJ P 3 P P P P

tT o 3 o u u p

> A H Oh o H A

3 u au p 3

, H O Wi U P P

J A U Φ U A A

P O W H 3 u u P u au u h

A A <-H H U U

03 5 U m A P < w 3 p en p p o

tf P 3 rH p H U

p O P P P u

_ 3 P 3 3 P P

H O P rH 3 o u H 3 P P 3 3 P U 3 0 u 3

Η Η a Η P H

P U J U P 3 3 Η a U P 3

P 3 rH O Η H

Η H 3 P Η P

P p O C P P H

rH 3 P U <7\ rH 3 Η H

P'WH 3 PU Η H

J U P 3 P U 3

O C O H 0) H O U

P*rH3 O J U O H

P U U 3 U 3 U

3 p p a h p u

0» Η P JO Η H

JO p >1 P P H

au p r-Hpoep H

rH υ p P P CM rH 3 3 3 P Eh eP rH p o u ep o rH 3 cp p rH 3 P PU rH 3 3 PU 3 u u PU u oh u 3 >« 3 ap u 01 U U EhEh up o M3 U 3 U E· Eh o

OU EH »EH au U

UU Η JU rH Eh O

ao p aiu m3 3 au p x: Eh uo u

PhP 3 a Eh £U Eh

U Eh o 3 Eh E < O

u o O 0) Eh u o Eh

aip EH JO £ U U

to 3 O >1 O Eh 3 P

U O Eh rH p aO Eh ap p pp Mo 3

M3 Eh O u O 3 P U

3 p 3 a> a o a eh O

a EH O tn 3 JS Eh Eh J U O ra EH a EH p

O O O O -H < ao EH

vo u o o æ u a 3 o au o 3 u 3 p u

a EH Eh a Eh aU O

rHO O JU Μ O P

34 DK 174980 B1 o o o o o o o o o o o o o o o o

Λ O Η N π ^ ιΠ \Q

i-» <N iS «Ν <M CN (N (N

—· tf H U P P H U H

su tf u 3 tf h tf p u u η p h 2 o 3 h

« u tf η o u u tf G

U)H tf U O tf U 2 tf •au Η υ u p u h 3 3 8 ϋ s s s s g s *1 s e 8 g § f g

> P U tf U Η H G P

so η υ υ p u h 3 «Η U Η H U U H p J U Η H U tf U H tf

* O tf Η P U U Η P

« & - Η P H U P H U

> p H tf u u (5 o tf o>.3 Η P tf H U u 5

•nnO tf H p U P H U

•HOP H U Η H tf G U

>i < O H tf P U H U

ns uFnotftfu

ϋ O tf H U tf U 2 P

* tf U tf tf U P P H

-* U U U Η Η H 3 G

^ tf P U P H tf G P U

i« θ' O Η H tf H tf P U

ti “3 tf υ η p S h o

S tfU U U H tf U G H

® σ> u υ υ Η p u o G

+j up U H tf tf P H U

U tf U U Η Η P tf H tf

O C P H U P H U £ U

m ^ tf u u tf S h tf tf

U U U H tf U U 2 P

I 8 S g 8 8 g 8 § S 3 8 g g g 3 g g 38 8 8 3 8 8 8 8 > u f P U 2 H U H 3

II U tf U U tf U S

UH Q.PPPUu3h

J <0 U OHPPtfHPP

HU^OUtftfuGop

U -«is r*uu U H U U H O

w o 01 U -Η A u U tf U U U H

m ** 33 H CPUPUUUU

« Ή A H <HtfUtf H tf UH

. « U PUPHOUPH

tf i-iu «eutfppppH

tf U r-tUOOOHHH

H ou tfUP tf tf H tf H

u U 3HUPPUUP

fc U WHtfPHUPH

v U OUtfPUHpG

OJ H OOJU P H U P tf U

tf tf r^-utf < tj 94 p p 34 <eu <H S U U tf p p p u

h U O' U p p p H U H

tf P >-*PtfPHUHP

* H tfUUHUHUH

Η P 3tftfUUtfPP

P U »HtfUUUtfU

c3 JupuuuStf

*H tf »-«HOUPUtfP

O y tfHPHtfUUU

uU >PtftfPHUU

•C y O'UUUHHOtf

Htf uptfp p p p p

oy tfUPUHHHH

u U uutfHUPPtf A U >1 tf 2 U 3 tf P u ocp HH tf U U U tf tf fij-jtf up η H U P p 2 ή o υ ai uHpptftfp

3P UHHHtfUUU

® H *-*PtfUptfpu tfHHUHtftfu « H >ptfHtf2 2n

3 y 3UUUPHUU

tf u -itfHPPHtftf OH PPUtfPHpp

jwy 3 O U 2 H tf p H

AU OHPtf U HHH

•ay iJutftftftfuH

rny οαιυ tf 2 u 2 u u

tf O Ό £ (4 Η P P H U P

Jjp -«AH H tf p Η U H

OH uuHUOHOtf tftf »PtfHHPPu >< tf UtfHUtfHtftf nS cputf2upp SS Ή tf H U U U H 3 3P OUPPPUpp 2S s 8 s g s s s £ 33 sg&gssst: 35 DK 174980 B1 o o o o o o o o o r* r*» oo σι o o in in <n m n fr* O fri fri U 2 O y f« 4 t3 4 o < 4 e< o fr« o o 04ου o 4 o 4

4 fr« 4 O

0 4 0 0 5 8 S o

4 S O O

□ e· o t* H fri 4 4 4 O O fri

4 4 4 S

O 4 O fri 0 0 0 4 4 fr· p fri O O fri 4

O 4 O O

4 4 0 4

O fri O O

5 g S 3 ϋ 3 5 g t: ® < 4 O 8

g 8 g g .g S

o o o o fr· o m 4 fr« o 4 o w o o 4 o fri o 4 o fr· o Μ o U o fri 4

M fri u O 4 O

μ O fri O O O

C 12 O ti 4 fri

^ 4 O O O O

O O . O fr· fri - 0 0 0 0 4 J O fri O fr! 4

O O O O O

W fr; fr· 4 O O

O O O fri fri ffl 4 4 O fr. 4 o u ο ο υ „£0 0 0 4 4

*· O 4 fri 4 O

_ 0 0 0 0 4

fr« fr« fri o fr! O

4 0 0 O O

O 4 fr· fri O

p o o fr· 4 H O O O 4 o o fri 4 o 00044 fri O O 4 4

fr· O 4 O O

0 4 0 0 0

O O O 4 O

O fr! fr« O 4 fr* fr* o o υ

fr· O 4 4 O

fri fr* O O 4

4 O fri O O

O O fri 4 4 4 4 0 0 0 O O fr< O 4

O O fri O O

fri fr* O 4 O

O O O O O

O O fri o o O O O fr· fr·

fr· 4 O O O

O O fr* o o O fri I« 4 fri 4 0 0 0 0 o fri o o 4 O O fri 4 4 O 4 O O fr· 4 0 0 0 0 0 0 4 0 0

O fri O O O

O O fri fri O

O O O O fri

O 4 4 fri O

4 4 0 0 0

fr1 O O O O

fr* O fri 4 4

fri 4 O O O

fri 4 o O 4

fri 4 O 4 O

O o fr· O O

fri fri fri O Ei

O O fri O O

4 fri O O fr»

O . O fr« O O

'36 DK 174980 B1

Et. restriktionsendonucleoasekort (ca. 3*4 kb) for genomisk DNA, der indeholder hpG-CSF genet, vises i detailler i fig. 1. Restriktionsendonucleaserne i fig. 1 er: Ncol, N; PstI, Pr BamHI, B; Apal, A; Xhol, X; og 5 Kpn, K. Pilene under kortet viser den sekvenseringsstrategi, man benytter for at opnå den genomiske sekvens. De indrammede regioner er sådanne, som man finder i cDNA klonen og den punkterede åbne indramning repræsenterer en sekvens, der ikke findes i c DNA klonen, 10 men er identificeret med blot med mRNA sonde. Man udførte identifikationen af de kodende sekvenser, der foreslås til exon én ved Northern blot analyse. En 24 mer oligonucleotid sonde, 5'CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3', der spændte over de antagne sammensplejsningsforbindelser 15 for exonerne 1 og 2, blev hybridiseret med hpG-CSF mRNA i Northern blot format. Det resulterende blot viser en mRNA af samme størrelse (ca. 1650 bp), som man ser med ' en exon 2 oligonucleotidsonde. Dette resultat og evnen til at dirigere eksprimering af hpG-CSF ud fra pSVGM-20 Ppol vektoren (Eksempel 9) med Met initieringskodon, vist i Tabel VIII, definerer de kodende sekvenser, der findes i exon 1. Exonerne 2-5 defineres ved de kodende sekvenser, som man opnår i cDNA klonen (Ppo2) fra hpG-CSF genet (Tabel VII).

25

Eksempel 6

Eksemplet angår præparering af et fremstillet gen, der koder for hpG-CSF og omfatter kodoner til E. coli.

30 I korthed anvendte man samme fremgangsmåde, som vises i PCT publikation WOA3/04053, Alton, et al., som vi herved refererer til. Generne blev konstrueret, idet man først samlede komponent oligonucleotider til multiple duplexer, som derefter blev samlet i tre adskilte 35 sektioner. Disse sektioner blev konstrueret, så de let kunne mangfoldiggøres, og efter fjernelse fra mangfol- DK 174980 B1 37 diggørelsessystemet kunne samles i rækkefølge eller ved en ligering af mange fragmenter til en passende ekspri-meringsvektor.

Kontruktionen af sektionerne I, II og III illu-5 streres i tabellerne IX-XIV. Ved konstruktionen af sektion I, som illustreret i Tabellerne IX og X, samlede man oligonucleotiderne 1-14 til 7 duplexer (1 og 8; 2 og 9? 3 og 10? 4 og 11? 5 og 12? 6 'og 13? og 7 og 14).

Man sammenbandt derefter de syv duplexer under dannelse 10 af sektion I som vist i Tabel X. Man bør notere i forbindelse med Tabel x, at sektion I indeholder opstrøms en Xbal klæbende ende og nedstrøms en BamHI klæbende ende, der er nyttig til sammenbinding med mangfoldiggørelses- og eksprimeringsvektorer og til lig-15 ering til sektion II.

20 25 30 35 DK 174980 B1 38 TABEL IX 5

EChpG-CSFDNA SECTION I

CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA 1 TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT 2 10 CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG 3 AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT 4 GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA 5 CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC 6 TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG 7 15 CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT 8 GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT 9 TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG 10 CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC 11 TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG 12 20 ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG 13 GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT 14 25 30 35 39 DK 174980 B1 o O O o o O o u n «uu m eh d oo o α

Et d H u U Htid y y o o o o

Et d Et d < £-t O O O O En d

Et d U O y O

i* 3 y y o u y o d i* Et d

Et d y y o y

o Eh < o B < o O O

Kl U U HUU r- d E-I

yy hou Huu

Et d o»i y uhi < eh y y < e< *-t| 3 Et uy ^riyy οοή|

Et d y y voiy cj |y y Et d y y y y d Eh y y d Et 3 Et E-· d O Eh d O tf B o d Et ^E-t< o 3 Et vo y y d Et ι-t Eh < huo y y y y y o y y y y tt d

Et d Et < y y * y y Et 3 Et < < Et y y o y o u y cj < s- •J Et d < Et 3 Eh W o d H oyy o<Eh «η d Et σι < Et in cj y CQ E;< 3 Et <H <C Et d Et c y eh d < 5¾ oy μ 3 3 Ej E-ι c y y eh £ < y y < Ε«

Et < Et d 3 Et y y y y

Et d Et d y y

H

oyy o tf b oyy © o EC

g (NOCJ oo 3 Et <f ou ode O dEj 3 Et HEd »-t Et <0 n yu yo y o uco

Et yucoi Et d Et d yy y dEt uy yy yo ω ή 3 Et n|y uo dEt Et d M yy Et d '-il dEtntl Et 3 . yp yy m|3 Et h o y < 3 Et Et d dEt End P °3Et o Ε-· d o d Eh oyy fa ή d Eh r»Et d nyy o Et d W dEt yy ftdet ή tt 3 y dEt oo 3ε< dit ' 3 Et m dEt oy ootj-i p y <o 3 Et yo tt d ή Λ d Λ 3 Et Et d Mo o

Et xloo oy yo u y yy dEt oy w u y u y Et d 40 DK 174980 B1

Som illustreret som i Tabellerne XI og XII i forbindelse med konstruktion af sektion II samlede man oli-gonucleotiderne 15-20 i 8 duplexer (15 og 23; 16 og 24: 17 og 25; 18 og 26; 19 og 27; 20 og 28; 21 og 29; 5 og 22 og 30)· Derefter sammenbandt man disse 8 duplexer til opnåelse af sektion II, som vist i Tabel XII. Som yderligere vist i Tabel XII besidder sektion II opstrøms en BamHI klæbende ende og nedstrøms en EcoRI klæbende ende, der er nyttig til ligering til en mangfoldiggørel-10 sesvektor og til ligering til sektion I. Tæt ved ned-strømsenden omfatter sektion II også et nedstrøms SstI sted, der er nyttig ved eventuel sammenbinding af sektionerne II og III.

15 TABEL XI

EChpG-CSPDNA SECTION II

20 GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT 15 TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC 16 TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT 17 CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG 18 CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA 19 25 ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA 20 GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT 21 ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG 22 GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG 23 ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG 24 30 ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA 25 CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA 26 CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG 27 TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC 28 AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC 29 35 AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC 30 DK 174980 B1 Λ 1

·* I

© υ O o < E-ι o < B

© E-i < (N ti < æ ti < ου Hoy hoo eh < ocjm o u Εη < σ\Ι<£ Eh γμ| E-I «£ <λ|

O O rH|< EM £h < CN

ου ου i-iie-* i

En < ου nu o u o eh < < Eh ου υ o ου o o υ o h < o E-i < m f < riuu r* υ o uo <που που ου < Eh < Eh < Eh < Εη Η < υ ο η» υ ο ου vd|eh<«n| ου e < ήΙε-ι < Εη < < Εη υ ο υ ο ου Εη < Εη < < Εη _ Μ Ο υ Ο Ο Εη *< ο t < pj ο u ο υ ο νουο οι 3εη -η η < η ο υ ο εη ο υ «οι < eh < w υο οο ο υ γμ ] υο < ΰ eh < r-c|oυ ου εη Η υο ceh Εη< εη χ εη< υο υο ου < Εη Εη < Εη< «£ Εη ^ υο <εη υο <εη ,, ο υ Ο ο t <1 · © < Ε< · ο < t w η Ε-ι < σι ο υ ιηυο ή υ Ο ι-ι - ου Ε-ι < <Η 4! Eh CNEh<4J| β ε^«£ οο ου υο« εη< υο ουοοί ου to < υο εη< εη<γμ| <εη ,. εη < εη < οΐυ ο ο υ οι Εη Εη < ου γί|Εη < γμ|<* Επ η υ ο εη < υ ο γί|<! εη μ εη< υο <εη. ου Η ο ο υ ο t < ο ο υ ο ο υ 2 μ η < οο ο υ υ ο ο Ε-» < ο υο ου η υ ο γμ < εη η ουηΐ εη< εη«< ου Εη ιηΐυ ο <ν| υο ου < εη υ ι-πυ ο εη < ου υ ο

W Εη< Εη «ί OU «CEH

W υο <Εηιπ| Εη< < Εη ου γ-ιοογμΙ υο υο < ου *—* Ιο υ < εη ου 2 ο ο ο υ ο εη < ο < ε-ι ο ο υ t, <-<ΕΗ< NUO που σ»Επ< to ου <5 Ε-* που r-i εη «2 υ υο <εη υο εη < ι υο υο υο < εη Ο υ μ Εη < Εη< ΕΗ< α εη κ υο υο υο Λ <ΕΕη< Ε-ι < <Εη υ ο <ο o υ υο ε-*< w «Εη< εη< υο DK 174980 B1 42

Endelig konstruerede man sektion III som vist i Tabellerne XIII og xiv. Med henblik på denne konstruktion samlede man oligonucleotiderne 31-42 i 6 duplexer (31 og 37; 32 og 38; 33 og 39; 34 og 40; 35 og 41; 5 og 36 og 42)· Man sammenligerede derefter de 6 duplexer under dannelse af sektion III, som vist i Tabel XIV.

Som også vist i Tabel XIV omfatter sektion III opstrøms en BamHI klæbende ende og nedstrøms en EcoRl klæbende ende, nyttig til ligering i en mangfoldiggørelsesvektor 10 og, i hvert fald når det drejer sig om EcoRl, i en ek-sprimeringsvektor. Derudover besidder sektion II et opstrøms SstI sted, nyttig ved eventuel ligering af sektionerne II og III.

15 TABEL XIII

ECHGpG-CSFDNA sektion III

2o GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG 31 CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG 32 GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC 33 AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG 34 CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT 35 25 TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG 36 AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG 37 ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC 38 TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA 39 ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC 40 30 C AG AAC ACGG TAAG ATACTTC CAGGAAAG 41 AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG 42 35 43 DK 174980 B1 o < f OEh«(

vo U O (N U U

O O r-4 < M

O U < Eh « u o 3 eh οι CJ o o o < u O O O CJ 3 w

Eh < Eh < in 1 «it· O O f eh < t· < o u

OOC5 o<f o < E-I

Lfi U U h u U r- Eh <

Ε-·«ΐ Hf· <o| h < H

O CJ CJ o v| < Eh CJ CJ CO I ηγ|Εη «£ M <

γμ|<£ f ro| γο|εη 3 o CJ

ro|3 Eh CJ O O O

CJ O O U U O

E-« «< E-ι «C C5CJNI

CJ O Eh 3 < EH '»I

O < Eh O o CJ O CJ O

'a' O CJ OOU «3Εη<

OO HE< HUO

w o o u o o u

> < Eh < Eh O O

ti < Eh Eh < voIEh <

X CJ O O U cocj O

OO Eh «i Eh < . Eh < O U «ί Eh ►3 o o o u u o W OlEH < O < Eh o Eh <

_ ro|u o σου m o U

® OU OU HUO

^ «< EH < Eh O U

< U O U O Eh C

u O o o o o

Eh < Eh Eh «£ Eh < U O O U Eh <

M O O U O O O

w O U Eh < Eh <

O EH < OOU OOU

2 CN < Eh oo U O <f U O

0 Eh < r»| OU HUO

« P U n| < Eh C Eh

Eh Hp U U O σι Eh «ί U nluo ro|U O <o| Eh 3

Μ £h < M ro Eh «£ UO

W UOhJI Eh 3 Eh<

OU 0)1 <EH <EH

< < Eh cn| UO Eh< 2

Q OOU OOU OOU

ti ή«£Εη Γ»Εη< ro «ί Eh W < Eh U O H < Eh

U «S. Eh Eh«£ OUhI

1 U O Eh 3 OUO· U U M U O U0|Eh <

Di Eh K OU rolu O

JC .< E| U O U O

U O (0 Eh «C Eh «£ w ml eh|3 eh 3 DK 174980 B1 44

Xbal-BamHI fragmentet, dannt af sektion I, ligeres i en M13mpll phag vektor, åbnet med Xbal og BamHI.

Man genåbner derefter vektoren ved fordøjelse med BamHI og EcoRI, hvorefter man ligerer med BamHI-EcoRI frag-5 mentet, dannet af sektion II. på dette trin er sektionerne I og II blevet sammenbundet i den rigtige orientering. Derefter åbner man en anden M13mpll vektor ved hjælp af fordøjelse med BamHI og EcoRI og ligerer den derefter med BamHI-EcoRI fragmentet, dannet af sektion 10 III.

Man lader vektoren, der indeholder sektionerne I og II, fordøje med xbal og Sstl. Ligeledes lader man vektoren, der indeholder sektion III, fordøje med Sstl og EcoRI. De mindste af de to fragmenter, der i begge 15 tilfælde dannes ved fordøjelsen, ligeres i et plasmid pCFM1156, som tidligere er åbnet med Xbal og EcoRI. Reaktionsproduktet er et eksprimeringsplasmid, der inde- ' holder en kontinuert DNA sekvens, som vist i Tabel XV, og som koder for hele hpG-CSF polypeptidet med en amino-20 terminal methioninkodon (ATG) til initiering af translation i E. coli.

25 30 35 45 DK 174980 B1 s o e« <a 30 se« 30 ae« me >,«£ ni e« u ή die« ai e« di e« «< hu hu »jo o c »jo »jo »jo <o <o oo u e« e« >. <-» < «ae« 3 e« a < o < «a < οι o o fH <a e« ho die« die« u o ho we oo >o <o »jo »j o p. o <o u E* oa 30 c< >e« co «a < o»e« d> o <m die« ή < »ho »π < ho v< u t n e« o< »jo oo oo oo <o <o •c e« e« >» so u e« co so wo o»e«

rH O O Ή rH < dl O rH < dl E« die« U O

<o oo oo ω e« oo »j o s: < <o oe« oc 3 < o < u e« u e« >»e« c o 1- O < rH rH < M O >1 < £0 rH O rH < a*o o o o o o*o e« e« e« < o o o o >«eh odi oo « e« 30 ao 3 o di o <h o e« »η u o >»o <ue« μ < <ue« λ e« oo <h o*o o e« »jo <o ho o* e« 3 < <03 01 e« H Eh dl O 30 30 <0 < die« <>i ·η< dio .c e« oie« *h< ,η u »j e« < »j k o rne« o* e« »jo oo <o o< e« σ» oio >« e« so u e* 3< u e«

u O O Vi >iO dl O die« £0 rH < Q> CJ

o*o o< o e« ene« »jo e« < oo tue > Η I* E« e« rH 30 30 >»H O O 4J o nj e« ><+j3o e« <a die« die« <-* o »«o die« hu e« < o > »jo »jo oo o*o s < <o jrHjJO o o c ooi< o o o o «- e« o >»e« o c o o di o I dl e* «Ν < r-H «ί>ι< »O U O COdlO OHO MH< «J· .C £« ω s < oo j < o* o. tn e« >huo huo *ho*eh a < <3 »«o «o e« oie« 30 c < «o <

e« < rH >1 < HO -H< dl EH rH < HU

< < OO Eh E« «Α O SCO »JO OO <0 t* < 0 3 u e« ao so 3< ao o o < e« di c o u o aie« <h< uo uo e« o »j e« < e« e« <h o o o e« e« o* o 3e« ai «oe* oo c < oo die« -«o O >1 H O U O rH < u o rH f« dl E« e« e« o <o p* o oo p* o m < s: < o <oi οι o οι o u e u e« u e« «ae« o < >« >i o rne« oio oi o x: o *h o < < »j o e« h < we« oie« e« < <o O 0 3 3 0 >tO 3 0 dl O u e« >,E«

O Eh 01 die« H u die« rH E« JCO HU

< o »j »jo oo »jo m < e« < oo < 03 W < 3 Eh «Eh >»E« «AE« C< O Eh dl >1< dl Eh ShO Ή O rH O rH < o o »j »j < »jo oe oo <o oo < e« oi 3 < ue >»e« 3 < oi e« u en < Eh JZ rH< OO HU rH< JSEh X30 < Eh P* OO ene« OO OO Pi E« E« < < ou c <£ »e« «ae« 3 o ao o o < ooi rH< -h< ho die« «< uo < < tn oo sco < o »jo < o p* o O <c 3 0 >*e« 30 «0 Eh «ae« c < < < Ή 0) E« hu O Eh hu hu rH < EH UO »JO oo »jo <o <o ou O o o O 0«a< 030 O C o OCrf O rH < 030 H u u Γ0 H O ir»0)=H i'·' rH < OI rH < rH <a Eh ΓΟ Q) Eh

UP* <0 »JO OU OU rH > o HJU

46 DK 174980 B1 0ȣh

kl O

< O

3 O 0) Eh J o rH H «0 E-< > o

Cr>E-< kl o

< O k. O

>i < E< E* kl t* tt) u to E-) ^ <H c 4j «0 E-·

ro > O

m S 33

o o O

lu 3 0 0)

> JO

o tt) O

Ό £ E^

J H ft M

U ^ E-r

0) O

n w & < 55

Eh o o e< 3 0 f

tt) E-r <C

JO <

0) E-< O

·* < < as o k. Eh < o; o < 10 E< É-<

ro Eh xt O O

HU ki O

< O »H 04 u

Hfr CO

ro E* <H <

> O O O

3 0 fl ti

0) E-« ·-< CJ

JO < O

Ή < 3 0 <0 E-r 0) E-r

> O JO

O >iEH O « Eh in -( O i" -π <

ή O O HSO

DK 174980 B1 47

Selv om man kan anvende en hvilken som helst passende vektor til at eksprimere dette DNA, kan man uden videre konstruere eksprimeringsplasmidet pCFMll56 ud fra et plasmid pCFM836, hvis konstruktion er beskrevet i EPO 5 publiceret patentansøgning nr. 136 490. Man gennemskærer først pCFM836 med Ndel og afrunder enderne med Poll, således at begge de eksisterende Ndel steder ødelægges.

Derefter lader man vektoren fordøje med Clal og Sadl, så man fjerner en eksisterende polysammenbinder før lig-10 ering til en substitut polysammenbinder, som illustreret i Tabel XVI. Man kan konstruerer denne substitut poly-sammenbinder ved fremgangsmåden ifølge Alton, et al., se ovenfor. Kontrol af eksprimeringen i eksprimeringsplasmidet pCFM1156 foregår ved hjælp af en lambda Pl promo-15 tor, som selv måske er under kontrol af et C1857 repressor gen (såsom hvad der tilvejebringes i E. coli stamme K12AHtrp).

20 25 30 35 48 DK 174980 B1 I—i

M

f < OS

< t Ol o o ui u o wl < Eh tt < O CJ n* O O *· O O Eh tf

E-l tf rH

< tt 3

tf f iH CN

O CJ X o cj u nj

Eh tf 0\ W

Eh tf m CJ U «Λ U CJ - O O ΓΗ o o <-t u o > u o tol η tf X tf f QJ < Eh <n tf h æl o o οι , ti tf U CJ J= J f tf * tf t x O U Ή tf tt

W CJ CJ r-i E-ι tf M

t· tf οι o cj a α C ti c «El El f tf ·Η tf EH «0 tf tf t al t< < ml U CJ * tf Eh t· <Et mn «Et m tf Eh fo>| «Η r-

En tf 4J| Eh < tf Eh *cn| tf f tf Eh r-i O CJ *—i o u <u|r-t o cj οι O O Ό 0| U O £ tf Eh zlu o U x| ou z| uu

CJ U <J\ u CJ rH

tf Eh CM t" Eh tf «TJI

tf Eh in < Eh > O U ·» CJ U «cl

tf Eh >-h - CJ CJ

Eh tf fC -H tf Eh O

U CJ JO Cl CJ U

Eh «ί X DJ U CJ

Eh <2 il Ei«

tf E-ι (N U CJ rH

O U i—t <—l < Eh rH

f tf U Eh tf rH

El < *·Η| Eh< Ό

Eh tf rH Ol U O C

tf ti mial o u -π O O rH tf EH a U CJ U |tn < Eh E-i < in CJ U η tf Eh rH (J CJ vo

^4 iH

VO

DK 174980 B1 49

Eksempel 7

Dette Eksempel angår E. coli eksprimering af et hpG-CSF polypeptid ved hjælp af en DNA sekvens, der ko-5 der for fMet-l] hpCSF. Den anvendte sekvens var delvis syntetisk og delvis afledt fra cDNA. Den syntetiske sekvens benyttede kodoner egnet til E. coli.

Man fordøjede plasmidet Ppo2, der indeholdt hpG-CSF genet vist i Tabel VII, med HgiAI og Stul under tiΙ-ΙΟ vejebringelse af et ca. 645 basepar fragment, der indeholdt genet for færdig hpCSF (som vist i Tabel VII) med syv af ledersekvensens kodoner i 5' enden og ca. 100 basepar i den ikke kodende 3'-ende. Fordøjelse med HgiAI tilvejebringer en 5' 4-base klæbende ende, der er iden-15 tisk med, hvad man får med Pst i, og fordøjelse med Stul giver en lige ende. Dette medfører, at man uden videre kan indsætte fragmentet i Ml3 mp8 (Rf) gennemskåret med PstI, og med det ligeende-dannende restriktionsenzym Hindi. Efter mangedobling i M13 lod man hpG-CSF DNA 20 udskære ved fordøjelse med Apal og BamHI, som henholdsvis skærer ved Apal stedet, der indeholder kodonerne for resterne +3 til +5 i hpCSF og ved et BamHI sted "ned-strøms" i forhold til Hindi stedet i M13 rop8 restriktionssammenbinderen. For at man kunne opnå E. coli ek-25 sprimering af hpG-CSF polypeptidet, fremstillede man et syntetisk fragment, som vist i Tabel XVII nedenfor.

30 35 DK 174980 B1 50

TABEL XVII

5' - C TAG AAA AAA CCA AGG AGG TAA TAA ATA

5 3' - TTT TTT GGT TCC TCC ATT ATT TAT

Xbal -1 +1

Met Thr Pro Leu ATG ACA CCT CTG GGC C - 5' TAC TGT GGA GAC -3' 10

Som man kan se ved analyse af Tabel xvil, omfatter sammenbinderen en Apal klæbende ende, kodoner, der koder for de første tre rester i aminoenden af hpG-CSF 15 (og som "genopretter" kodonerne, der koder for Thr*,

Pro^ og Leu3, og som blev udslettet ved Apal fordøjelse af Ml3 DNA, beskrevet ovenfor, og under anvendelse af kodoner, der fortrinsvis eksprimeres i E. coli), et translationsinitierende ATG, en sekvens på 24 basepar, 20 der tilvejebringer et ribosombindingssted og en Xbal klæbende ende.

Eksprimeringsvektoren, som man anvender til E. coli eksprimering, var den, der beskrives aom pCFM536 i EPO patentansøgning nr. 136 490, Morris, offentliggjort 25 10. april 1985. (Se også A.T.C.C. 39934, E. coli JM103 med indhold af pCFM536). Kort fortalt fordøjede man plasmid pCFM536 med Xbal og BamHI. Man ligerede derefter hpG-CSF fragmentet (Apal/BamHI) og sammenbinderen (Xbal/ Apal), beskrevet ovenfor, under dannelse af et 30 plasmid, der blev betegnet p536Ppo2.

Man transformerede plasmid p536Ppo2 i en phag modstandsdygtig variant af E. coli AM7 stammen, som tidligere var blevet transformeret med plasmidet pMWl (A.T.C.C. nr. 39933), der indeholdt et CI857 gen. Man 35 kontrollerede transformationen ved hjælp af markørgenet for antibiotisk modstand (amp), som bæres af stamfader- 51 DK 174980 B1 plasmidet pCFM536. Cellekulturer i LB urt (ampicillin 50 |ig 1 ral) blev opretholdt ved 28*£# og efter vækst af celler i kulturen til A$qo = 0,5, inducerede man hpCSF eksprimering, idet man forhøjede temperaturen af kultu-5 ren til 42°C i tre timer. Den sluttelige O.D. af kulturen var AgøO = 1,2.

Man bestemte niveauet for eksprimering af hpG-CSF af de transformerede celler på en SDS-polyacrylamidgél, farvet med blå cooraassifarve til at være 3-5% af total 10 cellulær protein.

Man indhøstede celler ved centrifugering ved 3500 g i 10 minutter på en JS-4,2 rotor. Man knuste celler i vand 25% (w/v), idet man lod opslæmningen passere tre gange gennem en French trykcelle ved 10.000 psi. Den 15 sønderdelte cellesuspension blev centrifugeret ved 10.000 g i 15 minutter i en JA-20 rotor. Bundfaldet blev igen suspenderet i vand og eolubiliseret med et indhold på ca. 5 mg/ml total protein i 1% laurinsyre, 50 mM Tris, pH 8,7. Det solubiliserede materiale fra bund-20 faldet blev centrifugeret ved 15.000 g i ti minutter, og man satte CUS04 op til en koncentration på 20 mM til su-pernatanten. Efter en time påsatte man denne prøve en C4 HPLC søjle til rensning ifølge fremgangsmåden i Eksempel 1 (B) med korrektioner for rumfang og koncentra-25 tion.

Man udviklede en anden rensningsfremgangsmåde med henblik på større mængder af hpG-CSF formuleret i en puffer, der indeholdt ikke-organisk materiale. Dette materiale er egnet til in vivo studier. Man udsuspende-30 rede 150 g cellepasta i ca. 600 ml 1 mM DTT og lod det fire gange passere gennem en Manton Gualin homogenisa-tor ved ca. 7000 psi. Den knuste cellesuspension blev centrifugeret ved 10.000 g i 30 minutter, og man udsuspenderede bundfaldet i 400 ml desoxycholat (DOC), 5 mM 35 EDTA, 5 mM DTT, og 50 mM Tris, pH 9. Denne suspension blev sammenblandet i 30 minutter ved stuetemperatur og 52 DK 174980 B1 centrifugeret: ved 10.000 g i 30 minutter. Man udsuspenderede igen bundfaldet i ca. 400 ml vand og centrifugerede ved 10.000 g i 30 minutter. Bundfaldet blev solu-biliseret i 100 ml 2% sarkosyl og 50 mM ved pH 8· Man 5 tilsatte CuS04 op til 20 in og boldt blandingen under omrøring 16 timer ved stuetemperatur, hvorefter man centrifugerede ved 20*000 g i 30 minutter. Til supernatan-tan tilsatte man 300 ml acetone. Denne blanding blev anbragt på is i 20 minutter og derefter centrifugeret 10 ved 5000 g i 30 minutter. Bundfaldet blev opløst i 250 ml 6 M guanidin og 40 mM natriumacetat ved pH 4 og påsat en 1200 ml <3-25 søjle, bragt i ligevægt og drevet med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. Fraktioner med indhold af hpG—CSF (ca. 400 ml) blev sammenbragt og påsat en 15 ml 15 CM-cellulosesøjle, bragt i ligevægt med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. Efter påsætningen vaskede man søjlen med 60 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 25 mM natriumchlorid og derefter eluerede man søjlen med 200 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 37 mM natrium-20 chlorid. 150 ml af dette gennemløb blev indkoncentreret til 10 ml og påsat en 300 ml G-75 søjle, bragt i ligevægt og drevet roed 20 mM natriumacetat og 100 mM natriumchlorid ved pH 5,4. Fraktioner med relevant indhold (35 ml) blev sammenbragt og filtersteriliseret. Slut-25 koncentrationen af phG-CSF var 1,5 mg /ml, det var mere end 95% rent som bestemt ved analyse på en gel og indeholdt mindre end 0,5 ng pyrogen pr. 0,5 mg hpG-CSF. Indholdet af pyrogen blev bestemt under anvendelse af et . Limulus Amebocyte Lysate (LAL) prøveudstyr (Μ. A. Bio-30 products, Walkersville, Maryland).

Eksempel 8 (reference) I dette Eksempel benyttede man et pattedyrscelle-eksprimeringssystem til at fastslå, om et aktivt poly-peptidprodukt ud fra phG-CSF DMA kunne eksprimeres i og ^ udskilles af pattedyrsceller (COS-1, A.T.C.C. CRL-1650)« DK 174980 B1 53

Systemet blev konstrueret, så det kunne tilvejebringe udskillelse af et polypeptid analogt til phGCSF ved eks-primering og udskillelse af en delvis syntetisk, delvis cDNA-afledt konstruktion, der kodede for [Alal ] hpG-CSF, 5 hvor der foran var anbragt et leader polypeptid med en sekvens af aminosyrerester, som henføres til human G--CSF ifølge Wong, et al., Sciense, 228, 810-815 (1985) og Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360-4364 (1985).

10 Eksprimeringsvektoren, som man anvendte til fore løbige studier af eksprimering af polypeptidprodukter ifølge opfindelsen, var en "shuttle"-vektor, der inkorporerede både pBR322 og SV40 DNA, og som var blevet konstrueret til autonom replikation både i E. coli og i 15 pattedyrsceller, idet eksprimeringen i pattedyrsceller af indsat exogen DNA var under kontrol af en viral promotor /regulator DNA sekvens. Denne vektor, betegnet pSVDM-19 i E. coli Hn 101, blev deponeret 23. august 1985 hos American Type Culture Collection, 12301 Par-20 klawn DRive, Rockville, Maryland, med nr. A.T.C.C.

53241.

Ved konstruktion af ekspressionsvektoren udførte man følgende specifikke manipulationer. Man syntetiserede en DNA sekvens, der kodede for leader, som nævnt i 25 Tabel 20 nedenfor. 1 35 30 DK 174980 B1 54

TABEL XX

-17 5 Hindlll Met Trp

5' - A GCT TCC AAC ACC ATG TGG 3' - AGG TTG TGG TAC ACC

-10 I 10 Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly The Val

I CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG

I GAC GTC TCG GAC GAC GAG AAC CCG TGA CAC

I -1 +1 I 15 Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Leu I GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC CTG GGC G -3 1 I CGG ACG TCG TAG AGA CGT GGG GAC -5' I 20 I Som det: ses af Tabel XX, omfatter sekvensen Hin- I dm og Apal klæbende ender og kodoner for de 17 amino- I syrerester, som man mener tilhører "leaderen" for human I 25 GM-CSF. Derefter følger kodoner for en alaninrest, en I prolinrest og en leueinrest. Prolin- og leueinresterne I duplikerer de aminosyrer, der findes ved positionerne +2 I og +3 i hpG-CSF, hvorimod alaninresten duplikerer den I . første aminosyre rest (+1) i GM-CSF snarere end den før- I 30 ste i hpG-CSF.

I Man havde konstrueret ombytningen af threonin I med alanin, idet det derved ville være lettere for den I aktuelle værtscelle at fjerne GM-CSF leaderpeptidet ved I cellemekanismer, normalt forbundet med udskillelse af I 35 GM-CSF.

I Man fordøjede plasmid pSVDM-19 med Kpnl og ud- I fyldte til lige ender med Klenow enzym. Derefter gen- 55 DK 174980 B1 nemskar man DMA med Hind 111. Det resulterende store fragment blev kombineret og ligeret med Hindlll/pvuII fragmentet i der er vist i Tabel VII (isoleret fra plasmid ppo2 som det næststørste fragment efter en Hindlll 5 fordøjelse og en delvis fordøjelse med Pvull) under dannelse af plasmid pSV-Ppol. Derefter ligerede man det fremstillede GM-CSF leadersekvensfragment i Tabel VIII i pSV-Ppol (efter at det var kløvet med Hindlll og Apal) til opnåelse af plasmid pSVGM-ppol.

10 Man transformerede calciuraphosphatprecipitater (1-5 ug) af plasmid pSVGM-Pol DNA i duplikat 60 mm plader af COS-1 celler, i det væsentlige som beskrevet ifølge Wigler, et al., Cell, 14, 725-731 (1978). Som kontrol transformerede man også plasmid pSVDM-19 i COS-1 15 celler. Man indhøstede supernatanten over vævskulturen fera dage efter transficering og analyseredes for hpG-CSF aktivitet. Udbyttet af [Alal ]hpG-CSF fra kultursuperna-tanten var af størrelsesordenen 1-2,5 pg/ml.

Efter den positive eksprimering af plasmidet 20 pSVGM-Ppol, der koder for [Alal]hpG-CSF i COS-1 celler, konstruerede man en anden vektor, som omfattede den humane GM-CSF leadersekvens, men havde en kodon for en threoninrest (naturlig forekommende i position 1 i hpG-CSF), der erstattede kodonet for alanin ved denne 25 stilling. I korthed syntetiserede man et oligonucleotid (5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG) til positionsrettet mutagenese (SDM). Man ligerede Hindlll - BamHI hpG-CSF fragmentet i pSVGM-ppol i M13mpl0 med henblik på SDM. Det nysyn-. tetiserede hpG-CSF gen, der indeholdt en Thr kodon i po- 30 sition 1, blev isoleret ved spaltning med Hindlll og

EcoRI. Derefter klonede man fragmentet i pSVDM-19, forberedt ved kløvning med de samme to restriktions-endonucleaser. Den resulterende vektor pSVGM-Ppo(Thr) blev transformeret i COS celler, og udbyttet af hpG-CSF 35 målt i supernatanten fra kulturen lå i området 1-5 ug/ml.

56 DK 174980 B1

Endelig anvendte man den genomiske sekvens, hvis isolering beskrives i Eksempel 5, til at danne en ekspressionsvektor til eksprimering hpG-CSP i pattedyrsceller. Mere detailleret lod man pSVDM-19 fordøje med Kpnl 5 og Hindlll og benyttede det store fragment i en firedobbelt legering med en syntetisk sammenbinder med Hindlll og Ncol klæbende ender, som vist i Tabel XXI. Et Ncol -BamHI fragment, der indeholdt exon 1 isoleret fra pBR322 (8500 hpG-CSP), en genomisk subklon, og et BamHI - Kpbl 10 fragment med indhold af exonerne 2-5, isoleret fra plasmid pBR322 (8599 hpG-CSP genomisk subklon). Den resulterende ekspressionsvektor til pattedyrsceller, pSV/ghG-CSF producerede 1-2,5 Mg/ml hpG-CSF fra transformerede COS celler.

15

TABEL XXI

Hindlll

5'AGCTTCCAACAC

20 AGGTTGTGGTAC5'

Ncol

Eksempel 9

Eksemplet angår fysiske og biologiske egenskaber 25 af rekombinante polypeptidprodukter ifølge opfindelsen.

1. Molekylvagt

Rekombinante hpG-CSF produkter fra E. coli eksprimering som i Eksempel 7 havde en tilsyneladende mole-30 . kylvægt på 18,8 kD, bestemt ved hjælp af reducerende SDS—PAGE (som man ville vente ud fra de angivne aminosyrer i Tabel VII), hvorimod naturlige idolater renset som i Eksempel 1 har en tilsyneladende molekylvægt på 19,6 kD. En teori om tilstedeværelse af N-glycaner, as-35 socieret med de naturlige isolater, kan afvises, da der mangler asparaginrester i priroærsekvensen for hpG-CSF i 57 DK 174980 B1

Tabel VII« og som følge heraf konstruerede man en fremgangsmåde til at bestemme, om O-glycaner var ansvarlige for forskelle i molekylvægt mellem de naturlige isolater og de ikke-glycosylerede rekombinante produkter. Man 5 behandlede ca. 5 pg af naturligt isolat med neuraminidase (Calbiochem, LaJolla, Californien), man udtog en prøve'på 0,5 pg og inkuberede resten med 4 mU O-glycana-se (endo-x-n-acetylgalactoseaminidase, Genzyme, Boston, Massachusetts) ved 37¾. Man udtog lige store portioner 10 efter 2 og 4 timers inkuberuring. Disse prøver blev underkastet Βϋδ-ΡΛΰΕ side om side med det rekombinante materiale, afledt fra E. coli. Efter behandling med neuraminidase ændredes den tilsyneladende molekylvægt af isolatet fra 19,6 kD tril 19,2 kD, hvad der kunne skyl-15 des, at en "sailic acid11 rest blev fjernet. Efter to timers behandling med O-glycanase ændredes molekylvægten til 18,8 kD - denne værdi er identisk med den tilsyneladende molekylvægt af materialet, afledt fra E. coli. På grund af carbohydratstrukturens følsomhed overfor neura-20 minidaser og O-glycanase, kan man foreslå følgende struktur for carbohydratkomponenten: N-acetyl-neuramin- syre-a(2-6)(galactose p(1—3) N-acetylgalactose-amin-R, hvori R er serin eller threonin.

25 2. Optagelse af 3H-Thymidin

Man undersøgte induktion af vækst ved celledeling for humane knoglemarvsceller, baseret på voksende inkorporering af 3H-thymidin. Man underkastede human knogle-, marv fra sunde donorer en opdeling med hensyn til den-30 sitet ved hjælp af Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml. Pharma-cie) og udsuspenderede celler med lav densitet i Iscove’s medium (GIBCO), der indeholdt 10% kalvefoster-seruro og glutamin pen-strep. Derefter inkuberede man 2x104 humane knoglemarvsceller med enten kontrolmedium 35 eller det rekombinante E. coli materiale fra Eksempel 7 i plader med 96 fordybninger med flad bund ved 37^ med DK 174980 B1 58 5% CO2 1 luften i to dage. Man foretog dobbeltanalyser og lod koncentrationen variere med en faktor 10.000. Kulturerne blev derefter holdt under pulsering i fire timer roed 0,5 μ Ci/fordybning 3H-thymidin (New England 5 Nuclear, Boston, Massachusetts). Man målte optagelsen af 3H-thymidin som beskrevet hos Ventua, et al.. Blood,

61, 781 (1983). Ved dette forsøg kan humane hpG-CSF

ieolater inducere inkorporering af 3H-thyroidin i humane knoglemarvsceller i et ca. 4-10 gange højere niveau end 10 ved anvendelse af kontrolsupernatanter. hpG-CSF mate rialet, afledt fra E. coli, ifølge Eksempel 6, havde lignende egenskaber.

Man udførte et andet studie over vækst ved celledeling af humane knoglemarvsceller, idet man anvendte et 15 dyrkningsmedium fra transficerede C0S-1 celler ifølge Eksempel 8, og opnåede samme resultater, hvad der var et tegn på, at det kodede polypeptidprodukt faktisk som aktivt materiale blev udskilt i dyrkningsmediet.

20 3. Inducering af differentiering i WEHI-3B D+

Evnen hos rekombinantmateriale, afledt fra E. coli, til at inducere differentiering i den myelomonocy-tiske leukæmicellelinie WEHI-3B D+ fra mus, blev undersøgt i et halvfast agarmedium, som beskrevet i Metcalf, 25 Int. J. Cancer, 25, 255 (1980). Man inkuberede det re-kombinante hpG-CSF produkt og et kontrolmedium med ca.

60 WEHI-3B D+ celler/fordybning ved 37¾ med 5% CO2 i luften i syv dage. Man inkuberede prøverne i plader med , 24 fordybninger med flad bund og lod koncentrationen va-30 riere med en faktor 2000. Kolonierne blev opdelt som ikke-differentierede, delvis differentierede eller fuldstændig differentierede, og man talte celler i kolonierne under mikroskop. Man fandt, at det rekombinante materiale fra E. coli inducerede differentiering.

35 59 DK 174980 B1

4. Analyser for CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM

Man fandt, at naturlige isolatet af pluripotent human G-CSF (hpG-CSF) og det rekombinante pluripotente human G-CSF (rhpG-CSF) kunne få menneskelige knogle-5 marvsceller til at undergå celledeling og differentie

res. Disse aktiviteter blev målt ved CFU-GM [Broxmeyer, et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)] BFU-E og CFU-GEMM

assays [lu, et al., Blood, 61, 250 (1983)] under anvendelse af ikke-sammenhængende knoglemarvsceller med lav 10 densitet fra sunde frivillige mennesker. En sammenligning af CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM biologiske aktiviteter under anvendelse af enten 500 enheder hpG-CSF eller rhpG-CSF vises i Tabel XXII nedenfor.

Alle koloniforsøgene blev udført med ikke-sammen-15 hængende knoglemarvsceller med lav densitet. Man underkastede humane knoglemarvsceller en densitetopdeling med Ficoll-Hypaque (densitet 1,077 g/cm^· Pharmacia). Man udsuspenderede cellerne med lav densitet i Iscove’s modificerede Dulbecco's medium, der indeholdt kalvefoster-20 serum og anbragte dem på Falcon vævskulturskåle (nr.

3003, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) i 1½ time ved 37°C.

TABEL XXII 25

_CFU-GM_BFU-E_CFR-GEMM

Kontrolmedlura 0±0 26 ±1 0±0 , Naturligt hpG-CSF 83 ±5,4 83 ±6,7 4±0 30 rhpG-CSF 87 ± 5 81 ± 0,1 6 ± 2

Kontrolmediet bestod af Iscove's modificeret Dul-becco medium plus 10% FCS, 0,2 mM haamin og 1 enhed re-kombinant erythropoietin.

35 Ved et CFU-GM assay udplattede man de pågældende celler i et antal på 1 x 105 i i nl 0,3% agar dyrknings- 60 DK 174980 B1 medium, der omfattede supplementeret McCoy's 5Ά medium og 10% varmeinaktiveret kalvefosterserum. Man gennemsøgte kulturerne for kolonier (mere end 40 celler pr. sammenklumpning) og undersøgte morphologien den syvende 5 kulturdag. Antallet af kolonier vises som middelværdi ± standardafvigelse, bestemt ud fra firedobbelte forsøg.

Ved BFU-E og CFU-GEMM assays satte man celler (1 x 105) til en 1 ml blanding af Iscove's modificeret Dul-10 becco medium (Gibco), 0,8% roethylcellulose, 30% kalvefosterserum, 0,05 nM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM hemin og l enhed rekorabinant erythropoietin. Man inkuberede skålene i en fugtig atmosfære, der indeholdt 5% CO2 og 5% O2. Man opnåede et lavt oxygentryk ved hjælp af en 15 oxyreducer fra Retning Bioinstruments (Syracuse, N.Y.).

Man talte kolonier efter 14 dages inkubering. Antallet af kolonier vises som middelværdi ± standardafvigelse, bestemt ved dobbeltforsØg.

Man fandt, at alle kolonier, der blev dannet i 20 CFU-GM assayet, var positive overfor chloracetatesterase og negative overfor ikke specifik esterase (a-naphthyl-acetatesteraee), i overensstemmelse med, at kolonierne er af granulocyttype. Man fandt, at både naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF havde en specifik aktivitet på ca. 1 x 25 108 U/mg rent protein, når det blev undersøgt ved vok sende fortynding i et CFU-GM assay. BFU-E og CFU-GEMM data i Tabel XXII er repræsentative for tre adskilte eksperimenter, og resultaterne ligner data, man tidligere . har opgivet for naturlig hpG-CSF. Det er vigtigt at be-30 mærke sig, at rhpG-CSF er overordentlig ren og fri for andre mulige vækstfaktorer fra pattedyr på grund af sin frembringelse i E. coli. rhpG-CSF er således i stand til at understøtte dannelse af blandede kolonier (CFU-GEMM), og BFU-E når det tilsættes under tilstedeværelse 35 af rekombinant erythropoietin.

61 DK 174980 B1 5· Forsøg med cellebinding

Det er tidligere blevet meddelt, at WEHI-3B(D+) celler og humane leukæmiceller fra frisk diagnosticeret leukæmi vil binde g-CSF fra mus, og at der 5 kan foregå konkurrence om denne binding ved tilsætning af ikke-mærket G-CSF eller human CSF-Ø. Man afprøvede evnen hos naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF til at konkurrere om binding af 125j_hpG_csF til leukæmiceller fra mennesker og mus. Man ioderede højrenset naturlig hpG-CSF 10 (>95% ren, 1 μg) [Trejedor, et al., Anal. Biochem., 127, 143 (1982)], og man skilte det fra reaktanterne ved hjælp af gelfiltrering og ionbytterchromatografi. Den specifikke aktivitet af det naturlige 125j_hpG-CSF var omtrent μCi/μg protein. Man afprøvede WEHI-3B(D+) 15 fra mus og to præparationer af periferale myeloide leukæmiceller fra menneskeblod (ANLL, én klassificeret som M4, en anden som MSB) for deres evne til at binde 125i_hpG-CSF.

Museleukæraicellerne og de frisk indsamlede humane 20 periferal myeloide leukæmiceller fra blod blev vasket tre gange med PBS/l% BSA. Man inkuberede WEHI-3B(D+) celler (5 x 10^) eller friske leukæmiceller (3 x 10*>) i dobbeltforsøg i PBS/l% BSA (100 μΐ) under fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer (rumfangs 10 μΐ) 25 ikke mærket hpG-CSF, rhpG-CSF eller GM-CSF og under tilstedeværelse af I25i_hp(3--CSF (ca. 100*000 cpm eller 1 ng) ved 0°C, i 90 minutter. (Totalrumfang; 120 μΐ). Man udsuspenderede cellerne igen og anbragte dem som et lag , over 200 μΐ iskold FCS i 350 μΐ plastcentr i fugerør og 30 centrifugerede dem (1000 g, 1 min.). Man indsamlede bundfaldet ved at skære enden af røret af og talte bundfaldet og superna tanten hver for sig i en gamma tæl ler (Packard).

Man bestemte specifik binding (cpm) som totalbin-35 ding under fravær af en konkurrent (gennemsnit af to forsøg) minus bindungen (cpm) under tilstedeværelse af 62 ' DK 174980 B1 et 100 dobbelt overskud af ikke-mærket hpG-CSF (ikke specifik binding). Den ikke-specifikke binding var mak» siraal 2503 qpm for WEHI-3B(D+) celler, 1072 cpra for ANLL (M4) celler og 1125 cpm for ANLL (M5B) celler. Det før-5 ste og det andet eksperiment blev udført på adskilte dage med samme præparation af ^2^I»hpG-CSF, og forsøgene udviser indre konsistens med henseende til procentværdien af inhibition, opnået for 2000 enheder hpG-CSF. Data angives i Tabel XXIII nedenfor.

10 15 20 25 30 35 63 DK 174980 B1 Λ •Η ,C I o o ^ c m -w in E «#> »q a 55 cn vo o < E cm r-

Dt Η n O i Λ

•H

Æ I r- co

Λ G 0> CC

^ Ή

S

*-* OP

w J

m a

H 53 00 <<t CN

K < _ »-< CO O

X E CN {N

ft w m < E-I 5 ^ ,c I o^toi o cn in O oo o + C 01 N \c o OD Ifi C" Q -H .-t

OQ OP

ro r

H

53 co m N h o in o oco^h W o co σ. ro con rH cn .-h ? E <x> vo vo o rH n d io ro ft · ·· ·· · ·

O \0 Ή CM rH cn O CO

*“* O OOO O O O O O o

H OOO O C O O O

E O C CN O O CN O O

" · · · · m ψ

O O ru O CN CN CN

' O rH

rH

4J ·· ..

C ft ·· ft ® cn co ft σ> in }· -HU CO Ή u ·· l-ι Ή rH I u CN I Pu

2 CtiO I C Ih O CO

Åc*®3ft o -ojoau

β ® 21 |J i ft # tjl |j £ I

feiWHfi Ih w h 55 O

64 DK 174980 B1

Som angivet, i Tabel XXIII udviste 125l-hpG-CSF binding til WEHI-3B(d+) leukæmicellerne. Bindingen blev dosisafhængigt ihhiberet af umærket naturligt hpG-CSF eller rhpG-CSF, men ikke af GM-CSF. Derudover observe» 5 rede man binding af naturligt hpG-CSF til humane myelo-monocytiske leukæmiceller (ANLL, M4). Bindingen til disse celler har en parallel i væskeformige kulturers respons til naturlig hpG-CSF, idet de differentierer til fuldt udviklet macrophager, bedømt ud fra morphologien.

10 Den manglende binding af naturlig 125i-hpG-CSF til mono-cytiske leukæmiceller fra en anden patient (ANLL, M5B) kan skyldes, at visse leukæmiceller kan differentiere på en anden måde eller mangle receptorer for hpG-CSF. Evnen af rhpG-CSF til at konkurrere med naturlig hpG-CSF om 15 binding til naturlig 125i_apG_csF er et tegn på, at receptorerne genkender begge former i lige høj grad.

Disse forsøg, der demonstrerer bindingen af naturlig 125j—mærket hpG-CSF til leukæmiceller, har en parallel i evnen hos naturlig hpG-CSF til at inducere 20 granulocytisk og monocytisk differentiering af knoglemarvsceller med lav densitet, opnået fra en patient med akut promyelocytisk leukæmi (M3) og en anden patient med akut myeloblastisk leukæmi (M2). Celler fra de to patienter blev dyrket i fire dage enten i dyrkningsmedium 25 alene eller under tilstedeværelse af 1 x 10^ enheder rhpG-CSF. Celler fra M3 kontrolmediet inkuberet alene her var stadig af promyelocyt-type; hvorimod celler, dyrket under tilstedeværelse af rhpG-CSF udviste fuldt , udviklede celler af den myeloide type, deriblandt en 30 metamyelocyt, en kæmpe båndform og segmenteret meutro-philis og monocyt. For denne patient var opdelingen af 100 celler i kontrolgruppen 100% promyelocyter, og af rhpG-CSF behandlede celler 22% blastceller plus promyelocyter, 7% myelocyter, 35% metamyelocyt er, 20% bånd-35 former plus segmenterede neutrofile, 14% monocyter og 2% macrophager. En interessant kendsgerning er, at en af 65 DK 174980 B1 de polymorphonucleære granulocyter stadig indeholdt et dominerende auerlegeme, et tegn på, at i det mindste denne celle repræsenterede en differentieret celle, der hørte til leukæmikIonen. Celler fra den anden patient 5 med myeloblastisk leukæmi (M2) blev også dyrket fire dage under fravær eller tilstedeværelse af rhpG-CSF.

Ved gennemsyn af M2 celler, der var dyrket i mediet alene, kunne man iagttage store "blastagtige" celler, af hvilke nogle besad kerner, visse af M2 cellerne diffβίο rentierede, når de blev behandlet med rhpG-CSF, til fuldt udviklede segmenterede neutrophile med rest af au-erlegemer i centret af neutrophilen, et tegn på at der var foregået differentiering i en celle, der tilhørte leukæmiklonen. En opdeling af 100 celler, der var un-15 dersøgt morphologisk, viste, at cellerne fra kontrolgruppen bestod af 100% blastceller. De celler, der var behandlet med rhpG-CSF, bestod af 43% blastceller, 1% myelocyter, 15% raetarayelocyter, 28% båndformer plus segmenterede neutrophile, 2% promonocyter og 11% mono-20 cyter. Man undersøgte også leukæmicellerne med henblik på differentiering ved fire andre koncentrationer af rhpG-CSF (5 x 103, 1 x 104, 2,5 x 104 og 5 x 104 U/ml, data ikke vist). Selv ved de lavest afprøvede koncentrationer af rhpG-CSF (5 x 103 U/ml) var der tydelig 25 differentiering (cellerne differentierede længere end til myelocyter) af M3 (50%) og M2 (37%) leukæmicellerne .

6· Immunassay 30 Til fremstilling af polyklone antistoffer til brug i immunassay anvendte man som antigen pluripotent G-CSF, oprenset fra human blærecarcinom cellelinie 5637 (1A6), som fremstillet i Eksempel 1 (B). På basis af sølvnitratfarvning af polyacrylamidgeler vurderede man 35 materialet til at være 85% rent. Man immuniserede seks uger gamle Balb/C mus med mange subkutane injektioner af 66 DK 174980 B1 antigenet. Antigenet blev udsuspenderet i PBs og emulgeret med lige så store rumfang af Freund's Komplette adjuvans.

Dosis var 5-7 pg antigen pr· mus pr. injektion.

5 18 dage senere forstærkede man immuniseringen ved den eamme mængde antigen emulgeret med et lige så stort rumfang af Freund's ikke-komplette adjuvane. 4 dage senere udtog man museserum til afprøvning for indhold af det antistof, der var specifikt overfor human pluripotent G-10 CSF.

Man overtrak Dynatech immulon II Removawell strips i holdere (Dynateck Lab., Inc., Alexandria, Virginia) med hpG-CSF 5 pg/ml i 50 mM carbonat-bicarbonat-puffer, pH 9,2. Fordybninger i plader blev overtrukket 15 med 0,25 μς i et rumfang på 50 μΐ. Man inkuberede de antigendækkede plader to timer ved stuetemperatur natten over ved 4°C. Man fradekanterede opløsningen og inkuberede pladerne 30 minutter med PBS med indhold af 5% BSA for at blokere den reaktive overflade. Man fradekante-20 rede denne opløsning og tilsatte enten fortyndet pre-immunserum eller serum til afprøvning til fordybningerne og inkuberede to timer ved stuetemperatur. Sera blev fortyndet med PBS, pH 7,0, med indhold af 1% BSA. Man fradekanterede serumopløsningen og vaskede pladerne tre 25 gange med Wash Solution (KPL, Gaithersburg, Maryland). Tilsatte ca. 200.000 cpm ioderet kanin-antimus IgG (NEW, Boston, Massachusetts) i 50 μΐ PBS, pH 7,0, med indhold af 1% BSA til hver fordybning. Efter inkubering 1¾ , time ved stuetemperatur fradekanterede man denne opløs-30 ning og vaskede pladerne fem gange med Wash solution.

Man fjernede fordybningerne fra holderen og talte dem i en Beckman 5500 gamma tæller. Højaktiv museserum viste mere end 12 gange større reaktivitet end det tilsvarende præ-immune serum ved en fortynding på 1:100.

35 Man bestemte de immunologiske egenskaber af E.

coli-afledt hpG-CSF ved reaktivitet over for højaktiv 67 DK 174980 B1 museserum, der var specifikt overfor pattedyrscelle afledt hpG-CSF· Man overtrak Iramulon II Removawells med 0,25 μg 90% ren E. coli afledt protein i et rumfang på 50 μΐ og analyserede museserummet som beskrevet oven-5 for.

Højaktive musesera udviste en 24 gange højere reaktivitet overfor materiale fra E. coli end de tilsvarende præ-immune sera ved en fortynding på 1:100.

0 7. In vivo bioassay

Man forbandt Alzet osmotiske pumper (Alzet Corp.,

Palo Alto, CA· Model 2001) til permanente katetere i den højre halsåre og implanterede dem under huden på syv syriske guldhamstre. Fire af pumperne indeholdt en puffer [ 20 mM natriumacetat (pH 5,4) og 37 mM natriumchlorid] og 1,5 mg/ml E. coli-afledt hpG-CSFf hvorimod 3 kun indeholdt puffer. Pumpehastigheden var angivet til at være 1 μΐ/time i op til syv dage. Tre dage efter anbringelsen af pumperne var middelantallet af granulocy-ter hos de fire behandlede hamstere seks gange højere 20 end hos de tre kontrolhamstere (puffer), og samtidig med det forøgede antal af granulocyter var der en firedobling i antallet af totale lymfocyter. Antallet af erythrocyter blev ikke ændret ved behandlingen. Disse resultater er et tegn på, at det rekombinante materiale 25 producerer en specifik forstærkning af produktionen af og/eller frigivelse af granulocyter hos et pattedyr.

De i forbindelse med opfindelsen ovenfor omtalte DNA-sekvenser, som koder for hpG-CSF polypeptider, kan yderligere være nyttige i henseende til den information, 2Q de:, leverer om aminosyresekvensen fra pattedyr s pr ote i net, som tidligere har været utilgængeligt, trods analyseforsøg på isolater af naturlige forekommende produkter. DNA sekvenserne må også anses for at være værdi- 68 DK 174980 B1 fulde som produkter, der kan anvendes ved mikrobiel syn-tese i stor skala af hpG-CSF ved et antal rekombinante fremgangsmåder. Sagt på en anden måde er DNA sekvenser tilvejebragt ifølge opfindelsen, nyttige ved frembrin-^ gelse af hidtil ukendte og nyttige virale og ringsluttede plasmid DNA vektorer, hidtil ukendte og nyttige . transformerede og transficerede prokaryotiske og euka-ryotiske værts-mikrobeceller (inkluderende bakterieceller og gærceller og pattedyrsceller dyrket i medium), og 10 hidtil ukendte og nyttige fremgangsmåder til dyrkning af sådanne værtsmikrobeceller, der er i stand til at eks-primere hpG-CSF og dets beslægtede produkter. DNA sekvenser ifølge opfindelsen må også anses for at være egnet materiale til anvendelse som mærkede sonder ved iso- 15 lering af hpG-CSF og beslægtet protein, der kodes for af human genomisk DNA, såvel som cDNA og genomiske DNA sekvenser fra andre pattedyrsarter. DNA sekvenserne kan også være nyttige ved forskellige andre fremgangsmåder for proteinsyntese (f.eks. i insektceller) eller i genetisk terapi på mennesker og andre pattedyr. Man venter, 2 0 at DNA sekvenser ifølge opfindelsen er nyttige ved ud-vikling af transgene pattedyrs-specier, som kan tjene som eukaryotiske "værter" ved produktion af hpG-CSF og hpG-CSF produkter i store mængder. Se i denne forbindelse Palmiter, et al., Science, 222 (4625), 809-814 25 (1983).

Det kan være relevant at nævne rapporter om den immunologiske aktivitet af syntetiske peptider, som i det væsentlige duplikerer aminosyresekvenser, der findes i naturligt forekommende proteiner, glycoproteiner 30 og nucleoproteiner. Mere detailleret har man vist, at relativt lavmolekylære polypeptider indgår i immunreaktioner, som med henseende til varighed og udbredelse ligner iromunreaktionerne af fysiologisk signifikante prot- 69 DK 174980 B1 einer som virale antigener, polypeptidhormoner og lignende. Blandt iramunreaktionerne på sådanne polypeptider er inkluderet provokation af dannelse af specifikke antistoffer i immunologisk aktive dyr. Se f.eks. Lerner, 5 et al., Cell, 23, 309-310 (1981); Ross, et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter, et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA), 77, 5197-5200 (1980); Lerner, et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3403-3407 (1981); Walter, et al., proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 4882-4886 q (1981); Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 7412-7416 (1981); Green, et al., Cell, 28, 477-487 (1982); Nigg, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 5322-5326 (1982); Baron, et al.. Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman, et al., Nature, 295, 185-160 (1982); og Lerner, et al.. Scientific American, 248, nr. 2, 66-74 (1983). Se også Kaiser, et al.. Science, 223, 249-255 (1984) hvad angår biologiske og immunologiske aktiviteter af syntetiske peptider, som med tilnærmelse deler den sekundære struktur med peptidhormoner, men muligvis ikke har primær strukturel konformation tilfælles med dem.

Claims (28)

1. 70 DK 174980 B1
2. 1. Isoleret polypeptid, kendetegnet ved, at det består af blot en del af eller af hele aminosyresekvensen 1-174 angivet i Tabel VII, der: 5 a) besidder en eller flere af de biologiske egenskaber, der er typiske for naturligt forekommende human pluripotent granulocyt kolonistimulerende faktor (hpG-CSF) med sekvensen vist i Tabel VII; b) ikke er et naturligt forekommende polypeptid; 10 og c) er produktet af prokaryotisk eller eukaryo-tisk ekspression af en exogen DNA-sekvens.
3. 2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den exogene DNA-sekvens er en cDNA- 15 sekvens.
4. 3. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den exogene DNA-sekvens bæres af et autonomt replikerende DNA-plasmid eller en viral vektor.
5. 4. Polypeptid ifølge krav 1, der yderligere er 20kendet egnet ved at være kovalent associeret med en påviselig markørsubstans.
6. 5. Polypeptid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den påviselige markørsubstans er en radioaktiv markør.
7. 6. Polypeptid ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det har en foranstillet methioninrest.
8. 7. DNA-sekvens, der ved eksprimering i en prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle koder for et po-lypeptidprodukt ifølge krav 1, kendetegnet 3 0ved, at den er DNA-sekvensen vist i Tabel VII eller dens komplementære strenge. 71 DK 174980 B1
9. 8. DNA-sekvens ifølge krav 7, kendetegnet ved at være en cDNA-sekvens
10. 9. DNA-sekvens ifølge krav 7, kendetegnet ved at være en genomisk DNA-sekvens.
11. 10. DNA-sekvens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den inkluderer et eller flere til ekspression i E. coli foretrukne kodoner.
12. 11. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den koder for ekspression af hu- 10 man pluripotent granulocyt kolonistimulerende faktor.
13. 12. DNA-sekvens ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den inkluderer et eller flere til ekspression i gærceller egnede kodoner.
14. 13. DNA-sekvens ifølge krav 8 eller 9, k e n - 15 detegnet ved, at den koder for ekspression af human pluripotent granulocyt kolonistimulerende faktor.
15. 14. DNA-sekvens ifølge krav 7, kende tegnet ved, at den er kovalent associeret med 20 en påviselig markørsubstans .
16. 15. DNA-sekvens ifølge krav 14, kende - tegnet ved, at den påviselige markørsubstans er en radioaktiv markør.
17. 16. DNA-sekvens ifølge krav 7, kende- 25 tegnet ved at være en enkeltstrenget DNA- , sekvens.
18. 17. Biologisk funktionelt plasmid eller viral DNA-vektor, kendetegnet ved, at det inkluderer en DNA-sekvens ifølge krav 7.
19. 18. Prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle, kendetegnet ved, at den er stabilt transformeret eller transficeret med DNA-vektor ifølge krav 17. 72 DK 174980 B1
20. 19. Prokaryotisk eller eukaryotisk værtscelle, kendetegnet ved, at den er transformeret eller transficeret med en DNA-sekvens ifølge krav 7 på en sådan måde, at værtscellen kan eksprimere poly- 5 peptidproduktet.
21. 20. Værtscelle ifølge krav 19, kende tegnet ved, at værten er E. coli.
22. 21. Værtscelle ifølge krav 19, kende tegnet ved, at værten er en pattedyrscelle.
23. 22. Fremgangsmåde til fremstilling af et poly- peptid ifølge krav l, kendetegnet ved, at man under egnede næringsbetingelser dyrker prokaryo-tiske eller eukaryotiske værtsceller ifølge krav 19, og at man isolerer ønskede polypeptidprodukter fra 15 ekspressionen af DNA-sekvensen.
24. 23. Fremgangsmåde til fremstilling af et poly-peptid ifølge krav l, kendetegnet ved, at man under egnede næringsbetingelser dyrker prokaryo-tiske eller eukaryotiske værtsceller, der er trans- 20 formeret eller transficeret med en DNA-sekvens som angivet i Tabel VII på en sådan måde, at de kan eksprimere polypeptidet, og at man isolerer ønskede po-lypeptidprodukter fra ekspressionen af DNA-sekvensen.
25. 24. Farmaceutisk præparat, kendeteg- 25. e t ved, at det omfatter en effektiv mængde af et polypeptid ifølge krav 1 eller et polypeptid fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 22 eller 23, og et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, ad-juvans eller bærer.
26. 25. Farmaceutisk præparat ifølge krav 24, yderligere kendetegnet ved at være frit for association med noget som helst humant proetin. 73 DK 174980 B1
27. 26. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en effektiv mængde af et polypeptid ifølge krav 6 og et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel, adjuvans eller bærer. ' 5 27. Anvendelse af et polypeptid ifølge krav 1 til fremstilling af et lægemiddel til tilvejebringelse af hæmatopoietisk terapi på et pattedyr.
28. 28. Anvendelse af et polypeptid ifølge krav 1 til fremstilling af et lægemiddel til standsning af 10 proliferation af leukæmiske celler. 15 t