DK175545B1 - Regenerering af fertile gramine-planter af underfamilien Pooideae ud fra protoplaster - Google Patents

Description

DK 175545 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår græsser af underfamilien (Subfamilia) Pooideae, som regenereres af protoplaster, af protoplaster med regenererede cellevægge (planteceller) • 5 eller af kalli, som stammer fra protoplaster, samt generelt anvendelige fremgangsmåder til regenerering af disse planter. Opfindelsen angår tillige embryogene cellekulturer (suspensionskulturer eller kalluskulturer) samt kalli, der tjener som udgangsmateriale for proto-10 plaster, der igen kan regenereres til hele planter. Opfindelsen angår tillige fremgangsmåder til fremstilling af de ovenfor omtalte embryogene cellekulturer, kuldekonservering (kryopræservering) af de omtalte embryogene cellekulturer og de embryogene kalli samt transgene 15 planter af underfamilien Pooideae, som regenereres af genetisk modificerede protoplaster.

Størsteparten af de planter, som menneskers ernæring i første række er afhængig af, hører til en gruppe planter, som er kendt under fællesbetegnelsen gramine. Gramineae 20 (Poaceae) er set fra et kommercielt synspunkt den mest betydningsfulde familie inden for de monokotyle planters klasse. Til Gramineae hører eksempelvis følgende underfamilier og slægter:

Underfamilie_Slægt inden for underfamilien 25 Bambusoideae Bamboo

Andropogonoideae Saccharum (sukkerroe)

Sorghum Zea (majs)

Arundineae Phragmites 30 Oryzoideae Oryza (ris)

I DK 175545 B1 I

I 2.1

I Panicoideae Panicum (*) I

I Pennisetum (*) I

I Setaria (*) I

I 5 Pooideae (Festuciadeae) Poa (**) I

I Festuca (**) I

I Lolium (**) I

I ^ a I

I Bromus ( ) I

I Trisetum (**) I

I 10 Agrostis (**) I

I Phleum (**) I

I Dactylis (**) I

Alopecurus ( ) I

I Avena (havre ***) I

I 15 Triticum (hvede ***) I

I Secale (rug ***) I

I Hordeum (hyg ***) I

I * hirse I

I 20 ** græsser I

I *** småkornet kornart I

I Blandt underfamilierne hørende til gramine udgør Pooideae I

I en meget betydningsfuld plantegruppe set fra et økonomisk I

I synspunkt. Dertil hører f.eks. også de to nært beslægtede I

I 25 undergrupper græsserne og de småkornede kornarter. I

I Interessant nok er det netop planterne hørende til under- I

I familien Pooideae, som er vanskeligt at manipulere ved I

I hjælp af videnskabelige metoder. Følgelig har man hidtil I

I ikke kendt nogen generel fremgangsmåde til regenerering af I

I 30 planter, af fertile planter eller af transgene planter med I

I stabilt indbygget exogent DNA fra underfamilien Pooideae I

I ud fra protoplaster, omend en sådan regenerering fra I

I kultiverede protoplaster er en forudsætning for eksempel- I

3 DK 175545 B1 vis anvendelsen af den somatiske hybridisering og for fremstillingen af transgene planter ved hjælp af den direkte genoverførsel. Den kendte teknik på korntransfor-5 mationsområdet er for nyligt blevet beskrevet i en oversigtsartikel af Cocking og Davey, 1987.

En beskrivelse af udgangsmateriale for kornkulturer, af protoplaster samt af fremgangsmåder til isolering af kornprotoplaster og deres egenskaber findes eksempelvis i 10 følgende publikation "Cereal Tissue and Cell Culture", S.W.J. Bright og M.G.K. Jones, (eds) (1985) M. Nijhoff; W. Junk, Dordrecht.

En stabil transformation af gramine kan opnås ved en kemisk og elektrisk stimuleret optagelse af DNA i proto-15 plaster ("Direkter Gentransfer"; Potrykus et al, 1985;

Lfirz et al, 1985; Fromm et al, 1986), hvorimod en regenerering af hele planter ikke var mulig ud fra de · i disse undersøgelser anvendte cellelinier.

Hidtil har det kun været muligt med godt resultat at 20 regenerere planter af gramine-gruppen, som ikke hører til underfamilien Pooideae. Abdullah et al., (1986) beretter eksempelvis om en effektiv planteregenerering ved hjælp af somatisk embryogenese ud fra risprotoplaster (underfamilie Oryzoideae). Endvidere beskriver Yamada et al., (1986) 25 planteregenerering hos ris ud fra kalli afledt af proto-plaster. Rhodes et al., (1988) beskriver regenereringen af ikke-fertile majsplanter. Cocking og Davey, (1987) diskuterer den kendte teknik inden for genoverførsel i kornplanter. 1

Regenereringen af gramine-planter af underfamilien Pooideae ud fra vævskulturer er kendt. Hanning et al., (1982) beskriver embryo- og kimplanteudviklingen hos Dactylis glomerata L. ud fra kallusvæv udviklet af bladsegmenter.

I DK 175545 B1 I

I 4 I

I I det følgende anføres eksempler på andre planter af I

I underfamilien Pooideae, hvis regenerering ud fra I

I kultiverede celler er beskrevet i de følgende artikler: I

I 5 Lolium rigidum (Skene et al, 1983); Lolium perenne, Lolium I

I multiflorum (Ahloowalia, 1975); Lolium multiflorum, I

I Festuca arundinacea (Kasperbauer et al, 1979); Alopecurus I

I arundinaceus, Agropyron crystatum, Stipa viridula, Bromus I

I inermis, Agropyron smithii (Lo et al, 1980) og Agrostis I

I 10 palustris (Krans et al, 1982). I

I En yderligere oversigt over vævskulturer hos fodergræsser I

I er angivet af Ahloowalia, (1984). I

I I de ovenfor anførte tilfælde foretages regenereringen af I

I Pooideae dog ikke ud fra det samme udgangsmateriale, som I

I 15 det er tilfældet ved den foreliggende opfindelse, men ud I

I fra andre cellekulturtyper. I intet af de ovenfor anførte I

I eksempler har det kunnet eftervises, at regenereringen I

I forløber de-novo via en somatisk embryogenese. De ovenfor I

I anførte litteratursteder indeholder desuden ingen I

I 20 angivelser vedrørende isoleringen og dyrkningen af proto- I

I plaster eller angående regenereringen af planter ud fra I

I protoplaster. I

I På trods af den store interesse for en genetisk transfor- I

I mation og regenerering af gramine af underfamilien I

I 25 Pooideae eksisterer der således ingen in-vitro fremgangs- I

I måde, som muliggør en vellykket regenerering af planter I

I eller fertile planter ud fra protoplaster, som eventuelt I

I kan være transformerede (Cocking og Davey, 1987). I

I Hidtil har alle undersøgelser og bestræbelser i denne I

I 30 retning været uden resultat, dvs. at de enten kun har ført I

I til embryoner eller til ikke-levedygtige små planter, som I

I er døde allerede i en tidlig udviklingsfase og derfor ikke I

5 DK 175545 B1 med godt resultat har kunnet udsættes i jord (Ahloowalia, 1984).

• Der kendes således Ingen fremgangsmåde, som muliggør 5 fremstillingen af protoplaster af underfamilien Pooideae, som kan føre til en differentiering til hele planter og fortrinsvis til hele fertile planter, for slet ikke at tale om en fremgangsmåde til regenerering af planter af underfamilien Pooideae ud fra protoplaster eller fra kalli 10 stammende fra protoplaster.

Dette og andre formål kan opnås med den foreliggende opfindelse, som tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af protoplaster, som er i stand til at danne celle- og kalluskolonier. Protoplasterne kan om ønsket 15 transformeres, hvorved de dannede kalli er i stand til at regenerere til hele planter (Pooideae). Denne fremgangsmåde til fremstilling af protoplaster, som er i stand til at dele sig og til at udvikle kallus, der derefter kan regenereres til hele planter, kræver nye embryogene 20 cellekulturer (suspensions- eller kalluskulturer) eller embryoner som udgangsmateriale. Disse embryogene cellekulturer og embryoner samt fremgangsmåder til deres fremstilling og identificering tilvejebringes ved og er ligeledes omfattet af den foreliggende opfindelse.

25 Som udgangsmateriale for protoplaster kan desuden anvendes embryogent kallus, hvoraf suspensionerne afledes. Dette kallus samt suspensionerne, embryoner og fremgangsmåder til deres fremstilling og identificering tilvejebringes ved og er ligeledes omfattet af den foreliggende 30 opfindelse.

Disse embryogene kulturer danner kilden for protoplaster, som kan transformeres med exogent DNA, og som er i stand til at undergå celledeling og til at danne kallus. Dette

I DK 175545 B1 I

I 6 I

I kallus kan derpå regenereres til hele planter, herunder I

I hele fertile planter, som kan vokse i jorden. I

I På baggrund af den kendte teknik kunne man ikke udlede, at I

I 5 det er muligt at regenerere fertile gramine af I

I underfamilien Pooideae ud fra protoplaster eller fra I

I celler eller kalli, som stammer fra protoplaster. Langt I

I mindre kunne man forvente, at protoplaster fra planter af - I

I underfamilien Pooideae, som i genomet stabilt har inkorpo- I

I 10 reret exogent DNA, ligeledes kan regenereres til transgene I

I planter, og især til fertile transgene planter. I

I Opfindelsen angår derfor i første række embryogene celle- I

I kulturer (suspensions- eller kalluskulturer), som er I

I 15 afledt af gramine af underfamilien Pooideae, af hvilke der I

I kan isoleres protoplaster, som først kan regenerere celle- I

I vægge, derpå dele sig og danne en kallus, der kan I

I regenereres til hele planter, herunder hele fertile I

I planter. Disse cellekulturer kan fremstilles ved, at man I

I 20 I

I (a) isolerer væv fra egnede dele af planter af I

I underfamilien Pooideae, I

I (b) dyrker dette væv i et medium, som er i stand til at I

I inducere dannelsen af et embryogent kallus eller af I

I 25 embryoner, I

I (c) periodisk anlægger følge- eller rækkekulturer af det I

I embryogene kallus eller af embryonerne på friskt I

I medium, idet man overfører små celleklynger med I

I cytoplasmarige celler til frisk medium, som er i I

I 30 stand til at opretholde en kontinuerlig formering, I

I (d) efter 0 til 500 overføringer (transfers) isolerer I

I embryogene celleklumper med en størrelse på 150-2000 I

I pm. I

I 35 Desuden omfatter opfindelsen regenererede gramine-planter I

I af underfamilien Pooideae samt deres formeringsmateriale, I

I især sådanne, der er afledt af protoplaster eller plante- I

I celler, som indeholder exogent DNA indbygget i genomet, I

I men fortrinsvis exogent DNA, som kan udtrykkes i planter. I

7 DK 175545 B1

Ved formeringsmaterialet skal der i forbindelse med den foreliggende opfindelse forstås alt plantemateriale, som kan formeres seksuelt eller aseksuelt eller in vitro eller in vivo, idet der foretrækkes protoplaster, celler, kalli, 5 væv, organer, zygoter, embryoner, pollen eller frø, der kan fås fra transgene planter af underfamilien Pooideae. Desuden angår opfindelsen afkom af de pågældende planter af underfamilien Pooideae, samt mutanter og varianter deraf, herunder sådanne, der er afledt af planter, som er 10 dannet ved somatisk cellefusion, genetisk modifikation eller mutantselektion.

Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til fremstilling af protoplaster og planteceller af planter af under- 15 familien Pooideae, som kan regenereres til hele fertile planter, endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af kalli, som er afledt af de nævnte protoplaster eller planteceller, og som kan regenereres til hele planter, især hele fertile planter. Ydermere angår opfindelsen en 20 fremgangsmåde til regenerering af planter af underfamilien Pooideae ud fra de omtalte kalli. Disse fremgangsmåder beskrives detaljeret i det følgende.

Disse og andre aspekter af opfindelsen forklares mere 25 detaljeret i det følgende, herunder under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser kolonier af Dactylis glomerata L., som stammer fra protoplaster og vokser indesluttet i agarose, 30 som er suspenderet i et flydende medium, fig. 2 viser en ung plante, der er udviklet af protopiast-afledt Dactylis glomerata L. kallus, og som vokser på et SH-0 medium, 35

8 I

DK 175545 B1 I

fig. 3 viser en beholder med unge planter med rødder, som I

er udviklet af et på SH-0 medium voksende Dactyl is I

glomerata L. kallus afledt af protoplaster, I

5 fig. 4 viser en Dactylis glomerata L. plante, som er I

regenereret af protoplaster (til venstre) sammen med en I

vildtype Dactylis glomerata L. plante (til højre),

fig. 5 viser plasmidet pCIB709, som kan anvendes til I

transformationen af Dactylis glomerata I». protoplaster til I

10 tilvejebringelse af resistens mod hygromycin. (Plasmidet I

pCIB709 er i henhold til Budapest-traktatens bestemmelser

deponeret ved American Type Culture Collection, Rockville, I

Maryland, USA under deponeringsnummeret ATCC 40428 den I

12. februar 1988), I

15 Signaturforklaring: I

35S prom.: 35S-promotorområde I

Hygro-gen: Strukturgen for hygromycinphospho- I

transferase (APH type IV) I

35S term.: CaMV-område med 31-polyadenylerings- I

20 stedet for 35S-transskriptet af CaMV, I

Fig. 6 viser "Southern blot"-analyse af DNA fra forskel- I

lige Dactylis glomerata L. kalli, som er udvundet deraf I

efter transformation af protoplaster med plasmidet

pCIB709: Analysen er gennemført ved hjælp af Xbal-SstI- I

25 fragmentet, der tjener som molekylsonde. I

Række 1,2: 10 ng og 2 ng pCIB709 skåret med I

restriktionsendonucleasen BamHI. I

Række 4-8: BamHI-skåret DNA fra Dactylis I

glomerata kalluskulturer afledt af

30 protoplaster, som forinden er trans- I

formeret med pCIB709. I

9 DK 175545 B1 Række 9,17: BamHI-skåret DNA fra ikke-transfor- meret Dactylis glomerata L. kallus afledt af protoplaster.

5 Række 10-13: BamHI-skåret DNA fra Dactylis glomerata L. kalluskulturer afledt af protoplaster, som i forvejen er transformeret med pCIB709.

Række 14: BamHI-skåret DNA fra Dactylis 10 glomerata L. kalluskulturer afledt af protoplaster, som forinden er transformeret med pCIB709.

Række 15,16: BamHI-skåret DNA fra Dactylis glomerata L. kalluskulturer afledt 15 af protoplaster, som forinden er transformeret med pCIB709.

Række 4: er tom.

I rækkerne 6, 10, 12 og 15 viser sværtningen af filmen tilstedeværelse af fremmed-DNA, som er integreret i 20 Dactylis glomerata L. cellernes genom. 1063 Bp fragmentet, som kan forventes ved spaltning af det integrerede hygro-mycingen fra plasmid pCIB709 med BamHI (nucleotider 683-1646 af pCIB709), er markeret med en pil.

Definitioner 25 Med henblik på at sikre en klar og entydig forståelse af beskrivelsen og kravene samt de deri anvendte begreber, anføres følgende definitioner:

Plantecelle: Den strukturelle og fysiologiske enhed i en plante, der består af en protoplast og en cellevæg.

I DK 175545 B1 I

I 10 I

I Plantevæv: En gruppe af planteceller, som er organiseret i I

I form af en strukturel og funktionel enhed. I

I Planteorgan: Et afgrænset og synligt differentieret område I

I 5 af en plante, som f.eks. rod, stængel, blade, blomster- I

I knopper eller embryoner. Et planteorgan kan være opbygget I

I af forskellige celle- eller vævstyper. I

I Protoplast: Isoleret plantecelle uden cellevæg. I

I Cellekultur: Formerende cellemasse i en udifferentieret I

I 10 eller delvis differentieret tilstand. I

I Embryo: Et meget lille eller tidligt udviklingsstadium af I

I en plante, som udvikler sig enten af en zygote (seksuel I

I embryo) eller af en embryogen somatisk celle (somatisk I

I embryo) og allerede udviser stadier med erkendelig I

I 15 morphologi, struktur og cellulær organisation, som I

I omfatter cellulære, globulære samt kotyledonære stadier. I

I (Embryonaludviklingen hos majs er eksempelvis beskrevet af I

I Randolph, 1936, embryonaludviklingen af græs af Brown, I

I 1960). I

I 20 Celleklynge: En gruppe indbyrdes · forbundne celler, som I

I hefter til hinanden. Sædvanligvis dannes denne celleklynge I

I ud fra en eller få forgængerceller eller -protoplaster ved I

I celledeling. I

I Ung plante: En multicellulær struktur,· som består af et I

I 25 skud og en rod, og som udviser den ydre form af en lille I

I plante. I

I Dicamba: 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoesyre I

I MES: 2-[ N-morpholin ]ethansulfonsyre I

11 DK 175545 B1 2,4-D: 2,4-Dichlorphenoxyeddikesyre

Picloram: 4-Amino-3,6,6-trichlorpicolinsyre

Tris-HCl: or, a, a-Trls(hydroxymethyl )methylaminohydro-5 chlorid EDTA: l-Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',N'-tetraeddikesyre PEG: Polyethylenglycol

Agarose: Fremstilling og rensning af agarose er eksempelvis beskrevet af Guisely og Renn, (1975). Agarose er en 10 bestanddel af agar. Kommercielt tilgængeligt agar består normalt af en blanding af neutral agarose og ionisk agaropectin, som indeholder et stort antal sidegrupper. I handelen forekommende agarose udvindes sædvanligvis ved hjælp af kendte fremgangsmåder af agar. Herved bibeholdes 15 i reglen en række af sidekæderne, som derfor er bestemmende for agarosens fysisk-kemiske egenskaber, f.eks. gelerings- og smeltetemperatur. Agarose, som smelter ved lave temperaturer ("Low-melting Agarose"), især "Sea Plaque"® agarose, er særligt foretrukket som gelerings-20 middel ved den forliggende opfindelse.

SH-0 medium: Hormonfrit medium ifølge Schenk og Hilde- brandt, (1972). (SH-medium kan være flydende eller geleret med 0,8% (v/r) agar eller med 0,5% (v/r) "GelRite"®).

Mediet steriliseres sædvanligvis på kendt måde ved 25 opvarmning eller i autoklaver ved en temperatur på 12lec og et tryk på 1,2 kg/cm2 i fra Ca. 15 til ca. 20 minutter.

"GelRite”®: GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories Inc., Fiskersville, RI, # 02823.

___—

I DK 175545 B1 I

I 12 I

I SH-30 medium: SH-0 medium med 30 μΜ dicamba I

I SH-45 medium: SH-0 medium med 45 μΜ dicamba I

I 5 KM-8p medium: 8p medium ifølge Kao et al, (1975). Dette I

I medium kan være flydende eller størknet med agar, agarose I

I eller "GelRite"® og kan videre fremstilles og anvendes I

I uden ascorbinsyre, vitamin A og vitamin D. Mediets I

I bestanddele, bortset fra geleringsmidlet, steriliseres I

I 10 sædvanligvis ved en filtrering gennem et 0,2 μΐη filter. I

I RY-2 medium: Medium ifølge Yamada et al., (1986). I

I OMS medium: Medium ifølge Murashige og Skoog, (1962). I

I 15 Mediet kan størknes eksempelvis ved tilsætning af 0,8% I

I (v/r) agar eller agarose eller med 0,5% (v/r) "GelRite"®. I

I Til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfin- I

I delse kan dette medium også fremstilles på den måde, at I

I det har samme vitaminsammensætning som B5 mediet ifølge I

I 20 Gamborg et al., (1968). I

I Cellulase RS: Cellulase RS, Yakult Honsha Co., Ltd., I

I 1.1.19 Higashi-Shinbashi, Minato-ku, Tokyo 105, Japan. I

I 25 "Pectolyase Y-23"®: Seishin Pharmaceutical Co., Ltd., I

I 4-13 Koami-cho, Nihonbashi, Tokyo, Japan. I

I "Parafilm"®: "Parafilm"® laboratoriefilm - American Can I

I Co., Greenwich, CT 06830, USA. I

I 30 I

I "Nalgene"®-filter: Nalge Co., Division of Synbron Corp. I

I Rochester, New York, 14602, USA. I

I Bglll: Restriktionsenzym Bglll: New England Biolabs, I

I ^^32 Tozer Road, Beverly, MA 01915, USA eller en vilkårlig I

I anden producent. I

13 DK 175545 B1

BamHI: Restriktionsenzym BamHI: New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915, USA eller en vilkårlig anden producent.

5 Caseinhydrolysat: Caseinhydrolysat - enzymatisk hydrolysat fra komælk, type 1, Sigma Co., P.0. Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA.

Hygromycin B: Cytotoxin: Hygromycin B, renset, kat. nr.

10 400050 Calbiochem Behring Diagnostica, La Jolla, CA 92037, USA, Chargen Nr. 702296.

"GeneScreen Plus"®: Kat. nr. NEF 976, NEN Research

Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118, USA.

TBE puffer: Tris-boratpuffer - almindelig puffer til elektroforese, jf. Maniatis et al., (1982).

Spinsøjle: "Sephadex"® G25 færdigpaksøjle, kat. nr.

20 100402, Boehringer Mannheim Biochemicals, Piscataway, NJ, USA.

SDS: Natriumdodecylsulfat.

25 SSC: 1,54 mM NaCl, 0,154 mM natriumcitrat, jf. beskrivelsen af Maniatis et al., (1982).

CETAB: Hexadecyltrimethy1ammoniumbromid.

30 ibi Random Primer Kit: "Prime Time" Random Primer Kit,

International Biotechnologies Inc., P.O. Box 1565, New Haven, CT 07606, USA (kat. nr. 77800, Chargen nr. F630-01). 1

Det har overraskende vist sig, at fertile gramine-planter af underfamilien Pooideae kan regenereres ud fra en specifik type protoplaster samt fra celler og kalli, som er udviklet af disse protoplaster.

I DK 175545 B1 I

I 14 I

I Denne regenerering af fertile planter kan også I

I gennemføres, når protoplasterne indeholder exogent DNA. I I

I dette tilfælde er der fortrinsvis tale om stabilt i I

I protoplastgenomet indbygget DNA, som kan udtrykkes i I

I 5 planter. I

I Ved den foreliggende opfindelse kan anvendes alle I

I gramine-planter af underfamilien Pooideae. Der foretrækkes I

I imidlertid planter af underfamilien Pooideae, som hører I

I 10 til græsserne,, eksempelvis slægter valgt blandt gruppen I

I Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, I

I Alopecurus og Dactylis. Især foretrækkes Dactylis planter. I

I Ved den foreliggende opfindelse foretrækkes endvidere I

I 15 planter af underfamilien Pooideae, som hører til de I

I småkornede kornarter, f.eks. slægter valgt blandt gruppen I

I bestående af Avena (havre), Triticum (hvede), Secale (rug) I

I og Hordeum (byg). I

I 20 Den specifikke type Pooideae protoplaster, der deler sig I

I og danner cellekulturer, som kan regenerere til hele I

I planter, stammer fra cellekulturer, især fra embryogene I

I cellekulturer. De embryogene cellekulturer er fortrinsvis I

I embryogene suspensions- eller kalluskulturer. Celle- I

I 25 kulturerne kan fremstilles ud fra egnede dele af planter I

I af underfamilien Pooideae. Ved egnede plantedele skal der I

I i forbindelse med den foreliggende opfindelse eksempelvis I

I forstås de basale afsnit af yngre, indreliggende blade, I

I umodne seksuelle embryoner, umodne blomsterstande, modne I

I 30 frø eller kimplantevæv, som stammer fra planter af under- I

I familien Pooideae, men opfindelsen er dog ikke begrænset I

I hertil. I 1 15 DK 175545 B1

Fremqangsmådetrln A: Fremstilling af embryogene suspen·* sioner af plantevæv

Til fremstilling af et embryogent kallus går man ud fra et 5 egnet afsnit af en plante af underfamilien Pooideae, i reglen fra et basalt afsnit af et ungt blad. Især foretrækkes de yngre, indreliggende blade af underfamilien Pooideae. Dette fremgangsmådetrin kan gennemføres analogt med beskrivelsen af Hanning et al., (1982) for Dactylis 10 glomerata L.. Den der beskrevne fremgangsmåde er ikke begrænset til denne art, men kan også anvendes på alle øvrige planter af underfamilien Pooideae. Denne publikation skal som følge af henvisningen betragtes som en del af den foreliggende beskrivelse.

15 Bladene skæres i stykker, f.eks. i små afsnit eller segmenter med en længde eller diameter på 1-5 mm. Disse bladstykkers form og størrelse er ikke kritisk. Segmenterne udplades på et til kallusinduktionen og -opretholdelsen egnet medium og dyrkes der, indtil der er dannet 20 kallus og/eller embryogen struktur. Et til dette formål egnet medium er eksempelvis et SH-medium (Schenk og Hilde-brandt, 1972) med 30 μΜ dicamba og 0,8% (v/r) agar eller agarose som geleringsmiddel. Andre egnede medier er beskrevet af George et al., (1987). Kallus og/eller 25 embryogene strukturer fremkommer i reglen 2-5 uger efter udpladningen. Initieringen og bevarelsen af kallus kan gennemføres i lys men fortrinsvis i mørke ved en temperatur mellem 0 og 50eC, fortrinsvis dog ved en temperatur mellem 20 og 32°C, specielt fordelagtigt ved en temperatur 30 mellem 25 og 28eC. Embryogent kallus kan også fremstilles ved hjælp af andre kendte fremgangsmåder, der eksempelvis er beskrevet af Ldhrs og Lftrz, (1987) samt i de deri indeholdte henvisninger for byg. Disse fremgangsmåder kan også anvendes på andre Pooideae og skal ligeledes betrag-35 tes som en del af den foreliggende beskrivelse.

I DK 175545 B1 I

I 16 I

I Etableringen af embryogene suspensionskulturer begynder I

I med, at man sætter friske stykker af det embryogene kallus I

I til et egnet flydende medium, f.eks. 0,5 g kallus i 50 ml I

I 5 flydende medium ifølge Gray et al., (1985), som indeholder I

I 45 μΜ dicamba og 4 g/1 caseinhydrolysat. Andre egnede I

medier er eksempelvis beskrevet af George et al., (1987). I

I Suspensionskulturerne vokser ved en temperatur mellem 10 I

I og 40°C, fortrinsvis mellem 20 og 32°C, især fortrinsvis I

I 10 mellem 25 og 30°C. Det kan være fordelagtigt at skifte I

I mellem faser med lys og mørke under dyrkningsperioden. I

I Suspensionen dyrkes fortrinsvis med en lysperiode på I

I 5-20 timer, især 16 timer, efterfulgt af en periode med I

I mørke på 5-20 timer, fortrinsvis 8 timer. Lysintensiteten I

I 15 ligger typisk mellem 0,1 μΕ/πι23 og 100 μΕ/m^s (E = I

I Einstein, m = meter, s = sekund), fortrinsvis mellem I

I 30 μΕ/m^s og 80 μΕ/m^s. Det er ligeledes fordelagtigt at I

I bevæge suspensionen under dyrkningsfasen. Suspensionen kan I

I holdes i bevægelse f.eks. i Delong-flasker, som er tætnet I

I 20 med en for lys og gas gennemtrængelig plasticfilm eller en I

I vilkårlig anden egnet lukkeanordning, på en rundryste- I

I maskine med en omdrejningshastighed på 100-150 omdrejnin- I

I ger pr. minut. Efter ca. 3-5 ugers forløb lader man de I

I større cellesammenklumpninger bundfælde i løbet af 30 se- I

I 25 kunder, hvorpå man fjerner supernatanten, som kun inde- I

I holder små celleklynger, og overfører disse til initie- I

ring af nye kulturer i et frisk medium. I

I Dette fremgangsmådetrin kan gentages periodisk, fortrins- I

I vis hver 3.-4. uge, idet man kun anvender de mest lovende I

I 30 kulturer, udtrykt ved celleklumpernes lille størrelse samt I

I kvaliteten. Efter 4-20 overføringer, i reglen dog efter I

I 6-8 overføringer (transfers) er suspensionen i det I

I væsentlige fri for ikke-embryogene celler, og største- I

I parten af de embryogene celleklumper har typisk en I

I 35 størrelse på 150-2000 μπι. I

17 DK 175545 B1

Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse foretrækkes især en fremgangsmåde, som fører til fremstilling af embryogene suspensioner, der i første række indeholder 5 små præembryogene cellemasser. Andelen af de præembryogene cellemasser kan yderligere forøges på signifikant måde ved, at man først lader det større materiale aflejre sig og derefter på ny kultiverer kun den ovenstående del af suspensionen.

10 Opfindelsen angår således en embryogen cellekultur, suspensionskultur eller kalluskultur, som er afledt af gramine-planter af underfamilien Pooideae, og som isoleres fra protoplasterne, idet de pågældende protoplaster er i stand til at regenerere cellevægge, at dele sig og at 15 danne kallus. Dette kallus kan derefter regenereres til hele planter, men især til hele fertile planter.

Specielt foretrækkes inden for rammerne af den foreliggende opfindelse embryogene cellekulturer (suspensionskulturer og kalluskulturer) af græsser, især af græsser 20 valgt blandt slægterne Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus og Dactylis. Især foretrækkes embryogene cellekulturer af Dactylis glomerata L..

Opfindelsen angår tillige embryogene cellekulturer 25 (suspensions- og kalluskulturer) af småkornede kornarter, især af kornarter valgt blandt slægterne Avena, Triticum, Secale og Hordeum.

Desuden angår opfindelsen det embryogene kallus, som er afledt af gramine-planter af underfamilien Pooideae, og 30 hvorfra der kan isoleres protoplaster, som kan regenerere cellevægge, dele sig og danne kallus, som derpå atter kan regenereres til hele planter, især til hele fertile planter.

DK 175545 B1 I

18 I

Specielt foretrækkes inden for rammerne af den fore- I

liggende opfindelse et embryogent kallus af græsser, især I

af græsser valgt blandt slægterne Poa, Festuca, Lolium, I

Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus og I

5 Dactylis. Ganske specielt foretrækkes et embryogent kallus I

af Dactylis glomerata L.. I

Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse fore- I

trækkes endvidere et embryogent kallus, som er afledt af I

10 småkornet kom, især af korn udvalgt blandt slægterne I

Avena, Triticum, Secale og Hordeum. I

Endelig angår den foreliggende opfindelse gramine-planter, I

men især fertile gramine-planter af underfamilien Pooideae I

15 og deres formeringsmateriale, som er regenereret ud fra I

protoplaster eller planteceller, som stammer fra en I

embryogen cellekultur. I

Fremganqsmådetrin B: Isolering og rensning af proto- I

20 plaster, som kan regenereres til hele planter, inklusive I

hele fertile planter I

Ud fra de i fremgangsmådetrin A) fremstillede embryogene I

suspensionskulturer udvindes protoplaster. Isoleringen og I

25 rensningen af protoplasterne gennemføres på den måde, at I

man først isolerer embryogene celleklumper fra suspensi- I

onskulturmediet, f.eks. ved filtrering af en suspensions- I

kultur fra fremgangsmådetrin A) over en "Nalgene"® I

filterenhed (0,2 /im), og derpå inkuberer den dannede I

30 celleklynge med en egnet enzymopløsning, som kan fjerne I

cellevæggen uden at beskadige protoplasterne. Enzymerne I

anvendes i form af en sterilfiltreret opløsning. Alle I

manipulationer i forbindelse med celle- eller andre I

kulturer, gennemføres under sterile betingelser og under I

35 anvendelse af sterile materialer. En egnet enzymopløsning I

kan eksempelvis have følgende sammensætning: I

19 DK 175545 B1

Enzymopløsning:

CellUlase RS 2% (v/r)

CaCl2xH20 7 mM

5 NaH2P04xH20 0,7 mM

MES [pH 5-7] 3,0 mM

Glucose (slutkoncentration) 550 mOs/kg H2O

Sædvanligvis bevæges denne blanding forsigtigt på en 10 rystemaskine ved en omdrejningshastighed på ca. 50 omdrejninger pr. minut og svag belysning (ca. 5 pE/m2s), uden at dette er kritisk. Fordøjelsen fortsættes ved en temperatur mellem 0 og 50°C, fortrinsvis mellem 10 og 35®C, især mellem 26 og 32eC, indtil protoplast erne er 15 frigjort. Den til fordøjelsen nødvendige tid udgør typisk mellem nogle sekunder og 2 dage, fortrinsvis mellem 1 time og 1 dag, især mellem 3 og 5 timer.

De frigjorte protoplaster samles og renses ved hjælp af 20 standardfremgangsmåder, f.eks. filtrerinig, centrifugering og skylning.

På dette sted kan der indføjes et yderligere rensningstrin. X dette anbringes protoplasterne på overfladen af et 25 egnet medium, f.eks. et KM-8p kulturmedium, som er indstillet med saccharose på en osmotisk værdi på 700 mOs/kg H2O, eller andre egnede medier, f.eks. som beskrevet af George et al., (1987). 1 2 3 4 5 6

Efter centrifugering i 10 minutter ved ca. 60 g samles 2 protoplasterne, som befinder sig i grænsefladeområdet.

3

Derefter kan protoplasterne resuspenderes i det samme 4 kulturmedium og eksempelvis filtreres ved passage af en 5 stålsigte (maskevidde 20 μπι).

6

I DK 175545 B1 I

I 20 I

I Uden dette yderligere rensningstrin ligger kontamineringen I

I af protoplasttilberedningen med hele/ ufordøjede celler i I

I området fra ca. 0,001% til 0,01% af det totale antal I

I celler. Denne værdi kan reduceres ved hjælp af det ovenfor I

I 5 beskrevne rensningstrin. Det yderligere rensningstrin I

I medfører dog et signifikant tab af protoplaster, som I

I udviser et meget tæt cytoplasma. Dette bevirker, at I

I udpladningseffektiviteten kan formindskes med op til det I

I tidobbelte, når ovennævnte rensningstrin inkorporeres. I

I 10 Protoplasterne kan således også renses ved hjælp af andre I

I kendte fremgangsmåder, såsom f.eks. ved hjælp af den I

I ovenfor beskrevne flotation på en saccharoseopløsning I

I eller på andre egnede pufferopløsninger med høj vægtfylde, I

I f.eks. en "Percoll"-opløsning. I

I 15 I

I Protoplastudbyttet og den efterfølgende udpladnings- I

I effektivitet opnår optimale værdier, når der af suspen- I

I sionskulturerne, som anvendes til protoplastisoleringen, I

I anlægges følgekulturer 1-30 dage, fortrinsvis dog I

I 20 5-10 dage inden protoplastisoleringen. I

I Den ovenfor nærmere omtalte enzymopløsning er en modifika- I

I tion af den af Lu et al., (1981) beskrevne enzymblanding, I

I som er alle andre testede enzymopløsninger overlegen, og I

I 25 som giver et udbytte på 40 x 10^ til 70 x 10^ protoplaster I

I pr. gram friskvægt. Ved en alternativ fremgangsmåde kan I

I man dog også ved anvendelse af 2% (v/r) cel lul ase RS i I

I KM-8p medium eller i et vilkårligt andet medium, som I

I eksempelvis er beskrevet af George et al., (1987), opnå I

I 30 betragtelige protoplastudbytter. I denne forbindelse er I

I anvendelsen af glucose som osmotikum ved protoplast- I

I isoleringen klart bedre end saccharose og også i visse I

I tilfælde klart bedre end mannitol med hensyn til udbyttet I

I og effektiviteten af den efterfølgende udpladning. Andre I

I 35 kendte og egnede enzymblandinger kan ligeledes anvendes I

I ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. I

21 DK 175545 B1

De ved filtrering, dvs. f.eks. efter passage af en 20 μπι sigte med en gennemsnitlig maskevidde på 12-15 jtm i diameter, opnåede protoplaster udviser et optisk tæt cytoplasma.

5

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af protoplaster, som kan regenereres til hele planter, især til hele fertile planter, ud fra gramine-planter af underfamilien Pooideae. Denne frem-10 gangsmåde er karakteriseret ved følgende trin: (a) Isolering af væv fra egnede dele af gramine-planter af underfamilien Pooideae, fortrinsvis fra de basale afsnit af unge, indreliggende blade, fra umodne kønnede embryoer, 15 umodne blomsterstande, modne frø eller kimspirevæv, men især fortrinsvis fra de yngste og inderstliggende blade, (b) dyrkning af dette væv i et medium, som kan inducere dannelsen af embryogent kallus og af embryoner, 20 (cj periodisk anlæggelse af rækkekulturer af det embryogene kallus og af embryonerne på frisk medium, som sikrer en kontinuerlig formering, 25 (d) isolering af embryogene celleklumper efter 0-500, for trinsvis 0-100 og ganske specielt efter 3-50 overføringer (transfers), og (e) fjernelse af cellevæggene med egnede enzymblandinger 50 og isolering og rensning af .de dannede protoplaster.

Opfindelsen angår tillige protoplaster (inklusive de efter regenerering af cellevæggene dannede planteceller) af gramine-planter af underfamilien Pooideae, som kan 35 regenereres til hele planter og især til hele fertile planter. Der foretrækkes protoplaster eller celler, som er udvundet enten af cellekulturer eller af embryogene cellesuspensioner.

I DK 175545 B1 I

I 22 I

I Desuden omfatter opfindelsen gramine-planter, især dog I

I fertile gramine-planter, af underfamilien Pooideae og I

deres formeringsmateriale, som er regenereret ud fra de I

I omtalte protoplaster eller ud fra de omtalte planteceller. I

I 5 I

I Fremganqsmådetrln C: Oprettelse af protoplastkulturer og I

I dannelse af kallus, der kan regenereres til hele planter I

og til hele fertile planter I

10 De rensede protoplaster fra fremgangsmådetrin B) udpiades I

I i et egnet flydende medium eller på et egnet fast medium, I

I uafhængigt af om de pågældende protoplaster i forvejen er I

I blevet behandlet med exogent DNA eller ej. (Behandlingen I

I med exogent DNA beskrives detaljeret i et af de følgende I

I 15 afsnit.) Ved egnede medier skal der inden for rammerne af I

I den foreliggende opfindelse eksempelvis forstås sådanne I

I medier, der er baseret på et KM-8p-, et RY-2- (Potrykus et I

I al., 1979), et SH-30- eller et SH-45-medium, og som inde- I

I holder en egnet koncentration af sukker og plantevækst- I

I 20 regulatorer. De foretrukne medier er KM-8p- og SH-45- I

I mediet, som indeholder et passende størkningsmiddel. Det I

I foretrukne størkningsmiddel er agarose, især "SeaPlaque"® I

agarose (FMC Corp. Marine Colloids Division, P.O. Box, I

I Rockland, ME 04841, USA). Når der anvendes "SeaPlaque"® I

I 25 agarose kan koncentrationen deraf ligge mellem 0,1 og 2,5% I

I (v/r), fortrinsvis dog mellem 0,6 og 1,5% (v/r). I

I Udpladningen af protoplasterne på et agaroseholdigt medium I

I kan gennemføres analogt med den af Shillito et al., I

I 30 (1983), i beskrivelsen til europæisk patentansøgning I

I EP-0.129.688 (Shillito et al.) eller af Adams et al., I

I (1983) beskrevne fremgangsmåde. Disse publikationer skal I

I betragtes som en del af den foreliggende beskrivelse som I

I følge af disse henvisninger. I

I 35 I

23 DK 175545 B1

Mediet, hvori protoplasterne dyrkes, kan indeholde andre egnede bestanddele, som understøtter protoplasternes deling og kolonidannelse. Til disse stoffer hører eksempelvis 2,4-D, dicamba, picloram eller andre plantevækst-5 regulatorer. Egnede plantevækstregulatorer er velkendt for en fagmand. Koncentrationen af disse stoffer ligger sædvanligvis i et område fra 0,01 til 100 mg/1.

Salicylsyre og derivater deraf kan fremme celledelingen og 10 kolonidannelsen hos Pooideae protoplasterne. Til salicyl-syrederivaterne hører 0-acyl- og O-aryl-derivaterne, uden at disse dog er begrænset hertil. O-acyl-derivaterne omfatter eksempelvis lavacylgrupper med f.eks. 1-7, fortrinsvis 1-4, især 2-3 carbonatomer. Ved O-aryl-derivater skal der i forbindelse med den foreliggende opfindelse forstås 5- eller 6-leddede ringe, som eventuelt er indbyrdes fusionerede, uden at disse dog er begrænset hertil. Ringene kan være usubstituerede eller substituerede med en eller flere grupper, herunder alkyl med 1-5 20 carbonatomer, O-alkyl med 1-4 carbonatomer, halogen (især chlorid og bromid), nitro, amino og amino, som igen er substitueret med alkyl med 1-4 carbonatomer.

S al icyl syreder ivateme omfatter også carboxylatestrene.

25 Foretrukne carboxylatestere er aryl- og alkylestrene, hvori alkylgruppen indeholder 1-4 carbonatomer.

Derudover skal der ved salicylsyrederivater også forstås sådanne forbindelser, hvori salicylsyreringen er yder-30 ligere substitueret, eksempelvis med en eller flere grupper inklusive alkyl med 1-4 carbonatomer, O-alkyl med 1-4 carbonatomer, halogen (især chlorid og bromid), nitro, amino og amino, som igen er substitueret med alkyl med 1-4 carbonatomer.

35

Foretrukne forbindelser, som fremmer delingen og/eller kolonidannelsen hos Pooideae protoplaster og celler er:

I DK 175545 B1 I

I 24 I

I O-Acetoxybenzoesyre (aspirin, acetylsalicylsyre), I

I O-hydroxybenzoesyre (salicylsyre), I

I O-methoxybenzoesyre (raethylsalicylsyre), og I

I O-dimethylcarbamoylbenzoesyre [ O-(CO-dimethyl)-salicyl- I

I 5 syre ]. I

I Koncentrationen af salicylsyre eller dens derivater i I

I kulturmediet ligger fortrinsvis i et område fra 0,1 til I

I 3000 mg/1, især fra 10 til 300 mg/1 og specielt omkring I

I 10 ca. 100 mg/1. I

I Mediet, hvori protoplasterne dyrkes, kan desuden også I

I indeholde medium, som i forvejen er blevet konditioneret I

I ved vækst af egnede celler, der eksempelvis stammer fra I

I 15 2ea mays, Dactylis glomerata eller af andre graminer eller I

I også fra andre (dikotylidone) planter. Der foretrækkes et I

I medium, hvori der er dyrket en embryogen suspension af en I

I gramineart. Især foretrækkes et medium, hvori der er I

I dyrket en embryogen suspension af Dactylis glomerata. Det I

I 20 på (jen ovenfor beskrevne måde konditionerede medium kan I

I udgøre mellem 0 og 100% (r/r), fortrinsvis mellem 5 og 50% I

I (r/r), specielt mellem 30 og 40% (r/r) af det samlede I

I medium. I

I 35 Protopl asterne kan dyrkes i et fast eller i et flydende I

I medium over et tidsrum på op til 12 uger, fortrinsvis på I

I op til 6 uger, specielt i et tidsrum på 1-3 uger, uden at I

I der i mellemtiden anlægges følge- eller rækkekulturer. Ved I

I en særlig udførelsesform for opfindelsen kan et fast I

I 30 medium sættes til et flydende medium som beskrevet i I

I beskrivelsen til europæisk patentansøgning EP 0.129.688 I

I (Shillito et al.), eller det kan behandles på en vilkårlig I

I anden måde, der understøtter celledelingen og/eller proto- I

I plasternes kolonidannelse. I

I 35 I

25 DK 175545 B1

Protoplasterne dyrkes i lys eller fortrinsvis i mørke ved en temperatur mellem 0 og 50®C, fortrinsvis mellem 20 og 32°C, især fortrinsvis mellem 25 og 28DC. Lysintensiteten ligger typisk mellem 0,1 μΕ/rn^s og 200 /tE/m2s, fortrinsvis 5 dog mellem 30 og 90 μΕ/rn^s.

Udpladningseffektiviteten ved anvendelse af et KM-8p-medium svinger mellem 0,5 og 10% afhængigt af kvaliteten af protoplastpræparationen. Tilsætningen af 30-40% (r/r) 10 af et konditioneret suspensionskulturmedium (suspensions-kulturmedium konditioneret ved væksten af de deri forekommende celler og indstillet på en osmotisk værdi på 550 mOsm/kg H2O ved tilsætning af glucose) til protopl astkul turmediet fører ganske vist ikke til en signifi-15 kant forøgelse af udpladningseffektiviteten men fremmer dog delingsprocessen i de yngre kolonier afledt af protopl as terne.

Ved en foretrukket udførelsesform for den foreliggende 20 opfindelse udplades protoplasterne på et med agarose storknet medium. De første celledelinger kan da iagttages ca. 2 dage efter udpladningen af protoplasterne. Yderligere delinger sker hver 2.-3. dag. Denne delingsproces forløber ikke synkroniseret, hvilket fremgår af den 25 kendsgerning, at første celledelinger også kan optræde først efter 7 dage. 5-20 dage, fortrinsvis dog 10-14 dage efter udpladningen, udskæres det agarosestørknede medium, og segmenterne, som indeholder cellekolonierne overføres til et flydende næringsmedium. Denne fremgangsmåde er 20 alment kendt under betegnelsen "bead culture technique" og er fuldstændigt beskrevet af Shillito et al., (1983) samt i beskrivelsen til europæisk patentansøgning EP-0.129.688 (Shillito et al.). 1 I stedet for at udskære det med agarose størknede medium kan dette også bringes på flydende form og i denne flydende form overføres til det flydende næringsmedium.

I DK 175545 B1 I

I 26 I

I Denne modifikation er beskrevet af Adams et al., (1983) og I

I kan gennemføres på analog måde. I begge tilfælde I

I (udskæring eller, smeltning) kan der anvendes KM-8p-medium I

I med glucose og saccharose som flydende mediekomponenter, I

I 5 hvorved der iagttages en god kolonivækst. De optimale I

I flydende komponenter med hénblik på kolonivæksten består I

I dog af et SH-45-medium med 4 g/1 caseinhydrolysat. I løbet I

I af ca. 2-3 uger efter starten af "bead" kulturen kan der i I

I pladerne konstateres nye suspensionskulturer. Den mikro- I

I 10 skopiske undersøgelse af agaroseskiverne viser, at I

I sædvanligvis udvokser nogle af de tættest på overfladen I

I forekommende kolonier ind i det flydende medium og frigør I

I mindre cellemængder til mediet, medens resten af I

I kolonierne fortsat forbliver fastsiddende i agarosen. Den I

I 15 nye suspension formerer sig hurtigt, og efter 2 yderligere I

I uger overføres denne på samme måde som normale suspen- I

I sionskulturer eller udplades på SH-30 medier til udvik- I

I ling af kallus. Ved en alternativ udførelsesform kan I

I agarosen også fordeles på petriskåle, som indeholder et I

I 20 med agarose størknet SH-45 medium, og derefter dyrkes. I

I Den foreliggende opfindelse angår således også en frem- I

I gangsmåde til fremstilling af cellekulturer (suspensions- I

I og kalluskulturer) af protoplaster fra gramine-planter af I

I 25 underfamilien Pooideae, som kan regenereres til hele I

I planter, men især til hele fertile planter.. Denne frem- I

I gangsmåde er karakteriseret ved følgende fremgangsmåde- I

I trin: I

I 30 (a) Kultivering af protoplaster, som stammer fra gramine- I

I planter af underfamilien Pooideae, og som kan regenereres

I til hele planter, i et egnet dyrkningsmedium til dannelse I

I af cellekolonier,

I 35 (5) dyrkning af disse cellekolonier eller af dele deraf på I

I et egnet medium, som fremmer dannelsen af cellekulturer, I

I og I

27 DK 175545 B1 (c) isolering af de dannede cellekulturer.

Fremgangsmådetrin (b) er ikke ubetinget nødvendigt. Det er på samme måde muligt at lade protoplasterne blive i det i 5 fremgangsmådetrin (a) definerede medium, indtil der er dannet cellekulturer eller embryoner.

Opfindelsen omfatter ligeledes gramine-planter, men især fertile gramine-planter, af underfamilien Pooldeae og 10 deres formeringsmateriale, som er regenereret af ovennævnte cellekulturer.

Et foretrukket aspekt af den foreliggende opfindelse angår udpladningen af protoplaster på et med agarose størknet 15 medium, smeltning eller segmentering af det med agarose størknede medium, overføring af det flydende eller segmenterede medium til et flydende næringsmedium og dyrkning til dannelse af cellekolonier.

20 Der foretrækkes en fremgangsmåde, hvori de i fremgangs mådetrin (b) omtalte dele af cellekolonier stammer fra celler eller cellemasser, som er frigjort i det flydende kulturmedium.

25 De i dette og i andre fremgangsmådetrin fremstillede kallus- og suspensionskulturer kan analogt med beskrivelsen i fremgangsmådetrin A) konserveres i kulden.

Fremgangsmådetrin D: Regenerering af unge planter af 30 kallus

Af kallus, som er vundet af protoplaster (fremgangsmådetrin C), især når der er tale om krumagtigt, granulært kallus, anlægges en eller flere gange, fortrinsvis hver 35 anden uge, følge- eller rækkekulturer på et frisk egnet medium for på denne måde at inducere en embryodannelse. Et egnet inducerende medium er eksempelvis et SH-medium med passende koncentrationer af sukker og plantevækstregulatorer.

I DK 175545 B1 I

I 28 I

I Alle på denne måde dannede embryoner overføres derefter I

I til et medium, som har egnede forudsætninger for induk- I

I tionen af modningen og kimdannelsen. Egnede medier er I

I eksempelvis et SH-30 medium eller et OMS medium, som er I

I 5 modificeret på en sådan måde, at de har egnede koncen- I

I trationer af sukker og plantevækstregulatorer. Dyrkningen I

I af pladerne gennemføres i lys [10 ^E/m2s til 200 /iE/m2s, I

I koldt hvidlys fra fluorescerende lamper eller en blanding I

I af dagslys og lyset > fra en "Gro-Lux"® (Sylvania) I

I 10 fluorescenslampe. Der kan selvfølgelig også anvendes en I

I vilkårlig anden egnet fluorescenslampe. 2-5 uger efter I

I udpladningen kan de første embryoner iagttages. I mange I

I tilfælde kan en eller flere yderligere overføringer til I

I friskt medium være en fordel for udmodningen af embryoner- I

I 15 ne. Embryonerne videreudvikler sig og danner unge planter I

I efter en vis tid, typisk fra 1 uge til 6 måneder, især dog I

I efter 1-3 måneder. I

I Ved en alternativ udførelsesform anlægges følge- eller I

I 20 rækkekulturer af det fra protoplaster vundne kallus I

I (fremgangsmådetrin C), især når der er tale om krumagtigt, I

I granulært kallus, en eller flere gange, fortrinsvis hver I

I anden uge, på friskt egnet medium for på denne måde at I

I inducere dannelse og modning af embryoner. Et til dette I

I 25 formål egnet medium er eksempelvis et OMS medium, som har I

I en passende sukkerkoncentration, men som ikke indeholder I

I plantevækstregulatorer. Opfindelsen er imidlertid ikke I

I begrænset hertil. Dyrkningen af pladerne gennemføres i lys I

I [10 ^E/m2s til 200 /iE/m2s, koldt lys fra fluorescerende I

I 30 lamper eller en blanding af dagslys og lyset fra en I

I "Gro-Lux"® (Sylvania) fluorescenslampe eller en vilkårlig I

I anden egnet fluorescenslampe]. Embryonerne videreudvikler I

I sig og danner unge planter efter en vis tid, typisk efter I

I 1 uge til 6 måneder, men især efter 1-3 måneder. I

I 35 I

29 DK 175545 B1

Fremqangsmådetrin E: Dannelse af planter, fortrinsvis fertile planter ud fra unge planter

De ovenfor i fremgangsmådetrin D dannede unge planter 5 overføres til et egnet medium, fortrinsvis et SH-0 medium eller et OMS medium uden vækstregulatorer. Alternativt kan der eventuelt også tilsættes en vækstregulator, som stimulerer dannelsen af rødder eller skud. Egnede vækstregulatorer er velkendte for en fagmand på dette område.

10 De unge planter dyrkes på dette medium, indtil de har dannet rødder. Det er i denne forbindelse vigtigt, at man fjerner alt kallus fra de unge planter, da det har vist sig, at dette kallus påvirker plantevæksten i negativ retning. For at opnå dette kan man skylle planterne med 15 destilleret vand, f.eks. under overførselen. Kallus, som dannes på et senere tidspunkt, må fjernes med regelmæssige mellemrum, fortrinsvis hver 3. til 30. dag, og især hver 1-2 uger. Det tidsrum, som er nødvendigt for roddannelsen, udgør typisk 1-4 uger, især dog 2 uger. Små planter, som 2 0 har et godt udviklet rodsystem, kan derefter overføres til jord og udsættes i væksthus, hvor de udhærder lidt efter lidt. Som tilstrækkeligt skal i denne sammenhæng forstås en rodlængde i området fra 1 til 10 cm, især dog mellem 2 og 5 cm. Ved skud ligger det tilsvarende område ligeledes 25 mellem 1 og 10 cm, især mellem 2 og 5 cm. Eventuelt kan de små planter også videredyrkes in vitro ved anlægning af nye følge- eller rækkekulturer i et ubestemt tidsrum, idet man adskiller de små skudplanter fra hinanden og overfører til friskt medium, f.eks. SH-0 medium eller OMS medium.

30 I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til regenerering af hele fertile gramine-planter af underfamilien Pooideae, karakteriseret ved fremgangsmådetrinnene i krav 22.

35

Blomsterdannelsen kan enten induceres ved hjælp af den af Heide (1987) beskrevne fremgangsmåde, men også ved anvendelse af en vilkårlig anden fremgangsmåde, som opfylder de fordringer, der stilles af den pågældende art eller

I DK 175545 B1 I

I 30 I

I varietet. Fremgangsmåder til induktion af blomstring hos I

I Pooideae er kendt. I

I De af disse planter producerede frø kan ved en passende I

I 5 behandling bringes til at danne kim og enten udsås i I

I potter eller steriliseres og udplades på et Murashige og I

I Skoog medium, som ikke indeholder vækstregulatorer (OMS I

I medium), og som er størknet med 0,8% agar eller agarose I

I "GelRite"® eller et vilkårligt andet geleringsmiddel. I

I 10 Frøene kan også udsås på et medium, som indeholder mellem I

I 10 og 1000 /tg/ml Hygromycin B, hvorved der kan påvises I

I nedarvning af hygromycinresistens. I

I Fremgangsmåden til regenerering af fertile gramine-planter I

I 15 af underfamilien Pooideae fra kallus omfatter således I

I følgende trin: I

I (a) Dyrkning af kallus, som er afledt af planter af I

I underfamilien Pooideae, og som udvindes af protoplaster I

I 20 ifølge krav 6 og kan regenereres til hele planter, på et I

I medium, der kan inducere dannelse af embryoner, til dan- I

I nelse af embryoner. I

I (b) dyrkning af embryonerne på et medium, som er egnet til I

I 25 at inducere modningen og kimdannelsen hos embryonerne, I

I (c) dyrkning af de dannede småplanter til et stadium, på I

I hvilket de kan overføres til jord og udmodnes til hele I

I planter, og I

I 30 I

I (d) dannelse af frø som følge af en kontrolleret eller I

I åben bestøvning. I

I Opfindelsen angår desuden gramine-planter, men især I

I 35 fertile gramine-planter, af underfamilien Pooideae og I

I deres formeringsmateriale, som er regenereret af oven- I

I nævnte kallus. I

31 DK 175545 B1

Fremgangsmådetrin F: Behandling af protoplaster roed

exogent DNA

Pooideae protoplaster kan behandles med exogent DNA, 5 hvorved der dannes celler, som indeholder alt eller en del af det exogene DNA stabilt integreret i genomet. Ved exogent DNA skal der i forbindelse med den foreliggende opfindelse forstås alt DNA, der sættes til protoplasterne.

Det pågældende DNA kan enten være homologt eller også 10 heterologt med hensyn til den transformerede plante. Det exogene DNA kan indeholde en promotor, der er aktiv i planter af familien Gramineae, men især i planter af underfamilien Pooideae, eller man kan anvende en promotor, som allerede foreligger i plantegenomet. Det exogene DNA 15 kan desuden indeholde et eller flere gener, der ændrer genotypen, men især fænotypen, af den dannede celle eller den deraf regenererede plante. Det er dog ønskeligt, at gensekvensen, som koder for en eller flere ønskede proteinagtige produkter, udtrykkes, og at der produceres 20 et eller flere funktionelle enzymer eller polypeptider i den dannede celle eller plante. Det exogene DNA kan være et kimært gen eller en del deraf.

Ved exogent DNA skal der i forbindelse med den foreliggende opfindelse definitionsmæssigt også forstås 25 ikke-kodende DNA med regulatorisk funktion, som eksempelvis spiller en rolle ved reguleringen af transskriptionen.

Behandlingen af protoplasterne med exogent DNA kan gennemføres under anvendelse af en af de fremgangsmåder, som er 30 beskrevet i følgende publikationer: [Paszkowski et al., 1984, europæisk patentansøgning EP-0.164.575 (Paszkowski et al.), Shillito et al., 1985, Potrykus et al., 1985, Loerz et al., 1985, Fromm et al., I DK 175545 B1

I 32 I

I 1986, britisk patentansøgning GB-2.140.822 (Mettler) og I

I Negrutiu et al., 1987]. Disse publikationer er i form af I

en henvisning en del af den foreliggende opfindelse. I

I 5 Det exogene DNA kan . sættes til protopl as terne i en I

vilkårlig form, eksempelvis som nøgent, lineært eller I

I cirkulært DNA, indkapslet i liposomer, i sfæroplaster, som I

I bestanddel af andre protoplaster, komplekseret med salte, I

I osv. Optagelsen af fremmed-DNA’et kan stimuleres ved hjælp I

I 10 af en vilkårlig egnet og kendt fremgangsmåde, herunder I

I sådanne, som er anført i ovennævnte publikationer. I

I Ved den foreliggende opfindelse foretrækkes kimære gener, I

I som giver de transformerede protoplaster samt de deraf I

I udviklede væv og især planterne fordelagtige egenskaber, I

I 15 såsom f.eks. en forøget resistens mod patogener (eksempel- I

I vis mod fytopatogene svampe, bakterier, vira, osv.), I

I resistens mod kemikalier (eksempelvis mod herbicider, som I

I f.eks. triaziner, sulfonylurinstoffer, imidazolinoner, I

I triazolpyrimidiner, bialaphos, glyphosat, osv., insekti- I

I 20 cider og andre biocier), resistens mod uheldige (enda- I

I fiske eller atmosfæriske) påvirkninger fra omgivelserne I

I (f.eks. mod varme, kulde, vind, ugunstige jordforhold, I

I fugtighed, tørhed, osv.), eller som fører til en forøget I

I dannelse af reserve- eller forrådsstoffer i blade, frø, I

I 25 knolde, rødder, stængler osv. Til de ønskede stoffer, som I

I kan produceres af transgene planter, hører eksempelvis I

I proteiner, stivelsesarter, sukkerarter, aminosyrer, I

I alkaloider, duftstoffer, farvestoffer, fedtstoffer, osv. I

I Resistens mod cytotoksiner kan eksempelvis opnås ved

I 30 overføring af et gen, som ved ekspressionen i planteceller I

I kan tilvejebringe et enzym, som detoksificerer cyto- I

I toksinet, som f.eks. neomycinphosphotransferase type II I

I eller aminoglycosidphosphotransferase type IV, som I

I medvirker til en detoksifikation af kanamycin, hygromycin I

33 DK 175545 B1 og andre aminoglycosidantibiotika, eller en glutathion- S-transferase, cytochrom-P-450 eller andre katabolisk virksomme enzymer, om hvilke man ved, at de detoksificerer 5 triaziner, sulfonylurinstoffer eller andre herbicider.

Resistens mod cytotoksiner kan også formidles af et gen, som i en plante udtrykker en bestemt form af et "målenzym" I

(angrebspunkt for cytotoksinvirkningen), som er resistent I

mod cytotoksinets aktivitet, som f.eks. en variant af I

10 acetohydroxysyresyntase, som er ufølsom over for den I

inhibitoriske virkning af sulfonylurinstoffer, imidazol- I

inoner eller andre herbicider, som interreagerer med dette I

specifikke stofskiftetrin, eller en variant af EPSP I

syntese, som er insensitiv mod glyphosats hæmmende I

15 virkning. Det kan være fordelagtigt at eksprimere disse I

ændrede målenzymer i en form, som tillader deres transport I

i det korrekte cellulære kompartiment, som f.eks. i ovennævnte tilfælde i chloroplasterne. I

I I visse tilfælde kan det være fordelagtigt at dirigere I 20 genprodukterne til mitochondrierne, vakuolerne, det I endoplasmatiske retikulum eller til andre celleområder, I eventuelt endog til de intercellulære rum (apoplaster).

I En resistens mod bestemte svampeklasser kan eksempelvis I opnås ved indføring af et gen, som udtrykker chitinase i I 25 plantevævene. Talrige plantepatogene svampe indeholer I chitin som integral bestanddel af hyphe- og spore- I strukturerne, således eksempelvis basidiomyceterne (brand- I og rustsvampe), ascomyceter og Fungi imperfecti (herunder I Alternaria og Bipolaris, Exerophilum turcicum, I 30 Colletotricum, Gleocercospora og Cercospora). Chitinase er I i stand til at hæmme mycelvæksten in vitro hos visse patogener. Et planteblad eller en planterod, som udtrykker chitinase konstitutivt eller som svar på indtrængningen af et patogen, er beskyttet mod angreb af et stort antal 35 forskellige svampe. Afhængigt af situationen kan en kon-

I DK 175545 B1 I

I 34 I

I stltutiv ekspression være fordelagtig sammenlignet med en I

I inducerbar ekspression, der optræder hos talrige planter I

I som normal reaktion ved et patogenangreb, da chitinasen I

I 5 umiddelbart foreligger i høj koncentration, uden at man I

I først må afvente en lag-fase for nysyntesen. I

I En resistens over for insekter kan eksempelvis overføres I

I ved hjælp af et gen, som koder for et polypeptid, som er I

I toksisk for insekter og/eller deres larver, såsom det I

I 10 krystallinske protein fra Bacillus thuringiénsis (Barton I

I et al., 1987, Vaeck et al., 1987). En anden klasse I

I proteiner, som formidler en insektresistens, er protease- I

I inhibitorerne. Proteaseinhibitorer udgør en almindelig I

I bestanddel af planters forrådsstrukturer (Ryan, 1973). Det I

I 15 kan påvises, at en fra sojabønner isoleret og renset I

I Bowman-Birk proteaseinhibitor hæmmer tarmproteasen fra I

I Tenebrio-larver (Birk et al., 1963). Genet, som koder for I

I trypsininhibitoren fra koærter (Kuherbse), er beskrevet af I

I Hilderet al., (1987). I

I 20 Et gen, som koder for en proteaseinhibitor, kan indføres i I

I en egnet vektor under kontrol af en plantepromotor, især I

I en konstitutiv promotor, f.eks. CaMV 35S promotoren I

I [beskrevet af Odeli et al., (1985)]. Genet, f.eks. den I

I kodende sekvens af Bowman-Birk proteaseinhibitoren fra I

I 25 sojabønne, kan opnås ved hjælp af den af Hammond et al., I

I (1984) beskrevne cDNA kloningsmetode. En anden mulighed I

I til fremstilling af en proteaseinhibitor er syntetisk I

I fremstilling, såfremt proteaseinhibitoren indeholder I

I mindre end 100 aminosyrer, f.eks. trypsininhibitoren fra I

I 30 limabønne. Den kodende sekvens kan bestemmes ved tilbage- I

I oversættelse af aminosyresekvensen. Desuden inkorporeres I

I ved begge ender restriktionsskæringssteder, som er egnede I

I for den pågældende ønskede vektor. Det syntetiske gen I

I fremstilles ved syntese af overlappende oligonucleotid- I

I 35 fragmenter på 30 til 60 basepar, idet disse først under- I

35 DK 175545 B1 kastes en kinasereaktion, hvorpå de sammenknyttes indbyrdes (Maniatis et al., 1982) og til sidst klones i en passende vektor. Ved hjælp af DNA sekvensering kan man 5 derefter identificere en klon, som indeholder insertet i en korrekt orientering. Til indføring i protoplasterne anvendes isoleret plasmid-DNA (Abel et al., 1986).

Den foreliggende opfindelse omfatter ligeledes gener, som koder for farmaceutisk virksomme stoffer, f.eks.

10 alkaloider, steroider, hormoner og andre fysiologisk virksomme stoffer, samt flaviner, vitaminer og farvestoffer. Til de gener, som er omfattet af den foreliggende opfindelse, hører derfor plantespecifikke gener, som f.eks. zeingenet (Wienand et al., 1981), pattedyrs-15 specifikke gener, såsom insulingenet, somatostatingenet, interleucingenerne, t-PA genet (Pennica et al., 1983) osv. eller gener af mikrobiel oprindelse, såsom NPT II genet, samt syntetiske gener såsom insulingenet (Itakura et al., 1975), uden at de omhandlede gener dog er begrænset 20 hertil,

Til transformationen af protoplasterne kan der foruden kodende DNA selvfølgelig også anvendes ikke-kodende DNA, der i reglen har regulative funktioner, og som eksempelvis kan indgå i reguleringen af transskriptionsprocessen.

25 Der findes enkelte plantegener, hvorom man ved, at de induceres ved hjælp af forskellige interne og eksterne faktorer, såsom plantehormoner, varmechok, kemikalier, patogener, oxygenmangel og lys.

Som et eksempel på en genregulering ved hjælp af et 30 plantehormon kan nævnes abszissinsyre (ABS), der som . bekendt inducerer det under den sene embryonalfase optrædende overskud af mRNA i bomuld.

I DK 175545 B1 I

I 36 I

I Et andet eksempel er gibberellinsyre (GA3), der i I

I rizinusfrø inducerer malatsyntasetransskripter samt i I

I aleuronlagene i byg isoenzyroer af a-amylase. I

I 5 Reguleringen af varmechokfølsomme proteingener i sojabønne I

I er blevet indgående undersøgt. En flere timers behandling I

I af planterne ved en temperatur på 40°C resulterer i de I

I novo syntesen af såkaldte varmechokproteiner. Talrige af I

I disse gener er i mellemtiden blevet isoleret, og deres I

I 10 regulering er blevet analyseret i detaljer. Ekspressionen I

I af disse gener kontrolleres i første række på transskrip- I

I tionsplanet (Shoffl et al., citeret i Willmitzer, 1988). I

I Promotoren for hps70 genet blev fusioneret med neomycin- I

I phosphotransferase II (NPT II)-genet. Derved kunne det I

I 15 påvises, at det kimære gen kan induceres ved hjælp af et I

I varmechok (Spena et al., 1985). I

I En anden klasse af planteinducerbare gener omfatter de I

I lysregulerede gener, især det nucleært kodede gen for den I

I lille underenhed af ribulose-l,5-bisphosphatcarboxylase I

I 20 (RUBISCO). Morelli et al., (1985) og Herrera-Estrella et I

I al., (1984) har vist, at 5'-flankeringssekvensen i et I

I RUBISCO-gen fra ærter er i stand til at overføre lys- I

I inducerbarheden til et reportergen, såfremt dette i kimær I

I form er bundet til denne sekvens. Denne iagttagelse kunne I

I 25 også udvides til andre lysinducerede gener, såsom I

I chlorophyll a/b-bindingsproteinet. I

I Alkoholdehydrogenase-generne (adh-gener) i majs har været I

I genstand for intensive undersøgelser. adhl-s-Genet fra I

I majs blev isoleret, og det blev påvist, at en del af det I

I 30 5'-flankerende DNA er i stand til at inducere ekspres- I

I sionen af et kimært reportergen (f.eks. chloramphenicol- I

I acetyltransferase, CAT), når det midlertidigt transfor- I

I merede væv udsættes for anaerobe betingelser (Howard et I

I al., 1987). I

37 DK 175545 B1

Ved en foretrukket udførelsesform for opfindelsen transformeres protoplaster, som er udvundet af planter fra underfamilien Pooideae, ved hjælp af en kombination af 5 elektroporation og polyethylenglycolbehandling. Umiddelbart efter rensningen af de i fremgangsmådetrin B) opnåede protoplaster underkastes disse en elektroporation, jf. Shillito et al., (1985) samt EP-0.164.575 (Paszkowski et al.). Protoplasterne resuspenderes efter den sidste 10 skylleproces i en elektroporationspuffer. Til dette formål kan der ved den foreliggende opfindelse eksempelvis anvendes en mannitolopløsning med en passende MgCl2~ koncentration. Til protoplastsuspensionen sættes derefter en vandig DNA opløsning. Ved en specifik udførelsesform 15 ifølge opfindelsen er der tale om plasmidet pCIB709, som i forvejen er blevet lineariseret ved behandling med en egnet restriktionsendonuclease. Den fremkomne blanding omrøres forsigtigt. Ved en specifik udførelsesform for opfindelsen tilsættes et halvt rumfang 24%'s (v/r) 20 PEG-opløsning i 0,5 M mannitol og 30 mM MgCl2· Efter grundig gennemblånding overføres protoplasterne til kammeret i en "Dialog"® elektroporator (DIA-LOG G.m.b.H., Haffstrasse 34, D-4000 Dilsseldorf 13, DE), og der pålægges 1-10 impulser, fortrinsvis dog 3 impulser på ca. 2000 V/cm 25 til 5000 V/cm udgangsspænding og en eksponentiel henfaldskonstant på 10 psec i intervaller på 30 sekunder. Prøven overføres derefter til en petriskål, idet der tilsættes 1-25% (v/r) agarose som størkningsmiddel eller geleringsmiddel. Protoplasterne fordeles ensartet over mediet 30 inden udhærdningen af agarosen. Fra denne kultur af transformerede protoplaster regenereres transgene planter, herunder fertile transgene planter af underfamilien Pooideae ifølge beskrivelsen i afsnittene C) til F).

Ved en anden foretrukket udførelsesform for opfindelsen 35 transformeres Pooideae protoplasterne ifølge den af Negrutiu et al., (1987) beskrevne fremgangsmåde. I dette

I DK 175545 B1 I

I 38 I

I . tilfælde suspenderes de rensede protoplaster efter den I

I sidste skylleproces i en 0,5 M mannitolopløsning, som I

I indeholder mellem 15 og 45 mM MgCl2· DNA'et tilsættes i I

I 5 form af en vandig opløsning efterfulgt af et lige så stort I

I rumfang 36%’s (v/r) PEG-opløsning (Negrutiu et al., 1987). I

I Den dannede opløsning blandes omhyggeligt og inkuberes i I

I et tidsrum på fra 5 til 60 minutter, fortrinsvis på ca. I

I 30 minutter, ved en temperatur mellem 10 og 32eC, I

I 10 fortrinsvis ved stuetemperatur (25eC). Under inkubations- I

fasen bevæges opløsningen lejlighedsvis. Efter endt I

I inkubation vaskes protopiasterne og udplades på et egnet I

I dyrkningsmedium. Til de egnede dyrkningsmedier hører I

I eksempelvis et KM-8p medium, uden opfindelsen er begrænset I

I 15 hertil, med 0,3-2,5% (v/r), fortrinsvis dog med 0,6-2% I

I (v/r) agarose som størkningsmiddel. Protoplasteme I

I fordeles ensartet over mediet, inden agarosen udhærder. I

I Af denne kultur af transformerede protoplaster regenereres I

I transgene planter, herunder fertile transgene planter af I

I 20 underfamilien Pooideae ifølge beskrivelsen i afsnittene C) I

I til F). I

I Et ifølge opfindelsen foretrukket exogent DNA er det i I

I fig. 7 viste plasmid pCIB709 i lineariseret form. I

I Fremgangsmådetrin G: Selektering af transformerede I

I 25 kolonier I

I Det med agarose størknede medium fra fremgangsmådetrin F), I

I som indeholder de transformerede protoplaster, inkuberes i I

I lys eller fortrinsvis i mørke i et tidsrum på fra 5 til I

I 30 dage, fortrinsvis 8 til 15 dage, især fortrinsvis i I

I 30 10 dage, ved en temperatur mellem 0 og 50°C, fortrinsvis I

I mellem 20 og 32eC, især fortrinsvis mellem 25 og 28°C. Det I

I faste medium udskæres derefter i f.eks. 5 stykker og I

I selekteres i et såkaldt "bead type culture system" som I

I beskrevet af Shiilito et al., (1983), i europæisk patent- I

39 DK 175545 B1 ansøgning EP-0.129.688 (Shillito et al.)/ Shillito et al., (1985) eller i europæisk patentansøgning EP-0.164.575 (Paszkowski et al.). Antal og størrelse af mediestykkerne 5 er ikke kritisk. Ved en specifik udførelsesform for opfindelsen overføres 4 af disse segmenter eller stykker enkeltvis til et egnet medium, som f.eks. et SH-45 kulturmedium med 4 g/l caseinhydrolysat og 20-100 ^g/ml hygromycin B. Det 5. segment anbringes i det samme medium 10 dog uden indhold af hygromycin (kontrol).

Efter ca. 4-5 uger udskæres de formodentligt transformerede cellekolonier af agarosen og dyrkes i et egnet kulturmedium, f.eks. et SH-45 medium, med 20-100 /ig/ml hygromycin B på en roterende rystemaskine med en omdrej-15 ningshastighed på 50-80 omdrejninger pr. minut. Efter yderligere 4-5 uger overføres samtlige kolonier, der giver en ny suspensionskultur, til friskt medium med 20 /tg/ml hygromycin B. Ud fra den nye suspension anlægges mindst 2 yderligere følge- eller rækkekulturer i nærværelse af 20 20 Mg/ml hygromycin B. Disse dyrkes under samme betingel ser som anført ovenfor, indtil kallusdannelsen begynder.

Kallus, suspensionskulturer samt de kulturer, som kan vindes ud fra de i dette fremgangsmådetrin fremstillede materialer, kan konserveres i kulden under anvendelse af·* 25 den i freragangsmådetrin A) beskrevne metode.

Fremgangsmådetrin H: Regenerering af transformerede planter af underfamilien Pooideae fra kallus

Ud fra transformeret kallus [fremgangsmådetrin G)] kan der regenereres transformerede planter af underfamilien 30 Pooideae ved hjælp af den i afsnit D) til E) beskrevne fremgangsmåde.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør således en re-

I DK 175545 B1 I

I 40 I

I generering af protoplaster, der stammer fra gramine- I

planter af underfamilien Pooideae, til hele planter, især I

I til hele fertile planter. Derved er det for første gang I

I 5 muligt at inkorporere exogent DNA stabilt i disse planters I

I genom og derved ændre deres geno- eller fænotyper. Desuden I

I kan protoplasterne fusioneres intra- eller interspecifikt I

I med andre protoplaster, hvorved der kan produceres nye I

I kombinationer af nucleært DNA eller nye kombinationer af I

I 10 nucleært og ekstranucleært DNA. Endvidere kan disse I

I protoplaster anvendes som kloningsdygtigt materiale, med I

I hvilke der kan gennemføres mutations- og selektionstrin I

I til fremstilling af en ønsket fænotype. I

I Som eksempler på ønskede fænotyper kan nævnes resistenser I

I 15 mod toksiske koncentrationer af naturlige eller syntetiske I

kemikalier, herunder insekticider, herbicider, fungicider, I

I baktericider, tungmetaller, salte, pathotoksiner, stof- I

I skifteinhibitorer samt strukturelt eller funktionelt I

analoge forbindelser til cellulære roetaboliter, uden at I

I 20 opfindelsen dog er begrænset hertil. Andre eksempler på I

ønskelige fænotyper, som der kan selekteres for, omfatter I

I resistenser mod kraftige miljøpåvirkninger, såsom lave I

I eller høje temperaturer eller biologiske stoffer, såsom I

I pathogener. I

25 Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende I

I eksempler. I

Eksempel 1 I

Fremstilling af embryogene suspensionskulturer ud fra væv I

I af Dactylis qlomerata L. (hundegræs) I

I 30 Som udgangsmateriale for det embryogene kallus tjener de I

I basale afsnit af de yngste blade af hundegræsplanter I

I (Dactylis glomerate L.) dyrket i væksthus, som beskrevet I

41 DK 175545 B1 af Hanning et al., (1982). Bladene overfladesteriliseres ved neddypning i 10 minutter i en fortyndet (1:10) cloroxopløsning [en opløsning af 5,25% (v/r) natrium- 5 hypochlorit, The Clorox Company, Oakland, CA 94623, USA], hvorefter de under sterile betingelser udskæres i små stykker på 1-5 mm's længde eller diameter. Disse stykker udplades på et sterilt SH-30 medium, der som størkningsmiddel indeholder 0,8% (v/r) agarose. Ved en dyrknings-10 temperatur på ca. 25eC fremkommer der kallus og/eller embryogene strukturer i løbet af 2-6 uger efter udplad-ningen.

Som udgangsmateriale til fremstillingen af embryogene suspensionskulturer anvendes embryogent kallus, som i en 15 mængde på 0,5 g (friskvægt) sættes til 50 ml af et af Gray et al., (1985) beskrevet flydende medium, som indeholder 45 μΜ dicamba og 4 g/1 caseinhydrolysat. Suspensionskulturerne inkuberes i 125 ml Delong-flasker, som er lukket med metalkapper og "Parafilm"®, ved en temperatur 20 på 27°C og en lys-/mørkerytme på 16 timers lys (40 μΕ/m^s) og 8 timers mørke på en rundrystemaskine ved ca. 130 omdrejninger pr. minut. Efter ca. 4 uger henstår flaskerne i ca. 30 minutter til aflejring af de store cellesammenklumpninger, og der udtages derefter 10 ml alikvoter af 25 supernatanten, som ikke indeholder celleklumper, og disse alikvoter overføres til 50 ml friskt medium. Dette gentages hver 3.-4. uge, idet man hver gang anvender de mest lovende celleklumper, bestemt ved celleklumpernes lille størrelse og bedre kvalitet som følge af tilstede-30 værelsen af små, cytoplasmarige celler. Efter 5-8 overføringer er suspensionerne i det væsentlige fri for ikke-embryogene celler, og størsteparten af de embryogene celleklumper er relativt små (150-2000 μπ>).

I DK 175545 B1 I

I 42 I

I Eksempel 2 I

I Isolering og rensning af Pactylis glomerata L.-proto- I

I plaster I

I 5 Protoplaster udvindes fra den embryogene suspensionskultur I

I (eksempel 1), idet cellerne først isoleres ved en steril- I

I filtrering over en "Nalgene"® 0,2 μπι filterenhed og I

I derefter i en mængde på 0,5 g (friskvægt) sættes til I

I 12,5 ml protoplast-enzymblanding, som befinder sig i en I

I 10 petriskål. Enzymblandingen, som består af I

I Cellulase RS 2% (v/r) I

I CaCl2xH20 7 mM I

I NaH2P04xH20 0,7 mM I

I MES [pH 5,6] . 3,0 mM I

I 15 Glucose (slutkoncentration) 550 m0s/kg H20 (pH 5,6), I

I underkastes derpå sterilfiltrering. Blandingen bevæges på I

I en rystemaskine ved en hastighed på ca. 50 omdrejninger I

pr. minut i svagt lys (<5 μΕ/ta^s) i 4-5 timer. Det I

I fordøjede materiale filtreres derpå gennem en rustfri I

20 stålsigte (maskevidde 100 /tm) og fordeles på 12 ml I

I centrifugerør, som centrifugeres i 5 minutter ved ca. I

60-100 G. Det protoplastholdige sediment vaskes derpå tre I

I gange med protoplastkulturmediet KM-8p, som ved hjælp af I

I glucose er indstillet på en osmotisk værdi på 550 mOs/kg I

I 25 H20. På dette sted kan der indkobles et flotationstrin til I

I yderligere rensning af protoplasteme. I dette tilfælde I

anbringes de vaskede protoplaster på overfladen af et med I

saccharose på en osmotisk værdi på 700 mOs/kg H20 indstil- I

let KM-8p medium (10 ml). Efter centrifugering i 10 minut- I

30 ter ved 60-100 G samles de ved grænsefladen koncentrerede I

protoplaster ved hjælp af en fin pipette. Derefter I

resuspenderes protoplasteme i 1-2 ml KM-8 p kulturmedium I

og filtreres gennem en rustfri sigte (20 pm). De frigjorte I

43 DK 175545 B1 protoplaster samles, vaskes og resuspenderes til dyrkningen i KM-8p medium eller i et osmotisk indstillet medium, som er egnet til en transformation ifølge eksempel 6.

5 Eksempel 3

Protoplastkultur af Dactylis glomerata L. og kallusvækst (a) De rensede protoplaster udplades i en tæthed på ca.

5 x 105 protoplast/ml på KM-8p kulturmedium, som indeholder 1,3% (v/r) "SeaPlaque"® agarose (FMC Corp., 10 Marine Colloids Division, Rockland, Maine, USA) og 30-40% (r/r) af et konditioneret medium. Det konditionerede medium udvindes af 3-4 uger gamle embryogene suspensionskulturer af Dactylis glomerata L·., idet disse filtreres over et sterilt "Nalgene"® filter (0,2 pm), mediet ind-15 stilles ved tilsætning af glucose på en osmotisk værdi på 550 m0sm/kg H2O, hvorpå det på ny. sterilfiltreres. Pladerne inkuberes derefter i mørke ved en konstant temperatur på 28eC. Efter 10-14 dage udskæres agarosen i kileformede stykker, som anbringes i et såkaldt "bead 20 culture system" (Shillito et al., 1983), under anvendelse af 20 ml SH-45 suspensionskulturmedium med 3% (v/r) saccharose pr. 3 ml af den oprindelige kultur størknet med agarose. Pladerne anbringes på en rystemaskine og bevæges ved ca. 50 omdrejninger pr. minut og en belysnings-25 intensitet på 8 μΕ/m^s. Ved frigørelsen af celler fra agarosen til det omgivende flydende medium dannes der nye suspensionskulturer. De dannede, i suspension dyrkede celler udplades på SH-30 medium størknet med agar, og dyrkningen gennemføres i mørke ved 25*C til dannelsen af 30 kallus.

(b) Protoplasterne dyrkes som beskrevet ovenfor i eksempel 3(a), idet dog dyrkningsmediet er tilsat 100 mg/1 0-acetylsalicylsyre.

I DK 175545 B1 I

I 44 I

I (c) Protoplasterne dyrkes som beskrevet ovenfor i eksempel I

I 3(a), idet dog dyrkningsmediet er tilsat 30 mg/1 O-acetyl- I

I salicylsyre. I

5 (d) Protoplasterne dyrkes på samme måde som beskrevet I

I ovenfor i eksemplerne 3(a) til 3(c), idet dog dyrknings- I

I mediet ikke indeholder noget konditioneret medium. I

Eksempel 4 * I

I Regenerering af Dactylis glomerate L.-planter ud fra I

I 10 kallus, der er afledt af protoplaster I

I (a) Dactylis glomerate L. kallus (fremstillet ifølge I

eksempel 3), der er udvundet af protoplaster, dyrkes på et I

I størknet SH-30 medium. Hver anden uge anlægges følge-’ I

eller rækkekulturer. Alle embryoner, der udvikler sig i I

I 15 dette tidsrum, udtages, udplades på et spiringsmedium I

I (SH-O) og inkuberes i lys (45 /xE/m2s til 55 /xE/m2s). Disse I

I embryoner spirer efter 1-4 uger. De dannede ungplanter I

overføres til SH-0 medium til dannelse af et rodsystem og I

I inkuberes i lys. Når planterne har nået 6- til 12-blad- I

I 20 stadiet anbringes de i et væksthus, hvor de udhærdes lidt I

I efter lidt. I

I (b) Kallus (fremstillet ifølge eksempel 3), der er I

I udvundet af protoplaster, dyrkes i SH-0 medium størknet I

I med 0,24% (v/r) "GelRite"® i lys (45 μΕ/πέε til 55 μΕ/ I

I 25 m2s). Hver anden uge anlægges følgekulturer. De dannede I

I unge planter anbringes med henblik på roddannelse på en I

I 1:1 blanding af SH-0 og OMS medium, som er størknet med en I

I kombination af 0,12% (v/r) "GelRite"® og 0,4% (v/r) agar, I

I og dyrkningen gennemføres i lys. Efter opnåelse af 6- til I

I 30 12-bladstadiet anbringes planterne i væksthus, hvor de I

I lidt efter lidt udhærdes. I

45 DK 175545 B1 (c) Små ungplanter udvikles som beskrevet ovenfor i eksempel 4 (a) og 4 (b), overføres til et OMS medium med 0,8% (v/r) agar og dyrkes i lys til dannelse af et 5 rodsystem. Efter opnåelse af 6- til 12-bladstadiet anbringes planterne i et væksthus, hvor de udhærder lidt efter lidt.

(d) Små ungplanter udvikles som beskrevet ovenfor i eksempel 4 (a), og de anbringes på en 1:1 blanding a£ SH-0 10 og OMS medium, som er størknet med en kombination af 0,12% (v/r) "GelRite"® og 0,4% (v/r) agar, til dannelse af rødder og dyrkes i lys. Efter opnåelse af 6- til 12-bladstadiet anbringes planterne i et væksthus, hvor de udhærdes lidt efter lidt.

15 Eksempel 5

Konstruktionen af plasmid pCIB709, et E. coli replikon med et i planter eksprimerbart hygromycinresistensqen Γ 35S/Hygr Ί

Den kodende sekvens af strukturgenet for hygromycin-20 resistens isoleres fra plasmidet pLG90 (Gritz og Davies, 1983) i form af et BamHI-fragment omfattende ca. 1150 baser. Plasmidet pLG90 kan fås fra Linda Gritz [Applied Biotechnology, 80 Rogers St., Cambridge, Mass. 02141]. Til konstruktion af plasmid pCIB709 indsplejses det isolerede 25 BamHI-fragment i BamHI-skæringsstedet i pCIB710 (Rothstein et al., 1987). Plasmidet pCIB710 indeholder den regula-toriske region af CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) 35S transskriptet, idet promotor- og terminatorområdet er adskilt af et singulært BamHI-snitsted.

30 Det dannede plasmid pCIB709 er deponeret ved "American

Type Culture Collection", Rockville, Maryland, USA, under deponeringsnummeret ATCC 40428.

I DK 175545 B1 I

I 46 I

I Inden anvendelsen til en transformation kan plasmldet I

I pCIB709 lineariseres ved behandling med restriktions- I

I enzymet PvuII. Dette konstruktion indeholder da et I

I 5 hygromycinresistensgen (aminoglycosidphosphotransferase I

I type IV) sammen med 5’- og 3'-ekspressionssignalerne i I

I CaMV 35S transskriptet fra blomkålsmosaikvirus (CaMV) i et I

I pCU plasmid. Sekvensen for pCIB709 er vist i fig. 7. I

I Eksempel 6 I

I 1Q Transformation af Pactylis glomerata L.-protoplaster ved I

I hjælp af elektroporation I

I (a) I umiddelbar tilslutning til rensningen af proto- I

I plasterne gennemføres en elektroporation som beskrevet af I

I Shillito et al., (1985) under anvendelse af det i fig. 7 I

I 15 viste plasmid pCIB709 i lineariseret form. Protopiasterne I

I resuspenderes efter den sidste skylleproces i en tæthed på I

I 7x 10^ protoplast/ml i en elektroporationspuffer (0,4 Μ I

I mannitol, 6 mM MgCl2). Protoplasterne overføres derefter i I

I alikvoter på 0,7 ml til plastcentrifugerør (10 ml). I

I 20 Derefter sættes plasmid-DNA [62 μΐ vand med PvuII fordøjet I

I plasmid pCIB709 og ultralydsbehandlet kalvethymus-DNA I

I (Sigma) i slutkoncentration på 10 μg/ml (pCIB709) eller I

I 50 ftg/ml (kalvethymus-DNA) ] til rørene. Desuden tilsættes I

I 0,38 ml polyethylenglycolopløsning (PEG-opløsning) [24% I

I 25 (v/r) PEG 6000 i 0,4 M mannitol, 30 mM MgCl2, 0,1% (v/r) . I

I MES (pH 5,6)], og opløsningen blandes omhyggeligt. Proto- I

I plastsuspensionen oæverføres derefter til kammeret i en I

I "Dialog"® elektroporator og behandles med 10 impulser, som I

I har en udgangsspænding på 3250 V/cm og en eksponentiel I

I 30 henfaldskonstant på 10 psec i intervaller på 30 sekunder. I

I Derefter udtages prøven fra kammeret, hvorpå den anbringes I

I i en petriskål med en diameter på 10 cm. Efter tilsætning I

I af 10 ml KM-8p medium med 1,2% "SeaPlaque"® agarose I

I fordeles protoplasterne ensartet over hele mediet inden I

I 35 udhærdningen af agarosen. I

47 DK 175545 B1 (b) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a), idet dog udgangsspændingen i dette tilfælde udgør 3500 V/cm.

5 (c) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a), idet dog udgangsspændingen i dette tilfælde udgør 4000 V/cm.

(d) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a), idet dog udgangsspændingen i dette tilfælde udgør 10 5000 V/cm.

(e) Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a), idet dog udgangsspændingen i dette tilfælde udgør 3000 V/cm.

(f) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a), 15 idet dog udgangsspændingen i dette tilfælde udgør 2500 V/cm.

(g) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a) til 6 (f), idet dog der anvendes PEG med en molekylvægt på 4000.

20 (h) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a) til 6 (f), idet dog der anvendes PEG med en molekylvægt på 8000.

(i) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 6 (a) til 6 (h), idet dog slutkoncentrationen af PEG ligger i et 25 område mellem 10 og 30% (v/r).

(j) Der gås frem som beskrevet ovenfor i eksempel 5 (a) til 6 (i), idet dog der yderligere gennemføres en varme-chokbehandling som beskrevet af Shiilito et al., (1985) og Potrykus et al., (1985).

I DK 175545 B1 I

I 48 I

I Eksempel 7 I

I Transformation af Dactylls glomerata L.-protoplaster ved I

I hjælp af en polyethylenqlycolbehandling I

I 5 (a) Direkte gentransfer ved hjælp af PEG gennemføres som I

I beskrevet af Negrutiu et al., (1987). Det anvendte DNA er I

I det lineariserede plasmid pCIB709. I

I I tilknytning til det sidste skylletrin suspenderes proto- I

I piasterne i en 0,5 M mannitolopløsning, som indeholder I

I 10 15 mM MgCl2, i en koncentration på 2 x 10^ pr. ml. Proto- I

I plastsuspensionen fordeles i form af 1 ml alikvoter i I

I piastcentrifugerør (10 ml). Inden tilsætningen af PEG- I

I opløsningen [40% (v/r)J tilsættes DNA'et som beskrevet I

I ovenfor i detaljer i eksempel 6. Opløsningerne blandes I

I 15 omhyggeligt og inkuberes i et tidsrum på 30 minutter ved I

I stuetemperatur under lejlighedsvis omrystning. Derefter I

I tilsættes 1,4 ml af vaskeopløsningen, og de enkelte I

I bestanddele i rørene blandes omhyggeligt. Vaskeopløsningen I

I består af 87 mM mannitol, 115 mM CaCl2, 27 mM MgCl2, 39 mM I

I 20 KOI, 7 mM Tris/HCl og 1,7 g/1 m-inositol, (pH 9,0). Med I

I 4 minutters intervaller tilsættes 4 yderligere 1,4 ml I

I alikvoter af vaskeopløsningen, og hver gang foretages I

I grundig blanding af hele blandingen. Rørene centrifugeres I

I derpå i 10 minutter ved 60 G, og supematanteme hældes

I 25 bort. De sedimenterede protoplaster optages i 1 ml KM-8p I

I medium og overføres til 10 cm petriskåle. Efter tilsætning I

I af 10 ml KM-8p medium med 1,2% (v/r) "SeaPlaque"® agarose I

I fordeles protoplasterne ensartet over hele mediet inden I

I udhærdningen af agarosen.

I 30 (b) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i m

I eksempel 7 (a), idet dog vaskeopløsningen indstilles på en I

I pH-værdi på 5,6. I

49 DK 175545 B1 (c) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i eksempel 7 (a), idet dog vaskeopløsningen indstilles på en pH-værdi på 7,0.

5 (d) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i eksempel 7 (a) til 7 (c), idet dog der anvendes PEG med en molekylvægt på 6000.

(e) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i eksempel 7 (a) til 7 (c), idet dog der anvendes PEG med en 10 molekylvægt på 2000.

(f) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I eksempel 7 (a) til 7 (c), idet dog der anvendes PEG med en I molekylvægt på 8000.

I (g) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I 15 eksempel 7 (a) til 7 (f), idet dog der yderligere fore- I tages en varmechokbehandling som beskrevet af Shillito et I al., (1985) og Potrykus et al., (1985).

I (h) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I eksempel 7 (a) til 7 (g), idet dog der anvendes en vaske-

I 20 opløsning indeholdende 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 og 5 mM

I glucose, og som er indstillet på en pH-værdi på 6,0 med I KOH.

I (i) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I eksempel 7 (a) til 7 (g), idet dog der anvendes en vaske- I 25 opløsning indeholdende 0,2 M CaCl2 og 0,1% (v/r) MES, I indstillet på en pH-værdi på 6,0 med KOH.

I (j) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I eksempel 7 (a) til 7 (g), idet dog der anvendes en vaske- I opløsning indeholdende 0,2 M CaCl2 og 7 mM Tris/HCl, I 30 indstillet på pH-værdien 9,0 med KOH.

I DK 175545 B1 I

I 50 I

I Eksempel 8 I

I Transformation af Dactylls glomerate L.-protoplaster ved I

I hjælp af elektroporatlon eller en polyethylenqlycol- I

I 5 behandling I

I (a) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I

I eksemplerne 6 og 7, idet dog plasmidet pCIB709 skæres med I

I restriktionsenzymet Bgll inden anvendelsen til transfor- I

I mationen. I

I 10 (b) Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I

I eksemplerne 6 og 7, idet dog plasmidet pCIB709 skæres med I

I restriktionsenzymet Hindlll inden anvendelsen til I

I transformationen. I

I Eksempel 9 I

I 15 Transformation af Dactylls qlomerata L-protoplaster ved I

I „ hjælp af elektroporatlon eller en polyethylenglycol- I

I behandling I

I Transformationen gennemføres som beskrevet ovenfor i I

I eksemplerne 6, 7 eller 8, idet dog protoplasterne I

I 20 behandles i 5 minutter ved en temperatur på 45°C inden I

I fordelingen af alikvoterne i de enkelte centrifugerør for I

I den efterfølgende transformation eller efterfordelingen af I

I alikvoterne og inden tilsætningen af PEG. I

I Eksempel 10

I 25 Selektering af de transformerede kolonier I

I (a) Kulturpladerne (petriskåle) med protoplasterne

I inkuberes i et tidsrum på 10 dage ved en temperatur på ca. I

25“C i mørke, hvorpå de skæres i 5 lige store stykker med I

51 DK 175545 B1 henblik på den efterfølgende dyrkning ("bead culture", Shillito et al., 1983). 4 af disse stykker anbringes hver for sig i 20 ml SH-45 kulturmedium med 4 g/1 casein-5 hydrolysat og 20 /ig/ml hygromycin B. Det 5. stykke anbringes ligeledes i 20 ml af det samme medium, der dog ikke indeholder hygromycin B, og således tjener som ikke-selektiv kontrol. Efter 4-5 uger udskæres de af protoplaster vundne, formodentligt transformerede celle-10 kolonier, som vokser i nærværelse af hygromycin B, fra agarosen og overføres til en petriskål med en diameter på 19 mm, som indeholder 2 ml flydende SH-45 medium med 20 ftg/ml hygromycin B. Petriskålene bevæges på en rystemaskine med en omdrejningshastighed på ca. 50 omdrej- 15 ninger pr. minut. Efter yderligere 4-5 uger overføres alle I de kolonier, som udviser vækst og fører til nye I suspensioner, til 125 ml Erlenmeyer-kolber, og kulturerne I dyrkes på samme måde som starterkulturen, bortset fra I hygromycintilsætningen (20 μς/ml).

I 20 Ud fra de nye suspensioner anlægges hver 1. til 3. uge I følge- eller rækkekulturer under anvendelse af SH-45 I medium med 4 g/1 caseinhydrolysat og 20 /ig/ml hygromycin I B. Desuden udplades celler fra disse suspensioner på SH-30 I fast medium med 20 /*g/ml hygromycin B, og der inkuberes I 25 ved 25°C i mørke. Af de kalli, der udvikler sig af disse I udpladede celler, anlægges hver 2. til 3. uge følge- I kulturer på friskt medium. Der gås ud fra, at de celler, I som vokser i nærværelse af hygromycin B, er transforman- I ter.

I 30 (b) Selekteringen gennemføres som beskrevet i eksempel 10 I (a), idet dog de af protoplaster vundne cellekolonier, som I vokser i et hygromycinholdigt medium, i dette tilfælde I overføres til agarplader med SH-30 medium, som indeholder I 20 μg/ml hygromycin B, og der inkuberes ved en temperatur I 35 på 25"C i mørke.

I DK 175545 B1 I

I 52 I

I Eksempel 11 I

I Regenerering af transformerede Dactylis glomerata I

I L.-planter I

I 5 Planterne regenereres på samme måde som beskrevet ovenfor I

I i eksempel 4 for det utransformerede materiale. I

I Eksempel 12 I

I Ekstraktion af DNA fra kallus og bladvæv I

I DNA ekstraheres fra planter regenereret ud fra kallus og I

I 10 blade under anvendelse af en modificeret CETAB-metode I

I (Roger og Bendich, 1985). Denne fremgangsmåde er her I

I beskrevet med Dactylis glomerata L.-planter som eksempel, I

I men fremgangsmåden kan med samme effektivitet også I

I anvendes på væv fra vilkårligt andre planter af under- I

I 15 familien Pooideae. Til udvinding DNA fra det ovenfor I

I beskrevne materiale kan man imidlertid også anvende en I

I anden af de sædvanligvis anvendte DNA ekstraktions- I

I fremgangsmåder. I

I Kallus dyrket på SH-0 medium og SH-30 medium dybfryses i I

I 20 fast carbondioxid, hvorpå det udrives til et fint pulver I

I ved flydende nitrogens temperatur. Det således dannede I

I pulver overføres til centrifugerør (5 ml) af polypropylen, I

I som er forkølet til flydende nitrogens temperatur. Det er I

I vigtigt, at pulveret ikke optør på noget tidspunkt under I

I 25 gennemførelsen af dette fremgangsmådetrin. Pulveret fryse- I

I tørres natten over, hvorpå det fordeles i 2,2 ml I

I Eppendorfrør, idet der til hvert rør sættes <0,5 ml

I pulver. Til hvert rør sættes 1 ml CETAB-ekstraktions- I

I puffer, hvorefter rørene inkuberes ved en temperatur på I

I 30 60eC i ca. 30-45 minutter. Efter afkøling til stuetempera- I

I tur tilsættes 1 ml 24:1 blanding af chloroform og isoamyl- I

DK 175545 B1 53 alkohol, og det hele blandes grundigt. Derpå foretages

centrifugering i 30 sekunder ved 3000 omdrejninger pr. I

minut i en Eppendorf-centrifuge. Derefter overføres den I

5 vandige fase til et friskt rør, der tilsættes 1/10 rumfang I

10%'s (v/r) CETAB-opløsning, og chloroformekstraktionen I

gentages. Den vandige fase sættes på ny til et friskt rør, I

og der tilsættes samme rumfang fældningspuffer. Ved 1

stuetemperatur sker der nu en udfældning af DNA og RNA. I

10 Udfældningen forløber over et tidsrum på fra 30 minutter I

til 1 time, hvorefter rørene på ny centrifugeres. Super- I

natanten hældes bort, og bundfaldet resuspenderes i en I

TE-puffer (se nedenfor), der har en høj saltkoncentration, I

ved en temperatur på 65®C i 30 minutter. I

15 Anvendte puffere og opløsninger

I CETAB-ekstraktionspuffer 1% (v/r) CETAB

I Tris pH 8,0 (50 mM) I EDTA (10 mM) I NaCl (0,7 M) I 20 0,5% (v/r) PVP MG 360.000 I [PVP: Polyvinylpyrrolidin ]

I 10% CETAB 10% (v/r) CETAB

I NaCl (0,7 M)

I Fældningspuffer 1% (v/r) CETAB

I 25 Tris pH 8,0 (50 mM) I EDTA (10 mM) I TE-opløsning Tris pH 8,0 (10 mM) I (høj saltkoncentration) EDTA (1 mM) I NaCl (1 M) I 30 TE-puffer Tris pH 8,0 (10 mM) I EDTA (1 mM)

I DK 175545 B1 I

I 54 I

I 1/10 TE Tris pH 8,0 (1 mM) I

I EDTA (0,1 mM) I

I Eksempel 13 I

I ^ Rensning af DNA I

I Det ved hjælp af den ovenfor i eksempel 12 beskrevne I

I fremgangsmåde eller en vilkårlig anden egnet fremgangsmåde I

I fremstillet DNA kan renses under anvendelse af en hvilken I

I som helst kendt fremgangsmåde. Som eksempler på egnede I

I 10 fremgangsmåder kan uden nogen former for begrænsning I

I nævnes ethidiumbromid-CsCl-gradientcentrifugering, behand- I

I ling med phenol/chloroform samt en rensning over en trin- I

I gradient uden ethidiumbromid. Disse fremgangsmåder er I

I beskrevet af Maniatis et al., (1982). I

I 15 (a) Rensning ved hjælp af phenol/chloroform-behandling I

I Nucleinsyrerne fra eksempel 12 udfældes med 2 rumfangsdele I

I koldt ethanol (-20°C), og rørene centrifugeres i 2-3 mi- I

I nutter ved 5000 G. Supernatanten fjernes, og bundfaldet I

I vaskes med 70%'s og 100%'s ethanol. Derefter tørres I

I 20 nucleinsyrerne delvis i en steril luftstrøm. DNA'et I

I opløses natten over i 200 μΐ 1/10 TE-puffer. DNA-opløs- I

I ningen overføres til Eppendorf-centrifugerør, og der

I tilsættes 10 μΐ af en RNAse-opløsning (2 mg/ml), som I

I forinden er opvarmet for at deaktivere eventuelt I

I 25 tilstedeværende DNAse, inden rørene inkuberes ved 37°C i I

I ca. 1 time. Derefter tilsættes 0,25 rumfangsdele 5 M NaCl, I

I og DNA'et udfældes ved tilsætning af 0,4 rumfangsdele I

I 30%'s PEG-opløsning (molekylvægt 6000-8000), som inde- I

I holder 1,5 M NaCl, samt ved inkubation i 1 time ved -20°C. I

I 30 Rørene centrifugeres derpå i 5 minutter, super- natanterne I

I hældes bort, og bundfaldene vaskes med koldt absolut I

I ethanol. Efter kort tids tørring i en steril luft- I

55 DK 175545 B1 strøm resuspenderes pellets i 0,3 ml TE-puffer. Denne opløsning ekstraheres med en phenol/chloroform/isoamyl-alkohol (25:24:l)-blanding, som er ækvilibreret med 5 TE-puffer, og der centrifugeres i 30 sekunder i en Eppendorf-centrifuge. Den vandige opløsning overføres derefter til friske rør. Opløsningen ekstraheres med chloroform/isoamylalkohol (24:1), og der centrifugeres i 30 sekunder, hvorpå den vandige fase overføres til friske 10 rør. Chloroform-ekstraktionen gentages. Til udfældning af DNA'et tilsættes derpå 1/10 rumfang 3 M natriumacetat efterfulgt af 2 rumfang isafkølet ethanol. Bundfaldet samles ved centrifugering, vaskes med 70%'s og 100%'s ethanol, tørres i kort tid i en steril luftstrøm og 15 opløses derefter i en tilstrækkelig mængde TE-puffer, I således at man får en opløsning til "Southern blot"- I analysen indeholdende en DNA-koncentration mellem 0,25 og I 1 /*g//*i· I (b) Rensning over en tringradient uden ethidiumbromid I 20 Nucleinsyreme renses over en CsCl-tringradient, som I består af et 5,7 M CsCl (i TE-puffer) underlag og et I ovenover liggende lag af 1,0 M CsCl i TE-puffer. Nuclein- I syrerne indføres i overlaget. Rørene, som indeholder I tringradienten, centrifugeres natten over i en centrifuge I 25 med ekscentrisk roterende rotor (f.eks. Beckman SW 50.1, I ved 45.000 omdrejninger pr. minut). DNA'et isoleres fra I grænsefladeområdet, medens RNA'et kan isoleres fra rørets I bund. DNA'et fortyndes med 2 rumfangsdele vand og udfældes I med 2 rumfangsdele iskoldt ethanol som beskrevet ovenfor i I 30 eksempel 13 (a). Bundfaldet resuspenderes derefter i I TE-puffer, fældes på ny med ethanol og anvendes til I "Southern blot"-analysen.

I DK 175545 B1 I

I 56 I

I Eksempel 14 I

I Påvisning af fremmede DNA-sekvenser 1 qenomet for I

I transformerede Dactylis glomerata L.-planter ved hjalp af I

I 5 "Southern blot"-analyse I

I Southern-hybridiseringen gennemføres i alt væsentligt I

I under anvendelse af den af Maniatis et al., (1982) I

I beskrevne fremgangsmåde. DNA fra Dactylis glomerata I

I L.-planter (renset ifølge de i eksempel 13 (a) og 13 (b) I

I 10 beskrevne fremgangsmåder), skæres med restriktionsenzymet I

I BamHI. 5 μg deraf sættes til en 1%'s agarosegel, og der I

I foretages adskillelse svarende til fragmentstørrelse. I

I Gelen anbringes i ca. 20 minutter i 0,25 M HC1, hvorpå den I

I skylles med vand, hvorefter den anbringes i yderligere I

I 15 30 minutter i 0,4 M NaOH. DNA*et overføres derpå natten I

I over på sædvanlig måde til "GeneScreen Plus"® (NEN Res. I

I Products, kat. nr. NEF 976, Chargen nr. 330GP62) (som I

I beskrevet i instruktionsheftet, som følger med produktet), I

I idet der anvendes 0,4 M NaOH som transfer-puffer. Efter I

I 20 transfer natten over fjernes filteret, vaskes i ca. 5 mi- I

I nutter med 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat), I

I hvorefter det tørres i luften. Aftrykket præhybridiseres i I

I et tidsrum på 4 timer ved en temperatur på 65“C med en I

I puffer, som indeholder 10 g/1 okseserumalbumin (fedtfrit, I

I 25 Sigma, kat. nr. A-4503), 7% SDS, 1 mM NaEDTA og 0,52 Μ I

I natriumphosphatpuffer (pH 7,0). I

I Ved hjælp af "Random Primer"-metoden fremstilles derefter I

I under anvendelse af IBI "Prime Time" markeringssættet I

I eller en vilkårlig anden egnet metode, en radioaktivt

I 30 mærket prøve, som befries for overskud af nucleotider på I

I en "Spin"-søjle. DNA-prøven består af et pCIB709-fragment,

I som indeholder 35S promotorområdet samt strukturgenet for I

I aminoglycosidphosphotransferase type IV. Hybridiserings- I

reaktionen gennemføres natten over ved en temperatur på H

DK 175545 B1 57 65°C. Aftrykket skylles derefter 4 gange med en SW vaskepuffer, idet de to sidste skylleprocesser gennemføres ved en temperatur på 65eC. Derefter skylles aftrykket endnu én gang og denne gang i et tidsrum på 2 timer i 0,2 x SSC med 5 1% SDS og 5 mM NaEDTA ved 65eC. Det våde aftryk indpakkes i en lysgennemtrængelig husholdningsfolie ("Saranwrap"®) eller en vilkårlig anden egnet folie og fremkaldes ved hjælp af en røntgenfilm (Kodak X-Omat AR Film, Eastman Kodak, Rochester, NY 14650, kat. nr. 165 1454). Bedømmel-10 sen af den fremkaldte røntgenfilm viser en entydig hybridisering mellem prøven og DNA’et, som ér udvundet med en fra pCIB709 transformeret kallus eller fra en med pCIB709 transformeret plante. pCIB709 DNA'et ligger således entydigt inkorporeret i transformantens høj-15 molekylære DNA.

Opløsninger og puffere SW hybridiseringspuffer 1% (v/r) okseserumalbumin 20 (fedtfri) 0,52% M natriumphosphat, pH 7,0

7% (v/r) SDS 1 mM NaEDTA

'25

Vaskeopløsning 0,04 M natriumphosphat,

pH 7,0 1 mM NaEDTA 1% (v/r) SDS

30 0,125 M NaCl 35 I DK 175545 B1

I 58 I

I Litteraturoversigt I

I 1. R. Abdullah et al., Bio/Technology,4 (1986) 1087-1090, I

I 2. P.P. Abel et al.. Science,233 (1986) 738, I

I 5 3. T.L. Adams et al., Plant Cell Reports,2 (1983) I

I 165-168, I

I 4. B.S. Ahloowalia, Crop Science,15 (1975) 449-452, I

I 5. B.S. Ahloowalia, Handbook of Plant Cell Culture, I

I Ammirato et al. (eds) Macmillan, NY, (1984) 91-125, I

I 6. K.A. Barton et al., Plant Physiol. ,85 (1987) I

I 1103-1109, I

I 7. Y. Birk et al., Biochim. Biophys. Acta,67 (1963) I

I 326-328, I

I 8. S.W.J. Bright og M.G.K. Johnes, "Cereal Tissue and I

I 15 cell Culture" (1985) 204-230, M. Nijoff/W.Dr. Junk, I

I Dordrecht, I

I 9. W.V. Brown, Phytomorphology,10 (1960) 215-223, I

I 10. E.C. Cocking og M.R. Davey, Science,236 (1987) I

I 1259-1262, I

I 20 11. M.E. Fromm et al., Nature,319 (1986) 791-793, I

I 12. 0. Gamborg et al., Exp. Cell Res., 50 (1968) 151-158, I

I 13. E.F. George et al. (eds), Exgetics Ltd., Edington, I

I Westbury, Wiltshire, England (1987), I

I 14. D.J. Gray et al., Plant Cell Tissue Organ Cult.,4 I

25 (1985) 123-133, I

15. L. Gritz og J. Davis, Gene,25 (1983) 179-188, I

16. Guiseley og Renn, "The Agarose Monograph", Marine I

Colloids Division, FMC Corp. (1975), I

17. Hammond et al., J.Biol.Chem.,259 (1984) 9883-9890, I

30 18. G.E. Hanning et al., Theor.Appl.Genet,63 (1982) I

155-159, I

19. Heide, Physiol, Plantarum,70 (1987) 523-529, I

20. L. Herrera-Estrella et al., Nature,310 (1984) 115, I

21. V.A. Hilder et al., Nature,330 (1987) 160-163, I

35 22. Howard et al., Planta,170 (1987) 535, I

23. K. Itakura et al., J.Am.Chem.Soc.,97 (1975) 7327, I

24. K.N. Kao et al., Planta,126 (1975) 105-110, I

59 DK 175545 B1 25. M.J. Kasperbauer et al., Crop Science, 19 (1979) 457-460, 26. J.V. Krans et al., Crop Science,22 (1982) 1193-1197, 27. H. Lipke et al., J.Agr.Food Chem,2 (1954) 410-414, 5 28. P.F. Lo et al., Crop Science,20 (1980) 363-367, 29. H. Loerz et al., Mol.Gen.Genet.,199 (1985) 178-182, 30. Ch. Lu et al., Z.Pflanzenphyslol.,104 (1981) 311-318, 31. R. Luehrs og H. Loerz, Theor.Appl.Genet.,75 (1987) 16-25, 10 32. Maniatis et al., "Molecular Cloning, a Laboratory

Manual", Cold Spring Habor Laboratory (1982), 33. I.J. Mettler, GB-2.140.822, 34. Morelli et al., Nature,315 (1985) 200, 35. T. Murashige et al., Physiol.PIant., (1962) 473-497), 15 36. I. Negrutiu et al., Plant Mol.Biology,8 (1987) 363-373, 37. J.T. Odell et al., Nature,313 (1985) 810, 38. J. Paszkowski et al., The EMBO Journal,3 (1984) 2717-2722, 20 39. J. Paszkowski et al., EP 0.164.575, 40. P. Pennica et al., Nature,301 (1983) 214, 41. I. Potrykus et al., Theor.Appl.Genet.,54 (1979) 209-214, 42. I. Potrykus et al., Mon.Gen♦Genet.,199 (1985) 183-188, 25 43. L.F. Randolph, J.Agric.Research,53 (1936) 881-916, 44. C. Rhodes et al., Biotechnology,6 (1988) 56-60, 45. Roger og Bendich, Plant Mol.Biology,5 (1985) 69-76, 46. S. Rothstein et al., Gene,53 (1987) 153-161, 47. C. Ryan et al., Ann.Rev.Plant Physiol.,24 (1973) 30 173-196, 48. R.D. Shillito et al., Plant Cell Reports,2 (1983) 244-247, 49. R.D. Shillito et al., Bio/Technology,3 (1985) 1099-1103, 35 50. R.D. Shillito et al., EP-0.129.688, 51. F. Shoffl et al., Plant Cell Environ., omtalt i L. Willmitzer, Trends in Genetics, 4, 13 (1988),

I DK 175545 B1 I

I 60 I

I 52. K.G.M. Skene et al., Zeitschr.PflanzenzQchtung.90 I

I (1983) 130-135, I

I 53. Spena et al., EMBO J.,4 (1985) 2735, I

I 54. P. Stephien et al., Gene,24 (1983) 281-297, I

I 5 55. R.U. Schenk og A.C. Hildebrandt, Can.J.Bot.,50 (1972) I

I 199-204, I

I 56. M. Vaeck et al., Nature,328 (1987) 33-37, I

I 57. V. Vasil et al., Z.Pflanzenphysiol.,111 (1983) I

I 233-239, I

I 10 58. U. Wienand et al., Mol.Gen.Genet.,182 (1981) 440-444, I

I 59. L.A. Withers, Plant Tissue Culture and its I

I Agricultural Application, I

I 60. L.A. Withers og P.G. Alderson (eds), University Press, I

I Cambridge, England (1986) 261-276, I

I 61. Y. Yamada et al., Plant Cell Reports,5 (1986) 85-88. I

I 20 I

i I

I 30 I

I 35 I

Claims (30)

1. 61 DK 175545 B1
2. 1. Embryogen cellekultur, som er afledt af gramine-planter af underfamilien Pooideae, og hvorfra der kan iso- 5 leres protoplaster, som regenererer cellevægge, deler sig og til sidst danner et kallus, som kan regenereres til hele planter, hvilken cellekultur kan fremstilles ved, at man 10 (a) isolerer væv fra egnede dele af planter af under familien Pooideae, (b) dyrker dette væv i et medium, som er i stand til at inducere dannelsen af et embryogent kallus eller af embryoner, 15 (c) periodisk anlægger felge- eller rækkekulturer af det embryogene kallus eller af embryonerne på friskt medium, idet man overfører små celleklynger med cyto-plasmarige celler til frisk medium, som er i stand til at opretholde en kontinuerlig formering, 20 (d) efter 0 til 500 overføringer (transfers) isolerer embryogene celleklumper med en størrelse på 150-2000 ym.
3. 2. Embryogen cellekultur ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at de regenererede planter er fertile planter.
4. 3. Embryogen cellekultur ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Pooideae-planterne er græsser eller småkornede kornarter. 30
5. 4. Embryogen cellekultur ifølge krav 3, kendetegnet ved, at græssrne er valgt blandt slægterne Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus og Dactylis. 35
6. 5. Embryogen cellekultur ifølge krav 3, kendetegnet ved, at de småkornede kornarter er valgt blandt slægterne Avena, Triticum, Secale og Hordeum. I DK 175545 B1 I I 62 I
7. 6. Fremgangsmåde til fremstilling af protoplaster, som I I kan regenereres til hele planter, ud fra gramine-planter I af underfamilien Pooideae, kendetegnet ved, at man I I (a) isolerer væv fra egnede dele af planter af under- I I 5 familien Pooideae, I (b) dyrker dette væv i et medium, som er i stand til at I I inducere dannelsen af et embryogent kallus eller af I I embryoner, I I (c) periodisk anlægger følge- eller rækkekulturer af det I I 10 embryogene kallus eller af embryonerne på friskt me- I I dium, idet man overfører små celleklynger med cyto- I I plasmarige celler til frisk medium, som er i stand I til at opretholde en kontinuerlig formering, I I (d) efter 0 til 500 overføringer (transfers) isolerer I I 15 embryogene celleklumper med en størrelse på 150-2000 I I μπ\, og I I (e) fjerner cellevæggene ved hjælp af egnede enzymer og I I isolerer de dannede protoplaster. I I 20 7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at I I Pooideae protoplasterne kan regenereres til hele fertile I I planter. I
8. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at I I 25 vævet fra trin (a) isoleres fra de basale afsnit af unge, I I indvendigt liggende blade af umodne kønnede embryoner, I I umodne blomsterstande, modne frø eller fra kimvæv fra I I planter af underfamilien Pooideae. I
9. 9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at I vævet fra trin (a) isoleres fra de yngste, inderst lig- I gende blade. I
10. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at I 35 isoleringen af de embryogene celleklumper foretages efter I 0-100 overføringer (transfers). I 63 DK 175545 B1
11. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at isoleringen af de embryogene celleklumper foretages efter 3-50 overføringer (transfers).
12. 12. Fremgangsmåde til fremstilling af en cellekultur, som kan regenereres til hele planter, ud fra gramine-plan-ter af underfamilien Pooideae, kendetegnet ved, at man (a) isolerer væv fra egnede dele af planter af under familien Pooideae, 10 (b) dyrker dette væv i et medium, som er i stand til at inducere dannelsen af et embryogent kallus eller af embryoner, (c) periodisk anlægger følge- eller rækkekulturer af det embryogene kallus eller af embryonerne på friskt me- 15 dium, idet man overfører små celleklynger med cyto- plasmarige celler til frisk medium, som er i stand til at opretholde en kontinuerlig formering, (d) efter 0 til 500 overføringer (transfers) isolerer embryogene celleklumper med en størrelse på 150-2000 2. pm. (e) fjerner cellevæggene eventuelt ved hjælp af egnede enzymer og isolerer de dannede protoplaster, (f) dyrker protoplaster fra fremgangsmådetrin (e) eller planteceller fra fremgangsmådetrin (d) til dannelsen 25 af cellekolonier i et egnet kulturmedium, (g) dyrker cellekolonierne eller dele deraf på et egnet medium, som fremmer dannelsen af cellekulturer, og (h) isolerer de dannede cellekulturer. 1 2 3 4 5 6
13. 13. Fremgangsmåde til fremstilling af en cellekultur 2 ifølge krav 12, der kan regenereres til hele plan 3 ter, ud fra gramine-planter af underfamilien 4 Pooideae, kendetegnet ved, at man 5 (a) dyrker protoplasterne eller plantecellerne i et 6 egnet kulturmedium i et tidsrum, der er tilstræk keligt til at fremme dannelsen af cellekulturer, indtil dannelsen af cellekolonier og (b) isolerer de dannede cellekulturer. I DK 175545 B1 I I 64 I
14. 14. Fremgangsmåde til fremstilling af en cellekultur I I ifølge et af kravene 12 eller 13, kendetegnet ved, at I I cellekulturen kan regenereres til hele fertile planter. I I 5 15. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 12-14, kende- I I tegnet ved, at cellekulturen er en suspensionskultur. - I
15. 16. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 12-14, kende- I I tegnet ved, at cellekulturen er en kalluskultur. I I 10 I
16. 17. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 12 eller 13, I I kendetegnet ved, at man gennemfører fremgangsmådetrin (a) I I i nærværelse af agarose som størkningsmiddel eller gele- I I ringsmiddel. I I 15 I
17. 18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at I I man smelter det med agarose størknede medium fra frem- I I gangsmådetrin (a) eller opdeler det i segmenter og over- I I fører det flydende eller opdelte agarosemedium til et I I 20 flydende medium, hvori der foretages videredyrkning til I I dannelse af cellekolonier. I
18. 19. Fremgangsmåde ifølg et af kravene 12 eller 13, I I kendetegnet ved, at delene af en cellekoloni i fremgangs- I I 25 mådetrin (b) er celler, som er frigjort fra cellekolonien. I
19. 20. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 12 eller 13, I I kendetegnet ved, at protoplasterne eller cellerne indehol- I I der exogent DNA stabilt inkorporeret i deres genom, som I I 30 ikke ad naturlig vej kan integreres i genomet. I
20. 21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at I det integrerede exogene DNA kan udtrykkes i planteceller. I 1
21. 22. Fremgangsmåde til regenerering af gramine-planter af I underfamilien Pooideae, kendetegnet ved, at man I (a) dyrker cellekulturer ifølge krav 12 til dannelsen af I enbryoner, I 65 DK 175545 B1 (b) dyrker embryonerne på et medium, som er egnet til at inducere modning og kimdannelse hos embryonerne, og (c) vider edyrker de dannede ungplanter, til de har nået et udviklingsstadium, der tillader en overføring til 5 jord.
22. 23. Fremgangsmåde til regenerering af fertile gramine-planter af underfamilien Pooideae, kendetegnet ved, at man <a) dyrker cellekulturer ifølge krav 12 til dannelsen af 10 enbryoner, (b) dyrker embryonerne på et medium, som er egnet til at inducere modning og kimdannelse hos embryonerne, (c) vider edyrker de dannede ungplanter til de har nået et udviklingsstadium, der tillader en overføring til 15 jord, og (d) udvinder frø efter en kontrolleret eller åben bestøvning.
23. 24. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 22 eller 23, 20 kendetegnet ved, at plantecellerne, som opbygger kaliuset, indeholder exogent DNA stabilt indbygget i genomet, som ikke ad naturlig vej kan integreres i genomet.
24. 25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, kendetegnet ved, at 25 det integrerede exogene DNA kan udtrykkes i planteceller.
25. 26. Fremgangsmåde til fremstilling af transgene gramine-planter af underfamilien Pooideae, kendetegnet ved, at man (a) transformerer protoplaster ifølge krav 6 med exogent
26. 30 DNA, som ikke kan integreres i genomet ad naturlig vej, ved hjælp af kendte transformationsfremgangsmåder , (b) dyrker de transformerede protoplaster ifølge et af kravene 12 eller 13, og 35 (c) regenererer hele planter ifølge et af kravene 22 eller 23. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at det exogene DNA er et kimært gen eller flere kimære gener, I DK 175545 B1 I I 66 I I som bibringer de transformerede protoplaster samt de deraf I I udviklede væv og især planternes fordelagtige egenskaber. I
27. 28. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at I I 5 det exogene DNA er et ikke-kodende DNA med regulator i sk I I funktion. -I
28. 29. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at I I man i fremgangsmådetrin (a) anvender en direkte gen- I I 10 transferfremgangsmåde til protoplasttransformationen. I
29. 30. Gramine-planter af underfamilien Pooideae samt deres I I formeringsmateriale, kendetegnet ved, at planten er en I I fertil plante, som kan fås ved regenerering ud fra en I I 15 embryogen cellekultur ifølge ét af kravene 1-5 og hvis I I formeringsmateriale indeholder exogent DNA stabilt inte- I I greret i plantegenomet, hvilket DNA er exprimerbart i I I planter eller planteceller og ikke kan integreres i geno- I I met ad naturlig vej. I I 20 I
30. 31. Formeringsmateriale ifølge krav 30, kendetegnet ved. I I at formeringsmaterialet er plantemateriale, som kan for- I I meres kønnet eller ukønnet samt in vitro eller in vivo. I I 25 32. Formeringsmateriale ifølge krav 31, kendetegnet ved. I I at det er protoplaster, celler, kalli, væv, organer, zygo- I I ter, embryoner eller frø, som stammer fra transgene I I Pooideae-planter ifølge krav 30. I I 30 33. Afkom af . planter ifølge krav 30, hvis genom inde- I I holder nævnte exogene DNA. I I 35 I