DK178976B1 - Forudsigelse af resistens over for sygdom - Google Patents
Forudsigelse af resistens over for sygdom Download PDFInfo
- Publication number
- DK178976B1 DK178976B1 DKPA201400114A DKPA201400114A DK178976B1 DK 178976 B1 DK178976 B1 DK 178976B1 DK PA201400114 A DKPA201400114 A DK PA201400114A DK PA201400114 A DKPA201400114 A DK PA201400114A DK 178976 B1 DK178976 B1 DK 178976B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- dna
- resistance
- salmon
- alleles
- polymorphism
- Prior art date
Links
- 206010058096 Pancreatic necrosis Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 101
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 67
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 42
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 claims description 42
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 39
- 208000009663 Acute Necrotizing Pancreatitis Diseases 0.000 claims description 30
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 29
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 29
- 241000277263 Salmo Species 0.000 claims description 16
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 2
- 101100452374 Mus musculus Ikbke gene Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 107
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 46
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 43
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 3
- 241000710921 Infectious pancreatic necrosis virus Species 0.000 description 3
- 241000277289 Salmo salar Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 101000724418 Homo sapiens Neutral amino acid transporter B(0) Proteins 0.000 description 2
- 102100028267 Neutral amino acid transporter B(0) Human genes 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 2
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- TWQHGBJNKVFWIU-UHFFFAOYSA-N 8-[4-(4-quinolin-2-ylpiperazin-1-yl)butyl]-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione Chemical compound C1C(=O)N(CCCCN2CCN(CC2)C=2N=C3C=CC=CC3=CC=2)C(=O)CC21CCCC2 TWQHGBJNKVFWIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 108010000178 IGF-I-IGFBP-3 complex Proteins 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 101150062912 cct3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til forudsigelse af resistens over for infektiøs pankreasnekrose hos laks, hvilken fremgangsmåde omfatter bestemmelse af allelerne, der er til stede i en DNA-polymorfisme hos laksen, og forudsigelse af, hvorvidt eller ikke laksen er resistent over for infektiøs pankreasnekrose, på baggrund af bestemmelsen af allelerne. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til udvælgelse af en laks til anvendelse som gydefisk, hvor laksen udvælges på baggrund af forudsigelsen ved hjælp af den første fremgangsmåde af, at laksen vil have resistens over for infektiøs pankreasnekrose.
Description
Forudsigelse af resistens over for sygdom
Den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåder til forudsigelse af resistens over for infektiøs pankreasnekrose hos atlantisk laks, mere specifikt angår opfindelsen forsigelse af en sådan resistens ved hjælp af en analyse af DNA-polymorfismer.
Infektiøs pankreasnekrose (IPN) er en af de største trusler for lakseopdrætsindustrien på verdensplan. Sygdommen forårsages afen akvatisk birnavirus, der forårsager nekrose af pankreasceller og leverceller, hvilket resulterer i letargi og pludselig dødelighed. Virusset er udbredt i naturen, men synes ikke i større grad at ramme fritlevende laks. I akvakulturmiljøer forårsager sygdommen dødelighed både i yngelstadiet, når fisken stadig lever i ferskvand, og i smoltstadiet kort efter overførsel til havvand. Branchens tab som følge af IPN er blevet estimeret til 8 % i ferskvandsfasen og 5 % i havvandsfasen
Lakseindustrien inddeles generelt i forskellige strata svarende til fiskens livsstadier: ægproducenter sælger befrugtede æg til producenter af smolt, som tilvejebringer saltvandsklare fisk (smolt) til udvoksningsproducenter. Det er for hvert stratum fordelagtigt at udvælge æg eller fisk, der er over gennemsnitligt resistente over for sygdomme. Lakseopdrætsfirmaer kører fortløbende fiskeudvælgelsesprogrammer, der er rettet mod en forbedring af akvakulturstammerne med hensyn til sygdomsresistens, og der er udviklet protokoller til test af fisk for resistens overfor adskillige specifikke sygdomme. Disse provokationstests har været anvendt til udvælgelse af fisk som gydefisk, der har over gennemsnitlig resistens over for de pågældende sygdomme. Traditionelle tests inddrager kontrolleret provokationstest af søskende blandt de ynglende kandidater. Denne metodik er dog hæmmet af det faktum, at inficerede fisk ikke kan anvendes som gydefisk. Man bliver derfor nødt til at benytte sig af udvælgelse af vilkårlige (ikke-testede) dyr fra familierne til den testede fisk, der fik det bedste resultat i provokationstestene (såkaldt familieudvælgelse).
Der er derfor et behov for alternative metoder til undersøgelse af dyrs resistens over for infektiøs pankreasnekrose, især metoder, der åbner mulighed for direkte undersøgelse af et dyrs resistens over for infektiøs pankreasnekrose ved opretholdelse af muligheden for at bruge det testede dyr som gydefisk.
Opfinderen af den foreliggende opfindelse har efter omfattende eksperimenter påvist, at man kan forudsige resistens over for infektiøs pankreasnekrose hos atlantisk laks ved hjælp af analyse af en eller flere DNA-polymorfismer (hvorved ovennævnte behov opfyldes). Følgeligt er der i et første aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebragt en fremgangsmåde til forudsigelse af resistens over for infektiøs pankreasnekrose hos atlantisk laks, hvilken fremgangsmåde omfatter bestemmelse af allelerne, der er til stede i en DNA-polymorfisme hos laksen, og forudsigelse af, hvorvidt eller ikke laksen er resistent overfor infektiøs pankreasnekrose, på baggrund af bestemmelsen af allelerne, hvor DNA-polymorfismen er udvalgt blandt en hvilken som helst af følgende: AGKD01281000.1_4157[T/TA]; AGKD01281000.1_5527[T/TAT]; AGKD01021775.1_19790[G/A]; AGKD01281000.1_5251[A/G]; AGKD01281000.1_4338[A/T]; AGKD01317469.1_245[T/A]; AGKD01281000.1_5457[A/G]; AGKD01028155.1_12812[A/G]; AGKD01452978.1 _5956[A/G]; AGKD01039267.1_12921[T/A]; AGKD01059002.1_4664[T/C]; og AGKD01451885.1_830[T/G].
Opfinderen har fundet, at DNA-polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse kan være til stede i den ene eller den anden af to former, det vil sige, at polymorfismerne har to alleler. Den ene allel kan karakteriseres som prædiktiv for resistens over for infektiøs pankreasnekrose (det vil sige resistensallelen), mens den anden er prædiktiv for ikke-resistens overfor infektiøs pankreasnekrose (det vil sige ikke-resistensallel). Laks er diploide organismer og har således to kopier af polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse (én kopi i hvert sæt af kromosomer). Trinet bestemmelse af allelerne i fremgangsmåden i det første aspekt af den foreliggende opfindelse indbefatter derfor trinet analyse af DNA-polymorfismen, der er til stede i hvert sæt af kromosomer, til bestemmelse af, hvorvidt hver af de tilstedeværende kopier af DNA-polymorfismen er en resistensallel eller en ikke-resistensallel. Når en laks ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse viser sig at have to kopier af resistensallelen for DNA-polymorfismen (det vil sige laksen er homozygot for resistensallelen), forudsiges det, at laksen har resistens overfor infektiøs pankreasnekrose. Omvendt forudsiges det, når en laks ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse viser sig at have to kopier af ikke-resistensallelen for DNA-polymorfismen (det vil sige er homozygot for ikke-resistensallelen), at laksen ikke har resistens overfor infektiøs pankreasnekrose. Det kan muligvis konkluderes, at en laks, der ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse forudsiges at have resistens over for infektiøs pankreasnekrose, har en større end normal chance for at have resistens overfor pankreasnekrose. Omvendt kan det muligvis konkluderes, at en laks, der forudsiges ikke at have resistens over for infektiøs pankreasnekrose, har en mindre end normal chance for at udvikle resistens overfor infektiøs pankreasnekrose. En laks, der ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, viser sig at have én kopi af resistensallelen for DNA-polymorfismen og én kopi af ikke-resistensallelen for DNA-polymorfismen (det vil sige er heterozygot), vil ifølge den foreliggende opfindelse ikke blive forudsagt at have resistens over for infektiøs pankreasnekrose. Det vil imidlertid blive forudsagt, at denne laks har en større chance for at være resistent over for infektiøs pankreasnekrose end en laks med to kopier af ikke-resistensallelen. En sådan laks vil i det følgende blive benævnt en laks med semiresistens over for infektiøs pankreasnekrose.
Den pågældende DNA-polymorfisme kan være en hvilken som helst af adskillige DNA-polymorfismer, som opfinderen har påvist har denne prædiktive egenskab. Alle disse DNA-polymorfismer er placeret på kromosom 26. DNA-polymorfismerne er koblet ved deres fælles træk til forudsigelse af resistens over for IPN. DNA-polymorfismernes evne til at forudsige resistens overfor IPN kan kvantificeres ved anvendelse af ^-statistik, som vil blive forklaret nedenfor. Alle DNA-polymorfismerne har det træk til fælles, at denne i^-værdi er større end 0,3. DNA-polymorfismen kan være en multipelnukleotidpolymorfisme (i.e. ikke-SNP-polymorfismer), en enkeltnukleotidpolymorfisme, en tilføjelsesmutation eller en deletionsmutation. Hver type af DNA-polymorfisme, der er nævnt ovenfor, påtænkes individuelt som en del af den foreliggende opfindelse i bestemmelsestrinet i fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse.
Hver af DNA-polymorfismerne ifølge den foreliggende opfindelse påtænkes individuelt som en del af den foreliggende opfindelse. DNA-polymorfismerne, der er beskrevet i denne ansøgning, defineres ved henvisning til den fulde genomsekvens for Salmo salar, der er publiceret i Genbank under accessionsnummer AGKD00000000 (version AGKD00000000.1 GI: 354459050). Mere specifikt er navnet på hver DNA-polymorfisme i den foreliggende ansøgning som beskrevet heri konstrueret som følger: Genbank-accessionsnummer, efterfulgt af en understregning ('_'), efterfulgt af positionen af DNA-polymorfismen i GenBank-sekvensen, efterfuldt af kantede parenteser, der omslutter referenceallelen (der er vist først) og den alternative allel (der er vist som nummer to). Referenceallelen er den allel, der fremkommer i referencesekvensen. DNA-polymorfismen kan for eksempel være: AGKD01281000.1_4157[T7TA]; AGKD01281000.1 _5527|Τ/ΤΑη; AGKD01021775.1_19790[G/A]; AGKD01281000.1_5251[A/G]; eller AGKD01281000.1_4338[A/T|.
Hver af ovennævnte DNA-polymorfismer påtænkes individuelt som en del af den foreliggende opfindelse.
Fremgangsmåden kan anvende to DNA-polymorfismer. Når fremgangsmåden anvender to DNA-polymorfismer, udgør de to DNA-polymorfismer én enhed, der herefter benævnes en haplotype. Hver haplotype kan have fire forskellige alleler svarende til de fire forskellige kombinationer af DNA-polymorfismealleler i de individuelle DNA-polymorfismer (hvis for eksempel haplotypen omfatter én DNA-polymorfisme med allelerne A og T og én DNA-polymorfisme med allelerne T og G, er de fire mulige haplotypealleler A-T, A-G, T-T og T-G). Hver af disse fire alleler vil være enten en resistensallel eller en ikke-resistensallel på en måde, der er analog til enkelt-DNA-polymorfismemetoden, der er beskrevet ovenfor. I det hypotetiske eksempel med en haplotype med de fire alleler A-T, A-G, T-T og T-G kunne alle A-T, A-G og T-T således være resistensalleler, mens T-G var en ikke-resistensallel. I dette tilfælde ville et dyr med én kopi af A-T-allelen og én kopi af A-G-allelen være resistent over for IPN, et dyr med én kopi af A-T og én kopi af T-G ville være semiresistant, mens et dyr med to kopier af T-G ville være ikke-resistent.
Opfinderen har opdaget et stort antal af sådanne haplotyper, det vil sige kombinationer af to DNA-polymorfismer, der er stærke prædiktorer af resistens over for IPN, stærkere end enkelt-DNA-polymorfismer. Opfinderen har for hver af disse haplotyper identificeret hvilke alleler, der er resistensalleler, og hvilke alleler, der er ikke-resistensalleler. Parrene af DNA-polymorfismer, der udgør prædiktive haplotyper, er enten en hvilken som helst kombination af DNA-polymorfismer, der er anført i tabel 1, eller de er en hvilken som helst kombination af én DNA-polymorfisme fra tabel 1 og én DNA-polymorfisme fra tabel 2. Alle prædiktive haplotyper er anført i tabel 3, hvor DNA-polymorfismerne er angivet ved numre i forhold til tabel 1 og tabel 2. Hvert af parrene af DNA-polymorfismer påtænkes til individuel anvendelse som en del af den foreliggende opfindelse. Alle par af DNA-polymorfismer har det fælles træk, at deres r2-værdi (beskrives nedenfor) er større end 0,6. Følgeligt kan den foreliggende opfindelse derfor angå en fremgangsmåde, der yderligere omfatter trinet bestemmelse af allelen, der er til stede i en yderligere DNA-polymorfisme, og en forudsigelse af, hvorvidt eller ikke laksen er resistent over for infektiøs pankreasnekrose, baseres på bestemmelsen af alleleme i begge DNA-polymorfismer.
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan for eksempel indbefatte bestemmelsen af alleler, der er til stede i DNA-polymorfismen AGKD01458345.1 _5634[G/T], og i den yderligere DNA-polymorfisme AGKD01021775.1_19790[G/A], og en forudsigelse af, hvorvidt eller ikke laksen er resistent over for infektiøs pankreasnekrose, baseres på bestemmelsen af allelerne i begge DNA-polymorfismer.
Når der anvendes haplotyper med to DNA-polymorfismer i stedet for enkelt-DNA-polymorfismer til forudsigelse af resistens, skal haplotypeallelerne først fastlægges i den testede fisk, det skal med andre fastlægges, hvilke alleler i den individuelle DNA-polymorfisme, der er placeret på de samme kromosomer. Dette kan udføres ved anvendelse af computerprogrammer, såsom PHASE (htto://etephenslab.uchicago.edu/eoftware.html#phase). omend haplotypeallelerne for de fleste dyr vil være evidente (hvis f.eks. et dyr har to kopier af allel A i én DNA-polymorfisme og én kopi af T og én kopi af G i den anden DNA-polymorfisme, er kun to konfigurationer af alleler i haplotypen mulige, nemlig A-G + A-T). Når der anvendes en haplotype med to DNA-polymorfismer i stedet for én DNA-polymorfisme, bliver testen mere prædiktiv sammenlignet med, når der kun anvendes én DNA-polymorfisme.
Fremgangsmåden kan inddrage analyse af mere end to DNA-polymorfismer. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan for eksempel inddrage bestemmelse af mere end to polymorfismer, hvor mindst én af polymorfismerne udvælges blandt de, der er anført i krav 1, og/eller mindst to af polymorfismerne er anført som et par i tabel 3.
Fremgangsmåden anvendes til atlantisk laks (i.e. Salmo salar).
Trinet bestemmelse af tilstedeværelse eller fravær hos en laks kan udføres på en prøve udtaget fra laksen. Prøven kan være en hvilken som helst prøve, hvor analyse af nukleinsyremateriale er mulig, som er velkendt for en fagmand. For at undgå tvivl kan prøven være en muskelvævsprøve, en blodprøve, en leverprøve og/eller et finneklip.
Fagmanden vil være bekendt med alle tilgængelige metoder, der kan anvendes til test for tilstedeværelse eller fravær af en DNA-polymorfisme. Metoden kan for eksempel inddrage sekvensanalyse af laksen, der skal testes. Alternativt kan metoden inddrage enkeltbaseforlængelse af DNA-fragmenter, der terminerer i det polymorfe sted (f.eks. iPLEX-assays fra Sequenom og Infinium-assays fra lllumina), allelspecifik PCR (f.eks. SNPtype-assays fra Fluidigm eller KASPar-assays fra KBioscienæs) eller kompetitiv hybridisering af prober, der er komplementære til de forskellige alleler (f.eks. TaqMan-assayetfra Applied Biosystems).
Der er tilvejebragt en hybridiseringsprobe, der er specifik for en eller flere af ovennævnte DNA-polymorfismer. DNA'et i og omkring DNA-polymorfismerne kan udledes fra navnene, der er anført for DNA-polymorfismerne i tabel 1 og tabel 2. Endvidere kan DNA-sekvenserne i og omkring DNA-polymorfismerne findes i tabel 4.
Det er mere sandsynligt end normalt, at en laks, der forudsiges at have resistens overfor infektiøs pankreasnekrose ifølge det første aspekt af den foreliggende opfindelse, får afkom, der har en højere end normal chance for at have resistens over for infektiøs pankreasnekrose. Følgeligt tilvejebringes i et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til udvælgelse afen atlantisk laks til anvendelse som gydefisk, hvor laksen udvælges på baggrund af forudsigelsen ved hjælp af fremgangsmåden ifølge det første aspekt af den foreliggende opfindelse af, at den har resistens over for infektiøs pankreasnekrose.
Omvendt vil en laks, der ved hjælp af fremgangsmåden i det første aspekt af den foreliggende opfindelse forudsiges ikke have resistens overfor infektiøs pankreasnekrose, ikke blive udvalgt som gydefisk.
Eksempler på sekvenser for isolerede polynukleotider, der omfatter en eller flere af enkelt-DNA-polymorfismerne udvalgt fra gruppen vist i tabel 1, der er placeret i en del af laksegenomet, kan findes i tabel 4.
Udtrykkene “haplotypeallel” og “DNA-polymorfismeallel” er brugt i deres normale betydning, som er velkendt for fagmanden. For at undgå tvivl kan “DNA-polymorfismeallel” betyde den ene af to forskellige nukleotidsekvenser på stedet for en DNA-polymorfisme ifølge den foreliggende opfindelse (hvor den ene allel er “resistensallelen”, og den anden er “ikke-resistensallelen”). For at undgå tvivl kan “haplotypeallel” betyde den ene af fire mulige par af DNA-polymorfismealleler ifølge den foreliggende opfindelse, eller: ..."haplotypeallel" kan betyde en hvilken som helst mulig unik kombination af alleler for denne haplotype, det vil sige en hvilken som helst unik kombination af én allel fra hver af DNA-polymorfismerne, der udgør haplotypen (i forbindelse med haplotyper, der omfatter to bi-alleliske DNA-polymorfismer, er fire sådanne kombinationer mulige).
Den foreliggende opfindelse vil nu blive beskrevet ved hjælp af eksempel med henvisning til de ledsagende figurer, hvori:
Figur 1 viser en graf, der illustrerer overlevelsesrater for laks i en provokationstest med infektiøs pankreasnekrose.
Figur 2 viser en graf, der illustrerer kumulativ dødelighed i en badprovokationstest af laks med standardvirusisolat C-1244.
Figur 3 viser en graf, der illustrerer kumulativ dødelighed i en badprovokationstest af laks med en norsk vildstamme af IPN-virus. 1. Udvælgelse af testdyr 45 atlantiske laks fra Aqua Gen-ynglekernen i Norge (udvalgt blandt forældrefiskene fra 2005-og 2008-årgangsklasserne) blev udvalgt til massiv parallelsekventering (lllumina Hi Seq 2000). Alle laks i ynglekernen er descendenter af laks fanget i norske elve.
Et kvantitativt karakterloci (Quantitative Trait Loci - QTL) er blevet koblet med IPN-resistens hos atlantisk laks (Moen et al. 2009). Tre enkelt-DNA-polymorfismer er nyligt blevet rapporteret at være forbundet med QTL (Houston et al.2012), men der er ikke præsenteret en test til udledning af, hvorvidt individuelle dyr er resistente eller ikke-resistente. QTL’et er placeret på kromosom 26.
Vi antager her, at ovennævnte QTL for resistens over for IPN er forårsaget af en underliggende, men ukendt mutation i et gen eller andet funktionelt DNA-element. Denne ukendte mutation vil i det følgende blive benævnt det kvantitative karakternukleotid (QTN).
Det antages endvidere, at QTN’et har to alleler, én allel, der giver forøget resistens (resistensallel, Q), og én allel, der giver reduceret resistens (ikke-resistensallel, q). 454 helsøskendegrupper af atlantisk lakseyngel blev provokeret i individuelle tanke kort efter fodringsstart (protokollerfor en provokationstest kan findes i Moen et al., 2009). Hver helsøskendegruppe bestod af 103 fisk (i gennemsnit), og der blev indsamlet vævsprøver fra de 10 første, der døde, i gruppen samt 10 overlevende (eller de 10 sidste, der døde), hvorfra DNA blev ekstraheret ved anvendelse af DNAeasy-kittet fra QIAGEN (QIAGEN, Venlo, Holland). Fra 206 udvalgte helsøskendegrupper blev angrebet og overlevende afkom genotypebestemt med tre mikrosatellitmarkører placeret i QTL-regionen for IPN-resistens, Alu333, Ssa0384BSFU/ii og Ssa0285BSFU, hvorpå koblingsfasen mellem alleler af de tre mikrosatelliter blev identificeret i hver kortlægnings-forælderfisk ved anvendelse af den observerede co-segregation af alleler fra forældrefisk til afkom (genotypebestemmelse af mikrosatellitmarkører er diskuteret mere detaljeret i Moen et al. 2009). Denne genotypebestemmelse blev udført på en iterativ måde, således at til sidst næsten alle helsøskendegrupper, der kunne tænkes at have mindst én QTN-heterozygot forælder (se nedenfor), var genotypebestemt. En chi i anden-test blev anvendt til test for co-nedarvning af tre-mikrosatellit-haplotypen og den ramte/resistente fænotype, som førte til identificering af 110 QTN-heterozygote forældrefisk. Ved anvendelse af data fra disse QTN-heterozygote forældrefisk blev der lavet en tabel, der koblede alleler i tre-mikrosatellit-haplotypen til QTN-alleler. (Hvis en tre-mikrosatellit-allel viste sig at være koblet til både Q og q, blev kun den mest fremherskende koblingsfase indført i tabellen). Denne tabel blev herefter anvendt til udledning af QTN-genotyper for kortlægnings-forældrefiskene, der blev fundet QTN-homozygote, samt for andre dyr fra Aqua Gen-ynglekernen. 22 Aqua Gen-dyr, der på denne måde blev udledt at have QTN-genotypen QQ (i.e. forventedes at give god IPN-resistens), samt 23 Aqua Gen-dyr, der på samme måde viste sig at have qq-genotypen (i.e. forventedes at give dårlig IPN-resistens), blev udvalgt til efterfølgende helgenomsekventering. Disse sæt af 22 og 23 dyr blev sat sammen på en sådan måde, at slægtskabet mellem dyr i gruppen blev minimeret ved maksimering af diversiteten af tre-mikrosatellit-alleler i hver gruppe. 2. Fremstilling af en reference-DNA-sekvenssamling for QTL-området QTL-området blev defineret som området mellem SNP’erne ESTNV_31602_808 og GCR_cBin30387_Ctg1_91 på SNP-koblingskortet for atlantisk laks (Lien et al. 2011). Bakterielt kunstigt kromosom (BAC)-kloner, der matchede disse SNP'er, blev isoleret fra et eksisterende BAC-bibliotek (Thorsen et al., 2004). På baggrund af et fysisk kort fremstillet fra dette bibliotek (vvww.asalbase.org) blev der lavet et minimalt overlappende forløb af 31 BAC'er (tabel 5). Genomisk DNA fra atlantisk laks (i.e. insert-DNA) blev ekstraheret fra hvert BAC. Et individuelt mærket parret ende-bibliotek (med en gennemsnitlig insertstørrelse på 350 bp) blev lavet for hver BAC-DNA-prøve, hvorpå prøverne blev sekventeret flerdobbelt på en HiSeq2000 (lllumina Inc., San Diego, USA) til en gennemsnitsdybde på ca. 800 gange haploid genomdækning. Efter fjernelse af resterende adaptersekvenser, kassering af for korte sekvensresultater, trimning af enderne af sekvensresultater af dårlig kvalitet og matchning af parret ende-sekvensresultater blev der lavet en de novo-samling i hvert BAC ved anvendelse af “clc_novo_assemble”-programmet fra CLC Assemble Cell Suite (CLC Bio, Aarhus,
Danmark). Phrap version 1.090518 (http://phrap.org.) blev herefter anvendt til samling af individuelle BAC-contig-sekvenser til et sæt af contigs spændende over alle BAC’er. Endelig blev contigs’ene fra denne reference kombineret til ét fortløbende genomisk skelet ved aligning af denne med skeletter fra en indledende version af atlantisk laks-genomsekvensen (der var lavet internt ved anvendelse af Celera Assembler-softwaren baseret på data fra de første 27 batches af sekvenser fremsendt af sekventeringsprojektet til NCBI Trace Archive).
Tabel 5: Bakterielt kunstigt kromosom (BAC), der udgjorde et minimalt overlappende forløb, som viste sig at spænde over QTL-området.
3. Opdagelse af DNA-polymorfismer, der var prædiktive for IPN
Ovennævnte 23 QQ-dyr og 22 qq-dyr blev sekventeret ved anvendelse af HiSeq2000-teknologi fra lllumina. Individuelt mærkede parret ende-biblioteker blev lavet fra hver prøve, før prøver blev puljet til sekventering. Der blev frembragt ialt 264 x 109 sekvensresultater svarende til en pr. dyr-dækning på to gange det haploide genom. Sekvensresultaterne blev samlet til ovennævnte QTL-områdereferencesekvens ved anvendelse af programmerne “clc_ref_assemble_long” og “clc_ref_assemble” fra CLC Assembly Cell Suite til frembringelse af to samlinger svarende til de to QTN-genotypegrupper. En matchende længdefraktion på 0,9 og en minimal lighed på 0,98 blev fastsat i et forsøg på at minimiere kortlægningen af sekvensresultater fra homologe kromosomer. SNP-påvisning blev udført på disse separate samlinger ved anvendelse af programmet “find_variations” fra CLC Assembly Cell Suite ved tilladelse af minimum én nukleotidforskel til referencebasen. Fishers eksakte test blev anvendt til test for uafhængighed mellem QTN-genotype (det vil sige samling) og SNP/indel-alleler. SNP’erne med den mest signifikante statistik fra denne eksakte test blev genotypebestemt i de 110 QTN-heterozygote dyr nævnt ovenfor samt i det provokationstestede afkom fra disse dyr, og Fishers eksakte test blev udført til test for uafhængig nedarvning af SNP-alleler og QTN-alleler. Korrelationskoefficienten (r2) mellem alleler i SNP og i QTN, som er et mål for graden af koblings-uligevægt (LD) mellem loci, blev også beregnet for hver SNP ved anvendelse af “LD”-funktionen i “genetik”-modulet af R-statistikprogramsættet. En SNP blev defineret som anvendelig til forudsigelse af resistens over for IPN, hvis den havde en r2-værdi over 0,3 (dette er en almindelig antagelse blandt genetikere, se f.eks. Shifman et al., Human Molecular Genetics 2003). I det aktuelle sammenhæng er r2-værdien fraktionen af allelvariation af QTL, som forklares ved den prædiktive DNA-polymorfisme. Hvis for eksempel r2 = 0,5 skal to gange så mange dyr genotypebestemmes for den prædiktive DNA-polymorfisme i forhold til et hypotitisk tilfælde, hvor de prædiktive DNA-polymorfismer er selve QTN.
Tabel 1 viser SNP'er, der er identificeret som mest kraftigt korrelerende med IPN-resistens.
Tabel 1. DNA-polvmorfismer. der er kraftigt forbundet med resistens overfor IPN. r2 = den fraktion af allelvariation i QTN, der forklares ved DNA-polymorfismen.
DNA- DNA-polymorfismes resistensallel/ r2 polymorfisme nr. navn ikke-resistensallel 1 AGKD01281000.1_4157[T/TA] T/TA 0,57 2 AGKD01281000.1_5527[T/TAT] T/TAT 0,57 3 AGKD01021775.1_19790[G/A] G/A 0,57 4 AGKD01281000.1_5251[A/G] A/G 0,54 5 AGKD01281000.1_4338[A/T] A/T 0,54 6 AGKD01317469.1_245|T/A] T/A 0,54 7 AGKD01281000.1_5457[A/G] A/G 0,54 8 AGKD01028155.1_12812[A/G] A/G 0,5 9 AGKD01452978.1_5956[A/G] A/G 0,41 10 AGKD01039267.1_12921 |T/A] T/A 0,41 11 AGKD01059002.1_4664|T/C] T/C 0,4 12 AGKD01451885.1_830[T/G] T/G 0,4 13 AGKD01003456.1 35321 [A/G] A/G 0,37 14 AGKD01059002.1_16264[G/A] G/A 0,36 15 AGKD01452978.1_6935[A/G] A/G 0,35 16 AGKD01003456.1_36664[G/T] G/T 0,35 17 AGKD01340746.1_282[C/T] C/T 0,35 18 AGKD01062103.1 13615|T/G] T/G 0,32 19 AGKD01062103.1 13695|T/C] T/C 0,32 20 AGKD01007787.1_13666[G/A] G/A 0,31 21 AGKD01059002.1_3603|T/G] T/G 0,31
4. Opdagelse af to-DNA-polymorfismehaplotyper, der er prædiktive for resistens over for IPN
Genotyperne for DNA-polymorfismer hos QTN-heterozygote forældrefisk og deres provokationstestede afkom, der er beskrevet ovenfor, blev også anvendt til at finde kombinationer af 2 DNA-polymorfismer, der var mere prædiktive for IPN-resistens end de mest prædiktive enkelt-DNA-polymorfismer. DNA-polymorfismerne blev kombineret i alle mulige kombinationer to og to, og for hver haplotype, der bestod af to DNA-polymorfismer, blev haplotypealleler identificeret for hver QTN-heterozygote forælderfisk, og en Fishers eksakte test blev anvendt til test for uafhængighed mellem haplotypeallel og QTN-alleler. Korrelationskoefficienten (r2) mellem alleltilstande i to-SNP-haplotypen og i QTN blev beregnet ved først at kortlægge to-SNP-haplotypen ned til et to-allelsystem ved at erstatte hvert allelnavn med navnet på den QTN-allel, som den pågældende to-SNP-haplotypeallel overvejende var koblet til (se tabel 3), efterfulgt af beregning af r2 ved anvendelse af “LD”-funktionen i “genetik”-modulet i R-statistikprogramsættet.
De haplotyper, der er prædiktive for resistens over for IPN, som blev identificeret på denne måde, var enten kombinationer af to DNA-polymorfismer fra tabel 1, eller de var kombinationer af én DNA-polymorfisme fra tabel 1 og én DNA-polymorfisme fra tabel 2. Tabel 3 indeholder alle de kombinationer af DNA-polymorfismer, som man fandt, hvade en i^-værdi større end 0,60. Tabel 3 indeholder også identiteten af de haplotypealleler, der blev fundet for de respektive prædiktive haplotyper, samt klassificeringen (resistent vs. ikke-resistent) af disse haplotypealleler.
Tabel 4 indeholder DNA-sekvenserne for DNA-polymorfismerne. Disse sekvenser kan også udledes på baggrund af DNA-polymorfismernes navne som anført ovenfor.
Tabel 2. Hiælpe-DNA-polvmorfismer. der danner diagnostiske par af DNA-polymorfismer i kombination med DNA-polymorfismer fra tabel 1. DNA- DNA-polymorfismes navn resistensallel/ polymorfisme nr. ikke-resistensallel
22 AGKD01000927.1 _15806[C/G] C/G
23 AGKD01458345.1 _5634[G/T| T/G
24 AGKD01083029.1 _8368[A/C] C/A
25 AGKD01062103.1 _13615|T/G] T/G
26 AGKD01062103.1 _13695|T/C] T/C
27 AGKD01032349.1 _7232[A/C] A/C
28 AGKD01032349.1 _14078[A/G] G/A
29 AGKD01051656.1 _1495[T/A] A/T
30 AGKD01083029.1 _5084[G/C] C/G
31 AGKD01455926.1 _1814[G/A] A/G
32 AGKD01003456.1 _1873[G/C] G/C
33 AGKD01037589.1 _572[C/T| C/T
34 AGKD01037589.1 _1369[C/A] C/A
35 AGKD01205804.1 _11559[A/G] A/G
36 AGKD01106761.1 _1717[T/C] T/C
Tabel 3
Prædiktive kombinationer af to DNA-polymorfismer (haplotyper). r2 = fraktionen af allelvariation i QTN’et, der forklares ved haplotypen, haplotypealleler = de gyldige allelerfor haplotypen, T-G(R) = en haplotype, som har allel T i DNA-polymorfisme nr. 1, G i DNA-polymorfisme nr. 2 og er en resistensallel, TA-G(N) = en haplotype, som har allel TA i DNA-polymorfisme nr. 1, G i DNA-polymorfisme nr. 2 og er en ikke-resistensallel, osv. Nummereringen af DNA-polymorfismerne er i forhold til tabel 1 og 2. DNA- DNA- r2 haplotypealleler polymorfisme polymorfisme nr. 1 nr. 2 1 23 0,84 T-T(R), T-G(R), TA-T(R), TA-G(N) 1 28 0,84 T-G(R), T-A(R), TA-G(R), TA-A(N) 2 23 0,84 T-T(R), T-G(R), TAT-T(R), TAT-G(N) 2 28 0,84 T-G(R), T-A(R), TAT-G(R), TAT-A(N) 3 23 0,84 G-T(R), G-G(R), A-T(R), A-G(N) 3 28 0,84 G-G(R), G-A(R), A-G(R), A-A(N) 4 23 0,81 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 4 28 0,81 A-G(R), A-A(R), G-G(R), G-A(N) 5 23 0,81 A-T(R), A-G(R), T-T(R), T-G(N) 5 28 0,81 A-G(R), A-A(R), T-G(R), T-A(N) 6 23 0,81 T-T(R), T-G(R), A-T(R), A-G(N) 6 28 0,81 T-G(R), T-A(R), A-G(R), A-A(N) 7 23 0,81 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 7 28 0,81 A-G(R), A-A(R), G-G(R), G-A(N) 1 11 0,79 T-T(R), T-C(R), TA-T(R), TA-C(N) 1 12 0,79 T-T(R), T-G(R), TA-T(R), TA-G(N) 2 11 0,79 T-T(R), T-C(R), TAT-T(R), TAT-C(N) 2 12 0,79 T-T(R), T-G(R), TAT-T(R), TAT-G(N) 3 11 0,79 G-T(R), G-C(R), A-T(R), A-C(N) 3 12 0,79 G-T(R), G-G(R), A-T(R), A-G(N) 4 11 0,78 A-T(R), A-C(R), G-T(R), G-C(N) 4 12 0,78 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 5 11 0,78 A-T(R), A-C(R), T-T(R), T-C(N) 5 12 0,78 A-T(R), A-G(R), T-T(R), T-G(N) 6 11 0,78 T-T(R), T-C(R), A-T(R), A-C(N) 6 12 0,78 T-T(R), T-G(R), A-T(R), A-G(N) 7 11 0,78 A-T(R), A-C(R), G-T(R), G-C(N) 7 12 0,78 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 1 31 0,76 T-A(R), T-G(R), TA-A(R), TA-G(N) 2 31 0,76 T-A(R), T-G(R), TAT-A(R), TAT-G(N) 3 31 0,76 G-A(R), G-G(R), A-A(R), A-G(N) 1 10 0,75 T-T(R), T-A(R), TA-T(R), TA-A(N) 2 10 0,75 T-T(R), T-A(R), TAT-T(R), TAT-A(N) 3 10 0,75 G-T(R), G-A(R), A-T(R), A-A(N) 4 31 0,74 A-A(R), A-G(R), G-A(R), G-G(N) 5 31 0,74 A-A(R), A-G(R), T-A(R), T-G(N) 6 31 0,74 T-A(R), T-G(R), A-A(R), A-G(N) 7 31 0,73 A-A(R), A-G(R), G-A(R), G-G(N) 8 14 0,73 A-G(R), A-A(R), G-G(R), G-A(N) 1 22 0,72 T-C(R), T-G(R), TA-C(R), TA-G(N) 2 22 0,72 T-C(R), T-G(R), TAT-C(R), TAT-G(N) 3 22 0,72 G-C(R), G-G(R), A-C(R), A-G(N) 4 10 0,72 A-T(R), A-A(R), G-T(R), G-A(N) 5 10 0,72 A-T(R), A-A(R), T-T(R), T-A(N) 6 10 0,72 T-T(R), T-A(R), A-T(R), A-A(N) 7 10 0,72 A-T(R), A-A(R), G-T(R), G-A(N) 11 32 0,7 T-G(R), T-C(R), C-G(R), C-C(N) 11 33 0,7 T-C(R), T-T(R), C-C(R), C-T(N) 11 35 0,7 T-A(R), T-G(R), C-A(R), C-G(N) 12 24 0,7 T-C(R), T-A(R), G-C(R), G-A(N) 12 30 0,7 T-C(R), T-G(R), G-C(R), G-G(N) 12 32 0,7 T-G(R), T-C(R), G-G(R), G-C(N) 12 33 0,7 T-C(R), T-T(R), G-C(R), G-T(N) 12 35 0,7 T-A(R), T-G(R), G-A(R), G-G(N) 1 21 0,69 T-T(R), T-G(R), TA-T(R), TA-G(N) 2 21 0,69 T-T(R), T-G(R), TAT-T(R), TAT-G(N) 3 21 0,69 G-T(R), G-G(R), A-T(R), A-G(N) 4 22 0,69 A-C(R), A-G(R), G-C(R), G-G(N) 5 22 0,69 A-C(R), A-G(R), T-C(R), T-G(N) 6 22 0,69 T-C(R), T-G(R), A-C(R), A-G(N) 7 22 0,69 A-C(R), A-G(R), G-C(R), G-G(N) 1 18 0,68 T-T(R), T-G(R), TA-T(R), TA-G(N) 1 19 0,68 T-T(R), T-C(R), TA-T(R), TA-C(N) 1 25 0,68 T-T(R), T-G(R), TA-T(R), TA-G(N) 1 26 0,68 T-T(R), T-C(R), TA-T(R), TA-C(N) 1 27 0,68 T-A(R), T-C(R), TA-A(R), TA-C(N) 2 18 0,68 T-T(R), T-G(R), TAT-T(R), TAT-G(N) 2 19 0,68 T-T(R), T-C(R), TAT-T(R), TAT-C(N) 2 25 0,68 T-T(R), T-G(R), TAT-T(R), TAT-G(N) 2 26 0,68 T-T(R), T-C(R), TAT-T(R), TAT-C(N) 2 27 0,68 T-A(R), T-C(R), TAT-A(R), TAT-C(N) 3 18 0,68 G-T(R), G-G(R), A-T(R), A-G(N) 3 19 0,68 G-T(R), G-C(R), A-T(R), A-C(N) 3 25 0,68 G-T(R), G-G(R), A-T(R), A-G(N) 3 26 0,68 G-T(R), G-C(R), A-T(R), A-C(N) 3 27 0,68 G-A(R), G-C(R), A-A(R), A-C(N) 4 21 0,68 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 5 21 0,68 A-T(R), A-G(R), T-T(R), T-G(N) 6 21 0,68 T-T(R), T-G(R), A-T(R), A-G(N) 7 21 0,68 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 11 24 0,67 T-C(R), T-A(R), C-C(R), C-A(N) 11 30 0,67 T-C(R), T-G(R), C-C(R), C-G(N) 4 18 0,65 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 4 19 0,65 A-T(R), A-C(R), G-T(R), G-C(N) 4 25 0,65 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 4 26 0,65 A-T(R), A-C(R), G-T(R), G-C(N) 4 27 0,65 A-A(R), A-C(R), G-A(R), G-C(N) 5 18 0,65 A-T(R), A-G(R), T-T(R), T-G(N) 5 19 0,65 A-T(R), A-C(R), T-T(R), T-C(N) 5 25 0,65 A-T(R), A-G(R), T-T(R), T-G(N) 5 26 0,65 A-T(R), A-C(R), T-T(R), T-C(N) 5 27 0,65 A-A(R), A-C(R), T-A(R), T-C(N) 6 18 0,65 T-T(R), T-G(R), A-T(R), A-G(N) 6 19 0,65 T-T(R), T-C(R), A-T(R), A-C(N) 6 25 0,65 T-T(R), T-G(R), A-T(R), A-G(N) 6 26 0,65 T-T(R), T-C(R), A-T(R), A-C(N) 6 27 0,65 T-A(R), T-C(R), A-A(R), A-C(N) 7 18 0,65 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 7 19 0,65 A-T(R), A-C(R), G-T(R), G-C(N) 7 25 0,65 A-T(R), A-G(R), G-T(R), G-G(N) 7 26 0,65 A-T(R), A-C(R), G-T(R), G-C(N) 7 27 0,65 A-A(R), A-C(R), G-A(R), G-C(N) 1 29 0,63 T-A(R), T-T(R), TA-A(R), TA-T(N) 2 29 0,63 T-A(R), T-T(R), TAT-A(R), TAT-T(N) 3 29 0,63 G-A(R), G-T(R), A-A(R), A-T(N) 10 36 0,62 T-T(R), T-C(R), A-T(R), A-C(N) 11 34 0,62 T-C(R), T-A(R), C-C(R), C-A(N) 12 34 0,62 T-C(R), T-A(R), G-C(R), G-A(N) 14 20 0,62 G-G(R), G-A(R), A-G(R), A-A(N) 1 8 0,61 T-A(R), T-G(R), TA-A(R), TA-G(N) 2 8 0,61 T-A(R), T-G(R), TAT-A(R), TAT-G(N) 3 8 0,61 G-A(R), G-G(R), A-A(R), A-G(N) 4 29 0,61 A-A(R), A-T(R), G-A(R), G-T(N) 5 29 0,61 A-A(R), A-T(R), T-A(R), T-T(N) 6 29 0,61 T-A(R), T-T(R), A-A(R), A-T(N) 7 29 0,61 A-A(R), A-T(R), G-A(R), G-T(N) 21 32 0,6 T-G(R), T-C(R), G-G(R), G-C(N) 21 33 0,6 T-C(R), T-T(R), G-C(R), G-T(N) 21 35 0,6 T-A(R), T-G(R), G-A(R), G-G(N)
Tabel 4. Sekvenser for DNA-polymorfismeme. der er anført i tabel 1 og tabel 2.
Nummereringen er den samme som nummereringen i tabel 1 og tabel 2. DNA DNA-polymorfismes navn DNA-sekvens polymor-fisme nr.
1 AGKD01281000.1_4157[T/TA] AAGTT CTTTTTTTTT[-/A]TATAT G ACT AT CCTT
2 AGKD01281000.1_5527[T/TAT| TTGAGCACGTGTTTT[-/AT]GACGGTGTAGGAAGT
3 AGKD01021775.1_19790[G/A] ACGTACGCAGGCGCA[C/T]CCCTGCGATTTAGTG
4 AGKD01281000.1_5251[A/G] GGGAGGTCAGTGGGG[C/T]AGACAACTTAAAGCA
5 AGKD01281000.1_4338[A/T| T CTT CAGG AAAAAAA[A/T]AT AT AATTAGTGATT
6 AGKD01317469.1_245[T/A] CT ACAAACTTT CT C A[A/T] G GTATAG CAAAAAAT
7 AGKD01281000.1_5457[A/G] G AATG AAAG C ACTTT[C/T]TTGGT AT CCTATGCT
8 AGKD01028155.1_12812[A/G] GTCCTAACATTGAGC[C/T]GTGTTTGTTTGGCAG
9 AGKD01452978.1_5956[A/G] ACTATTTT AT CTGGC[C/T]CTTTCAATCAGTCCT
10 AGKD01039267.1_12921 |T/A] GATGATGGCCCCTAG[A/T]GAGTTACTGTAATGA
11 AGKD01059002.1_4664|T/C] ACATTATAAAAACAG[C/T]ATGAAGTGTACGTGT
12 AGKD01451885.1_830[T/G] CAGACAG ACACCT AC[A/C] AGTAGGCTATGTGTT
13 AGKD01003456.1_35321[A/G] ACAAAGTAAGGTGGG[C/T]GGTGCAGAGTTAGGC
14 AGKD01059002.1_16264[G/A] AGTTTCAAATGAAAT[A/G]TGAATCCTTCAGGAT
15 AGKD01452978.1_6935[A/G] GGTGAAATCATCGTG[C/T]ATAGGCTATCACAGT
16 AGKD01003456.1_36664[G/T] G AGTACAGTG C ACT C [A/C] G ACAG ACAG G CAC AC
17 AGKD01340746.1_282[C/T] TTTTT GAG GAG GAG G [A/G] AAAT ACATTGTGTT C
18 AGKD01062103.1_13615[T/G] TCTTTCACACATGAC[G/T]CCGTAATCCCGTTAC
19 AGKD01062103.1_13695[T/C] G CAG G CAG CG CTT G A[C/T] G G CG AATTGTTTT G A
20 AGKD01007787.1_13666[G/A] CATTTT ATGCATT AT[A/G]T ATCAGT G ATGTT AC
21 AGKD01059002.1_3603[T/G] AG ACAT AGGCT CAAA[G/T] AATTCCT C ACT G AG G
22 AGKD01000927.1 _15806[C/G] AGTGTGTTGCACATC[C/G]TGTCATGCAGACAAT
23 AGKD01458345.1 _5634[G/T] C ACACTTTGTCAACA[A/ C] ACAC ATATT ATGTTA
24 AGKD01083029.1 _8368[A/C] CTGCT AAT GT CCTTT[G/T]GTGGGTTT CTTTTGG
25 AGKD01062103.1 _13615[T/G] GTAACGGGATTACGG[A/C]GTCATGTGTGAAAGA
26 AGKD01062103.1 _13695|T/C] TCAAAACAATTCGCC[A/G]TCAAGCGCTGCCTGC
27 AGKD01032349.1 _7232[A/C] ACT CCCAGTGCTAAG[G/T]G AAGT CTCCAACATT
28 AGKD01032349.1 _14078[A/G] CCTCCTCTCCCTCCC[A/G]GAGTCTGATGCAATT
29 AGKD01051656.1 _1495[T/A] ATT CATTAATCCAGC[A/T] AT AGTTACTGGCACC
30 AGKD01083029.1 _5084[G/C] TGCCAGAGACCCCCA[C/G]TGGAGCGTTCAGGGT
31 AGKD01455926.1 _1814[G/A] AGTCAACCGCAGT AC[C/T]G AAGCAAG ACTGTAG
32 AGKD01003456.1 _1873[G/C] CGGACCAGGAGACAG[C/G]GACCCATCATTTCAT
33 AGKD01037589.1 _572[C/T] G C AAT GTT CAT CCTG [C/T]TTA ATT C ACC AAAT G
34 AGKD01037589.1 _1369[C/A] CGCTACAGAAATGAC[A/C]GAAAATACACACTTC
35 AGKD01205804.1 _11559[A/G] AGATTTAGGAGGGTT[C/T]GCTCAAAAT AAG AAA
36 AGKD01106761.1 _1717[T/C] TTATTCGGTGGTACC[C/T]ACTCTCAGAAATCTT 5. Undersøgelse af effekten af SNP-assisteret udvælgelse
Provokation 1: Et forsøg blev udført til test af effekten af implementering af den SNP-haplotypebaserede DNA-test, der er beskrevet ovenfor (1-4): Ved anvendelse af den haplotypebaserede DNA-test (med markørpar 3+23, se tabel 3) blev der udvalgt 4 ikke-resistente hanner, 6 resistente hanner, 6 ikke-resistente hunner og 4 resistente hunner fra
Aqua Gen-ynglepopulationen. Alle hanner blev krydset med alle hunner til frembringelse af de 4 grupper RxR, RxN, NxR og NxN, hvor RxR bestod af afkommet fra resistente hanner og resistente hunner, RxN bestod af afkommet fra resistente hanner og ikke-resistente hunner, NxR bestod af afkommet fra ikke-resistente hanner og resistente hunner, og NxN bestod af afkommet fra ikke-resistente hanner og ikke-resistente hunner. Grupperne blev transporteret til provokationstestanlægget (VESO Vikan, Namsos, Norge) ved en gennemsnitsstørrelse på
0. 2 g (yngel før start på fodring), fik startet fodring i løbet af 1 dag efter ankomst, blev akklimatiseret i henhold til standardoperationsproceduren (SOP) S-2023, blev passet og overvåget dagligt i henhold til S-2002 og S-2004. Døde fisk blev indsamlet hver dag i henhold til S-2000, og dødeligheden blev registreret. Miljøparametre blev registreret dagligt. Hver af grupperne RxR, RxN, NxR og NxN blev testet i to tanke ifølge en badprovokationsmodel (S-1079). Hver tank rummede 100 stk. yngel fra den respektive gruppe. Der blev anvendt frisk (det vil sige ikke frosset) infektiøs pankreasnekrosevirus, som kom fra et isolat af serotype SP 1, passage j.no. V-1244 (norsk vildstammeisolat fra 2001), hvor vækst og titrering af virusset var foregået ved Norwegian School of Veterinary Science (Oslo, Norge). To yderligere tanke blev inkluderet som kontroller. De indeholdt pseudoprovokerede fisk fra alle fire grupper. Resulterne fremgår af figur 1.
Figur 1: Dødeligheder i en IPN-provokationstest udført på fire forskellige grupper af fisk, der var frembragt ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i denne ansøgning. Alle fisk i gruppe NxN var ikke-resistente, alle fisk i grupperne NxR og RxN var semiresistente, mens alle fisk i gruppe RxR var resistente. Fisken i kontrolgruppen blev pseudoprovokeret, således at dødelighederne i denne gruppe viser forventede dødeligheder i fravær af virus.
Provokation 2: Dette forsøg blev udført til sammenligning afdødeligheden forårsaget af standardvirusisolatet V-1244, der blev isoleret i 2001, med dødeligheden forårsaget af en norsk vildstamme, der blev isoleret i 2012 fra et klækningsanlæg, der oplevede IPN-relateret dødelighed. Ved anvendelse den haplotypebaserede DNA-test (med markørpar 3+23, se tabel 3) blev 6 ikke-resistente hanner, 5 resistente hanner, 6 ikke-resistente hunner og 6 resistente hunner udvalgt fra Aqua Gen-ynglepopulationen. Alle hanner blev krydset med alle hunner til frembringelse af de 3 grupper RxR, RxN og NxN, hvor RxR bestod af afkommet fra resistente hanner og resistente hunner, RxN bestod af afkommet fra resistente hanner og ikke-resistente hunner samt afkommet fra ikke-resistente hanner og resistente hunner, og NxN bestod af afkommet fra ikke-resistente hanner og ikke-resistente hunner. Grupperne blev transporteret til provokationstestanlægget (VESO Vikan, Namsos, Norge) ved en gennemsnitsstørrelse på 0,2 g (yngel før start på fodring), fik startet fodring i løbet af 1 dag efter ankomst, blev akklimatiseret i henhold til standardoperationsproceduren (SOP) S-2023, blev passet og overvåget dagligt i henhold til S-2002 og S-2004. Døde fisk blev indsamlet hverdag i henhold til S-2000, og dødeligheden blev registreret. Miljøparametre blev registreret dagligt. Hver af grupperne RxR, RxN og NxN blev testet i to parallelle tanke for hver virusstamme (V-1244 og vildstammen) ifølge en badprovokationsmodel (S-1079). Hver tank rummede 100 stk. yngel fra den respektive gruppe. V-1244-stammen, der blev isoleret i 2001, var fremstillet af Norwegian School of Veterinary Science (Oslo, Norge), hvorimod vildstammen var opformeret og titreret af Vaxxinova Norway. Begge virusisolater blev opbevaret på køl indtil provokation. Én tank blev inkluderet som en negativ kontrol. Den indeholdt pseudo-provokeret fisk af alle tre genotyper. Provokationen blev termineret 45 dage efter provokation, og resultaterne fremgår af figur 2 og 3. Resultaterne viser, at RxR-fiskene (bestemt ved hjælp af fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse) er fuldt resistente over for begge IPNV-stammer.
Figur 2.
Kumulativ dødelighed i en badprovokation af atlantisk lakseyngel af forskellige IPN-QTL-genotyper provokeret med et velkendt testisolat af IPNV, V-1244 (figur 2) eller med en vildstamme isoleret fra et klækningsanlæg i 2012 (figur 3). 6. Sammenligning af kendte SNP’er med SNP’er ifølge den foreliggende opfindelse
Houston et al. (2012) identificerede enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP’er), der angiveligt var forbundet med resistens over for IPN. I deres videnskabelige meddelelse nævner de to SNP’er (kaldet Ssa0139ECIG og RADJHT01), som, de rapporterer, har en særlig kraftig forbindelse med IPN-resistens. SNP’en Ssa0139ECIG blev først rapporteret i en videnskabelig meddelelse af Moen et al., men dette studie rapporterede ikke nogen forbindelse til IPN-resistens. RADJHT01 blev rapporteret for første gang af Houston et al. (2012). SNP’en RADJHT01 blev identificeret uafhængigt af ansøgeren som en del af den sekventeringsbaserede screening for DNA-polymorfismer forbundet med IPN-resistens, der er diskuteret ovenfor. Den estimerede forbindelse til IPN-resistens blev dog fundet for svag til at berettige yderligere testning ved genotypebestemmelse, p-værdien (signifikansniveauet for SNP’en) var 0,0199, hvorimod genotypebestemmelsen for alle SNP’erne, der blev udvalgt til testning af den foreliggende opfinder, havde p-værdier under 0,005). SNP’en Ssa0139ECIG blev ikke identificeret uafhængig af ansøgeren, da denne SNP ikke var dækket af reference-DNA-sekvensen, der blev anvendt under ansøgerens søgning efter IPN-forbundne SNP’er. I stedet blev forbindelsen mellem denne SNP og IPN-resistens testet af ansøgeren ved hjælp af genotypebestemmelse af forældrefiskene til IPN-provokerede fisk, efterfulgt af statistisk test af effekten af SNP-genotyper hos disse forældrefisk på dødelighedsrater hos deres afkom (på samme måde som diskuteret ovenfor for den foreliggende opfindelse). Datasættet bestod af 285 helsøskendegrupper med registrerede dødelighedsrater og genotypebestemte forældrefisk. SNP’en AGKD01021775.1_19790[G/A], der er anført i tabel 1, blev indbefattet i analysen som en positiv kontrol.
Forbindelsen mellem SNP’en og IPN-resistens blev testet ved anvendelse af denne lineære model (én SNP ad gangen):
hvor y er en vektor for dødelighedsrater for alle helsøskendegrupper, μ er det samlede gennemsnit, u er en vektor for vilkårlige additive genetiske effekter hos forældrefisk, Zs og er fader- og moderfordelingsmatricer, p er en vektor for SNP-allelkopier hos forældrefiskene (0-4) for hver helsøskendegruppe, b er den vilkårlige regressionskoefficient, der er forbundet med antal parentale SNP-alleler, og e er en vektor for vilkårlige rester. Endvidere er
hvor A er numerator-forbindelses-matrixen for forældrefiskene,
3r den samlede additive genetiske (polygene) varians, <?£ er variansen for den vilkårlige regressionskoefficient, og a£er restvariansen for helsøskendegruppers dødelighedsrater.
Varianskomponenter blev estimeret for alle vilkårlige effekter (additiv genetisk fader & moder, vilkårlig regression af SNP-effekt og rest) ved anvendelse af REML-metoden med DMU-softwaren (Madsen og Jensen 2008). Til test af signifikansen for en SNP blev den fulde model sammenlignet med en reduceret model uden den vilkårlige regression på antallet af parentale SNP-alleler ved anvendelse af en sandsynlighedskvotienttest. SNP'en Ssa0139ECIG viste sig ikke at have nogen signifikant effekt på IPN-dødeligheden (p-værdi = 0,64), hvorimod SNP’en AGKD01021775.1_19790[G/A] var yderst signifikant (p-værdi = 2.86E-18). I den videnskabelige meddelelse af Houston et al. (2012) er det anført, at SNP’erne Ssa0139ECIG og RADJHT01 har kraftige (og omtrent tilsvarende) effekter på IPN-resistens. Resultaterne, der er beskrevet ovenfor, indikerer, at DNA-polymorfismerne beskrevet af Houston et al. (2012) har ringe eller ingen effekt på IPN-resistens i den testede population, mens DNA-polymorfismerne beskrevet i den foreliggende ansøgning har kraftige og yderst signifikante effekter.
Referencer
Houston RD, Haley CS, Hamilton A, Guy DR, Tinch AE, Taggart JB, McAndrew BJ, Bishop SC (2008) Major quantitative trait loci affect resistance to infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon (Salmo salar). Genetics 178:1109-15.
Houston RD, Davey JW, Bishop SC, Lowe, NR, Mota-Velasco JC et al. (2012) Characterisation of QTL-linked and genome-wide restriction site-associated DNA (RAD) markers in farmed Atlantic salmon. BMC Genomics 13: 244,
Lien S, Gidskehaug L, Moen T, Hayes BJ, Berg PR, Davidson WS, Omholt SW, Kent MP (2011) A dense SNP-based linkage map for Atlantic salmon (Salmo salar) reveals extended chromosome homeologies and striking differences in sex-specific recombination patterns. BMC Genomics 12: 615.
Madsen and Jensen (2008) DMU: a user's guide. A package for analysing multivariate mixed models, version 6, release 5.0. University of Aarhus, Tjele, Denmark.
Moen T, Hayes B, Baranski M, Berg PR, Kjøglum S, Koop BF, Davidson WS, Omholt SW, Lien S (2008) A linkage map of the Atlantic salmon (Salmo salar) based on EST-derived SNP markers. BMC Genomics 9: 223.
Moen T, Baranski M, Sonesson AK, Kjøglum S (2009) Confirmation and fine-mapping of a major QTL for resistance to infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon (Salmo salar): population-level associations between markers and trait. BMC Genomics 10: 368.
Shifman S, Kuypers J, Kokoris M, Yakir B, Darvasi A (2003) Linkage diseuilibrium patterns of the human genome across populations. Human Molecular Genetics 12: 771-776.
Thorsen J, Zhu B, Frengen E, Osoegawa K, de Jong, PJ, Koop BF, Davidson WS, Høyheim B (2005) A highly redundant BAC library of Atlantic salmon (Salmo salar): an important tool for salmon projects. BMC Genomics 6: 50.
Claims (8)
1. Fremgangsmåde til forudsigelse af resistens over for infektiøs pankreasnekrose hos atlantisk laks, hvilken fremgangsmåde omfatter bestemmelse af allelerne, der er til stede i en DNA-polymorfisme hos laksen, og forudsigelse af, hvorvidt eller ikke laksen er resistent over for infektiøs pankreasnekrose, på baggrund af bestemmelsen af allelerne, hvor DNA-polymorfismen er udvalgt blandt en hvilken som helst af: AGKD01281000.1_4157|T/TA]; AGKD01281000.1_5527|T/TAT]; AGKD01021775.1_19790[G/A]; AGKD01281000.1_5251[A/G]; AGKD01281000.1_4338[A/T]; AGKD01317469.1_245|T/A]; AGKD01281000.1_5457[A/G]; AGKD01028155.1_12812[A/G]; AGKD01452978.1_5956[A/G]; AGKD01039267.1_12921 [T/A]; AGKD01059002.1_4664[T7C]; og AGKD01451885.1_830[T/G].
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor DNA-polymorfismernes duelighed til at forudsige resistens over for IPN kan kvantificeres ved, at de har en i^-værdi, der er større end 0,3.
3. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor DNA-polymorfismen er udvalgt blandt en hvilken som helst af følgende: AGKD01281000.1_4157[T/TA]; AGKD01281000.1_5527[T/TAT]; AGKD01021775.1_19790[G/A]; AGKD01281000.1_5251[A/G]; og AGKD01281000.1_4338[A/T].
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor allelerne, der er til stede i en yderligere DNA-polymorfisme, bestemmes, og en forudsigelse af, hvorvidt eller ikke laksen er resistent overfor infektiøs pankreasnekrose, basseres på bestemmelsen af allelerne i begge DNA-polymorfismer.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor DNA-polymorfismen og den yderligere DNA- polymorfisme er udvalgt blandt ét hvilket som helst af parrene, der er anført i tabel 3.
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor den ene eller de flere DNA-polymorfismer er placeret på kromosom 26.
7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor trinet bestemmelse af allelerne, der er til stede i en DNA-polymorfisme hos laksen, udføres på en muskelvævsprøve, en blodprøve, en leverprøve eller et finneklip.
8. Fremgangsmåde til udvælgelse af en atlantisk laks til anvendelse som gydefisk, hvor laksen udvælges på baggrund af forudsigelsen ved hjælp af fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7 af, at laksen vil have resistens over for infektiøs pankreasnekrose.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB201212069 | 2012-07-06 | ||
| GBGB1212069.7A GB201212069D0 (en) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | Predicting resistance to disease |
| GB2013051800 | 2013-07-08 | ||
| PCT/GB2013/051800 WO2014006428A1 (en) | 2012-07-06 | 2013-07-08 | Predicting resistance to disease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK201400114A DK201400114A (en) | 2014-02-28 |
| DK178976B1 true DK178976B1 (da) | 2017-07-17 |
Family
ID=46766272
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK13739245.2T DK2870262T3 (da) | 2012-07-06 | 2013-07-08 | Forudsigelse af sygdomsresistens |
| DKPA201400114A DK178976B1 (da) | 2012-07-06 | 2014-02-28 | Forudsigelse af resistens over for sygdom |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK13739245.2T DK2870262T3 (da) | 2012-07-06 | 2013-07-08 | Forudsigelse af sygdomsresistens |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9920368B2 (da) |
| EP (1) | EP2870262B1 (da) |
| CA (1) | CA2878220A1 (da) |
| CL (1) | CL2015000008A1 (da) |
| DK (2) | DK2870262T3 (da) |
| ES (1) | ES2643478T3 (da) |
| GB (1) | GB201212069D0 (da) |
| RU (1) | RU2661100C2 (da) |
| WO (1) | WO2014006428A1 (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201212069D0 (en) | 2012-07-06 | 2012-08-22 | Aqua Gen As | Predicting resistance to disease |
| GB201400311D0 (en) * | 2014-01-08 | 2014-02-26 | Aqua Gen As | Treating Susceptibility |
| GB201400309D0 (en) * | 2014-01-08 | 2014-02-26 | Aqua Gen As | Predicting Resistance to disease |
| RU2754039C2 (ru) * | 2014-11-18 | 2021-08-25 | Аква Ген Ас | Способ прогнозирования резистентности |
| GB201522230D0 (en) * | 2015-12-16 | 2016-01-27 | Aquagen As | Characteristic test |
| GB201701480D0 (en) * | 2017-01-30 | 2017-03-15 | Aquagen As | Disease resistance |
| NO344938B1 (en) * | 2018-12-13 | 2020-07-20 | Patogen As | Pancreas Disease Virus Markers |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003263693A1 (en) * | 2002-09-10 | 2004-04-30 | Unni Grimholt | Disease resistance in salmon |
| RU2310848C1 (ru) * | 2006-04-11 | 2007-11-20 | ГОУ ВПО "Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ прогнозирования риска возникновения, клинического течения и исхода острого идиопатического панкреатита |
| GB201212069D0 (en) | 2012-07-06 | 2012-08-22 | Aqua Gen As | Predicting resistance to disease |
| USD1021775S1 (en) * | 2022-11-13 | 2024-04-09 | AUO Display Plus Corporation | Charging station |
-
2012
- 2012-07-06 GB GBGB1212069.7A patent/GB201212069D0/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-07-08 DK DK13739245.2T patent/DK2870262T3/da active
- 2013-07-08 CA CA2878220A patent/CA2878220A1/en not_active Abandoned
- 2013-07-08 RU RU2015100258A patent/RU2661100C2/ru active
- 2013-07-08 WO PCT/GB2013/051800 patent/WO2014006428A1/en not_active Ceased
- 2013-07-08 US US14/412,829 patent/US9920368B2/en active Active
- 2013-07-08 EP EP13739245.2A patent/EP2870262B1/en active Active
- 2013-07-08 ES ES13739245.2T patent/ES2643478T3/es active Active
-
2014
- 2014-02-28 DK DKPA201400114A patent/DK178976B1/da active
-
2015
- 2015-01-05 CL CL2015000008A patent/CL2015000008A1/es unknown
-
2017
- 2017-12-20 US US15/848,386 patent/US10711301B2/en active Active
- 2017-12-20 US US15/848,434 patent/US10711302B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US10711301B2 (en) | 2020-07-14 |
| WO2014006428A1 (en) | 2014-01-09 |
| ES2643478T3 (es) | 2017-11-23 |
| DK201400114A (en) | 2014-02-28 |
| US20180105875A1 (en) | 2018-04-19 |
| CL2015000008A1 (es) | 2015-12-04 |
| EP2870262A1 (en) | 2015-05-13 |
| EP2870262B1 (en) | 2017-08-16 |
| US20180127820A1 (en) | 2018-05-10 |
| US9920368B2 (en) | 2018-03-20 |
| US20150329903A1 (en) | 2015-11-19 |
| GB201212069D0 (en) | 2012-08-22 |
| RU2015100258A (ru) | 2016-08-27 |
| DK2870262T3 (da) | 2017-10-30 |
| CA2878220A1 (en) | 2014-01-09 |
| RU2661100C2 (ru) | 2018-07-11 |
| US10711302B2 (en) | 2020-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK178976B1 (da) | Forudsigelse af resistens over for sygdom | |
| US20100281547A1 (en) | Selecting animals for desired genotypic or potential phenotypic properties | |
| US20110123983A1 (en) | Methods of Using Genetic Markers and Related Epistatic Interactions | |
| Allais et al. | Mapping of QTL for chicken body weight, carcass composition, and meat quality traits in a slow-growing line | |
| EP2417269A1 (en) | Genetic marker identification in atlantic cod | |
| CA2708273A1 (en) | Methods of improving genetic profiles of dairy animals and products | |
| Sauvage et al. | Coding gene single nucleotide polymorphism mapping and quantitative trait loci detection for physiological reproductive traits in brook charr, Salvelinus fontinalis | |
| Taslima et al. | Genomic architecture and sex chromosome systems of commercially important fish species in Asia–Current status, knowledge gaps and future prospects | |
| Marchant et al. | Genetic variability revealed with microsatellite markers in an introduced population of the abalone Haliotis discus hannai Ino | |
| Goddardt | Animal breeding in the (post-) genomic era | |
| Dor et al. | Development of genetic markers for the white grouper (Epinephelus aeneus) | |
| RU2754039C2 (ru) | Способ прогнозирования резистентности | |
| US12104208B2 (en) | Genetic identification of Piscirickettsia salmonis resistant salmonids | |
| Georges et al. | Positional identification of structural and regulatory quantitative trait nucleotides in domestic animal species | |
| Adikari et al. | Association of Polymorphisms in the Cryptochrome-1 gene (Turcry1) with Growth and Reproductive Traist in Turkeys, Meleagris Gallopavo | |
| 輿石雄一 | Development and application of molecular genetic marker in the emu (Dromaius novaehollandiae) | |
| Travisany | High-throughput single nucleotide polymorphism (SNP) discovery and validation through whole-genome resequencing of hundreds of individuals in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) | |
| Bao | Comparison of Index Selection, BLUP, MAS, and Whole Genome Selection | |
| Christianson | Reproductive isolation and X chromosome meiotic drive in Cyrtodiopsis stalk-eyed flies |