DK2069476T3 - Metabolisk modificering af arabinose-fermenterende gærceller - Google Patents

Claims (26)

1. Gærcelle, der er i stand til at udtrykke følgende nukleotidsekvenser, hvor ekspressionen af disse nukleotidsekvenser bibringer gærcellen evnen til at udnytte L-arabinose og/eller omdanne L-arabinose til L-ribulose og/eller xylulose-5-phosphat og/eller til ethanol, i hvilken gærcelle udtrykkes: (a) en nukleotidsekvens, der koder for en arabinoseisomerase (araA), hvor nukleotidsekvensen er udvalgt fra gruppen, der består af: i. nukleotidsekvenser, der koder for en araA, hvilken araA omfatter en aminosyresekvens, der har mindst 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 1; ii. nukleotidsekvenser, der omfatter en nukleotidsekvens, der har mindst 80 % sekvensidentitet med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 2; iii. nukleotidsekvenser, hvis komplementære streng hybridiserer til et nukleinsyremolekyle med sekvensen ifølge (i) eller (ii); (b) en nukleotidsekvens, der koder for en L-ribulokinase (araB), hvor nukleotidsekvensen er udvalgt fra gruppen, der består af: i. nukleotidsekvenser, der koder for en araB, hvilken araB omfatter en aminosyresekvens, der har mindst 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 3; ii. nukleotidsekvenser, der omfatter en nukleotidsekvens, der har mindst 80 % sekvensidentitet med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 4; iii. nukleotidsekvenser, hvis komplementære streng hybridiserer til et nukleinsyremolekyle med sekvensen ifølge (i) eller (ii); og (c) en nukleotidsekvens, der koder for en L-ribulose-5-P-4-epimerase (araD), hvor nukleotidsekvensen er udvalgt fra gruppen, der består af: i. nukleotidsekvenser, der koder for en araD, hvilken araD omfatter en aminosyresekvens, der har mindst 80 % sekvensidentitet med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 5; ii. nukleotidsekvenser, der omfatter en nukleotidsekvens, der har mindst 80 % sekvensidentitet med nukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 6; iii. nukleotidsekvenser, hvis komplementære streng hybridiserer til et nukleinsyremolekyle med sekvensen ifølge (i) eller (ii), hvor hybridisering i punkterne iii. bestemmes under hybridiseringsbetingelser, der åbner mulighed for, at en nukleinsyresekvens på 200 nukleotider kan hybridisere ved en temperatur på 65 °C i en opløsning, der omfatter ca. 1 M salt, og vask ved 65 °C i en opløsning på ca. 0,1 M, hvor hybridiseringen udføres i 10 timer, og vask udføres i 1 time med to skift af vaskeopløsningen.

2. Gærcelle ifølge krav 1, hvor en, to eller tre af araA-, araB- og araD-nukleotidsekvenserne stammer fra en Lactobacillus-slægt, fortrinsvis en Lactobacillus plantarum- art.

3. Gærcelle ifølge krav 1 eller 2, hvor cellen er en gærcelle, der fortrinsvis tilhører en af slægterne: Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces eller Yarrowia.

4. Gærcelle ifølge krav 3, hvor gærcellen tilhører en af arterne: S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, 5. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus eller K. fragilis.

5. Gærcelle ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, hvor nukleotidsekvenserne, der koder for araA, araB og/eller araD, er operabelt koblet til en promotor, der katalyserer tilstrækkelig ekspression af de tilsvarende nukleotidsekvenser i cellen til at bibringe cellen evnen til at udnytte L-arabinose og/eller omdanne L-arabinose til L-ribulose og/eller xylulose-5-phosphat og/eller til ethanol.

6. Gærcelle ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, hvor gærcellen fremviser evnen til direkte isomerisering af xylose til xylulose.

7. Gærcelle ifølge krav 6, hvor gærcellen omfatter en genmodifikation, der øger strømningen i pentosephosphat-reaktionsvej en.

8. Gærcelle ifølge krav 6 eller 7, hvor genmodifikationen omfatter overekspression af mindst ét gen af den ikke-oxidative del af pentosephosphat-reaktionsvejen.

9. Gærcelle ifølge krav 8, hvor genet er udvalgt fra gruppen, der består af generne, der koder for ribulose-5-phosphatisomerase, ribulose-5-phosphatepimerase, transketolase og transaldolase.

10. Gærcelle ifølge krav 8, hvor genmodifikationen omfatter overekspression af mindst generne, der koder for en transketolase og en transaldolase.

11. Gærcelle ifølge et hvilket som helst af kravene 8 til 10, hvor gærcellen yderligere omfatter en genmodifikation, der øger den specifikke xylulosekinase-aktivitet.

12. Gærcelle ifølge krav 11, hvor genmodifikationen omfatter overekspression af et gen, der koder for en xylulosekinase.

13. Gærcelle ifølge et hvilket som helst af kravene 8 til 12, hvor genet, der overudtrykkes, er endogent for cellen.

14. Gærcelle ifølge et hvilket som helst af kravene 5 til 13, hvor gærcellen omfatter en genmodifikation, der reducerer uspecifik aldosereductase-aktivitet i gærcellen.

15. Gærcelle ifølge krav 14, hvor genmodifikationen reducerer ekspressionen af eller inaktiverer et gen, der koder for en uspecifik aldosereductase.

16. Gærcelle ifølge krav 15, hvor genet er inaktiveret ved deletion af mindst en del af genet eller ved ødelæggelse af genet.

17. Gærcelle ifølge krav 14 eller 15, hvor ekspressionen af hvert gen i gærcellen, der koder for en uspecifik aldosereductase, er reduceret eller inaktiveret.

18. Gærcelle ifølge et hvilket som helst af ovennævnte krav, hvor fermenteringsproduktet er ethanol.

19. Nukleinsyrekonstruktion, der omfatter en nukleinsyresekvens, der koder for en araA, en nukleinsyresekvens, der koder for en araB, og/eller en nukleinsyresekvens, der koder for en araD, alle som defineret i krav 1 eller 2.

20. Fremgangsmåde til fremstilling af ethanol, hvilken fremgangsmåde omfatter: a. fermentering af et medium, der indeholder en kilde af arabinose og eventuelt xylose, med en modificeret gærcelle ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 18, hvor gærcellen fermenterer arabinose og eventuelt xylose til ethanol; og eventuelt b. indvinding af ethanol.

21. Fremgangsmåde til fremstilling af ethanol, hvilken fremgangsmåde omfatter: a. fermentering af et medium, der indeholder mindst en kilde af L-arabinose og en kilde af xylose, med en gærcelle ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 18 og en gærcelle, der er i stand til at udnytte xylose og/eller fremviser evnen til direkte isomerisering af xylose til xylulose, hvorved hver gærcelle fermenterer L-arabinose og/eller xylose til ethanol; og eventuelt b. indvinding af fermenteringsproduktet.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 20 eller 21, hvor mediet også indeholder en kilde af glucose.

23. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 20-22, hvor den volumetriske ethanolproduktivitet er mindst 0,5 g ethanol pr. liter pr. time.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, hvor ethanoludbyttet er mindst 30 %.

25. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 20 til 24, hvor fremgangsmåden er anaerob.

26. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 20 til 24, hvor fremgangsmåden er aerob og fortrinsvis udføres under oxygenbegrænsede betingelser.