EA014165B1 - Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина - Google Patents

Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина Download PDF

Info

Publication number
EA014165B1
EA014165B1 EA200801344A EA200801344A EA014165B1 EA 014165 B1 EA014165 B1 EA 014165B1 EA 200801344 A EA200801344 A EA 200801344A EA 200801344 A EA200801344 A EA 200801344A EA 014165 B1 EA014165 B1 EA 014165B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
saccharide
conjugated
immunogenic composition
vaccine
Prior art date
Application number
EA200801344A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801344A1 (ru
Inventor
Ральф Леон Бьеман
Натали Мари-Жозеф Гаркон
Филипп Винсент Арман
Ян Пулман
Марсель Полетт Ван Мешлен
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39133667&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA014165(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0526232A external-priority patent/GB0526232D0/en
Priority claimed from GBGB0607088.2A external-priority patent/GB0607088D0/en
Priority claimed from GB0607087A external-priority patent/GB0607087D0/en
Priority claimed from GB0609902A external-priority patent/GB0609902D0/en
Priority claimed from GB0620337A external-priority patent/GB0620337D0/en
Priority claimed from GBGB0620336.8A external-priority patent/GB0620336D0/en
Priority claimed from GB0620815A external-priority patent/GB0620815D0/en
Priority claimed from GB0620816A external-priority patent/GB0620816D0/en
Priority claimed from PCT/GB2006/004634 external-priority patent/WO2007068907A2/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200801344A1 publication Critical patent/EA200801344A1/ru
Publication of EA014165B1 publication Critical patent/EA014165B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области конъюгатных вакцин на основе пневмококковых капсульных сахаридов. Конкретно, предложена поливалентная иммуногенная композиция на основе Streptococcus pneumoniae, содержащая различные конъюгированные капсульные сахариды из разных серотипов S. pneumoniae, конъюгированные с 2 или более разными белками-носителями, причем данная композиция содержит капсульный сахарид серотипа 19F, конъюгированный с дифтерийным анатоксином (DT) или CRM197, и возможно 19F является единственным сахаридом в данной композиции, конъюгированным с дифтерийным анатоксином (DT) или CRM197.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине на основе 8!гер!ососсик рпеитошае.
Предшествующий уровень техники
Дети в возрасте менее 2 лет не генерируют иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому требовалось сделать эти полисахариды иммуногенными путем химического конъюгирования с белком-носителем. Связывание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает этому полисахариду свойства Т-зависимости, включая переключение изотипов, созревание аффинности и индуцирование памяти.
Однако могут возникать проблемы с повторным введением конъюгатов полисахарид-белок или комбинации конъюгатов полисахарид-белок с образованием поливалентных вакцин. Например, сообщалось, что вакцину на основе полисахаридов Наеторййик шПиепхае типа Ь (Н1Ь) (РКР (полирибозилрибитол-фосфатный капсульный полисахарид)), в которой в качестве белка-носителя использован столбнячный анатоксин (ТТ), тестировали в диапазоне доз с одновременной иммунизацией (свободным) ТТ и вакциной на основе конъюгата пневмококковый полисахарид-ТТ, следуя стандартной схеме для детей. По мере увеличения дозы пневмококковой вакцины иммунный ответ на РКР полисахаридную часть Н1Ь конъюгатной вакцины снижался, что указывает на иммунное вмешательство полисахарида, возможно через использование одного и того же белка-носителя (Эадап е! а1., 1пГес1. 1ттип. (1998); 66: 2093-2098).
Было также доказано, что влияние дозы белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок является разносторонним. Как сообщалось, у маленьких детей увеличение дозы тетравалентного конъюгата на основе столбнячного анатоксина приводило к снижению ответа на столбнячный носитель (Эадап е! а1., см. выше). Классический анализ таких эффектов комбинированных вакцин был описан как индуцированная носителем супрессия эпитопов, что не совсем понятно, но представляется результатом избыточного количества белка-носителя (Райот, Уассше 17: 126 (1999)). По всей вероятности, это приводит к конкуренции за Тй-клетки между В-клетками к белку-носителю и В-клетками к полисахариду. Если преобладают В-клетки к белку-носителю, то Тй-клеток, способных обеспечить необходимую помощь специфичным к данному полисахариду В-клеткам, оказывается недостаточно. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты оказались противоречивы, так как в некоторых случаях общее количество белканосителя увеличивало иммунный ответ, а в других случаях снижало иммунный ответ.
Таким образом, остаются технические трудности при комбинировании множества полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.
8!гер!ососсик рпеитошае является грамположительной бактерией, ответственной за значительную заболеваемость и смертность (особенно среди детей и пожилых людей), вызывающей инвазивные заболевания, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, ассоциированные с колонизацией, такие как острый средний отит. Установлено, что частота заболеваемости пневмококковой пневмонией в США для людей в возрасте старше 60 лет составляет 3-8 на 100000 В 20% случаев это приводит к бактериемии и другим проявлениям, таким как менингит, с процентом смертности близким 30% даже при лечении антибиотиками.
Пневмококк окружен капсулой из связанного химическими связями полисахарида, который придает ему серотипическую специфичность. Существует 90 известных серотипов пневмококков, и такая капсула представляет собой ключевую детерминанту вирулентности для пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерии от комплемента, но и сама проявляет слабые иммуногенные свойства. Полисахариды являются Т-независимыми антигенами и не могут процессироваться или быть представленными на молекулах МНС (главного комплекса гистосовместимости) для взаимодействия с Т-клетками Однако они могут стимулировать иммунную систему посредством альтернативного механизма, включающего перекрестное связывание поверхностных рецепторов на В-клетках.
В некоторых экспериментах было показано, что защита от инвазивного пневмококковоого заболевания коррелирует наиболее сильно с антителом, специфичным к данной капсуле, и такая защита является серотипически специфичной.
8!гер!ососсик рпеитошае представляет собой самую распространенную причину инвазивного бактериального заболевания и среднего отита у младенцев и маленьких детей. Аналогично пожилые люди генерируют слабые ответы на пневмококковые вакцины [Кодйтапп е! а1., (1987), 1. Сегоп1о1. 42: 265-270], отсюда - возрастающая частота заболеваемости бактериальной пневмонией в этой популяции [Уегдйеке апй Вегк (1983) Мейюше (ВаШтоге) 62: 271-285].
Основные клинические синдромы, вызываемые 8. рпеитошае, хорошо известны и изучены во всех стандартных медицинских руководствах (Рейкоп Ό.8., Миксйег Ό.Μ. В: Р1о1к1п 8.А., Огепк!еш \У.Л.. ей11огк. Уассшек, 4'1' еййюп. РЫ1айе1рЫа \УВ 8аипйегк Со., 2004а: 529-588). Например, инвазивное пневмококковое заболевание (!РО) определяется как любая инфекция, при которой из крови или другого обычно стерильного места выделяют 8. рпеитошае (Миксйег Ό.Μ. 8!гер!ососсик рпеитошае. В: Мапйе11 С.Ь., ВеппеИ ЕЕ., Эойп К (ейк). Рг1пс1р1ез апй Ргасйсе оГ 1пГесйоик Шкеакек (5!й ей.). №\ν Уогк, СйигсйШ ЬМпдк!опе, 2001, р. 2128-2147). Признано, что хроническая обструктивная болезнь легких (СОРЭ) включает в себя несколько состояний (обструкцию дыхательных путей, хронический бронхит, бронхиолит или заболевание малых дыхательных путей и эмфизему), которые часто сосуществуют друг с другом. Пациенты
- 1 014165 страдают от обострений своего состояния, обычно ассоциированных с возросшей одышкой, и часто имеют усиленный кашель, в результате которого может продуцироваться слизь или гнойная мокрота (^ίίδοη, Еиг. Κθδρίτ. 1., 2001, 17: 995-1007). Физиологически СОРЭ определяют по наличию необратимой или частично обратимой обструкции дыхательных путей у пациентов с хроническим бронхитом и/или эмфиземой (Стандарты диагностики и лечения пациентов с хронической обструктивной болезнью легких. Американское торакальное общество (81апбатб5 Ют Не б1адпо818 апб саге οί рабеп18 νίΐΠ ейтоше оЬЧгиейме ри1топагу б18еа8е. Атепеап Тйогае1е 8ое1е1у. Ат. 1. Κοβρίτ. Сгй. Саге Меб., 1995 Νον; 152 (5 Р1 2): 877-121). Причиной осложнений СОРЭ часто является бактериальная (например, пневмококковая) инфекция (8е11н 8, Мигрйу ТЕ. Вае1епа1 шГеебоп ш ейтоше оЬПгиебме ри1топагу Фзеазе ш 2000: а 81а1е-оГ1йе-аг1 ге\зе\у. Сйп М1етоЬю1. Кем. 2001 Арг; 14(2): 336-63).
Поэтому целью настоящего изобретения является разработка улучшенной композиции конъюгатной вакцины на основе полисахаридов 81тер1оеоееи8 рпеитошае многих серотипов.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (уровни анти-Р8 1дС после двух инокуляций (ро81-П)). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность 11-валентного конъюгата у пожилых макак-резус. Более светлые столбцы представляют собой СМС (средние геометрические концентрации) после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в алюминий-фосфатном адъюванте. Более темные столбцы представляют собой СМС после двух инокуляций 11-валентного конъюгата в адъюванте С.
Фиг. 2. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (частота встречаемости анти-Р83 Вклеток памяти ро81-П). Гистограмма, на которой продемонстрированы В-клетки памяти в отношении Р83 после инокуляции 11-валентного конъюгата в адъюванте С или алюминий-фосфатном адъюванте.
Фиг. 3. Р819Е-Иммуногенность у Ва1Ь/С мышей (ро81-Ш уровни 1дС) Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 19Е у Ва1Ь/С мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных бР1у конъюгатов.
Фиг. 4. Р822Е-Иммуногенность у Ва1Ь/С мышей (ро81-Ш уровни 1дС). Гистограмма, на которой продемонстрирована иммуногенность в отношении полисахарида 22Е у Ва1Ь/С мышей для 4-валентных простых полисахаридов и 4-валентных Р1йЭ конъюгатов.
Фиг. 5. Уровни сывороточных анти-Р8 1дС антител. Гистограмма, на которой продемонстрирован анти-22Е ЦС-ответ у Ва1Ь/С мышей.
Фиг. 6. Опсонофагоцитарные титры. Гистограмма, на которой продемонстрированы анти-22Е опсонофагоцитарные титры у Ва1Ь/С мышей.
Фиг. 7. Сравнение 1дС-ответов, индуцированных при использовании новых адъювантов, по сравнению с ответом, вызываемым при использовании А1РО4. Гистограмма для сравнения 1дС-ответов, индуцированных у молодых С57В1 мышей после иммунизации 13-валентной конъюгатной вакциной, приготовленной в разных адъювантах.
Фиг. 8. Защитная эффективность комбинации белков Рй1Э +бР1у против легочной колонизации типом 19Е у макак-резус. Гистограмма, на которой продемонстрирована защитная эффективность разных вакцинных комбинаций в модели пневмонии у обезьян.
Фиг. 9. Сывороточный анти-РйЮ 1дС-ответ. Гистограмма, на которой продемонстрированы антиΡ111Ό 1дС-ответы у Ва1Ь/С мышей после иммунизации конъюгатами 22Е-РйЮ или 22Е-АН-РйЮ.
Фиг. 10. Защита против контрольного заражения пневмококками типа 4 у мышей после иммунизации 22Е-Р111Э или 22Е-АН-РйЮ.
Описание изобретения
В настоящем изобретении предложена улучшенная вакцина на основе 81тер1оеоееи8 рпеитошае, содержащая 10 или более (например, 11, 12, 13, 14 или 15 или более) капсульных сахаридов из 8. рпеитошае разных серотипов, конъюгированных с 2 или более белками-носителями, при этом данная вакцина содержит капсульный сахарид серотипа 19Е, конъюгированный с дифтерийным анатоксином или СКМ197, и где вакцина дополнительно содержит белок Ό из Наеторйбив шПиепхае в виде свободного белка или в качестве дополнительного белка-носителя, либо их обоих.
Для целей данного изобретения иммунизация человека-реципиента против обострений СОРИ, или лечение или предупреждение обострений СОРИ, или уменьшение тяжести обострений СОРИ относится к уменьшению возникновения обострений или частоты заболеваемости обострениями СОРИ (например, уменьшение частоты заболеваемости на 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% или более) либо уменьшению тяжести обострений СОРИ, как определено выше, например в группе пациентов, иммунизированных композициями или вакцинами по изобретению.
Обычно вакцины на основе 81тер1оеоееи8 рпеитошае по настоящему изобретению будут содержать капсульные сахаридные антигены (предпочтительно, конъюгированные), при этом сахариды происходят по меньшей мере из десяти серотипов 8. рпеитошае. Количество капсульных сахаридов 8. рпеитошае может меняться от 10 разных серотипов (или V, валентностей) до 23 разных серотипов (23У). В одном воплощении присутствуют 10, 11, 12, 13, 14 или 15 разных серотипов. В другом воплощении изобретения вакцина может содержать конъюгированные сахариды 8. рпеитошае и неконъюгированные сахари- 2 014165 ды 8. рпеитошае. Предпочтительно общее количество сахаридных серотипов меньше или равно 23. Например, данное изобретение может содержать 10 конъюгированных серотипов (сахаридов) и 13 неконъюгированных сахаридов. Аналогично, вакцина может содержать 11, 12, 13, 14, 15 или 16 конъюгированных сахаридов и 12, 11, 10, 9, 8 или 7 соответственно неконъюгированных сахаридов.
В одном из воплощений поливалентная пневмококковая вакцина по изобретению будет выбрана из следующих серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9У, 10А, 11А, 12Р, 14, 15В, 17Р, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р, хотя очевидно, что один или два другие серотипа могут быть заменены в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и географического места, где эту вакцину будут вводить, например, в этот перечень может быть включен серотип 6А. Например, 10-валентная вакцина может содержать полисахариды из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р. 11-валентная вакцина также может включать в себя сахариды из серотипа 3. 12- или 13-валентная педиатрическая (детская) вакцина также может включать в себя 10- или 11-валентную композицию, дополненную серотипами 6А и 19А, или 6 А и 22Р, или 19А и 22Р, или 6 А и 15В, или 19А и 15В, или 22Р и 15В, в то время как 13-валентная вакцина для пожилых людей может включать в себя 11-валентную композицию, дополненную серотипами 19А и 22Р, 8 и 12 Р, или 8 и 15В, или 8 и 19А, или 8 и 22Р, или 12Р и 15В, или 12Р и 19А, или 12Р и 22Р, или 15В и 19А, или 15В и 22Р. 14-валентная педиатрическая вакцина может включать описанную выше 10-валентную композицию, дополненную серотипами 3, 6А, 19А и 22Р; серотипами 6А, 8, 19А и 22Р; серотипами 6А, 12Р, 19А и 22Р; серотипами 6А, 15В, 19А и 22Р; серотипами 3, 8, 19А и 22Р; серотипами 3, 12Р, 19А и 22Р; серотипами 3, 15В, 19А и 22Р; серотипами 3, 6А, 8 и 22Р; серотипами 3, 6А, 12Р и 22Р; или серотипами 3, 6 А, 15В и 22Р.
В одном воплощении композиция включает капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9ν, 14, 18С, 19Р и 23Р (предпочтительно конъюгированные). В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 11 сахаридных антигенов (предпочтительно конъюгированных), например капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9ν, 14, 18С, 19Р и 23Р. В другом воплощении изобретения включены по меньшей мере 12 или 13 сахаридных антигенов, например, вакцина может содержать капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7Р, 9ν, 14, 18С, 19А, 19Р и 23Р, или капсульные сахариды, происходящие из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9ν, 14, 18С, 19А, 19Р, 22Р и 23Р, хотя и другие сахаридные антигены, например 23-валентной вакцины (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 8, 9Ν, 9ν, 10А, 11 А, 12Р, 14, 15В, 17С, 18С, 19А, 19Р, 20, 22Р, 23Р и 33Р), также охвачены изобретением.
Вакцина по настоящему изобретению может содержать белок Ό (ΡΌ) из НаеторЫ1и§ тПиепхае (см., например, ЕР 0594610). НаеторЫ1и§ тПиепхае представляет собой организм-возбудитель среднего отита, и авторы настоящего изобретения показали, что включение этого белка в вакцину на основе 81гер(оеосси8 рпеитошае будет обеспечивать уровень защиты в отношении среднего отита, связанного с НаеторЫ1и8 тПиепхае (ссылка на публикацию РОЕТ). В одном из воплощений вакцинная композиция содержит белок Ό (ΡΌ). В одном аспекте ΡΌ присутствует в качестве белка-носителя одного или более сахаридов. В другом аспекте ΡΌ может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В следующем аспекте белок Ό присутствует как в качестве белка-носителя, так и в виде свободного белка. Белок Ό может быть использован в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (\УО 0056360). В следующем аспекте белок Ό представлен в качестве белка-носителя для большинства сахаридов, например 6, 7, 8, 9 или более сахаридов могут быть конъюгированы с белком Ό. В этом аспекте белок Ό также может быть представлен в виде свободного белка.
Вакцина по настоящему изобретению содержит два или более разных типов белка-носителя. Каждый тип белка-носителя может выступать в качестве носителя для более чем одного сахарида, причем сахариды могут быть одинаковыми или разными. Например, серотипы 3 и 4 могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном из воплощений два или более разных сахаридов могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя.
Каждый капсульный сахарид 81тер!ососси8 рпеитошае может быть конъюгирован с белкомносителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, ΌΤ, СИМ197, фрагмента С из ТТ, ΡΗίΌ, слитых конструкций Ρ111ΩΕ (в частности, описанных в XVО 01/98334 и XVО 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка Ό, в отличие от сахарида из серотипа 19Р, который всегда конъюгирован с ΌΤ или СИМ 197, предпочтительно с ΌΤ. Более полный перечень белковых носителей, которые могут быть использованы в конъюгатах по изобретению, представлен ниже.
Если белковый носитель является одним и тем же для 2 или более сахаридов в композиции, эти сахариды могли бы быть конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (причем с молекулами носителя будут конъюгированы более 2-х разных сахаридов) [см., например? XVО 04/083251]. Альтернативно, каждый из сахаридов по отдельности может быть конъюгирован с разными молекулами белкового носителя (при этом с каждой молекулой белкового носителя конъюгирован только один тип сахарида).
Белок-носитель, конъюгированный с одним или более капсульными сахаридами 8. рпеитошае в
- 3 014165 конъюгатах, присутствующих в иммуногенных композициях по изобретению, возможно является членом белков полигистидинового триадного семейства (РП1), их фрагментами или слитыми белками. Белки РЫЛ, Р111В. РЫБ или РЫЕ могут иметь аминокислотную последовательность, идентичную на 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% последовательности, раскрытой в АО 00/37105 или АО 00/39299 (например, с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 из 8ЕО ГО N0: 4 в АО 00/37105 для РЫБ). Например, слитые белки состоят из полноразмерных 2, 3 или 4 РЫЛ, РЫВ, РЫБ, РЫЕ или их фрагментов. Примерами слитых белков являются РЫА/В, РЫА/Б, РЫА/Е, РЫВ/А, РЫВ/Б, РЫВ/Е, РЫБ/А, РЫБ/В, РЫБ/Е, РЫЕ/А, РЫЕ/В и РЫЕ/Б, причем белки связаны с белком, упомянутым первым на Ν-конце (см., например, АО 01/98334).
Там, где используются фрагменты РЫ белков (по отдельности или в виде части слитого белка), каждый фрагмент возможно содержит один или более чем один гистидиновый триадный мотив и/или участок двойной спирали таких полипептидов. Гистидиновый триадный мотив представляет собой часть полипептида, имеющего последовательность НххНхН, где Н является гистидином, а х является аминокислотой, отличной от гистидина. Участок двойной спирали представляет собой участок, спрогнозированный на основании алгоритма Сойк (Бирик, А. е! а1. (1991) 8с1епсе 252: 1162-1164). В одном из воплощений этот или каждый фрагмент включает один или более чем один гистидиновый триадный мотив, а также по меньшей мере один участок двойной спирали В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 гистидиновых триадных мотивов (возможно с нативной РЫ последовательностью между 2 или более триадами, либо внутритриадной последовательностью, более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100% идентичной нативной внутритриадной РЫпоследовательности пневмококков - например внутритриадной последовательности, показанной в 8ЕО ГО NО: 4 из АО 00/37105 для РЫБ). В одном из воплощений этот или каждый фрагмент содержит точно или по меньшей мере 2, 3 или 4 участка двойной спирали. В одном из воплощений РЫ белок, раскрытый в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Ν-конце), существующие в природе варианты РЫ-белка и иммуногенные фрагменты РЫ-белка (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в АО 00/37105 или АО 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфический для аминокислотной последовательности, указанной в АО 00/37105 или АО 00/39299).
В частности, термин РЫБ, как он использован в данном описании, включает полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например, 20 аминокислот на Ν-конце), существующие в природе варианты РЫБ и иммуногенные фрагменты РЫБ (например, фрагменты, которые описаны выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности РЫБ в АО 00/37105 или АО 00/39299, где указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для РЫБ аминокислотной последовательности, указанной в АО 00/37105 или АО 00/39299 (например, 5ЕО ГО 4 из АО 00/37105 для РЬГО)
Если белковый носитель является одинаковым для 2 или более сахаридов в композиции, эти сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (при этом молекулы носителя будут иметь еще 2 разных сахарида, конъюгированных с ним) [см., например АО 04/083251]. Альтернативно, каждый из сахаридов по отдельности может быть конъюгирован с разными молекулами белкового носителя (при этом с каждой молекулой белкового носителя конъюгирован только один тип сахарида).
Примерами белков-носителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются ΌΤ (дифтерийный анатоксин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмент С из ТТ, ΌΤ СКМ197 (мутант ΌΤ), другие точечные мутанты ΌΤ, такие как СКМ176, СКМ228, СКМ 45 (ИсЫйа е! а1. 1. Вю1. СЫет. 218: 3838-3844, 1973); СКМ 9, СКМ 45, СКМ102, СКМ 103 и СКМ107, и другие мутации, описанные в №с1ю11к апй Уои1е, 6епе11са11у Епдшеегей Τοχίηκ, Ей: Егаике1, Маесе1 Беккег 1пс., 1992; делеция или мутация О1ц-148 на Акр, О1п или 8ег и/или А1а 158 на О1у и другие мутации, раскрытые в И8 4709017 или И8 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Бук 516, Бук 526, РЫе 530 и/или Бук 534 и другие мутации, раскрытые в И8 5917017 или И8 6455673; или фрагмент, раскрытый в И8 5843711, пневмококковый пневмолизин (Кио е! а1. (1995) 1пГес1. 1ттип. 63: 2706-13), включая р1у, детоксифицмрованный каким-либо образом, например ЙРБУ-ОМВ8 (ОМВ8 означает №[д-малеимидобутирилокси]сульфосукцинимидный эфир) (АО 04081515, РСТ/ЕР 2005/010258) или йРБУ-формол, РЫХ, включая РЫА, РЫВ, РЫБ, РП1Е, и слитые конструкции РЫ! белков, например слитые конструкции РЫБЕ, слитые конструкции РЫВЕ (АО 01/98334 и АО 03/54007) (РЫ! А-Е описаны более подробно ниже), ОМРС (менингококковый белок наружной мембраны - обычно экстрагируемый из Ν. тешпдЫтйЫ серогруппы В - ЕР 0372501), РогВ (протохлорфиллид-оксидоредуктаза В) (из Ν. тешпдЫтйЫ), РБ (белок Б НаеторЫ1ик шПиепхае - см., например, ЕР 0594610 В) или их иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (АО 93/17712, АО 94/03208), коклюшные белки (АО 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, ростовые факторы или
- 4 014165 гормоны (\νϋ 91/01146), искусственные белки, содержащие многочисленные человеческие С.П4+ Тклеточные эпитопы из различных антигенов, происходящих из патогенов (Ра1ид1 е! а1. (2001) Еиг. 1. 1ттипо1. 31: 3816-3824), такие как белок N19 (Вага1бо1 е! а1. (2004) 1пГес!. 1ттип. 72: 4884-7), пневмококковый поверхностный белок ΡκρΆ (νΟ 02/091998), железосвязывающие белки (νΟ 01/72337), токсин А или В из С. б1Гйсйе (νΟ 00/61761). В Шгкка е! а1., Реб1а1г1с ктГесбоик Э^еа^е 1оитиа1, 23(11): 1008-14, 2004 Νον. описана 11-валентная пневмококковая вакцина со всеми серотипами, конъюгированными с ΡΌ. Однако авторы настоящего изобретения показали, что опсонофагоцитарная активность была улучшенной в отношении антител, индуцированных конъюгатами, имеющими 19Р, конъюгированный с ΌΤ, по сравнению с 19Р, конъюгированным с ΡΌ. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что более высокая перекрестная реактивность в отношении 19А наблюдается при использовании 19Р, конъюгированного с ΌΤ. Следовательно, особенностью композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197. В одном аспекте серотип 19Р конъюгирован с ΌΤ. Все остальные сахаридные серотипы иммуногенной композиции могут быть конъюгированы с одним или более белками-носителями, не являющимися ΌΤ (т.е. только 19Р конъюгирован с ΌΤ), или могут быть распределены между одним или более белками-носителями, не являющимися ΌΤ, и самим ΌΤ. В одном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197, а все остальные серотипы конъюгированы с ΡΌ. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ и ТТ, или ΌΤ, или СКМ 197. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197 и не более чем один сахарид конъюгирован с ТТ. В одном аспекте этого воплощения одним указанным сахаридом является 18С или 12Р. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197 и не более чем два сахарида конъюгированы с ТТ. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и ΌΤ или СКМ 197. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и пневмолизином. В еще одном воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ и СКМ 197. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ, пневмолизином и возможно Ρ111Ω или слитым белком ΡΙιΐΩ/Е. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ 197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, а остальные серотипы распределены между ΡΌ, ТТ, пневмолизином и возможно Ρ111Ω или слитым белком ΡΙιΐΩ/Е. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином или ТТ, еще один (два или три) сахарид(а) конъюгирован(ы) с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с Ρ111Ω или ΡΙιΐΩ/Е. а все остальные сахариды конъюгированы с ΡΌ. В другом воплощении 19Р конъюгирован с ΌΤ или СКМ197, 19А конъюгирован с пневмолизином, еще один (два или три) сахарид(а) конъюгирован(ы) с ТТ, еще один сахарид конъюгирован с пневмолизином, еще 2 других сахарида конъюгированы с Ρ111Ω или ΡΗίΌ/Е, а все остальные сахариды конъюгированы с ΡΌ.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит белок Ό из НаеторЫ1ик шПиепхае. В этом воплощении, если ΡΌ не является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования с любыми сахаридами, отличными от 19Р, например 19Р конъюгирован с ΌΤ, в то время как другие серотипы конъюгированы с одним или более другими белками-носителями, не являющимися ΡΌ, тогда ΡΌ будет присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. Если ΡΌ является одним из белков-носителей, используемых для конъюгирования сахаридов, отличных от 19Р, тогда ΡΌ возможно может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка.
Термин сахарид в данном описании может указывать на полисахарид или олигосахарид и включает в себя их оба. Полисахариды выделяют из бактерий, и они могут быть до некоторой степени доведены до определенного размера известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525) и предпочтительно микрофлюидизацией. Полисахариды могут быть доведены до определенного размера с целью снижения вязкости полисахаридных образцов и/или для улучшения фильтруемости конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют небольшое количество повторяющихся единиц (обычно 5-30 повторяющихся единиц) и обычно представляют собой гидролизованные полисахариды.
Капсульные полисахариды §1тер1ососси8 рпеитошае содержат повторяющиеся олигосахаридные единицы, которые могут содержать вплоть до 8 сахарных остатков. Обзора по олигосахаридным единицам ключевых серотипов §1тер1ососси8 рпеитошае см. в 1ΟΝΕ8, Сйпкйрйег, Уассшек Ьакеб оп 111е се11 кигГасе сатЬойубга1е8 оГ раЮдешс Ьас1епа. Ап. Асаб. Вгак. С1епс, 1ипе 2005, νο1. 77, № 2, р. 293-324. Ι88Ν 0001-3765. В одном воплощении капсульный сахаридный антиген может представлять собой полноразмерный полисахарид, однако в других воплощениях это может быть одна олигосахаридная единица или более короткая, чем длина нативной цепи, сахаридная цепь из повторяющихся олигосахаридных единиц. В одном воплощении все сахариды, присутствующие в вакцине, являются полисахаридами. Полноразмерные полисахариды могут быть доведены до определенного размера, т.е. их размер может быть уменьшен различными способами, такими как обработка посредством кислотного гидролиза, обработка перекисью водорода, уменьшение размера с помощью ети181Г1ех® с последующей обработкой перекисью водорода для образования олигосахаридных фрагментов или микрофлюидизация.
Авторы изобретения также отмечают, что в данной области техники внимание было сфокусировано на применении олигосахаридов для облегчения получения конъюгатов. Авторы изобретения обнаружи
- 5 014165 ли, что в результате использования нативных или слегка уменьшенных в размере полисахаридных конъюгатов может быть реализовано одно или более чем одно из следующих преимуществ: 1) конъюгат с высокой иммуногенностью, являющийся фильтруемым, 2) соотношение полисахарида и белка в конъюгате может быть изменено таким образом, чтобы увеличить отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате (что может влиять на эффект супрессии носителем), 3) иммуногенные конъюгаты, имеющие склонность к гидролизу, могут быть стабилизированы посредством применения больших по размеру сахаридов для конъюгирования. Применение больших по размеру полисахаридов может приводить к большему сшиванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из конъюгата. В конъюгатных вакцинах, описанных в предшествующем уровне техники, имеется тенденция к деполимеризации полисахаридов перед конъюгированием для улучшения конъюгирования. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сахаридные конъюгатные вакцины, сохраняющие больший размер сахарида, могут вызывать хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания.
Таким образом, иммуногенная композиция по изобретению может содержать один или более чем один сахаридный конъюгат, где средний размер (например, средневзвешенная молекулярная масса; М„) каждого сахарида перед конъюгированием составляет более 80, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 кДа. В одном воплощении один или более чем один сахаридный конъюгат по изобретению имеет средний размер сахарида перед конъюгированием, равный 50-1600, 80-1400, 100-1000, 150-500 или 200-400 кДа (отметим, что, когда средний размер представляет собой М„, единицы кДа следует заменить в данном описании на х103). В одном воплощении конъюгат после конъюгирования должен легко фильтроваться через фильтр 0,2 мкм, так чтобы после фильтрации получался выход более 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с образцом до фильтрации.
Для целей данного изобретения нативный полисахарид относится к сахариду, который не был подвергнут обработке (например, последующей очистке), целью которой является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может стать немного меньшим по размеру в ходе обычных процедур очистки Такой сахарид все еще является нативным. Только если полисахарид был подвергнут процедурам уменьшения размера, такой полисахарид не считается нативным.
Для целей данного изобретения уменьшенный в размере вплоть до 2 раз означает, что сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого сахарида, но с сохранением размера, равного более чем половине размера нативного полисахарида. Х3, х4 и тд. следует интерпретировать таким же образом, т.е. сахарид подвергается обработке, предназначенной для уменьшения размера этого полисахарида, но с сохранением размера, равного более чем трети, четверти и т.д. размера нативного полисахарида.
В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 8!тер1ососси5 рпеитошае по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или каждый сахарид 8. рпеитошае представляет собой нативный полисахарид.
В одном из аспектов изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды 8!тер1ососси5 рпеитошае по меньшей мере из 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или все сахариды 8. рпеитошае уменьшены в размере вплоть до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз. В одном воплощении этого аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов, уменьшены в размере вплоть до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 или х10 раз.
Молекулярная масса или средняя молекулярная масса (или размер) сахарида в данном описании относится к средневзвешенной молекулярной массе (М„) сахарида, измеренной до конъюгирования, и ее измеряют с помощью МАЬЬ8 (многоуглового рассеяния лазерного света).
Методика МАЬЬ8 хорошо известна в данной области техники, и ее обычно выполняют, как описано в примере 2. Для МАТЬ8-анализа пневмококковых сахаридов можно использовать в комбинации две колонки (Т8КС6000 и 5000Ρνχ1), и сахариды элюируют в воде. Сахариды детектируют, используя детектор рассеяния света (например, ννηΙΙ Эачп Ό8Ρ, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и инферометрический рефрактометр (наприме, ννηΙΙ Ой1аЬ Ό8Ρ, оборудованный ячейкой Р100 и красным светофильтром на 498 нм).
В одном из воплощений сахариды 8. рпеитошае представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, размер которых был уменьшен в процессе обычного процесса экстракции.
В одном из воплощений сахариды 8. рпеитошае уменьшены в размере посредством механического расщепления, например микрофлюидизацией или обработкой ультразвуком. Микрофлюидизация и воздействие ультразвука имеют преимущество, уменьшая размер более крупных нативных полисахаридов в степени, достаточной для получения фильтруемого конъюгата. Уменьшение в размере осуществляют в не более чем х20, х10, х8, х6, х5, х4, х3 или х2 раза.
В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит конъюгаты 8. рпеитошае, которые приготовлены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые уменьшены в размере не более чем в х20 раз. В одном аспекте этого воплощения большая часть сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов, уменьшены в размере вплоть до х2, х3, х4, х5 или х6 раз.
В одном из воплощений сахарид 8!тер1ососси5 рпеитошае конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Линкер возможно является гетеробифункциональным или
- 6 014165 гомобифункциональным, имеющим, например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную карбоновокислотную группу, 2 реакционноспособные аминогруппы или две реакционноспособные карбоновокислотные группы. Линкер имеет, например, 4-20, 4-12, 5-10 атомов углерода. Возможным линкером является ΆΌΗ (дигидразид адипиновой кислоты). Другие линкеры включают Впропионамидо (АО 00/10599), нитрофенил-этиламин (Ссусг е! а1. (1979) Меб. М1сгоЫо1. 1ттипо1. 165: 171-288), галогеноалкилгалогениды (И8 4057685), гликозидные связи (И8 4673574, И8 4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (И8 4459286). В одном из воплощений в качестве линкера для конъюгирования сахарида из серотипа 18С используют ΆΌΗ. В одном из воплощений в качестве линкера для конъюгирования сахарида из серотипа 22Р используют ΆΌΗ.
Сахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению, могут быть получены любым известным методом сочетания. Способ конъюгирования может быть основан на активации сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (СЭАР) с образованием сложного цианатного эфира. Таким образом, активированный сахарид может быть подвергнут сочетанию непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно связать с носителем через простую тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с малеимид-активированным белком-носителем (например с использованием СМВ8) или галогеноацетилированным белком-носителем (например с использованием иодацетимида [например, этилиодацетимида НС1] или Ν-сукцинимидил-бромацетат или 81АВ (Ы-сукцинимидил-(4-иодацетат)аминобензоат), или 81А (Ν-сукцинимидил-иодацетат), или 8ВАР (№сукцинимидил-3-(бромацетатамидо)пропионат)). Предпочтительно, цианатный сложный эфир (возможно полученный посредством СЭАРхимии) подвергают сочетанию с гексан-диамином или ΑΌΗ, и аминопроизводный сахарид конъюгируют с белком-носителем, используя карбодиимидную (например БОАС или БОС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид)) химию, через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке АО 93/15760 (ИпгТогтеб 8егу1се§ Ишуегайу) и АО 95/08348 и АО 96/29094.
В других подходящих методиках используются карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборнан, лара-нитробензойная кислота, Ν-гидроксисукцинимид (ΝΗ8), 8-ΝΗ8 (сульфо-ΝΗδ), БОС, ΤδΤϋ (О-(№сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат). Многие методики описаны в АО 98/42721. В конъюгирование может быть вовлечен карбонильный линкер, который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с СЭ1 (1,1'-карбонилдиимидазол) (Ве1йе11 е! а1. 1. Вю1. Сйет. 1979, 254: 2572-4; ^ат е! а1. 1. Сйгота!одг. 1981, 218: 509-18) и последующего взаимодействия с белком с образованием карбаматной связи. Этот способ может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможное введение защиты/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с ί'ΌΙ с образованием СЭ1-карбаматного промежуточного соединения и сочетание СЭ1-карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.
Конъюгаты также могут быть получены методами прямого восстановительного аминирования, как описано в И8 4365170 (1епп1п§5) и И8 4673574 (Апбегаоп). Другие методы описаны в ЕР-0161188, ЕР208375 и ЕР-0477508.
Другой способ включает сочетание активированного бромцианом (или СЭАР) сахарида, дериватизированного с использованием дигидразида адипиновой кислоты (ΛΩΗ). с белковым носителем посредством карбодиимидной конденсации (Сйи С. е! а1. 1п1ес!. 1ттипИу, 1983, 245-256), например с использованием БЭАС.
В одном из воплощений гидроксильную группу (предпочтительно активированную гидроксильную группу, например гидроксильную группу, активированную с целью получения цианатного сложного эфира [например, используя СЭАР]) на сахариде связывают с аминогруппой или карбоксильной группой на белке либо непосредственно, либо опосредовано (через линкер). Если присутствует линкер, то гидроксильную группу на сахариде предпочтительно связывают с аминогруппой на линкере, например, используя БЭАР-конъюгирование. Другая аминогруппа в линкере (например АОИ) может быть конъюгирована с группой карбоновой кислоты на белке, например с использованием карбодиимидной химии, например путем использования БОАС. В одном из воплощений пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы) конъюгируют с линкером до того, как линкер конъюгируют с белком-носителем. Альтернативно, линкер может быть конъюгирован с носителем до конъюгирования с сахаридом.
Также можно применять комбинацию методик, при этом некоторые конъюгаты сахарид-белок получают с использованием СЭАР, а некоторые путем восстановительного аминирования.
В общем случае для связывания/конъюгирования могут быть использованы следующие типы химических групп на белковом носителе:
а) карбоксильная (например, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу связывают с аминогруппами на сахаридах непосредственно или с аминогруппой на линкере, используя карбодиимидную химию, например ЕЭАС;
б) аминогруппа (например, через лизин). В одном воплощении эту группу связывают с карбоксиль
- 7 014165 ными группами на сахаридах непосредственно или с карбоксильной группой на линкере, используя карбодиимидную химию, например ЕОАС. В другом воплощении эту группу связывают с гидроксильными группами, активированными СЭЛР или СЫВг на сахаридах непосредственно или с такими же группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами, имеющими сукцинимидную эфирную группу;
в) сульфгидрил (наприме, через цистеин). В одном воплощении эту группу связывают с бром- или хлор-ацетилированным сахаридом или линкером, используя малеимидную химию. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
г) гидроксильная группа (например, через тирозин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
д) имидазолильная группа (например, через гистидин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином;
е) гуанидильная группа (например, через аргинин);
ж) индолильная группа (например, через триптофан).
В общем случае для связывания на сахариде можно использовать следующие группы: ОН, СООН или ΝΗ2. Альдегидные группы могут быть образованы в результате разных обработок, известных в данной области техники, таких как: обработка периодатом, кислотный гидролиз, обработка перекисью водорода и т.д.
Подходы на основе прямого связывания:
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СОАР -> цианатный эфир + ΝΗ2-6θποκ -> конъюгат;
сахарид-альдегид + ИНг-белок основание Шиффа + НаСИВН3 ->
конъюгат;
сахарид-СООН + ИН2-белок + ЕОАС -> конъюгат;
сахарид-ЫНг + СООН-белок + ЕОАС -» конъюгат.
Подходы на основе непрямого связывания через спейсер (линкер):
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СОАР -> цианатный эфир + ΝΗ2—ΝΗ2 ->
сахарид—ΝΗ2 + СООН-белок + ЕОАС -> конъюгат;
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СОАР -> цианатный эфир + ΝΗ2—5Н сахарид—ЗН + 8Н-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например ЗРОР(Н-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат)) -> сахарид-8-8-белок;
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СОАР -> цианатный эфир + ΝΗ2----8Η ->
сахарид—8Н + малеимид-белок (модификация аминогрупп) -> конъюгат;
сахарид-ОН + ΟΝΒγ или СОАР -> цианатный эфир + ΝΗ2—8Н ->
сахарид-8Н + гапогенацетилированный белок -> конъюгат;
сахарид-СООН + ЕОАС + ΝΗ2—ΝΗ2 -> сахарид—ΝΗ2 + ЕОАС + СООНбелок конъюгат;
сахарид-СООН + ЕЭАС+ ΝΗ2—8Н сахарид—ЗН + 8Н-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с помощью, например, ЗРОР) -> сахарид-8-8белок;
сахарид-СООН + ЕОАС+ ΝΗ2—-ЗН -> сахарид-—8Н + малеимид-белок (модификация аминогрупп) -+ конъюгат;
сахарид-СООН + ЕОАС + ΝΗ2--8Η -> сахарид-8Н + гапогенацетилированный белок конъюгат сахарид-альдегид + ΝΗ2—ΝΗ2 -> сахарид—ΝΗ2 + ЕОАС + СООН-белок
-> конъюгат.
Примечание: вместо указанного выше ЕОАС можно использовать любой подходящий карбодиимид.
- 8 014165
Таким образом, типами химических групп белкового носителя, которые обычно могут быть использованы для сочетания с сахаридом, являются аминогруппы (например, на остатках лизина), группы СООН (например, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и группы 8Н (если это приемлемо) (например на остатках цистеина).
Предпочтительно, соотношение белка-носителя и сахарида 8. рпеитошае составляет от 1:5 до 5:1, например 1:0,5-4:1, 1:1-3,5:1, 1,2:1-3:1, 1,5:1-2,5:1; например 1:2 - 2,5:1; 1:1 - 2:1 (мас./мас.). В одном воплощении большинство конъюгатов, например 6, 7, 8, 9 или более конъюгатов, имеют соотношение белка-носителя к сахариду выше 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1.
В одном из воплощений по меньшей мере один сахарид 8. рпеитошае конъюгирован с белкомносителем через линкер с использованием ΟΏΛΡ и ΕΩΛΟ. Например, 18С или 22Р может быть конъюгирован с белком через линкер (например линкер с двумя группами гидразино на концах, такой как ΛΩΗ) с использованием ΟΏΛΡ и ΕΩΛΟ, как описано выше. При использовании линкера ΟΏΛΡ можно использовать для конъюгирования сахарида с линкером, и ΕΩΛΟ затем можно использовать для конъюгирования линкера с белком или, альтернативно, сначала ΕΩΛΟ может быть использован для конъюгирования линкера с белком, после чего ΟΌΛΡ может быть использован для конъюгирования линкера с сахаридом.
В общем случае иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата от 0,1 до 20 мкг, от 1 до 10 мкг или от 1 до 3 мкг сахарида.
В одном из воплощений иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный сахарид 8. рпеитошае в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида. В одном из воплощений капсульные сахариды могут быть представлены в разных дозировках, например, некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 1 мкг или некоторые капсульные сахариды могут быть представлены в дозе точно 3 мкг В одном из воплощений сахариды из серотипов 3, 18С и 19Р (или 4, 18С и 19Р) представлены в более высокой дозе, чем другие сахариды. В одном аспекте этого воплощения серотипы 3, 18С и 19Р (или 4, 18С и 19Р) представлены в дозе приблизительно или точно 3 мкг, в то время как другие сахариды в иммуногенной композиции представлены в дозе приблизительно или точно 1 мкг.
Около или приблизительно определяют как нахождение в пределах больше или меньше 10% от приведенной цифры для целей данного изобретения.
В одном из воплощений по меньшей мере один из капсульных сахаридов 8. рпеитошае непосредственно конъюгирован с белком-носителем (например, с использованием одного из описанных выше химических превращений). Предпочтительно по меньшей мере один из капсульных сахаридов 8. рпеитошае непосредственно конъюгирован с использованием ΟΩΛΡ. В одном из воплощений большинство капсульных сахаридов, например 5, 6, 7, 8, 9 или более, непосредственно связаны с белком-носителем с использованием ΟΩΛΡ (см. νθ 95/08348 и νθ 96/29094).
Иммуногенная композиция может содержать белки 81тер1ососси8 рпеитошае, называемые в данном описании как белки 81гер1ососси8 рпеитошае по изобретению. Такие белки могут быть использованы в качестве белков-носителей, или могут быть представлены в виде свободных белков, или могут быть представлены как в качестве белков-носителей, так и в виде свободных белков. Белки 81тер1ососси8 рпеитошае по изобретению либо экспонированы на поверхности, по меньшей мере в течение части жизненного цикла пневмококка, либо являются белками, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Предпочтительно белки по изобретению выбраны из следующих категорий, таких как белки, имеющие мотив сигнальной последовательности II типа ΩΧΧΟ (где X представляет собой любую аминокислоту, например полигистидиновое триадное семейство (Ρ111Χ)). холинсвязывающие белки (Ο^Χ). белки, имеющие мотив сигнальной последовательности I типа (например 8р101), белки, имеющие мотив ЬРХТС (где X представляет собой любую аминокислоту, например 8р128, 8р130) и токсины (например Р1у). Предпочтительными примерами среди этих категорий (или мотивов) являются следующие белки или их иммунологически функциональные эквиваленты.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере 1 белок, выбранный из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (ΡΗ1Χ), семейства холинсвязывающих белков (Ο^Χ), укороченных Ο^Χ, Ьу1Х-семейства, укороченных Ьу1Х, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный ΟЬрX-укороченный ΕλΊΧ, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА, 8р128, 8р101, 8р130, 8р125 и 8р133. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (ΡΗ1Χ), семейства холинсвязывающих белков (Ο^Χ), укороченных Ο^Χ, ^уΐX-семейства, укороченных ΡαΙΧ, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный ΟЬрX-укороченный ΕνίΧ, пневмолизина (Р1у), РкрА, РкаА и 8р128. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более чем два белка, выбранных из группы, состоящей из полигистидинового триадного семейства (ΡΗ1Χ), семейства холинсвязывающих белков (Ο^Χ), укороченных Ο^Χ, Ьу 1Χ-семейства, укороченных ΕλΊΧ, химерных белков (или слитых конструкций) укороченный ΟЬрX-укороченный ΕλΊΧ, пневмолизина (Р1у) и 8р128.
Р111 (полигистидиновое триадное)-семейство включает белки РЙ1А, РМВ, Ρ111Ω и Ρ111Ε. Это семейство характеризуется липидированной последовательностью, двумя доменами, разделенными пролин
- 9 014165 обогащенным участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно вовлеченными в связывание металлов или нуклеозидов или ферментативную активность, (3-5)-участками двойной спирали, консервативным Ν-концом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестируемых штаммах пневмококков. Гомологичные белки также были обнаружены у других стрептококков и нейсеррий. В одном из воплощений изобретения Р1Ч белок по изобретению представляет собой Ρ111Ό. Однако понятно, что термины Р111 А, В, Ό и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в приведенных ниже ссылках, а также к их существующим в природе (и искусственным) вариантам, имеющим гомологию последовательностей, которая по меньшей мере на 90% идентична белкам из ссылок. Предпочтительно, она идентична по меньшей мере на 95% и, наиболее предпочтительно идентична на 97%.
Что касается белков Р1ДХ. то Р111Л раскрыт в \УО 98/18930 и также упоминается как 8р36. Как указано выше, он является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. Ρ111Ό раскрыт в \УО 00/37105 и также упоминается как 8р036Э. Как указано выше, он также является белком полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. Р1йВ раскрыт в \УО 00/37105 и также упоминается как 8р036В. Другим членом РМВ-семейства является С3деградированный полипептид, как раскрыто в \УО 00/17370. Этот белок также принадлежит полигистидиновому триадному семейству, и он имеет сигнальный мотив II типа ЬХХС. Предпочтительным иммунологически функциональным эквивалентом является белок 8р42, раскрытый в \УО 98/18930. Укороченный Р1ПВ (приблизительно 79 кДа) раскрыт в XVО 99/15675, и также считается членом Р1!Х-семейства. РЫБ раскрыт в VО 00/30299 и упоминается как ВУН-3. Когда в данном описании упоминается РП1белок, это означает, что могут быть использованы иммуногенные фрагменты или слитые конструкции этого Р1й белка. Например, ссылка на Р1йХ включает в себя иммуногенные фрагменты или слитые конструкции любого РН1 белка. Ссылка на Р1йЭ или Р111В также является ссылкой на слитые конструкции Р1ЦЭЕ или РЫВЕ, которые можно обнаружить, например, в VО 0198334.
Пневмолизин представляет собой многофункциональный токсин с явно выраженными цитолитической (гемолитической) активностью и активностью активации комплемента (КиЬйъ е! а1., Ат. КекрЕ СП. Саге Мей., 153: 1339-1346 (1996)). Этот токсин не секретируется пневмококками, но он высвобождается при лизисе пневмококков под действием аутолизина. Его эффекты включают, например, стимуляцию продуцирования воспалительных цитокинов человеческими моноцитами, ингибирование пульсации ресничек на эпителии дыхательных путей человека и уменьшение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее явным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, который включает связывание с холестерином. Поскольку он является токсином, его необходимо детоксифицировать (то есть сделать нетоксичным для человека, получающего его в дозе, пригодной для защиты), до того как его можно будет вводить ίη νίνο. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмолизина известны в данной области техники. См., например, ΧναΙΙ^Γ е! а1. (ЧпРесЕ Iттиη., 55: 11841189 (1987)), МйсЬе11 е! а1. (ВюсЫт. ВюрЬуз. Ас!а, 1007: 67-72 (1989)) и МПсйе11 е! а1. (ΝΑΚ., 18: 4010 (1990)). Детоксификация Р1у может быть проведена химическим образом, например обработкой формалином или обработкой глутаровым альдегидом или комбинацией обоих (^О 04081515, РСТ/ЕР 2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области для различных токсинов. Альтернативно, Р1у может быть генетически детоксифицирован. Таким образом, данное изобретение охватывает производные пневмококковых белков, которые могут быть, например, мутантными белками. Термин мутантный использован в данном описании для обозначения молекулы, подвергнутой делеции, вставке или замене одной или более чем одной аминокислоты с использованием хорошо известных методик сайт-направленного мутагенеза или любого другого традиционного метода. Например, как описано выше, мутантный белок Р1у может быть изменен таким образом, что он будет биологически неактивен, в то же время сохраняя свои иммуногенные эпитопы (см., например, ^№О 90/06951, Веггу е! а1. ОпРесЕ Iттиη., 67: 981-985 (1999)) и \ν() 99/03884).
Очевидно, что используемый в данном описании термин Р1у относится к мутантному или детоксифицированному пневмолизину, подходящему для медицинского применения (то есть нетоксичному).
Что касается семейства холинсвязывающих белков (СЬрХ), то члены этого семейства первоначально были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно было очистить холин-аффинной хроматографией. Все холинсвязывающие белки связаны нековалентными связями с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты из клеточной стенки и мембран-ассоциированной липотейхоевой кислоты. Структурно они имеют несколько участков, общих для всего семейства, хотя точная природа белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) может варьироваться. В общем случае холинсвязывающие белки содержат Ν-концевой участок (Ν), консервативные повторяющиеся участки (К.1 и/или К2), пролин-обогащенный участок (Р) и консервативный холинсвязывающий участок (С), составленный из множественных повторов, который составляет приблизительно половину белка. При использовании в данной заявке термин семейство холинсвязывающих белков (СЬрХ) выбран из группы, состоящей из холинсвязывающих белков, которые идентифицированы в VО 97/41151, РЬсА, 8р§А, РкрС, СЬрА, СЬрЭ и СЬрО. СЬрА раскрыт в VО 97/41151. СЬрЭ и СЬрО раскрыты в VО 00/29434. РкрС раскрыт в VО 97/09994. РЬсА раскрыт в VО 98/21337. 8р§А представляет собой холинсвязывающий белок, раскрытый в VО 98/39450. Предпочтительно, чтобы холинсвязывающие белки были выбраны из группы,
- 10 014165 состоящей из СЬрЛ, РЬсЛ, 8ркА и РкрС.
Другим предпочтительным воплощением являются укороченные СЬрХ, где СЬрХ определен выше, а термин укороченные относится к СЬрХ белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка (С) или более. Предпочтительно, чтобы у таких белков отсутствовал весь холинсвязывающий участок. Более предпочтительно, чтобы у таких укороченных белков отсутствовал (1) холинсвязывающий участок, а также (2) часть Ν-концевой половины данного белка, при этом оставался по меньшей мере один повторяющийся участок (В1 или В2). Еще более предпочтительно, чтобы укороченная структура имела 2 повторяющихся участка (В1 и В2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются ΝΚ1χΚ2 и В1хВ2, как проиллюстрировано в \УО 99/51266 или \УО 99/51188, однако другие холинсвязывающие белки, у которых отсутствует аналогичный холинсвязывающий участок, также считаются входящими в объем данного изобретения.
Ьу1Х-семейство представляет собой мембран-ассоциированные белки, связанные с лизисом клеток. Ν-концевой домен содержит холинсвязывающий(е) домен(ы), однако Ьу!Х-семейство не имеет всех признаков, обнаруженных у СЬрА-семейства, как указано выше, и, таким образом, для настоящего изобретения Ьу!Х-семейство считается отличающимся от СЬрХ-семейства. В противоположность СЬрХсемейству, С-концевой домен содержит каталитический домен Ьу1Х белкового семейства. Это семейство включает в себя Ьу1А, В и С. Что касается Ьу1Х-семейства, то Ьу!А раскрыт в Воиба с1 а1., Еиг. 1. Βίοсйет., 164: 621-624 (1987). Ьу® раскрыт в XVО 98/18930, где он также обозначен как 8р46. Бу1С также раскрыт в νθ 98/18930, и также упоминается как 8р91. Предпочтительным членом этого семейства является Бу1С.
Другим предпочтительным воплощением являются укороченные Бу1Х. где Бу1Х определен выше, и укороченные относится к Ьу1Х-белкам, у которых отсутствует 50% холинсвязывающего участка или более. Предпочтительно, чтобы у таких белков отсутствовал весь холинсвязывающий участок. Еще одним предпочтительным воплощением данного изобретения являются химерные белки (или слитые конструкции) - укороченные СЬрХ-укороченные Бу1Х. Предпочтительно, чтобы они содержали ΝΚ1χΚ2 (или В1 хВ2) от СЬрХ и С-концевую часть (С1етт, т.е., чтобы отсутствовали холинсвязывающие домены) от Бу1Х (например Ьу1СС1егт или 8р91 С1етт). Более предпочтительно СЬрХ выбран из группы, состоящей из СЬрА, РЬсА, 8ркА и РкрС. Еще более предпочтительно, чтобы он представлял собой СЬрА. Предпочтительно, чтобы Бу1Х представлял собой Бу1С (также упоминаемый как 8р91). Другим воплощением настоящего изобретения является укороченный РкрА или РкаА, у которого отсутствует холинсвязывающий домен (С) и который экспрессируется в виде слитого белка с Ьу1Х. Предпочтительно Бу1Х представляет собой Бу1С.
Что касается РкаА и РкрА, то оба известны в данной области. Например, РкаА и его варианты с трансмембранной делецией описаны в Веггу & Ра1ои, 1пГес1. 1ттип., 1996, Эес, 64(12): 5255-62. РкрА и его варианты с трансмембранной делецией раскрыты, например, в И8 5804193, νθ 92/14488 и νθ 99/53940.
8р128 и 8р130 раскрыты в νθ 00/76540. 8р125 является примером пневмококкового поверхностного белка с заякоренным в клеточной стенке мотивом БРХТС (где Х представляет собой любую аминокислоту). Обнаружено, что любой белок из этого класса пневмококковых поверхностных белков с таким мотивом полезен в контексте данного изобретения и, следовательно, считается дополнительным белком по изобретению. Сам 8р125 раскрыт в νθ 98/18930 и также известен как 2трВ - цинковая металлопротеиназа. 8р101 раскрыт в νθ 98/06734 (где он упоминается как #у85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью I типа. 8р133 раскрыт в νθ 98/06734 (где он упоминается как #у85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью I типа.
Примерами предпочтительных белковых антигенов Могахе11а са1атгйайк, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), являются: ОМР106 [νθ 97/41731 (Айех) и νθ 96/34960 (РМС)]; ОМР21 или его фрагменты (νθ 0018910); ЬЬрА и/или ЬЬрВ ^О 98/55606 (РМС)]; ТЬрА и/или ТЬрВ [νθ 97/13785 и VО 97/32980 (РМС)]; СорВ [Не1тшеп М.Е., е1 а1. (1993) 1пГес1. 1ттип., 61: 2003-2010]; ИкрА1 и/или ИкрА2 ^О 93/03761 (Университет Техаса)]; ОтрСЭ; НакВ (РСТ/ЕР 99/03824); РИС) (РСТ/ЕР 99/03823); ОМР85 (РСТ/ЕР 00/01468); Бро06 (СВ 9917977.2); Иро10 (СВ 9918208.1); Иро11 (СВ 9918302.2); Иро18 (СВ 9918038.2); Р6 (РСТ/ЕР 99/03038); Ό15 (РСТ/ЕР 99/03822); Отр1А1 (РСТ/ЕР 99/06781); Н1у3 (РСТ/ЕР 99/03257); и ОтрЕ. Примеры антигенов нетипируемых штаммов Наеторййик шПиепхае или их фрагментов, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), включают: белок фимбрин [(И8 5766608 - О1ио 81а1е Векеагсй Еоипйайоп)] и слитые конструкции, содержащие его пептиды [например, ЬВ1 (Г)-пептидные слитые конструкции; И8 5843464 (О8И) или VО 99/64067]; ОМР26 ^О 97/01638 (Сойеск)]; Р6 [ЕР 281673 (Государственный университет Нью-Йорка)]; ТЬрА и/или ТЬрВ; Н1а; НГ; Нш47; НГ; Нш1; Нш^2; Нш^3; Нтм4; Нар; Ό15 (νθ 94/12641); Р2; и Р5 (νθ 94/26304).
Кроме того, белки по изобретению могут быть с пользой скомбинированы. Под комбинированием понимается, что иммуногенная композиция включает в себя все белки из следующих комбинаций, либо в качестве белков-носителей, либо в виде свободных белков, либо смесей двух белков. Например, в ком
- 11 014165 бинации двух белков, как изложено ниже, оба белка могут быть использованы в качестве белковносителей, или оба белка могут быть представлены в виде свободных белков, или оба могут быть представлены в качестве носителя и в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя и свободного белка, в то время как другой представлен только в качестве белка-носителя или только в виде свободного белка, или один может быть представлен в качестве белка-носителя, а другой в виде свободного белка. Когда приведена комбинации трех белков, то существуют аналогичные возможности. Предпочтительные комбинации включают ΡΙιΐΌ + ΝΚ1χΒ2, химерные или слитые белки Ρ111Ό + NΚ1χΒ2-8ρ91Сΐе^т, Ρ111Ό + Р1у, ΡΙιΐΌ + 8ρ128, Ρ111Ό + РкаЛ, Ρ111Ό + ΡκρΑ, РЫЛ + ΝΚ1χΚ2, химерные или слитые белки ΡΙιΐΛ + ΝΚ1χΚ.2-8ρ91Ηθ™, ΡΙιΐΛ + Ρ^, ΡΙιΐΛ + 8ρ128, ΡΙιΐΛ + ΡκηΑ, ΡΙιΐΛ + ΡκρΑ, ΝΚ1χΚ2 + Ьу1С, ΝΚ1χΚ2 + ΡκρΑ, ΝΚ1χΚ2 + ΡκαΑ, ΝΚ1χΚ2 + 8ρ128, Κ1χΚ2 + Ьу1С, Κ1χΚ2 + ΡκρΑ, Κ1χΚ2 + ΡκηΑ, Κ1χΚ2 + 8ρ128, Κ1χΚ2 + ΡΗίΌ, Κ1χΚ2 + ΡΙιίΑ, но не ограничиваются ими. Предпочтительно ΝΚ1χΚ2 (или Κ1χΚ2) происходит из ί,'όρΑ или Ρκρί.'. Более предпочтительно он происходит из ί,’όρΑ. Другие комбинации включают комбинации 3 белков, такие как ΡΙιΐΌ + ΝΚ1χΚ2 + Ρ1ν и ΡΙιίΑ + ΝΚ1χΚ2 + ΡΙιΐΌ. В одном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и Ρ111Ό или ΡΗΙΕ в качестве белков-носителей. В другом воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и Ρ111Ό или ΡΗΙΕ в виде свободных белков.
В настоящем изобретении также предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Вакцины по настоящему изобретению могут быть адъювантными, в частности, когда они предназначены для применения на пожилом населении, а также для применения в детских популяциях. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, или фосфат алюминия, или квасцы, но они также могут представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированные сахара, катионно или анионно дериватизированные сахариды или полифосфазены.
Предпочтительно, чтобы выбранный адъювант преимущественно индуцировал Т111-тип ответа. Такие высокие уровни цитокинов ТЫ-типа способствовуют индуцированию клеточно-опосредованных иммунных ответов на данный антиген, тогда как высокие уровни цитокинов Т112-типа способствовуют индуцированию гуморальных иммунных ответов на этот антиген.
Разница между иммунными ответами ТЫ- и Т112-типа не является абсолютной. В действительности индивидуум будет поддерживать иммунный ответ, который описывается как преимущественно ТЫ или преимущественно Т112. Тем не менее, часто бывает удобно рассматривать семейства цитокинов в терминах, используемых в описании мышиных СЭ4 +уе Т-клеточных клонов Мосманном и Коффманом (Моктапп, Т.Н. апк СоГГтап, К..Б. (1989) ТН1 апк ТН2 се11к: к1ГГегеп( [заИетк оГ 1\τηρ1ιο1<ίικ кесгекоп 1еак 1о к1ГГегеп( Гипс1юпа1 ρ^ορе^ί^еκ. Αηηиа1 Ве\ае\\· оГ 1ттипо1оду, 7, ρ. 145-173). Традиционно, ответы ТЫ-типа ассоциированы с продуцированием Т-лимфоцитами цитокинов ΙΕΝ-γ (интерферон-γ) и 1Ь-2 (интерлейкин-2). Другие цитокины, часто напрямую ассоциированные с индуцированием иммунных ответов ТЫтипа, не продуцируются Т-клетками, как например 1Б-12. Напротив, ответы Т112-типа ассоциированы с секрецией 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-10. Подходящие системы адъювантов, которые стимулируют преимущественно ТЫ-ответ, включают: монофосфориллипид А или его производные, в частности 3-де-Оацилированный монофосфориллипид Α (3Ό-ΜΡΕ) (его получение см. в СВ 2220211 А); и комбинацию монофосфориллипида А, возможно 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А, вместе с либо солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло-вводе. В таких комбинациях антиген и 3Ό-ΜΡΕ содержатся в структурах одних и тех же частиц, что позволяет осуществлять более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3Ό-ΜΡΕ способен дополнительно усиливать иммуногенность адсорбированного на квасцах антигена |Т1юе1еп е! а1. Уассше (1998) 16: 708-14, ЕР 689454-В1].
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡΕ, которая раскрыта в \УО 94/00153, или менее реактогенную композицию, в которой 0821 погашен холестерином, как описано в \УО 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая 0821, 3Ό-ΜΡΕ и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описана в \УО 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой 0821. Эта композиция также может содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол (\УО 95/17210). Неметилированные СρС-содержащие олигонуклеотиды (\УО 96/02555) и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (\УО 0226757 и XVО 03507822) также являются преимущественными индукторами ТЫ-ответа и подходят для использования в настоящем изобретении.
Конкретными адъювантами являются адъюванты, выбранные из группы солей металлов, эмульсий масло-в-воде, агониста То11-подобных рецепторов (в частности агониста То11-подобного рецептора 2, агониста То11-подобного рецептора 3, агониста То11-подобного рецептора 4, агониста То11-подобного рецептора 7, агониста То11-подобного рецептора 8 и агониста То11-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций.
Адъювантом, который может быть использован с вакцинными композициями по изобретению, яв
- 12 014165 ляется пузырьковые препараты или препараты везикул наружной мембраны грамотрицательных бактериальных штаммов, например описанные в \УО 02/09746, - в частности везикулы N. шешидй1Б18. Адъювантные свойства везикул можно усилить путем сохранения ЬО8 (липоолигосахарида) на их поверхности (например посредством экстракции низкими концентрациями детергентов [например 0-0,1%-ным дезоксихолатом]) ЬО8 могут быть детоксифицированы посредством ткЬВ(-) или й!гВ(-) мутаций, рассмотренных в νθ 02/09746. Адъювантные свойства также можно усилить путем сохранения РогВ (и возможно удаления РогА) из менингококковых везикул. Адъювантные свойства также можно усилить путем укорочения сахаридной структуры внешнего ядра ЬО8 на менингококковых везикулах, - например посредством мутации 1д1В(-), рассмотренной в VО 2004/014417 Альтернативно, вышеупомянутые ЬО8 (например выделенные из ткЬВ(-)- и/или 1дВ(-)-ЬиТаММа) можно очистить и использовать в качестве адъюванта в композициях по изобретению.
Другой адъювант, который может быть использован с композициями по изобретению, может быть выбран из группы сапонин, липид А или его производное, иммуностимулирующий олигонуклеотид, алкилглюкозаминидфосфат, эмульсия масло-в-воде или их комбинации Другим предпочтительным адъювантом является соль металла в комбинации с другим адъювантом. Предпочтительно, чтобы адъювант представлял собой агонист То11-подобного рецептора 4, в частности агонист То11-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонин, в частности 0821. Также предпочтительно, чтобы адъювантная система содержала два или более чем два адъюванта из приведенного выше перечня В частности, комбинации предпочтительно содержат сапониновый (например 0821) адъювант и/или агонист То11-подобного рецептора 9, такой как СрС-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид. Другие предпочтительные комбинации содержат сапонин (в частности 0821) и агонист То11-подобного рецептора 4, такой как монофосфориллипид А или его 3-деацилированное производное, ЗП-МРЬ, или сапонин (в частности, 0821) и лиганд То11-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозаминидфосфат.
Особенно предпочтительными адъювантами являются комбинации ЗЬ-МРЬ и 0821 (ЕР 0671948 В1), эмульсии масло-в-воде, содержащие ЗЬ-МРЬ и 0821 (\УО 95/17210, VО 98/56414), или ЗП-МРЬ, приготовленный в виде препарата с другими носителями (ЕР 0689454 В1) Другие предпочтительные адъювантные системы содержат комбинацию ЗО-МРЬ, 0821 и СрС олигонуклеотида, которая описана в И8 6558670, И8 6544518.
В одном воплощении адъювант представляет собой (или содержит) лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК) 4, предпочтительно агонист, такой как производное липида А, в частности монофосфориллипид А, или более конкретно З-деацилированный монофосфориллипид А (ЗО-МРЬ).
ЗЬ-МРЬ может быть приобретен у С1ахо8тййК1ше Вю1ощса1к №г1й Ашепеа и стимулирует, главным образом, ΟΩ4+ Т-клеточные ответы с фенотипом ΙΕΝ-γ (ТЫ). Он может быть получен способами, раскрытыми в СВ 2220211А. С химической точки зрения он представляет собой смесь З-деацилированного монофосфориллипида А с З, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используют небольшие частицы ЗЬ-МРЬ. Небольшие частицы ЗО-МРЬ имеют такой размер частиц, что их можно подвергать стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в международной заявке на патент VО 94/21292. Синтетические производные липида А известны и, по-видимому, являются антагонистами ТЬК 4. Они включают, без ограничения ими:
ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К.)-З-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоно-в-Оглюкопиранозил]-2-[(К)-З-гидрокситетрадеканоиламино]-а-О-глюкопиранозилдигидрофосфат) (\УО 95/ 14026);
ОМ 294 ЭР (З8,9К)-З-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-З-гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис(дигидрофосфат) (\УО 99/64З01 и VО 00/0462);
ОМ 197 МР-Ас ЭР (З8,9К)-З-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-Згидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат) (\УО 01/46127).
Другими лигандами ТЬК4, которые могут быть использованы, являются алкилглюкозаминидфосфаты (АСР), например, раскрытые в VО 9850З99 или И8 6З0ЗЗ47 (также раскрыты способы получения АСР), или фармацевтически приемлемые соли АСР, которые раскрыты в И8 6764840. Некоторые АСР являются агонистами ТЬК.4, а некоторые являются антагонистами ТЬК4. Полагают, что и те и другие полезны в качестве адъювантов.
Другим предпочтительным иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является Оий А и его производные. 0ш1 А представляет собой препарат сапонина, выделенный из южноамериканского дерева 0ш11а.)а кароиапа той па, и впервые был описан как обладающий адъювантной активностью ОакдаагБ и др. в 1974 г. (8ароши афиуаШк, АгсЫу. Гиг Ле декат!е УпикГогксйипд, Уо1. 44, 8ргшдег Уег1ад, Вег1ш, р. 24З-254). Очищенные фрагменты Оий А были выделены с помощью НРЬС, что сохраняет адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с 0ш1 А (ЕР 0З62278), например 087 и 0821 (также известными как 0А7 и 0А21). 08-21 является природным сапонином, выделенным из коры 0ш11а]а кароиапа той па, который индуцирует СЭ8+ цитотоксические Т-клетки (СТЬ), ТЙ1клетки и преимущественный 1дС2а-антительный ответ, и в контексте настоящего изобретения представ
- 1З 014165 ляет собой предпочтительный сапонин.
Были описаны конкретные композиции 0821. которые являются особенно предпочтительными, эти композиции дополнительно содержат стерин (νΟ 96/33739). Сапонины. образующие часть настоящего изобретения. могут быть отделены в форме мицелл. смешанных мицелл (предпочтительно. но не исключительно. с солями желчных кислот) или могут находиться в форме 18СОМ(иммуностимулирующий комплекс)-матриц (ЕР 0109942 В1). липосом или родственных коллоидных структур. таких как червеобразные или кольцеобразные мультимерные комплексы либо липидные/слоевые структуры и ламеллы. когда их приготавливают вместе с холестерином или липидом. или в форме эмульсии масло-в-воде (например как в νΟ 95/17210). Сапонины предпочтительно могут быть ассоциированы с солью металла. например гидроксидом алюминия или фосфатом алюминия (νΟ 98/15287).
Предпочтительно сапонин представлен в форме липосомы. 18СОМ или эмульсии масло-в-воде.
Усиленная система включает комбинацию монофосфориллипида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина. в частности комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡΕ. которая раскрыта в νΟ 94/00153. или менее реактогенную композицию. в которой 0821 погашен холестерином. как описано в νθ 96/33739. Особенно эффективная адъювантная композиция. включающая в себя токоферол с 0821 и/или 3Ό-ΜΡΕ в эмульсии типа масло-в-воде или без них. описана в νθ 95/17210. В одном воплощении такая иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин. который может представлять собой 0821.
Кроме того. могут быть использованы иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонист То11-подобного рецептора (ТЬК.) 9. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению представляют собой СрС-содержащие олигонуклеотиды. предпочтительно содержащие два или более динуклеотидных СрС мотивов. отделенных по меньшей мере тремя. более предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрС представляет собой нуклеотид цитозин. за которым следует нуклеотид гуанин. СрС-олигонуклеотиды по настоящему изобретению обычно являются дезоксинуклеотидами. В предпочтительном воплощении межнуклеотидной структурой в олигонуклеотиде является фосфородитиоат или более предпочтительно фосфоротиоатная связь. хотя в объем данного изобретения включены фосфодисложноэфирная и другие межнуклеотидные связи. Также в объем изобретения включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатных олигонуклеотидов описаны в И8 5666153. И8 5278302 и νθ 95/26204.
Примеры предпочтительных олигонуклеотидов имеют следующие далее последовательности. Эти последовательности предпочтительно возможно содержат фосфоротиоат-модифицированные межнуклеотидные связи.
ОЛИГО 1 (ЗЕО ГО ΝΟ: 1): ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826);
ОЛИГО 2 (ЗЕО ГО ΝΟ: 2): ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758);
ОЛИГО 3 (ЗЕО ГО N0:3): АСС САТ САС СТС ССС СОТ САС ССС АСС
АСС;
ОЛИГО 4 (ЗЕО ГО N0:4): ТСС ТСС ТТТ ТСТ СОТ ТТТ СТС СТТ (СрС
2006);
ОЛИГО 5 (ЗЕО ГО N0:5): ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668);
ОЛИГО 6 (ЗЕО ГО N0:6): ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС
5456).
Альтернативные СрС-содержащие олигонуклеотиды могут содержать предпочтительные последовательности. приведенные выше. в которых имеются незначительные делеции или вставки.
СрС-олигонуклеотиды. используемые в настоящем изобретении. могут быть синтезированы любым способом. известным в данной области техники (например. см. ЕР 468520). Удобно. что такие олигонуклеотиды можно синтезировать. используя автоматизированный синтезатор.
Адъювант может представлять собой эмульсию масло-в-воде или может содержать эмульсию масло-в-воде в комбинации с другими адъювантами.
Масляная фаза эмульсионной системы предпочтительно содержит метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в данной области техники. Метаболизируемый можно определить как который может быть превращен посредством метаболизма (Эог1ап6'8 111и81га1е6 Ме61са1 ЭЩюпагу. ν.Β. 8ап6ега Сотрапу. 25-е издание (1974)). Масло может представлять собой любое растительное масло. рыбий жир. животный жир или синтетическое масло. которое не токсично для реципиента и может быть превращено посредством метаболизма. Орехи. зерна и крупа являются традиционными источниками растительных масел. Синтетические масла также составляют часть этого изобретения и могут включать имеющиеся в продаже масла. такие как ΝΕΟΒΕΕ® и другие. Сквален (2.6.10.15.19.23-гексаметил-2.6.10.14.18.22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло. которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах в оливковом
- 14 014165 масле, масле из семян пшеницы, масле из рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло ввиду того, что является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Мегск 1пбех, 10е издание, входной № 8619).
Токолы (например витамин Е) также часто используют в масляных эмульсионных адъювантах (ЕР 0382271 В1; И85667784; νθ 95/17210). Токолы, используемые в масляных эмульсиях (предпочтительно эмульсиях масло-вводе) по изобретению, могут быть приготовлены в виде препарата, как описано в ЕР 0382271 В1, где токолы могут представлять собой дисперсии токоловых капелек, возможно содержащие эмульгатор, предпочтительно менее 1 мкм диаметром. Альтернативно, токолы можно использовать в комбинации с другим маслом с образованием масляной фазы масляной эмульсии. Примеры масляных эмульсий, которые можно использовать в комбинации с токолом, описаны в данном изобретении, например описанные выше метаболизируемые масла.
Полагают, что адъюванты в виде эмульсии масло-в-воде сами по себе полезны в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843В), кроме того, комбинации эмульсий масло-в-воде и других активных агентов описаны в качестве адъювантов для вакцин (νθ 95/17210; νθ 98/56414; νθ 99/12565; νθ 99/11241). Описаны другие адъюванты в виде масляных эмульсий, такие как эмульсии вода-в-масле (И8 5422109; ЕР 0480982 В2) и эмульсии вода-в-масле-в-воде (И8 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют предпочтительные масляные эмульсионные системы (в частности при включении токолов) с образованием адъювантов и композиций по настоящему изобретению.
Наиболее предпочтительно масляная эмульсия (например эмульсии масло-в-воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как Твин 80, и/или стерин, например холестерин.
Предпочтительная масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) содержит метаболизируемое, нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как альфа-токоферол (и предпочтительно и сквален, и альфа-токоферол), и возможно эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Твин 80. Также может быть включен стерин (предпочтительно холестерин).
Способ приготовления эмульсии масло-в-воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно этот способ включает смешивание токол-содержащей масляной фазы с поверхностноактивным веществом, таким как раствор ΡΒ8/ΤνΕΕΝ80™, с последующей гомогенизацией с использованием гомогенизатора; специалисту в данной области техники очевидно, что способ, включающий прохождение смеси дважды через иглу шприца будет пригодным для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени, процесс эмульгирования в микрофлюидизаторе (установка М1108 М1сгойиίάκκ, максимум 50 прогонов, в течение периода времени 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (0,6 МПа) (давление на выходе приблизительно 850 бар (85 МПа))) может быть адаптирован специалистом в данной области техники для приготовления меньших или больших объемов эмульсии. Адаптация может быть проведена путем осуществления рутинных экспериментов, включающих определение параметров получаемой эмульсии до тех пор, пока не будет получен препарат с необходимым диаметром капелек масла.
В эмульсии масло-в-воде масло и эмульгатор должны находиться в водном носителе. Водным носителем может быть, например, забуференный фосфатом физиологический раствор (ΡΒ8).
Размер капелек масла, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масло-вводе, предпочтительно составляет менее 1 мкм, может находиться в основном в диапазоне 30-600 нм, предпочтительно в основном составлять приблизительно 30-500 нм в диаметре и наиболее предпочтительно в основном 150-500 нм в диаметре и, в частности, приблизительно 150 нм в диаметре, как измерено с помощью фотоннокорреляционной спектроскопии (РС8). В этом отношении 80% капелек масла по количеству должны находиться в указанных диапазонах, более предпочтительно более 90% и наиболее предпочтительно более 95% капелек масла по количеству находятся в диапазонах указанных размеров. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, обычно находятся в диапазоне 0,520 или 2-10% масла (от общего объема дозы), такого как сквален; и, если он присутствует, 2-10% альфатокоферола; и 0,3-3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Предпочтительно соотношение масло (предпочтительно сквален):токол (предпочтительно α-токоферол) равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Эмульгатор, такой как Твин 80 или 8рап 85, также может присутствовать, например, на уровне приблизительно 1%. В некоторых случаях полезно, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.
Примеры предпочтительных эмульсионных систем описаны в νθ 95/17210, νθ 99/11241 и νθ 99/12565, где раскрыты эмульсионные адъюванты на основе сквалена, α-токоферола и Твина 80, возможно приготовленные с иммуностимуляторами 0821 и/или 3П-МРЬ.
Так, в особенно предпочтительном воплощении по настоящему изобретению адъювант по изобретению может дополнительно содержать другие иммуностимуляторы, такие как ЬР8 (липополисахарид) или его производные и/или сапонины. Примеры других иммуностимуляторов приведены в данном описании и в Уассте Эе5щп - ТНе 8иЬипй апб АбщуаШ АрргоасН 1995, Рйагтасеибса1 Вю!есйпо1о§у, Уо1
- 15 014165 ите 6, Ебк. Ро^с11. Μ. Е., апб Ые^тап, М.1., Р1епит Ргекк, Νο\ν Уогк апб Ьопбоп, Ι8ΒΝ 0-306-44867-Х.
В предпочтительном аспекте адъювант и иммуногенные композиции по изобретению содержат сапонин (предпочтительно 0821) и/или производное ЬР8 (предпочтительно 3Ό-ΜΡΕ) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стерином (предпочтительно холестерином). В дополнение к этому масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) может содержать крап 85 и/или лецитин и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию масло-в-воде, стерин и сапонин, описаны в νθ 99/12565.
Обычно для введения людям сапонин (предпочтительно 0821) и/или ЬР8-производное (предпочтительно 3Ό-ΜΡΕ) будут присутствовать в предназначенной для человека дозе иммуногенной композиции в диапазоне от 1 до 200 мкг, например 10-100 мкг, предпочтительно 10-50 мкг на дозу. Обычно масляная эмульсия (предпочтительно эмульсия масло-в-воде) будет содержать 2-10% метаболизируемого масла. Предпочтительно она будет содержать 2-10% сквалена, 2-10% альфа-токоферола и 0,3-3% (предпочтительно 0,4-2%) эмульгатора (предпочтительно Твина 80 [полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат]). Если присутствуют и сквален и альфа-токоферол, то предпочтительно, чтобы соотношение сквален:альфатокоферол было равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. 8рап 85 (сорбитантриолеат) также может присутствовать на уровне 0,5-1% в эмульсиях, используемых в данном изобретении. В некоторых случаях может быть полезно, чтобы иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностно-активные вещества, включая каприловую кислоту (Мегск шбех, 10-е издание, номер по списку 1739), из которых особенно предпочтителным является трикаприлин.
Когда включены сквален и сапонин (предпочтительно 0821), также полезно включать в композицию стерин (предпочтительно холестерин), так как это позволяет уменьшить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к снижению стоимости изготовления, улучшению общего комфорта при вакцинации, а также качественным и количественным улучшениям получаемых иммунных ответов, таких как усиленное продуцирование ΙΕΝ-γ. Соответственно, адъювантная система по настоящему изобретению обычно имеет соотношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в диапазоне от 200:1 до 300:1, кроме того, настоящее изобретение может быть применено в форме с низким содержанием масла, с предпочтительным диапазоном 1:1-200:1, предпочтительно 20:1-100:1 и наиболее предпочтительно 48:1; эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов со значительно сниженным профилем реактогенности. Соответственно особенно предпочтительные воплощения имеют соотношение сквален:О821 (мас./мас.) в диапазоне 1:1-250:1, также предпочтительным диапазоном является 201200:1, предпочтительно 20:1-100:1 и наиболее предпочтительно 48:1 Предпочтительно, стерин (наиболее предпочтительно холестерин) также включен и присутствует в соотношении сапонинхтерин, приведенном в данном описании.
Эмульсионные системы по настоящему изобретению предпочтительно имеют капельки масла небольшого размера в субмикронном диапазоне. Наиболее предпочтительно размеры капелек масла находятся в диапазоне 120-750 нм и наиболее предпочтительно 120-600 нм в диаметре.
Особенно эффективная адъювантная композиция (для окончательной комбинации с А1РО4 в иммуногенных композициях по изобретению) включает сапонин (предпочтительно 0821), производное ЬР8 (предпочтительно 3П-МРЬ) и масляную эмульсию (предпочтительно сквален и альфа-токоферол в эмульсии масло-в-воде), как описано в νθ 95/17210 или в νθ 99/12565 (в частности, адъювантная композиция 11 в примере 2, табл. 1).
Примеры агониста ТЬЯ 2 включают пептидогликан или липопротеин. Известными агонистами ТЬЯ7 являются имидазохинолины, такие как имиквимод или резиквимод. Одноцепочечная РНК также является известным агонистом ТЬЯ (ТЬЯ8 у людей и ТЬЯ7 у мышей), в то время как двухцепочечная РНК и поли-1С (полиинозиновая-полицитидиловая кислота - имеющийся в продаже синтетический миметик вирусной РНК) являются примерами агонистов ТЬЯ3. 3П-МРЬ является примером агониста ТЬЯ4, тогда как СрС является примером агониста ТЬЯ9.
Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированные на соль металла. Вакцинные композиции на основе алюминия, в которых антиген и иммуностимулятор 3де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3П-МРЬ) адсорбированы на одной и той же частице, описаны в ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1 и ЕР 0633784 В1 Тогда в этих случаях сначала адсорбируют антиген на соль алюминия с последующей адсорбцией иммуностимулятора 3П-МРЬ на тех же частицах соли алюминия. В таких процессах сначала суспензию 3П-МРЬ подвергают воздействию ультразвука на водяной бане до тех пор, пока частицы не достигнут размера 80-500 нм. Обычно антиген адсорбируют на соль алюминия в течение одного часа при комнатной температуре при перемешивании. Затем к адсорбированному антигену добавляют суспензию 3П-МРЬ и композицию инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и затем хранят при 4°С до использования.
В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах соли металла, как описано в ЕР 1126876. Улучшенный способ включает абсорбцию иммуностимулятора на частицах соли металла с последующей абсорбцией антигена на другую частицу соли металла, затем смешивание отдельных частиц соли металла с образованием вакцины. Адъювант для использования в настоящем изо
- 16 014165 бретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающейся тем, что данная частица соли металла, по существу, не содержит другой антиген. Кроме того, вакцины, предложенные согласно настоящему изобретению, отличаются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, по существу, не содержащих другой антиген, и что частицы соли металла, на которых адсорбируется антиген, по существу, не содержат другой иммуностимулятор.
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена адъювантная композиция, содержащая иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, характеризующейся в композиции как, по существу, не содержащей другой антиген. Кроме того, эта адъювантная композиция может представлять собой промежуточный продукт, который, если используют такой адъювант, требуется для изготовления вакцины. Соответственно, предложен способ изготовления вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, представляющей собой один или более чем один иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла с антигеном. Предпочтительно антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Указанная соль металла может быть идентичной или аналогичной соли металла, на которой адсорбирован иммуностимулятор. Предпочтительно, соль металла представляет собой соль алюминия, например фосфат алюминия или гидроксид алюминия.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первые и вторые частицы соли металла являются отдельными частицами.
ΕΡ8 или ЬО8 производные или мутации или производные липида А, описанные в данном изобретении, сконструированы с меньшей токсичностью (например 3Ό-ΜΡΕ), чем нативные липополисахариды, и представляют собой взаимозаменяемые эквиваленты в отношении любых применений этих групировок, описанных в данном изобретении. Они могут представлять собой лиганды ΤΕΒ4, которые описаны выше. Другие такие производные описаны в УО 020786737, УО 9850399, УО 0134617, УО 0212258, УО 03065806.
В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит липосомный носитель (приготавленный известными методами из фосфолипидов (таких как диолеоилфосфатидилхолин [^ОΡС]) и возможно стерина [такого как холестерин]). Такие липосомные носители могут нести производные липида А [такие как 3Ό-ΜΡΕ - см. выше] и/или сапонины (такие как 0821 - см. выше). В одном воплощении адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,1-10 мг, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2 или 0,5-1 мг (например 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 или 1 мг) фосфолипида (например ^ОΡС), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,10,3 или 0,125-0,25 мг (например 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например холестерина), 560, 10-50 или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например 3Ό-ΜΡΕ) и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например Р821).
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает в себя сахаридные конъюгаты, происходящие из по меньшей мере всех следующих серотипов: 4, 6В, 9ν, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19А и 22Р), при этом СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов -4, 6В, 9ν, 14, 18С, 19Р и 23Р, не является значительно более низкой чем индуцированная вакциной ΡϊΌνΐ'ΐηΓ® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый для композиций по изобретению, содержит эмульсию масло-в-воде, приготовленную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно токола (такого как альфа-токоферол). В одном воплощении адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8 или 5-6 мг (например, 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален), 0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4 или 2-3 мг (например, 0,9-1,1, 2-3 или 4-5 мг) эмульгатора (такого как Твин 80) и возможно 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (например, 11-13, 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как альфа-токоферол).
Этот адъювант возможно может дополнительно содержать 5-60, 10-50, или 20-30 мкг (например, 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Ό-ΜΡΕ).
Такие адъюванты, в частности, подходят для вакцинных композиций, предназначенных для маленьких детей или пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие из по меньшей мере всех следующих серотипов: 4, 6В, 9ν, 14, 18С, 19Р, 23Р, 1, 5, 7Р (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Р), где СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9ν, 14, 18С, 19Р и 23Р не является значительно более низкой чем индуцированная вакциной ΡϊΌνικίΓ® у вакцинированных людей.
Этот адъювант возможно может содержать 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерина (например, холестерина), 5-60, 10-50 или 20-30
- 17 014165 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, ЗО-МРЬ) и 5-60, 10-50, или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (например, ^821).
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, включает сахаридные конъюгаты, происходящие из по меньшей мере всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19А и 22Е), при этом СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е, не является значительно более низкой чем индуцированная вакциной Ргеуиаг® у вакцинированных людей.
В одном воплощении адъювант, используемый в композициях по изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 3О-МРЬ). Этот адъювант может содержать (на 0,5 мл дозы) 100-750, 200-500 или 300-400 мкг А1 в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (например, 3Э-МРЬ).
Этот адъювант, в частности, подходит для вакцинных композиций для пожилых людей или маленьких детей. В одном воплощении вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит сахаридные конъюгаты, происходящие из по меньшей мере всех следующих серотипов: 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е, 23Е, 1, 5, 7Е (и также может содержать один или более из серотипов 3, 6А, 19А и 22Е), при этом СМС титра антител, индуцированных против одного или более (или всех) вакцинных компонентов - 4, 6В, 9У, 14, 18С, 19Е и 23Е не является значительно более низкой чем индуцированная вакциной Ргеуиаг® у вакцинированных людей.
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, могут быть использованы для защиты или лечения восприимчивого к инфекции млекопитающего путем введения указанной вакцины системным или мукозальным путем. Такие способы введения могут включать введение посредством внутримышечной (в/м), внутрибрюшинной, внутрикожной (в/к) или подкожной инъекции; или введение на слизистую оболочку в пероральный/пищеварительный, респираторный, мочеполовой тракты. Для лечения пневмонии или среднего отита предпочтительно интраназальное (и/н) введение вакцин (так как носоглоточный перенос пневмококков может быть предупрежден с большей эффективностью, тем самым инфекция ослабляется на самой ранней ее стадии). Хотя вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты также можно совместно вводить одновременно или в разные моменты времени (например, пневмококковые сахаридные конъюгаты можно вводить по отдельности, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу. Для совместного введения возможный ТЫ-адъювант может присутствовать в любом или во всех разных способах введениях. В дополнение к одному способу введения, можно использовать 2 разных способа введения. Например, сахариды или сахаридные конъюгаты можно вводить в/м (или в/к), а бактериальные белки можно вводить и/н (или в/к). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить в/м для примирующих доз, и и/н для бустерных доз.
Содержание белковых антигенов в вакцине обычно будет находиться в диапазоне 1-100 мкг, возможно 5-50 мкг, наиболее типично в диапазоне 5-25 мкг. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные промежутки времени.
Изготовление вакцин в общем описано в Уассте Эе^ди (Тке киЬиш! аиб афиуаи! арргоасй (ей§ Ро\уе11 М.Е. & №\ушап М.1.) (1995) Р1еиит Рге§8, Νονν Уогк). Инкапсулирование в липосомы описано ЕиНейои в патенте США 4235877.
Вакцины по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизованном состоянии. Предпочтительно раствор лиофилизуют в присутствии сахара, такого как сахароза или лактоза. Еще более предпочтительно, что их лиофилизуют и разводят непосредственно перед использованием. В результате лиофилизации можно получить более стабильную композицию (вакцину) и возможно можно придти к более высоким титрам антител в присутствии 3П-МРЬ и в отсутствие адъюванта на основе алюминия.
В одном аспекте данного изобретения предложен вакцинный набор, содержащий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизованной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, который описан в данном изобретении. Очевидно, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для разведения лиофилизованной иммуногенной композиции.
Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описываемых вакцин в кожу (в/к) составляет одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит наружную ороговевшую кутикулу, называемую роговым слоем, которая лежит поверх эпидермиса. Под эпидермисом лежит слой, называемый дермой, который, в свою очередь, лежит поверх подкожной ткани. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, что также может быть связано с рядом дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация описанной в данном изобретении вакциной образует предпочтительный аспект настоящего изобретения.
Традиционная методика внутрикожной инъекции процедура манту, включает стадии, на которых
- 18 014165 очищают кожу, затем натягивают ее одной рукой и фаской иглы малого размера (размер 26-31), направленной вверх, вводят иглу под углом 10-15°. Как только фаска иглы введена, цилиндрическую часть иглы углубляют и продвигают дальше, одновременно осуществляя легкое надавливание, чтобы поднять иглу под кожей. Затем очень медленно вводят жидкость, получая таким образом пузырь или выпуклость на поверхности кожи, после чего медленно извлекают иглу.
Совсем недавно были описаны устройства, специально разработанные для введения жидких агентов в кожу или через нее, например устройства, описанные в \УО 99/34850 и ЕР 1092444, а также безыгольные инъекционные устройства, описанные, например, в XVО 01/13977, И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312335, И8 5503627, И8 5064413, И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, И8 4940460, XVО 97/37705 и XV О 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных композиций могут включать традиционные шприцы и иглы или устройства, сконструированные для баллистической доставки твердых вакцин (XVО 99/27961), или трансдермальные пластыри (XVО 97/48440; XVО 98/28037); или накладываемые на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка, ХХ'О 98/20734, АО 98/28037).
Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или более конкретно в дерму, вакцина представлена в малом объеме жидкости, в частности в объеме от приблизительно 0,05 до 0,2 мл.
Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть аналогично обычным дозам, установленным для внутримышечных вакцин (см. выше). Однако особенностью кожных или внутрикожных вакцин является то, что эти композиции могут быть низкодозовыми. Соответственно, белковые антигены в низкодозовых вакцинах возможно присутствуют в таких небольших количествах как 0,1-10 мкг, предпочтительно 0,1-5 мкг на дозу; а сахаридные (предпочтительно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг и предпочтительно 0,01-0,5 мкг сахарида на дозу.
При использовании в данном описании термин внутрикожная доставка означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно будет локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный на расстоянии от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 мм от поверхности кожи человека, однако существует определенное количество вариаций между индивидуумами и в разных частях тела. В общем случае можно ожидать достижения дермы, пройдя на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем, лежащим ниже. В зависимости от способа доставки вакцина может окончательно локализоваться исключительно или в основном в дерме или она может окончательно распределиться в эпидермисе и дерме.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления среднего отита, вызываемого Наеторййик шЛиепхае, путем добавления белков Наеторййик шПиепхае, например белка Ό в свободной или конъюгированной форме. В дополнение к этому, согласно настоящему изобретению также предложена улучшенная вакцина для предупреждения или ослабления пневмококковой инфекции у маленьких детей (например, среднего отита), основанная на добавлении одного или двух пневмококковых белков в виде свободного или конъюгированного белка к конъюгатным композициям 8. рпеитошае по изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут быть одинаковыми или разными по сравнению с любыми белками 8. рпеитошае, используемыми в качестве белков-носителей. Кроме того, в комбинированную вакцину могут быть включен один или более чем один белковый антиген Могахе11а са!аггйа11к в свободной или конъюгированной форме. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа против среднего отита у маленьких детей.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа у маленьких детей (определенных как дети в возрасте 0-2 лет в контексте настоящего изобретения) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению [педиатрической вакцины]. Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предложены антигенные конъюгатные композиции 8. рпеитошае по изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов 8. рпеитошае по изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения (или лечения) пневмококкового заболевания.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ индуцирования (защитного) иммунного ответа у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациент считается пожилым, если его возраст составляет 50 лет или старше, обычно старше 55 лет и в более общем случае старше 60 лет) путем введения безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению, предпочтительно вместе с одним или двумя белками 8. рпеитошае, присутствующими в виде свободного или конъюгированного белка, причем свободные белки 8. рпеитошае могут быть одинаковыми или разными как любые белки 8. рпеитошае, используемые в качестве белков-носителей.
Другим аспектом данного изобретения является способ иммунизации человека-реципиента против заболевания, вызываемого инфекцией 8. рпеитошае и возможно Наеторййик шПиепхае, включающий
- 19 014165 введение реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению.
Другим аспектом данного изобретения является иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого инфекцией 8. рпеитошае и возможно НаеторЫ1ик тПиепхае.
Другой аспект данного изобретения заключается в применении иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией 8. рпеитошае и возможно НаеторЫ1ик тПиепхае.
Авторами изобретения подразумевается, что термины содержащий, содержат и содержит в данном описании возможно заменять в каждом случае соответственно на термины состоящий из, состоят из и состоит из.
В данном описании изобретения воплощения, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к иммуногенным композициям по изобретению, и наоборот.
Все ссылки и патентные заявки, приведенные в данной патентной заявке, включены в описание посредством ссылки.
Для лучшего понимания изобретения приведены следующие ниже примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации, и их никоим образом не следует истолковывать как каким-либо образом ограничивающие объем данного изобретения.
Примеры
Пример 1а. Экспрессия белка Ό.
Белок Ό НаеторШик тПиепхае.
Генетическая конструкция для экспрессии белка Ό.
Исходные материалы.
ДНК, кодирующая белок Ό.
Белок Ό является высококонсервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов Н. 1пГ1иепхае. Вектор рНЮ348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую весь ген белка Ό, был получен от доктора А. Рогкдгеп, ОераПтеп) оГ Меб1са1 М1сгоЫо1оду, Ищуегкйу оГ Ьипа, Ма1то Сепега1 Нокр11а1, Ма1то, 8^ебеп. Последовательность ДНК белка Ό была опубликована в 1апкоп е1 а1. (1991) 1пГес1. 1ттип. 59: 119-125.
Экспрессирующий вектор рМС1.
Экспрессирующий вектор рМС1 представляет собой производное рВК322 (Сгокк е1 а1., 1985), куда были введены элементы контроля транскрипции и трансляции чужеродных встроенных генов бактериофага λ (811а1/1пап е1 а1., 1983). В дополнение к этому, ген устойчивости к ампициллину был заменен на ген устойчивости к канамицину.
Штамм Е. со11 АК58.
Был сконструирован штамм Е. со11 АК58 посредством трансдукции N99 фагом линии Р1, предварительно выращенным на производном 8А500 (даШ::ТШ0, 1атЬбаК11- с1857 ДН1). N99 и 8А500 представляют собой штаммы Е. сой К12 из лаборатории доктора Магйп КокепЬегд, №йопа1 1пк111и1е оГ Неа1111.
Экспрессирующий вектор рМС 1.
Для продуцирования белка Ό ДНК, кодирующая этот белок, клонировали в экспрессирующий вектор рМС 1. Эта плазмида использует сигналы от ДНК фага лямбда для управления транскрипцией и трансляцией встроенных чужеродных генов. Вектор содержит промотор РЬ, оператор ОЬ и два сайта утилизации (МпЬ и ΝιιΐΡ) для ослабления эффектов транскрипционной полярности при получении белка N (Сгокк е1 а1., 1985). Для стабилизации плазмидной ДНК в лизогенный штамм хозяина Е. со11 введены векторы, содержащие промотор РЬ. Лизогенные штаммы хозяина содержат репликон-дефектную ДНК фага лямбда, интегрированную в геном (811а1/тап е1 а1., 1983). Хромосомальная ДНК фага лямбда направляет синтез белка-репрессора с1, который связывается с ОЬ репрессором вектора и препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором РЬ и тем самым транскрипции встроенного гена. Экспрессирующий штамм АК58 представляет собой температурочувствительный мутант по гену с1, так что РЬнаправляемую транскрипцию можно регулировать путем изменения температуры, то есть повышение температуры в культуре инактивирует репрессор, и инициируется синтез чужеродного белка. Эта система экспрессии позволяет регулировать синтез чужеродных белков, особенно таких, которые могут быть токсичными для клетки (81шпа1ака & КокепЬегд, 1981).
Штамм Ε. сой АК58.
Лизогенный штамм Е. сой АК58, используемый для продуцирования носителя - белка Ό, представляет собой производное стандартного штамма МН Е. сой К12 N99 (Р- ки- да1К2, 1ас2- Иг-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (даШ::ТШ0, 1атЬбаК11- с1857 АН1). Фенотип К11- препятствует выключению синтеза макромолекул хозяина. Мутация с1857 обуславливает температурочувствительное повреждение репрессора с1. Делеция АН1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы хозяина Ыо, иуг3 и сН1А. Штамм АК58 был сконструирован посредством трансдукции N99 фагом линии Р1, предваритель
- 20 014165 но выращенным на производном 8А500 (да1Е::'ТЫ10, 1атЬбаК11 с1857 ДН1). Введение дефектного лизогена в N99 отбирали с использованием тетрациклина на основании присутствия в соседнем гене да1Е транспозона ΤΝ10, кодирующего устойчивость к тетрациклину.
Конструирование вектора рМСМЭРРГО.
Вектор рМС 1, содержащий ген, кодирующий неструктурный белок 81 вируса гриппа (рМС№1), использовали для конструирования рМСМЭРРГО Ген белка Ό (РГО) амплифицировали посредством ПЦР из вектора рШС348 Лаптоп е! а1. 1991, 1п1ес!. 1ттип. 59: 119-125) с использованием ПЦР-праймеров, содержащих сайты рестрикции №о1 и ХЬа1 на 5'- и 3'-концах соответственно. Затем фрагмент №о1/ХЬа1 вводили в рМС№1 между №о1 и ХЬа1, создавая таким образом слитый белок, содержащий Ν-концевую 81 аминокислоту белка N81, потом белок Ό (РЭ). Этот вектор помечали как рМС№1РГО.
На основе описанной выше конструкции, создавали конечную конструкцию для экспрессии белка Ό. Фрагмент ВатΗI/ВатΗI удаляли из рМС№1РГО. В результате такого ДНК гидролиза удаляется N81кодирующий участок за исключением первых трех Ν-концевых остатков После повторного лигирования вектора был создан ген, кодирующий слитый белок со следующей Ν-концевой аминокислотной последовательностью:
-----МБР 88Η88ΝΜΑΝΤ----N81 Белок Б
Белок Ό не содержит лидерного пептида или Ν-концевого цистеина, к которому обычно присоединяются липидные цепи. Следовательно, этот белок не выделяется в периплазму и не липидируется и остается в цитоплазме в растворимой форме.
Конечную конструкцию рМС-МЭРРГО вводили в штамм хозяина АК58 путем теплового шока при 37°С. Плазмидсодержащие бактерии отбирали в присутствии канамицина. Наличие вставки ДНК, кодирующей белок Ό, демонстрировали посредством расщепления выделенной плазмидной ДНК выбранными эндонуклеазами. Рекомбинантный штамм Е. со11 обозначают как ЕСГО4.
Экспрессия белка Ό находится под контролем промотора Р|/оператора Оъ (от фага) лямбда. Штамм хозяина АК58 содержит в геноме температурочувствительный ген с1, который блокирует экспрессию Р|. лямбда при низкой температуре посредством связывания с Оь Как только температура повышается, с1 высвобождается от Оь, и белок Ό экспрессируется.
Мелкомасштабное получение.
По окончании ферментации клетки концентрируют и замораживают.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό осуществляли следующим образом. Замороженной осадок клеточной культуры оттаивают и ресуспендируют в растворе для разрушения клеток (цитратный буфер рН 6,0) до конечной оптической плотности ОЭ650=60. Суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления при Р=1000 бар (100 МПа) Гомогенат клеточной культуры осветляют центрифугированием и клеточный дебрис удаляют фильтрацией. На первой стадии очистки отфильтрованный лизат наносят на катионообменную хроматографическую колонку (8Р 8ерНаго5е Еа§! Е1о\г). РЭ связывается с матрицей геля посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (О 8ерНаго5е Еа§! Е1о\г). РЭ не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке.
Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по ОЭ. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют ультрафильтрацией.
В конце ультрафильтрационный ретентат, содержащий белок Ό, пропускают через мембрану 0,2 мкм.
Крупномасштабное получение.
Экстракцию из собранных клеток и очистку белка Ό осуществляли следующим образом. Собранный бульон охлаждают и немедленно пропускают дважды через гомогенизатор высокого давления при давлении приблизительно 800 бар (80 МПа).
На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на катионообменную хроматографическую колонку (большие гранулы 8Р 8ерНаго5е). РЭ связывается с гелевой матрицей посредством ионных взаимодействий, и его элюируют с использованием ступенчатого повышения ионной силы элюирующего буфера и фильтруют.
На второй стадии очистки примеси задерживаются на анионообменной матрице (О 8ерНаго5е Еа§! Е1о\г). РЭ не связывается с гелем и может быть собран в проходящем потоке.
Сбор фракций на обеих стадиях колоночной хроматографии регистрируют по ОЭ. Проходящий проток с анионообменной колоночной хроматографии, содержащий очищенный белок Ό, концентрируют и подвергают диафильтрации посредством ультрафильтрации.
Наконец, удержанный при ультрафильтрации ретентат, содержащий белок Ό, пропускают через мембрану 0,2 мкм.
Пример 1б. Экспрессия Р11ГО.
- 21 014165
Белок Р111Э является членом пневмококкового гистидин-триадного (РН1) белкового семейства, характеризующегося присутствием гистидинтриад (мотив НХХНХН). РМЭ представляет собой молекулу из 838 аминокислотных (ак) остатков и несет 5 гистидиновых триад (см. Меб1ттипе \О00/37105 8ЕЦ ГО NО:4 для аминокислотной последовательности и 8ЕЦ ГО NО:5 для последовательности ДНК). Р111Э также содержит пролин-обогащенный участок в середине (положение аминокислот 348-380). Р111Э имеет состоящую из 20 аминокислотных остатков Ν-концевую сигнальную последовательность с мотивом ЬХХС.
Генетическая конструкция.
Генную последовательность зрелого белка РйГО от Меб1ттипе (от ак 21 до ак 838) переносили рекомбинантным способом в Е. ео11, используя собственный вектор рТСМР14, несущий промотор рХ. Штаммом хозяина Е. ео11 является АК58, который несет термочувствительный репрессор е1857, позволяющий осуществлять тепловую индукцию промотора.
Для амплификации гена рйГО из плазмиды Меб1ттипе (несущей ген рйГО из штамма 81гер1оеоееи5 рпеитошае №г\\'ау 4 (серотип 4) - 8ЕЦ ГО NО: 5, как описано в \О 00/37105) осуществляли полимеразную цепную реакцию. Праймеры, специфические только для гена рйГО, использовали для амплификации гена рйГО в двух фрагментах. Праймеры несут либо Ше1 и Крп1, либо Крп1 и ХЬа1 сайты рестрикции. Эти праймеры не гибридизуются ни с каким нуклеотидом из данного вектора кроме специфических рйГО генных последовательностей. Вставляли искусственный стартовый кодон АТС, используя первый праймер, несущий сайт рестрикции №е1. Образованные ПЦР-продукты затем вставляли в клонирующий вектор рСЕМ-Т (Рготеда) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессирующий вектор ТСМР14, используя стандартные методики, и этим вектором трансформировали Е. ео11 АК58.
Очистка Р111Э.
Очистку Р1ЦЭ осуществляли следующим образом.
Рост клеток Е.ео11 в присутствии канамицина: рост в течение 30 ч при 30°С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5°С.
Разрушение клеток Е.еоН из целой культуры при ОЭ ± 115 в присутствии ЕЭТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (5 мМ) и РМ8Е (фенилметилсульфонилфторид) (2 мМ) в качестве ингибиторов протеаз: Капше, 2 прохода, 1000 бар (100 МПа).
Захват антигена и удаление клеточного дебриса при 8!геат1ше О ХЬ хроматографии в рыхлом слое при комнатной температуре (20°С): колонку промывают №1С1 (150 мМ) + Етр1деп (0,25%; рН 6,5) и элюируют №1С1 (400 мМ) + Етр1деп (0,25%) в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,4.
Фильтрация на картридже 8айоЬгап 150 (0,45 + 0,2 мкм).
Связывание антигена с использованием хроматографии 1МАС (аффинная хроматография на иммобилизованном металле) на Ζπ-хелатирующей 8ерйаго5е ЕЕ при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4°С; колонку промывают 5 мМ имидазоломом и 1% ЕтрЦеп и элюируют 50 мМ имидазолом, все в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0.
Хроматография на слабом анионообменнике в режиме с положительным зарядом с использованием Егае!оде1 ЕМЭ ЭЕАЕ при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4°С; колонку промывают 140 мМ №1С1 и элюируют при 200 мМ №С1, при этом примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменнике.
Концентрирование и ультрафильтрация с использованием 2 мМ Nа/К-фосфата рН 7,15 на мембране 50 кДа.
Стерильная фильтрация очищенной нерасфасованной формы на фильтровальном картридже 0,2 мкм М1Шрак-20.
Пример 1в. Экспрессия пневмолизина.
Пневмококковый пневмолизин получали и детоксифицировали, как описано в \О 2004/081515 и \О2006/032499.
Пример 2. Получение конъюгатов.
В данной области хорошо известно как приготовить очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей данных примеров полисахариды приготавливали по существу, как описано в ЕР072513 или с использованием близких способов. Перед конъюгированием полисахариды могут быть уменьшены в размере посредством микрофлюидизации, как описано ниже.
Условия активации и связывания специфичны для каждого полисахарида. Они приведены в табл. 1. Уменьшенный в размере полисахарид (исключение для Р85, 6В и 23Е) растворяли в 2 М №С1, 0,2 М №С1 или в воде для инъекций (\Е1). Для всех серотипов оценивали оптимальную концентрацию полисахарида. Все серотипы за исключением серотипа 18С были конъюгированы непосредственно с белкомносителем, как подробно описано ниже. Были получены два альтернативных конъюгата серотипа 22Е; один конъюгированный непосредственно, один через линкер АЭН.
К раствору полисахарида добавляли СЭАР (соотношение СЭАР/Р8 0,5-1,5 мг/мг Р8) из концентрированного раствора (100 мг/мл) в ацетонитриле или раствора в смеси ацетонитрил/вода (50%/50%). Через
- 22 014165
1.5 мин добавляли 0.2 М - 0.3 М Ν;·ιΟΗ для получения конкретного рН активации. Активацию полисахарида проводили при этом рН в течение 3 мин при 25°С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок Ό. ΡΜΌ. пневмолизин или ΌΤ) (количество зависит от начального соотношения Р8/белок-носитель) и реакцию сочетания проводили при конкретном рН в течение вплоть до 2 ч (в зависимости от серотипа). регулируя рН. Для гашения непрореагировавших групп цианатного эфира затем к смеси добавляли 2 М раствор глицина. рН подводили до рН гашения (рН 9.0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем в течение ночи при 2-8°С при постоянном медленном перемешивании.
Подготовка 18С.
18С связывали с белком-носителем через линкер-дигидразид адипиновой кислоты (ΆΌΗ). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 18С подвергали микрофлюидизации.
Получение производных столбнячного анатоксина с использованием ΕΩΛΟ
Для получения производных столбнячного анатоксина очищенный ТТ разбавляли до 25 мг/мл в 0.2 М №С1 и добавляли спейсер ΆΌΗ для достижения конечной концентрации 0.2 М. После полного растворения спейсера рН подводили до 6.2. Затем добавляли ΕΩΛΕ' (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид) для достижения конечной концентрации 0.02 М и смесь перемешивали в течение 1 ч. регулируя рН. Реакцию конденсации останавливали путем увеличения рН включительно до 9.0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25°С. Затем дериватизированный ТТ подвергали диафильтрации (мембрана с СО (отсечением) 10 кДа) для удаления оставшихся ΑΩΗ и реагента ΕΩΛί.'.
Наконец. весь объем ТТАН подвергали стерильной фильтрации до проведения стадии сочетания и хранили при -70°С.
Химическое связывание ТТАН с Р8 18С
Подробное указание параметров конъюгирования можно найти в табл. 1.
г подвергнутого микрофлюидизации Ρ8 разбавляли в определенной концентрации водой и доводили до 2 М №1С1 путем добавления порошка №С1.
Добавляли раствор СВАР (100 мг/мл. свежеприготовленный в смеси 50/50 (об./об.) ацетонитрил/νΕΙ) для достижения подходячщего соотношения СВАР/Р8.
рН повышали вплоть до рН активации 9.0 путем добавления 0.3 М ΝηΟΗ и стабилизировали при этом рН до добавления ТТАН.
Через 3 мин добавляли дериватизированный ТТАН (20 мг/мл в 0.2 М №1С1) для достижения соотношения ТТАН/Р8 равного 2. рН регулировали до рН связывания (рНс) 9.0. Раствор оставляли на один час. регулируя рН.
Для гашения к смеси Р8/ТТЛН/СВАР добавляли 2 М раствор глицина.
рН подводили до рН гашения (рНч) (рН 9.0).
Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25°С и затем оставляли на ночь при 2-8°С при постоянном медленном перемешивании.
Конъюгат Р822ЕЛц-Р11Ю.
Во втором способе конъюгирования этого сахарида (первый представляет собой способ прямого конъюгирования Р822Е-РйФ. показанный в табл. 1) 22Е связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (АВН). Перед конъюгированием полисахарид серотипа 22Е подвергали микрофлюидизации.
Получение производных Р8 22Е.
Активацию и связывание выполняли при 25°С при постоянном перемешивании в водяной бане с регулируемой температурой.
Подвергнутый микрофлюидизации Р8 22Е разбавляли до получения конечной концентрации Р8 6 мг/мл в 0.2 М №1С1 и раствор подводили до рН 6.05 ± 0.2. используя 0.1н. НС1.
Добавляли раствор СВАР (100 мг/мл. свежеприготовленный в смеси ацетонитрил/νΕΙ. 50/50) для достижения подходящего соотношения СВАР/Р8 (1.5/1 мас./мас.).
рН повышали вплоть до рН активации 9.00±0.05 путем добавления 0.5 М ΝηΟΗ и стабилизировали при этом рН до добавления АВН.
Через 3 мин добавляли АВН для достижения соответстующего соотношения АВН/Р8 (8.9/1 мас./мас.); рН регулировали до рН связывания 9.0. Раствор оставляли на 1 ч. регулируя рН.
Производное Р8АН концентрировали и подвергали диафильтрации.
Связывание.
РИФ в концентрации 10 мг/мл в 0.2 М №1С1 добавляли к производному Р822ЕАН для достижения соотношения РйФ/Р822Еан 4/1 (мас./мас.). рН доводили до 5.0±0.05. используя НС1. Добавляли раствор ЕВАС (20 мг/мл в 0.1 М Трис-НС1. рН 7.5) вручную в 10 мин (250 мкл/мин) для достижения 1 мг ЕВАС/на один мг Р822ЕАН. Полученный раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали 60 мин) при 25°С при перемешивании и регулировании рН. Раствор нейтрализовали путем добавления 1 М Трис-НС1. рН 7.5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25°С.
Перед элюированием на 8ерИасгу1 8400НК конъюгат осветляли с использованием фильтра 5 мкм МшЦаЛ.
- 23 014165
Полученный конъюгат имеет конечное соотношение ΡΗίΌ/Ρδ 4,1 (мас./мас.), содержание свободного Ρδ ниже 1% и антигенность (α-Ρδ/α-Ρδ) 36,3% и анти-ΡΜΟ антигенность 7,4%.
Очистка конъюгатов.
Конъюгаты очищали гель-фильтрацией, используя колонку для гельфильтрации 8ерЬасгу1 8400НК, уравновешенную 0,15 М №С1 (8500НК для 18С) для удаления небольших молекул (включая ^МАΡ) и неконъюгированных Ρδ и белка. Из-за разных молекулярных размеров компонентов реакционной смеси конъюгаты Ρδ-ΡΌ, Ρδ-ΤΤ, Ρδ-ΡΗίΌ, Ρδ-пневмолизин или Ρδ-ΌΤ элюируются первыми, затем свободный Ρδ, затем свободный ΡΌ или свободный ΌΤ и наконец ΩΙΗΑΡ и другие соли (№С1, глицин).
Фракции, содержащие конъюгаты, определяли по УФ280 нм. Фракции собирали в соответствии с их Кб, подвергали стерильной фильтрации (0,22 мкм) и хранили при +2-8°С. В препаратах конъюгатов определяли соотношения Ρδ/белок.
Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Ρδ δ. рпеитошае-белок Ι)/ΤΤ/Ι)Ί7ΡΙιΐΙ)/Ρ1\
Если в заголовке колонки появляется микрофлюид., это указывает на то, что перед конъюгированием сахарид уменьшали в размере посредством микрофлюидизации. Размеры сахаридов после микрофлюидизации приведены в табл. 2.
Таблица 1. Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Ρδ δ. рпеитошае-белок
Ρ/ΤΤ/ΡΤ/ΡΙιΐΡ/ΡΕ
Серотип 1 микрофлюид. 4 микрофлюид. 5 6А 6В 7Е микрофлюид.
Конц. Р8 (мг/мл) 2,5 2,5 7,1 5,0 5,0 5,0
Растворение РЭ М/Я \Л/Р1 \Л/Р! 2 М ЫаС1 2 М №01 2 М ЫаС!
Конц. Ρϋ (мг/мл) 10,0 10,0 5,0 5,0 5,0 10,0
Исходное соотношение Ρϋ/Ρ8 (масс./масс.) 1,5/1 1,5/1 1/1 1/1 1,1/1 1,2/1
Конц. СОАР (мг/мг Р8) 0,50 0,50 0.79 0,83 0,83 0,75
рНа=рНс=рН(| 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Серотип 91/ микрофлюид. 14 микрофлюид. 18С микрофлюид. 19А микрофлюид. 19Е микрофлюид. 22Р микрофлюид. 23Р
Конц. Р8 (мг/мл) 5,0 5,0 4,5 15,0 9,0 6,0 2,38
Растворение Р5 2 М №С1 2 М ЫаС1 2 М №С! 2 М ИаС! 2 М МаС! 0,2 М №С1 2 М ЫаС1
Конц, белканосителя (мг/мл) 10,0 10,0 20,0 (ТТ) 10,0 (Р!у) 20,0 (ОТ) 10,0 (РИЮ) 5,0
Исходное соотношение белокноситель/РЗ (масс./масс.) 1,2/1 1,2/1 2/1 2,5/1 1,5/1 3/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг Р8) 0,50 0,75 0,75 1,5 1,5 1,5 0,79
рН.=рНс=рН<, 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Примечание: рНа,с,д соответствуют рН активации, связывания и гашения соответственно Определение характеристик.
Каждый конъюгат был охарактеризован и соответствовал характеристикам, описанным в табл. 2.
- 24 014165
Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли резорциновым методом, а содержание белка (мкг/мл) тестированием по Лоури. Конечное соотношение Р8/РЭ (мас./мас.) определяют по соотношению этих концентраций.
Содержание свободного полисахарида (%).
Содержание свободного полисахарида в конъюгатах, выдерживаемых при 4°С или хранимых в течение 7 суток при 37°С, определяли на супернатанте, полученном после инкубации с антителами на αбелок-носитель и насыщенным сульфатом аммония с последующим центрифугированием.
Для количественного определения свободного полисахарида в супернатанте использовали ЕЫ8А а-Р8/а-Р8. Отсутствие конъюгата также контролировали с использованием ЕЫ8А для α-белокноситель/а-Р8.
Антигенность.
Антигенность вышеупомянутых конъюгатов анализировали в ЕЫ8А сэндвич-типа, где антителами захвата и детекции были а-Р8 и α-белок соответственно.
Содержание свободного белка (%).
Неконъюгированный белок-носитель может быть отделен от конъюгата во время стадии очистки. Содержание свободного остаточного белка определяли, используя эксклюзионную (гель-проникающую) хроматографию (8ЕС) (Т8К 5000-РVX^) с последующим УФ-детектированием (214 нм). Условия элюирования позволяли разделять свободный белок-носитель и конъюгат. Затем определяли содержание свободного белка в нерасфасованном конъюгате по калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг белка-носителя в мл). Свободный белок-носитель в % выражали следующим образом:
% свободного носителя = (свободный носитель (мкг/мл))/(общая концентрация соответствующего белка-носителя, измеренная по Лоури (мкг/мл)) · 100%.
Стабильность.
Молекулярно-массовое распределение (Кау) и стабильность определяли по результатам НРБС-8ЕС гельфильтрации (Т8К 5000-РVX^) для конъюгатов, выдерживаемых при 4°С или хранимых в течение 7 суток при 37°С.
Определение характеристик 10/11/13/14-валентных конъюгатов приведено в табл. 2 (см. комментарий под ней).
Белковые конъюгаты могут быть адсорбированы на фосфате алюминия и объединены с образованием конечной вакцины.
Вывод.
Получены иммуногенные конъюгаты, которые, как затем было показано, являются компонентами многообещающей вакцины.
Таблица 2. Характеристики конъюгатов
Конъюгаты Размер Ρ8 (Да χ 103) Соотношение носитель/РЗ Свободный РЗ (ЕНза) Свободный носитель Антигенность РЗ (ЕНва) Размер конъюгата (кДа)
Ρ81-Ρϋ 349- 382* 1,5-1,6 1,0%- 1,2% 3,9%-4,8% 87%-95% 1499- 1715
Ρ$4-Ρϋ 93-100* 1,5-1,6 4,7- 6,5% 3,2%-4,0% 90%-96% 13031606
Ρ85-Ρϋ*** 367-443 0,80 8,7- 11,2% 2,2%-3,8% 93%108% 1998- 2352
РЗбА-Ρϋ 1100- 1540 0,61 4,5% Не определ. 45,9% Не определ
РЗбВ-Ρϋ*** 1069- 1391 0,7-0,8 1,3- 1,6% <2,0% 68%-75% 4778- 5235
Р37Р-Р0 255- 264* 1,1-1,2 <1% <1,4% 58% 39074452
Ρ39ν-Ρϋ 258280* 1,3-1,5 <1% <1,3% 67%-69% 9073- 9572
Ρ314-Ρϋ 232- 1.4 <1% <1,5% 70% 3430-
241* 3779
Р318С-ТТ 89-97* 2,2-2,4 1,52,2% <4% 46%-56% 5464- 6133
Р319А-Р1у* 151 3,2 <1% 29%
Ρ819Ρ-ϋΤ 133143* 1,4-1,5 4,1%-5,9% <1,2%- <1,3% 82%-88% 2059- 2335
Ρ822ΡΡΜϋ* 159-167 2,17 5,8 Не определ. 37% Не определ.
Ρ322ΡΛΗΡΜϋ* 159-167 3,66-4,34 <1% Не определ 28-31% Не определ
Ρ523Ερρ*** 914-980 0,5 1,4- 1,9% 3,7%-4,9% 137%- 154% 2933- 3152
* размер Р8 после микрофлюидизации нативного Р8.
- 25 014165
Приготавливали 10-валентную вакцину путем смешивания конъюгатов серотипов 1, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р (например, в дозе 1,3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида соответственно на дозу, предназначенную для человека). Приготавливали 11-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгат серотипа 3 из табл. 5 (например, 1 мкг сахарида на дозу, предназначенную для человека). Приготавливали 13-валентную вакцину, дополнительно добавляя конъюгаты серотипов 19А и 22Р, упомянутые выше (где 22Р либо непосредственно связан с РЫБ, либо, альтернативно, через линкер АБН) [например, в дозе 3 мкг каждого сахарида на дозу, предназначенную для человека]. 14-Валентная вакцина может быть приготовлена путем дополнительного добавления конъюгата серотипа 6А, упомянутого выше [например, в дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека].
Пример 3. Подтверждение того, что включение белка Б НаеторЫ1ик тПиепхае в иммуногенную композицию по изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого среднего отита (АОМ).
Дизайн исследования.
В данном исследовании использовали вакцину 11Рп-РБ, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6В, 7Р, 9У, 14, 18С, 19Р и 23Р, каждый из которых конъюгирован с белком Б из Н. тПиепхае (ссылка на табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали на две группы, получающие четыре дозы либо вакцины 11РпРБ, либо Наупх, в возрасте приблизительно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты получали вакцину 1пГаппх-Ыеха (Б'ГРа-НВУ-ТРУ/ШЬ) фирмы 68К Вю1ощса1к одновременно в возрасте 3, 4 и 5 месяцев. 1пГаппх-Ыеха представляет собой комбинацию Рей1апх и Н1Ь, смешанных перед введением. Контрольное наблюдение эффективности для анализа согласно протоколу (АТР) начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до достижения возраста 24-27 месяцев. В выбранной подгруппе субъектов оценивали носоглоточный перенос 8. рпеитошае и Н. тПиепхае.
Родителей приглашали на консультацию к исследователю, если их ребенок испытывал тошноту, имел боль в ушах, самопроизвольную перфорацию барабанной перепонки или самопроизвольные выделения из уха. Если у исследователя было подозрение на эпизод АОМ, ребенка немедленно отсылали к специалисту отоларингологу (ухо, нос, горло (Еаг, №ке и ΤЬ^οа! (ΞΝΤ))) для подтверждения диагноза.
Клинический диагноз АОМ был основан либо на визуальной картине барабанной перепонки (т.е. покраснение, вздутие, потеря отражена света), либо на наличии выделения жидкости из среднего уха (как продемонстрировано с помощью простой или пневматической отоскопии или с помощью микроскопа). К тому же, должны были присутствовать по меньшей мере два из следующих признаков или симптомов: боль в ушах, выделения из уха, тугоухость, жар, вялость, возбудимость, анорексия, тошнота или диарея. Если специалист ΞΝΤ подтверждал клинический диагноз, отбирали посредством тимпаноцентеза пробу жидкости среднего уха для бактериологического тестирования.
Для субъектов с повторными приступами тошноты устанавливали начало нового эпизода АОМ, если от начала предыдущего эпизода проходило более 30 суток. К тому же эпизод АОМ считался новым бактериальным эпизодом, если выделенные бактерия/серотип отличались от предыдущего изолята, какой бы ни был интервал между двумя последовательными эпизодами.
Результаты испытания.
Суммарно было охвачено 4968 маленьких детей, 2489 в группе 11Рп-РБ и 2479 в контрольной группе. Никаких больших различий в демографических характеристиках или факторах риска среди этих двух групп не имелось.
Клинические эпизоды и определение случаев АОМ.
В период контрольного наблюдения по протоколу суммарно было зарегистрировано 333 эпизода клинического АОМ в группе 11Рп-РБ и 499 в контрольной группе.
В табл. 3 представлена защитная эффективность вакцины 11Рп-РБ и обеих 7-валентных (7-ν) вакцин, ранее протестированных в Финляндии (Екко1а е! а1. Ν. Епд1. 1. Мей. 2001, 344: 403-409 и К11р1 е! а1. С11п. 1пГес!. Б1к. 2003, 37: 1155-64) в отношении любого эпизода АОМ и АОМ, вызываемого разными пневмококковыми серотипами, Н. тПиеи/ае, ΝΤΕί и М. са1аггЫа11к.
Статистически значимое и клинически релевантное уменьшение на 33,6% общей тяжести заболевания АОМ было достигнуто при использовании 11Рп-РБ, независимо от этиологии (табл. 3).
Общая эффективность в отношении эпизодов АОМ вследствие присутствия любых 11 пневмококковых серотипов, содержащихся в вакцине 11Рп-РБ, составляла 57,6% (табл. 3).
Другим важным результатом в настоящем исследовании является 35,6%-ная защита, обеспечиваемая 11Рп-РБ вакциной против АОМ, вызываемого Н. тПиепхае (и конкретно 35,3%-ная защита, обеспечиваемая ΝΠΉί) Этот результат имеет большую клиническую значимость, предполагая повышенную значимость Н. тПиепхае в качестве основной причины АОМ в эпоху пневмококковых конъюгатных вакцин. Параллельно с защитой, которую вакцина 11Рп-РБ обеспечивала против АОМ, она также уменьшала носоглоточный перенос Н. тПиепхае после бустерной дозы на втором году жизни. Эти результаты противоречат предыдущим наблюдениям, полученным в Финляндии, где для обеих 7-валентных пневмококковых конъюгатных вакцин наблюдалось увеличение количества эпизодов АОМ, обусловленных Н тПиепхае (Екко1а и др. и К11р1 и др.), как свидетельство этиологического замещения.
Четкой корреляции между защитой против эпизодов АОМ, обусловленных Н1, и уровнями антител
- 26 014165 против носителя белка Ό установить не удалось, поскольку концентрации анти-ΡΌ 1дС-антител после первичной вакцинации у вакцинированных 11Ρπ-Ρ6, у которых не было Ηί АОМ эпизодов, по существу, были аналогичны уровням анти-ΡΌ 1дС антител после первичной вакцинации, измеренным у вакцинированных с примененим ΠΡ^Ρά, у которых развивался по меньшей мере один Ηί АОМ эпизод в течение периода контрольного наблюдения эффективности. Однако, несмотря на то что не удалось установить никакой корреляции между биологическим воздействием вакцины и 1дС анти-ΡΌ иммуногенностью после первичной вакцинации, разумно предположить, что белок-носитель ΡΌ, который является высоко консервативным среди штаммов Н. тПиеи/ае, внес большой вклад в индукцию защиты против Ηί.
Влияние на заболевание АОМ сопровождалось влиянием на носоглоточный перенос, которое имело аналогичную величину для пневмококков и Н. тПиепхае вакцинных серотипов (фиг. 1). Это уменьшение носоглоточного переноса Н. тПиепхае у вакцинируемых ΡΌ-конъюгатами поддерживает гипотезу прямого защитного эффекта ΡΌ-конъюгатной вакцины против Н. тПиеи/ае, даже если защитная эффективность не могла коррелировать с анти-ΡΌ 1дС-иммунными ответами при измерении посредством ЕЫ8А.
В следующем эксперименте использовали модель среднего отита на шиншиллах с использованием сывороточных пулов от маленьких детей, иммунизированных 11-валентной композицией из этого примера или 10-валентной вакциной из примера 2 (см. также табл. 1 и 2 и комментарии под ними). Оба пула вызывают значительное уменьшение процента животных со средним отитом по сравнению с сывороточным пулом до иммунизации. Нет никакого значимого различия между 10- и 11-валентными иммунными пулами. Это показывает, что обе вакцины имеют одинаковую эффективность в индуцированию защиты против среднего отита, вызываемого нетипируемым Н. тПиепхае в данной модели.
Таблица 3
Тип эпизода АОМ ПРп-РЦ Ргеупаг в ΡίηΟΜ 7ν-ΟΜΡ в ΡϊηΟΜ
п УЕ п УЕ Л УЕ
11Рп- РЦ Контроль % ДИ 95% 7ν- СКМ Контроль % ДИ 95% 7ν- ОМР Контроль % ДИ 95%
ΙΛ υι ы. иь ίί υί
N 2455 2452 786 794 805 794
Любой АОМ 333 499 33,6 20,8 44,3 1251 1345 6 -4 16 1364 1345 -1 -12 10
Любой АОМ с МЕЕ 322 474 32,4 19,0 43,6 1177 1267 7 -5 17 1279 1267 0 -12 10
Культурально подтвержденный пневмококк 92 189 51,5 36,8 62,9 271 414 34 21 45 314 414 25 11 37
Вакцинные пневмококковые серотипы (*) 60 141 57,6 41,4 69,3 107 250 57 44 67 110 250 56 44 66
Другие бактериальные патогены
Н. тйоепгае 44 68 35,6 3,8 57,0 315 287 -11 -34 8 315 287 -9 -32 10
Нетипируемый Н. /пЯиелгае (ΝΤΗΪ) 41 63 35,3 1.8 57,4 ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΡ ΝΟ ΝΡ ΝΡ
М. са1аггбаИа 31 34 9,4 -52,5 46,1 379 381 -1 -19 15 444 381 -16 -36 2
ΝΡ = не опубликовано, N = количество субъектов в группе АТР определения эффективности, п = количество эпизодов;
* Вакцинные пневмококковые серотипы для 11Ρ11-ΡΌ = 11 серотипов, для Ггеупагп 7ν-ОМΡ = 7 серотипов;
МЕЕ = жидкость среднего уха;
ЬЬ = нижний предел; ИЬ = верхний предел, ДИ = доверительный интервал
УЕ = эффективность вакцины
Пример 4. Выбор белка-носителя для серотипа 19Е.
Используемый анализ ЕЫ8А.
Метод ЕЬ18А с ингибированием 22Е, по существу, основан на анализе, предложенном в 2001 г. Сопсерсюп и ЕтаксЕ, и о котором сообщалось в Непскаейк е1 а1., 2006, С11шса1 апб Уассше 1ттипо1оду, 13: 356-360. В кратком изложении, очищенные пневмококковые полисахариды смешивали с метилированным сывороточным альбумином человека и адсорбировали на микротитрационных планшетах для сильного связывания Шпс Махщотр™ (Коккббе, ΌΚ) в течение ночи при 4°С. Планшеты блокировали 10%-ной фетальной сывороткой теленка (ЕВ8) в ΡΒ8 в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Образцы сыворотки разбавляли ΡΒ8, содержащим 10% ЕВ8, 10 мкг/мл полисахарида клеточной стенки (881) и 2 мкг/мл пневмококкового полисахарида серотипа 22Е (АТСС (Американская коллекция типовых культур)) и потом разбавляли в микротитрационных планшетах, используя тот же буфер. Внутренний стандарт, откалиброванный относительно стандартной сыворотки 89-8Е с использова
- 27 014165 нием серотип-специфических концентраций 1дС в 89-8Р был обработан тем же способом и включен в каждый планшет. После промывки связавшиеся антитела детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой моноклонального антитела против 1дС человека (8(га(есЬ 8с1епййс Ь!б., 8ойат, иК), разбавленного в 10%-ной РВ8 (в ΡΒ8), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Для развития окраски использовали готовый к употреблению однокомпонентный набор для иммуноанализа на основе субстрата для фермента пероксидазы тетраметилбензидина (ВюВаб, Негси1е§, СА, И8) в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали, используя 0,18 М Н28О4, и оптическую плотность считывали при 450 нм. Концентрации серотип-специфических 1дС (в мкг/мл) в образцах рассчитывали путем соотнесения значений оптической плотности в определенных пределах с кривой для внутреннего сывороточного стандарта, смоделированой с использованием 4параметрического логистического логарифмического уравнения, рассчитанного с применением программного обеспечения 8ойМах Гго™ (Мо1еси1аг Беуюек, 8ипиууа1е, СА). Порог отсечения для ЕЫ8А составлял 0,05 мкг/мл 1дС для всех серотипов с учетом ограничения по детектированию и предела количественного определения.
Опсонофагоцитарный анализ (ОРА).
На совещании ВОЗ в июне 2003 г. было рекомендовано использовать анализ ОРА, изложенный в Котего-8!етег е! а1. С1т. О1адп. ЬаЬ. 1ттипо1. 2003, 10 (6): рр. 1019-1024. Этот протокол использовали для тестирования ОРА активности серотипов в следующих тестах.
Получение конъюгатов.
В исследования 11Ρπ-Ρ0&0ί-001 и 11Ρπ-Ρ0&0ί-007 были включены три 11-валентных вакцинных композиции (табл. 4), в которых 3 мкг полисахарида 19Р были конъюгированы с дифтерийным анатоксином (19Ρ-ΌΤ) вместо 1 мкг полисахарида, конъюгированного с белком Ό (19Ρ-ΡΌ). Параметры конъюгирования для исследований ΠΡ^ΡΌ, 11Ρπ-Ρ0&0ί-001 и 11Ρπ-Ρ0&0ί-007 описаны в табл. 5, 6 и 7 соответственно.
Антипневмококковые антительные ответы и ОРА активность против серотипа 19Р через один месяц после первичной вакцинации этими 19Ρ-ΌΤ композициями показаны в табл. 8 и 9 соответственно.
В табл. 10 приведены концентрации 22Р-ЕЫ8А-антител и проценты субъектов, достигших порога 0,2 мкг/мл до и после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной.
Показано, что опсонофагоцитарная активность антител, индуцированных этими 19Ρ-ΌΤ композициями, явно усиливалась, что продемонстрировано более высокими уровнями серопозитивности (опсонофагоцитарные титры > 1:8) и СМΤ ОРА через один месяц после первичной вакцинации (табл. 9). Через один месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной опсонофагоцитарная активность 19Р-антител оставалась значительно лучшей у маленьких детей, примированных 19Ρ-ΌΤ композициями (табл. 11).
В табл. 12 представлены данные по иммуногенности после бустерного введения ΠΡ^ΡΌ начинающим ходить детям, ранее примированным конъюгатами 19Ρ-ΌΤ или 19Ρ-ΡΌ, по сравнению с 4-ой последовательной дозой Огсупаг®. Приведенные обнаруженные случаи, отмеченные после введения ΡϊΌνικίΓ® в США, улучшенная опсонофагоцитарная активность против серотипа 19Р при конъюгации с белком-носителем ΌΤ могут быть полезны для вакцины-кандидата.
В табл. 13 приведены данные ЕЬ18А и ОРА для конъюгата 19Ρ-ΌΤ по отношению к перекрестнореактивному серотипу 19А. Было обнаружено, что 19Ρ-ΌΤ индуцирует низкую, но значимую ОРА активность против 19А.
Таблица 4. Пневмококковые конъюгатные вакцинные композиции, использованные в клинических исследованиях
Композиция Пневмококковый серотип мкг/белок-носитель ΑΡ+ ΜΓ
1 3 4 5 6Β 7Γ 9ν 14 18С 19Ε 23Ε
ΙΐΡπ-Ρϋ 1/Ρϋ 1/Ρϋ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/ΡΟ 1/Ρϋ 1/Ρϋ <0,8
19Р-0Т Форма 1 3/РЭ 3/Ρϋ 3/ΡΟ 3/Ρϋ 10ЮТ з/Ρϋ з/Ρϋ з/Ρϋ 3/Ρϋ ЗЮТ 5/ϋΤ <0,35
19ΕΌΤ Форма 2 З/РБ 2/Ρϋ 2/Ρϋ з/Ρϋ 5/ϋΤ 3/Ρϋ 2/Ρϋ 2/Ρϋ 2/ρσ з/ϋτ 5.ΌΤ <0,35
19Г-0Т Форма 3 3/ΡΩ 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/Ρϋ 3/Ρϋ з/Ρϋ ЗЮТ 3/ΡΟ = 0,5
- 28 014165
Таблица 5. Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р8 8. рпеитошае-белок Ό/ΤΤ/ΌΤ
Серотип 1 Нативный 3 микрофлюид. 4 Нативный 5 Нативный 6В Нативный 7Р Нативный
Конц. Р8 (мг/мл) 1,5 2 2,0 7,5 5,5 3,0
Растворение РЗ 150 мМ ЫаС1 2 М №С1 ννη ννπ 2 М №С) 2 М №С1
Конц. ΡΌ (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Исх. соотн. Ρ3/Ρϋ (масс./масс.) 1/0,7 1/1 1/1 1/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рНа=рНс=рНа 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 мин 60 мин
Серотип ЭУ Нативный 14 Нативный 18С Нативный 19Е Нативный 23Р Нативный
Конц. РЗ (мг/мл) 1.75 2,5 1.75 4,0 2,5
Растворение РЗ 2 М №С! 2 М ЫаС1 ννπ 2 М ЫаС1 2 М ЫаС1
Конц. РО (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Исх. соотн. Ρ3/Ρϋ (масс./масс.) 1/0,75 1/0,75 1/1,2 1/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рНа=рНс=рН0 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 30 мин 60 мин
Таблица 6. Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р8 8. рпеитошае-белок Ό/ΌΤ для исследования 11Рп-Р0&0|-001
Серотип 1 микрофлюид. 3 микрофлюид. 4 микрофлюид. 5 микрофлюид. 6В микрофлюид. 7Р Нативный
Конц. РЗ (мг/мл) 4 2,0 2,5 7,5 10 3,0
Растворение РЗ 2 М ИаС! 2 М МаС1 2 М №С! 2 М ИаС! 2 М ИаС) 2 М №С!
Конц. Ρϋ (мг/мл) 10,0 5,0 5,0 5,0 2 М №С( 20 (ϋΤ) 2 М №С1 5,0
Исх. соотн. Ρϋ/Ρ8 (масс./масс.) 1,2/1 1/1 1/1 1/1 1,5/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 1,50 0,75 1,5 2 1,5 0,75
рНа=рНс=рН0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9/9/9
Время связывания 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин 60 мин
- 29 014165
Серотип 9У Нативный 14 Нативный 18С микрофлюид. 19Р микрофлюид. 23Р микрофлюид.
Конц. Р8 (мг/мл) 1,75 2,5 5,0 9,0 10
Растворение РЗ 2 М №С| 2 М №С1 2 М ЫаС1 2 М ЫаС| 2 М №С1
Конц, белканосителя (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 20 (ОТ) 10 (ОТ)
Исх. соотн. белокноситель/РЗ (масс./масс.) 0,75/1 0,75/1 1,2/1 1,5/1 1,5/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,75 0,75 1,5 1,5 0,75
рНа=рН0=рНа 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 30 мин 60 мин 60 мин
Таблица 7. Конкретные условия активации/связывания/гашения конъюгатов Р8 8. рпеитошае-белок Э/ЭТ для исследования 11Рп-РЭ&0|-007
Серотип 1 Нативный 3 микрофлюид. 4 Нативный 5 Нативный 6В Нативный 7Е микрофлюид.
Конц. РЗ (мг/мл) 1,5 2,0 2 7,5 5,5 5,0
Растворение РЗ 150 мМ №С1 2 М №С1 ννρι ννρι 2 М №С< 2 М ЫаС1
Конц. РО (мг/мл) 5,0 5,0 5,0 5,0 5 10
Исх. соотн. РЭ/РЗ (масс./масс.) 0,7/1 1/1 1 1/1 1/1 1,2/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
рНа=рНс=рНа 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 40 мин 60 мин 60 мин
Серотип 9Ϋ микрофлюид. 14 микрофлюид. 18С Нативный 19А микрофлюид. 19Р микрофлюид. 23Р микрофлюид.
Конц. РЗ (мг/мл) 5,0 5,0 1,75 9,0 10,0 9,5
Растворение РЗ 2 М №С1 2 М №С1 ννρι 2 М №С1 2 М №С1 2 М №С1
Конц, белканосителя (мг/мл) 10 10,0 5,0 20 (ОТ) 5,0 (Ρϋ) 10
Исх. соотн. белокноситель/РЗ (масс./масс.) 1,2/1 1,2/1 1,2/1 1,5/1 1,2/1 1/1
Конц. СОАР (мг/мг РЗ) 0,5 0,75 0,75 1,5 0,75 0,75
рНэ=рНс=рН0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Время связывания 60 мин 60 мин 45 мин 120 мин 120 мин 60 мин
- 30 014165
Таблица 8. Процентное содержание субъектов с концентрацией 19Р-антител > 0,20 мкг/мл и средними геометрическими концентрациями 19Р-антител (СМС с ДИ 95%; мкг/мл) через один месяц после первичной вакцинации 1 мкг 19Р-РИ, 3 мкг 19Р-ИТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СВМ) (общая группа)
Группа 11Ρπ-Ρϋ&Οί-001 (22Е-ЕИ8А) 11Ρη-ΡΟ&ϋί-007 (22Ε-Ε1.Ι8Α)
N %А20 мкг/мл (ДИ 95%) ОМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N % ;> 20 мкг/мл (ДИ 95%) ОМС (мкг/мл) (ДИ 95%)
ИРп-Ρϋ 152 98,7 (95,3-99,8) 1,93 (1,67-2,22) 50 100 (92,9-100) 2,78 (2,31-3,36)
19Ε-ϋΤ Форма 1* 146 99,3 (96,2-100) 2,88 (2,45-3,38) - - -
19Е-0Т Форма 2* 150 96,0 (91,5-98,5) 2,43 (2,01-2,94) - - -
19Е-ИТ Форма 3* - - 50 96,0 (86,3-99,5) 3,70 (2,58-5,30)
Ргеупаг 148 98,6 (95,2-99,8) 2,98 (2,60-3,41) 41 97,6 (87,1-99,9) 2,91 (2,15-3,94)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 9. Процентное содержание субъектов с 19Р-ОРА-титром > 1:8 и 19Р-ОРА СМТ через один месяц после первичной вакцинации с использованием 1 мкг 19Р-РИ, 3 мкг 19Р-ИТ или Ргеупаг (2 мкг 19Р-СВМ) (общая группа)
Г руппа 11Ρη4Ό&Οϊ-001 11 Рп-РО&Ы-007
N % £ 1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%) N %>1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%)
ιίΡη-Ρϋ 136 84,6 (77,4-90,2) 77,8 (58,1-104,4) 46 95,7 (85,2-99,5) 167,8 (118,1-238,6)
19ΕΌΤ Форма 1* 137 95,6 (90,7-98,4) 263,2 (209,4-330,7) - - -
19Р-0Т Форма 2* 139 92,1 (86,3-96,0) 218,9 (166,5-287,9) - - -
19ΕΌΤ Форма 3* * 49 91,8 (80,4-97,7) 403,1 (225,7-719,9)
Ргеупаг 131 86,3 (79,2-91,6) 82,6 (61,1-111,6) 38 81,6 (65,7-92,3) 65,0 (37,7-112,2)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 10. Процентное содержание субъектов с концентрацией 19Р-антител > 0,20 мкг/мл и СМС 19Рантител (мкг/мл) до и через один месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной детей, примированных с использованием 1 мкг 19Р-РИ, 3 мкг 19Р-ИТ или Ргеупаг(2 мкг 19Р-СВМ) (общая группа)
Первичная группа 11ΡΠ-ΡΟ&ΟΪ-002 (22Е Ей®А)
До бустерной вакцинации Через один месяц после бустерной иммунизации 23валентной Р8-вакциной
N % £ 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) ОМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N % > 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%)
11Ρη-Ρϋ 70 77,1 (65,6-86,3) 0,67 (0,45-0,98) 67 94,0 (85,4-98,3) 11,50 (7,76-17,03)
19Г-0Т Форма 1* 68 91,2 (81,8-96,7) 0,71 (0,54-0,94) 69 98,6 (92,2-100) 14,50 (10,47-20,07)
19ΡΌΤ Форма 2* 74 81,1 (70,3-89,3) 0,59 (0,43-0,80) 72 95,8 (88,3-99,1) 9,90 (6,74-14,54)
Ргеупаг 65 64,6 (51,8-76,1) 0,40 (0,27-0,60) 67 100 (94,6-100) 9,40 (6,95-12,71)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
- 31 014165
Таблица 11. Процентное содержание субъектов с титром 19Е-ОРА > 1:8 и 19Е-ОРА СМТ до и через один месяц после бустерной иммунизации 23-валентной простой полисахаридной вакциной детей, примированных 1 мкг 19Е-РЭ. 3 мкг 19Е-ЭТ или Ргеуиаг (2 мкг 19Е-СКМ) (общая группа)
Первичная группа 11Ρη-ΡΟΛϋί-002
До бустерной вакцинации Через один месяц после бустерной иммунизации 23валентной РЗ-вакциной
N % £ 1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%) N % 2:1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%)
11 Ρπ-Ρϋ 29 27,6 (12,7-47,2) 10,9 (5,0-23,7) 28 82,1 (63,1-93,9) 408,0 (157,3-1058,3)
19ΕΌΤ Форма 1* 19 47,4 (24,4-71,1) 18,1 (7,2-45,7) 18 94 4 (72,7-99,9) 1063,8 (386,6-2927,5)
19Ε-ϋΤ Форма 2* 27 (А, 8,5 (4,7-15,3) 28 100 (87,7-100) 957,6 (552,8-1659,0)
Ргечпаг 24 12,5 (2,7-32,4) (3,4-19,6) 23 82,6 (61,2-95,0) 380,9 (133,2-1089,5)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Таблица 12. Процентное содержание субъектов с концентрациями антител > 0,2 мкг/мл, ОРА > 1:8 и
СМС/СМТ против пневмококков 19Е через один месяц после бустерной иммунизации вакциной 11Рп-РЭ или Ргеуиаг детей, примированных 1 мкг 19Е-РО, 3 мкг 19Е-ЭТ или
Ргеуиаг (2 мкг 19Е-СКМ) (общая группа)
Первичная группа 11Ρη-ΡΟ&ϋί-002
Анализ 22Р-ЕИ8А Анализ ОРА
N % £ 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N %2 1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%)
11Ρη-Ρϋ 70 100 (94,9-100) 4,52 (3,7-5,5) 21 100 (83,9-100) 255,6 (135,5-481,9)
19Е-0Т Форма 1* 66 98,5 (91,8-100) 3,45 (2,8-4,3) 23 95,7 (78,1-99,9) 374,0 (192,6-726,2)
19ΕΌΤ Форма 2* 70 98,6 (92,3-100) 3,80 (2,9-4,9) 29 96,6 (82,2-99,9) 249,1 (144,7-428,7)
Ргвчпаг 69 97,1 (89,9-99,6) 2,56 (2,0-3,3) 31 96,8 (83,3-99,9) 528,7 (319,4-875,2)
* Состав разных композиции приведен в табл. 4.
Таблица 13. Процентное содержание субъектов с концентрациями антител > 0,2 мкг/мл, ОРА > 1:8 и
СМС/СМТ против пневмококков 19А через один месяц после первичной вакцинации 1 мкг 19Е-РО, 3 мкг 19Е-ЭТ или Ргеуиаг (2 мкг 19Е-СКМ) (общая группа)
Группа 11Ρη-ΡΟ&ϋϊ-001
Анализ 22Ρ-ΕΙ.Ι8Α Анализ ОРА
N % £ 0,20 мкг/мл (ДИ 95%) СМС (мкг/мл) (ДИ 95%) N % > 1:8 (ДИ 95%) СМТ (ДИ 95%)
11РЛ-РО 45 28,9 (16,4-44,3) 0,09 (0,07-0,11) 52 7,7 (2,1-18,5) 5,2 (4,0-6,8)
19Е-0Т Форма 2* 51 29,4 (17,5-43,8) 0,11 (0,08-0,16) 59 27,1 (16,4-40,3) 12,4 (7,6-20,3)
Ргечпаг 55 18,2 (9,1-30,9) 0,10 (0,08-0,12) 61 3,3 (0,4-11,3) 4,6 (3,8-5,6)
* Состав разных композиций приведен в табл. 4.
Пример 5. Эксперименты с адъювантами в доклинических моделях: влияние на иммуногенность пневмококковых 11-валентных полисахаридных конъюгатов у пожилых макак-резус.
Для оптимизации ответа, вызываемого на конъюгатные пневмококковые вакцины у пожилого населения, С8К изготовила 11-валентную полисахаридную (Р8) конъюгатную вакцину с новым адъювантом Адъювантом С - см. ниже.
Группы из 5 пожилых макак-резус (в возрасте 14-28 лет) иммунизировали внутримышечно (в/м) на 0-е и 28-е сутки, используя 500 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, адсорбированных на 315 мкг А1РО4, либо 11-валентных Р8 конъюгатов, смешанных с адъювантом С.
- 32 014165
В обеих вакцинных композициях каждый из 11-валентных Р8 конъюгатов был составлен из следующих конъюгатов: Р81-РП, Р8З-РП, Р84-РП, Р85-РП, Р87Е-РП, Р89У-РП, Р814-РП, Р818С-РП, Р819ЕРЭ, Р82ЗЕ-ЭТ и Р86В-ЭТ Доза применяемой вакцины составляла 1/5 дозы вакцины для человека (5 мкг каждого сахарида на дозу для человека за исключением 6В [10 мкг]), конъюгированной в соответствии с условиями табл. 6 (пример 4), за исключением того, что 19Е приготавливали в соответствии со следующими условиями способа с использованием СААР: уменьшенный в размере сахарид 9 мг/мл, РЭ 5 мг/мл, начальное соотношение РЭ/Р8 1,2/1, концентрация СЭАР 0,75 мг/мг Р8, рНа=рНс=рНс.| 9,0/9,0/9,0 и время связывания 60 мин.
Уровни анти-Р8 ЕЬ18А 1дС и опсонофагоцитарные титры измеряли в сыворотке, собранной на 42-е сутки. Частоту встречаемости анти-Р8З В-клеток памяти измеряли с использованием Ейкро! в клетках периферической крови, собранных на 42-е сутки.
Согласно результатам, показанным в данном описании ниже, адъювант С значительно усиливал иммуногенность 11-валентных Р8 конъюгатов по сравнению с конъюгатами с А1РО4 на пожилых макаках. Новый адъювант усиливал 1дС-ответы на Р8 (фиг. 1) и опсонофагоцитарные титры антител (табл. 14). Также было доказательно очевидно, что частота встречаемости Р8З-специфических В-клеток памяти возрастала в результате применения адъюванта С (фиг. 2).
Таблица 14. Иммуногенность конъюгатов у пожилых макак-резус (опсонофагоцитарные титры после второй иммунизации (рокЫГ)).
Р81 Ρδ3 Р84 Р35 Р86В Р37Е Р39У Р314 Р318С Р319Е Р523Р
11 -валент До иммуниз <8 5 <8 5 <8 16 <8 <8 <8 <8 <8
А1Р0< 14-е сут ροδί II 8 181 64 49 64 4096 42 37 169 64 <64
11 -валент До иммуниз 5 δ <8 5 8 37 <8 <8 <8 <8 <8
Адъюв С 14-е сут ροδί II 776 1351 891 676 6208 16384 111 161 7132 2048 <64
Ейкро! В-клеток
Принцип данного анализа основан на том факте, что В-клетки памяти созревают в плазматические клетки ίη νίΙΐΌ после культивирования с СрС в течение 5 суток. Генерированные ίη νίΙΐΌ антигенспецифические плазматические клетки можно легко детектировать и, следовательно, их можно подсчитать с использованием еНкроРанализа В-клеток. Количество специфических плазматических клеток отображает частоту встречаемости В-клеток памяти в культуре в начальный момент.
В кратком изложении, образованные ίη ν 11го плазматические клетки инкубируют в культуральных планшетах, покрытых антигеном. Антиген-специфические плазматические клетки образуют пятна антитело/антиген, которые детектируют с использованием стандартной иммуноферментной методики и подсчитывают как В-клетки памяти. В настоящем исследовании для того, чтобы подсчитать соответствующие В-клетки памяти, для покрытия культуральных планшетов использовали полисахариды. Результаты выражают в виде частоты встречаемости Р8-специфических В-клеток памяти на миллион В-клеток памяти.
Это исследование показало, что адъювант С может смягчать известную проблему биостабильности Р8З (см. 5-й международный Симпозиум по пневмококкам и пневмококковым заболеваниям, 2-6 апреля 2006 года, А11се 8ргтдк, Центральная Австралия, Специфичность иммунных ответов против пневмококкового конъюгата серотипа З. 8сйиегтап Ь, Ргути1а К., Роо1тап ί. АЬк1гас1: Ьоок, р. 245, РО10.06).
Пример 6. Эффективность детоксифицированного пневмолизина (БР1у) в качестве белкового носителя для усиления иммуногенности Р8 19Г у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-е, 14-е и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 4-валентного простого Р8, либо 4-валентного БР1у-конъюгированного Р8, в обоих случаях в смеси с адъювантом С.
Обе вакцинные композиции содержали по 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из следующих Р8: Р88, Р812Г, Р819Г и Р822Г.
Уровни ЕЫ8А анти-Р8 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
Анти-Р819Е-ответ, показанный в качестве примера на фиг. З, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные БР1у-конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными простыми Р8. Аналогичное улучшение наблюдалось для анти-Р88, 12Г и 22Г 1дС-ответов (данные не показаны).
Пример 7. Эффективность пневмококкового белка Ό гистидинового триадного семейства (Р11Ю) в качестве белкового носителя для усиления иммуногенности Р8 22Г у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-е, 14-е и 28-е сутки, используя 50 мкл либо 4-валентного простого Р8, либо 4-валентного РМЭ-конъюгированного Р8, в обоих случаях в смеси с адъювантом С.
Обе вакцинные композиции содержали по 0,1 мкг (количество сахарида) каждого из следующих Р8: Р88, Р812Г, Р819Г и Р822Г.
Уровни анти-Р8 ЕЫ8А 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
Анти-Р822Е-ответ, показанный в качестве примера на фиг. 4, был значительно усилен у мышей, получавших 4-валентные РМЭ-конъюгаты, по сравнению с мышами, иммунизированными простыми Р8. Аналогичное улучшение наблюдали для анти-Р88, 12Г и 19Г ГдС-ответов (данные не показаны).
- ЗЗ 014165
Пример 8. Иммуногенность 13-валентных Р8 конъюгатов. содержащих 19А-6Р1у и 22Е-Р11Ф у старых С57В1 мышей.
Группы из 30 старых С57В1 мышей (в возрасте более 69 недель) иммунизировали в/м на 0-е. 14-е и 28-е сутки. используя 50 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов. либо 13-валентных Р8 конъюгатов. в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-Валентная вакцинная композиция содержала по 0.1 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РП. Р83-РП. Р84-РП. Р85-РП. Р86В-Р1Г Р87Е-РП. Р89У-РП. Р814-РП. Р818С-ТТ. Р819ЕФТ и Р823Е-РЭ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине. приведенный под табл. 2). 13-Валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0.1 мкг конъюгатов Р819А-6Р1у и Р822Е-Р11Ф (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине. приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Е]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой СМВ8. в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Р8 22Е использовали РИФ. в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию Р11Ф_Е (конструкция УР147 из νΟ 03/054007). В группе 6 19А конъюгировали с дифтерийным анатоксином. а 22Е - с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Е ЕЫ8А 1дС измеряли в индивидуальных образцах сыворотки. собранных на 42-е сутки. ЕЫ8А 1дС-ответ. полученный на остальные Р8. измеряли в объединенных образцах сыворотки.
19А-6Р1у и 22Е-Р11Ф. введенные в составе 13-валентной конъюгатной вакцинной композиции. продемонстрировали иммуногенность у старых С57В1 мышей (табл. 15). Иммунный ответ. индуцированный против остальных Р8. не оказывал негативного воздействия на мышей. получавших 13-валентную композицию. по сравнению с мышами. иммунизированными 11-валентной композицией.
Таблица 15. Р8 иммуногенность у старых С57В1 мышей (уровни 1дС после III иммунизации (рокЕ-Ш))
Старые С57 черные мыши
ЕЫ5А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11 -вал. 11-вал.
19А-6Р1у 19А-дР1у 19А-0Р1у 19А-с1Р1у
дтЬз формол дтЬз формол 19ΑΌΤ
22Е-Р11ГО 22Е-РКЮ 22Е-Р11Ю-Е 22Р-РМР-Е 22Ρ-Ρϋ
0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкп 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл
Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С
1 средний пул 19,30 20,20 24,40 12,80 12,10 13,60
3 средний пул 6,32 4,84 5,21 6,74 2,38 2,54
4 средний пул 60,9 67,1 51,4 47,4 45,5 41,1
5 средний пул 1,34 3,81 3,06 2,75 1,26 1,23
6В средний пул 4,41 4,12 5,88 1,58 2,31 5,64
7Р средний пул 0,83 0,81 1,65 1,98 0,89 0,99
ЭУ средний пул 13,8 23,7 20,0 13,1 15,5 9,6
14 средний пул 25,73 42,96 34,12 32,53 23,97 15,60
18С средний пул 13,4 20,1 11,9 9,1 8,3 8,4
19Е средний пул 57,5 90,0 63,8 36,5 47,0 69,1
23Р средний пул ΝΚ ΝΚ ΝΚ ΝΚ ΝΚ ΝΚ
СМС 0,06 0,09 0,25 0,08 0,23 0,19
19А 1С 0,04-0,1 0,05-0,14 0,15-0,41 0,06-0,12 0,14-0,38 0,09-0,3
%серо 33% 47% 83% 53% 80% 73%
СМС ΝΚ 5,81 3,76 0,54 0,85 2,02
22Е ЕС 3,2-10,6 1,8-7,9 0,3-1,1 0,4-1,7 1,2-3,4
%серо 0% 97% 90% 77% 87% 97%
Пример 9. Иммуногенность 13-валентных Р8 конъюгатов. содержащих 19А-6Р1у и 22Е-РИФ. у молодых Ва1Ь/с мышей.
Группы из 30 молодых Ва1Ь/с мышей (в возрасте 4 недель) иммунизировали в/м на 0-е. 14-е и 28-е сутки. используя 50 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов. либо 13-валентных Р8 конъюгатов. в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
- 34 014165
11-Валентная вакцинная композиция содержала по 0,1 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РИ, Р83-РИ, Р84-РИ, Р85-РИ, Р86В-РИ, Р87Е-РИ, Р89У-РИ, Р814-РИ, Р818С-ТТ, Р819Е-ИТ и Р823Е-РЭ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2). 13-Валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Р819А-бР1у и Р822Е-Р111Э (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Е]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой СМВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Р8 22Е использовали РЕГО, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЕГО_Е (конструкция УР147 из АО 03/054007). В группе 6 конъюгировали 19А с дифтерийным анатоксином, а 22Е - с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Е ЕЫ8А 1дС измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки. ЕЫ8А 1дС-ответ, полученный на остальные Р8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
19А-бР1у и 22Е-РЕ1Э, введенные в составе 13-валентной конъюгатной вакцинной композиции, демонстрировали иммуногенность у молодых Ва1Ь/с мышей (табл. 16). Иммунный ответ, индуцированный против остальных Р8, не оказывал негативного воздействия на мышей, получавших 13-валентную композицию, по сравнению с мышами, иммунизированными 11-валентной композицией.
Таблица 16. Р8 иммуногенность у молодых Ва1Ь/с мышей (рой-ΙΙΙ уровни 1дС)
Ва1ЬС мыши
ЕЫ8А ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11-вал, 0,1мкг/50мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-с1Р1у дтЬз 22Р-Р11Ю 0,1мкг150мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-(1Р1у формол 22Р-РЬЮ 0,1мкг/50мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-ЦР1у дтЬз 22Ρ-ΡΙΗϋ-Ε 0,1мкг/50мкл Адъюв. С 11-вал. 19А-с1Р1у формол 22Р-РЙЮ-Е 0,1мкг/50мкп Адъюв. С 11-вал. 19ΑΌΤ 22Е-Рй 0,1мкг/50мкп Адъюв. С
1 средний Ί пул 131,70 101,20 83,00 82,40 67,90 85,50
* средний * пул 21,85 10,38 12,53 8,83 8,73 14,98
. средний пул 147,4 127,0 104,4 95,0 113,6 114,2
е средний 5 пул 21,38 20,29 18,26 18,95 18,02 23,04
ев средний пул 1,97 4,76 3,72 2,35 1,43 1,05
-- средний /г пул 7,69 4,58 4,77 4,24 3,92 3,94
9ν средний пул 30,1 30,7 26,5 21,4 23,4 28,3
14 средний 4 пул 28,78 27,67 26,23 21,54 24,34 13,73
-ас средний пул 53,4 52,37 46,5 57,8 47,8 75,8
40е средний ’ пул 186,6 157,7 169,3 178,9 181,9 223,2
средний пул 4,98 3,9 5,11 0,57 3,13 4,57
емс 19А 1С %серо 0,4 0,2-0,6 93% 32,8 26,6-40,7 100% 25,1 20,6-30,6 100% 21,6 17,5-26,7 100% 18,9 15,1-23,5 100% 23,5 19,5-28,5 100%
СМС 22Е 1С %серо ΝΡ 0% 3,99 1,9-8,42 93% 3,76 1,8-8 100% 6,27 3,8-10,4 100% 8,70 5,4-13,9 100% 18,76 15,2-23,1 100% |
Пример 10. Иммуногенность 13-валентных Р8 конъюгатов, содержащих 19А-бР1у и 22Е-РЕ1Э, у морских свинок.
Группы из 20 молодых морских свинок (линия ΗηιΐΚν; в возрасте 5 недель) иммунизировали в/м на 0-е, 14-е и 28-е сутки, используя 125 мкл либо 11-валентных Р8 конъюгатов, либо 13-валентных Р8 конъюгатов, в обоих случаях в смеси с адъювантом С (см. ниже).
11-Валентная вакцинная композиция содержала по 0,25 мкг сахарида каждого из следующих конъюгатов: Р81-РИ, Р83-РИ, Р84-РИ, Р85-РИ, Р86В-РИ, Р87Е-РИ, Р89У-РИ, Р814-РИ, Р818С-ТТ, Р819Е-ИТ и Р823Е-РЭ (см. табл. 1 и комментарий к 11-валентной вакцине, приведенный под табл. 2). 13-Валентная вакцинная композиция содержала в дополнение к этому по 0,1 мкг конъюгатов Р819А-бР1у и Р822Е-РЕ1Э (см. табл. 1 и комментарий к 13-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Е]). В группе 2 и 4 носитель пневмолизин детоксифицировали обработкой СМВ8, в группе 3 и 5 для этого использовали формальдегид. В группах 2 и 3 для конъюгирования с Р8 22Е использовали РЕГО, в группах 4 и 5 использовали слитую конструкцию РЕГО_Е (конструкция УР147 из АО 03/054007). В группе б конъюгировали 19А с дифтерийным анатоксином, а 22Е - с белком Ό.
Уровни анти-Р819А и 22Е ЕЫ8А 1дС измеряли в индивидуальных образцах сыворотки, собранных
- 35 014165 на 42-е сутки. ЕЬ18Л 1дС-ответ, полученный на остальные Ρ8, измеряли в объединенных образцах сыворотки.
Таблица 17. Ρ8 иммуногенность у молодых морских свинок (рокЫП уровни 1дС)
Морские свинки
ЕИЗА ГРУППА 1 ГРУППА 2 ГРУППА 3 ГРУППА 4 1 ГРУППА 5 ГРУППА 6
11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал. 11-вал.
19А-с1Р1у 19А-с1Р1у 19А-с1Р1у 19А-с1Р1у
дтЬв формол дтЬ$ формол 19ΑΌΤ
22Е-РНЮ 22Е-РМО 22Р-Р11Ю-Е 22Е-Р11Ю-Е 22Ε-Ρϋ
0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл 0,1мкг/50мкл
Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв. С Адъюв С Адъюв. С
1 средний пул 78,00 77,21 76,15 68,77 68,59 81,04
3 средний пул 7,75 9,31 12,73 7,94 4,75 9,59
4 средний пул 130,7 94,4 132,6 166,8 85,0 101,3
5 средний пул 109,10 117,10 110,70 158,40 74,10 100,40
6В средний пул 3,14 4,26 14,4 7,63 6,3 7,52
7Е средний пул 154,2 216,0 240,0 181,0 142,0 179,1
9У средний пул 90,69 105,45 98,20 93,45 54,12 73,05
14 средний пул 71,19 77,18 46,53 59,67 38,47 53,69
18С средний пул 109,4 122,3 137,1 79,9 73,7 83,1
19Е средний пул 73,9 102,5 112,2 75,5 62,3 72,1
23Е средний пул 19,19 30,74 29,44 31,52 19,13 24,94
ОМС 0,4 25,58 41,49 14,25 27,49 6,74
19А ГС 0,24-0,63 12-54,5 24,4-70,5 5,9-34,6 16,6-45,4 4-11,3
%серо 75% 100% 100% 100% 100% 100%
ОМС 0,12 2,51 3,67 45,74 30,68 96,38
22Е 1С 0,09-0,16 0,94-6,73 1,59-8,42 29,3-71,4 17-53,3 73,5-126,4
%серо 10% 95% 95% 100% 100% 100%
Пример 11. Приготовленные и протестированные композиции.
а) Приготавливают следующие композиции (используя 13-валентную вакцину из табл. 1 и серотип 3 из табл. 5 - см. комментарий к 14-валентной вакцине, приведенный под табл. 2 [с использованием непосредственно конъюгированного 22Е или через линкер ΑΌΗ]). Сахариды приготавливают с фосфатом алюминия и 3Ό-ΜΡΕ, как показано ниже.
14-валентная 25 мкг МР1 Суммарное содержание алюминия (РЕ) в ВАС На дозу 14-валентная 10 мкг ΜΡΙ_ Суммарное содержание алюминия (РЕ) в ВАС На дозу
РЗ носитель ΜΚΓ Ρ3 ΜΚΓ ΜΡί отнош Ρ3/ΑΙ 1/χ ΜΚΓ ΑΙ РЗ носитель ΜΚΓ Ρ3 ΜΚΓ ΜΡΙ отнош Ρ5/ΑΙ 1/χ ΜΚΓ ΑΙ
1 Ρβ 1 10 10 1 Ρϋ 1 10 10
3 Ρϋ 1 10 10 3 Ρϋ 1 10 10
4 Ρϋ 3 10 30 4 Ρϋ 3 10 30
5 Ρϋ 1 10 10 5 Ρϋ 1 10 10
6А Ρϋ 1 10 10 6А Ρϋ 1 10 10
6В Ρβ 1 10 10 6В Ρϋ 1 10 10
7Р Ρϋ 1 10 10 7Р Ρϋ 1 10 10
9ν Ρϋ 1 10 10 9ν ΡΟ 1 10 10
14 Ρϋ 1 10 10 14 Ρϋ 1 10 10
18С ТТдн 3 15 45 18С ТТдн 3 15 45
19А с1Р1у 3 10 30 19А ЬР1у 3 10 30
19Е ϋΤ 3 10 30 19Е ϋΤ 3 10 30
22Р РЫО 3 10 30 22Е РЬЮ 3 10 30
23Е ΡΟ 1 10 10 23Е Ρϋ 1 10 10
ВАС ΜΡί 50/200 25 4 100 ВАС МР1. 50/200 10 4 40
Содержание алюминия в ЕЕ Сумма = 355 Содержание алюминия в РЕ Сумма = 295
ВАС = бактериальный антигенный комплекс
- 36 014165
Адъювант А1
Адъювант А2
Адъювант АЗ
б) В ту же сахаридную композицию добавляют каждый из следующих адъювантов (в приведенной ниже таблице показана концентрация компонентов эмульсии на 500 мкл дозы):
Ингредиенты
Ингредиенты
Токоферол
Сквален мкл водномаслянои эмульсии
125 мкл водномаслянои эмульсии
Адъювант А7 маслянои эмульсии
Сквален
250 мкл водномаслянои эмульсии ал ьфа-Т окоферол
Адъювант А4 Адъювант А5 Адъювант А6
250 мкл 250 мкл 125 мкл
водно- ВОДНО- ВОДНО-
масляной масляной масляной
эмульсии эмульсии эмульсии
11,88 мг 11,88 мг 5,94 мг
10,7 мг 10,7 мг 5,35 мг
4,85 мг 4,85 мг 2,43 мг
50 мкг 25 мкг 25 мкг
мкл воднов) Сахариды также готовят в виде препарата с двумя адъювантами на основе липосом.
Состав адъюванта В1
Качественный/количественный (на 0,5 мл дозы).
Липосомы:
ВОРС, 1 мг;
холестерин, 0,25 мг;
3О-МРЬ, 50 мкг;
Ц821, 50 мкг;
буфер: 3,124 мг КН2РО4;
буфер: 0,290 мг №ьНРО4;
№С1, 2,922 мг, (100 мМ);
\Е1 добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,1.
1. Полная концентрация РО4 = 50 мМ.
Состав адъюванта В2.
Качественный/количественный (на 0,5 мл дозы).
Липосомы:
ВОРС, 0,5 мг;
холестерин, 0,125 мг; 3В-МРЬ, 25 мкг; Ц821, 25 мкг;
буфер: 3,124 мг КН2РО4;
буфер: 0,290 мг №ьНРО4;
№С1, 2,922 мг, (100 мМ);
\Е1 добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,1.
г) Сахариды также готовят в виде препарата с адъювантом С (см. выше для других композиций, в которых был использован этот адъювант).
Качественный/количественный состав (на 0,5 мл дозы).
Эмульсия масло-в-воде: 50 мкл;
сквален, 2,136 мг;
α-токоферол, 2,372 мг;
Твин 80, 0,97 мг;
холестерин, 0,1 мг;
3В-МРЬ, 50 мкг;
Ц821, 50 мкг;
буфер: 0,470 мг КН2РО4;
буфер: 0,219 мг №ьНРО4;
№С1, 4,003 мг, (137 мМ);
КС1, 0,101 мг, (2,7 мМ);
\Е1 добавить сколько требуется до 0,5 мл растворителя;
рН 6,8.
Пример 12. Влияние химии конъюгирования на иммуногенность конъюгата 22Е-РМВ у Ва1Ь/е мышей.
Группы из 30 самок Ва1Ь/е мышей иммунизировали внутримышечным (в/м) способом на 0-е, 14-е и
- 37 014165
28-е сутки 13-валентными Ρδ композициями, содержащими Ρδ 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е, 9У, 14, 18С, 19А, 19Е, 22Е и 23Е (доза: 0,3 мкг сахарида/Ρδ для Ρδ 4, 18С, 19А, 19Е и 22Е и 0,1 мкг сахарида/Ρδ для остальных Ρδ).
Ρδ 18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Е - с дифтерийным анатоксином, 19А - с детоксифицированным формолом Ρ1\\ 22Е - с ΡΗίΌ, а остальные Ρδ - с ΡΌ.
Сравнивали две композиции, состоящие либо из 22Ε-ΡΗίΌ, полученного посредством прямой С^АΡ-химии, либо ΣΣΕ-ΑΜ-ΡΙΠΩ (АИН-дериватизированный Ρδ). Характеристики 13-валентной вакцины, приготовленной либо с использованием 22Е, конъюгированного непосредственно, либо через спейсер АИН, см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2. Вакцинные композиции были дополнены адъювантом С.
Уровни ΕυδΛ анти-Ρδ22Ε 1дС и опсонофагоцитарные титры измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки.
22Ε-ΛН-Ρ1и^ показал себя намного более иммуногенным, чем 22Ε-Ρ111Ω в исчислении как уровней 1дС (фиг. 5), так и опсонофагоцитарных титров (фиг. 6).
Пример 13. Влияние новых адъювантов на иммуногенность конъюгатов на основе капсульных Ρδ δΐ^еρΐοссοссик рпеитошае.
Группы из 40 самок Ва1Ь/с мышей иммунизировали в/м способом на 0-е, 14-е и 28-е сутки 13валентными Ρδ композициями, содержащими Ρδ 1, 3, 4, 5, 6В, 7Ε, 9У, 14, 18С, 19А, 19Ε, 22Ε и 23Ε (доза: 0,3 мкг/Ρδ для Ρδ 4, 18С, 19А, 19Ε и 22Ε и 0,1 мкг/Ρδ для других Ρδ).
Ρδ 18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Ε - с дифтерийным анатоксином, 19А - с детоксифицированным формолом ΡΕ', 22Ε -с ΡΗίΌ, а остальные Ρδ - с ΡΌ. Характеристики 13-валентной вакцины, приготовленной с непосредственно конъюгированным 22Ε, см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл. 2.
Сравнивали четыре композиции, дополненные либо АФО^ адъювантом А1, адъювантом А4, либо адъювантом А5.
Уровни анти-Ρδ, Ρ1', ΡΙιΙϋ и ΡΌ ЕЬКА 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 42-е сутки и объединенных в группе. Для каждого антигена рассчитывали следующее соотношение: уровень 1дС, индуцированный новым протестированным адъювантом/уровень 1дС, индуцированный АФО^
Все протестированные новые адъюванты улучшали по меньшей мере в 2 раза иммунные ответы на 13-валентные конъюгаты по сравнению с классической композицией А1ΡΟ4 (фиг. 7).
Пример 14. Защитная эффективность комбинации (сотЬо) Ρΐιΐθ/детоксифицированный Ρ1' в модели пневмококковой пневмонии у обезьян.
Группы из 6 макак-резус (в возрасте от 3 до 8 лет), отобранных как имеющие самые низкие уровни анти-19Е антител до иммунизации, иммунизировали внутримышечно на 0-е и 28-е сутки либо 11валентными Ρδ конъюгатами (т.е. 1 мкг Ρδ 1, 3, 5, 6В, 7Ε, 9У, 14 и 23Ε и 3 мкг Ρδ 4, 18С и 19Ε), либо Ρ111Ω (10 мкг) + детоксифицированный формолом Ρ1' (10 мкг), либо только адъювантом.
Ρδ 18С конъюгировали со столбнячным анатоксином, 19Ε - с дифтерийным анатоксином, а остальные Ρδ - с ΡΌ. Характеристики 11-валентной вакцины см. в примере 2, табл. 1 и комментарии под табл.
2. Все композиции были дополнены адъювантом С.
Пневмококки типа 19Ε (5-108 КОЕ (колониеобразующих единиц)) инокулировали в правое легкое на 42-е сутки. Колонии подсчитывали в бронхо-альвеолярных лаважах, собранных на 1-е, 3-й и 7-е сутки после контрольного заражения. Результаты выражали в виде количества животных на группу либо умерших, с колонизированным легким, либо с чистым легким на 7-е сутки после контрольного заражения.
Как показано на фиг. 8, хорошая защита, близкая к статистической значимой (несмотря на небольшое количество используемых животных) была получена при использовании 11-валентных конъюгатов и ΡΗίΌ+6Ρ1' сотЬо (р < 0,12, точный тест Фишера) по сравнению с группой только с одним адъювантом.
Пример 15. Влияние химии конъюгирования на анти-ΡΙιΙΟ антительный ответ и защитную эффективность против контрольного заражения 4 типа, индуцированных конъюгатами 22Ε-Ρ111Ω.
Группы из 20 самок ΟΕ1 мышей иммунизировали внутримышечным способом на 0-е и 14-е сутки, используя 3 мкг либо 22Ε-Ρ111Ω (приготовленного с применением прямой С^АΡ-химии), либо 22Е-АНΡ111Ω (АОН-дериватизированного Ρδ), либо только адъюванта. Оба моновалентных конъюгата на основе 22Ε готовили способами примера 2 (см. также табл. 1 и табл. 2). Каждая композиция была дополнена адъювантом С.
Уровни ημη-ΡΗΦ ЕЬКА 1дС измеряли в образцах сыворотки, собранных на 27-е сутки.
Проводили контрольное заражение мышей, интраназально с использованием 5-106 КОЕ пневмококков 4 типа на 28-е сутки (т.е. пневмококкового серотипа, потенциально не охватываемого Ρδ, присутствующим в тестируемой вакцинной композиции). Вызываемую смертность регистрировали до срока 8 суток включительно после контрольного заражения.
22Ε-ΛН-Ρ1и^ индуцировал значительно более высокий анти-ΡΗίΌ 1дС-ответ и лучшую защиту против контрольного заражения 4 типа по сравнению с 22Ε-Ρ111Ω.

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуногенная композиция на основе 81герЮсоссик рпеитошае, содержащая 9 или более, 10 или более, 11 или более, 13 или более, или 14 или более капсульных сахаридов из разных серотипов 8. рпеитошае, конъюгированных с 2 или более разными белками-носителями, где данная композиция содержит капсульный сахарид серотипа 19Р, конъюгированный с дифтерийным анатоксином (ΌΤ) или СКМ197, причем возможно, что 19Р является единственным сахаридом в данной композиции, конъюгированным с дифтерийным анатоксином (ΌΤ) или СКМ197.
  2. 2. Иммуногенная композиция по п.1, где серотип 19Р конъюгирован с дифтерийным анатоксином.
  3. 3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где капсульный сахарид 19Р непосредственно конъюгирован с белком-носителем.
  4. 4. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где капсульный сахарид 19Р конъюгирован с белкомносителем через линкер.
  5. 5. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-4, где сахарид 19Р конъюгирован с белкомносителем или с линкером с использованием химии ΟΌΛΓ (тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния).
  6. 6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, где отношение белка-носителя ксахариду 19Р составляет от 5:1 до 1:5, от 4,1 до 1:1 или от 2,1 до 1:1 или от 1,51 до 1,4:1 (мас./мас.).
  7. 7. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-6, где средний размер (например М„) сахарида 19Р составляет более 100 кДа.
  8. 8. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-7, где доза конъюгата сахарида 19Р составляет 110 мкг, 1-5 мкг или 1-3 мкг сахарида.
  9. 9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-8, содержащая 2, 3, 4, 5 или 6 разных белковносителей.
  10. 10. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-9, где один или более чем один, или все белкиносители выбраны из группы, состоящей из ΌΤ, ΟΚМ 197, ТТ, фрагмента С, бР1у, РЫА, РНуВ, РЮ, РЫБ, ΓΜΕ, ОтрΟ, РогВ и белка Ό НаеторЫ1ик тПиепхае.
  11. 11. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-10, содержащая капсульный сахарид 18С, конъюгированный с ТТ, причем возможно, что 18С является единственным сахаридом в данной композиции, конъюгированным со столбнячным анатоксином (ТТ).
  12. 12. Способ иммунизации человека-реципиента против заболевания, вызываемого инфекцией 8(гер(ососсик рпеитошае, включающий введение данному реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции по любому из пп.1-11.
  13. 13. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-12 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией 81гер1ососсик рпеитошае.
  14. 14. Иммуногенная композиция по пп.1-11, содержащая конъюгат капсульного сахарида серотипа 19Р, но не содержащая капсульный сахарид серотипа 19А.
  15. 15. Применение иммуногенной композиции по пп.1-11 или 14, содержащей конъюгат капсульного сахарида серотипа 19Р, но не содержащей капсульный сахарид серотипа 19А, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией штаммами 81гер1ососсик рпеитошае серотипа 19 А.
  16. 16. Способ иммунизации человека-реципиента против заболевания, вызываемого инфекцией 8(гер(ососсик рпеитошае серотипа 19 А, включающий стадии введения реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции по пп.1-11 или 14, содержащей конъюгат капсульного сахарида серотипа 19Р, но не содержащей капсульный сахарид серотипа 19А.
EA200801344A 2005-12-22 2006-12-20 Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина EA014165B1 (ru)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0526232A GB0526232D0 (en) 2005-12-22 2005-12-22 Vaccine
GBGB0607088.2A GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0607087A GB0607087D0 (en) 2006-04-07 2006-04-07 Vaccine
GB0609902A GB0609902D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Novel composition
GB0620337A GB0620337D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620815A GB0620815D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 Vaccine
GB0620816A GB0620816D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 vaccine
PCT/GB2006/004634 WO2007068907A2 (en) 2005-12-13 2006-12-12 Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
PCT/EP2006/069974 WO2007071707A2 (en) 2005-12-22 2006-12-20 Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801344A1 EA200801344A1 (ru) 2008-12-30
EA014165B1 true EA014165B1 (ru) 2010-10-29

Family

ID=39133667

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801374A EA014649B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина
EA200801367A EA014107B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
EA200801344A EA014165B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801374A EA014649B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина
EA200801367A EA014107B1 (ru) 2005-12-22 2006-12-20 Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae

Country Status (36)

Country Link
US (10) US20090017059A1 (ru)
EP (10) EP1968631B1 (ru)
JP (7) JP5579387B2 (ru)
KR (5) KR101515078B1 (ru)
CN (6) CN101378778B (ru)
AR (3) AR058592A1 (ru)
AT (1) ATE520415T1 (ru)
AU (4) AU2006327041B2 (ru)
BR (3) BRPI0620193B8 (ru)
CA (5) CA2633772C (ru)
CL (1) CL2013002106A1 (ru)
CR (2) CR10119A (ru)
CY (5) CY1112677T1 (ru)
DK (5) DK1962899T3 (ru)
EA (3) EA014649B1 (ru)
ES (4) ES2614938T3 (ru)
HR (4) HRP20161682T1 (ru)
HU (3) HUE041979T2 (ru)
IL (5) IL191913A (ru)
JO (1) JO2813B1 (ru)
LT (3) LT3017827T (ru)
MA (3) MA30066B1 (ru)
MX (2) MX2008008140A (ru)
MY (4) MY147495A (ru)
NO (4) NO346529B1 (ru)
NZ (4) NZ569076A (ru)
PE (2) PE20071058A1 (ru)
PH (1) PH12014502544A1 (ru)
PL (5) PL1962899T3 (ru)
PT (5) PT2384765T (ru)
SG (1) SG168517A1 (ru)
SI (5) SI1962899T1 (ru)
TR (1) TR201900418T4 (ru)
TW (4) TWI465248B (ru)
UA (2) UA96934C2 (ru)
WO (3) WO2007071707A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2687460C2 (ru) * 2014-01-21 2019-05-13 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные капсульные сахаридные антигены, и их применение

Families Citing this family (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ20024224A3 (cs) * 2000-06-29 2003-05-14 Glaxosmithkline Biologicals S. A. Farmaceutický prostředek
DE60117164T2 (de) * 2000-11-07 2006-08-03 Immuno Vaccine Technologies Inc., Halifax Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung
EP3311836A1 (en) 2005-04-08 2018-04-25 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
PE20110072A1 (es) * 2005-06-27 2011-02-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
WO2008022299A1 (en) * 2006-08-17 2008-02-21 The Uab Research Foundation Diagnosing pneumococcal pneumonia
WO2008129559A2 (en) * 2007-04-23 2008-10-30 Serum Institute Of India Ltd Antigenic polysaccharides and process for their preparation
JP2010525035A (ja) * 2007-05-02 2010-07-22 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
CA2690708A1 (en) * 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
CN106310293A (zh) 2007-09-27 2017-01-11 免疫疫苗技术有限公司 在包括连续疏水相的载体中的脂质体在体内输送多核苷酸中的应用
BR122016015627A2 (pt) 2007-10-19 2018-10-30 Novartis Ag kit, composição antigênica liofilizada e método para preparação de uma composição imunogênica
EP2252326A4 (en) * 2008-02-01 2012-08-29 Newcastle Innovation Ltd VACCINE COMPOSITIONS
ES2553113T3 (es) * 2008-04-16 2015-12-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna
JP2011516597A (ja) * 2008-04-16 2011-05-26 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
US9125863B2 (en) * 2008-05-22 2015-09-08 Children's Medical Center Corporation Synergistic immunogenic fusion protein-polysaccharide conjugate
WO2009146523A1 (en) 2008-06-05 2009-12-10 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
WO2010070453A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
EP2411048B1 (en) 2009-03-24 2020-05-06 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
EP3017826A1 (en) 2009-03-24 2016-05-11 Novartis AG Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
CN102421449A (zh) * 2009-03-24 2012-04-18 诺华有限公司 含14型肺炎球菌糖的组合
US20120052088A1 (en) 2009-04-30 2012-03-01 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
WO2010141312A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
US20120237536A1 (en) 2009-09-10 2012-09-20 Novartis Combination vaccines against respiratory tract diseases
KR20110068831A (ko) * 2009-12-16 2011-06-22 재단법인 전라남도생물산업진흥재단 리포좀 조성물, 그 제조방법, 및 폐렴 백신으로서의 그 용도
TW201136603A (en) * 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
GB201003924D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB201003922D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
AU2011268507B2 (en) 2010-06-25 2014-08-14 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor H binding proteins
US9259462B2 (en) 2010-09-10 2016-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Developments in meningococcal outer membrane vesicles
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
WO2012117377A1 (en) * 2011-03-02 2012-09-07 Novartis Ag Combination vaccines with lower doses of antigen and/or adjuvant
GB201103836D0 (en) * 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
CN103533953A (zh) * 2011-05-17 2014-01-22 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 针对肺炎链球菌的疫苗
CN113876945A (zh) 2011-10-06 2022-01-04 免疫疫苗技术有限公司 包括激活或增加tlr2活性的佐剂的脂质体组合物及其应用
JP2015505309A (ja) 2011-12-29 2015-02-19 ノバルティス アーゲー 髄膜炎菌ｈ因子結合タンパク質のアジュバントされた組み合わせ
MX354103B (es) * 2012-01-30 2018-02-13 Serum Inst India Ltd Composicion inmunogenica.
EP3299467B1 (en) 2012-02-02 2021-08-11 GlaxoSmithKline Biologicals SA Promoters for increased protein expression in meningococcus
ES2729967T3 (es) * 2012-02-07 2019-11-07 Infectious Disease Res Inst Formulaciones de adyuvante mejoradas que comprenden agonistas de TLR4 y métodos para usar las mismas
JP2015510872A (ja) * 2012-03-07 2015-04-13 ノバルティス アーゲー Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原の増強された製剤
EP2822584A1 (en) 2012-03-08 2015-01-14 Novartis AG Combination vaccines with tlr4 agonists
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
CN104487086B (zh) * 2012-07-07 2019-08-30 巴拉特生物技术国际有限公司 无动物源的不含酒精的疫苗组合物及其制备方法
DK2885007T3 (en) 2012-08-16 2018-12-03 Pfizer Methods for glycoconjugation and compositions
JP6324961B2 (ja) 2012-09-06 2018-05-16 ノバルティス アーゲー 血清群ｂ髄膜炎菌とｄ／ｔ／ｐとの組み合わせワクチン
CN104812405A (zh) * 2012-09-19 2015-07-29 国立大学法人大阪大学 含有肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US20150320852A1 (en) 2012-12-18 2015-11-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugates for protecting against diphtheria and/or tetanus
JP6502262B2 (ja) * 2012-12-20 2019-04-17 ファイザー・インク 糖複合化方法
RU2544168C1 (ru) * 2014-01-17 2015-03-10 Андрей Дмитриевич Протасов Способ формирования иммунологической памяти к антигенам streptococcus pneumoniae у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PL3096786T3 (pl) * 2014-01-21 2021-11-08 Pfizer Inc. Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty
BR112016015835B1 (pt) 2014-01-21 2023-12-26 Pfizer Inc Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae
ES2701169T3 (es) * 2014-02-14 2019-02-21 Pfizer Conjugados glucoproteicos inmunogénicos
CN103893751B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 天津康希诺生物技术有限公司 一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法
CN103936842B (zh) * 2014-04-30 2016-03-23 重庆医科大学 肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
CA2968491C (en) * 2014-11-20 2023-09-26 Biological E Limited Codon optimized polynucleotide for high level expression of crm197
MY191539A (en) * 2015-03-26 2022-06-30 Gpn Vaccines Pty Ltd Streptococcal vaccine
MY182282A (en) 2015-05-04 2021-01-18 Pfizer Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
EA201792470A1 (ru) * 2015-06-08 2018-10-31 Серум Инститьют Оф Индия Прайват Лтд. Способы улучшения адсорбции полисахарид-белковых конъюгатов и полученная из них композиция поливалентной вакцины
RU2600838C1 (ru) * 2015-06-08 2016-10-27 Андрей Дмитриевич Протасов Способ усиления активности факторов неспецифической защиты у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
KR20160146240A (ko) 2015-06-12 2016-12-21 전관구 염기성 계면활성제를 이용한 산화은나노 및 은나노 제조 방법
US11147863B2 (en) 2015-06-23 2021-10-19 Biological E Limited Multivalent pneumococcal conjugate vaccine
KR102225282B1 (ko) * 2015-07-21 2021-03-10 화이자 인코포레이티드 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도
GB201518684D0 (en) * 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB201522068D0 (en) * 2015-12-15 2016-01-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Dried composition
CA3031797A1 (en) * 2016-08-05 2018-02-08 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CA3031799A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
BR112019003992A2 (pt) 2016-09-02 2019-05-28 Sanofi Pasteur Inc vacina contra neisseria meningitidis
CN109982715A (zh) * 2016-09-27 2019-07-05 免疫疫苗技术有限公司 利用低剂量体积b细胞表位组合物以在受试人中诱导抗体免疫应答的方法
NZ752348A (en) * 2016-09-30 2022-11-25 Biological E Ltd Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates
US11027005B2 (en) * 2016-10-20 2021-06-08 Km Biologics Co., Ltd. Method for producing Hib conjugate vaccine using PRP with lowered molecular weight
WO2018080213A1 (ko) * 2016-10-28 2018-05-03 주식회사 엘지화학 향상된 IgG 역가를 갖는 다가면역원성 조성물 및 이의 용도
CN108144052A (zh) * 2016-12-02 2018-06-12 武汉博沃生物科技有限公司 肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物及其制取方法和用途
WO2018124959A2 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Henriques Normark Birgitta Microparticles from streptococcus pneumoniae as vaccine antigens
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CN110366428B (zh) * 2016-12-30 2024-05-17 Vaxcyte公司 具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物
BR112019014833A2 (pt) * 2017-01-20 2020-04-14 Pfizer composições imunogênicas para uso em vacinas pneumococais
CN110225757A (zh) * 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法
CA3052621A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 Schadeck, Eva Barbara Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
MX2019009869A (es) 2017-02-24 2019-10-02 Merck Sharp & Dohme Formulaciones de vacunas de conjugado de neumococos.
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN107929728A (zh) * 2017-04-19 2018-04-20 武汉博沃生物科技有限公司 一种肺炎球菌蛋白疫苗及其制备方法
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
WO2018227177A1 (en) 2017-06-10 2018-12-13 Inventprise, Llc Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
WO2019043245A1 (en) * 2017-09-04 2019-03-07 London School Of Hygiene And Tropical Medicine MICROBIAL CELLS EXPRESSING STREPTOCOCCAL SERROTYPES
CN111093650B (zh) 2017-09-07 2024-03-01 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
MX394768B (es) 2017-09-07 2025-03-21 Merck Sharp & Dohme Llc Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina.
MX394767B (es) 2017-09-07 2025-03-24 Merck Sharp & Dohme Llc Polisacaridos neumococicos y su uso en conjugados de polisacarido inmunogenico con proteina transportadora.
MX2020002558A (es) * 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Procesos para la formulacion de polisacaridos neumococicos para la conjugacion a una proteina transportadora.
WO2019070994A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Liffey Biotech Limited SACCHARIDE-POLYPEPTIDE CONJUGATE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
ES3058336T3 (es) 2017-12-06 2026-03-10 Merck Sharp & Dohme Llc Composiciones que comprenden conjugados polisacárido-proteína de Streptococcus pneumoniae y métodos de uso de los mismos
BR112020014978A2 (pt) 2018-02-05 2020-12-22 Sanofi Pasteur, Inc. Composição de conjugado polissacarídeo-proteína pneumocócico multivalente
EP3749357A4 (en) 2018-02-05 2022-04-20 Sanofi Pasteur, Inc. POLYVALENT PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE COMPOSITION
US11951162B2 (en) 2018-04-18 2024-04-09 Sk Bioscience Co., Ltd. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and immunogenic conjugate thereof
US20230182041A1 (en) * 2018-04-25 2023-06-15 Medimmune, Llc Purification of antibodies
US12144855B2 (en) 2018-04-30 2024-11-19 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates from lyospheres
EP3787673A4 (en) * 2018-04-30 2022-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates
EP3788143B1 (en) 2018-04-30 2023-06-28 Merck Sharp & Dohme LLC Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
CN108524926B (zh) * 2018-06-29 2021-06-29 康希诺生物股份公司 一种多价肺炎球菌结合疫苗的制剂组合及其应用
DK3817775T3 (da) * 2018-07-04 2024-09-16 Vaxcyte Inc Forbedringer i immunogene konjugater
CN112969474A (zh) 2018-09-12 2021-06-15 艾芬尼维克斯公司 多价肺炎球菌疫苗
IL284349B2 (en) * 2018-10-12 2025-06-01 Biological E Ltd Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine
CA3120922A1 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
CR20210333A (es) 2018-12-19 2021-08-18 Merck Sharp & Dohme Composiciones que comprenden conjugados de polisacárido de streptococcus pneumoniae con proteína y sus métodos de uso
US12280098B2 (en) * 2019-03-29 2025-04-22 The University Of Tokyo Pneumococcal surface proteins
MY207971A (en) * 2019-07-18 2025-03-31 Celltrion Inc Immunogenic composition comprising multivalent streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
US12377118B2 (en) * 2019-08-09 2025-08-05 Case Western Reserve University Nanoparticle constructs for systemic co-delivery of anti-tumor agents
US12473379B2 (en) 2019-09-06 2025-11-18 Serum Institute Of India Private Limited Method for obtaining purified bacterial polysaccharides
JP7419499B2 (ja) 2019-09-18 2024-01-22 アルコン インク． 湿式充填のソフトヒドロゲル眼用インサート
CN115003330A (zh) * 2019-09-23 2022-09-02 科纳克斯资本 作为疫苗和诊断工具的新糖缀合物
WO2021146681A1 (en) * 2020-01-17 2021-07-22 Inventprise, Llc Multivalent streptococcus vaccines
KR20210117663A (ko) 2020-03-20 2021-09-29 주식회사 보고 수직형 침지식 dpf 세척장치
WO2022035816A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Inventprise, Llc Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24f
CN116121106A (zh) * 2021-07-08 2023-05-16 成都生物制品研究所有限责任公司 肺炎链球菌无动物源冻干保护剂
KR20240055283A (ko) 2022-10-20 2024-04-29 우남철 Ｄｐｆ용 순환펌프 연결구
WO2024180472A1 (en) 2023-02-28 2024-09-06 Alcon Inc. Ocular inserts
WO2026034617A1 (ja) * 2024-08-09 2026-02-12 バイオ科学株式会社 長期保存安定性を有するワクチン製剤
CN118702827B (zh) 2024-08-27 2025-03-07 南京澄实生物医药科技有限公司 一种预防肺炎链球菌感染的融合蛋白及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147922A1 (en) * 1999-03-19 2003-08-07 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides

Family Cites Families (180)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
EP0027888B1 (en) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Semiconductor switch
IL61904A (en) * 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4619828A (en) 1982-07-06 1986-10-28 Connaught Laboratories, Inc. Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
EP0362278A4 (en) 1987-06-05 1990-05-14 Us Health Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management.
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5785973A (en) * 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
WO1990006951A1 (en) 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
ATE115862T1 (de) 1989-02-04 1995-01-15 Akzo Nobel Nv Tocole als impfstoffadjuvans.
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
KR920703114A (ko) 1989-07-14 1992-12-17 원본미기재 접합체 백신을 위한 시토킨 및 호르몬 운반체
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
ATE128628T1 (de) 1990-08-13 1995-10-15 American Cyanamid Co Faser-hemagglutinin von bordetella pertussis als träger für konjugierten impfstoff.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
FI933580A7 (fi) 1991-02-15 1993-10-13 Uab Research Foundation Pneumokokkiproteiinin rakennegeeni
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
ES2204900T3 (es) 1992-02-11 2004-05-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Estructura inmuinogena de doble vector.
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
MA22842A1 (fr) 1992-03-27 1993-10-01 Smithkline Beecham Biolog Procede de preparation de compositions de vaccin.
CA2135052A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 R. John Collier Diphtheria toxin receptor-binding region
PT652758E (pt) 1992-06-18 2000-04-28 Harvard College Vacinas de toxina da difteria
CA2138997C (en) 1992-06-25 2003-06-03 Jean-Paul Prieels Vaccine composition containing adjuvants
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
US5776468A (en) 1993-03-23 1998-07-07 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid A
JP3429313B2 (ja) 1993-05-18 2003-07-22 オハイオ・ステイト・リサーチ・ファウンデーション 中耳炎ワクチン
WO1995008348A1 (en) 1993-09-22 1995-03-30 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
PL181241B1 (pl) 1993-11-17 2001-06-29 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Disacharydy beta(1 6)glukozoaminowe, sposób wytwarzania disacharydu beta(1 6) glukozoaminowego, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i środek immunomodulujący i/lub przeciwnowotworowy oraz szczepionka
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
EP1167379A3 (en) 1994-07-15 2004-09-08 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5565204A (en) * 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
NZ304715A (en) 1995-03-22 1999-07-29 Jackson H M Found Military Med Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5695768A (en) * 1995-06-07 1997-12-09 Alberta Research Council Immunostimulating activity of Streptococcus pneumoniae serotype 8 oligosaccharides
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ES2262177T3 (es) 1996-05-01 2006-11-16 The Rockefeller University Proteinas de union a colina para vacunas frente a neumococos.
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
CA2253549C (en) 1996-06-18 2005-10-25 Alza Corporation Device for enhancing transdermal agent delivery or sampling
WO1998006734A1 (en) 1996-08-16 1998-02-19 Smithkline Beecham Corporation Novel prokaryotic polynucleotides, polypeptides and their uses
JP4469026B2 (ja) 1996-10-31 2010-05-26 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原およびワクチン
JP2002503087A (ja) 1996-11-12 2002-01-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ストレプトコッカス・ニューモニアのｃ３結合タンパク質
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
EP0957972B1 (en) 1996-12-20 2003-03-19 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal agent flux
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
AU739129B2 (en) 1997-06-03 2001-10-04 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
EP0998557A2 (en) 1997-07-21 2000-05-10 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
AU1145699A (en) 1997-09-05 1999-03-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Oil in water emulsions containing saponins
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
AU9510598A (en) 1997-09-24 1999-04-12 American Cyanamid Company Human complement c3-degrading proteinase from (streptococcus pneumoniae)
US5965714A (en) * 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
CA2312900A1 (en) 1997-12-02 1999-06-10 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US7018637B2 (en) 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
DE69942176D1 (de) 1998-04-07 2010-05-06 Medimmune Llc Choline-bindende proteine derivate aus pneumokoken als impfstoff
IL138939A0 (en) 1998-04-07 2001-11-25 St Jude Childrens Res Hospital A polypeptide comprising the amino acid of an n-terminal choline binding protein a truncate, vaccine derived therefrom and uses thereof
WO1999053940A1 (en) 1998-04-23 1999-10-28 Uab Research Foundation PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN C(PspC), EPITOPIC REGIONS AND STRAIN SELECTION THEREOF, AND USES THEREFOR
AU7924598A (en) 1998-06-08 1999-12-30 Sca Emballage France Fast flattening packaging
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN1168702C (zh) 1998-06-30 2004-09-29 Om药业 酰基-二肽类化合物,其制备方法以及含有前述化合物的药物组合物
DE69941574D1 (de) 1998-08-19 2009-12-03 Baxter Healthcare Sa Immunogenes beta-propionamido-gebundenes polysaccharid-protein konjugat geeignet als impfstoff und hergestellt bei verwendung von n-acryloyliertem polysaccharid
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
EP1115875A1 (en) 1998-09-24 2001-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
US6541616B1 (en) 1998-10-01 2003-04-01 Antex Biologics Inc. Moraxella catarrhalis protein, gene sequence and uses thereof
KR100629028B1 (ko) 1998-10-16 2006-09-26 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 애쥬번트 시스템 및 백신
WO2000030299A1 (en) 1998-11-17 2000-05-25 Schlumberger Technology Corporation Transmitting information over a communication link
WO2000029434A2 (en) 1998-11-19 2000-05-25 St. Jude Children's Research Hospital PNEUMOCOCCAL CHOLINE BINDING PROTEINS, CbpG AND CbpD, DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES THEREOF
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
KR100802198B1 (ko) 1998-12-23 2008-02-11 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 신규한 스트렙토코커스 항원
EP1034792A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Intranasal delivery of pneumococcal polysaccharide vaccines
JP2002541808A (ja) 1999-04-09 2002-12-10 テクラブ， インコーポレイテッド ポリサッカリド結合体ワクチンのための組換えトキシンａタンパク質キャリア
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
PT1187629E (pt) 1999-04-19 2005-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicao adjuvante que compreende saponina e um oligonucleotido imunoestimulador
JP2003501110A (ja) 1999-06-10 2003-01-14 メディミューン，インコーポレーテッド 肺炎連鎖球菌タンパク質とワクチン
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US20040191834A1 (en) * 1999-10-28 2004-09-30 Laferriere Craig Antony Joseph Novel method
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
FR2806304B1 (fr) * 2000-03-17 2002-05-10 Aventis Pasteur Conjugues polysaccharidiques du pneumocoque a usage vaccinal contre le tetanos et la diphterie
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
CA2413450C (en) 2000-06-20 2014-02-18 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
CZ20024224A3 (cs) * 2000-06-29 2003-05-14 Glaxosmithkline Biologicals S. A. Farmaceutický prostředek
GB0103170D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
CA2417806C (en) 2000-08-04 2011-05-10 Corixa Corporation New immunoeffector compounds
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU2001294750C1 (en) 2000-09-26 2008-09-18 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
WO2002078673A1 (fr) 2001-03-29 2002-10-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de production d'un medicament sous forme de granules fins
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
WO2002091998A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
FR2827199B1 (fr) 2001-07-10 2004-07-09 Centre Nat Rech Scient Procede et machine de fabrication ex situ de reseaux de biopuces basse et moyennes integration
GB0123580D0 (en) 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1456231A2 (en) 2001-12-20 2004-09-15 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
DE60234386D1 (de) 2002-02-04 2009-12-24 Corixa Corp Neue immuneffektor-verbindungen
GB0213622D0 (en) * 2002-06-13 2002-07-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine Corporation
WO2004011027A1 (en) 2002-07-30 2004-02-05 Baxter International Inc. Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
US20060057160A1 (en) 2002-08-02 2006-03-16 Ralph Biemans Vaccine composition
GB0220198D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture
JP3754420B2 (ja) 2003-02-04 2006-03-15 三洋電機株式会社 二次電池用電極板及びその製造方法並びにこの電極板を用いた二次電池
RU2340627C2 (ru) 2003-03-13 2008-12-10 ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. Способ очистки бактериального цитолизина
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
CA2530364C (en) 2003-06-23 2014-03-18 Baxter International Inc. Vaccines against group y neisseria meningitidis and meningococcal combinations thereof
US8048432B2 (en) * 2003-08-06 2011-11-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Polysaccharide-protein conjugate vaccines
GB0323103D0 (en) * 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0408977D0 (en) * 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
NZ550533A (en) 2004-04-30 2010-02-26 Novartis Vaccines & Diagnostic Meningococcal conjugate vaccination comprising N. meningitidis and diphtheria toxin
PL1748791T3 (pl) 2004-05-11 2010-08-31 De Staat Der Nederlanden Vert Door De Mini Van Vws LOS IgtB Neisseria Meningitidis jako adjuvant
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
GB0502096D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Purification of streptococcal capsular polysaccharide
US7955605B2 (en) * 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3311836A1 (en) 2005-04-08 2018-04-25 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
PE20110072A1 (es) 2005-06-27 2011-02-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica
JP5135220B2 (ja) 2005-09-01 2013-02-06 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー 血清群ｃ髄膜炎菌を含む複数ワクチン接種
WO2007053781A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Novartis Ag Compositions with antigens adsorbed to calcium phosphate
TWI457133B (zh) * 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
GB0607088D0 (en) * 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
ES2540059T3 (es) 2006-04-26 2015-07-08 Micell Technologies, Inc. Recubrimientos que contienen múltiples fármacos
CA2690708A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
ES2749952T3 (es) 2008-12-18 2020-03-24 Wyeth Llc Procedimiento de control del peso molecular de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae usando carbono

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147922A1 (en) * 1999-03-19 2003-08-07 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dagan R. et al.Tolerability and immunogenicity of an eleven valent mixed carrier Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide-diphtheria toxoid or tetanus protein conjugate vaccine in Finnish and Israeli infants, Pediatr Infect Dis J., 2004 Feb; 23(2):91-8 *
Sigurdardottir S.T. et al. Immune response to octavalent diphtheria-and tetanus-conjugated pneumococcal vaccines is serotype-and carrier-specific: the choice for a mixed carrier vaccine Pediatr Infect Dis J, 2002, 21(6); 548-54 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2687460C2 (ru) * 2014-01-21 2019-05-13 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные капсульные сахаридные антигены, и их применение

Also Published As

Publication number Publication date
US20190262447A1 (en) 2019-08-29
HRP20161682T1 (hr) 2017-01-27
JP2009520761A (ja) 2009-05-28
JP5600337B2 (ja) 2014-10-01
IL191911A (en) 2015-09-24
JP5749689B2 (ja) 2015-07-15
EA014649B1 (ru) 2010-12-30
US20090010959A1 (en) 2009-01-08
US9884113B2 (en) 2018-02-06
EP2384765A3 (en) 2012-06-20
EP1968631A2 (en) 2008-09-17
DK1973564T3 (da) 2017-01-16
DK3017827T3 (en) 2019-02-18
UA96934C2 (ru) 2011-12-26
BRPI0620163A2 (pt) 2011-11-01
EP3017827B1 (en) 2018-11-07
DK1968631T3 (da) 2015-06-15
BRPI0620193B1 (pt) 2019-12-31
EP1962899A2 (en) 2008-09-03
BRPI0620460A2 (pt) 2011-11-16
NO20082647L (no) 2008-09-18
SI3017827T1 (sl) 2019-01-31
EP2384765B1 (en) 2016-11-23
AU2010241281B2 (en) 2012-12-06
KR101441368B1 (ko) 2014-09-24
MY150719A (en) 2014-02-28
AR058707A1 (es) 2008-02-20
EP1968631B1 (en) 2015-04-08
BRPI0620460B8 (pt) 2021-05-25
ES2614938T3 (es) 2017-06-02
KR20080081061A (ko) 2008-09-05
EP1962899B1 (en) 2011-08-17
CA2634885A1 (en) 2007-06-28
SI1968631T1 (sl) 2015-07-31
WO2007071710A8 (en) 2008-09-04
KR101418240B1 (ko) 2014-07-16
JP2009520759A (ja) 2009-05-28
EP1973564A2 (en) 2008-10-01
PL3017827T3 (pl) 2019-04-30
JP2009520760A (ja) 2009-05-28
AU2006327041B2 (en) 2010-08-26
NO346529B1 (no) 2022-09-26
JP5792920B2 (ja) 2015-10-14
EP2384765A2 (en) 2011-11-09
SI1962899T1 (sl) 2011-11-30
IL192084A (en) 2013-11-28
WO2007071710A2 (en) 2007-06-28
IL191913A (en) 2012-07-31
EP2382986A3 (en) 2012-08-22
US20220354941A1 (en) 2022-11-10
CN103585623A (zh) 2014-02-19
PH12014502544A1 (en) 2015-12-14
LT3017827T (lt) 2019-01-10
EP3017827A1 (en) 2016-05-11
IL219641A0 (en) 2012-06-28
PT3017827T (pt) 2019-01-28
AU2006327041A1 (en) 2007-06-28
CN101378779A (zh) 2009-03-04
HK1120230A1 (en) 2009-03-27
US20150190521A1 (en) 2015-07-09
PT1962899E (pt) 2011-10-19
NO343981B1 (no) 2019-08-05
NZ569076A (en) 2011-08-26
EA014107B1 (ru) 2010-10-29
IL211664A0 (en) 2011-05-31
HUE033081T2 (hu) 2017-11-28
US20090017072A1 (en) 2009-01-15
NZ596500A (en) 2013-05-31
BRPI0620460B1 (pt) 2019-08-13
MX2008008140A (es) 2008-09-24
NO345368B1 (no) 2021-01-04
WO2007071707A2 (en) 2007-06-28
AU2010241281A1 (en) 2010-11-25
SI2384765T1 (sl) 2017-03-31
KR20080081063A (ko) 2008-09-05
AU2006327040B2 (en) 2010-08-19
CL2013002106A1 (es) 2014-03-07
KR20130103831A (ko) 2013-09-24
PL2384765T3 (pl) 2017-05-31
CA2633772C (en) 2015-09-15
CN103251940A (zh) 2013-08-21
NO344187B1 (no) 2019-09-30
KR20080081060A (ko) 2008-09-05
IL192084A0 (en) 2008-12-29
EP1973564B1 (en) 2016-11-09
US20090017059A1 (en) 2009-01-15
JP5461838B2 (ja) 2014-04-02
CN101378778B (zh) 2013-02-06
MY147495A (en) 2012-12-14
AR058706A1 (es) 2008-02-20
AR058592A1 (es) 2008-02-13
DK1962899T3 (da) 2011-10-31
EP2402025A3 (en) 2012-03-07
CY1121376T1 (el) 2020-05-29
TW200738257A (en) 2007-10-16
IL219641A (en) 2017-10-31
KR101367237B1 (ko) 2014-03-14
PL1973564T3 (pl) 2017-04-28
US9107872B2 (en) 2015-08-18
US11400147B2 (en) 2022-08-02
US20160243219A1 (en) 2016-08-25
MY148141A (en) 2013-03-15
TWI487534B (zh) 2015-06-11
NZ569077A (en) 2011-08-26
US10279033B2 (en) 2019-05-07
WO2007071711A2 (en) 2007-06-28
EP3130348A1 (en) 2017-02-15
TWI415622B (zh) 2013-11-21
WO2007071711A3 (en) 2007-11-08
HRP20161681T1 (hr) 2017-01-13
KR20140036327A (ko) 2014-03-25
ES2630759T3 (es) 2017-08-23
CA2816182A1 (en) 2007-06-28
US20100074922A1 (en) 2010-03-25
CA2808919C (en) 2016-04-19
CA2634887A1 (en) 2007-06-28
ES2707499T3 (es) 2019-04-03
MX354843B (es) 2018-03-22
TR201900418T4 (tr) 2019-02-21
JO2813B1 (en) 2014-09-15
CA2634885C (en) 2016-04-19
JP5849125B2 (ja) 2016-01-27
CN101378779B (zh) 2015-09-02
PE20071305A1 (es) 2007-12-14
KR101515078B1 (ko) 2015-04-24
AU2006327036A1 (en) 2007-06-28
HUE041979T2 (hu) 2019-06-28
JP2012229228A (ja) 2012-11-22
PE20071058A1 (es) 2007-11-27
MY160199A (en) 2017-02-28
BRPI0620193A2 (pt) 2011-11-01
CA2634887C (en) 2016-01-19
JP5579387B2 (ja) 2014-08-27
SG168517A1 (en) 2011-02-28
PL1968631T3 (pl) 2015-08-31
US10646564B2 (en) 2020-05-12
SI1973564T1 (sl) 2017-02-28
CY1112677T1 (el) 2016-02-10
CY1118345T1 (el) 2017-06-28
EP2402025A2 (en) 2012-01-04
JP5615323B2 (ja) 2014-10-29
PT1973564T (pt) 2017-01-24
HRP20110685T1 (hr) 2011-10-31
LT2384765T (lt) 2017-01-10
DK2384765T3 (en) 2017-01-09
NO20082718L (no) 2008-09-16
EA200801344A1 (ru) 2008-12-30
CA2816182C (en) 2018-02-20
CR10119A (ru) 2008-07-29
BRPI0620163B8 (pt) 2021-05-25
JP2012232985A (ja) 2012-11-29
US20180207262A1 (en) 2018-07-26
US20150265702A1 (en) 2015-09-24
TWI465248B (zh) 2014-12-21
CN101374548A (zh) 2009-02-25
CN101378778A (zh) 2009-03-04
NO20082646L (no) 2008-09-16
HRP20190037T1 (hr) 2019-02-22
CR10122A (ru) 2008-08-21
NO20190104A1 (no) 2008-09-18
CA2808919A1 (en) 2007-06-28
CN110179974B (zh) 2024-01-09
EP3020411A1 (en) 2016-05-18
MA30065B1 (fr) 2008-12-01
HUE032903T2 (hu) 2017-11-28
IL191913A0 (en) 2009-02-11
MA30066B1 (fr) 2008-12-01
JP2012211165A (ja) 2012-11-01
WO2007071707A3 (en) 2007-09-13
MA30062B1 (fr) 2008-12-01
PT2384765T (pt) 2017-02-06
EP2382986A2 (en) 2011-11-02
AU2006327040A1 (en) 2007-06-28
BRPI0620193B8 (pt) 2021-05-25
US20180250389A9 (en) 2018-09-06
PL1962899T3 (pl) 2011-12-30
LT1973564T (lt) 2016-12-27
IL191911A0 (en) 2008-12-29
EA200801374A1 (ru) 2008-12-30
EP3470080A1 (en) 2019-04-17
PT1968631E (pt) 2015-07-20
WO2007071710A3 (en) 2007-11-29
ATE520415T1 (de) 2011-09-15
KR101365001B1 (ko) 2014-02-21
UA96583C2 (ru) 2011-11-25
CY1118535T1 (el) 2017-07-12
CA2633772A1 (en) 2007-06-28
TW201350129A (zh) 2013-12-16
CN103585623B (zh) 2016-09-28
AU2006327036B2 (en) 2012-11-15
CN110179974A (zh) 2019-08-30
TW200738258A (en) 2007-10-16
CN101374548B (zh) 2013-05-01
JP2014205673A (ja) 2014-10-30
ES2539795T3 (es) 2015-07-06
EA200801367A1 (ru) 2008-12-30
NZ569168A (en) 2012-02-24
BRPI0620163B1 (pt) 2019-08-13
CY1116407T1 (el) 2017-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014165B1 (ru) Пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина
JP5476295B2 (ja) 肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートを含むワクチン
EA015551B1 (ru) Конъюгатные вакцины

Legal Events

Date Code Title Description
TK4A Corrections in published eurasian patents
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM