EA018014B1

EA018014B1 - Ингибиторы кинезина в качестве средств для лечения рака

Info

Publication number: EA018014B1
Application number: EA201000900A
Authority: EA
Inventors: Тиниа Абрамс; Пол Барсанти; Дейвид Дул; Мишель Форе; Пол А. Ренхау; Аннетте Ольга Вальтер
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2013-04-30
Also published as: BRPI0821248A2; UY31532A1; ES2459442T3; ECSP10010248A; NZ585142A; US8252832B2; CO6290651A2; JP5501976B2; IL205831A0; NI201000091A; MA31872B1; JP2011506402A; DOP2010000175A; US20090239922A1; PE20091451A1; CR11412A; EP2229170B1; MY150214A; US8664256B2; GEP20125647B

Abstract

В изобретении описаны новые имидазолы формулыкоторые ингибируют активность кинезина - белка веретена (КБВ, также называемый Eg5). Ингибиторы КБВ могут уменьшить нежелательную пролиферацию клеток и оказать другие лечебные воздействия. В изобретении также описаны фармацевтические композиции, содержащие эти новые соединения, и способы применения новых ингибиторов КБВ и содержащих их фармацевтических композиций для лечения разных типов раковых заболеваний. Соединения, композиции и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, являются особенно полезными для лечения некоторых классов рака, которые резистентны по отношению к воздействию обычных лекарственных средств, поскольку показано, что такие раковые заболевания остаются чувствительными к соединениям, предлагаемым в настоящем изобретении.

Description

Настоящее изобретение относится к способам лечения пролиферативных нарушений, таких как раковые заболевания, путем введения ингибиторов КБВ.

Уровень техники

Кинезины являются моторными белками, которые используют аденозинтрифосфат для связывания с микротрубочками и генерации механического усилия. Кинезины характеризуются моторным доменом, содержащим примерно 350 аминокислотных остатков. Расшифрована кристаллическая структура нескольких моторных доменов кинезина.

К настоящему времени идентифицированы около тысячи родственных кинезину белков (РКБ). Кинезины участвуют во многих биологических процессах в клетках, включая транспорт органелл и везикул и поддержание эндоплазматического ретикулума. Различные РКБ взаимодействуют с микротрубочками митотического веретена или с хромосомами непосредственно и, видимо, играют главную роль на митотических стадиях клеточного цикла. Эти митотические РКБ представляют особый интерес для разработки противораковых средств.

Кинезин - белок веретена (КБВ) (также известный как Ед5, НкЕд5, ΚΝ8Ε1 или ΚΙΕ11) - является одним из нескольких кинезиноподобных моторных белков, которые локализованы в митотическом веретене и для которых известно, что они необходимы для образования и/или функционирования биполярного митотического веретена.

В 1995 г. показано, что уменьшение содержания КБВ с помощью антител против С-конца КБВ задерживает митоз клеток НеЬа с помощью последовательностей моноастральных микротрубочек (В1апду е! а1., Се11 83:1159-1169, 1995). Мутации в генах ЫшС и си!7, которые считаются гомологами КБВ, приводят к нарушению отделения центросом в АкретдШик шби1апк (Епок, А.Р., апб Ν.Κ. Мотк, Се11 60:10191027, 1990) и 8с1н/о8асс11аготусе8 рошЬе (Надап, I., апб М. Уапад1ба, №Ш.1ге 347:563-566, 1990). Обработка клеток с помощью АТКА (полностью-транс-ретиноевая кислота), которая уменьшает экспрессирование КБВ на уровне белка, или уменьшение количества КБВ с помощью антисмысловых олигонуклеотидов показали, что происходит значительное подавление роста клеток ΌΑΝ-0 карциномы поджелудочной железы, и это указывает на то, что КБВ может участвовать в антипролиферативном воздействии полностью-транс-ретиноевой кислоты (Кащет, А., е! а1., 1. Вю1. Сйеш. 274, 18925-18931, 1999). Интересно, что показано, что родственная Хепорик 1аеу18 Аигога протеинкиназа рЕд2 связывается с Х1Ед5 и фосфорилирует его (О1е1, К., е! а1., 1. Вю1. Сйеш. 274:15005-15013, 1999). Возможные субстраты родственных Аигога киназ представляют особый интерес для разработки противораковых средств. Например, у пациентов, страдающих раком толстой кишки, киназы Аигога 1 и 2 сверхэкспрессируются на уровне белка и ДНК и гены амплифицируются.

Показано, что первая проникающая в клетку небольшая молекула - ингибитор КБВ, монастрол, останавливает клеточный цикл у клеток с монополярными веретенами, но не влияет на полимеризацию микротрубочек, на которую влияют обычные химиотерапевтические средства, такие как таксаны и алкалоиды барвинка (Мауег, Т.и., е! а1., 8аепсе 256:971-974, 1999). При исследованиях, основанных на фенотипе, установлено, что монастрол является ингибитором, и предположено, что это соединение может послужить основой для разработки противораковых лекарственных средств. Установлено, что ингибирование не является конкурентным по отношению к аденозинтрифосфату и быстро обратимо (ЭеВошк, 8., е! а1., В1осйеш181гу, 42:338-349, 2003; Кароог, Т.М., е! а1., 1. Се11 Вю1., 750:975-988, 2000).

Вследствие важности улучшенных химиотерапевтических средств необходимы ингибиторы КБВ, которые ш у1уо являются эффективными ингибиторами КБВ и белков, родственных КБВ. Некоторые ингибиторы КБВ были описаны ранее. Например, в \УО 06/002236 и РСТ/И8 2006/031129 раскрыты некоторые классы соединений, для которых указано, что они являются ингибиторами КБВ. Испинесиб (8В715992) является исследуемым в клинике соединением, разработанным фирмой СуФкшебск, для которого указано, что он действует, как ингибитор КБВ. Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам КБВ, обладающим улучшенной активностью, и к новым способам применения этих ингибиторов КБВ. Кроме того, оно относится к новым ингибиторам КБВ, которые эффективны по отношению к раковым клеткам, которые резистентны по отношению к другим терапевтическим средствам, таким как паклитаксел, поскольку они экспрессируют Р-гликопротеин, который действует, как выкачивающий насос.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению формулы (II)

- 1 018014

в которой К.^1с выбран из группы, включающей этил, изопропил и трет-бутил;

В^2с обозначает водород или метил;

В¹⁵, В¹⁶, В¹⁷ и В¹⁸, все независимо, выбраны из группы, включающей Н, галоген, С|-С.₄-алкил. С₁-С₄галогеналкил и ί.'Ν;

В¹⁹, В²⁰ и В²¹ обозначают Н;

В²² обозначает С₁-С₄-галогеналкил;

р обозначает целое число от 1 до 3 и

с.| обозначает целое число от 1 до 3; или его фармацевтически приемлемой соли.

В одном варианте осуществления В²² обозначает фторметил.

В другом варианте осуществления р равно 2.

В другом варианте осуществления с.| равно 1.

В другом варианте осуществления В^2с и В¹⁵ все обозначают Н.

В другом варианте осуществления В¹⁷ и В¹⁸ все обозначают галоген.

В некоторых вариантах осуществления соединение содержит 2 или большее количество структурных фрагментов, описанных выше для В²², р, ср В^2с и В¹⁷-В²¹. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит по меньшей мере 3 из этих структурных фрагментов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления этих соединений В²² обозначает фторметил, р равно 2, с.| равно 1 и В^2с и В¹⁵ все обозначают Н. В некоторых таких вариантах осуществления В¹⁷ и В¹⁸ все обозначают Р.

Настоящее изобретение также относится к соединению формулы 11а

или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение также относится к соединению формулы 11Ь

или его фармацевтически приемлемой соли.

- 2 018014

Настоящее изобретение также относится к соединению формулы 11с

(5)-М-((5)-3-амино-4-фторбутил-Ы-((К)-1-(1бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1 Н-имидазол-2ил)-2,2-диметилпропил)2-гидроксипропанамид

Пс или его фармацевтически приемлемой соли.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, включающей солидную опухоль и рак крови, у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему соединения любой из формул II, 11а, 1ГЬ или 11с или фармацевтически приемлемой соли любого из этих соединений в терапевтически эффективном количестве.

В другом варианте осуществления солидная опухоль выбрана из группы, включающей карциному легких, карциному молочной железы, карциному яичника, карциному кожи, карциному толстой кишки, карциному мочевого пузыря, карциному печени, карциному желудка, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, носоглоточную карциному, плоскоклеточную карциному, папиллярную карциному щитовидной железы, карциному шейки матки, мелкоклеточную карциному легких (МККЛ), немелкоклеточную карциному легких, рак поджелудочной железы, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак головного мозга и саркомы. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой опухоль, которая резистентна по отношению к другим противораковым лекарственным средствам. Она может представлять собой рак, который экспрессирует выкачивающий насос, такой как Р-др, который стимулирует резистентность по отношению к лекарственному средству, или рак, для которого показано, что он является резистентным при лечении такими лекарственными средствами, как паклитаксел или 8В-715992. Раковые заболевания, которые являются резистентным по отношению к таким лекарственными средствами, как паклитаксел, вследствие сверхэкспрессирования раковыми клетками выкачивающего насоса, в частности Р-гликопротеина (Р-др), чувствительны по отношению к соединениям формулы II, как это показано в настоящем изобретении, в то время как соединения, не содержащие гидроксигруппу, сходные с соединениями формулы II, могут не являться эффективными для борьбы с этими резистентными по отношению к лекарственному средству опухолями. Соединения формулы Па, ПЬ, и Пс являются особенно подходящими для борьбы с опухолями, которые экспрессируют Р-др и обладают резистентностью по отношению к другим терапевтическим средствам. Эти соединения являются предпочтительными вследствие указанной неожиданной применимости для борьбы с резистентными по отношению к лекарственному средству опухолями. Предполагается, что их активность по отношению к резистентным по отношению к лекарственному средству опухолям связана со свободной гидроксигруппой амидного фрагмента формулы II.

В другом варианте осуществления солидная опухоль представляет собой карциному молочной железы.

В другом варианте осуществления карцинома молочной железы представляет собой метастатическую карциному молочной железы.

В альтернативном варианте осуществления солидная опухоль представляет собой карциному желудка.

В другом варианте осуществления солидная опухоль представляет собой рак предстательной железы.

В каждом из этих вариантов осуществления опухоль иногда представляет собой опухоль, которая резистентна по отношению к другим лекарственным средствам. В некоторых вариантах осуществления опухоль выбрана из группы, включающей рак почки, печени, толстой кишки, головного мозга или молочной железы. В некоторых вариантах осуществления она представляет собой опухоль, которая экспрессирует повышенное количество Р-др. Такое увеличенное экспрессирование Р-др может возникнуть естественным путем или явиться следствием лечения другими лекарственными препаратами.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, включающей солидную опухоль и рак крови, у млекопитающего, включающему введение указанному млекопитающему соединения любой из формул Па, ПЬ или Пс или фармацевтически приемлемой соли любого из этих соединений в терапевтически эффективном количестве, в котором рак крови выбран из группы, включающей ходжкинскую лимфому (ХЛ), неходжкинскую лимфому (НХЛ), лейкоз, миелогенный лейкоз, лимфолейкоз, острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз

- 3 018014 (ХЛЛ), миелодиспластический синдром (МДС), волосатоклеточный лейкоз и множественную миелому.

В другом варианте осуществления рак крови представляет собой острый миелогенный лейкоз.

В другом варианте осуществления рак крови представляет собой множественную миелому.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение формул II, 11а, ПЬ или 11с и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - относительная чувствительность по отношению к соединению 11а для линий клеток, полученных из злокачественных новообразований в крови. Значения относительной чувствительности, основанные на данных исследования Се11Тйег С1о® набора линий клеток злокачественных новообразований в крови, приведены в виде зависимости средних значений Ьо^СДо) (С1₅₀ означает концентрацию при 50% подавлении) для всей группы клеток от значений Ьод(С1₅₀) для каждой линии клеток; положительные значения (столбик диаграммы направлен направо) относятся к линиям клеток, которые являются более чувствительными, чем в среднем, и отрицательные значения (столбик диаграммы направлен налево) относятся к линиям клеток, которые являются менее чувствительными, чем в среднем;

фиг. 2 - исследование с помощью РАС8 стадий развития клеток для линий клеток 8иОНЬ-4 и КВ, обработанных соединением 11а: первый столбец относится к необработанным клеткам, второй столбец относится к клеткам после обработки соединением 11а в течение 24 ч и третий столбец относится к клеткам после обработки соединением 11а в течение 48 ч;

фиг. 3 - данные, показывающие, что соединение 11а является цитотоксичным для бластных клеток ОМЛ, взятых у пациентов, страдающих ОМЛ. На фиг. ЗА представлена зависимость выраженной в процентах выживаемости от дозы. На фиг. ЗВ охарактеризованы культуры клеток после выращивания в течение 2 недель. На фиг. ЗС представлены доли клеток на стадиях <2Ν, 2Ν или 4Ν и проведено сопоставление воздействия соединения 11а и паклитаксела;

фиг. 4 - эффективность соединения 11а при введении в режиме с.|4йх3 для модели ксенотрансплантата подкожной опухоли МУ4;11. Опухоли МУ4;11 вводили самкам лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи путем подкожной инъекции 10⁷ клеток в 0,2 мл смеси состава 1:1 НВ88 и Ма1пде1™ в правый бок каждой мыши. Когда объемы опухолей достигали 250 мм³, примерно через 24 дня после имплантации клеток, на основе объемов опухолей мышей путем рандомизации разделяли на группы для лечения (п=9). Животным внутривенно вводили разбавитель (каптисол®), соединение 11а или 8В-715992 (испинесиб, ингибитор КБВ фирмы Су(ок1пе(1С8. который проходит клинические исследования) ВВ. Всем животным введение проводили в режиме с.|4йх3. (А) Зависимость эффективность/объемы опухолей для групп животных, подвергавшихся лечению, от количества дней, прошедших после рандомизации; (В) зависимость для выраженного в процентах изменения массы тела по сравнению с начальной массой в день рандомизации;

фиг. 5 - эффективность соединения 11а при введении в режиме с.|4йх3 для модели ксенотрансплантата опухоли КВ8.5. Опухоли КВ8.5 вводили самкам лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи (Сйат1е8 Ктует ЬаЬотаФпек) путем подкожной инъекции 5х10⁶ клеток в 0,2 мл смеси состава 1:1 НВ88 и Ма!т1де1™ в правый бок каждой мыши. Когда объемы опухолей достигали примерно 300 мм³, примерно через 10 дней после имплантации клеток, на основе объемов опухолей мышей путем рандомизации разделяли на группы для лечения (п=9/группа). Животным ВВ вводили соединение 11а или 8В-715992. Паклитаксел ВБ вводили в дозе, равной 30 мг/кг. Всем животным введение проводили в режиме с.|4йх3. Слева - зависимость эффективность/объемы опухолей для групп животных, подвергавшихся лечению, от количества дней, прошедших после начала введения; справа - зависимость для выраженного в процентах изменения массы тела по сравнению с начальной массой в день рандомизации/начала введения. *р <0,05 для сопоставления с разбавителем и 8В-715992 (АNΟУА/методика Данна);

фиг. 6 - эффективность соединения 11с при введении в режиме с.|4йх3 для модели ксенотрансплантата опухоли КВ8.5. Опухоли КВ8.5 вводили самкам лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи (Сйат1е8 Ктует ЬаЬотаФпек) путем подкожной инъекции 5х10⁶ клеток в 0,2 мл смеси состава 1:1 НВ88 и Майтде1™ в правый бок каждой мыши. Когда средние объемы опухолей достигали 339 мм³, на основе объемов опухолей мышей путем рандомизации разделяли на группы для лечения (п=9). Животным ВВ вводили соединение 11с или 8В-715992. Паклитаксел вводили ВБ в дозе, равной 30 мг/кг. Всем животным введение проводили в режиме с.|4йх3. Слева - зависимость эффективность/объемы опухолей для групп животных, подвергавшихся лечению, от количества дней, прошедших после начала введения; справа зависимость для выраженного в процентах изменения массы тела по сравнению с начальной массой в день рандомизации/начала введения. В день 11 данные для группы животных, которым вводили соединение 11с при дозе, равной 1,25 мг/кг, статистически значимо отличались от данных для группы животных, которым вводили разбавитель (*р <0,05, АNΟУА/критерий Тьюки);

фиг. 7 - эффективность соединения 1а при введении в режиме с.|4йх3 для модели ксенотрансплантата опухоли КВ8.5. Опухоли КВ8.5 вводили самкам лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи (Сйат1е8 Ктует ЬаЬотаФпек) путем подкожной инъекции 5х10⁶ клеток в 0,2 мл смеси состава 1:1 НВ88 и Ма!т1де1™ в правый бок каждой мыши. Когда средние объемы опухолей достигали 285 мм³, на основе

- 4 018014 объемов опухолей мышей путем рандомизации разделяли на группы для лечения (п=10). Животным ВВ вводили соединение Л или 8В-715992. Паклитаксел вводили ВБ в дозе, равной 30 мг/кг. Всем животным введение проводили в режиме с.|46/3. Слева - зависимость эффективность/объемы опухолей для групп животных, подвергавшихся лечению, от количества дней, прошедших после начала введения; справа зависимость для выраженного в процентах изменения массы тела по сравнению с начальной массой в день рандомизации/начала введения. Данные для всех групп статистически значимо не отличались от данных для группы животных, которым вводили разбавитель (ΑΝΟνΑ для методики Ранкса).

Варианты осуществления изобретения

А. Определения и общий обзор.

Следует понимать, что терминология, использующаяся в настоящем изобретении, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения. Следует отметить, что при использовании в настоящем изобретении и формуле изобретения термины в единственном числе включают и термины во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. В настоящем описании и приведенной ниже формуле изобретения используется целый ряд терминов, которые обладают указанными ниже значениями.

При использовании в настоящем изобретении алкил означает одновалентные насыщенные алифатические обладающие линейной цепью, разветвленные или циклические гидрокарбильные группы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода. Примерами этого термина являются такие группы, как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил.

Термин линейный алкил означает алкильную группу, которая не является разветвленной.

Термин галогеналкил означает алкильную группу, в которой по меньшей мере один атом водорода заменен на атом галогена. В одном варианте осуществления термин означает фторметил, дифторметил или трифторметил и т.п.

Галоген означает фтор, хлор, бром или йод и предпочтительно означает фтор или хлор.

Цианогруппа означает группу -ΟΝ.

Биологическая активность при использовании в настоящем изобретении означает уменьшение концентрации по данным исследования с помощью по меньшей мере одной из методик, описанных в примерах 1-13.

При использовании в настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемые соли означает нетоксичные соли с кислотой или щелочно-земельным металлом соединений формул (II). Эти соли можно получить ίη 811и во время окончательного выделения и очистки соединений формул (II) или посредством отдельной реакции основной или кислотной группы с подходящей органической или неорганической кислотой или основанием соответственно. Типичные фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются только ими, следующие: ацетат, адипат, альгинат, цитрат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, диглюконат, циклопентанпропионат, додецилсульфат, этансульфонат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, фумарат, гиппурат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, никотинат, 2-нафталинсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат и ундеканоат. Кроме того, основные азотсодержащие группы можно кватернизировать такими реагентами, как алкилгалогениды, такие как метил-, этил-, пропил- и бутилхлориды, -бромиды и -йодиды; диалкилсульфаты, такие как диметил-, диэтил-, дибутил- и диамилсульфаты, галогениды с длинными цепями, такие как децил-, лаурил-, миристил- и стеарилхлориды, -бромиды и -йодиды, арилалкилгалогениды, такие как бензил- и фенетилбромиды и др. Таким образом получают растворимые или диспергирующиеся в воде или масле продукты.

Примеры кислот, которые можно использовать для получения фармацевтически приемлемых солей присоединения с кислотами, включают такие неорганические кислоты, как хлористо-водородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и такие органические кислоты, как уксусная, гиппуровая, молочная, щавелевая кислота, малеиновая кислота, метансульфоновая кислота, янтарная кислота и лимонная кислота. Соли присоединения с основаниями можно получить ίη Ли при окончательном выделении и очистке соединений формулы (II) или путем раздельных реакций кислотных групп карбоновых кислот с подходящим основанием, таким как гидроксид, карбонат или бикарбонат фармацевтически приемлемого катиона металла, или с аммиаком или с первичным, вторичным или третичным органическим амином. Фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются только ими, соли, содержащие катионы щелочных и щелочно-земельных металлов, такие как соли натрия, лития, калия, кальция, магния, алюминия и т.п., а также соли аммония, четвертичного аммония и аминов, включая, но не ограничиваясь только ими соли аммония, тетраметиламмония, тетраэтиламмония, метиламина, диметиламина, триметиламина, триэтиламина, этиламина и т.п. Другие типичные органические амины, применяющиеся для получения солей присоединения с основаниями, включают диэтиламин, этилендиамин, этаноламин, диэтаноламин, пиперазин и т.п.

При использовании в настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемый сложный эфир означает сложные эфиры, которые гидролизуются ίη νίνο, и включают такие, которые легко раз

- 5 018014 рушаются в организме человека с высвобождением исходного соединения или его соли. Подходящие сложноэфирные группы включают, например, образованные из фармацевтически приемлемых алифатических карбоновых кислот, предпочтительно алканкарбоновых, алкенкарбоновых, циклоалканкарбоновых и алкандикарбоновых кислот, в которых каждый алкильный или алкенильный фрагмент предпочтительно содержит не более 6 атомов углерода. Типичные примеры предпочтительных сложных эфиров включают, но не ограничиваются только ими, формиаты, ацетаты, пропионаты, бутираты, акрилаты и этилсукцинаты.

Термин фармацевтически приемлемое пролекарство при использовании в настоящем изобретении означает такие пролекарства соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, которые с медицинской точки зрения применимы для взаимодействия с тканями человека и низших животных без проявления нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., характеризуются разумным соотношением польза/риск и эффективны для применения по назначению, а также, когда это возможно, цвиттерионные формы соединений, предлагаемых в настоящем изобретении. Термин пролекарство означает соединения, которые быстро подвергаются превращению ίη νίνο и образуют исходные соединения указанной выше формулы, например путем гидролиза в крови. Обсуждение приведено в публикациях Т. Н1дисЫ апб V. 81с11а, Рго-Игидк аз Ν|\ό1 Иейусгу 8у81ст8, Уо1. 14 οί 1Нс А.С.8. δνηιροδίιιιη 8спс5. и Еб\\агб В. Коейе, сб., ВюгсусгмЫс Сатсгз ίη Эгид □смдп, Атепсап Рйагтассийса1 ΑδδοοίοΙίοη апб Рсгдатоп Рге§8, 1987, которые включены в настоящее изобретение в качестве ссылки.

При использовании в настоящем изобретении противораковые средства, или средство для лечения рака, или противораковое лекарственное средство означают средства, которые включают только в качестве примера средства, которые вызывают апоптоз; полинуклеотиды (например, рибозимы); полипептиды (например, ферменты); лекарственные средства; биологические миметики; алкалоиды; алкилирующие средства; противоопухолевые антибиотики; антиметаболиты; гормоны; соединения платины; моноклональные антитела; моноклональные антитела, конъюгированные с противораковыми лекарственными средствами, токсинами и/или радионуклидами; модификаторы биологического ответа (например, интерфероны и интерлейкины и т.п.); средства для адоптивной иммунотерапии; гематопоэтические факторы роста; средства, которые вызывают дифференциацию опухолевых клеток (например, полностью-транс-ретиноевая кислота и т.п.); реагенты для генной терапии; реагенты для антисмысловой терапии и нуклеотиды; противоопухолевые вакцины; ингибиторы ангиогенеза и т.п. Многочисленные другие средства хорошо известны специалисту в данной области техники.

Следует понимать, что для всех замещенных групп, определенных выше, в объем настоящего изобретения не входят полимеры, получающиеся путем определения заместителей, в которые входят собственные заместители (например, замещенный арил, содержащий в качестве заместителя замещенную арильную группу, которая сама замещена замещенной арильной группой и т.п.). В таких случаях максимальное количество таких заместителей равно трем. Это означает, что каждое из приведенных выше определений обладает ограничениями, например замещенные арильные группы ограничены системой -замещенный арил-(замещенный арил)-замещенный арил.

Аналогичным образом, следует понимать, что приведенные выше определения не включают неразрешенные схемы замещения (например, метил, замещенный 5 фторидными группами, или гидроксигруппу, находящуюся в α-положении по отношению к двойной или тройной связи, или двухвалентную группу, такую как оксогруппа в фенильном кольце). Такие неразрешенные схемы замещения хорошо известны специалисту в данной области техники.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут обладать стереоизомерией вследствие наличия в соединениях одного или большего количества асимметрических или хиральных центров. В объем настоящего изобретения входят все различные стереоизомеры и их смеси. Некоторые из соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, содержат асимметрично замещенные атомы углерода. Такие асимметрично замещенные атомы углерода могут привести к соединениям, предлагаемым в настоящем изобретении, включающим смеси стереоизомеров по конкретному асимметрично замещенному атому углерода или к одному стереоизомеру. Поэтому рацемические смеси, смеси диастереоизомеров, отдельные энантиомеры, а также отдельные диастереоизомеры соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, входят в объем настоящего изобретения. Термины 8- и К-конфигурация, при использовании в настоящем изобретении являются такими, как определено в публикации ШРАС 1974 Кссοттсηба!юпб Γογ 8сс1юп Е, Еипбатсп1а1 8ΐс^сοсйст^8ΐ^у, Ригс Арр1. Сйст. 45:13-30, 1976. Искомые энантиомеры можно получить хиральным синтезом из имеющихся в продаже хиральных исходных веществ по методикам, хорошо известным в данной области техники, или их можно получить из смеси энантиомеров путем выделения искомого энантиомера по известным методикам. В некоторых вариантах осуществления соединений формулы (II) изображен один изомер по меньшей мере для одного стереоцентра в соединениях; когда изображен один изомер для конкретного стереоцентра, представленная абсолютная относительная стереохимическая конфигурация является предпочтительным вариантом осуществления. Если конкретная стереохимическая конфигурация не указана, то стереоцентр может находиться в К- или 8-конфигурации, или соединение может представлять собой любую смесь соединений в этих двух конфигурациях, включая рацемическую смесь.

- 6 018014

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, также могут обладать геометрической изомерией. Геометрические изомеры включают цис- и транс-формы соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, содержащих двойные связи, таких как алкенильные, оксимные, иминные или алкениленильные фрагменты. В объем настоящего изобретения входят отдельные геометрические изомеры и стереоизомеры и их смеси.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получить по методикам, известным в данной области техники и дополнительно описанным в настоящем изобретении. Например, методики получения соединений формулы (II) описаны в опубликованных заявках РСТ/ϋδ 2005/022062 (\νϋ 06/002236) и соответствующих заявках на патенты США. Примеры дополнительных методик синтеза, применимых для получения соединений формулы (II), приведены в настоящем изобретении.

Пример получения некоторых ингибиторов КБВ формулы II приведен ниже на схеме 1.

Схема 1

Соединение 1.1 и 1.2 вводили в реакцию с К₂СО₃ в ацетоне, содержащем КГ Установлено, что использование смеси К₂СО₃/ацетон предпочтительнее использования смеси С§₂СО₃/этанол вследствие меньшей стоимости К₂СО₃ и по той причине, что соединение 1.3 осаждается из раствора в ацетоне после добавления воды, что устраняет необходимость обработки водой для экстрагирования 1.3. Затем кетоэфир 1.3 кипятили с обратным холодильником с ацетатом аммония (ЛП₄ОАс) в толуоле с получением имидазола 1.4. Установлено, что использование толуола приводит к более высоким выходам имидазола по сравнению с кипячением с обратным холодильником в ксилолах с применением ловушки ДинаШтарка, поскольку последняя методика приводит к удалению ацетата аммония из реакционной смеси в ловушку. Реакция 1.4 с бензилбромидом и К₂СО₃ в диметилформамиде давала 1.5, который можно осадить из раствора реакционной смеси путем добавления воды. Обработка 1.5 метанолом и ацетилхлоридом давала соль 1.6 с НС1, которую затем превращали в свободное основание путем растирания с раствором ЫаОН/метанол. Установлено, что образование 1.6 и 1.1 и 1.2 протекает с выходом 81% при высокой чистоте (>97% по данным ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)) и высокой оптической чистоте (энантиомерный избыток >99%).

Соединение 1.6 можно ввести в реакцию с альдегидом НС(О)В^Ь при условиях восстановительного аминирования или с Υ-Ρ¹’. где Υ обозначает отщепляющуюся группу, для присоединения алкильной группы к аминнному атому азота и затем ацилировать с получением соединения формулы (II). На схеме 2 проиллюстрировано получение альдегида, который можно использовать на стадии восстановительного аминирования для получения соединений формулы (II) и в особенности соединений формулы Па или ПЬ, или Пс.

- 7 018014

Схема 2

После восстановительного аминирования с целью ацилирования вторичного амина с получением соединений формулы (II) используют известные ацилирующие реагенты и условия. На схеме 3 проиллюстрировано восстановительное аминирование для получения УШа. Ацилирование амина с последующим удалением защитной группы фталимида и удалением защитной группы гидроксигруппы дает соединение 11а. Подходящие защитные группы гидроксигруппы включают, например, простые эфирные группы бензильные, которые можно удалить путем гидролиза, и алкилкарбонатные группы, которые можно селективно удалить с помощью таких реагентов, как триметилсилилйодид. Масса соединения 11а, определенная с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения, составляла 503,2609 для иона [М+Н]⁺, что согласуется с молекулярной формулой С₂-Н₃₃М|О₂Е₃.

Схема 3

Это соединение дополнительно охарактеризовано его ИК (инфракрасным) спектром, в котором имеются полосы поглощения в области 3500-2700 (Ьт) и при 1641, 1591, 1508, 1491, 1162, и 1088 см^-1. Оно дополнительно охарактеризовано следующими данными ЯМР:

- 8 018014

№	δ 'Н [част./млн]	η ’Н	Мульти- * плетность
1	7,84	1	а
2	7,74	1	ΠΊ
3	7,38	2	1
4	7,34-7,27	4	гл
5	7,09	1	т
6	5,71	1	5
7	5,16	2	АВ
8	4,65	1	5_? ШИРОКИЙ
9	4,21	2	АВ
10	3,72	2	ά,Ι
№	δ ¹Н [част./млн]	η 'н	Мультиплетность
И	3,55	1	ί
12	2,41	1	т
13	1,43	2	8, ШИРОКИЙ
14	0,96	1	ГЛ
15	0,91	3	3
16	-0,77	1	гл

*Мультиплетность: АВ (квадруплет АВ), Ь (широкий), б (дублет), бб (дублет дублетов), т (мультиплет), 5 (синглет), 1 (триплет).

**Сдвиг средней точки мультиплета присоединенного ¹⁹Р.

Отметим, что абсолютные стереохимические конфигурации хиральных центров этой молекулы установлены на основании хиральности известных исходных веществ или промежуточных продуктов. Данные ВЭЖХ и ЯМР свидетельствуют в пользу вывода о том, что указанный выше способ приводит к образованию соединения в виде одного изомера.

По таким же методикам соединение 11с получали путем использования хирального α-гидроксиацилирующего реагента. Он обладает масс-спектром, ожидающимся для указанной структуры, включая молекулярный ион М+Н со значением т/ζ = 517,3 и значением Р1 = 3,70 мин, полученным с помощью аналитической ВЭЖХ (с обращенной фазой). Данные ЖХ/ИЭР-МС (жидкостная хроматография/ионизация электрораспылением-масс-спектроскопия) получали с помощью масс-спектрометра Аа1ег5 ЬСТ Ргет1ег с двойным источником с ионизацией электрораспылением и жидкостного хроматографа Адйеп1 1100. Разрешение системы МС составляло примерно 12000 (по определению ЕАНМ). Разделение с помощью ВЭЖХ проводили при скорости потока, равной 1,0 мл/мин, в градиентном режиме от 10 до 95% за 2,5 мин. В качестве модифицирующей добавки для водной фазы использовали 10 мМ формиат аммония. В качестве стандарта использовали сульфадиметоксин (8щта; протонированная молекула, т/ζ 311,0814) и его вводили через канал ЬоскБргау™ при каждом третьем сканировании. Точность определения масс в системе найдена равной <5 ч./млн.

Ацилирующие реагенты и кислоты, подходящие для стадии ацилирования, включают ацилгалогениды, ангидриды и кислоты, содержащие подходящую группу Р^с (см. формулу I). Реагенты, подходящие для сочетания амидов, включают множество реагентов для сочетания амидов, приводящих к образованию амидной связи, такие как карбодиимиды: Ν-Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ОСС), Ν-Ν'диизопропилкарбодиимид (Э1РСЭ1). и 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭС1). Карбодиимиды можно использовать вместе с добавками, такими как диметиламинопиридин (ДМАП) или бензотриазолы, такие как 7-аза-1-гидроксибензотриазол (НОА1), 1-гидроксибензотриазол (НОВ1) и 6-хлор-1гидроксибензотриазол (С1-НОВ1); условия такого формирования амидной связи хорошо известны в данной области техники.

Дополнительные реагенты для сочетания амидов также включают реагенты на основе урония и фосфония. Соли урония включают №[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-Ь]пиридин-1-илметилен]-Нметилуронийгексафторфосфат-Л-оксид (НАТИ), №[(1Н-бензотриазол-1-ил)(диметиламино)метилен]-Нметилуронийгексафторфосфат-Л-оксид (НВТИ), №[(1Н-6-хлорбензотриазол-1-ил)(диметиламино)метилен]-Н-метилуронийгексафторфосфат-Н-оксид (НСТИ), №[(1Н-бензотриазол-1-ил)(диметиламино)метилен]-Н-метилуронийтетрафторборат-Н-оксид (ТВТИ) и №[(1Н-6-хлорбензотриазол-1-ил)(диметил

- 9 018014 амино)метилен]-Ы-метилуронийтетрафторборат-Ы-оксид (ТСТИ). Соли фосфония включают бензотриазол-1 -илокси-трис-(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат (ВОР), 7-азабензотриазол-1 -ил-Ы-окситрис(пирролидино)фосфонийгексафторфосфат (РуАОР) и бензотриазол-1-ил-Ы-окси-трис(пирролидино) фосфонийгексафторфосфат (РуВОР).

Стадию образования амида можно провести в полярном растворителе, таком как диметилформамид (ДМФ), и в ней также можно использовать органическое основание, такое как диизопропилэтиламин (ДИЭА) или диметиламинопиридин (ДМАП).

Методики выбора, введения и удаления подходящих защитных групп для гидроксигруппы при получении соединения формулы II хорошо известны в данной области техники. На основе приведенной выше схемы реакций специалист с общей подготовкой в данной области техники, который знает, как выбрать исходные вещества, подходящие для получения искомых продуктов, может легко получить соединения формулы II.

Ингибитор КБВ представляет собой соединение, которое способно ингибировать кинезин - белок веретена (КБВ) при любой его измеримой активности. Предпочтительно, если ингибитор КБВ характеризуется значением ГО₅₀, равным менее 100 мкМ, более предпочтительно менее 10 мкМ и часто менее 1 мкМ.

Пролиферативное заболевание включает любое заболевание или патологическое состояние, влияющее на позвоночное, которое характеризуется чрезмерной или нежелательной пролиферацией клеток. Способ лечения пролиферативного заболевания в контексте настоящего изобретения включает способ лечения (подавления) аномального роста клеток, включая трансформированные клетки, у пациента, нуждающегося в таком лечении (например, у млекопитающего, такого как человек), путем одновременного или последовательного введения ингибитора КБВ в эффективном количестве по отдельности или в комбинации с химиотерапевтическим реагентом в эфективном количестве и/или лучевой терапией. Аномальный рост клеток означает рост клеток, не зависящий от нормальных механизмов регуляции (например, прекращение контактного торможения роста), включая аномальный рост опухолевых клеток или доброкачественных и злокачественных клеток при других пролиферативных заболеваниях.

Термины рак и злокачественное означает или описывает физиологическое патологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток.

Опухоль при использовании в настоящем изобретении означает все растущие и пролиферирующие опухолевые клетки, доброкачественные или злокачественные, и все предраковые и раковые клетки и ткани. Термин солидная опухоль означает рак или карциному тканей организма, которые не являются кровью, костным мозгом и лимфоидной системой. Примеры солидных опухолей могут включать, но не ограничиваются только ими, карциному легких, карциному молочной железы, карциному яичника, карциному кожи, карциному толстой кишки, карциному мочевого пузыря, карциному печени, карциному желудка, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, почечно-клеточную карциному, носоглоточную карциному, плоскоклеточную карциному, папиллярную карциному щитовидной железы, карциному шейки матки, мелкоклеточную карциному легких, немелкоклеточную карциному легких, плоскоклеточный рак головы и шеи и саркомы.

При использовании в настоящем изобретении термин рак крови означает раковое заболевание крови и включает, в частности, лейкоз и злокачественные гиперпролиферативные нарушения. Лейкоз означает рак крови, при котором образуется слишком много лейкоцитов или эритроцитов, которыми вытесняются другие компоненты крови, такие как тромбоциты и нормальные эритроциты. Следует понимать, что случаи лейкоза разделяются на острые и хронические. При острых лейкозах раковые клетки блокируются на стадии созревания, хотя они продолжают размножаться. Вследствие этого происходит накопление большого количества нефункциональных зрелых клеток и одновременное уменьшение количества функциональных клеток. Хронические лейкозы прогрессируют медленнее и при этом раковые клетки полностью созревают. Кроме того, лейкоциты могут быть миелогенными или лимфоидными. Поэтому некоторые формы лейкоза могут представлять собой острый лимфоцитарный (или лимфобрастный) лейкоз (ОЛЛ), острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) или хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ) и миелодиспластический синдром. Злокачественные гиперпролиферативные нарушения могут означать лимфому, в частности, такую как ходжкинскую лимфому и неходжкинскую лимфому или множественную миелому.

Некоторые опухоли, описанные в настоящем изобретении, могут быть резистентными по отношению к различным терапевтическим средствам. Резистентный означает, что терапевтическое средство, вводимое в обычных дозах или в дозах, которые переносятся пациентом, не оказывает значительное воздействие на рак. Основная форма резистентности по отношению к множеству противоопухолевых средств включает действие группы мембранных белковых насосов, которыми выводятся эти цитотоксичные молекулы. Насосы множественной лекарственной резистентности'' могут означать суперсемейство белков АТР Βίπάίπβ Саккейе (АВС), содержащихся в организмах в диапазоне от бактерий до людей. АВС переносящие насосы расположены в плазматической мембране клеток или в мембране различных клеточных органелл и они опосредуют перенос различных молекул через эти барьеры. В большинстве насосов АВС для осуществления такого переноса используется энергия гидролиза АТФ (активные пере

- 10 018014 носчики), но с помощью некоторых насосов АВС образуются специфические мембранные каналы. Многочисленные клинические исследования показали, что фенотип множественной лекарственной резистентности в опухолях связан со сверхэкспрессированием некоторых насосов АВС, называющихся белками множественной лекарственной резистентности (ΜΌΚ). Первым был открыт Р-гликопротеин (называющийся Р-др, ΜΌΚ1 или АВСВ1), опосредующий множественную лекарственную резистентность ИиНапо. К.Ь. апб Ипд, ν., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 455, 152-162 (1976); СЕеп. Ό. е! а1., Се11, 47, 381-389 (1986); Иеба, К. е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8сЕ, 84, 3004-3008 (1987)) и, вероятно, он участвует в механизме множественной лекарственной резистентности, чаще всего наблюдающейся в клинических условиях (Епбюой, ТА. апб Мид, ν., Аипи. Рет. Вюсйет., 58, 137-171 (1989); Н1ддтк, С.Е, Аип. Рех. Се11 Вю1., 8, 67-113(1992); Сойектап. Μ.Μ. апб Рак!ап, I., Аппи. Рех. Вюсйет., 62, 385-427 (1993); Сойектап, Μ.Μ. е! а1., №11. Реу. Сапсег; 2, 48-58 (2002)). Имеются два других насоса АВС, для которых показано, что они участвуют во множественной лекарственной резистентности опухолей: белок 1 множественной лекарственной резистентности (ΜΚΡ1, АВСС1) и белок резистентности по отношению к митоксантрону (ΜΧΚ/ВСРР, АВСС2) ((Сойектап, Μ.Μ. 1Ыб, Со1е, 8.Р.с. е! а1., 8аепсе, 258, 1650-1654 (1992); Вогк!, Р. е! а1., 1. №й1. Сапсег. 1пкЕ. 92, 1295-1302 (2000); Эее1еу. К.С. апб Со1е, 8.Р.с, 8ет. Сапсег Вю Ь, 8, 193-204 (1997); Ьйтап, Ь. е! а1., Се11. Μо1. Ьйе 8οΐ., 58, 931-959 (2001)). Кроме того, в некоторых случаях множественной лекарственной резистентности также могут участвовать другие насосы АВС человека, способные активно переносить различные соединения. К ним относятся АВСВ4 (ΜΌΚ3) и АВСВ11 (сестринский Р-др или В8ЕР), два насоса, расположенные преимущественно в печени, участвующие в секреции фосфатидилхолина и желчных кислот соответственно (Ьесигеиг, V. е! а1., Тохюо1., 152, 203-219 (2000); Раи1икта, С.С. е! а1., 8с1епсе, 271, 1126-1128 (1996); Раи1икта, С.С. е! а1., Нера!о1оду, 25, 1539-1542 (1997)). Ранее показано, что ΜΌΚ3 переносит и некоторые лекарственные средства (8шйй, А.Т е! а1., 1. Вю1. С11еш.. 275, 23530-23539 (2000)). В дополнение к ΜΚΡ1 были клонированы 5 гомологов (Μ№2ΜΚΡ6). С определенностью показано, что сверхэкспрессирование ΜΚΡ2 (переносчик органических анионов, который также может выводить гидрофобные соединения) приводит к ΜΌΚ9 рака (Коо1, Μ. е! а1., Сапсег Рек., 57, 3537-3547 (1997)). ΜΚΡ3, органический конъюгат переносящего насоса, и Μ№5, насос, переносящий нуклеозид, также предположительно являются белками, приводящими к некоторым формам множественной лекарственной резистентности (Вогк!, Р. е! а1. 1Ыб).

Антитела и иммуноглобулины (1дк) являются гликопротеинами, обладающими одинаковыми структурными характеристиками. В то время как антитела связываются с антигеном специфически, иммуноглобулины включают и антитела, и другие молекулы типа антител, которые не обладают специфичностью по отношению к антигенам. Полипептиды последнего типа, например, продуцируются в небольших количествах лимфатической системой и в повышенных количествах миеломами.

Термин метка при использовании в настоящем изобретении означает обнаруживаемое соединение или композицию, которая непосредственно или косвенно конъюгируется с антителом с образованием так называемого меченого антитела. Метка может быть обнаруживаемой самой по себе (например, радиоактивные метки или флуоресцентные метки) или в случае ферментной метки может катализировать химическое изменение соединения-субстрата или композиции, которые становятся обнаруживаемыми. Радионуклиды, которые могут выступать в качестве обнаруживаемых меток, включают, например, 1-131, 1123, 1-125, Υ-90, Ке-188, Ке-186, А!-211, Си-67, В1-212 и Рб-109. Метка также может быть нерадиоактивным объектом, таким как токсин, который обнаруживается по своей биологической или биохимической активности.

Термин антагонист используется в самом широком смысле и включает любые молекулы, которые частично или полностью блокируют, ингибируют или нейтрализуют биологическую активность нативной мишени, раскрытой в настоящем изобретении, или ее транскрипцию или трансляцию.

Носители при использовании в настоящем изобретении включают фармацевтически приемлемые носители, инертные наполнители и стабилизаторы, которые при использующихся дозах и концентрациях нетоксичны по отношению к клеткам или млекопитающему, подвергающимся их воздействию. Часто физиологически приемлемым носителем является забуференный водный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфатный, цитратный, сукцинатный и основанные на других органических кислотах; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; обладающие небольшой молекулярной массой (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкоза, манноза или декстрины; хелатные реагенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; гидроксисахара, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как ион натрия; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Т\УЕЕ№ полиэтиленгликоль (ПЭГ) и Р1игошск. Введение в комбинации с одним или большим количеством других терапевтических средств включает одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке. Предпочтительно, если терапевтические средства, объединенные в таких режимах, одновременно содержатся в организме подвергающегося лечению субъекта в терапевтически необходимых количествах.

- 11 018014

Клетка-хозяин при использовании в настоящем изобретении означает микроорганизм, или эукариотную клетку, или линию клеток, выращенную в виде моноклеточного объекта, которая может использоваться или была использована в качестве реципиента для рекомбинантного вектора или других переносящих полинуклеотидов, и включает потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Следует понимать, что потомство одной клетки по морфологии или геномному или полному ДНК комплименту не обязательно может быть полностью таким же, как исходная родительская клетка, что обусловлено естественной, случайной или искусственной мутацией.

Лечение в настоящем изобретении определяется, как нанесение ингибитора КБВ на субъект или его введение или нанесение ингибитора КБВ на изолированную ткань или линию клеток субъекта или его введение, когда у субъекта наблюдается солидная опухоль или рак крови, симптом, связанный с солидной опухолью или раком крови, или предрасположение к развитию солидной опухоли или рака крови, при котором задачей является лечение, излечивание, облегчение протекания, уменьшение, изменение, смягчение, улучшение состояния, улучшение показателей или воздействие на солидную опухоль или рак крови, любые сопутствующие симптомы солидной опухоли или рака крови, или предрасположение к развитию солидной опухоли или рака крови. Субъектом может быть млекопитающее, и в некоторых вариантах осуществления субъектом является человек. Часто субъектом является человек, у которого диагностировано по меньшей мере одно из патологических состояний, описанных в настоящем изобретении, как пригодное для лечения соединениями и способами, предлагаемыми в настоящем изобретении. В предпочтительных вариантах осуществления у субъекта может наблюдаться рак, при котором экспрессируется выкачивающий насос, который способствует резистентности по отношению к лекарственному средству, такой как Р-др, или у субъекта может наблюдаться опухоль, которая проявляет резистентность по отношению к лекарственным средствам, таким как паклитаксел или 8В-715992.

Лечение также означает нанесение фармацевтической композиции, содержащей ингибитор КБВ, на субъекта или ее введение или нанесение фармацевтической композиции, содержащей ингибитор КБВ, на изолированную ткань или линию клеток субъекта или ее введение, когда у него наблюдается солидная опухоль или рак крови, симптом, связанный с солидной опухолью или раком крови, или предрасположение к развитию солидной опухоли или рака крови, при котором задачей является лечение, излечивание, облегчение протекания, уменьшение, изменение, смягчение, улучшение состояния, улучшение показателей или воздействие на солидную опухоль или рак крови, любые сопутствующие симптомы солидной опухоли или рака крови или предрасположение к развитию солидной опухоли или рака крови.

Противоопухолевая активность означает уменьшение скорости пролиферации или накопления злокачественных клеток и тем самым уменьшение скорости роста имеющейся опухоли или опухоли, которая образуется во время лечения, и/или разрушение имеющихся неопластических (опухолевых) клеток или вновь образовавшихся опухолевых клеток и, следовательно, уменьшение полного размера опухоли при лечении. Лечение по меньшей мере одним ингибитором КБВ приводит к физиологическому ответу, который благоприятен для борьбы с солидными опухолями у людей. Лечение по меньшей мере одним ингибитором КБВ приводит к физиологическому ответу, который благоприятен для лечения опухолевых заболеваний крови у человека. Следует понимать, что способы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть применимы для предупреждения дальнейшего разрастания опухоли, проявляющегося во время лечения.

В соответствии со способами, предлагаемыми в настоящем изобретении, по меньшей мере один ингибитор КБВ, определенный в настоящем изобретении, применяют для стимулирования положительного терапевтического ответа в случае солидной опухоли или рака крови. Положительный терапевтический ответ при лечении рака означает улучшение протекания заболевания в связи с противораковой активностью этих антител или их фрагментов и/или ослабление симптомов, связанных с заболеванием. Это означает, что можно наблюдать антипролиферативный эффект, предупреждение дальнейшего разрастания опухоли, уменьшение размера опухоли, уменьшение количества раковых клеток и/или ослабление одного или большего количества симптомов, опосредуемых стимулированием раковых клеток. Так, например, улучшение протекания заболевания можно охарактеризовать, как полный ответ. Полный ответ означает отсутствие клинически обнаруживаемого заболевания с нормализацией любых наблюдавшихся ранее аномальных данных радиографического обследования, костного мозга и спинномозговой жидкости (С8Р). Такой ответ должен сохраняться в течение не менее одного месяца после лечения способами, предлагаемыми в настоящем изобретении. Альтернативно, улучшение протекания заболевания можно охарактеризовать, как частичный ответ. Частичный ответ означает составляющее по меньшей мере 50% уменьшение всей измеримой массы опухоли (т.е. количества опухолевых клеток, находящихся в субъекте) при отсутствии новых поражений и сохраняющееся в течение не менее одного месяца. Такое определение ответа применимо только к измеримым опухолям.

Ответ опухоли можно оценить по изменениям морфологии опухоли (т.е. полной массы опухоли, размера опухоли и т.п.) по данным просвечивающих методик, таких как магнитно-резонансная сканирующая визуализация (ΜΚΙ), рентгенографическая визуализация, сканирующая компьютерная томография (СТ), биолюминесцентная визуализация, например визуализация с помощью люциферазы, сканирующая визуализация костей и отбор проб для биопсии опухоли, включая аспирацию костного мозга

- 12 018014 (АКМ). В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам у субъекта, подвергающегося лечению ингибитором КБВ, может проявляться такой благоприятный эффект, как ослабление симптомов, связанных с заболеванием.

Терапевтически эффективная доза или количество или эффективное количество означает количество ингибитора КБВ, которое при введении приводит к положительному терапевтическому ответу при лечении пациента, у которого наблюдается солидная опухоль или рак крови. Следует понимать, что способ лечения может включать однократное введение терапевтически эффективной дозы или многократное введение терапевтически эффективной дозы ингибитора.

Ген тирозинкиназы Всг-АЬ1 кодирует белок слияния и образуется путем аномального соединения генов ВСЯ и АВЬ. Это слияние обнаруживается в так называемой филадельфийской хромосоме и вызвано обратной транслокацией 1(9:22), которое приводит к образованию гена слияния Всг-АЬ1, который вызывает нерегулируемую экспрессию тирозинкиназы АВЬ. Наличие филадельфийской хромосомы считают одним из факторов, вызывающих и ХМЛ, и ОЛЛ (АЬгайаш, (2007) Соттипйу Опсо1оду 4 (1) р. 1114). В настоящее время тирозинкиназа Всг-АЬ1 является мишенью для нового класса ингибирующих ВсгАЬ1 терапевтических соединений, таких как иматиниб (глеевек®, ΝονηΠίδ). дасатиниб (сприцел®, Впк1о1Муегк 8с.|шЬЬ) и нилотиниб (АМЬ107, ШмагНк). Тирозинкиназа Всг-АЬ1 действует в обратном направлении от белка КБВ.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления ингибитор КБВ применяют в комбинации по меньшей мере с одним другим активным средством, которым может быть противораковое средство, включая, но не ограничиваясь только ими, оперативное вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, лечение цитокином или другими моноклональными антителами, предназначенными для борьбы с рассматриваемой солидной опухолью, и дополнительное противораковое средство применяют до, во время или после лечения ингибитором КБВ, и оба терапевтических средства одновременно содержатся в субъекте в терапевтических концентрациях. Таким образом, когда объединенные методики лечения включают введение ингибитора КБВ в комбинации с введением другого терапевтического средства, такого как химиотерапевтическое средство, цитокин или другие моноклональные антитела, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, включают совместное введение с использованием отдельных препаратов или одного фармацевтического препарата и последовательное введение, проводимое в любом порядке, и при этом предпочтительно существует период времени, за который оба (или все) активные средства одновременно проявляют свою терапевтическую активность. Когда способы, предлагаемые в настоящем изобретении, включают объединенные терапевтические режимы, эти средства можно вводить одновременно, т.е. ингибитор КБВ вводят совместно или в тот же период времени, что и другое противораковое средство (т.е. средства применяют совместно, но ингибитор КБВ вводят не точно в то же время, как другое противораковое средство). Альтернативно, ингибитор КБВ, предлагаемый в настоящем изобретении, также можно вводить до или после другого противоракового средства. Для уменьшения вероятности ремиссии или рецидива последовательное введение разных противораковых средств можно проводить независимо от реакции подвергающегося лечению субъекта на первый курс лечения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибиторы КБВ, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят в комбинации с химиотерапевтическим средством или цитокином, причем ингибитор КБВ и химиотерапевтическое средство (средства) или цитокин(ы) можно вводить последовательно в любом порядке или одновременно (т.е. совместно или в один и тот же период времени). Примеры подходящих химиотерапевтических средств включают, но не ограничиваются только ими, СРТ-11 (иринотекан), который можно применять, например, для лечения колоректального рака и немелкоклеточной карциномы легкого; гемцитабин, который можно применять, например, для лечения рака легкого, рака молочной железы и эпителиального рака яичников; и другие химиотерапевтические средства, применимые для борьбы с солидными опухолями. Рассматриваемые цитокины включают, но не ограничиваются только ими, α-интерферон, γ-интерферон, интерлейкин-2 (1Ь-2), 1Ь-12, 1Ь-15, и 1Ь-21, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (6М-С8Р), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р) или биологически активные варианты этих цитокинов.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения ингибиторы КБВ, описанные в настоящем изобретении, вводят в комбинации с моноклональными антителами, предназначенными для борьбы с солидной опухолью. Так, например, когда у субъекта лечат рак желудка или толстой кишки, лечение может включать введение эффективных количеств ингибитора КБВ, описанного в настоящем изобретении, в комбинации с введением эффективных количеств моноклональных антител, таких как эрбутукс® (также известный под названием цетуксимаб; 1шС1опе 8ук1еш8 1псогрога1ей, №\ν Уогк, №\ν Уогк и ВпкЮ1 Меуегк 8с.|шЬЬ, РппсеЮп, №\ν Фегкеу). Аналогичным образом, когда у субъекта лечат колоректальный рак, лечение может включать введение эффективных количеств ингибитора КБВ, описанного в настоящем изобретении, в комбинации с введением эффективных количеств гуманизированных моноклональных антител авастин™ (также известных под названием бевацизумаб; Сепеп1есй, 1пс., 8ап Ргапсгксо, СаКГогша), который связывается с сосудистым эндотелиальным фактором роста (УБОР), белком, который играет критически важную роль в ангиогенезе опухоли, или ингибирует его. Альтернатив

- 13 018014 но, когда у субъекта лечат рак молочной железы, лечение может включать введение эффективных количеств ингибитора КБВ, описанного в настоящем изобретении, в комбинации с эффективным количеством гуманизированных моноклональных антител герцептин® (также известных под названием трастузумаб; Оеиеи!есй Ιη, 8аи Ртаис15со, Са1Иотша). Другие примеры моноклональных антител, предназначенных для борьбы с солидными опухолями, которые можно применять в комбинации с ингибиторами КБВ, предлагаемыми в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ими, антитела против ЕОЕВ, воздействующие на рецептор эпидермального фактора роста (например, 1МС-С225 (1тС1оие 8уз!етз, №\ν Уогк, Иете Уогк) (см., например, Меибе15ойи аиб Вазе1да (2000) Оисодеие 19:6550-6565 и 8о1Ьас11 е! а1. (2002) 1и1. 1. Саисег 101:390-394); антитела против рецептора ЮЕ-1, воздействующие на рецепторный белок ЮЕ-1 (см., например, Ма1оиеу е! а1. (2003) Саисег Вез. 63:5073-5083 и Найеу е! а1. (2002) Мо1. Саисег. Тйет. 1:1349-1353; антитела против МИС1, воздействующие на связанный с опухолью антиген МИС1; против α5β1, против ανβ5 и против ανβ3, воздействующие на эти соответствующие интегрины, которые регулируют адгезию клеток и передачу сигналов, способствующую пролиферации и выживанию клеток (см., например, Ьа1б1ет е! а1. (2000) Аба ВюсЫтюа Ро1ошса 47(4):1159-1170 и Сгие!е! а1. (2003) Оисодеие 22(11):1688-1702); антитела против Р-кадгерина, воздействующие на представителя семейства кадгеринов (см., например, одновременно находящуюся на рассмотрении заявку на патент И8 20030194406); и антитела против УЕ-кадгерина, влияющие на связанную с ангиогенезом активность этой специфической по отношению к эндотелиальным клеткам адгезивной молекулы (см., например, Ыао е! а1. (2002) Саисег Вез. 62:2567-2575). В предпочтительных вариантах осуществления этих комбинаций ингибитор КБВ представляет собой соединение формулы (ΙΙ) и может представлять собой соединение формулы 11а, 11Ь или 11с.

Ингибиторы КБВ, предлагаемые в настоящем изобретении, и моноклональные антитела можно вводить последовательно в любом порядке или одновременно (т.е. совместно или в один и тот же период времени). Если вводят моноклональные антитела более одного типа, то способы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут дополнительно включать лучевую терапию и/или химиотерапию, если это оправдано для подвергающегося лечению рака и если это рекомендует лечащий врач.

Примеры

Пример 1. Исследование по определению активности КБВ.

Очищенные микротрубочки, полученные из головного мозга крупного рогатого скота, приобретали у фирмы Су!озке1е!ои 1ис. (Оеихег. Со1огабо, И8А). Моторный домен КБВ человека (Ед 5, КИ8Ь1) клонировали, экспрессировали и очищали до однородности, составляющей более 95%. Вюто1 Отееи™ приобретали у фирмы Аййшйу Везеатсй Ргобис!з Ь!б. (Майогб Соий, Ехе!ег, ^еνоη, Иш!еб Кшдбот). Микротрубочки и моторный белок КБВ (т.е. моторный домен КБВ) разводили в буфере для анализа (20 мМ Тйз-НС1 |Тпз = трис(гидроксиметиламинометан)] (рН 7,5), 1 мМ МдС1₂, 10 мМ ДТТ (дитиотреитол) и 0,25 мг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин) до конечной концентрации, равной 35 мкг/мл микротрубочек и 45 нМ КБВ. Затем смесь микротрубочки/КБВ предварительно инкубировали при 37°С в течение 10 мин для стимулирования связывания КБВ с микротрубочками.

В каждую лунку исследовательского планшета (384-луночный планшет), содержащую 1,25 мкл ингибитора или исследуемого соединения в ДМСО (диметилсульфоксид) (или только ДМСО в случае контролей), добавляли 25 мкл раствора АТФ (аденозинтрифосфат) (АТФ, разведенный в буфере для анализа до концентрации, равной 300 мкМ) и 25 мкл описанного выше раствора микротрубочки/КБВ. Планшеты инкубировали при КТ (комнатная температура) в течение 1 ч. После инкубации в каждую лунку добавляли 65 мкл Вюто1 Отееи™ (краситель на основе малахитового зеленого, с помощью которого можно обнаружить выделение неорганического фосфата). Планшеты инкубировали в течение еще 5-10 мин, затем с помощью устройства Ую!от II для считывания планшетов измеряли поглощение при 630 нм. Степень поглощения при 630 нм соответствует степени активности КБВ в образцах. Затем значения 1С₅₀ для каждого ингибитора или исследуемого соединения определяли по уменьшению поглощения при 630 нм при каждой концентрации с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения для обработки данных ХЬЕй для Ехсе1 или Рпзт, выпускающегося фирмой ОтарйРаб 8оП\\аге 1ис.

Предпочтительные соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают биологической активностью, характеризующейся значениями 1С₅₀, равными менее примерно 1 мМ, а предпочтительные варианты осуществления соединений обладают биологической активностью, характеризующейся значениями, равными менее примерно 25 мкМ, особенно предпочтительные варианты осуществления соединений обладают биологической активностью, характеризующейся значениями, равными менее примерно 1000 нМ, и наиболее предпочтительные варианты осуществления соединений обладают биологической активностью, характеризующейся значениями, равными менее примерно 100 нМ. Соединения формулы II исследовали по этой методике и установлено, что они характеризуются значениями 1С₅₀, меньшими, чем предел обнаружения для этой методики (по оценке они равны 2-4 нМ).

Пример 2. Подавление пролиферации линий опухолевых клеток, обработанных соединением Па. Использовали следующие линии клеток: НСТ-116 (Иа!юиа1 Саисег Ечзбипе'з ЭСТЕ Титог ВерозЕ

- 14 018014

1огу, са1а1од# N01 502568, ВоскуШе, ΜΌ), НСТ-15 (ΝοΙίοηοΙ Сапсег 1пкШи1е'к ЭСТЕ Титог Верокйоту, са1а1од# ΝΟΊ 502711, ВоскуШе, ΜΌ, которые можно получить из Атепсап Туре Т1ккие Со11ес!юп, са!а1од # ХЛЛ-225), КВ-3-1 (которые можно получить из Ό8ΜΖ, ОеШксПе 8атт1ипд уоп М1кгоогдашктеп ипП 2е11ки1(игеп СтЬН (Сегтап СоПесИоп о£ Мютоогдатктк апб Се11 СиИигек-са1а1од питЬег АСС 158), КВУ1 (которые можно получить из ^8ΜΖ-саΐа1οд питЬег АСС 149), АС8 (которые можно получить из Атепсап Туре СиПите СоПесИоп, Мапаккак УА, са1а1од питЬег СВЬ-1739™), N87 (которые можно получить из Атепсап Туре СиПите СоПесИоп, Мапаккак УА, са!а1од питЬег СВЬ-5822), Не192.1.7 (которые можно получить из Атепсап Туре СиПите СоПесИоп, Мапаккак УА, са1а1од питЬег Т1В 180), К562 (которые можно получить из Атепсап Туре СиПите СоПесИоп, Мапаккак УА, са!а1од питЬег СВИ-243™), МУ4;11 (Атепсап Т1ккие СиПите СоПесИоп, Мапаккак УА, са!а1од питЬег СВЬ-9591) и И937 (которые можно получить из Атепсап Туре СиПите СоПесИоп, Мапаккак УА, са!а1од питЬег СВЬ-1593.2).

Клетки помещали в 96-луночные планшеты при плотностях, равных примерно 500 клеток/лунка 96луночного планшета, и им давали расти в течение 24 ч. Затем клетки в течение 72 ч обрабатывали соединениями в разных концентрациях. Затем добавляли 100 мкл реагента Се11ТПет-С1о® (Рготеда СогрогаИоп). Се11Т11ет-С1о® используют в однородной методике определения количества жизнеспособных клеток с использованием только реагента Се11ТПет-С1о® для обнаружения АТФ (патенты И8 №№ 6602677 и 7241584) (см. Рготеда ртоИис! са!а1од #С7570). После добавления реагента Се11ТПет-С1о® клетки инкубировали в темноте в течение 30 мин. Интенсивность люминесценции определяли для каждой лунки с помощью устройства ^Уа11ас ТтЛих для считывания планшетов, и она коррелирует с количеством клеток в лунке. Количество жизнеспособных клеток в лунках, в которых содержался только ДМСО (0,5%), считали результатом отсутствия подавления, тогда как содержимое лунок, не содержащих клеток, считали результатом 100% подавления роста клеток. Концентрацию соединения, которая приводила к равному 50% подавлению роста (С1₅₀), определяли графически по сигмовидным зависимостям доза-ответ, построенным в координатах логарифмически преобразованная доза - количество клеток (в процентах от контроля), полученных за 72 ч непрерывного воздействия соединения. Данные приведены ниже в табл. 1. Для всех исследованных линий клеток обнаружено, что антипролиферативные воздействия находятся в широком диапазоне (значения С1₅₀ равны 0,1-6,5 нМ). Этот широкий диапазон активности согласуется с соединением, которое является ингибитором митоза.

Таблица 1 Исследование ш уйто антипролиферативной активности (значения С1₅₀ в нМ) соединения 11а

Тип опухоли	Линия клеток	О1₅₀ (нМ)	Количество исследований	Время удвоения (ч)
Толстой кишки	НСТ-116	0,1	4	22
Толстой кишки	НСТ-15	0,3	9	34
Эпидермоидная	КВ3.1	0,6	15	24
Эпидермоидная	КВ8.5	0,5	16	24
Эпидермоидная	КВ VI	6.5	11	29
Желудка	АО8	0,2	4	20
Желудка	N87	1,0	2	47
Лейкоз	Не192.1.7	0,5	4	18
Лейкоз	К.562	0,1	4	30
Лейкоз	МУ4-11	0,2	2	36,5
Лейкоз	и937	0,1	4	24

Р-Гликопротеин (Р-др, также известный под названием МЭВ1) является выкачивающим насосом, представляющим собой переносчик АВС, который опосредует множественную лекарственную резистентность по отношению к некоторым цитотоксичным лекарственным средствам в экспрессирующих его клетках. Некоторые линии клеток, использующиеся в настоящем исследовании (НСТ-15, КВУ1, и КВ8.5), экспрессируют Р-др и, как можно видеть из табл. 1, эти линии клеток чувствительны к ингибиторам КБВ формулы II. В приведенном ниже примере 12 показано, что аналогичные соединения формулы I, в которых нет гидроксигруппы в ацильном фрагменте, неактивны ш у1уо по отношению к таким опухолям.

Пример 3. Исследование ш уйто влияния ингибиторов КБВ на характеристики клеточного цикла линий раковых клеток.

Линии клеток лимфомы обрабатывали ингибиторами КБВ, предлагаемыми в настоящем изобретении, и исследовали с помощью РАС8 (исследование с помощью возбужденной флуоресценции). Собирали примерно 2х 10⁵ клеток, таблетки клеток дважды промывали холодным ЗФФ (забуференный фосфатом физиологический раствор) и повторно суспендировали в 500 мкл холодного ЗФФ. Клетки фиксировали путем добавления 8 мл холодного 80% этанола при медленном взбалтывании. После инкубации в течение 15 мин фиксированные клетки дважды промывали с помощью ЗФФ и таблетки клеток повторно суспендировали в 1 мл окрашивающего буфера РI/ВNА8Ε (ВИ Рйатттдеп™ са!а1од #550825) и инкубирова

- 15 018014 ли в течение 15 мин при 37°С с защитой от воздействия света. Пропидиййодид (ΡΙ) является флуоресцентным красителем, который окрашивает и ДНК, и РНК. Поэтому РНК необходимо удалить путем разложения с помощью рибонуклеазы (РНКазы). Перед проведением анализа с помощью ЕАС8 окрашенные клетки пропускали через устройство для окрашивания клеток в пробирку для РЛС8 с целью уменьшения количества агрегатов клеток (ΒΌ Ра1еои # 352235). Содержание ДНК в фиксированных и окрашенных клетках определяли с помощью проточного устройства для подсчета клеток ΒΌ ЕАСБСаБЬит с использованием программного обеспечения СсИРисЧ.

Обработка раковых клеток ингибиторам КБВ приводила к задержке митоза, но степень задержки, ее длительность и последствия после задержки для разных линий клеток могут быть разными. После задержки митоза возможны различные варианты поведения клеток, включая прекращение задержки и нормальное деление, непосредственное протекание апоптоза или прекращение митоза без протекания цитокинеза (явление, называющееся митотическим скольжением). Если клетки испытывают митотическое скольжение, то они могут перейти на псевдостадию 01 и затем продолжается клеточный цикл, они стареют или подвергаются апоптозу. Некоторые из этих различий проявляются при обработке линий клеток лимфомы БЫ)111.-4 (линия клеток В-клеточной лимфомы, полученная у фирмы Ό8ΜΖ, ОеШкс11е 8ашт1иид νοη М1кгоогдашктеи ииб ΖοΙΙΚυΙΙυΓοη ОшЬН (Оегшаи Со11ес1юи о! Мктоогдашктк аиб Се11 Си1Шгс5. са1а1од иитЬег АСС 495) и ВЬ (линия клеток неходжкинской лимфомы человека, Атепсаи Туре СиНиге СоИесйои, Маиаккак УА, са!а1од иитЬег СВЬ-2261™) ингибиторами КБВ.

При воздействии соединения 11а у обеих линий клеток происходила задержка митоза, однако после обработки в течение 48 ч клетки 8υΌΗΕ-4 подвергались апоптозу, о чем свидетельствовало увеличение количества клеток при содержании ДНК <2Ν, тогда как для клеток лимфомы ВЕ происходила задержка митоза и не происходило ни индуцирования апоптоза, ни митотического скольжения. См. фиг. 2.

Пример 4. Скрининговые исследования ингибитора КБВ.

Выявление типов опухолей, которые наиболее чувствительны по отношению к ингибиторам КБВ, предлагаемым в настоящем изобретении, можно провести с применением несмещенной методики, в которой проводятся различные исследования с использованием клеток. Выбраны следующие методики.

Се11Т1!ет-01о®. Это исследование предназначено для определения концентрации АТФ в культуре клеток и результат можно скоррелировать с количеством клеток. При кратком описании Се11Т1!ет-01о® (Рготеда Сотрогайои) представляет собой однородную методику, в которой для обнаружения АТФ используют один реагент Се11Тйет-01о®, и в исследовании АТФ инициирует активность термически стабильной люциферазы, в результате чего вырабатывается люминесцентный сигнал, интенсивность которого можно измерить и скоррелировать с количеством жизнеспособных клеток. Вкратце, методика заключается в следующем: в случае прилипающих клеток от 1000 до 5000 клеток/лунка помещали в 96луночные планшеты (100 мкл/лунка) и им давали прилипать в течение 24 ч и затем обрабатывали лекарственным средством. В случае неприлипающих клеток от 1000 до 10000 клеток/лунка помещали в 96луночные планшеты (100 мкл/лунка) и сразу обрабатывали лекарственным средством. Разведения лекарственного средства готовили в ДМСО при концентрации, в 1000 раз превышающей конечную концентрацию. Затем эти разведения разводили в соотношении 1/100 в среде для выращивания и после этого добавляли к клеткам (11 мкл/лунка) для обеспечения необходимой конечной концентрации. После обработки в течение 48 ч при 37°С в инкубаторе для культур клеток планшеты обрабатывали для проведения исследования Се11Тйег-01о® в соответствии с инструкциями изготовителя. Методика исследования пролиферации клеток в течение 72 ч: исследование, проводимое в течение 72 ч, выполняли таким же образом, как исследование, проводимое в течение 48 ч, но со следующими изменениями. В случае прилипающих клеток от 500 до 5000 клеток/лунка помещали в 96-луночные планшеты (90 мкл/лунка среды для выращивания клеток) и им давали прилипать в течение 24 ч и затем обрабатывали лекарственным средством. В случае неприлипающих клеток от 1000 до 10000 клеток/лунка помещали в 96-луночные планшеты (90 мкл/лунка среды для выращивания клеток) и сразу обрабатывали лекарственным средством. Приводимые значения представляют собой концентрацию исследуемого соединения, необходимую для снижения роста на 50%.

Высвобождение ЛДГ (лактатдегидрогеназа). В исследовании по обнаружению цитотоксичности КйРЬиБ (ЛДГ) (Восйе П1адиокйск, Маийет, Оегтаиу) определяют количество ЛДГ, выделенного в среды гибнущими клетками; ЛДГ катализирует превращение лактата в пируват. Ферментная реакция сочетается с химической реакцией, в которой соль тетразолия используется для образования формазана, который обладает красным цветом, и его можно зарегистрировать по поглощению при 490 нм. В этом исследовании определяют количество клеток, погибших после обработки лекарственным средством. Клетки по 10000 клеток/лунка помещали в 96-луночные планшеты (100 мкл/лунка). Прилипающим клеткам давали прилипать в течение 24 ч и затем обрабатывали лекарственным средством, а неприлипающие клетки сразу обрабатывали лекарственным средством. Разведения лекарственного средства готовили в ДМСО при концентрации, в 1000 раз превышающей конечную концентрацию. Затем эти разведения разводили в соотношении 1/100 в среде для выращивания и затем добавляли к клеткам (11 мкл/лунка) для обеспечения необходимой конечной концентрации. После обработки в течение 48 ч при 37°С в инкуба

- 16 018014 торе для культур клеток планшеты обрабатывали для проведения исследования ί,'νίοίοχίαΐν Ие1есОоп КпР1.1)8 (ЛДГ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Перед проведением анализа значения, полученные для чистых сред, вычитали из полученных значений. Приводимые значения представляют собой концентрацию исследуемого соединения, при которой образование ЛДГ составляет половину от максимального.

Сакраке-С1о® 3/7. Исследование Сакраке-С1о® 3/7 (Рготеда СогрогаПоп) представляет собой основанную на люминесценции однородную методику, в которой определяют активность каспазы-3/7. В исследовании используют пролюминесцентный субстрат каспаза-3/7 ИЕУИ-аминолюциферин и термически стабильную люциферазу, в реагенте, оптимизированном для обеспечения активности каспазы-3/7, активность люциферазы и лизис клеток. Добавление одного реагента Сакраке-С1о® 3/7 приводит к лизису клеток и последующему отщеплению каспазы субстрата. Это приводит к высвобождению свободного аминолюциферина, который используется люциферазой, в результате чего вырабатывается люминесцентный сигнал. Интенсивность сигнала пропорциональна активности каспазы-3/7. Приводимые значения представляют собой концентрацию соединения, при которой активность каспазы-3/7 равна половине максимального значения.

Для того чтобы продемонстрировать прогнозирующую способность скрининговых исследований, выбраны клетки 5 линий, обладающие известными различающимися чувствительностями по отношению к ингибиторам КБВ, предлагаемым в настоящем изобретении. Этими линиями являются следующие.

НСТ-116 и НТ29. НСТ-116 - линия клеток, образованная из карциномы эпителия толстой кишки человека, и показано, что ίη у1уо она чувствительна по отношению к ингибиторам КБВ, предлагаемым в настоящем изобретении. НТ29 (можно получить у фирмы Атепсап Туре СиНиге Со11ес11оп. Мапаккак УА, са1а1о§ питЬег НТВ-38) также образована из карциномы эпителия толстой кишки человека, но она менее чувствительна по отношению к ингибиторам КБВ.

МУ4;11 (Атепсап Т1ккие СиПиге Со11ес1юп (са!а1од # СКЬ-9591, ВоскуШе, МИ) представляет собой линию клеток острого миелогенного лейкоза (ОМЛ).

Со1о205 (Атепсап Т1ккие СиПиге Со11ес11оп (са!а1од # НВ-8307, ВоскуШе, МИ) представляет собой линию клеток колоректального рака человека.

Т47И (можно получить у фирмы Атепсап Т1ккие СиПиге Со11ес1юп (са!а1од # НТВ-133, ВоскуШе, МИ) представляет собой линию клеток, образованную из карциномы эпителия протоков молочной железы человека, которая, видимо, содержит дефект в точке контроля веретена).

Данные для соединения Па приведены ниже в табл. 2. Результаты показывают, что в целом результаты анализов хорошо согласуются друг с другом и их можно использовать для широкого скрининга клеток разных типов для скрининга ингибиторов КБВ и скрининга чувствительных типов клеток.

Таблица 2 Скрининговые исследования пролиферации/выживаемости

	Исследование СТС (нМ)	Исследование ЛДГ (нМ)	Исследование каспазы 3/7 (нМ)
Линия клеток	24 ч	48 ч	72 ч	24 ч	48 ч	72 ч	24 ч	48 ч	72 ч
МУ4;1 1	0,05	0,04	0,04	ДН	0,03	ДН	0,02	0,03	ДН
нет- 116	>5	0,11	0,13	0,06	0,10	0,10	0,12	0,09	ДН
Со1о- 205	>5	0,18	0,19	ДН	0,11	0,16	0,13	0,21	0,19
НТ29	>5	>5	0,21	ДН	0,35	0,27	ДН	ДН	ДН
Т47-И	>5	>5	0,45	ДН	0,32	0,33	ДН	0,39	0,40

*ДН - данных нет

Исследование СТС - результатами являются значения СС,, которые рассчитывают, как концентрацию соединения, приводящую к 50% выживаемости. Исследование ЛДГ - результатами являются значения ЕС₅₀, которые рассчитывают, как концентрацию соединения, приводящую к эффекту, составляющему половину максимального. Исследование каспазы 3/7 - результатами являются значения ЕС₅₀, которые рассчитывают, как концентрацию соединения, приводящую к эффекту, составляющему половину максимального.

Пример 5. Активность ингибиторов КБВ по отношению к набору линий клеток N060.

Набор N6.4-60 представляет собой стандартизированный набор линий опухолевых клеток, который часто используют для изучения чувствительности опухолей разной этиологии по отношению к определенному средству (8Еоетакег 2006 №1. Веу. Сапсег., 6:813-23). Исследование Се11Тйег-С1о®, описанное выше, используют для определения чувствительности целого ряда линий клеток, полученных из опухолей, по отношению к соединениям-ингибиторам КБВ. Данные для соединения Па приведены ниже в табл. 3 и они показывают, что многие линии клеток, полученных из опухолей, чувствительны по отно

- 17 018014 шению к ингибиторам КБВ, предлагаемым в настоящем изобретении.

Таблица 3

Сводка данных исследования Се11ТНег-С1о для соединения 11а

Тип клеток	Линия клеток	О1₅₀	Ьо₆(С1₅₀)	Разность
Лейкоз	ССК.Р-СЕМ	0,215	-0,6676	0,999
Лейкоз	ХЛ-60	0,165	-0,7825	1,114
Лейкоз	К-562	0,218	-0,6615	0,993
Лейкоз	МОЬТ-4	0,331	-0,4802	0,811
Лейкоз	ΚΡΜΙ-8226	0,351	-0,4547	0,786
Лейкоз	8К	0,095	-1,0223	1,353
НМКРЛ	А549	10	1,0000	-0,669
НМКРЛ	ЕКУХ	10	1,0000	-0,669
НМКРЛ	НОР-62	10	1,0000	-0,669
НМКРЛ	НОР-92	10	1,0000	-0,669
НМКРЛ	МС1-Н226	10	1,0000	-0,669
НМКРЛ	ΝΟΙ-Η23	0,223	-0,6517	0,983
НМКРЛ	ΝΟ1-Η322Μ	10	1,0000	-0,669
НМКРЛ	ЫС1-Н460	0,378	-0,4225	0,754
НМКРЛ	ΝΟΙ-Η522	0,166	-0,7799	1,111
Толстая кишка	СОЬО 205	10	1,0000	-0,669
Толстая кишка	НСС-2998	0,608	-0,2161	0,547
Толстая кишка	НСТ-116	0,138	-0,8601	1,191
Толстая кишка	нет-15	0,378	-0,4225	0,754
Толстая кишка	НТ29	10	1,0000	-0,669
Толстая кишка	КМ12	0,423	-0,3737	0,705
Толстая кишка	8\ν-620	0,236	-0,6271	0,958
ЦНС	8Р-268	10	1,0000	-0,669
ЦНС	8Р-295	0,162	-0,7905	1,122
ЦНС	8Р-539	0,387	-0,4123	0,743
ЦНС	8ΝΒ-19	10	1,0000	-0,669
ЦНС	8ΝΒ-75	10	1,0000	-0,669
ЦНС	и251	0,239	-0,6216	0,953
Меланома	ЬОХ ΙΜνί	10	1,0000	-0,669
Меланома	МАТМЕ-ЗМ	10	1,0000	-0,669
Меланома	М14	0,209	-0,6799	1,011
Меланома	8К-МЕЬ-2	2,773	0,4429	-0,112
Меланома	8К-МЕЦ-28	10	1,0000	-0,669
Меланома	8К-МЕЬ-5	10	1,0000	-0,669
Меланома	САСС-257	10	1,0000	-0,669
Меланома	идсс-62	10	1,0000	-0,669
Меланома	МЦА-МВ-435	0,152	-0,8182	1,149
Яичник	ιοκονι	10	1,0000	-0,669
Яичник	ОУСАК-З	10	1,0000	-0,669
Яичник	ОУСАК-4	10	1,0000	-0,669
Тип клеток	Линия клеток	ΟΙ50	ЬовСОЬо)	Разность
Яичник	ОУСАК-5	10	1,0000	-0,669
Яичник	ОУСАК-8	0,324	-0,4895	0,821
Яичник	8К-ОУ-3	0,421	-0,3757	0,707
Яичник	ΝΟΙ/ΑϋΚ-ΚΕ8	4,18	0,6212	-0,290
Почка	786-0	10	1,0000	-0,669
Почка	А498	10	1,0000	-0,669
Почка	АСНЦ	10	1,0000	-0,669
Почка	САК1-1	10	1,0000	-0,669
Почка	КХЕ 393	10	1,0000	-0,669
Почка	8Ы12С	10	1,0000	-0,669
Почка	ТК-10	10	1,0000	-0,669
Почка	ио-31	10	1,0000	-0,669
Предстательная железа	РС-З	10	1,0000	-0,669
Предстательная железа	ϋυ-145	0,435	-0,3615	0,693
Молочная железа	МСЕ7	10	1,0000	-0,669
Молочная железа	ΜϋΑ-ΜΒ-231	0,333	-0,4776	0,809
Молочная железа	Н8 578Т	0,22	-0,6576	0,989
Молочная железа	ВТ-474	10	1,0000	-0,669
Молочная железа	ВТ-549	0,809	-0,0921	0,423
Молочная железа	Т-47Э	10	1,0000	-0,669
	Среднее значение	2,143	0,331

*ЦНС - центральная нервная система, НМКРЛ - немелкоклеточный рак легкого, Значение С1₅₀ представляет собой концентрацию соединения (выраженную в нМ), приводящую к 50% выживаемости.

Разность: разность среднего значения Ьод(С1₅₀) (0,331) и Ьод(С1₅₀) для каждой линии клеток.

Среднее значение: среднее геометрическое значение для С1₅₀ и среднее арифмети ческое значение для Ьод(С1₅₀).

- 18 018014

Пример 6. Активность ингибиторов КБВ по отношению к линиям клеток, полученных из злокачественных новообразований в крови.

Данные, приведенные в табл. 3, показывают, что линии клеток лейкозов являлись наиболее чувствительными по отношению к ингибиторам КБВ, предлагаемым в настоящем изобретении. Кроме того, набор различных линий клеток, полученных из злокачественных новообразований в крови, изучили с помощью исследования СеИТНег-СЬ®, описанного выше, и результаты приведены ниже в табл. 4 и на фиг. 1.

Таблица 4 Значения С!₅₀ для соединения На по отношению к линиям клеток, полученных из злокачественных новообразований в крови

Заболевание	Линия клеток	Номер по каталогу	θΐ50 (нМ)	ЬовСЖо)	Разность
ОМЛ	МУ4;11	АТСС СВ.Ь-9591	0,08	-1,114	0,644
ОМЛ	МУ4;11Ь ис	Образована из МУ4;11	0,11	-0,979	0,509
ОМЛ	омл- 193	АТСС СКЬ-9589	0,11	-0,959	0,489
ОМЛ	Казшш-1	АТСС СВ.Ь-2724	0,44	-0,357	-0,113

ОМЛ	8ЕТ-2	Можно получить из коллекции ϋ8ΜΖ АСС608	0,34	-0,469	-0,001
ОМЛ	ΜΟΕΜ1 З-Ьис	Можно получить из коллекции АТСС 30-2001	0,23	-0,645	0,175
ОМЛ	НЬ60	Можно получить из коллекции АТСС ССЬ-240	0,17	-0,783	0,313
ОМЛ	НЕ60- Ьис	Можно получить из коллекции АТСС 30-2001	0,51	-0,297	-0,173
ОМЛ	НЕЬ92	АТСС ΤΙΒ-180	0,49	-0,310	-0,160
хмл	К562	Можно получить из коллекции АТСС ССЬ-243	0,21	-0,680	0,210
олл	ССКРСЕМ	АТСС ССЬ-119	0,16	-0,785	0,315
олл	К84;11	АТСС СКЬ-1873	0,10	-1,000	0,530
олл	МОЬТ-4	Можно получить из коллекции АТСС СКТ-1582	0,33	-0,480	0,010
олл	ЗЕМ-Ьис	Можно получить из коллекции АТСС 30-2001	0,15	-0,824	0,354
мм	КМ811	См. Ниже ИаглЬа е1 а1	0,48	-0,316	-0,154
мм	КМ511- Ьис	Образована из К8М-11	0,29	-0,538	0,068
мм	КМ818Ьис	Можно получить из коллекции АТСС 30-2001	0,52	-0,286	-0,184
мм	ОРМ2	Ο8ΜΖ Асс50	0,14	-0,870	0,400
Заболевание	Линия клеток	Номер по каталогу	С1₅₀(нМ)	ίθ8(ΟΙ₅ο)	Разность
мм	КМ826	Можно получить из коллекции 1СВ.В ДСЯВ1187	0,24	-0,620	0,150
мм	Ь363	Можно получить из коллекции ϋδΜΖ АСС49	0,13	-0,886	0,416
мм	ЕР1	Можно получить из коллекции ϋδΜΖ АСС41	0,21	-0,688	0,218
мм	ΚΡΜΙ- 8226	Можно получить из коллекции АТСС СКЬ-8658™	0,26	-0,582	0,112
мм	Н929	Можно получить из коллекции АТСС СКЕ-9068	0,34	-0,475	0,005
мм	Н929- Ьис	Можно получить из коллекции АТСС 30-2001	1,69	0,227	-0,697
нхл	КЬ	АТСС СКЬ-226™	20,00	1,301	-1,771
нхл	ЗиОНЬ-4	Ο8ΜΖ АСС495	0,45	-0,350	-0,120
нхл	11937	Можно получить из коллекции АТСС СКЕ-1593,2	0,20	-0,699	0,229
нхл	8В.	Можно получить из коллекции АТСС 8ЬК.-2262	0,11	-0,957	0,487
нхл	Каграз299-Ьис	Можно получить из коллекции АТСС 30-2001	20,18	1,305	-1,775
хл	Ь428	Ό8ΜΖ АСС197	20,00	1,301	-1,771
хл	К.М-Н2	ϋδΜΖ АСС 8	0,23	-0,632	0,162
	Среднее значение		0,34	-0,470

Значение Οϊ₅₀ представляет собой концентрацию соединения, приводящую к 50% выживаемости.

Разность: разность среднего значения Ηο§(ΟΣ₅₀) (-0,470) и Ηο§(ΟΣ₅₀) для каждой линии клеток.

Среднее значение: среднее геометрическое значение для ΟΣ₅₀ и среднее арифметическое значение для Ьод(СХ₅₀). (КМ8-11, см. \'ашЬа е! а1 (1989) Ση νίίτο Се11 Оет. Вю1. 25 (8) р. 723-729).

Пример 7. Чувствительность первичных бластных клеток по отношению к ингибиторам КБВ.

Данные, приведенные в табл. 4, показывают, что различные типы линий клеток рака крови чувстви

- 19 018014 тельны по отношению к ингибиторам КБВ, предлагаемым в настоящем изобретении. Первичные бластные клетки пациентов, страдающих ОМЛ, исследовали на чувствительность по отношению к соединению 11а, как показано ниже. Замороженные бластные клетки ОМЛ периферической крови получали у фирмы А11Се11 ЬЬС. (ЕтетууШе, СА). Приобретали 3 замороженных флакона, содержащие ~1х10⁷МКПК. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) трех пациентов, у которых впервые диагностирован ОМЛ, с большим содержанием бластных клеток (#06-188, 80%; #06-366, 88%; #06-503, 73%) выращивали в течение нескольких недель и обрабатывали ингибиторами КБВ. Флаконы быстро оттаивали и клетки выращивали в среде Исков ЭМЕМ с добавлением 10% ФБС (фетальная бычья сыворотка) и следующих цитокинов, всех при концентрации 10 нг/мл: СМ-С8Е, С-С8Е, 8СЕ, 1Ь-3, и 1Ь-6 (все выпускающиеся фирмой Κ&Ό 8ук1ешк). Три исследования с использованием клеток проводили следующим образом.

Исследование Се11Тйег-61о® бластных клеток ОМЛ. МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови), содержащие бластные клетки ОМЛ, высевали в 96-луночные планшеты (5000/лунка) и обрабатывали соединением 11а при различных концентрациях (от 10 пМ до 10 нМ) в течение 48 ч и затем выживаемость клеток определяли так, как описано выше. Значения ΟΙ₅₀ (нМ) рассчитывали так же, как для линий клеток.

Исследование клеточного цикла с применением окрашивания пропидиййодидом. МКПК, содержащие бластные клетки ОМЛ, высевали в 6-луночные планшеты (от 0,6 до 1х10⁶ клеток/лунка) и обрабатывали одним из следующих веществ: ДМСО (разбавитель), соединением 11а при концентрации, равной 0,2 или 2 нМ, или паклитакселом при концентрации, равной 100 нМ. Собирали примерно 2х 10⁵ клеток, таблетки клеток дважды промывали холодным ЗФФ и повторно суспендировали в 500 мкл холодного ЗФФ. Клетки фиксировали путем добавления 8 мл холодного 80% этанола при медленном взбалтывании. После инкубации в течение 15 мин фиксированные клетки дважды промывали с помощью ЗФФ и таблетки клеток повторно суспендировали в 1 мл окрашивающего буфера РI/КNΑ8Е (ВО Вюкшепсек #550825) и инкубировали в течение 15 мин при 37°С с защитой от воздействия света. Пропидиййодид (ΡΙ) является флуоресцентным красителем, который окрашивает и ДНК, и РНК. Поэтому РНК необходимо удалить путем разложения с помощью рибонуклеазы (РНКазы). Перед проведением анализа с помощью ЕАС8 окрашенные клетки пропускали через устройство для окрашивания клеток в пробирку для ЕАС8 с целью уменьшения количества агрегатов клеток (ВО Еа1соп # 352235). Содержание ДНК в фиксированных и окрашенных клетках определяли с помощью проточного устройства для подсчета клеток ВО ЕАС8Са11Ьиг с использованием программного обеспечения Се110нек1. Исследование образования колоний в среде, содержащей метилцеллюлозу. Полужидкую среду, содержащую метилцеллюлозу, приобретали у фирмы 81ешСе11 ТесНпо1од1ек 1пс. (МеШосиИ™ 6Е+ Н4435, Са!# 04435). Властные клетки высевали при плотностях в диапазоне от 1х 10³ до 1х 10⁵ клеток/лунка в не предназначенные для культур тканей обработанные 6-луночные планшеты. ДМСО (разбавитель) или соединение 11а (0,1, 0,2, 0,5, 1 и 2 нМ) добавляли к средам одновременно с клетками. Количество колоний подсчитывали под микроскопом через 2 недели. Живые клетки окрашивали Р-йоднитротетразолием по 750 мкл/лунка при концентрации, равной 1 мг/мл (81дша Са!#18377); изображения получали после инкубации в течение ночи при 37°С.

Результаты: хотя кажущееся время удвоения этих бластных клеток было меньше, чем для большинства линий клеток ОМЛ, 50-70 ч и 30-50 ч соответственно, значения С1₅₀, полученные для соединения 11а (0,12, 0,28 и 0,34 нМ), согласовывались с приведенными выше для линий клеток ОМЛ. Сходные результаты получены с помощью исследования образования колоний, по данным которого для образца #06-366 количество колоний заметно уменьшалось при концентрации, равной 0,2 нМ, и колонии отсутствовали при концентрации, равной 0,5 нМ и выше. Сходные результаты получены для образцов #06-188 и #06503, во всех случаях колонии отсутствовали при концентрации, равной 0,5 нМ и выше. Характеристики клеточного цикла показали, что для образца #06-366 через 24 ч увеличивалось количество клеток, у которых задержан митоз (4Ν популяция), и через 48 ч увеличивалось количество погибших клеток (<2Ν популяция). При наибольшей концентрации (2 нМ) эти изменения были более выраженными, чем при меньшей концентрации (0,2 нМ), которая близка к ΟΙ₅₀. Для получения положительного контрольного образца устойчивой задержки митоза использовали большую дозу паклитаксела (100 нМ). Сходные результаты получены для образцов #06-188 и #06-503. Для образца #06-503 данные получали через 48 и 72 ч. Характеристики, полученные через 48 ч, сходны с наблюдавшимися для образца #06-366, и через 72 ч увеличение количества погибших клеток (<2Ν популяция) было более заметным, в особенности при концентрации, равной 2 нМ. См. фиг. 2. Тот факт, что значения ΟΙ₅₀ все еще является очень низким, показывает, что клетки, вступившие в клеточный цикл, очень эффективно уничтожались соединением Па.

Пример 8. Исследование ш у1уо эффективности ингибиторов КБВ.

Линию клеток НСТ-116 широко использовали для исследования ингибиторов митоза, таких как средства, разрушающие микротрубочки, ингибиторы митотической киназы и ингибиторы КБВ. Исследование эффективности многократного введения доз проводили в режиме введения по четыре раза в день в течение 3 дней (с.|4бх3). Эксперименты проводили с использованием аутбредных лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи в возрасте примерно 6-8 недель (Сйат1ек К1ует ЕаЬогаЮпек, НоШк1ет, СА).

- 20 018014

Для идентификации отдельных мышей им сразу же после поступления подкожно имплантировали микрочип (ЛУГО, Рокот, ЬЛ) в подлопаточную область. До начала каких-либо экспериментальных исследований животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели. Мышей по 4-5 особей помещали в прозрачные изготовленные из поликарбоната изолирующие микроклетки при освещении в циклическом режиме - 12 ч освещение, 12 ч без освещения - при температуре в диапазоне 70-80°Р и относительной влажности 30-70%. Корм (гранулированный корм для грызунов Риппи) и воду давали без ограничений. С мышами обращались в соответствии с правилами и руководствами №таг1к ЛСИС (Ашта1 Саге апб Ике СоттШее) и руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию 1ЬАК (1п5(11и(е Гог ЬаЬогаЮгу Ашта1 Кекеагсй) Стбе Гог 1Не Саге апб Ике оГ ЬаЬотаРоту АштаК Эксперименты проводили в помещениях, аттестованных АЛЛЬАС (Аккое1айоп Гог Аккекктеп) апб Асегебйакоп оГ ЬаЬотаРоту Ашта1 Саге), по методике, утвержденной АСИС.

Соединение 11а (свободное основание) и 8В-715992 (испинесиб, ингибитор КБВ фирмы СуРоктеР1ск, который проходит клинические исследования; в виде свободного основания) готовили в 20% каптисоле® во всех указанных выше дозах для объемной дозы, составляющей 8 мл/кг. Дозы устанавливали в соответствии массой тела каждого животного. Препараты готовили один раз в начале исследования и хранили при комнатной температуре. Паклитаксел, предназначенный для клинических исследований, приобретали в виде смеси с разбавителем на основе кремофора (Маупе Рйагта, по\у Нокриа, Ьаке РотекР, 1Ь, са1а1од # N006170334209) и разводили в стерильном физиологическом растворе с получением объемной дозы, составляющей 16 мл/кг для ВБ введения дозы, равной 30 мг/кг.

Клетки НСТ116 карциномы толстой кишки человека получали из №1бопа1 Сапсег 1пкШи1е'к ЭСТО Титог Керокйогу (саРа1од # ΝΟ 502568, КоскуШе, МО) и с помощью набора анализов 1МРАСТ1 РСК (КАО1Ь, итуегкНу оГ Мккошт, Со1итЬ1а, МО) подтверждали отсутствие Мусор1акта кр. и вирусов мышей. Клетки НСТ116 выращивали в среде КРМ1 1640, содержащей 2 мМ Ь-глутамина (Меб1аРесй 1пс., са1а1од #15-040-СУ), к которой добавляли 10% фетальную бычью сыворотку (ДКН Вюкаепсек, са1а1од #12003-1000М). Эти клетки выращивали в виде прилипающих культур, хранили при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода. Перед использованием клетки выращивали посредством менее 10 пассажей. Клетки собирали при слиянии, составляющем 95%, и центрифугировали при ~800хд в течение 5 мин при 4°С и затем повторно суспендировали в холодной среде НВ88 (Меб1аРесй 1пс., са1а1од #21-021-СУ) при концентрации, равной 50 млн клеток/мл, для подкожной имплантации (вводимый объем составлял 0,1 мл).

Самкам мышей линии пи/ии (Сйаг1ек К1ует, НоШкРет, СА) в правый бок путем инъекции подкожно вводили 5 млн. опухолевых клеток НСТ-116, суспендированных в сбалансированном солевом растворе Хенкса (НВ88), при полном объеме, равном 0,1 мл/мышь. Для исследования эффективности мышей рандомизировали через 10 дней после имплантации. В исследование 1 включали 72 мышей и в исследование 2 включали 81 мышь, обладающих опухолями со средним объемом, равным примерно 300 мм³. Ксенотрансплантаты опухолей измеряли в двух направлениях (Ь (длина) и (ширина)) с помощью цифровых штангенциркулей два раза в неделю от момента начала введения в день 0. Объем опухоли рассчитывали по уравнению (Ьх^2)/2. Массы тела измеряли два раза в неделю и результаты клинических обследований регистрировали ежедневно. Значения объемов опухолей и массы тела регистрировали и хранили с использованием программного обеспечения ОибуОиесЮг (8РибуЬод, 8оиРй 8ап РтапсРксо, СА). Выраженные в процентах значения лечение/контроль (Т/С) рассчитывали по следующей формуле:

%Т/С = 100хЛТ/ДС в которой Т - средний объем опухоли для группы, получавшей лекарственное средство, в последний день исследования;

ДТ - средний объем опухоли для группы, получавшей лекарственное средство, в последний день исследования - средний объем опухоли для группы, получавшей лекарственное средство, в первый день исследования;

С - средний объем опухоли для контрольной группы в последний день исследования и

ДС - средний объем опухоли для контрольной группы в последний день исследования - средний объем опухоли для контрольной группы в первый день исследования.

Все данные представляли в виде средних значений с указанием СКП (среднеквадратичная погрешность). Сопоставление конечных данных измерений опухолей между группами проводили с использованием одностороннего парного дисперсионного анализа (АNΟVА). Статистическую значимость определяли с помощью одностороннего АNΟVА Крускала-Уоллиса для методики множественных парных сравнений Ранкса и Данна. Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения 8|дта81а1 (8ук1а1 8оП\таге 1пс., 8ап 1оке, СА).

Исследование эффективности многократного введения доз проводили в режиме с.|4бх3 для сопоставления противоопухолевой активности соединения 11а с данными для 8В-715992 и паклитаксела. Результаты приведены в табл. 5. В этом исследовании животные, которых лечили с применением наибольших доз, равных 5 мг/кг для соединения 11а и 15 мг/кг для 8В-7115992, получали только две первые дозы из запланированного режима с.|4бх3 вследствие значительного уменьшения массы тела мышей, которую

- 21 018014 восстанавливали. Даже после введения только двух доз сходным образом происходила значительная регрессия опухоли (73% регрессия, р<0,05 в каждом случае). Две меньшие дозы соединения Па, равные 2,5 и 1,25 мг/кг, и дозу 8В-715992, равную 7,5 мг/кг, вводимые в режиме с.|4б/3, также сходным образом приводили к регрессии ксенотрансплантатов опухолей НСТ116 (82%, 66%, 65% регрессия, р<0,05 соответственно). В целом паклитаксел был менее эффективным, чем соединение Па; хотя для опухолей, сначала регрессировавших, рост возобновлялся вскоре после превращения введения.

Таблица 5

Эффективность соединения Па при введении в режиме с.|4б/3 для модели ксенотрансплантата опухоли НСТ116

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	Т/С, день 17 (%)	Δ Объема опухоли, день 17 (мм )	Максимальная регрессия, % (день)	Максимальное Δ массы тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель (20% ® каптисод )	ς4ϋχ3, ВВ	100	756 + 95	-	0,9 + 0,5 (день 11)	3,4 ± 0,02 (день ! 1)	9/9
Соединение 11а	1,25 мг/кг, ВВ, 44(1x3		-173 ± 12	66 (день 20)	•0,7+ 0,3 (день 4)	>2,9 ± 0,01 (день 4)	9/9
Соединение На	2,5 мг/кг, ВВ, ц4с!хЗ		-208 ± 17	82 (день 20)	-1,8 ±0,2 (день 11)	-7,0 ± 0,03 (день 11)	9/9
Соединение Па	5 мг/кг, ВВ, η4<1χ3		•196 ± 11	73 (день 20)	-3,0 ±0,2 (день 7)	-11,7 ± 0,02 (день 7)	8/9 (уменьшение массы тела)
8В-715992	3,5 мг/кг, ВВ, η4άχ3	5	39±4	10 (день 11)	-0,7 ±0,05 (день 4)	-2,7 + 0,17 (день 4)	9/9
5В-715992	7,5 МГ/КГ , ВВ, ς4άχ3		•177 + 55	65 (день 17)	•0,3 ± 0,05 (день 4)	-1,3 ± 0,25 (день 4)	9/9
8В-715992	15 мг/кг, ВВ, д4<1хЗ		-205 ± 24	73 (день 20)	•2,5 + 0,2 (день 7)	>10,6 ± 0,75 (день	9/9
Паклитаксел	30 мг/кг, ВБ, ц4<1хЗ	— *	-80 + 3	31 (день 17)	-1,3 ± 0,1 (день 7)	-5,0 ±0,46 (день 7)	9/9

Поскольку столь низкая доза, как равная 1,25 мг/кг, в режиме введения с.|4б/3 приводила к регрессии ксенотрансплантатов НСТ116, исследование эффективности проводили повторно в диапазоне доз от 2 до 0,125 мг/кг, чтобы изучить ответ на дозы и определить, насколько низкую дозу можно ввести, чтобы вызвать регрессию опухоли. Результаты, приведенные в табл. 6, показывают, что при введении регрессия опухолей наблюдалась при низкой дозе, равной лишь 1 мг/кг (46% регрессия, р<0,05, день 17), и остановка роста опухоли наблюдалась при дозе соединения Па, равной лишь 0,25 мг/кг, однако при сопоставлении с данными для животных контрольной группы, которым вводили разбавитель, результат не становился статистически значимым. Противоопухолевый эффект соединения Па при дозе, равной 0,125 мг/кг, статистически значимо не отличался от результата для животных контрольной группы, которым вводили разбавитель. Только равная 7,5 мг/кг доза 8В-715992 приводила к регрессии опухолей. Кроме того, через 72 ч после введения последней дозы брали пробы крови для сопоставления содержания нейтрофилов в кровотоке в разных группах. Содержание нейтрофилов уменьшилось в соответствии с дозой аналогично тому, как изменилась эффективность воздействия на опухоли.

- 22 018014

Таблица 6

Эффективность низких доз соединения Па при введении в режиме с.|46/3 для модели ксенотрансплантата опухоли НСТ116.

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	ДОЖ путь, режим	Т/С, день 24 (%)	д Объема опухоли, день 24 (мм )	Максимальная регрессия, % (день)	Нейтрофилов/мкл через 72 после введения дозы + стандартное отклонение (СО)	Макси- ! мальное Δ массы тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество вьгживюх/полное количество)
Разбавитель (20% каптисол )	η4άχ3, вв	100	1104 ± 262	-	1227 ± 257	-0,1± 0,2 (день 3)	-0,4 ± 0,86 (день 3)	9/9
Соединение Па	0,125 мг/кг, ВВ,	£1	809 + 193	-	1346 ± 427	-0,4 +0,16 (день 3)	-1,4 ± 0,59 (день 3)	9/9
Соединение Па	0,25 мг/кг, ВВ,	35	382 ± 120	-	785 ±374	-0,6 ± 0,15 (день 3)	-2,3 ± 0,58 (день 3)	9/9
		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	т/с, день 24 (%)	Δ Объема опухоли, день 24 3 (мм )	Максимальная регрессия, % (день)	Нейтрофи· лов/мкл через 72 после введения дозы ± стандартное отклонение (СО)	Макси· ^;мальное , Δ массы тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/полное количество)
Соединение Па	0,5 мг/кг, ВВ, η 4с1 х 3	14	155 + 145	8 (день 14)	293 ±29	-0.7 ±0,1« (день 3)	-2,7 ± 0,75 (день 3)	9/9
Соединение Па	1 мг/кг, ВБ, ¢4(1 кЗ		-34 ± 36	46 (день 17)	343 + 255	-0,7 ±0,23 (день 3)	-2,8 ± 0.83 (день 3)	9/9
Соединение Па	2 мг/кг, ВБ, η4άχ3		-141 ±4«	73 (день 71)	193 ± 125	-1,35 + 0,87 (день 10)	-4,7 ± 1,17 (день 3)	8/9 (уменьше ние массы тела)
КВ-715992	1,75 мг/кг, ВВ, ο4άχ3	36	395 ± 84	-	1026 ± 229	-0,6 ± 0,58 (день 3)	-2.3 ± 0,51 (день 3)	9/9
8В-715992	3,5 мг/кг, ВВ, ц4с!хЗ	15	165 ± 60	13 (день 7)	731 ±391	-0,5 ±0,37 (день 3)	-2,0 ± 0,44 (день 3)	9/9
8В-715992	7,5 мг/кг, ВВ, ς4άχ3	-	-145 + 25	65 (день 21)	476±112	-0,7 ± 1,1 (день 10	-3,0 ± 2,49 (день 10)	9/9

Пример 9. Эффективность ингибиторов КБВ для модели ксенотрансплантата опухоли НСТ15.

НСТ15 представляет собой линию клеток аденокарциномы человека и также известно, что они экспрессируют насос Р-др. Таким образом, модель ксенотрансплантата опухоли с применением этой линии клеток использована для проверки результатов, полученных в примере 10.

Эксперименты проводили с использованием аутбредных лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи в возрасте примерно 6-8 недель (Сйаг1ев ΚίνβΓ ЬаЬога1опев, НоШв1ег, СА). Для идентификации отдельных мышей им сразу же после поступления подкожно имплантировали микрочип (АУТО, Ро1вот, ЬА) в подлопаточную область. До начала каких-либо экспериментальных исследований животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели. Стандартный уход за животными и жизнеобеспечение осуществляли так, как описано выше.

Клетки НСТ15 карциномы толстой кишки человека получали из Ыайопа1 Сапсег [п8111и(е'8 ЭСТЭ Титог Керовйогу (са!а1од # ΝΤΊ 502711, ПосктШе, ΜΌ). Клетки НСТ15 выращивали в среде ΚРΜI 1640, содержащей 2 мМ Ь-глутамина (МеЛа1есй Лс., са!а1од #15-040-СУ), к которой добавляли 10% феталь

- 23 018014 ную бычью сыворотку (1КН Вюксшпсск, сай^д #12003-1000М). С помощью набора анализов 1МРАСТ1 РСК (КАО1Ь, Иптусгайу οί Μίδδοιιπ, ^^тШа, МО) подтверждали отсутствие в клетках МуторПкта §р. и вирусов мышей. Эти клетки выращивали в виде прилипающих культур, хранили при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода. Перед использованием клетки выращивали посредством менее 10 пассажей. Клетки собирали при слиянии, составляющем 95%, и центрифугировали при ~800хд в течение 5 мин при 4°С и затем повторно суспендировали в смеси состава 1:1 НВ88 (Мсб1а1ссй 1пс., са1а^д #21-021-СУ) и Ма1пдс1™ при концентрации, равной 50 млн клеток/мл, для подкожной имплантации (вводимый объем составлял 0,2 мл).

Лечение для изучения эффективности начинали через 10 дней после имплантации опухолевых клеток, когда объемы опухолей составляли примерно 300 мм³. Соединение 11а и 8В-715992 вводили внутривенно (ВВ) через хвостовую вену в объеме, равном 8 мл/кг, в указанных дозах. Паклитаксел вводили внутрибрюшинно (ВБ) в объеме, равном 16 мл/кг, в дозе, равной 30 мг/кг.

Для изучения эффективности мышей рандомизировали через 10 дней после имплантации и включали в исследование при среднем объеме опухоли, равном примерно 300 мм³. Ксенотрансплантаты опухолей измеряли в двух направлениях (Ь (длина) и (ширина)) с помощью цифровых штангенциркулей два раза в неделю от момента начала введения в день 0. Объем опухоли рассчитывали по уравнению (Ьх^2)/2. Массы тела измеряли два раза в неделю и результаты клинических обследований регистрировали ежедневно. Значения объемов опухолей и массы тела регистрировали и хранили с использованием программного обеспечения 81ибуО|гссЮг ^^бу^д, 8οιι11ι 8ап Б^аηс^8сο, СА). Данные анализировали так, как описано выше.

Результаты, приведенные в табл. 7, показывают, что соединение 11а обладает большей эффективностью по отношению к опухоли НСТ15, чем паклитаксел; при дозе, равной 4 мг/кг, выраженное в процентах значение Т/С равнялось 26% (р <0,05 при сравнении с разбавителем и аналогичное значение получено при сравнении с паклитакселом). Хотя эти данные свидетельствуют о различии результатов для животных групп, которым вводили 4 мг/кг ингибитора КБВ и 7,5 и 15 мг/кг 8В-715992, результаты не являются статистически значимыми вследствие разброса значений объемов опухолей в этой модели. В день 10 обнаружено статистически значимое (р<0,05) различие результатов для животных групп, которым вводили 4 мг/кг соединения 11а и 7,5 мг/кг 8В-715992. Паклитаксел, являющийся известным субстратом для Р-др, в этой модели обладал очень низкой противоопухолевой активностью. Ни для одной из подвергавшихся лечению мышей не обнаружены ни значительное уменьшение массы тела, ни внешние признаки токсического воздействия. Увеличенная противоопухолевая активность для модели НСТ15 свидетельствует об эффективности соединения 11а для моделей ксенотрансплантатов опухолей, которые экспрессируют большие количества Р-др.

Таблица 7

Эффективность соединения Па при введении в режиме с.|4бх3 для модели ксенотрансплантата опухоли НСТ15

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь» режим	дт/дс, день 15 (%)	Регрессия (%)	Д Объем опухоли, день 15 3 (мм )	Максимальное Δ массы тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель (20% каптисол)	ΐ мл/кг, 44(1x3, вв	100	--	1123 ± 84	0,3 ± 0,2 (день 10)	1,4±0,8 (день 10)	9/9
Соединение На	1,25 мг/кг, 44(1x3, ВВ	60	-	671 + 172	-0,5± 0,4 (день 3)	-2,1 ±0,6 (деиь 3)	9/9
Соединение Па	2,5 мг/кг, ς4(1χ3, ВВ	65	-	735± 159	0,6± 0,2 (день 3)	2,3 ± 0,8 (день 10)	9/9
Соединение На	4,0 мг/кг, 446x3, ВВ	26*	--	99± 78	-0,8± 0,3 (день 10}	-3,2± 1,4 (день 10)	9/9

- 24 018014

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	дт/дс, день 15 (%)	Регрессия (%)	Д Объем опухоли, день 15 (мм )	Максимальное Δ массы тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
8В-715992	7.5 мг/кг. Ч46х3, ВВ	87	-	647 + 164	0,6 ± 0,2 (день 8)	2,6 + 1,0 (день 8)	9/9
8В-715992	15 мг/кг, Ч4с1х3, ВВ	67	-	491 ± 109	-1,2 ± 0,4 (день 10)	-4,9± 1,4 (день 10)	9/9
Паклитаксел	30 мг/кг, η46χ3, ВБ	104	-	703± 198	0,8 + 0,6 (день 8)	3,3 ± 1,0 (день 8)	9/9

Пример 10. Эффективность ингибиторов КБВ для модели ксенотрансплантата острого миелогенного лейкоза (ОМЛ).

Эффективность соединения 11а для модели ксенотрансплантата опухоли МУ4;11 (О'Еаттей, е! а1., 2003) оценивали с использованием лишенных вилочковой железы мышей. Сначала эффективность исследовали для модели подкожного ксенотрансплантата опухоли МУ4;11 у мышей и, поскольку микроокружение костного мозга оказывает значительное влияние на рост и выживание клеток ОМЛ, эффективность также исследовали для модели диссеминированного заболевания МУ4;11-1ис у мышей, в которой клетки находились и росли в костном мозге и некоторых мягких органах. Поскольку опухолевые клетки экспрессируют люциферазу, последовательный комплексный мониторинг роста лейкозных поражений проводили с помощью биолюминесцентной визуализации.

Исследования эффективности по отношению к подкожным опухолям проводили с использованием аутбредных лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи в возрасте примерно 6-8 недель (Сйаг1е8 Ктует ЬаЬогаЮпеу НоШйет, СА). Исследования эффективности для модели диссеминированного заболевания проводили с использованием иммунодефицитных самок мышей линии Ν0Ό-8ΟΌ в возрасте примерно 7-8 недель (1аск§оп ЬаЬогакпеу Ваг НагЬог, МЕ). Для идентификации отдельных мышей им сразу же после поступления подкожно имплантировали микрочип (АУГО, Ео1§от, ЬА) в подлопаточную область. До начала каких-либо экспериментальных исследований животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели. Стандартный уход за животными и жизнеобеспечение осуществляли так, как описано выше.

Клетки МУ4; 11 острого миелогенного лейкоза человека получали из Атепсап Тшкие СиИиге Со11есйоп (са!а1од # СКЕ-9591, КоскуШе, МИ) и с помощью набора анализов 1МРАСТ1 РСК (КАШИ, Ишуегкйу о£ М188оил, Со1итЫа, МО) подтверждали отсутствие Мусор1ахта хр. и вирусов мышей. Для модели диссеминированного заболевания стабильный пул клеток МУ4;11, экспрессирующих ген люциферазы, получали из Еаидх1аи 8ип а! И1е Сепоткз 1п8Й!и!е о£ И1е №уай18 Кезеатсй Еоипйайоп т 8ап И1едо, СаШогша (МУ4;11-1ис). Клетки МУ4;11 выращивали в среде Дульбекко, модифицированной по методике Исков (Мей1а!есй 1пс., са!а1од #15-016-СУ), к которой добавляли 10% фетальную бычью сыворотку (ЖН Вюзаепсех, са!а1од #12003-1000М), 4 мМ Ь-глутамина и 5 нг/мл рекомбинантных гранулоцитов человека МС8Е (6М-С8Е) (К&И 8у51ет5. са!а1од #215-СМ). МУ4;11-1ис выращивали таких же средах, но с добавлением 2 мкг/мл пуромицина для селекции экспрессии люциферазы. Эти клетки выращивали в виде суспензий культур, хранили при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода. Перед использованием клетки выращивали посредством менее 10 пассажей. Клетки собирали примерно по 2 млн клеток/мл и центрифугировали при ~800хд в течение 5 мин при 4°С и затем повторно суспендировали в холодной среде НВ88 (Мей1а!есй 1пс., са!а1од #21-021-СУ) при концентрации, равной 25 млн клеток/мл (содержащей 50% Ма!пде1™, ВИ Вюзшепсез, са!а1од #354234), для подкожной имплантации (вводимый объем составлял 0,2 мл) или при концентрации, равной 100 млн клеток/мл, для внутривенной (ВВ) имплантации через хвостовую вену (вводимый объем составлял 0,1 мл). Мышей облучали дозой, равной 3 Гр, в течение 3 мин за один день до ВВ имплантации клеток.

Соединение 11а (свободное основание) и 8В-715992 (свободное основание) готовили в 20% каптисоле® для объемной дозы, составляющей 8 мл/кг. Дозы устанавливали в соответствии с массой тела каждого животного. Препараты готовили один раз в начале исследования и хранили при комнатной температуре. Паклитаксел, предназначенный для клинических исследований, приобретали в виде смеси с разбавителем на основе кремофора (Маупе Рйатта, пои Нозрйа, Ьаке Еотей, 1Ь, са!а1од # НИС-6170334209) и разводили в стерильном физиологическом растворе с получением объемной дозы, составляющей 16 мл/кг для ВБ введения дозы, равной 30 мг/кг.

При двух исследованиях с помощью модели подкожной опухоли 10 млн клеток, объединенных со

- 25 018014 смесью 1:1 НВ88 и Ма1пде1™, путем инъекции подкожно вводили в правый бок при полном объеме, равном 0,2 мл/мышь. Мышей рандомизировали через 17 дней после имплантации и в исследование включали мышей, обладающих опухолями со средним объемом, равным примерно 250 мм³. Ксенотрансплантаты опухолей измеряли в двух направлениях (Ь (длина) и А (ширина)) с помощью цифровых штангенциркулей два раза в неделю от момента начала введения в день 0. Объем опухоли рассчитывали по уравнению (Ьх А2)/2. Массы тела измеряли два раза в неделю и результаты клинических обследований регистрировали ежедневно. Значения объемов опухолей и массы тела регистрировали и хранили с использованием программного обеспечения 81ибуП1гес1ог (81ибуЬод, 8ои111 8ап Ргапсщсо, СА).

Для оценки эффективности в модели диссеминированного заболевания проводили облучение всего тела самок мышей линии Ν0Ό-8ΟΌ дозой, равной 3 Гр, за один день до введения путем инъекции в хвостовую вену 10 млн клеток в 0,1 мл среды НВ88. Сорок мышей рандомизировали и включали в исследование через 28 дней после имплантации при среднем количестве фотонов (со стороны спины + со стороны живота), определенном с помощью биолюминесцентной визуализации, равном примерно 5х10 фотон/с. Примерно за 10 мин до визуализации мышам с помощью ВБ инъекции вводили 150 мг/кг люциферина (Хеподеп СогрогаБоп, А1атеба, СА), затем их анестезировали изофлураном. Испускание фотонов измеряли с помощью камеры на приборах с зарядовой связью в системе визуализации 1У18 (Хеподеп СогрогаБоп). Вкратце, методика заключается в следующем: получали полутоновое изображение мыши, затем накладывали карту биолюминесценции, представляющую пространственное распределение фотонов, зарегистрированных вследствие разложения люциферина в раковых клетках, экспрессирующих люциферазу. Интенсивности сигналов количественно определяли с использованием модифицированной версии программного обеспечения ЮОК Рго гегБоп 4.09А (АауеМеБтск, 1пс., Баке О5\\'едо, ОК) под названием ЬМпд 1таде уегБоп 2.50.2 (Хеподеп). Определяли суммарное количество всех зарегистрированных фотонов со стороны спины + со стороны живота. Биолюминесценцию раковых клеток животных исследовали путем визуализации в назначенные дни, пока у первой мыши не развивался паралич задней конечности, вызванный развитием заболевания; этот момент являлся главной конечной точкой для гуманного умерщвления мыши. Регистрировали день умерщвления каждой мыши и строили зависимость выраженного в процентах количества оставшихся мышей от времени (анализ выживания КапланаМейера). Значения Р рассчитывали с использованием логарифмического рангового критерия (программное обеспечение СгарБРаб Ргйш 4.0) для оценки различия между группой животных, подвергавшихся лечению, и контрольной группой (значение р <0,05 считали обеспечивающим статистическую значимость). Массы тела измеряли два раза в неделю и результаты клинических обследований регистрировали ежедневно. Значения массы тела регистрировали и хранили с использованием программного обеспечения 81ибуП1гес1ог (81ибуЬод, 8ои1Б 8ап Ргапс18со, СА). Анализ данных проводили так, как описано выше.

Результаты, модель подкожной опухоли. Исследования эффективности для модели подкожной опухоли проводили для сопоставления активности соединения 11а в диапазоне доз при введении в режиме с.|4бх3. В первом исследовании для мышей линии пи/пи определили наибольшие переносимые дозы: 4 мг/кг соединения 11а, 15 мг/кг 8В-715992 и 30 мг/кг паклитаксела. Четырем оставшимся мышам, у которых имелись опухоли, в том же режиме вводили 0,625 мг/кг ингибитора КБВ. Результаты приведены в табл. 8. В течение введения регрессию опухолей наблюдали во всех группах, для которых проводили лечение, и у 9/9, 6/9 и 7/9 мышей наблюдалась длительная/полная регрессия опухолей (ПР) в течение более 100 дней в группах животных, которым вводили наибольшие дозы соединения 11а, 8В-715992 и паклитаксела соответственно. Хотя в группах животных, которым вводили 0,625 мг/кг соединения 11а, опухоли регрессировали, они начинали повторно расти примерно через 10 дней после введения последней дозы. Дозы исследуемых средств обычно хорошо переносились, и среднее максимальное уменьшение массы составляло <10%, хотя в группах животных, которым вводили 8В-715992, у двух мышей уменьшение массы тела составляло >20%.

- 26 018014

Таблица 8

Эффективность соединения 11а при подкожном введении в режиме с.|4б/3 для модели ксенотрансплантата опухоли МУ4;11

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь., режим	ΔΤ/ЛС, лень 24 (%)	Максимальная регрессия, %(день)	Δ Объем опухоли, день 24 (мм )	ПР	Максимальное Δ массы тела (день) (г)	Максимально е Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель (20% каптисол)	Я4<1х3. вв	100	-	911+ 101	0	0,23+0,3, (день 10)	1+ 1,4 (день 10)	9/9
Соединение Па	0,625 мг/кг, η4ί)χ3, ВВ	-	69(день Ю)	-32+ 172	0	-0,5± 1,3 (день 7)	-1,7± 5,0 (день 7)	4/4
Соединение Па	4 мг/кг, Ч44хЗ, ВВ	-	100, (день 60)	-176± 31	9	-1,5+ 0,4 (день 10)	-5,9+ 1,6 (день Ю)	9/9
5Β-7Ι5992	15 мг/кг, ς4(1χ3, ВВ	-	98(день 60)	-21 1± 28	6	-1,4+ 0,3 (день 3)	-5,6± 1,1 (день 3)	7/9 (уменьшение массы тела)
Паклитаксел	1 мг/кг, ς4άχ3, ВБ	--	75 (день 46)	-151± 63	7	ол± 0,3 (день 10)	0,4+ 1,1 (день Ю)	9/9

Второе исследование эффективности для модели подкожной опухоли проводили путем сопоставления активности в диапазоне низких доз соединения 11а при введении в режиме с.|4б/3. Наибольшая использованная доза равнялась 2 мг/кг, что составляло половину наибольшей переносимой дозы для голых мышей. Активность соединения 11а сопоставляли с активностью 8В-715992 при дозе, равной 7,5 мг/кг, что составляло половину наибольшей переносимой дозы. Результаты приведены в табл. 9 и на фиг. 2. При равных 0,5, 1 и 2 мг/кг дозах соединения 11а и равных 1,75, 3,5 и 7,5 мг/кг дозах 8В-715992 наблюдали различные степени регрессии опухоли. Через 5 дней после введения последней дозы начинался рост опухолей в группах животных, которым вводили 0,5 мг/кг соединения 11а и 1,75 мг/кг 8В-715992. Затем, через 30 дней после введения начинался рост опухолей в группах животных, которым вводили 7,5 мг/кг 8В-715992. Равные 1 и 2 мг/кг дозы соединения 11а приводили к длительной регрессии и в течение более 100 дней наблюдалась полная регрессия 6 и 5 опухолей соответственно. Дозы исследуемых средств обычно хорошо переносились и среднее максимальное уменьшение массы составляло <10%.

- 27 018014

Таблица 9

Исследование 2: сводка данных по противоопухолевой эффективности и переносимости соединения Па для подкожных ксенотрансплантатов опухолей МУ4;11 ОМЛ человека

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза> путь, режим	ΔΤ/ДС, день 21 (%)	Максима* льная регрессия, % (день)	Δ Объем I опухоли, день 21 3 (мм )	ПР	Максимальное Δ массы тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель (20% каптисол)	44(1x3, ВВ	100	-	574184	0	0,31 0,24 (день 10)	1,110,9, день 10	9/9
Соединение На	0,13 мг/кг, Ч4о1х3, ВВ	161	-	9211341	0	-0,61 1,0 (день 10)	2,31 1,7 (день 10)	9/9
Соединение 11а	0,25 мг/кг, Ч4с1х3, ВВ	133	-	7651196	0	0,21 0,14, (день 10)	0,641 0,5 (день 10)	9/9
Соединение Па	0,5 мг/кг, ς4άχ3, ВВ	20	55 (день Ю)	1141110	0	-0,61 0,24 (день 7)	-2,51 0,8 (день 7)	9/9
Соединение На	1 мг/кг, ц4ихЗ, ВВ	-	89 (ден ь 63)	-194127	6	-0,31 0,2 (день 7)	-1,11 0,7 (день 7)	9/9
Соединение На	2 мг/кг, Ч4с1х3, ВВ	-	87(день 63)	-201123	5	-0,11 0,14 (день 3)	-0,41 0,6 (день 3)	9/9
56-715992	1,8 мг/кг, η40χ3, ВВ	59	-	3391218	0	0,51 0,4, день 10	2,01 1,0, день 10	9/9
5В-715992	3,5 мг/кг, η4άχ3, ВВ	44	41 (день Ю)	2511132	0	0.21 0,3, день 3	0,71 0.3, день 3	9/9
5В-715992	7,5 мг/кг, Ч4(1х3, ВВ	__*	75(день 31)	-204120	3	-0,41 0,8, день 10	-1,41 1,3, день 10	9/9

Результаты, модель диссеминированного ОМЛ. Активность соединения Па оценивали для модели диссеминированного заболевания ОМЛ МУ4;11-1ис, в которой опухолевые клетки имплантировали внутривенно. Введение лекарственного средства начинали через 28 дней после имплантации клеток, и в это время животные находились на стадии запущенного заболевания, о чем свидетельствовал интенсивный сигнал биолюминесценции. Результаты приведены в табл. 10. При начальной визуализации сигнал биолюминесценции наблюдался в костях (нижняя челюсть, череп, позвоночный столб и длинные кости), но он также наблюдался для всего тела, включая легкие и печень. Поэтому после этого регистрировали испускание фотонов из всего тела (со стороны спины + со стороны живота). Эти поражения в конечном счете приводили к параличу задней конечности и в некоторых случаях к значительному уменьшению массы тела вследствие увеличения массы опухоли и в это время мышей умерщвляли. Это называли условной выживаемостью.

Последовательный мониторинг испускания фотонов из опухоли МУ4;11-1ис у мышей проводили, пока от болезни не погибала первая мышь, что происходило после 12-го дня исследования. Равные 0,5 и 1 мг/кг дозы соединения Па при введении в режиме с.|4б/3 приводили к значительно меньшему сигналу биолюминесценции, который являлся мерой развития заболевания, чем для группы животных, которым вводили разбавитель (р <0,05), в то же время воздействие дозы лекарственного средства, равной 0,25 мг/кг, статистически значимо не отличалось от воздействия разбавителя. При этих дозах соединение Па хорошо переносилось. Соединение Па значительно задерживало развитие паралича задней конечности и при всех трех дозах приводило к лучшей выживаемости мышей, чем в когорте животных, которым вво

- 28 018014 дили разбавитель (р <0,05). Средняя выживаемость в группе животных, которым вводили разбавитель, составляла 15 дней, а в группах животных, которым вводили 0,25, 0,5 и 1 мг/кг соединения Па, она составляла 27, 31 и 30 дней соответственно. Уменьшение массы опухоли в начале введения (по данным биолюминесценции), которое происходило во время введения, не согласовывалось с зависящим от дозы увеличением выживаемости. Представляется, что после прекращения воздействия соединения заболевание быстро прогрессировало во всех группах.

Таблица 10

Эффективность соединения Па при введении в режиме с.|4б/3 для модели диссеминированного заболевания МУ4; 11

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	дт/дс, день 12 (%)	Регрессия, день 12 (%)	Δ биолюминесценции опухоли, день 12 (фотон/с)	Среднее значение выживаемости, дни	Максимальное Δ массы тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)
Разбавитель (20% каптисол)	ς44χ3, ВВ	100	-	$ 9,2x10 + 8 2,6x10	15	-0,64± 0,16 (день 6)	-3,6+0,92 (день 6)
Соединение Па	0. 25 мг/кг, ς44χ3, ВВ	46	--	4,Зх10⁸± 8 2,0x10	27**	1,1± 0,44 (день 5)	5,6+ 1,3 (день 5)
Соединение На	0,5 мг/кг, Я44х3, ВВ	-	9*	-4,0x10⁶± 1,3х Ι0⁷	31**	-0,57± 0,45 (день 10)	-2,6± 2,3 (день 10)
Соединение Па	1 мг/кг, ¢)44 хЗ, ВВ	-	80*	7 -3,9x10 + 7 1,4x10	30**	-0,77± 0,32 (день 10)	-4,2± 1.7 (день 10)

Пример 11. Исследование эффективности ингибиторов КБВ для ксенотрансплантатов множественной миеломы человека КМ8-11-1ис.

Оценивали эффективность соединения Па для ксенотрансплантатов множественной миеломы человека КМ8-11-1ис. Сначала эффективность исследовали для модели подкожного ксенотрансплантата опухоли у мышей этой линии и соединение Па приводило к выраженному противоопухолевому эффекту. Поскольку микроокружение костного мозга оказывает значительное влияние на рост и выживание клеток миеломы, эффективность также исследовали для модели диссеминированного заболевания КМЗ-111ис у мышей, в которой клетки предпочтительно находились и росли в ортотопической части костного мозга. Экспрессирование репортерного гена люциферазы в клетках позволило провести последовательный комплексный мониторинг роста миеломных поражений в кости с помощью биолюминесцентной визуализации.

Эксперименты проводили с использованием иммунодефицитных самок мышей линии 8СШ-Ве1де в возрасте примерно 7-8 недель (СНаг1ез Вшет ЬаЬота!опез, ^11ттд!ои, МА). Для идентификации отдельных мышей им сразу же после поступления подкожно имплантировали микрочип (АУТО, Ео1зот, ЬА) в подлопаточную область. До начала каких-либо экспериментальных исследований животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели. Стандартный уход за животными и жизнеобеспечение осуществляли так, как описано выше.

Клетки КМ8-11-1ис множественной миеломы человека получали из лаборатории Зи/аипе Тгибе1 а! (Не ЬшхегзЦу ой Тогои!о (Ои!апо, Саиаба) и с помощью набора анализов ВИРАСТ1 РСВ (ВАШЬ, ЬшхегзНу ой М1ззоит1, Со1итЬ1а, МО) подтверждали отсутствие Мусор1азта зр. и вирусов мышей. До получения нами этих клеток их с помощью генной инженерии путем ретровирусной трансфекции вектора рОСдйр/1ис модифицировали, так чтобы они стабильно экспрессировали люциферазу. Клетки КМ8-11-1ис выращивали в среде Исков, к которой добавляли 2 ммоль/л Ь-глутамина (Меб1а!есН, Нчс., Негибои, УА) и 10% фетальную бычью сыворотку (ГВН ВюзОеисез, са!а1од #12003-1000М). Эти клетки выращивали в виде суспензий культур, хранили при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода. Перед использованием клетки выращивали посредством менее 10 пассажей. Клетки собирали примерно по 2 млн клеток/мл и центрифугировали при ~800хд в течение 5 мин при 4°С и затем повторно суспендировали в смеси состава 1:1 холодного сбалансированного солевого раствора Хенкса (НВ88) и Ма!г1де1™ (Меб1а!есН Нчс., са!а1од #21-021-СУ; ВЭ ВюзОеисез, са!а1од #354234 соответственно) при концентрации, равной 50 млн клеток/мл, для подкожной имплантации (вводимый объем составлял 0,2 мл). Альтернативно, для модели диссеминированного заболевания клетки готовили только в холодном НВ88 при концентрации, равной 100 млн клеток/мл, для внутривенной (ВВ) имплантации через хвостовую ве

- 29 018014 ну (вводимый объем составлял 0,1 мл).

Соединение 11а и 8Β-715992 (свободное основание) готовили в 20% каптисоле® для объемной дозы, составляющей 8 мл/кг. Дозы устанавливали в соответствии массой тела каждого животного. Препараты готовили один раз в начале исследования и хранили при комнатной температуре. Паклитаксел, предназначенный для клинических исследований, приобретали в виде смеси с разбавителем на основе кремофора (Мауие РИагта, иоу Нокрта, Ьаке Ротек!, 1Ь, са!а1од # N06-6170334209) и разводили в стерильном физиологическом растворе с получением объемной дозы, составляющей 16 мл/кг для ВБ введения дозы, равной 30 мг/кг.

Для оценки эффективности в модели подкожной опухоли 10 млн клеток, объединенных со смесью 1:1 ΗΒ88 и Мабтде1™, путем инъекции подкожно вводили в правый бок при полном объеме, равном 200 мкл/мышь. Мышей рандомизировали через 11 дней после имплантации и 54 мышей включали в исследование при среднем объеме опухоли, равном примерно 140 мм³. Ксенотрансплантаты опухолей измеряли в двух направлениях (Ь (длина) и (ширина)) с помощью цифровых штангенциркулей два раза в неделю от момента начала введения в день 0. Объем опухоли рассчитывали по уравнению (Ьх^2)/2. Массы тела измеряли два раза в неделю и результаты клинических обследований регистрировали ежедневно. Значения объемов опухолей и массы тела регистрировали и хранили с использованием программного обеспечения 8!ибуО1тес!ог (8!ибуЬод, 8ои!й 8аи Егаис1ксо, СА). Анализ данных проводили так, как описано выше.

Для оценки эффективности в модели диссеминированного заболевания 10 млн клеток в среде ΗΒ88 вводили ВВ путем инъекции в хвостовую вену при полном объеме, равном 100 мкл/мышь. Сорок мышей рандомизировали и включали в исследование через 10 дней после имплантации при среднем количестве фотонов для костей конечностей (правой + левой), определенном с помощью биолюминесцентной визуализации, равном примерно 9х10⁵ фотон/с. Примерно за 10 мин до визуализации мышам с помощью ВБ инъекции вводили 150 мг/кг люциферина (Хеиодеи Согрогайои, А1атеба, СА), затем их анестезировали изофлураном. Испускание фотонов измеряли с помощью камеры на приборах с зарядовой связью в системе визуализации 1У18 (Хеиодеи Согрогабои). Вкратце, методика заключается в следующем: получали полутоновое изображение мыши, затем накладывали карту биолюминесценции, представляющую пространственное распределение фотонов, зарегистрированных вследствие разложения люциферина в раковых клетках, экспрессирующих люциферазу. Интенсивности сигналов количественно определяли с использованием модифицированной версии программного обеспечения ЮОВ Рго тегкюп 4.09А (^аνеΜеΐпск, 1ис., Ьаке Окуедо, ОР) под названием ЬМид 1таде \^гегкюп 2.50.2 (Хеиодеи). Определяли суммарное количество всех зарегистрированных фотонов от правой + левой конечностей. Биолюминесценцию раковых клеток животных исследовали путем визуализации в назначенные дни, пока у первой мыши не развивался паралич задней конечности, вызванный развитием заболевания; этот момент являлся главной конечной точкой для гуманного умерщвления мыши. Регистрировали день умерщвления каждой мыши и строили зависимость выраженного в процентах количества оставшихся мышей от времени (анализ выживания Каплана-Мейера). Значения Р рассчитывали с использованием логарифмического рангового критерия (программное обеспечение СгарИРаб Рпкт 4.0) для оценки различия между группой животных, подвергавшихся лечению, и контрольной группой (значение р <0,05 считали обеспечивающим статистическую значимость). Массы тела измеряли два раза в неделю и результаты клинических обследований регистрировали ежедневно. Значения массы тела регистрировали и хранили с использованием программного обеспечения 8!ибуИ1гес!ог (8!ибуЬод, 8ои!й 8аи Ргаишксо, СА). Анализ данных проводили так, как описано выше.

Результаты, модель ксеротрансплантата подкожной опухоли КМ8-11-1ис. Исследования эффективности для модели подкожной опухоли проводили с целью определения активности соединения 11а в диапазоне доз при введении в режиме с.|4бх3 при наибольшей дозе, равной 1 мг/мг, что составляло примерно половину наибольшей переносимой дозы для мышей линии ЗСГО-Бд. Активность соединения 11а сопоставляли с активностью 8Β-715992 (испинесиб, ингибитор КБВ фирмы Су!ок1иебск, который проходит клинические исследования) при дозе, составляющей половину наибольшей переносимой дозы, равной 7,5 мг/кг, и паклитаксела при его наибольшей переносимой дозе, равной 30 мг/кг, в режиме с.|4бх3. Результаты приведены в табл. 11. Регрессию опухоли разной степени во время введения наблюдали во всех группах; однако рост опухоли возобновлялся после завершения введения. У мышей, которым вводили меньшие дозы соединения 11а, повторный рост опухоли начинался раньше и протекал быстрее. Через 8 дней после окончания лечения опухоли повторный рост опухоли наблюдали в группах животных, которым вводили паклитаксел и 0,25 мг/кг соединения 11а. Через 13 дней после окончания лечения повторный рост опухоли наблюдали в группе животных, которым вводили 0,5 мг/кг соединения 11а. Дозы соединения 11а, равная 1 мг/кг, и 8Β-715992, равная 7,5 мг/кг, приводили к максимальной регрессии опухолей КМ8-11-1ис на 56% и 49% (р <0,05) соответственно и повторный рост опухоли не происходил в течение примерно 4 недель после окончания лечения. Дозы исследуемых средств обычно хорошо переносились и среднее максимальное уменьшение массы составляло <10% за исключением равной 1 мг/кг дозы соединения 11а, которая приводила к составляющему 12% среднему уменьшению массы тела через 10

- 30 018014 дней после начала введения. У одной мыши этой группы масса тела уменьшилась на 20% и ее исключили из исследования. У всех остальных мышей этой группы после введения последней дозы масса тела восстановилась.

Таблица 11

Эффективность соединения 11а при подкожном введении в режиме с.|4б/3 для модели ксенотрансплантата опухоли ΚΜ8-11-1ικ:

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	ДТ/ДС, день 31 (%)	Максимальная регрессия, % (день)	Δ Объем опухоли, день 3 1 3 (мм )	Максимальное Δ массу тела (день) (г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель (20% каптясол)	Ч4с1х3, вв	100	--	2150+ 191	0,31± 0,33 (день 10)	1,74± 1,37 (день 10)	9/9
Соединение Па	0. 25 мг/кг, Ч4(1хЗ, ВВ	25	24 (день 7)	527+ 152	-1,4± 1,2, (день 10)	-6,68± 1,67 (день Ю)	9/9
Соединение На	0,5 мг/кг, д4с1хЗ, ВВ	10	42 (день 10)	221 ± 71	-0,94± 0,3 (день 10)	-4,58+ 1,67 (день Ю)	9/9
Соединение Па	1 мг/кг, ц4<1хЗ, ВВ	0,1*	56(день П)	1,5± 26	-2,76± 0,65 (день 10)	-12,69± 5,0 (день ю)	8/9
5В-715992	7,5 мг/кг, ς4ϊ1χ3, ВВ		49,(день 14)	-46+ 19	-0,96± 0,31 (день 10)	-4,8± 1,93 (день 10)	9/9
Паклитаксел	30 мг/кг, <)4<1хЗ, ВБ	30	5 (день 3)	640± 190	-0,63± 0,22 (день 3)	-2,95± 1,0 (день 10)	9/9

Результаты для модели диссеминированной опухоли КΜ§-11-1ис. Лечение лекарственным средством начинали через 10 дней после имплантации клеток. При биолюминесцентной визуализации обнаруживалось усиление во времени сигнала для группы животных, которым вводили разбавитель, это свидетельствовало о локализации в областях вне скелета, включая легкие, печень и селезенку. Однако для большинства мышей преобладающий сигнал биолюминесценции, видимо, поступал от скелета, и имеется множество источников сигнала, включая длинные кости, корни зубов/нижняя челюсть, таз и позвоночный столб. Гистологический анализ бедренных костей, собранных в предыдущих исследованиях с использованием этой модели, подтвердил инфильтрацию миеломных клеток в костный мозг (Х1п, е! а1., 2006 С11п. Сапсег Кек. Аид. 15;12(16):4908-15). Прогрессирование заболевания приводило преимущественно к параличу задней конечности и в некоторых случаях к значительному уменьшению массы тела вследствие увеличения массы опухоли и в это время мышей гуманно умерщвляли. Это называли условной выживаемостью.

Результаты приведены в табл. 12. При введении доз соединения 11а, равных 0,5 и 1 мг/кг, в режиме с.|4б/3 сигнал биолюминесценции, который являлся общей мерой развития заболевания, значительно ослаблялся, однако для группы животных, которым вводили 0,25 мг/кг, воздействие статистически значимо не отличалось от воздействия разбавителя. Составляющее 47% ослабление сигнала в день 13 для мышей, которым вводили дозу, равную 1 мг/кг, сопровождалось составляющим >20% уменьшением массы тела в день 13 для одной мыши этой группы. Все остальные животные этой группы хорошо переносили такую дозу. При меньших дозах соединение 11а хорошо переносилось.

Это зависящее от дозы подавление развития заболевания, охарактеризованное с помощью биолюминесценции, приводило к аналогичной задержке паралича задней конечности и тем самым приводило к увеличению условной выживаемости мышей по сравнению с данными для когорты животных, которым вводили разбавитель во всех группах. Средняя выживаемость в группе животных, которым вводили разбавитель, составляла 19 дней, а в группах животных, которым вводили 0,25, 0,5 и 1 мг/кг соединения 11а, она составляла 29, 35 и 52 дня соответственно.

- 31 018014

Таблица 12

Эффективность соединения 11а при введении в режиме с.|4П/3 для модели диссеминированного заболевания КМ8-11-1ис

		Ответ опухоли		Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	ΔΤ/Δ С, день 13 (%)	Регрессия, день 13 (%)	Δ биолюминесценции опухоли, день 13 (фотон/с)	Среднее значение выживаемости, дни	Максимальное Δ массы тела (день) (Г)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)
Разбавитель (20% каптисол)	ς46χ3, вв	100	--	в 1,5x10 + 1,8х \|0⁷	19**	1,3± 0,19 (день 14)	5,9±1,04 (день 14)
Соединение Па	0,25 мг/кг, Ч4<1х3, ВВ	15	-	2,2х 10⁷± 6 1,1x10	29**	2,1± 1,23 (день 14)	5,0+ 2.0 (день 14)
Соединение Па	0,5 мг/кг, ς4άκ3, ВВ	0,7*	-	6 1,1x10 ± 5 5,8x10	35**	2,5± 0,23 (день 14)	6.7+ 1,1 (день 14)
Соединение Па	1 мг/кг, ц4(1хЗ, ВВ		47	-4,Зх1О⁵± 1,7х10⁵	52**	-0,74+ 0,75 (день 13)	-3,3±4,О (день В)

Пример 12. Соединения формулы II эффективны для борьбы с резистентными по отношению к лекарственному средству опухолями.

Доклинические эксперименты ш у1уо неожиданно показали, что соединения формулы II по своим характеристикам превосходят сходные по структуре соединения, которые не содержат гидроксигруппу или пролекарственную гидроксигруппу в ацильном фрагменте. Модели опухолей, которые экспрессируют выкачивающий насос, Р-гликопротеин (Р-др) плазматической мембраны, исследовали на чувствительность по отношению к соединениям формулы II и другим лекарственным средствам, включая сходные по структуре соединения, которые не содержат гидроксигруппу (или ацилоксигруппу), содержащуюся в соединениях формулы II. Р-др участвует в обычном механизме резистентности опухоли и видимо является лучше всего исследованным и самым классическим примером выкачивающего насоса, участвующего в механизме резистентности. Модель подкожного ксенотрансплантата карциномы шейки матки КВ8.5 человека на мышах выбрана для проведения фармакологического скрининга и последующего выбора и оценки этих соединений; она соответствует линии клеток КВ3.1 и отличается только наличием выкачивающего насоса. Соединения формулы II сопоставлены с другими ингибиторами КБВ, а также с паклитакселом, для которого известно, что он воздействует на Р-др. Исследование, описанное в настоящем изобретении, показало, что соединения формулы II (например, соединения Па и Пс) эффективны 1п у1уо для борьбы с опухолью, которая экспрессирует Р-др и резистентна по отношению к другим лекарственными средствам, тогда как аналогичное соединение формулы I, не содержащее гидроксигруппу, неактивно по отношению к этой опухоли.

Материалы.

Таблица 12а Характеристики животных

Вид______________Линия Поставщик__Пол Масса Возраст

Мышь (Мих пи/пи СйаНез Κ,ίνβΓ, женский 25 г 6-8 тихси1и$) Но1Нз!ег, СА недель

Эксперименты проводили с использованием аутбредных лишенных вилочковой железы мышей линии пи/пи (СПат1ек В1ует ЬаЬога!опек) в возрасте примерно 6-8 недель. Для идентификации отдельных мышей им сразу же после поступления подкожно имплантировали микрочип (АУГО, Ро1кот, ЬА) в подлопаточную область. До начала каких-либо экспериментальных исследований животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели.

Условия содержания.

Мышей по 4-5 особей помещали в прозрачные изготовленные из поликарбоната изолирующие микроклетки при освещении в циклическом режиме -12 ч освещение, 12 ч без освещения - при температуре в диапазоне 70-80°Р и относительной влажности 30-70%. Корм (гранулированный корм для грызунов Риппа) и воду давали без ограничений.

Условия проведения экспериментов.

Клетки КВ8.5 выращивали в среде ЭМЕМ с добавлением 2 мМ Ь-глутамина (МеП1а!есП Шс., са!а1од

- 32 018014 #10-013-СУ), к которой добавляли 10% фетальную бычью сыворотку (ЖН Вюкаепсек, са!а1од #120031000М). После того как клетки КВ8.5 начинали расти с высокой скоростью, для поддержания экспрессии Р-др добавляли 10 нг/мл колхицина.

Эти клетки выращивали в виде прилипающих культур, хранили при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода. Перед использованием клетки выращивали посредством менее 10 пассажей. Клетки собирали при слиянии, составляющем 95%, и центрифугировали при ~800/д в течение 5 мин при 4°С и затем повторно суспендировали в смеси состава 1:1 НВ88 (МеШа1ес11 Жс., са!а1од #21021-СУ) и Ма1пде1™ при концентрации, равной 25 млн клеток/мл линии КВ8.5, для подкожной имплантации (вводимый объем составлял 0,2 мл).

Соединения и препараты.

Соединение Па, соединение Пс, соединение Б1 (представлено ниже) и 8В-715992 готовили в виде препаратов на основе каптисола®. Дозы вводили внутривенно (ВВ) и устанавливали в соответствии массой тела каждого животного. Препараты готовили один раз в начале исследования и хранили при комнатной температуре. Паклитаксел, предназначенный для клинических исследований, приобретали в виде смеси с разбавителем на основе кремофора (Маупе Рйагта, поте Нокрта, Баке Богек!, Ж, са!а1од # ΝΩΟ6170334209) и разводили в стерильном физиологическом растворе с получением объемной дозы, составляющей 16 мл/кг для внутрибрюшинного (ВБ) введения дозы, равной 30 мг/кг.

Соединение Ь по структуре сходно с соединениями формулы II, но содержит метоксигруппу, а не гидроксигруппу или ацилоксигруппу, и его активность ίη νίίΐΌ по отношению к КБВ очень близка к активности соединений Па и Пс. Например, по данным исследования Се11Тйег-С1о® значение СЕ₀ для соединения Б1 для воздействия на клетки НСТ-15 составляло 0,3 нМ, что эквивалентно значению для соединения Па (см. пример 2). Аналогичным образом, для соединения Б1 для воздействия на клетки линий КВ3.1 и КВ8.5 это значение найдено равным 0,4 нМ, а для соединения Па для воздействия на клетки этих же линий эти значения найдены равными 0,6 и 0,5 нМ (см. пример 2). Однако соединения формулы II содержат свободную гидроксигруппу в ацильном фрагменте (или ацилоксигруппу, которая является пролекарством для свободной гидроксигруппы), тогда как соединение Б1 вместо этого содержит метоксигруппу. Метиловый эфир хорошо подходит к активному центру, о чем свидетельствует активность ίη νίίΐΌ, и, в частности, такое соединение весьма эффективно действует ίη νίΙΐΌ на линии клеток, резистентные по отношению к р-СР. Кроме того, можно полагать, что ίη νί\Ό оно будет менее восприимчиво к метаболической инактивации, чем соединения формулы II. Действительно, как следует из приведенной ниже таблицы, сопоставление фармакокинетических параметров показывает, что ίη νί\Ό соединение Б1 оказывает более значительное воздействие и обладает более высокой метаболической стабильностью, чем соединения формулы Па и Пс. Согласно изобретению неожиданно установлено, что по воздействию ίη νί\Ό на раковые опухоли, экспрессирующие Р-др, соединения формулы II эффективнее, чем соединения предшествующего уровня техники, поскольку резистентный по отношению к Р-др ксенотрансплантат рака являлся чувствительным по отношению к соединениям формулы II, но не по отношению к соединению Ба

Примечательно, что согласно изобретению также установлено, что соединения формулы II намного более эффективны, чем соединения, совсем не содержащие гидроксигруппу, например соединение формулы Ж

- 33 018014

Соединение 1Ь, для которого 1С₅₀ равно 22 нМ, намного менее активно ίη νίΙΐΌ, чем соединения формулы II, поскольку для соединений 11а и 11с 1С₅₀ равны менее 1 нМ. Соединение 1Ь не исследовали в модели ксенотрансплантата, поскольку его фармакокинетические характеристики и активность ίη νίίΐΌ слишком неблагоприятны, чтобы можно было ожидать эффективности ίη νί\Ό. На основании данных, показывающих, что оно обладает более значительным иммунным клиренсом и меньшим значением ИНК (площадь под кривой, стандартная характеристика, описывающая воздействие соединения ίη νί\Ό на исследуемый объект), было показано, что ίη νί\Ό оно обладает намного меньшей доступностью, а также намного менее активно по отношению к целевому центру, о чем свидетельствует большее значение 1С₅₀. В то же время соединения 1а, 11а и 11с оказывают лучшее фармакокинетические воздействие ίη νί\Ό, а также обладают более высокой активностью ίη νίίΐΌ и их исследовали с использованием ксенотрансплантата рака.

Соединение	Активность ίη νίίνο (1С₃₀ - нМ)	Иммунный клиренс (мл/мин/кг) 1П νινο	Период полувыведения ίη νίνο (мин)	ППК (нгмин/мл)
1а	0,6	29	117	160000
1Ь	22	94	90	52000
Па	0,8	41	110	116000
Пс	0,9	47	110	102000

Таким образом, соединения формулы II являются более эффективными ίη νίίΐΌ и более стойкими ίη νί\Ό, чем соединение и согласно изобретению неожиданно было установлено, что они эффективны по отношению к резистентным к лекарственным средствам раковым опухолям, экспрессирующим выкачивающий насос множественной лекарственной резистентности (ΜΌΚ), тогда как соединение I;·! было неэффективно по отношению к той же ΜΌΚ раковой опухоли несмотря на такую же активность по отношению к клеткам линий р-СР ίη νίΙΐΌ и большей доступности при исследованиях на животных (меньшее значение иммунного клиренса и большее значение ИИК).

Методики исследования.

Для изучения эффективности в исследование включали мышей, обладающих опухолями со средним объемом, равным примерно 300 мм³. Ксенотрансплантаты опухолей измеряли в двух направлениях (Ь (длина) и (ширина)) с помощью цифровых штангенциркулей два раза в неделю от момента начала введения в день 0. Объем опухоли рассчитывали по уравнению (Ьх^2)/2.

Массы тела измеряли два раза в неделю и результаты клинических обследований регистрировали ежедневно. Значения объемов опухолей и массы тела регистрировали и хранили с использованием программного обеспечения Б1ибуЭ|гес1ог (Б1ибуЬод, Бои!й Баи Бн-тсБсо, СА).

Анализ данных.

Выраженные в процентах значения лечение/контроль (ДТ/ДС) для объемов опухолей рассчитывали по следующей формуле:

%ДТ/ДС = 100 х ДТ/ДС в которой Т - средний объем опухоли для группы, получавшей лекарственное средство, в последний день исследования;

ΔΤ - средний объем опухоли для группы, получавшей лекарственное средство, в последний день исследования - средний объем опухоли для группы, получавшей лекарственное средство, в первый день исследования;

ΔС - средний объем опухоли для контрольной группы в последний день исследования - средний объем опухоли для контрольной группы в первый день исследования.

Все данные представляли в виде средних значений с указанием СКИ. Сопоставление конечных данных измерений опухолей между группами проводили с использованием одностороннего парного дисперсионного анализа (ΑΝΟΥΑ). Статистическую значимость определяли с помощью одностороннего

- 34 018014

АNОVА Крускала-Уоллиса для методики Ранкса, затем с помощью подходящего последующего критерия (методика Данна или критерий Тьюки) для методики множественных парных сравнений. Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения 8гдша81а1 (8ук1а1 8ой^аге 1пс., 8ап 1оке, СА).

Исследование эффективности для моделей ксенотрансплантатов, экспрессирующих Р-др.

Исследование эффективности многократного введения доз в этих моделях проводили при дозе, равной 5 мг/кг, в режиме с.|4б/3 для сопоставления активности соединения 11а и соединения 1а. Доза соединения 11с, равная 2,5 мг/кг, переносилась не очень хорошо, и поэтому сопоставление эффективности проводили при дозе, равной 1,25 мг/кг. Результаты, приведенные на фиг. 3 и в табл. 13, показывают, что в этой модели соединение 11а обладает значительно большей противоопухолевой эффективностью и для модели ксенотрансплантата КВ8.5 в день 11 выраженное в процентах значение ΔΤ/ДС равно 19% (р<0,05).

Таблица 13 Эффективность соединения Па при введении в режиме с.|4б/3 для модели ксенотрансплантата опухоли КВ8.5

	Ответ опухоли	Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	АТ/ЛС, день 11 (%)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель	ВВ,ς4άχ3	день	6(день 7)	9/9
Соединение Па	5 мг/кг, ВВ, я4<5хЗ	19*	-2 (день 11)	9/9
8В-715992	15 мг/кг, ВВ, ς4άχ3	56	4 (день 7)	9/9
Паклитаксел	30 мг/кг, ВБ,ς4άχ3	78	5(день 11)	9/9

Клетки КВ8.5 вводили самкам мышей линии пи/пи (Сйаг1ек Кгуег) путем подкожной инъекции 5/10⁶клеток в 0,2 мл смеси состава 1:1 НВ88 и Ма1пде1™ в правый бок мыши. Когда объемы опухолей достигали примерно 300 мм³, на основе объемов опухолей мышей путем рандомизации разделяли на группы для лечения (п=9). Соединения вводили с использованием указанных доз и режимов. Влияние лечения на объемы опухолей и массы тела описывали с помощью средних значений ± СКП. Результаты лечения оценивали в день 11 лечения. *р<0,05 для сопоставления с разбавителем и 8В-715992 (односторонний АNОVА Крускала-Уоллиса для методики Ранкса/Данна).

Аналогичным образом, результаты, приведенные на фиг. 4 и в табл. 14, показывают, что в этой модели соединение 11с обладает значительной противоопухолевой активностью и в день 11 выраженное в процентах значение ΔΤ/ΔС равно 39% (р <0,05).

- 35 018014

Таблица 14

Эффективность соединения Пс при введении в режиме с.|4бх3 для модели ксенотрансплантата опухоли КВ8.5

	Ответ опухоли	Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	ДТ/ДС, день 11 (%)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель	ВВ, 444x3	100	+8 (день 11)	9/9
Соединение Пс	1,25 мг/кг, ВВ, ц4<1хЗ	39*	-5 (день 11)	9/9
Соединение Пс	2,5 мг/кг, ВВ, ч44хЗ	Неприменимо	-10 (день 8)	Все до дня 8, поскольку у

мышей 4/9 уменьшение массы тела составляло 15% или более

8В-715992	15 мг/кг, ВВ, ς4άχ3	77	-1 (день 4)	9/9
Паклитаксел	30 мг/кг, ВБ, ς4άχ3	87	+3 (день 11)	9/9

Клетки КВ8.5 вводили самкам мышей линии пи/пи (СНаг1ек К1уег) путем подкожной инъекции 5х 10⁶клеток в 0,2 мл смеси состава 1:1 НВ88 и Ма1Пде1™ в правый бок мыши. Когда средние объемы опухолей достигали 339 мм³, на основе объемов опухолей мышей путем рандомизации разделяли на группы для лечения (п=9). Соединения вводили с использованием указанных доз и режимов. Влияние лечения на объемы опухолей и массы тела описывали с помощью средних значений ±СКП. Результаты лечения оценивали в день 11 лечения. *р<0,05 для сопоставления с разбавителем (односторонний ΑNОVΑ КрускалаУоллиса для методики Ранкса/Тьюки).

В отличие от этого, сходное соединение, не содержащее гидроксигруппу в ацильном фрагменте и содержащее вместо нее метоксигруппу, соединение Ет не являлось эффективным в модели ксенотрансплантата опухоли КВ8.5 опухоли, как это показано на фиг. 5 и в табл. 15.

Таблица 15

Эффективность соединения Ι;·ι при введении в режиме с.|4бх3 для модели ксенотрансплантата опухоли КВ8.5

	Ответ опухоли	Ответ хозяина
Соединение	Доза, путь, режим	дт/дс, день 11 (%)	Максимальное Δ массы тела (день) (%)	Выживаемость (количество выживших/ полное количество)
Разбавитель	ВВ, ч44хЗ	100	4(день 11)	10/10
Соединение 1а	1,25 мг/кг, ВВ, ς4άχ3	84	1 (день 11)	10/10
Соединение 1а	2,5 мг/кг, ВВ, ц4с1хЗ	61	-0,4 (день 4)	10/10
Соединение 1а	5 мг/кг, ВВ, ¢4(1 хЗ	66	-2 (день 4)	10/10
ЗВ-715992	15 мг/кг, ВВ, η44χ3	60	-3 (день 11)	10/10
Паклитаксе л	30 мг/кг, ВБ, цДйхЗ	60	-2 (день 4)	10/10

- 36 018014

Клетки КВ8.5 вводили самкам мышей линии пи/пи (СВаг1ек КЛег) путем подкожной инъекции 5/10⁶клеток в 0,2 мл смеси состава 1:1 НВ88 и Ма1пде1^т™ в правый бок мыши. Когда средние объемы опухолей достигали 285 мм³, на основе объемов опухолей мышей путем рандомизации разделяли на группы для лечения (η=10). Соединения вводили с использованием указанных доз и режимов. Влияние лечения на объемы опухолей и массы тела описывали с помощью средних значений ± СКП. Данные для всех групп статистически значимо не отличались от данных для группы животных, которым вводили разбавитель (односторонний ΑΝΟνΑ Крускала-Уоллиса для методики Ранкса).

Ни для одной из проходивших лечение мышей не обнаружены значительное уменьшение массы тела или внешние признаки токсического воздействия за исключением значительного уменьшения массы тела для группы животных, которым вводили 2,5 мг/кг соединения Нс. Увеличенная противоопухолевая активность, наблюдавшаяся для модели КВ8.5, в которой экспрессируется Р-др, свидетельствует от неожиданном превосходстве соединений формулы II над сходным соединением формулы I, у которого отсутствует гидроксигруппа, наличие которой отличает соединения формулы II.

Пример 13. Соединения формулы II эффективны для борьбы со многими эксплантатами опухолей.

Соединение На исследовали с использованием набора линий клеток и эксплантатов опухолей с помощью анализа на мягком агаре, описанного в публикации НеЫд, Н.Н., Ма1ег, Α., апб Вигдег, Α.Μ. (С1οηοдеη^с аккау \νίΐ1ι екЫЬНкНеб Витап ίитοи^ хегюдгаПк: ^ΠΌΕ-Κίοΐ'! ο£ Λ νίίτο ίο ш νίνο ас+лу ак а Ьак18 £ογ апНсапсег бгих άίί^ονΌΓν, Еиг. ί. Сапсег 40, 802-820 (2004)). В табл. 16 указаны тип рака, название образца, полученное с помощью анализа значение СЕ₀ (концентрация, необходимая для 50% подавления роста), логарифм СЕ₀ (1ο§(Ο!₅₀) и относительная чувствительность для каждого образца (разность). Разность рассчитывают путем вычитания значения ЬдССЦо) для каждой линии клеток из среднего значения ЛдССЦо) для всей группы клеток (в этом случае оно равно 0,236); положительное значение указывает, что образец является более чувствительным, чем в среднем, а отрицательное значение указывает, что образец является менее чувствительным, чем в среднем.

Для большинства заболеваний имеются образцы, которые являются чувствительными. По данным этого исследования наиболее чувствительными раковыми заболеваниями являются раковые заболевания крови (лейкоз и лимфома, 5/5), мелкоклеточный рак легкого (МККЛ; 5/5), рак молочной железы (7/10), рак мочевого пузыря (4/6) и саркомы (4/7).

Таблица 16

Активность соединения На по отношению к разным линиями раковых клеток

Тип рака	Образец опухоли	О1₅₀ (нМ)	1о₈(О1₅₀)	Разность
Лейкоз (ОЛЛ)	ССКРСЕМ	0,287	-0,542	0,779
Лейкоз (ОЛЛ)	ГОККАТ	0,106	-0,975	1,211
Лейкоз (ХМЛ)	К562	0,27	-0,569	0,805
Лейкоз (ОЛЛ)	МОЬТ4	0,877	-0,057	0,293
Лимфома (НХЛ)	13937	0,086	-1,066	1,302

- 37 018014

НМКРЛ	1012	0,926	-0,033	0,270
НМКРЛ	289	4,899	0,690	-0,454
НМКРЛ	526	1,265	0,102	0,134
НМКРЛ	629	10	1,000	-0,764
НМКРЛ	677	1,162	0,065	0,171
НМКРЛ	737	3,068	0,487	-0,250
НМКРЛ	1422	0,728	-0,138	0,374
НМКРЛ	211	0,216	-0,666	0,902
НМКРЛ	1176	3	0,477	-0,241
НМКРЛ	1647	16,752	1,224	-0,988
МКРЛ	538	0,339	-0,470	0,706
МКРЛ	573	0,587	-0,231	0,468
МКРЛ	615	0,082	-1,086	1,323
МКРЛ	650	0,376	-0,425	0,661
МКРЛ	Н69	0,269	-0,570	0,807
Ко лоректальн ый	1034	0,214	-0,670	0,906
Ко лоре ктальн ый	1044	0,612	-0,213	0,450
Ко лоре ктальн ый	1103	1	0,000	0,236
Колоректальный	1299	10	1,000	-0,764
Колоректальный	1297	10	1,000	-0,764
Колоректальный	158	10	1,000	-0,764
Колоректальный	1729	10	1,000	-0,764
Колоректальный	1753	11,279	1,052	-0,816
Колоректальный	1788	2,246	0,351	-0,115
Колоректальный	1783	0,721	-0,142	0,378
Колоректальный	1784	5,969	0,776	-0,539
Колоректальный	233	0,238	-0,623	0,860
Колоректальный	243	10	1,000	-0,764
Колоректальный	260	10	1,000	-0,764
Ко лоректальн ый	268	6,24	0,795	-0,559
Колоректальный	280	10	1,000	-0,764
Колоректальный	504	0,273	-0,564	0,800
Колоректальный	533	1,753	0,244	-0,007
Колоректальный	609	10	1,000	-0,764
Колоректальный	647	10	1,000	-0,764
Колоректальный	676	10	1,000	-0,764
Колоректальный	742	1,873	0,273	-0,036
Колоректальный	94ЬХ	19,52	1,290	-1,054
Колоректальный	975	10	1,000	-0,764
Меланома	1341	10	1,000	-0,764
Меланома	462	10	1,000	-0,764
Меланома	989	12,722	1,105	-0,868
Яичниковый	1353	10	1,000	-0,764
Яичниковый	899	10,000	1,000	-0,764
Предстательной железы	22ΚΎ1	0,537	-0,270	0,506
Предстательной железы	011145	1	0,000	0,236
Предстательной железы	МК1Н1579	10	1,000	-0,764

- 38 018014

Предстательной железы	РСЗМ	0,424	-0,373 I	0,609
Молочной железы	1162	0,286	-0,544	0,780
Молочной железы	1322	1,402	0,147	0,090
Молочной железы	1384	2,666	0,426	-0,189
Молочной железы	1398	0,239	-0,622	0,858
Молочной железы	401	0,563	-0,249	0,486
Молочной железы	449	0,534	-0,272	0,509
Молочной железы	574	10	1,000	-0,764
Молочной железы	583	0,239	-0,622	0,858
Молочной железы	713	0,244	-0,613	0,849
Молочной железы	857	2,456	0,390	-0,154
Мочевого пузыря	1036	0,115	-0,939	1,176
Мочевого пузыря	1218	0,509	-0,293	0,530
Мочевого пузыря	1228	0,315	-0,502	0,738
Мочевого пузыря	1258	17,076	1,232	-0,996
Мочевого пузыря	1352	0,972	-0,012	0,249
Мочевого пузыря	439	10	1,000	-0,764
Желудка	1172	10	1,000	-0,764
Желудка	209	10	1,000	-0,764
Желудка	214	9	0,954	-0,718
Саркома	117	0,249	-0,604	0,840
Саркома	1186	0,327	-0,485	0,722
Саркома	1301	0,235	-0,629	0,865
Саркома	1410	2,246	0,351	-0,115
Саркома	417	0,16	-0,796	1,032
Саркома	463	19,122	1,282	-1,045
Саркома	627	10	1,000	-0,764
Поджелудочной железы	1657	26,952	1,431	-1,194
Поджелудочной железы	1861	0,623	-0,206	0,442
Поджелудочной железы	1869	10,865	1,036	-0,800
Поджелудочной железы	1876	0,337	-0,472	0,709
Поджелудочной железы	1872	0,282	-0,550	0,786
Поджелудочной железы	1881	2,316	0,365	-0,128
Поджелудочной железы	1887	10	1,000	-0,764
Поджелудочной железы	1900	16,933	1,229	-0,992
Поджелудочной железы	1912	0,112	-0,951	1,187
Поджелудочной железы	1937	0,185	-0,733	0,969
Поджелудочной железы	546	2,591	0,413	-0,177
Поджелудочной железы	736	1,265	0,102	0,134
	Среднее значение	1,724	0,236

Пример 14. Соединения формулы II эффективны по отношению к линиям клеток многих солидных опухолей.

Соединение Па исследовали с использованием набора линий клеток, полученных из солидных опухолей, как это описано в публикации МсОст-юИ и., 8йагта, 8.ν., Οο\\ό11, Б., Сгешпдег, Р., Мοηίадиΐ, С, БатЬ, 1., АгсЫЬа1б, Н., Каиба1е8, К., Тат, А., Бее, Ό., КοίйеηЬе^д, 8.М., Бир^, 1.С., 8ο^11;·ι, К., БП/ик, Б.Е., Ыга^е, А.Б, Майектеагап, 8., Νί;·ιιι\ν, Ο.Ν., Ткю, Н., Огете, Б., Напке, БН., Ма, Х.Б, Ег1апбег, М.С., Сгау, Ν.8., НаЬег, Б.А., апб 8е111стап, 1. (2007), ^ΓΐοΓΚί·!!^ οί деηοίуре-сο^^е1аΐеб кепкйкйу ΐο 5е1ес1гое ките ίπΙιίΝίοΐΈ Ьу ияпд Ыдйййгоидйри! ΐитο^ се11 Йпе ргоПКпд. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 104, 1993619941 (2007)). Клетки обрабатывали соединением в течение 72 ч и регистрировали долю выживших клеток по сравнению с контролем, который не обрабатывался. В табл. 17 приведены название линии клеток, орган, из которого они взяты, доля выживших клеток при трех использованных для исследования концентрациях (0,2, 2,0 и 20 нМ) и показатель чувствительности. Показатель чувствительности равнялся от 5 (наибольшая чувствительность) до 1 (наименьшая чувствительность) и определялся следующим образом: 5 = доля выживших < 0,2 при 0,2 нМ; 4 = 0,2 < доля выживших < 0,5 при 0,2 нМ; 3 = доля выживших > 0,5 при 0,2 нМ и < 0,5 при 2,0 нМ; 2 = доля выживших > 0,5 при 2,0 нМ и < 0,5 при 20 нМ; 1 = 8 доля выживших > 0,5 при 20 нМ.

Для всех заболеваний имеются образцы, которые являются чувствительными. Одним из многих возможных путей ранжирования этих раковых заболеваний по чувствительности является расчет среднего показателя чувствительности для каждого заболевания (отношение суммы показателей чувствительности к количеству образцов). Если применять более строгие критерии с использованием среднего показателя, равного 3 или более, то по данным этого исследования наиболее чувствительными являются раковые заболевания следующих органов: яичника (3,38), желудка (3,32), головного мозга (3,21), кожи (3,02), шейки матки (3,00) и щитовидной железы (3,00).

- 39 018014

Таблица 17

Активность соединения Па по отношению к разным линиями клеток солидных опухолей

Линия клеток	Орган	0,2 нМ	2,0 нМ	20 нМ	Показатель чувствительности
ЗСаВЕК	Мочевой пузырь	0,6666	0,0383	0,0238	3
ΙΑ6	Мочевой пузырь	0,9359	0,0473	0,0309	3
КТ 112/84	Мочевой пузырь	1,0884	0,0457	0,0312	3
5637	Мочевой пузырь	1,1044	0,0595	0,0423	3
ЕЛ38	Мочевой пузырь	1,1072	0,0888	0,0712	3
КТ-112	Мочевой пузырь	0,925	0,099	0,0915	3
780	Мочевой пузырь	0,7289	0,091	0,0981	3
КТ4	Мочевой пузырь	0,5091	0,1175	0,1008	3
Т24	Мочевой пузырь	0,723	0,131	0,102	3
647-ν	Мочевой пузырь	0,721	0,185	0,141	3
ум-сив1	Мочевой пузырь	0,8161	0,1594	0,1497	3
8Ψ-1710	Мочевой пузырь	0,7185	0,1353	0,1546	3
κυ-19-19	Мочевой пузырь	0,9247	0,1929	0,1985	3
им-ис-з	Мочевой пузырь	0,9804	0,2219	0,2074	3
ВЕТС-905	Мочевой пузырь	1,089	0,264	0,223	3
НТ 1376	Мочевой пузырь	1,1586	0,2837	0,233	3
САЬ-29	Мочевой пузырь	0,967	0,282	0,256	3
182	Мочевой пузырь	0,7211	0,3475	0,2914	3
639-У	Мочевой пузырь	0,961	0,37	0,31	3
ТСС813Р	Мочевой пузырь	1,0148	0,5876	0,4752	2
НТ-1197	Мочевой пузырь	1,0133	0,9855	0,8308	1
С5К1	Кость	0,2156	0,0818	0,0769	4
С81	Кость	0,4253	0,1844	0,1903	4
Из 888.Т	Кость	0,4945	0,4138	0,3803	4
МНН-Е8-1	Кость	0,687	0,032	0,017	3
8К-Е8-1	Кость	0,9862	0,0606	0,0516	3
КНО8-2408	Кость	0,925	0,071	0,065	3
8ао5-2	Кость	0,6146	0,118	0,1008	3
НО8	Кость	1,033	0,078	0,118	3
КО-Е8	Кость	0,6036	0,2671	0,1397	3
КНО8-312Н	Кость	1,103	0,284	0,231	3
и-2 08	Кость	1,0283	0,241	0,2322	3
ΝΥ	Кость	1,293	0,341	0,3	3
САЬ-72	Кость	0,9276	0,3256	0,3065	3
ΗιιΟ-3Ν1	Кость	0,9177	0,3533	0,3165	3
МО-63	Кость	0,815	0,57	0,502	1
Н-ЕМС-55	Кость	0,8996	0,604	0,5042	1
МС-1ХС	Головной мозг	0,079	0,047	0,033	5
8Κ-Ν-8Η	Головной мозг	0,1798	0,0495	0,0574	5
ΝΒ69	Головной мозг	0,0922	0,0639	0,0662	5
Нз 683	Головной мозг	0,4152	0,0858	0,0278	4
8Κ-Ν-Α8	Головной мозг	0,357	0,0895	0,0819	4
М0591	Головной мозг	0,4307	0,1343	0,0874	4
8Η-8Υ5Υ	Головной мозг	0,4428	0,1183	0,0946	4
Раоу	Головной мозг	0,4727	0,0556	0,1088	4
МОО-С-ССМ	Головной мозг	0,2092	0,1363	0,1564	4
ΥΚΟ-1	Головной мозг	0,3102	0,1764	0,1624	4
ССЕ-8ТТС1	Головной мозг	0,3804	0,3579	0,2861	4
СО8-3	Головной мозг	0,4488	0,3264	0,2977	4

- 40 018014

δΚ-Ν-МС	Головной мозг	0,5584	-0,0017	0,0048	3
и-251 МС	Головной мозг	0,8575	0,0313	0,0321	3
ВЕ(2)-С	Головной мозг	0,757	0,0224	0,033	3
ίΝΖΤΑ3ΨΤ4	Головной мозг	0,5274	0,0814	0,052	3
ΕΝΖΤΑ3ΨΤ11	Головной мозг	0,6268	0,0841	0,0567	3
Т98С	Головной мозг	0,6311	0,0972	0,0718	3
ЫЧ-229	Головной мозг	0,7177	0,1241	0,0965	3
мос-с-υνψ	Головной мозг	0,7682	0,1238	0,1114	3
Н4	Головной мозг	0,5851	0,1689	0,12	3
РР8К.-1	Головной мозг	0,5585	0,1428	0,1766	3
8Ψ 1783	Головной мозг	0,7547	0,2518	0,1872	3
8Р-295	Головной мозг	0,5622	0,2393	0,191	3
ϋΚ-ΜΟ	Головной мозг	0,5941	0,228	0,1916	3
А172	Головной мозг	0,6374	0,22	0,1923	3
САМО	Головной мозг	1,2891	0,2385	0,1923	3
1321Ν1	Головной мозг	0,7485	0,2015	0,1977	3
СНР-212	Головной мозг	0,946	0,267	0,216	3
ич-18	Головной мозг	0,9918	0,238	0,2181	3
и-118 мс	Головной мозг	0,9433	0,2612	0,2391	3
из73 мс	Головной мозг	0,5474	0,307	0,2442	3
8\ν 1088	Головной мозг	0,7941	0,242	0,2644	3
ОВТК.С-05МС	Головной мозг	0,8442	0,387	0,2789	3
КО-1-С	Головной мозг	0,9548	0,3391	0,3367	3
8ССН-26	Головной мозг	0,8806	0,351	0,3398	3
42-М6-ВА	Головной мозг	0,9486	0,4389	0,3783	3
8ΝΒ-19	Головной мозг	1,0241	0,4679	0,4543	3
ΙΡΤΡ/98	Головной мозг	0,8158	0,3799	0,4603	3
СМ8-10	Головной мозг	0,9262	0,6735	0,5424	1
и-138 МС	Головной мозг	0,8028	0,4448	0,5689	1
ЫЧ-405	Головной мозг	1,046	0,6715	0,7525	1
Αϋ565	Молочная железа	0,1024	0,0539	0,0297	5
НСС1954	Молочная железа	0,2453	0,0742	0,0831	4
Нз 578Т	Молочная железа	0,287	0,075	0,085	4
САЬ-85-1	Молочная железа	0,2062	0,1707	0,1396	4
ЕРМ-192В	Молочная железа	0,3565	0,2746	0,1884	4
ЕРМ-19	Молочная железа	0,4888	0,2428	0,2227	4
НСС1143	Молочная железа	0,3856	0,2969	0,2799	4
МОА-МВ-415	Молочная железа	0,4378	0,2779	0,2826	4
МВ 157	Молочная железа	0,919	0,03	0,013	3
ΜϋΑ-ΜΒ-468	Молочная железа	0,826	0,131	0,104	3
МСР7	Молочная железа	0,7312	0,1175	0,106	3
ΜϋΑ-ΜΒ-453	Молочная железа	0,9677	0,1497	0,128	3
НСС1806	Молочная железа	0,63	0,157	0,135	3
НСС38	Молочная железа	0,799	0,198	0,135	3
САЬ-148	Молочная железа	0,8879	0,1778	0,1446	3
МЭА-МВ-436	Молочная железа	0,9257	0,235	0,1588	3
ЕУ8А-Т	Молочная железа	0,8101	0,1921	0,1617	3
ЛМТ-1	Молочная железа	1,0342	0,2107	0,2045	3
САЬ-120	Молочная железа	0,7606	0,3094	0,2346	3
САЬ-51	Молочная железа	1,0399	0,252	0,2391	3
НСС1569	Молочная железа	0,8118	0,3757	0,2706	3
ΜϋΑ-ΜΒ- 4358	Молочная железа	0,736	0,4 '	0,369	3
КРЬ-1	Молочная железа	0,8294	0,4721	0,3691	3
НСС70	Молочная железа	1,029	0,4525	0,3868	3
ΜϋΑ-ΜΒ-361	Молочная железа	0,51	0,4185	0,4945	3
ЕРМ-192С	Молочная железа	1,1771	0,5303	0,2644	2
ΜϋΑ-ΜΒ-175- VII	Молочная железа	0,9252	0,6705	0,4413	2
иАСС-893	Молочная железа	0,578	0,635	0,474	2
ВТ-474	Молочная железа	1,7649	0,4043	0,4842	2
ВТ-549	Молочная железа	0,7005	0,6093	0,5628	1
Τ47ϋ	Молочная железа	1,1392	0,657	0,6325	1
ΖΚ-75-30	Молочная железа	0,979	0,7094	0,6879	1
МТ-3	Молочная железа	0,8962	0,6827	0,704	1
ВТ-483	Молочная железа	0,8449	1,114	0,8657	1
С-4 I	Шейка	0,3791	0,0476	0,0328	4
САЬ-39	Шейка	0,3382	0,1481	0,1479	4
С-33 А	Шейка	0,916	0,0127	-0,006	3
8180	Шейка	0,7157	0,0163	-0,002	3
НеЬа	Шейка	0,7398	0,048	0,0072	3
М8751	Шейка	0,6941	0,0256	0,0552	3
ВТ-В	Шейка	0,788	0,0821	0,0657	3
МЕ-180	Шейка	0,9997	0,1521	0,1564	3
Са 8к1	Шейка	0,7077	0,2047	0,1791	3
ЗКС-ШЬ	Шейка	0,718	0,2701	0,2185	3
ЭоТс2 4510	Шейка	0,9503	0,2981	0,2597	3
8\¥756	Шейка	0,9509	0,371	0,3384	3
81На	Шейка	0,5524	0,3919	0,3415	3
С-4 II	Шейка	0,8416	0,4293	0,4254	3
НТ-3	Шейка	0,8834	0,6888	0,6523	1
ΚΥ8Ε-50	Пищевод	0,183	0,055	0,063	5
ΚΥ8Ε-410	Пищевод	0,244	0,211	0,214	4
Т.Тп	Пищевод	0,4246	0,3322	0,2448	4
Т.Т	Пищевод	0,8253	0,0649	0,0197	3
ΚΥ8Ε-180	Пищевод	0,617	0,085	0,079	3
ТЕ7	Пищевод	0,718	0,113	0,113	3
ΚΥ8Ε-510	Пищевод	0,671	0,223	0,129	3
ΚΥ8Ε-70	Пищевод	0,824	0,201	0,158	3
ΚΥ8Ε-150	Пищевод	1,166	0,213	0,163	3

- 41 018014

ОЕ21	Пищевод	0,7539	0,2571	0,2117	3
Κ.Υ8Ε-520	Пищевод	1,111	0,386	0,356	3
ΚΥ8Ε-30	Пищевод	0,7729	0,5353	0,4066	2
ΚΥ8Ε-270	Пищевод	1,057	0,582	0,453	2
ΚΥ8Ε-140	Пищевод	1,114	0,512	0,461	2
НСЕ7	Пищевод	0,865	0,488	0,512	1
εοίο-όδΟΝ	Пищевод	0,882	0,535	0,515	1
ОЕЗЗ	Пищевод	1,006	0,5977	0,5259	1
ΚΥ8Ε-220	Пищевод	0,833	0,626	0,661	1
ΟΕ19	Пищевод	0,9684	0,8451	0,6916	1
Ж 029	Голова и шея	0,0671	0,0015	0,0021	5
РС1-38	Голова и шея	0,2035	0,0781	0,0682	4
САЬ 27	Голова и шея	0,449	0,1068	0,069	4
САЬ-33	Голова и шея	0,5807	0,0516	0,0204	3
Н8С-2	Голова и шея	0,7659	0,0902	0,0707	3
РС1-15В	Голова и шея	0,8113	0,0605	0,0753	3
ΗΟ-1-Ν-1	Голова и шея	0,9323	0,095	0,096	3
РС1-6А	Голова и шея	1,1429	0,1568	0,1195	3
Н3118	Голова и шея	0,8217	0,108	0,131	3
АСС2	Голова и шея	1,1233	0,1636	0,1357	3
АСС8	Голова и шея	0,7258	0,2017	0,1658	3
АССЗ	Голова и шея	0,887	0,186	0,168	3
В1СК. 78	Голова и шея	1,0035	0,1602	0,1694	3
ЗЯ 028	Голова и шея	1,0931	0,2299	0,2027	3
РС1-15	Голова и шея	1,0668	0,1987	0,2061	3
8СС-9	Голова и шея	0,5841	0,2727	0,272	3
8АТ	Голова и шея	0,854	0,302	0,307	3
8СС90	Голова и шея	0,5915	0,3331	0,3358	3
ΗΝ	Голова и шея	0,9124	0,3981	0,3481	3
РС1-15А	Голова и шея	0,8516	0,3844	0,3675	3
Ж 013	Голова и шея	1,0158	0,3829	0,3766	3
РС1-4В	Голова и шея	1,2078	0,4475	0,3808	3
РС1-30	Голова и шея	0,8216	0,362	0,4064	3
иЭ8СС2	Голова и шея	0,5716	0,4203	0,4394	3
ЛК 019	Голова и шея	1,0805	0,4801	0,484	3
Κ.ΡΜΙ 2650	Голова и шея	1,1239	0,5619	0,4435	2
Ж 028ЕР	Голова и шея	0,995	0,5386	0,4657	2
ΒΗΥ	Голова и шея	1,0468	0,5311	0,4897	2
РС1-4А	Голова и шея	1,0214	0,6602	0,4984	2
Н8С-3	Голова и шея	1,069	0,3074	0,5475	1
АСС 8-2	Голова и шея	1,1417	0,7519	0,5967	1
ЗЯ 022	Голова и шея	1,0441	0,7332	0,6409	1
РС1-6В	Голова и шея	1,1076	0,7016	0,6703	1
АСС112	Голова и шея	0,9498	0,7645	0,916	1
ΟΡ5ά	Кишечник	0,185	0,116	0,0711	5
8Ψ 48	Кишечник	0,471	0,028	0,053	4
Т84	Кишечник	0,462	0,068	0,058	4
ЬоУо	Кишечник	0,2792	0,0659	0,0611	4
СОЬО 205	Кишечник	0,8137	0,0578	0,0376	3
Нз 257.Т	Кишечник	0,8128	0,0699	0,0465	3
ΜΏ8Τ8	Кишечник	0,7601	0,094	0,0774	3
СЬ-11	Кишечник	0,9903	0,1858	0,1559	3
8ΑΥ-948	Кишечник	1,0249	0,2096	0,1757	3
СоСМ-1	Кишечник	1,062	0,227	0,191	3
Ь8174Т	Кишечник	0,8916	0,2634	0,2176	3
СОЬО 201	Кишечник	1,029	0,204	0,24	3
8У/620	Кишечник	0,7593	0,2603	0,288	3
ΨϊϋΓ	Кишечник	0,8917	0,3977	0,3243	3
Ь8180	Кишечник	0,9989	0,4556	0,3266	3
8Ψ837	Кишечник	1,0342	0,4365	0,3773	3
8К-СО-1	Кишечник	0,93	0,464	0,405	3
СЬ-14	Кишечник	0,8508	0,6531	0,4248	2
НЯТ-18	Кишечник	0,744	0,523	0,425	2
Сасо-2	Кишечник	0,769	0,538	0,496	2
СОЬО-206Е	Кишечник	1,075	0,651	0,543	1
8АУ 1417	Кишечник	1,016	0,769	0,607	1
СЬ-34	Кишечник	1,1299	0,4878	0,6107	1
ЯСМ-1	Кишечник	1,0188	0,8159	0,6594	1
СОЬО-678	Кишечник	1,06	0,802	0,661	1
ОиМ8-23	Кишечник	0,7971	0,9316	0,7076	1
8\У 1116	Кишечник	1,0852	1,0031	0,7353	1
8Ψ 1463	Кишечник	1,164	0,925	0,862	1
С-402	Почка	0,4146	0,1885	0,1583	4
8Ψ 156	Почка	0,4381	0,3386	0,2802	4
САЬ-54	Почка	0,4808	0,3592	0,326	4
8 XV 13	Почка	0,697	0,014	0,023	3
С-401	Почка	0,857	0,081	0,073	3
ΝΗ-6	Почка	0,9578	0,1525	0,1175	3
КМЯМ-М1	Почка	1,072	0,139	0,126	3
8Ы-12С	Почка	0,9117	0,1661	0,1382	3
СакМ	Почка	0,6522	0,1373	0,1431	3
786-0	Почка	1,066	0,205	0,17	3
УМЯС-ЯС\У	Почка	1,081	0,156	0,171	3
ио-31	Почка	0,8695	0,3772	0,3758	3
769-Р	Почка	0,977	0,478	0,431	3
КМЯС-20	Почка	0,84	0,466	0,459	3
ВРТС-909	Почка	1,076	0,4325	0,4869	3
КМЯС-1	Почка	0,8824	0,6127	0,5558	1
умяс-ясг	Почка	0,9492	0,6125	0,5913	1
Α0ΗΝ	Почка	1,005	0,623	0,6277	1

- 42 018014

1НН-4	Печень	0,4019	0,0719	0,0775	4
осио-ι	Печень	0,4247	0,115	0,0881	4
$N11-182	Печень	0,3211	0,3009	0,2618	4
8Νυ-398	Печень	0,7925	0,0572	0,048	3
ΙΗΗ-7	Печень	0,526	0,0621	0,049	3
8Νυ-475	Печень	0,9855	0,1516	0,1274	3
Л4Н-6	Печень	0,6033	0,1987	0,1906	3
НиССТ1	Печень	0,731	0,2303	0,1941	3
ЕСЫ	Печень	0,8992	0,2121	0,2415	3
киН-1	Печень	0,637	0,3355	0,2569	3
8К-НЕР-1	Печень	0,7567	0,2521	0,2684	3
РЬС/РВГ/5	Печень	0,7758	0,2551	0,3086	3
Нер С2	Печень	0,8333	0,2949	0,311	3
8Ν11-423	Печень	0,9714	0,304	0,3364	3
δΝϋ-387	Печень	0,6457	0,4265	0,3953	3
ДНН-1	Печень	0,6947	0,4443	0,4458	3
δΝϋ-449	Печень	1,0774	0,486	0,4864	3
СЗА	Печень	0,9439	0,4686	0,5087	1
1НН-2	Печень	1,0593	0,7702	0,7744	1
А549	Легкое	0,4707	0,0974	0,129	4
Н290	Легкое	0,4248	0,4081	0,3961	4
Н2691	Легкое	0,468	0,4411	0,4795	4
КЕКГ-ЬС-МА	Легкое	0,639	0,0854	0,0623	3
ЫС1-Н841	Легкое	0,8459	0,1149	0,1057	3
8ВС-3	Легкое	0,9716	0,2057	0,155	3
Н2369	Легкое	1,0518	0,172	0,1562	3
СкаСо-К-1	Легкое	1,0137	0,1936	0,1726	3
Н2804	Легкое	0,8272	0,2981	0,195	3
ΝΟΙ-Η2286	Легкое	0,8997	0,2979	0,2466	3
имс-и	Легкое	0,6174	0,2438	0,276	3
Н2373	Легкое	0,8795	0,3019	0,2853	3
Н2461	Легкое	0,8732	0,3484	0,2912	3
Н2795	Легкое	1,0282	0,3473	0,3436	3
ΝΟ1-Η196	Легкое	0,8976	0,3922	0,389	3
Н2722	Легкое	0,8473	0,4877	0,4089	3
Н28	Легкое	0,9309	0,4937	0,4124	3
Н2803	Легкое	0,6578	0,4814	0,4939	3
Н2731	Легкое	0,9841	0,5147	0,4912	2
Н2591	Легкое	1,0024	0,5897	0,5288	1
8\ν 1271	Легкое	1,054	0,681	0,585	1
Н2052	Легкое	0,9018	0,7748	0,6495	1
Н513	Легкое	0,8696	0,747	0,7763	1
ΝΟΙ-Η2195	Легкое	1,0695	0,7473	0,7937	1
УМКС-ЬСО	Легкое: НМКРЛ	0,1083	0,0165	0,0206	5
ΝΟΙ-Η1703	Легкое: НМКРЛ	0,0217	0,0234	0,0387	5
ЭУ-90	Легкое: НМКРЛ	0,1662	0,0939	0,0801	5
ΝΌΙ-Η52Ο	Легкое: НМКРЛ	0,1553	0,0853	0,0943	5
НСС-44	Легкое: НМКРЛ	0,4828	0,0622	0,0573	4
ьои-ын91	Легкое: НМКРЛ	0,2854	0,0649	0,0667	4
ΝΟΙ-Η1792	Легкое: НМКРЛ	0,4287	0,1012	0,085	4
Ш99А	Легкое: НМКРЛ	0,3858	0,1388	0,1203	4
Ьи99В	Легкое: НМКРЛ	0,3259	0,1927	0,1616	4
ьсьс-юзн	Легкое: НМКРЛ	0,4592	0,1711	0,163	4
ΝΟΙ-Η2009	Легкое: НМКРЛ	0,2163	0,1481	0,1764	4
ЫС1-Н2170	Легкое: НМКРЛ	0,477	0,2033	0,1894	4
САБ-12Т	Легкое: НМКРЛ	0,4345	0,2399	0,2003	4
8К-МЕ8-1	Легкое: НМКРЛ	0,2868	0,2316	0,2173	4
ΝΟΙ-Η2122	Легкое: НМКРЛ	0,8339	0,0731	0,0601	3
ΝΟΙ-Η460	Легкое: НМКРЛ	0,9368	0,0626	0,0624	3
ΝΟΙ-Η1437	Легкое: НМКРЛ	1,0697	0,11	0,0878	3
АВС-1	Легкое: НМКРЛ	0,7461	0,1129	0,0899	3
1ЧС1-Н1299	Легкое: НМКРЛ	0,902	0,105	0,094	3
НСС-366	Легкое: НМКРЛ	1,1043	0,0917	0,1002	3
ΙΛΙ65Β	Легкое: НМКРЛ	0,9138	0,1102	0,1013	3
УМКС-ЬСР	Легкое: НМКРЛ	0,6195	0,1294	0,1061	3
ΝΟΙ-Η3122	Легкое: НМКРЛ	0,664	0,1227	0,113	3
Ы165А	Легкое: НМКРЛ	0,5925	0,1313	0,1233	3
201Т	Легкое: НМКРЛ	1,1069	0,1758	0,1239	3
ЕВС-1	Легкое: НМКРЛ	0,806	0,155	0,128	3
ΝΟΙ-Η1666	Легкое: НМКРЛ	1	0,112	0,135	3
КЕК.Р-ЬС-М8	Легкое: НМКРЛ	0,6674	0,141	0,1425	3
273Т	Легкое: НМКРЛ	0,8467	0,1865	0,159	3
Ν01-Η2110	Легкое: НМКРЛ	0,929	0,244	0,194	3
ЫС1-Н2085	Легкое: НМКРЛ	1,0485	0,2496	0,2008	3
ΝΟΙ-Η358	Легкое: НМКРЛ	1,1308	0,2687	0,2249	3
Ьи99С	Легкое: НМКРЛ	0,5091	0,1845	0,2281	3
ЕРБС-272Н	Легкое: НМКРЛ	0,7924	0,2789	0,24	3
ΝΟΙ-Η2087	Легкое: НМКРЛ	0,7317	0,2612	0,2452	3
ΝΟΙ-Η1915	Легкое: НМКРЛ	1,1651	0,2784	0,25	3
СОК-Ь23	Легкое: НМКРЛ	1,0115	0,2364	0,2645	3
ΝΟΙ-Η1944	Легкое: НМКРЛ	0,7625	0,2508	0,2692	3
ьиб5	Легкое: НМКРЛ	1,0552	0,3022	0,2768	3
8Ψ 1573	Легкое: НМКРЛ	0,6665	0,3095	0,2782	3
8К-МЕ8	Легкое: НМКРЛ	0,7978	0,3101	0,3203	3
ΝΟΙ-Η2172	Легкое: НМКРЛ	0,9469	0,4313	0,3324	3
ЫС1-Н322	Легкое: НМКРЛ	0,5775	0,4467	0,3978	3
ΝΟΙ-Η1623	Легкое: НМКРЛ	0,8983	0,436	0,4131	3
ΝΟΙ-Η2030	Легкое; НМКРЛ	0,9091	0,4382	0,4146	3
ΝΟΙ-Η1869	Легкое: НМКРЛ	0,53	0,4401	0,4219	3
ΝΟΙ-Η1793	Легкое: НМКРЛ	0,8914	0,4837	0,426	3

- 43 018014

ЫС1-Н2228	Легкое: НМКРЛ	1,111	0,419	0,431	3
ΝΟΙ-Η1573	Легкое: НМКРЛ	0,5795	0,4795	0,4416	3
НСС-15	Легкое: НМКРЛ	1,081	0,4963	0,4502	3
КЕКг-ьс-лаг	Легкое: НМКРЛ	0,5334	0,4658	0,4902	3
1ЧС1-Н838	Легкое: НМКРЛ	1,043	0,5099	0,3182	2
ЫС1-Н650	Легкое: НМКРЛ	1,0045	0,5034	0,502	1
ΝΟΙ-Η2405	Легкое: НМКРЛ	0,8472	0,497	0,5105	1
ΝΟ1-Η2444	Легкое: НМКРЛ	0,9104	0,601	0,5357	1
РС-3 ЦРС-31	Легкое: НМКРЛ	0,7824	0,5818	0,5439	1
ЫС1-Н1693	Легкое: НМКРЛ	0,6644	0,6313	0,5467	1
СОК-Ь 105	Легкое: НМКРЛ	0,7921	0,5136	0,5478	1
8Κ-ΙΛ1-1	Легкое: НМКРЛ	0,8993	0,5272	0,582	1
НСС-78	Легкое: НМКРЛ	0,865	0,666	0,595	1
Н3255	Легкое: НМКРЛ	0,894	0,686	0,598	1
ЫС1-Н1781	Легкое: НМКРЛ	0,8353	0,6108	0,6045	1
НСС-827	Легкое: НМКРЛ	0,8265	0,6909	0,6187	1
НОР92	Легкое; НМКРЛ	0,9934	0,695	0,6344	1
Са1и-1	Легкое: НМКРЛ	0,8105	0,6374	0,6643	1
МС1-Н2342	Легкое: НМКРЛ	0,8589	0,778	0,7798	1
ΝΟΙ-Η2347	Легкое: НМКРЛ	0,9848	0,8783	0,845	1
ЬС-1 54	Легкое: НМКРЛ	1,9116	0,996	1,2191	1
1АК.	Разные	0,0398	0,0104	0,0015	5
НТ 1080	Разные	0,0583	0,0135	0,0141	5
ТА8К1	Разные	0,8609	0,0456	0,0344	3
ОСТ	Разные	0,6099	0,097	0,0732	3
5Т8 0421	Мышца	0,3838	0,1484	0,11	4
А673	Мышца	0,5523	0,0896	0,0731	3
Ον-1063	Яичник	0,1051	-0,0465	-0,0045	5
Τθν-112ϋ	Яичник	0,059	0,0111	0,0122	5
А2780	Яичник	0,1745	0,0693	0,0442	5
ονΜΐυ	Яичник	0,1776	0,138	0,1443	5
ΜϋΑ-Η2774	Яичник	0,2085	0,0117	0,0207	4
ιοκ.ον-1	Яичник	0,4271	0,1121	0,1124	4
ΚΜΟ-1	Яичник	0,2666	0,2123	0,1716	4
8К-ОУ-3	Яичник	0,2853	0,2647	0,291	4
ΟΑΨ42	Яичник	0,4569	0,3872	0,3435	4
οντοκο	Яичник	0,4835	0,42	0,412	4
Саоу-З	Яичник	0,5251	-0,0004	-0,0224	3
МСА8	Яичник	1,2885	-0,0085	-0,0142	3
ΡΑ-1	Яичник	0,636	0,005	0,005	3
Ε8-2	Яичник	0,9311	0,0747	0,0623	3
ΚΚ.Ν	Яичник	1,0045	0,1482	0,1049	3
ОУСАК-8	Яичник	0,7166	0,1442	0,1224	3
Α2780ΑΟΚ	Яичник	0,5276	0,1526	0,1356	3
ТУК-пи	Яичник	0,7871	0,245	0,2265	3
ΝΙΗ:θνθΑΚ-3	Яичник	1,0723	0,2539	0,2416	3
ОА\У28	Яичник	0,8974	0,2001	0,2458	3
ОУСАК-5	Яичник	0,7739	0,2162	0,2648	3
ΕΡΟ-27	Яичник	0,8772	0,2627	0,3237	3
8Ψ 626	Яичник	1,0372	0,3903	0,4064	3
0νΐ8Ε	Яичник	0,6107	0,4587	0,4191	3
ОУЗАУО	Яичник	0,9829	0,4188	0,4195	3
ΕΡΟ-21	Яичник	0,8922	0,4971	0,4502	3
Ον-90	Яичник	1,175	0,4593	0,4735	3
ρυ-ον-ι	Яичник	0,9593	0,5098	0,495	2
ΟνΚΑΤΕ	Яичник	1,0241	0,9374	0,8461	1
ΚΡ-4	Поджелудочная железа	0,1844	0,0203	0,0222	5
ΡΑΝΟ-1	Поджелудочная железа	0,3146	0,1726	0,1474	4
ΚΡ-3	Поджелудочная железа	0,378	0,222	0,175	4
Κ.Ρ-1Ν	Поджелудочная железа	0,3155	0,1894	0,1894	4
Рапс 03.27	Поджелудочная железа	0,702	0,111	0,117	3
ΗϋΡ-Τ4	Поджелудочная железа	0,952	0,144	0,154	3
Α2.1	Поджелудочная железа	1,339	0,186	0,208	3
НРАС	Поджелудочная железа	0,939	0,251	0,213	3
КР-ШЬ	Поджелудочная железа	0,702	0,287	0,219	3
ВхРС-3	Поджелудочная железа	1,233	0,321	0,236	3
Α13Α	Поджелудочная железа	1,115	0,28	0,239	3
КР-ЗЬ	Поджелудочная железа	0,875	0,287	0,258	3
Рапс 10.05	Поджелудочная железа	1,204	0,2845	0,267	3
нир-тз	Поджелудочная железа	0,7682	0,2841	0,2686	3
НРАР-П	Поджелудочная железа	1,042	0,423	0,372	3
ϋΑΝ-Ο	Поджелудочная железа	0,6668	0,3759	0,3811	3
КР-2	Поджелудочная железа	0,8359	0,4032	0,4095	3

- 44 018014

УАРС	Поджелудочная железа	0,76	0,507	0,289	2
Сарап-1	Поджелудочная железа	0,857	0,51	0,368	2
Рапс 02.03	Поджелудочная железа	1,0158	0,5008	0,4159	2
АзРС-1	Поджелудочная железа	1,292	0,721	0,535	1
8и.86.86	Поджелудочная железа	1,1289	0,645	0,5435	1
РБ4	Поджелудочная железа	0,929	0,651	0,544	1
81ЛТ-2	Поджелудочная железа	1,123	0,844	0,57	1
Рапс 08.13	Поджелудочная железа	0,91	0,761	0,703	1
Сарап-2	Поджелудочная железа	1,0128	0,7716	0,7456	1
Рапс 04.03	Поджелудочная железа	0,994	0,798	0,77	1
ϋϋ 145	Предстательная железа	0,931	0,049	0,044	3
МОН-ВА-1	Кожа	0,15	0,044	-0,013	5
ΨΜ1158	Кожа	0,0594	0,0252	0,0321	5
ЮК-1	Кожа	0,1978	0,0714	0,0587	5
СОБО-849	Кожа	0,4553	-0,0091	0,0093	4
А2058	Кожа	0,2671	0,0255	0,02	4
М-14	Кожа	0,3071	0,0703	0,0561	4
МОН-8Т-1	Кожа	0,4152	0,074	0,0578	4
СОБО 792	Кожа	0,3273	0,1011	0,0917	4
УМКС-МЕБО	Кожа	0,4605	0,1462	0,1194	4
МОН-ВО-1	Кожа	0,353	0,186	0,151	4
А375.82	Кожа	0,452	0,1896	0,1536	4
8К-МЕБ-39	Кожа	0,4542	0,2968	0,2391	4
К.19	Кожа	0,323	0,3	0,247	4
1РС-298	Кожа	0,4501	0,3059	0,2539	4
ΜΟΗ-8Ψ-1	Кожа	0,2458	0,2558	0,271	4
А431	Кожа	1,0122	0,022	0,0192	3
ви-мл	Кожа	0,7451	0,0443	0,0244	3
СНБ-1	Кожа	0,8801	0,0514	0,0326	3
СОБО 857	Кожа	0,7565	0,0666	0,0529	3
8К-МЕБ-131	Кожа	0,7317	0,0848	0,0599	3
иАСС-62	Кожа	0,5483	0,1094	0,124	3
Ηδ 944.Т	Кожа	0,7522	0,1316	0,1388	3
МОН-РО-1	Кожа	0,7752	0,1548	0,1397	3
ЮК-37	Кожа	0,5675	0,1714	0,1429	3
иАСС903	Кожа	0,555	0,181	0,175	3
8К-МЕБ-37	Кожа	0,536	0,2181	0,1784	3
МОН-МС-1	Кожа	0,7186	0,1934	0,1994	3
С32	Кожа	0,9511	0,2482	0,2055	3
С-МЕБ	Кожа	0,6624	0,2227	0,2122	3
ΜΕΨΟ	Кожа	0,991	0,255	0,214	3
ЮК-39	Кожа	0,834	0,2702	0,2141	3
МЕшизо	Кожа	0,7127	0,1949	0,2211	3
451 Би	Кожа	0,7217	0,2594	0,2265	3
ΨΜ35	Кожа	0,8726	0,2125	0,2318	3
СОЬО 858	Кожа	0,806	0,306	0,234	3
1205Ьи	Кожа	0,5617	0,2665	0,2484	3
К4	Кожа	0,919	0,257	0,254	3
К1	Кожа	0,6275	0,2832	0,2662	3
ΨΜ793Β	Кожа	0,6332	0,3606	0,3015	3
ΨΜ 266-4	Кожа	0,7552	0,3436	0,3252	3
ММ608	Кожа	0,7646	0,3161	0,3265	3
МОН-ТН-1	Кожа	1,114	0,4408	0,3347	3
К2	Кожа	0,97	0,33	0,36	3
Ηδ 939.Т	Кожа	0,7495	0,4148	0,3821	3
ΨΜ164	Кожа	0,805	0,414	0,399	3
мон-ои-ι	Кожа	0,97	0,46	0,433	3
8К-МЕБ-28	Кожа	0,841	0,476	0,459	3
Ηδ 940.Т	Кожа	0,899	0,552	0,492	2
МЕЕ-НО	Кожа	0,8835	0,6098	0,5037	1
8К-МЕЕ-119	Кожа	0,8436	0,4805	0,5052	1
НМУП	Кожа	0,7604	0,6097	0,5073	1
К8	Кожа	0,762	0,468	0,509	1
МОН-МСС-1	Кожа	1,03	0,73	0,573	1
ΨΜ239Α	Кожа	1,447	0,732	0,64	1
ММ455	Кожа	1,257	0,718	0,672	1
ΨΜ902Β	Кожа	1,401	0,99	0,805	1
А68	Желудок	0,1829	0,0811	0,067	5
Так1£а\уа	Желудок	0,1891	0,1612	0,1255	5
ТМК-1	Желудок	0,334	0,0293	0,0321	4
ΑΖ-521	Желудок	0,3819	0,0702	0,0601	4
ΜΚΝ28	Желудок	0,3799	0,1106	0,0748	4
1М-95т	Желудок	0,4254	0,1195	0,0834	4
КАТО II	Желудок	0,3873	0,2237	0,2532	4
НОС-27	Желудок	0,536	0,044	0,057	3
Νυοο-з	Желудок	1,1004	0,09	0,0967	3
23132/87	Желудок	1,0523	0,1618	0,1552	3
ΜΚΝ74	Желудок	1,0538	0,1651	0,1667	з
КАТО III	Желудок	0,6955	0,1991	0,196	3

- 45 018014

К.ЕКЕ-6С-1В	Желудок	0,8254	0,3142	0,2073	3
ΜΚΝ7	Желудок	1,1909	0,2781	0,2612	3
Ν(Π-Ν87	Желудок	0,8742	0,3371	0,29	3
ΙΜ-95	Желудок	0,902	0,311	0,292	3
осим-ι	Желудок	0,8101	0,2168	0,3176	3
иисс-4	Желудок	0,5093	0,3328	0,335	3
ОТЬ-16	Желудок	0,7105	0,4124	0,3635	3
ΜΚΝ45	Желудок	0,851	0,326	0,429	3
ГИ97	Желудок	0,7699	0,5171	0,404	2
ΜΚΝ1	Желудок	1,024	0,5318	0,4098	2
КМН-2	Щитовидная железа	0,343	0,017	0,0093	4
ΙΗΗ-4	Щитовидная железа	0,3912	0,0328	0,0391	4
ЕТС-133	Щитовидная железа	0,3884	0,1596	0,1535	4
8505С	Щитовидная железа	0,7694	0,1011	0,0742	3
ГТС-238	Щитовидная железа	0,5915	0,0995	0,0877	3
САЬ-62	Щитовидная железа	0,9829	0,1362	0,1365	3
οΝεο-ϋα-ι	Щитовидная железа	1,0952	0,3063	0,1977	3
ТСО-1	Щитовидная железа	0,7356	0,2228	0,1992	3
нтс-сз	Щитовидная железа	0,7903	0,2916	0,2857	3
ТТ2609-С02	Щитовидная железа	0,9862	0,3171	0,3136	3
8305С	Щитовидная железа	0,7851	0,435	0,3771	3
МЛ-1	Щитовидная железа	0,7562	0,4193	0,4005	3
ВНТ-101	Щитовидная железа	1,0259	0,4909	0,4394	3
5-117	Щитовидная железа	0,8908	0,4405	0,4683	3
ΚΟ82-Ψ-1	Щитовидная железа	0,7894	0,4013	0,4831	3
В-СРАР	Щитовидная железа	1,378	0,763	0,49	2
А8Н-3	Щитовидная железа	0,7518	0,6432	0,5762	1
МЕЕ-319	1 Матка	0,2338	0,0988	0,0843	4 1
НЕС-1	Матка	0,2361	0,0976	0,1034	4
8ΝΟ-Μ	Матка	0,6532	0,0129	0,0117	3
Ыика^уа	Матка	0,9421	0,0306	0,0209	3
МРЕ-296	Матка	0,6434	0,0852	0,0762	3
Е88-1	Матка	0,881	0,1059	0,0827	3
МЕ5-8А	Матка	0,808	0,1341	0,1377	3
8ΚΝ	Матка	0,864	0,2716	0,1851	3
АИЗСА	Матка	0,9261	0,2145	0,2207	3
15Ыка\уа (НегакНо) 02 ЕВ,-	Матка	0,88	0,242	0,225	3
МРЕ-280	Матка	0,9711	0,4052	0,3979	3
ЕЕЕ-184	Матка	0,986	0,5066	0,426	2
ЕН	Матка	1,0579	0,6322	0,5471	1

Пример 15. Соединения формулы II эффективны по отношению к линиям клеток многих злокачественных новообразований в крови.

Соединение На исследовали с использованием набора линий клеток, полученных из злокачественных новообразований в крови с помощью исследования выживаемости клеток с применением СеПТИегС1о® с получением данных через 48 ч в присутствии соединения. В табл. 18 приведены тип злокачественного заболевания крови, название образца, полученное с помощью анализа значение Ш50 (концентрация, необходимая для 50% подавления роста), логарифм Ш50 (1од(С^0) и относительная чувствительность для каждого образца (разность). Разность рассчитывают путем вычитания значения 1од(С^0) для каждой линии клеток из среднего значения 1од(С^0) для всей группы клеток (в этом случае оно равно 0,236); положительное значение указывает, что образец является более чувствительным, чем в среднем, а отрицательное значение указывает, что образец является менее чувствительным, чем в среднем.

Чувствительными злокачественными заболеваниями крови являются острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), острый лимфолейкоз (ОЛЛ), множественная миелома (ММ), неходжкинская лимфома (НХЛ) и ходжкинская лимфома (ХЛ).

- 46 018014

Таблица 18

Активность соединения На по отношению к линиям клеток рака крови

Заболевание	Линия клеток	О1₅о (нМ)	Ьо§(С15о)	Разность
ОМЛ	МУ4;11	0,08	-1,114	0,747
ОМЛ	МУ4;11Ьис	0,11	-0,979	0,613
ОМЛ	ОМЛ-193	0,11	-0,959	0,593
ОМЛ	Ка8шт-1	0,44	-0,357	-0,010
ОМЛ	икЕ-1	0,18	-0,757	0,391
ОМЛ	8ЕТ-2	0,34	-0,469	0,102
ОМЛ	МОЬМ13-Ьис	0,23	-0,645	0,279
ОМЛ	НЬбО	0,17	-0,783	0,416
ОМЛ	НЬбО-Ьис	0,51	-0,294	-0,072
ОМЛ	НЕЬ92	0,49	-0,310	-0,056
хмл	К562	0,21	-0,680	0,314
олл	ССКР-СЕМ	0,16	-0,785	0,419
олл	К84;11	0,10	-1,000	0,634
олл	МОЬТ-4	0,33	-0,480	0,114
олл	8ЕМ-Ьис	0,15	-0,824	0,458
олл	МОЬТ-3	0,34	-0,475	0,109
олл	КЕН	0,18	-0,745	0,379
олл	8иР-В15	0,19	-0,721	0,355
олл	ССКР-Н8В-2	0,19	-0,733	0,367
олл	697	0,11	-0,979	0,613
олл	ΝΑί,Μ-6	0,14	-0,870	0,504
олл	ΝΑίΜ-19	0,19	-0,721	0,355
олл	ΤΑΝΟυΕ	10,00	1,000	-1,366
олл	МНН-САЬЬ-2	0,32	-0,502	0,136
олл	МНН-САЬЬ-3	0,20	-0,699	0,333
олл	МНН-САЫ.-4	10,00	1,000	-1,366
олл	Μυτζ-5	10,00	1,000	-1,366
олл	ΥΤ	10,00	1,000	-1,366
мм	КМ811	0,48	-0,316	-0,050
мм	КМЗИ-Ьис	0,29	-0,538	0,172
мм	КМ818-Ьис	0,52	-0,286	-0,080
мм	ОРМ2	0,14	-0,870	0,504
мм	ММ1-8	0,24	-0,620	0,254
мм	ΜΜΙ-8-Ьис	0,23	-0,638	0,272
мм	КМ826	0,24	-0,620	0,254
мм	КМ812	0,29	-0,538	0,172
мм	Ь363	0,13	-0,886	0,520
мм	ЬР1	0,21	-0,688	0,322
мм	ΙΝΑ-6	0,12	-0,921	0,555
мм	ΚΡΜΙ8226	0,26	-0,582	0,216
мм	Н929	0,34	-0,475	0,109
мм	Н929-Ьис	1,69	0,227	-0,593
нхл	КЬ	20,00	1,301	-1,667
нхл	8иЭНЬ-1	10,00	1,000	-1,366
нхл	ЗиОНЬ-4	0,45	-0,350	-0,016
нхл	ЗиЭНЬ-6	0,16	-0,796	0,430
нхл	и937	0,20	-0,699	0,333
нхл	8К	0,11	-0,957	0,591
нхл	Каграз-299-Ьис	20,18	1,305	-1,671
нхл	Каграз-299	0,20	-0,699	0,333
нхл	Каграз-422	5,14	0,711	-1,077
нхл	Катоз	0,16	-0,796	0,430
нхл	НиТ78	0,28	-0,561	0,195
нхл	НН	0,22	-0,668	0,301
нхл	ОЕЬ	0,28	-0,548	0,182
нхл	81ГР-М2	0,18	-0,745	0,379
нхл	ϋΟΗΗ2	0,24	-0,629	0,263
нхл	зир-τι	5,57	0,746	-1,112
хл	НОЬМ-2	0,12	-0,921	0,555
хл	Ь-1236	3,67	0,564	-0,930
хл	Ь428	20,00	1,301	-1,667
хл	КМ-Н2	0,23	-0,632	0,266
	Среднее значение	0,430	-0,366

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (II) в которой К^1с выбран из группы, включающей этил, изопропил и трет-бутил; К^2с обозначает водород или метил;

- 47 018014

Л¹⁵, Л¹⁶, Л¹⁷ и Л¹⁸, все независимо, выбраны из группы, включающей Н, галоген, С₁-С₄-алкил, С₁-С₄галогеналкил и СА

Л¹⁹, Л²⁰ и Л²¹ обозначают Н;

Л²² обозначает С₁-С₄-галогеналкил;

р обозначает целое число от 1 до 3 и

с.| обозначает целое число от 1 до 3; или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п.1, в котором Л²² обозначает фторметил.
3. Соединение по п.1 или 2, в котором р равно 2.
4. Соединение по любому из пп.1-3, в котором с.| равно 1.
5. Соединение по любому из пп.1-4, в котором Л^2с и Л¹⁵, каждый, обозначают Н.
6. Соединение по п.5, в котором Л¹⁷ и Л¹⁸, каждый, обозначают галоген.
7. Соединение формулы ПЬ или его фармацевтически приемлемая соль.
8. Соединение формулы Па {5)-Ν-({'5)-3-3ΜΗΗθ-·4·φτορ6ντιι.Τ'Ν’((Κ.)-1-(1бензил-4-(2, 5-дифторфенил)-1 Н-имидазол-2-ил)-2_ъ2-дяметилпропил)-2-гидроксипропанамид или его фармацевтически приемлемая соль.
9. Соединение формулы Пс

Пс или его фармацевтически приемлемая соль.
10. Способ лечения пролиферативного заболевания, выбранного из группы, включающей солидную опухоль и рак крови, у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему соединения по любому из пп.7, 8 или 9 или фармацевтически приемлемой соли любого из этих соединений в терапевтически эффективном количестве.
11. Способ по п.10, в котором указанное пролиферативное заболевание представляет собой солидную опухоль, выбранную из группы, включающей карциному легких, карциному молочной железы, карциному яичника, карциному кожи, карциному толстой кишки, карциному мочевого пузыря, карциному печени, карциному желудка, рак предстательной железы, почечно-клеточную карциному, носоглоточную

- 48 018014 карциному, плоскоклеточную карциному, папиллярную карциному щитовидной железы, карциному шейки матки, мелкоклеточную карциному легких (МККЛ), немелкоклеточную карциному легких, рак поджелудочной железы, плоскоклеточный рак головы и шеи и саркомы.
12. Способ по п.11, в котором солидная опухоль представляет собой карциному молочной железы.
13. Способ по п.12, в котором карцинома молочной железы представляет собой метастатическую карциному молочной железы.
14. Способ по п.11, в котором солидная опухоль представляет собой карциному желудка.
15. Способ по п.11, в котором солидная опухоль представляет собой рак предстательной железы.
16. Способ по любому из пп.11-15, в котором опухоль представляет собой опухоль, обладающую множественной лекарственной резистентностью.
17. Способ по п.16, в котором опухоль экспрессирует повышенный уровень Р-гликопротеина.
18. Способ по п.10, в котором указанное пролиферативное заболевание представляет собой рак крови, выбранный из группы, включающей ходжкинскую лимфому (ХЛ), неходжкинскую лимфому (НХЛ), лейкоз, миелогенный лейкоз, лимфолейкоз, острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), миелодиспластический синдром (МДС), волосатоклеточный лейкоз и множественную миелому.
19. Способ по п.18, в котором указанный рак крови представляет собой острый миелогенный лейкоз.
20. Способ по п.18, в котором указанный рак крови представляет собой множественную миелому.
21. Фармацевтическая композиция, включающая соединение по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый наполнитель.