ES2459442T3

ES2459442T3 - Inhibidores de quinesina como compuestos terapéuticos contra el cáncer

Info

Publication number: ES2459442T3
Application number: ES08863009.0T
Authority: ES
Inventors: Tinya Abrams; Paul Barsanti; David Duhl; Michel Faure; Paul A. Renhowe; Annette Olga Walter
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2014-05-09
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: BRPI0821248A2; UY31532A1; ECSP10010248A; NZ585142A; US8252832B2; CO6290651A2; JP5501976B2; IL205831A0; NI201000091A; MA31872B1; JP2011506402A; DOP2010000175A; US20090239922A1; PE20091451A1; CR11412A; EP2229170B1; MY150214A; US8664256B2; GEP20125647B; TW200930704A

Abstract

Un compuesto de fórmula (II): **Fórmula** en donde: R1c se selecciona entre el grupo que consiste en etilo, isopropilo, t-butilo, fenilo, -CH(CH2)2O(oxetan-3-ilo) y - CCH3(CH2)2O(3-metiloxetan-3-ilo); R2c es hidrógeno o metilo; R15, R16, R17 y R18 se seleccionan cada uno independientemente entre H, halo, alquilo C1 - 4, haloalquilo C1 - 4, y CN; R19, R20 y R21 son cada uno independientemente H o acilo C1 - C10 opcionalmente sustituido; R22 es haloalquilo C1 - C4; p es un número entero de 1 a 3; y q es un número entero de 1 - 3; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo

Description

Inhibidores de quinesina como compuestos terapéuticos contra el cáncer

Campo técnico

Esta invención se refiere a inhibidores de KSP para uso en el tratamiento de trastornos proliferativos, tales como cánceres, mediante la administración de inhibidores de KSP.

Antecedentes

Las quinesinas son proteínas motoras que hidrolizan el trifosfato de adenosina a medida que viajan a lo largo de los microtúbulos y generan fuerza mecánica. Estas proteínas se caracterizan porque contienen un dominio motor que tiene aproximadamente 350 residuos de aminoácidos. Se han resuelto las estructuras cristalinas de varios dominios motores de quinesina.

En la actualidad, se han identificado aproximadamente cien proteínas relacionadas con quinesina (KRP). Las quinesinas están involucradas en una variedad de procesos biológicos celulares, incluyendo el transporte de organelos y vesículas, y el mantenimiento del retículo endoplasmático. Varias KRP interactúan con los microtúbulos del huso mitótico o con los cromosomas directamente, y parecen jugar un papel esencial durante las etapas mitóticas del ciclo celular. Estas KRP mitóticas son de un interés particular para el desarrollo de compuestos terapéuticos contra el cáncer.

La proteína del huso de quinesina (KSP) (también conocida como Eg5, HsEg5, KNSL1, o KIF11) es una entre varias proteínas motoras de tipo quinesina que se localizan en el huso mitótico, y se sabe que son requeridas para la formación y/o función del huso mitótico bipolar.

En 1995, se demostró que el consumo de KSP utilizando un anticuerpo dirigido contra el terminal C de KSP detiene las células HeLa en la mitosis con los arreglos de microtúbulos monoastrales (Blangy y colaboradores, Cell 83: 1159

-: 1169, 1995). Las mutaciones en los genes bimC y cut7, que se considera que son homólogos de la KSP, provocan una falla en la separación del centrosoma en Aspergillus nidulans (Enos, A. P., y N. R. Morris, Cell 60: 1019 - 1027, 1990) y en Schizosaccharomyces pombe (Hagan, I., y M. Yanagida, Nature 347: 563 - 566, 1990). El tratamiento de células con cualquier ATRA (ácido retinoico todo trans), el cual reduce la expresión de KSP al nivel de la proteína, o el consumo de KSP, utilizando oligonucleótidos antisentido, reveló una inhibición significativa del crecimiento en las células de carcinoma pancreático DAN-G, indicando que la KSP puede estar involucrada en la acción antiproliferativa del ácido retinoico todo trans (Kaiser, A., y colaboradores, J. Biol. Chem. 274, 18925 - 189131, 1999). En forma muy interesante, se demostró que la proteína quinasa relacionada con Xenopus laevis Aurora pEg2 se asocia y fosforila X1Eg5 (Giet, R., y colaboradores, J. Biol. Chem. 274: 15005 -15013, 1999). Los sustratos potenciales de las quinasas relacionadas con Aurora son de interés particular para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Por ejemplo, las quinasas Aurora 1 y 2 son sobreexpresadas al nivel de la proteína y del ARN, y los genes se amplifican en los pacientes con cáncer de colon.

Se demostró que el primer inhibidor de molécula pequeña permeable de la célula para KSP, “monoastral”, detiene las células con husos monopolares sin afectar la polimerización de los microtúbulos, como lo hacen los compuestos quimioterapéuticos convencionales, tales como los taxanos y los alcaloides vinca (Mayer, T. U., y colaboradores, Science 286: 971 - 974, 1999). Se identificó al monastrol como un inhibidor en las cribas basadas en el fenotipo, y se sugirió que este compuesto puede servir como guía para el desarrollo de los fármacos contra el cáncer. Se determinó que la inhibición no es competitiva con respecto a la interacción del trifosfato de adenosina con la KSP, y se encontró que es rápidamente reversible (DeBonis, S., y colaboradores, Biochemistry 42: 338 - 349, 2003; Kapoor,

T. M., y colaboradores, J. Cell Biol. 150: 975 - 988, 2000).

A la luz de la importancia de contar productos quimioterapéuticos mejorados, existe la necesidad de inhibidores de KSP que sean inhibidores efectivos in vivo de KSP y de las proteínas relacionadas con KSP. Anteriormente se han reportado algunos inhibidores de KSP. Por ejemplo, la publicación internacional WO 06/002236 y la PCT/US2006/031129 dan a conocer ciertas clases de compuestos indicados como inhibidores de KSP. Ispinesib (SB-715992) es un candidato clínico de Cytokinetics, que es indicada para actuar como un inhibidor de KSP. La presente invención proporciona nuevos inhibidores de KSP con actividades mejoradas, y se relaciona con el uso de estos inhibidores de KSP. Además, proporciona novedosos inhibidores de KSP que son efectivos contra las células cancerosas que son resistentes a otros agentes terapéuticos, tales como paclitaxel, debido a su expresión de la glicoproteína P que actúa como una bomba de flujo de salida.

La invención se relaciona con inhibidores de KSP para uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa seleccionada a partir de un tumor sólido o un cáncer hematológico en un mamífero, que comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la Fórmula II, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos, en donde el compuesto de la Fórmula lI es:

en donde: R1c

se selecciona entre el grupo que consiste en etilo, isopropilo, t-butilo, fenilo, -CH(CH2)2O(oxetan-3-ilo) y CCH3(CH2)2O(3-metiloxetan-3-ilo);

10 R2c es hidrógeno o metilo;

R15, R16, R17 y R18 se seleccionan cada uno independientemente entre H, halo, alquilo C1 - 4, haloalquilo C1 - 4, y CN;

R19, R20 y R21 son cada uno independientemente H o acilo C1 - C10 opcionalmente sustituido;

R22 es haloalquilo C1 - C4; 15 p es un número entero de 1 a 3; y q es un número entero de 1 - 3;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula II, R1c se selecciona entre el grupo que consiste de etilo, isopropilo y t- butilo;

20 R2c es H; R15, R17 y R18 se seleccionan cada uno independientemente entre H, halo, alquilo C1 - 4, haloalquilo C1 - 4, y CN;

R16 es H o alquilo C1 - C4;

R22 es haloalquilo C1 - C4;

25 p es 2; y q es 1. Estos compuestos también incluyen las sales farmacéuticamente aceptables correspondientes.

Los compuestos de Fórmula II y Fórmula IIa - IIc (más abajo) son un subconjunto de los compuestos de Fórmula I, y se caracterizan por la presencia de un grupo hidroxilo libre o una versión de un profármaco de un grupo hidroxilo libre en la fracción acilo, es decir, en estos compuestos, R19 es H, o R19 es un grupo acilo que puede hidrolizarse in vivo para proporcionar un compuesto en el que R19 es H. Los compuestos en los que R19 es un grupo acilo adecuados son profármacos que se hidrolizan fácilmente en el cuerpo para producir un compuesto en el que R19 es

H. Los compuestos en los que R19 es H se ha encontrado que tienen sorprendentemente buena actividad para el tratamiento de ciertas condiciones tales como el cáncer de próstata, y son particularmente efectivos contra tumores en los que P-gp se expresa y en ciertos cánceres hematológicos. En particular, estos compuestos son efectivos contra los tumores resistentes a fármacos que expresan P-gp, un mecanismo de resistencia común, mientras que incluso compuestos muy similares sin el hidroxilo son mucho menos efectivos contra tales tumores resistentes a fármacos. Si bien es común que un hidroxilo libre sea una característica indeseable en un candidato a fármaco debido a problemas metabólicos tales como oxidación y glicosilación, se encontró sorprendentemente que los compuestos de Fórmula II o IIa, IIb o IIc, son más efectivos in vivo contra ciertos tumores que compuestos similares que no contienen un hidroxilo libre y que no se puede hidrolizar fácilmente para proporcionar un hidroxilo libre (R19 = H). Su efectividad contra tumores resistentes a los fármacos hace que estos compuestos de Fórmula II sean particularmente útiles para el tratamiento del cáncer.

En una realización adicional, la invención se refiere a inhibidores de KSP para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa seleccionada de entre un tumor sólido o un cáncer hematológico en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de fórmula II, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos, en donde el tumor sólido se selecciona de entre el grupo que consiste de carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de piel, carcinoma de colon, carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma de hígado, carcinoma gástrico, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC), carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello y sarcomas. En ciertas realizaciones, el tumor es uno resistente a múltiples fármacos, o uno que expresa un nivel elevado de glicoproteína P (P- gp).

En una realización adicional, el tumor sólido es un carcinoma de mama. En una realización adicional, el carcinoma de mama es carcinoma de mama metastásico.

En una realización alternativa, el tumor sólido es un carcinoma gástrico. En una realización adicional, el tumor sólido es cáncer de próstata. En una forma de realización, la invención proporciona inhibidores de KSP para uso en un método de tratamiento para una enfermedad proliferativa seleccionada de un cáncer sólido o hematológico que comprende la administración de la Fórmula II en donde el tumor es un cáncer resistente a múltiples fármacos. En algunas realizaciones, la malignidad hematológica se selecciona entre leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), mieloma múltiple (MM), linfoma no Hodgkin (LNH) y linfoma de Hodgkin (LH). En ciertas realizaciones, la malignidad es una resistente a múltiples fármacos, o una que expresa un nivel elevado de glicoproteína P (P- gp).

En una realización adicional, la invención se refiere a inhibidores de KSP para su uso en un método para tratar una enfermedad proliferativa escogida entre un tumor sólido o un cáncer hematológico en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de Fórmula II, un tautómero del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos, en donde el cáncer hematológico se selecciona entre el grupo que consiste de linfoma de Hodgkin (LH), linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia, leucemia mielógena, leucemia linfocítica, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia de células peludas y mieloma múltiple.

En una realización adicional, dicho cáncer hematológico es leucemia mielógena aguda. En una realización alternativa, el cáncer hematológico es mieloma múltiple.

En otra realización, la invención se refiere a inhibidores de KSP para uso en un método para tratar una enfermedad proliferativa seleccionada a partir de un tumor sólido o un cáncer hematológico en un mamífero, en donde el método comprende administrar a dicho mamífero una cantidad de un inhibidor de KSP de Fórmula (II) y comprende además administrar un segundo compuesto terapéutico contra el cáncer. En una forma de realización, el segundo compuesto terapéutico contra el cáncer se administra antes de, junto con, o después del tratamiento con el inhibidor de KSP de Fórmula (II).

El segundo compuesto terapéutico contra el cáncer se puede seleccionar a partir de irinotecano, topotecano, gemcitabina, imatinib, trastuzumab, 5 - fluorouracilo, leucovorina, carboplatino, cisplatino, docetaxel, paclitaxel, tezacitabina, ciclofosfamida, alcaloides vinca, antraciclinas, rituximab, y nilotinib.

En algunas realizaciones, el segundo compuesto es un inhibidor de Bcr-Abl. En realizaciones particulares, el inhibidor de Bcr-Abl se selecciona de entre el grupo de imatinib y nilotinib. La invención proporciona un compuesto de fórmula (II) :

5 en donde: R1c

se selecciona entre el grupo que consiste en etilo, isopropilo, t-butilo, fenilo, -CH(CH2)2O(oxetan-3-ilo) y CCH3(CH2)2O(3-metiloxetan-3-ilo); R2c es hidrógeno o metilo; R15, R16, R17 y R18 se seleccionan cada uno independientemente entre H, halo, alquilo C1 - 4, haloalquilo C1 - 4, y 10 CN; R19, R20 y R21 son cada uno independientemente H o acilo C1 - C10 opcionalmente sustituido; R22 es haloalquilo C1 - C4; p es un número entero de 1 a 3; y q es un número entero de 1 - 3; 15 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una forma de realización, R22 es fluorometilo. En otra forma de realización, p es 2. En una forma de realización adicional, q es 1. En otra forma de realización, R2c y R15 son cada uno H. 20 En una forma de realización adicional, R17 y R18 son cada uno halógeno. En aun otra forma de realización, R19, R20 y R21 son cada uno H. En una forma de realización adicional, R19 es H. En otra forma de realización, R19 es aciIo C1 - C10 opcionalmente sustituido. En algunas forma de realización, el compuesto comprende dos o más de las características estructurales descritas

25 anteriormente para R22, p, q, R2c y R17 - R21. En algunas forma de realización, el compuesto comprende cuando menos tres de estas características estructurales. En algunas forma de realización preferidas de estos compuestos, R22 es fluorometilo, y p es 2, y q es 1, y R2c y R15 son cada uno H. En algunas de estas forma de realización, R17 y La invención también proporciona un compuesto de la fórmula lla:

: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La invención también proporciona un compuesto de la fórmula llb:

: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La invención también proporciona un compuesto de la fórmula IIc:

(S)-N-((S)-3-amino-4-fluorobutiI)-N-((R)-1-(1bencil-4-(2,5-difIuorofenil)-1H-imidazol-2-il) 2,2-dimetiIpropiI)-2-hidroxipropanamida IIc

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

15 En una forma de realización, la invención proporciona inhibidores de KSP para el uso en un método para el tratamiento de una enfermedad proliferativa seleccionada a partir de un tumor sólido o un cáncer hematológico en un mamífero, en donde el método comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de cualquiera de las fórmulas II, lla, llb o Ilc, un tautómero de cualquiera de estos compuestos, una sal

farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estos compuestos, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos.

En una forma de realización adicional, el tumor sólido se selecciona a partir del grupo que consiste en carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de piel, carcinoma de colon, carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma de hígado, carcinoma gástrico, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma cervical, carcinoma pulmonar de células pequeñas (SCLC), carcinoma pulmonar de células no pequeñas, cáncer pancreático, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, y sarcomas. En ciertas forma de realización, el tumor sólido es un tumor que es resistente a otros fármacos para el cáncer. Puede ser un cáncer que exprese una bomba de flujo de salida, tal como P-gp que promueve la resistencia a fármacos, o un cáncer que ha demostrado que es resistente al tratamiento con fármacos como paclitaxel o SB-715992. Los cánceres que son resistentes a fármacos, tales como paclitaxel, debido a sobreexpresión por parte de las células cancerosas de una bomba de flujo de salida, en particular glicoproteína P (P-gp), son sensibles a los compuestos de la fórmula II, como se demuestra en la presente invención, mientras que compuestos similares que carecen del hidroxilo de los compuestos de la Fórmula Il pueden no ser efectivos en estos tumores resistentes a fármacos. Los compuestos de las fórmulas lla, llb, y llc son especialmente útiles para el tratamiento de tumores que expresan P-gp y exhiben resistencia a otros agentes terapéuticos. Estos compuestos son convenientes por su capacidad inesperada para tratar los tumores resistentes a fármacos. Se cree que su actividad sobre los tumores resistentes a fármacos está asociada con el hidroxilo libre sobre la fracción de amida de la Fórmula ll.

En otra forma de realización, el tumor sólido es carcinoma de mama. En una forma de realización adicional, el carcinoma de mama es carcinoma de mama metastásico.

En una forma de realización alternativa, el tumor sólido es carcinoma gástrico.

En otra forma de realización, el tumor sólido es cáncer de próstata.

En cada una de estas forma de realización, el tumor algunas veces es uno que es resistente a otros fármacos. En algunas forma de realización, el tumor se selecciona a partir de cáncer de riñón, hígado, colon, cerebro o de mama. En ciertas forma de realización, es un tumor que expresa niveles elevados de P-gp. Tal expresión elevada de P-gp puede surgir naturalmente, o como resultado del tratamiento con otros fármacos.

En otra forma de realización, la invención proporciona inhibidores de KSP para uso en un método para el tratamiento de una enfermedad proliferativa seleccionada a partir de un tumor sólido o un cáncer hematológico en un mamífero, el cual comprende administrar a este mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de cualquiera de las fórmulas lla, llb o llc, un tautómero de cualquiera de estos compuestos, una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estos compuestos, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos, en donde el cáncer hematológico se selecciona a partir del grupo que consiste de linfoma de Hodgkin (LH), linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia, leucemia mielógena, leucemia Iinfocítica, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia Iinfocítica aguda (LLA), leucemia Iinfocítica crónica (LLC), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia de células pilosas, y mieloma múltiple.

En otra forma de realización, el cáncer hematológico es leucemia mielógena aguda.

En otra forma de realización, el cáncer hematológico es mieloma múltiple.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Sensibilidad relativa al compuesto lla para las líneas celulares derivadas a partir de malignidades hematológicas. Las sensibilidades relativas basadas en el ensayo CellTiter Glo® de las líneas celulares en un panel de malignidad hematológica se muestran graficando la diferencia entre el promedio de los valores Log(Gl50) (GI50 es la concentración con una inhibición del 50%) para el panel completo, y el valor Log(Gl50) para cada línea celular; los valores positivos (barras a la derecha) indican las líneas celulares que son más sensibles que el promedio, y los valores negativos (barras a la izquierda) indican las líneas celulares que son menos sensibles que el promedio.

Figura 2. Evaluación de la etapa celular mediante FACS para las líneas celulares SUDHL-4 y RL tratadas con el Compuesto lla: la primera columna muestra las células no tratadas, la segunda columna muestra las células después de 24 horas con el Compuesto lla, y la tercera columna muestra las células 48 horas después del tratamiento con el Compuesto lla.

Figura 3. Datos que muestran que el compuesto lla es citotóxico para las células blásticas de LMA de pacientes con LMA. El Panel A muestra el porcentaje de supervivencia en función de la dosificación. El Panel B muestra cultivos

celulares después de 2 semanas de tiempo de crecimiento. El Panel C muestra el porcentaje de células en la etapa lt;2N, 2N o 4N, comparando el efecto del compuesto lla con aquél del paclitaxel.

Figura 4. Eficacia del compuesto lla administrado en un programa de dosificación cada 4 días, 3 veces (q4d x 3) en el modelo de xenoinjerto de tumor subcutáneo MV4;11. Se establecieron tumores MV4;11 en ratones nu/nu atímicos hembra, mediante inyección subcutánea de 107 células en 0,2 mL de una relación 1:1 de HBSS y MatrigelMR en el costado derecho de cada ratón. Cuando los tumores alcanzaron 250 mm3, aproximadamente 24 días después del implante de las células, se dividieron aleatoriamente los ratones de acuerdo con el volumen del tumor, en grupos de tratamiento (n = 9). Se les administró a los animales en forma intravenosa el vehículo (CaptisoI®), el compuesto lla,

o SB-715992 (Ispinesib, un inhibidor de KSP de Cytokinetics que está en estudios clínicos). Todos fueron dosificados en un programa q4d x 3. (A) Eficacia / volúmenes tumorales de los grupos de tratamiento vs los días después de la selección aleatoria; (B) Porcentaje de cambio del peso corporal en relación con los pesos iniciales en el día de la selección aleatoria.

Figura 5. Eficacia del compuesto lla administrado en un programa de dosificación cada 4 días, 3 veces (q4d x 3) en el modelo de xenoinjerto de tumor KB8.5. Se establecieron tumores KB8.5 en ratones nu/nu atímicos hembra (Charles River Laboratories) mediante inyección subcutánea de 5 x 106 células en 0,2 mL de una relación 1:1 de HBSS y MatrigelMR en el costado derecho de cada ratón. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 300 mm3, aproximadamente 10 días después del implante de las células, se seleccionaron los ratones en forma aleatoria de acuerdo con el volumen del tumor en los grupos de tratamiento (n = 9 / grupo). A los animales se les administró en forma intravenosa el compuesto lla o SB-715992. El paclitaxel se administró a razón de 30 mg/kg en forma intraperitoneal. Todos se dosificaron en un programa q4d x 3. (Izquierda) Eficacia / volúmenes tumorales de los grupos de tratamiento vs días después del inicio de la dosificación; (Derecha) Porcentaje de cambio del peso corporal en relación con los pesos iniciales el día de la selección aleatoria / inicio de la dosificación. *p lt; 0,05 comparado con el vehículo y SB-715992 (ANOVA / Método de Dunn).

Figura 6. Eficacia del compuesto Ilc administrado en un programa de dosificación cada 4 días, 3 veces (q4d x 3) en el modelo de xenoinjerto de tumor KB8.5. Se establecieron tumores KB8.5 en ratones nu/nu atímicos hembra (Charles River Laboratories) mediante inyección subcutánea de 5 x 106 células en 0,2 mL de una relación 1:1 de HBSS y MatrigelMR en el costado derecho de cada ratón. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 339 mm3, se seleccionaron los ratones en forma aleatoria con base en los volúmenes de los tumores, en los grupos de tratamiento (n = 9). A los animales se les administró en forma intravenosa el compuesto Ilc o SB-715992. El paclitaxel se administró a razón de 30 mg/kg en forma intraperitoneal. Todos se dosificaron en un programa q4d x 3. (Izquierda) Eficacia / volúmenes tumorales de los grupos de tratamiento vs días después del inicio de la dosificación; (Derecha) Porcentaje de cambio del peso corporal en relación con los pesos iniciales el día de la selección aleatoria / inicio de la dosificación. El compuesto Ilc a razón de 1,25 mg/kg fue estadísticamente diferente del grupo con vehículo el día 11 (*p lt; 0,05, ANOVA / Prueba de Tukey).

Figura 7. Eficacia del compuesto la administrado en un programa de dosificación cada 4 días, 3 veces (q4d x 3) en el modelo de xenoinjerto de tumor KB8.5. Se establecieron tumores KB8.5 en ratones nu/nu atímicos hembra (Charles River Laboratories) mediante inyección subcutánea de 5 x 106 células en 0,2 mL de una relación 1:1 de HBSS y MatrigelMR en el costado derecho de cada ratón. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 285 mm3, se seleccionaron los ratones en forma aleatoria con base en los volúmenes de los tumores, en los grupos de tratamiento (n = 10). A los animales se les administró en forma intravenosa el compuesto la o SB-715992. El paclitaxel se administró a razón de 30 mg/kg en forma intraperitoneal. Todos se dosificaron en un programa q4d x 3. (Izquierda) Eficacia / volúmenes tumorales de los grupos de tratamiento vs días después del inicio de la dosificación; (Derecha) Porcentaje de cambio del peso corporal en relación con los pesos iniciales el día de la selección aleatoria / inicio de la dosificación. Ninguno de los grupos fue estadísticamente diferente del grupo con vehículo (ANOVA en Rangos).

Modalidades de la invención

A. Definiciones y visón de conjunto

Se debe entender que la terminología empleada en la presente invención tiene el propósito de describir las forma de realización particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Se debe observar que, como se utilizan en la presente y en las reivindicaciones, las formas en singular quot;un, unaquot;, “y” y quot;el, laquot; incluyen los referentes en plural, a menos que el contexto claramente dictamine otra cosa. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que se presentan más adelante, se hará referencia a una cantidad de términos que serán definidos por tener los siguientes significados:

Como se utiliza en la presente invención, quot;alquiloquot; se refiere a los grupos hidrocarbilo alifáticos saturados monovalentes de cadena recta, ramificada, o cíclica, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, y más

preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. Este término es ejemplificado por grupos tales como metilo, etilo, npropilo, isopropilo, isobutilo, n-butilo, ter-butilo, n-pentilo, y similares.

El término “alquilo lineal” se refiere a un grupo alquilo que no está ramificado.

“Alquilo sustituidoquot; se refiere a un grupo alquilo que tiene uno o más sustituyentes, con frecuencia de 1 a 4, y de preferencia de 1 a 2 sustituyentes. Los sustituyentes adecuados para los grupos alquilo se seleccionan a partir del grupo que consiste de alcoxi sustituido o no sustituido, acilo sustituido o no sustituido, aciIamino sustituido o no sustituido, aciloxi sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido, amino acilo sustituido o no sustituido, arilo, arilo sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido, ciano, halógeno, hidroxilo, nitro, carboxilo, oxo, hidroxi-imino, ésteres C1 - C4 alcoxi-imino-carboxilo sustituidos o no sustituidos, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, espiro-cicloalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, -SO2-aIquiIo, -SO2aIquiIo sustituido, en donde dichos sustituyentes se definen en la presente invención. Los sustituyentes preferidos para los grupos alquilo incluyen alcoxi, hidroxi, halógeno que es de preferencia F o Cl, ciano, oxo, amino sustituido o no sustituido, aciloxi sustituido o no sustituido, y aciIamino sustituido o no sustituido.

EI término “haloalquilo” se refiere a un grupo alquilo en donde cuando menos un átomo de hidrógeno es reemplazado con un átomo de halógeno. En una forma de realización, el término se refiere a fluorometilo, difluorometilo o trifluorometilo, y similares.

El término “hidroxialquilo” se refiere a un grupo alquilo en donde cuando menos un átomo de hidrógeno es reemplazado con un grupo hidroxilo. En una forma de realización, el término se refiere a hidroximetilo, 1 o 2- hidroxietilo, 1, 2, o 3-hidroxipropilo, y similares.

“Alquileno” se refiere a grupos hidrocarbilo alifáticos saturados divalentes que tienen de preferencia de 1 a 5, y de una manera mas preferible de 1 a 3 átomos de carbono, los cuales son de cadena recta o ramificada. Este término es ejemplificado por grupos tales como metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), n-propileno (-CH2CH2CH2-), isopropileno (-CH2CH(CH3)-) y similares. “Alquileno sustituido” se refiere a un grupo alquileno que tiene uno o más sustituyentes, de preferencia de 1 a 4, y de una manera muy preferible de 1 a 2 sustituyentes seleccionados a partir de los sustituyentes adecuados para los grupos alquilo.

“Alcoxiquot; se refiere al grupo quot;alquiI-O-quot; el cual incluye, a manera de ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi, nbutoxi, ter-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi y similares.

“Alcoxi sustituidoquot; se refiere al grupo quot;aIquiI-O- sustituidoquot;.

“Aciloquot; se refiere a los grupos H-C(O)-, alquil-C(O)-, alquil-C(O)- sustituido, aIqueniI-C(O)-, aIqueniI-C(O)- sustituido, alquinil-C(O)-, alquinil-C(O)- sustituido, cicloalquil-C(O)-, cicloalquil-C(O)- sustituido, aril-C(O)-, aril-C(O)- sustituido, heteroaril-C(O)-, heteroaril-C(O)- sustituido, heterocíclico-C(O)-, y heterocíclico-C(O)- sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente invención.

“Aminoaciloquot; se refiere al grupo -C(O)NRR en donde cada R se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, y heterocíclico sustituido, y en donde dos grupos R se pueden unir para formar, junto con el átomo de nitrógeno con el que están unidos, un anillo heterocíclico o heterocíclico sustituido; en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente invención. En donde dos grupos R se unen para formar un anillo, con frecuencia es un anillo de 5 a 6 miembros que está opcionalmente sustituido como se permite de acuerdo con los sustituyentes que pueden estar sobre los grupos R; con frecuencia se seleccionan a partir de pirrolidina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, y piperazina.

“Aciloxiquot; se refiere a los grupos alquil-C(O)O-, alquiI-C(O)O- sustituido, alquenil-C(O)O-, alquenil-C(O)O- sustituido, alquinil-C(O)O-, alquinil-C(O)O- sustituido, aril-C(O)O-, aril-C(O)O- sustituido, cicloalquil-C(O)O-, cicloalquil-C(O)Osustituido, heteroaril-C(O)O-, heteroaril-C(O)O- sustituido, heterocíclico-C(O)O-, y heterocíclico-C(O)O- sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente invención.

“Oxiaciloquot; o “carboxil éster” se refieren a los grupos -C(O)O-aIquilo, -C(O)O-aIquilo sustituido, -C(O)O-alqueniIo, C(O)O-alquenilo sustituido, -C(O)O-alquinilo, -C(O)O-alquinilo sustituido, -C(O)O-arilo, -C(O)O-ariIo sustituido,

C(O)O-cicloalquilo, -C(O)O-cicloalquilo sustituido, -C(O)O-heteroarilo, -C(O)O-heteroarilo sustituido, -C(O)Oheterocíclico, y -C(O)O-heterocíclico sustituido, en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente invención.

“Alqueniloquot; se refiere a los grupos alquenilo que tienen de 2 a 6 átomos de carbono, y de preferencia de 2 a 4 átomos de carbono, y que tienen cuando menos 1, y de preferencia de 1 a 2 sitios de insaturación de alquenilo. Estos grupos son ejemplificados por vinilo, alilo, but-3-en-1-ilo, y similares.

“Alquenilo sustituido” se refiere a los grupos alquenilo que tienen uno o más, de preferencia de 1 a 4 sustituyentes, y de una manera muy preferible 1 a 2 sustituyentes. Los sustituyentes adecuados incluyen aquéllos descritos para los grupos alquilo en la presente invención.

“AlquiniIoquot; se refiere a los grupos alquinilo que tienen de 2 a 6 átomos de carbono, y de preferencia de 2 a 3 átomos de carbono, y que tienen cuando menos 1, y de preferencia de 1 a 2 sitios de insaturación de alquinilo.

“AlquiniIo sustituidoquot; se refiere a los grupos alquiniIo que tienen uno o más, de preferencia de 1 a 4 sustituyentes, y de una manera muy preferible de 1 a 2 sustituyentes. Los sustituyentes adecuados incluyen aquéllos descritos como sustituyentes para los grupos alquilo en la presente invención. “Ciano” se refiere al grupo -CN.

“Amino” se refiere al grupo -NH2.

“Amino sustituido” se refiere al grupo -NR'R’’, en donde R’ y R’’ se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, -SO2-aIquilo, -SO2-alquiIo sustituido, y en donde R’ y R’’ se unen opcionalmente, junto con el átomo de nitrógeno enlazado a los mismos, para formar un grupo heterocíclico o heterocíclico sustituido; en el entendido de que R’ y R’’ no son ambos hidrógeno. Cuando R’ es hidrógeno y R’’ es alquilo, el grupo amino sustituido algunas veces es denominado en la presente invención como alquilamino. Cuando R’ y R’’ son alquilo, el grupo amino sustituido algunas veces es denominado en la presente invención como dialquilamino. Cuando se hace referencia a un amino monosustituido, esto significa que ya sea R’ o R’’ es hidrógeno pero no ambos. Cuando se hace referencia a un amino disustituido, esto significa que ni R’ ni R’’ es hidrógeno.

“Acilaminoquot; se refiere a los grupos -NRC(O)alquiIo, -NRC(O)-aIquiIo sustituido, NRC(O)cicloalquilo, NRC(O)cicloalquilo sustituido, -NRC(O)alqueniIo, -NRC(O)alquenilo sustituido, -NRC(O)alquinilo, NRC(O)alquiniIo sustituido, -NRC(O)arilo, -NRC(O)arilo sustituido, -NRC(O)heteroarilo, -NRC(O)heteroariIo sustituido, -NRC(O)heterocíclico, y -NRC(O)-heterocíclico sustituido, en donde R es hidrógeno o alquilo, y en donde alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquiniIo, alquiniIo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definen en la presente invención.

“Nitro” se refiere al grupo -NO2.

“Ciano” se refiere al grupo -CN.

“Ariloquot; o quot;Arquot; se refiere a un grupo carbocíclico aromático monovalente de 6 a 14 átomos de carbono, que tiene un solo anillo (por ejemplo, fenilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, naftilo o antrilo), en donde los anillos condensados pueden o no ser aromáticos (por ejemplo, 2-benzoxazolinona, 2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-on-7-ilo, y similares), en el entendido de que el punto de unión está en un átomo de carbono aromático. Los arilos preferidos incluyen fenilo y naftilo.

“Arilo sustituidoquot; se refiere a los grupos arilo que están sustituidos con uno o más, de preferencia de 1 a 3 sustituyentes, y de una manera muy preferible de 1 a 2 sustituyentes. Los sustituyentes adecuados incluyen hidroxilo, acilo, acilamino, aciloxi, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquiniIo sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, arilo, arilo sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido, carboxilo, carboxil ésteres, ciano, tiol, tioalquilo, tioalquilo sustituido, tioarilo, tioarilo sustituido, heterotioarilo, heterotioarilo sustituido, tiocicloalquilo, tiocicloalquilo sustituido, tioheterocíclico, tioheterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, halógeno, nitro, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, heteroariloxi, heteroariloxi sustituido, heterocicliloxi, heterocicliloxi sustituido, amino sulfonilo (NH2-SO2-), y amino sulfonilo sustituido.

“Ariloxiquot; se refiere al grupo aril-O- que incluye, a manera de ejemplo, fenoxi, naftoxi, y similares.

“Ariloxi sustituidoquot; se refiere a los grupos aril-O-sustituidos.

“Benciloquot; se refiere al grupo -CH2-fenilo.

“Arilmetilo” se refiere al grupo -CH2-arilo.

“Carboxilo” se refiere a -COOH o sales del mismo.

“Carboxil éster” se refiere a un grupo que tiene la fórmula -COOH, en donde R es alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo, alquiniIo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, o heteroarilalquilo. Con frecuencia, R es un grupo alquilo C1 - C4 opcionalmente sustituido, tal como metilo, etilo, isopropilo, o metoxietilo.

“Cicloalquiloquot; se refiere a grupos alquilo cíclicos de 3 a 10 átomos de carbono que tienen anillos cíclicos individuales

o múltiples, incluyendo, a manera de ejemplo, adamantilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo y similares.

“Espirocicloalquilo” se refiere a grupos cíclicos de 3 a 10 átomos de carbono, que tienen un anillo de cicloalquilo con una unión espiro (la unión formada por un solo átomo, que es el único miembro común de los anillos) como se ejemplifica mediante la siguiente estructura, en donde las dos valencias abiertas se conectan entre sí para formar un anillo:

“Cicloalquilo sustituidoquot; se refiere a un grupo cicloalquilo, que tiene de 1 a 5 sustituyentes seleccionados a partir del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, oxo (=O), tioxo (=S), alcoxi, alcoxi sustituido, acilo, aciIamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, arilo, arilo sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido, ciano, halógeno, hidroxilo, nitro, carboxilo, carboxil ésteres, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, y heterocíclico sustituido.

“Haloquot; o quot;halógenoquot; se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo, y de preferencia es flúor o cloro.

“Hidroxiquot; se refiere al grupo -OH.

“Oxo” se refiere al grupo =O.

“Heteroariloquot; se refiere a un grupo aromático que tiene de 5 a 10 átomos en el anillo, incluyendo de 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre como miembros del anillo. Estos grupos heteroarilo pueden tener un solo anillo (por ejemplo, piridinilo o furilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, indolizinilo o benzotienilo), en donde los anillos condensados pueden o no ser aromáticos y/o contener un heteroátomo, en el entendido de que el punto de unión es a través de un átomo del grupo heteroarilo aromático. En una forma de realización, el(los) átomo(s) de nitrógeno y/o de azufre del anillo del grupo heteroarilo están opcionalmente oxidados, para proporcionar las fracciones N-óxido (N

O) sulfinilo o sulfonilo. Los heteroarilos preferidos incluyen piridinilo, pirrolilo, indolilo, tiofenilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazoIiIo, isotiazolilo, imidazolilo, triazoIiIo, y furanilo.

“HeteroariIo sustituido” se refiere a los grupos heteroarilo que están sustituidos con de 1 a 3 sustituyentes, de preferencia 1 o 2 sustituyentes, seleccionados a partir del mismo grupo de sustituyentes definidos para arilo sustituido.

“Heteroarilo que contiene nitrógenoquot; y quot;heteroarilo sustituido que contiene nitrógenoquot; se refieren a los grupos heteroarilo y a los grupos heteroarilo sustituido que comprenden cuando menos un átomo de nitrógeno del anillo, y que comprenden opcionalmente otros heteroátomos tales como azufre, nitrógeno, u oxígeno, y similares como miembros del anillo.

“Heteroariloxiquot; se refiere al grupo -O-heteroarilo, y quot;heteroariloxi sustituidoquot; se refiere al grupo -O-heteroarilo sustituido, en donde heteroarilo y heteroarilo sustituido son como se definen en la presente invención.

“Heterocicloquot; o quot;heterocíclicoquot; o quot;heterocicloalquiloquot; o quot;heterocicliloquot; se refieren a un grupo saturado o insaturado que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados, incluyendo sistemas anulares espiro, fusionados, unidos a través de un puente o espiro, de 3 a 10 átomos por anillo, incluyendo de 1 a 4 heteroátomos seleccionados a partir del grupo que consiste en nitrógeno, azufre y oxígeno como miembros del anillo; en los sistemas de anillos fusionados, uno o más de los anillos pueden ser cicloalquilo, arilo o heteroarilo, en el entendido de que el punto de unión es a través del anillo heterocíclico. En una forma de realización, los átomos de nitrógeno y/o de azufre del grupo heterocíclico están opcionalmente oxidados para proporcionar las fracciones de N-óxido, sulfinilo, sulfonilo.

“Heterocíclico sustituidoquot; o quot;heterocicloalquilo sustituidoquot; o quot;heterociclilo sustituidoquot; se refiere a los grupos heterociclilo que están sustituidos con uno o más, y de preferencia de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados a partir de los sustituyentes descritos en la presente invención. Los sustituyentes adecuados incluyen aquéllos descritos en la presente invención para los grupos alquilo y cicloalquilo.

Los ejemplos de heterociclilos y heteroarilos incluyen, pero no se limitan a, azetidina, pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, dihidroindol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, quinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazol, fenazina, isoxazol, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, ftalimida, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]-tiofeno, tiazol, tiazolidina, tiofeno, benzo[b]tiofeno, morfolinilo, tiomorfolinilo (también denominado como tiomorfolinilo), 1,1-dioxotiomorfolinilo, piperidinilo, pirrolidina, tetrahidrofuranilo, y similares.

“Heterocíclico que contiene nitrógenoquot; y quot;heterocíclico sustituido que contiene nitrógeno” se refieren a los grupos heterocíclicos y a los grupos heterocíclicos sustituidos que comprenden cuando menos un átomo de nitrógeno del anillo, y que comprenden opcionalmente otros heteroátomos como átomos del anillo seleccionados a partir de azufre, oxígeno y similares.

“Tiolquot; se refiere al grupo -SH.

“Alquiltioquot; o quot;tioalcoxiquot; se refieren al grupo -S-alquilo.

“Alquiltio sustituido“ o quot;tioalcoxi sustituidoquot; se refieren al grupo -S-aIquilo sustituido.

“Ariltioquot; se refiere al grupo -S-arilo, en donde arilo se definió anteriormente.

“Ariltio sustituidoquot; se refiere al grupo -S-ariIo sustituido, en donde arilo sustituido se definió anteriormente.

“Heteroariltio” se refiere al grupo -S-heteroarilo, en donde heteroarilo es como se definió anteriormente.

“Heteroariltio sustituido” se refiere al grupo -S-heteroarilo sustituido, en donde heteroarilo sustituido se definió anteriormente.

“Heterocíclicotioquot; se refiere al grupo -S-heterocíclico, y quot;heterocíclicotio sustituido“ se refiere al grupo -S-heterocíclico sustituido, en donde heterocíclico y heterocíclico sustituido son como se definió anteriormente.

“Heterocicliloxiquot; se refiere al grupo heterocicIiI-O-, y “heterocicliloxi sustituidoquot; se refiere al grupo heterociclilo-Osustituido en donde heterociclilo y heterociclilo sustituido son como se definió anteriormente.

“Cicloalquiltioquot; se refiere al grupo -S-cicloalquilo, y “cicloalquiItio sustituidoquot; se refiere al grupo -S-cicloalquilo sustituido, en donde cicloalquilo y cicloalquilo sustituido son como se definió anteriormente.

“Actividad biológicaquot;, como se utiliza en la presente invención, se refiere a una concentración inhibidora cuando se prueba en cuando menos uno de los ensayos expuestos en los Ejemplos 1 a 13.

Como se utiliza en la presente invención, el término quot;sales farmacéuticamente aceptables“ se refiere al ácido o a las sales de metales alcalinotérreos no tóxicos de los compuestos de la fórmulas (ll). Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos de la fórmulas (ll), o por haciendo reaccionar por separado las funciones básica o ácida con un ácido o base orgánicos o inorgánicos adecuados, respectivamente. Las sales farmacéuticamente aceptables representativas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, camforato, camforsulfonato, digluconato, ciclopentanopropionato, dodecil sulfonato, etano sulfonato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hipurato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivaloato, propionato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, y undecanoato. También, los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilo, tales como cloruros, bromuros, y yoduros de metilo, etilo, propilo, y butilo; sulfatos de dialquilo tales como

sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo, y diamilo, haluros de cadena larga, tales como cloruros, bromuros y yoduros de deciIo, IauriIo, miristilo y estearilo; haluros de arilalquilo como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. De esta forma se obtienen productos solubles o dispersables en agua o en aceite.

Ejemplos de los ácidos que se pueden emplear para formar las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, hipúrico, láctico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido metanosulfónico, ácido succínico y ácido cítrico. Las sales de adición básica se pueden preparar in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos de fórmula (ll), o por separado mediante la reacción de fracciones de ácido carboxílico con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, o con amoniaco, o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, cationes basados en los metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como las sales de sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y similares, así como los cationes de amonio, de amonio cuaternario, y de amina, incluyendo, pero sin limitarse a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina, y similares. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición básica incluyen dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares.

Como se utiliza en la presente invención, el término “éster farmacéuticamente aceptable” se refiere a ésteres que se hidrolizan in vivo e incluyen aquéllos que se descomponen en el cuerpo humano para liberar el compuesto progenitor o una sal del mismo. Los grupos éster adecuados incluyen, por ejemplo, aquéllos derivados a partir de los ácidos carboxílicos alifáticos farmacéuticamente aceptables, en particular los ácidos alcanoico, alquenoico, cicloalcanoico, y alcanodioico, en donde cada fracción alquilo o alquenilo convenientemente no tiene más de 6 átomos de carbono. Los ejemplos representativos de los ésteres particulares incluyen, pero no se limitan a, formatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos y etilsuccinatos.

El término “profármaco farmacéuticamente aceptablequot;, como se utiliza en la presente invención, se refiere a aquellos profármacos de los compuestos de la presente invención que, dentro del alcance de un buen juicio médico, son adecuados para utilizarse en contacto con los tejidos de los seres humanos y de los animales inferiores sin una indebida toxicidad, irritación, respuesta alérgica, y similares, de una forma adecuada con una relación razonable de beneficio/riesgo, y que son efectivos para el pretendido, así como las formas zwitteriónicas, donde sea posible, de los compuestos de la invención. El término “profármaco” se refiere a los compuestos que se transforman rápidamente in vivo para proporcionar el compuesto progenitor de la fórmula anterior, por ejemplo mediante hidrólisis en la sangre. Se proporciona una discusión en T. Higuchi y V. Stella, PRO-DRUGS AS NOVEL DELIVERY SYSTEMS, Volumen 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Edward B. Roche, ed., BIOREVERSIBLE VEHICLES IN DRUG DESIGN, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Como se utilizan en la presente invención “agentes contra el cáncerquot; o quot;agente para el tratamiento de cáncerquot; o “compuestos terapéuticos contra el cáncer” se refieren a agentes que incluyen, a manera de ejemplo solamente, los agentes que inducen apoptosis; polinucleótidos (por ejemplo, ribozimas); polipéptidos (por ejemplo, enzimas); fármacos; miméticos biológicos; alcaloides; agentes alquilantes; antibióticos antitumorales; antimetabolitos; hormonas; compuestos de platino; anticuerpos monoclonales; anticuerpos monoclonales conjugados con fármacos contra el cáncer, toxinas, y/o radionúclidos; modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferones e interleucinas, etc.); agentes de inmunoterapia adoptiva; factores de crecimiento hematopoyéticos; agentes que inducen la diferenciación de las células tumorales (por ejemplo, ácido retinoico todo trans, etc.); reactivos de terapia genética; reactivos para terapia antisentido y nucleótidos; vacunas tumorales; inhibidores de angiogénesis, y similares. Otros numerosos agentes están también dentro de la esfera de una persona capacitada en el arte.

Se entiende que en todos los grupos sustituidos definidos anteriormente, no se pretende que los polímeros a los que se llega mediante la definición de los sustituyentes con sustituyentes adicionales para ellos mismos (por ejemplo, arilo sustituido que tiene un grupo arilo sustituido como sustituyente, el cual por sí mismo está sustituido con un grupo arilo sustituido, etc.) se incluyan en la presente invención. En tales casos, el número máximo de estos sustituyentes es de tres. Es decir, que cada una de las definiciones anteriores está restringida por una limitación de las mismas, por ejemplo, los grupos quot;arilo sustituidoquot; están limitados a arilo sustituido-(arilo sustituido)-arilo sustituido.

De una manera similar, se entiende que las definiciones anteriores no pretenden incluir patrones de sustitución no permisibles (por ejemplo, metilo sustituido con 5 grupos flúor, o un grupo hidroxilo sobre una insaturación etilénica o acetilénica, o un grupo divalente, tal como oxo, sobre un anillo de fenilo). Estos patrones de sustitución no permisibles son bien conocidos por la persona capacitada en el arte.

Los compuestos de esta invención pueden exhibir estereoisomerismo en virtud de la presencia de uno o más centros asimétricos o quirales en los compuestos. La presente invención contempla cada uno de los diferentes estereoisómeros y mezclas de los mismos. Algunos de los compuestos de la invención comprenden átomos de

carbono asimétricamente sustituidos. Estos átomos de carbono asimétricamente sustituidos pueden dar como resultado los compuestos de la invención que comprenden las mezclas de estereoisómeros en un átomo de carbono asimétricamente sustituido particular, o estereoisómeros individuales. Como resultado, se incluyen en la presente invención mezclas racémicas, mezclas de diastereómeros, enantiómeros individuales, así como los diastereómeros 5 individuales de los compuestos de la invención. Los términos configuración quot;Squot; y quot;Rquot;, como se utilizan en la presente invención, son como se definen por parte de la IUPAC 1974 quot;RECOMMENDATIONS FOR SECTION E, FUNDAMENTAL STEREOCHEMISTRYquot;, Pure Appl. Chem. 45: 13 - 30, 1976. Se pueden obtener los enantiómeros deseados mediante síntesis quiral a partir de los materiales de partida quirales comercialmente disponibles, mediante métodos bien conocidos en el arte, o se pueden obtener a partir de las mezclas de enantiómeros,

10 mediante la separación del enantiómero deseado, empleando las técnicas conocidas. Para algunas forma de realización de los compuestos de la fórmula (ll), se ilustra un solo isómero para al menos un estereocentro en los compuestos; en donde se ilustra un solo isómero de un estereocentro particular, la estereoquímica relativa absoluta ilustrada es una forma de realización preferida. Donde no se indica una estereoquímica específica, un estereocentro puede estar en la configuración R o S, o puede ser cualquier mezcla de los dos, incluyendo una mezcla racémica.

15 Los compuestos de esta invención también pueden exhibir isomerismo geométrico. Los isómeros geométricos incluyen las formas cis y trans de los compuestos de la invención que tienen dobles enlaces, tales como las fracciones de alquenilo, oxima, imina, o alquenilenilo. La presente invención comprende los isómeros geométricos y estereoisómeros individuales, y mezclas de los mismos.

Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante los métodos conocidos en el arte, y además como se

20 describe en la presente invención. Por ejemplo, los métodos para la elaboración de los compuestos de la fórmula (II) se describen en la solicitud publicada PCT/US2005/022062 (publicación internacional número WO O6/002236) y en las solicitudes de patentes de los Estados Unidos correspondientes. En la presente invención se proporcionan ejemplos de métodos adicionales de síntesis aplicables a la preparación de los compuestos de la fórmula (II).

Un ejemplo de la preparación de ciertos inhibidores de KSP de la Fórmula II, se muestra a continuación, en el 25 Esquema 1.

5 Los compuestos 1.1 y 1.2 se hicieron reaccionar con K2CO3 en acetona que contenía KI. Se encontró que el uso de K2CO3 / acetona es superior a Cs2CO3 / etanol, debido al menor costo del K2CO3 y debido a que el compuesto 1.3 se precipitó a partir de la solución de acetona después de la adición de agua, eliminando la necesidad de un procesamiento de la fracción acuosa para la extracción del 1.3. Se sometió luego a reflujo el ceto éster 1.3 con acetato de amonio (NH4OAc) en tolueno, para producir el imidazol 1.4. Se encontró que el uso de tolueno produce

10 mayores rendimientos del imidazol en comparación con el reflujo en xilenos con una trampa Dean Stark, debido a que el último método condujo a la remoción del acetato de amonio de la mezcla de reacción en la trampa. La reacción de 1.4 con bromuro de bencilo y K2CO3 en dimetiI formamida produjo 1.5, el cual se puede precipitar de la solución de la reacción después de la adición de agua. El tratamiento de 1.5 con metanol y cloruro de acetilo produjo la sal de HCI de 1.6, que fue luego convertida en su base libre cuando se tituló con una solución de NaOH / metanol.

15 Se encontró que la formación del 1.6 a partir de 1.1 y 1.2 procedió con un rendimiento del 81% con una alta pureza (gt; 97%, como se determinó mediante HPLC) y una alta pureza óptica (gt;99% de exceso enantiomérico).

Se puede hacer reaccionar el compuesto 1.6 con un aldehído HC(O)Rb bajo condiciones de aminación reductiva, o con Y-Rb, en donde Y es un grupo saliente, para introducir un grupo alquilo sobre el nitrógeno de la amina, que luego se puede acilar para proporcionar los compuestos de fórmula (II). El Esquema 2 ilustra la preparación de un aldehído

20 que se puede utilizar en la etapa de aminación reductiva para preparar los compuestos de la fórmula (II), y en particular los compuestos de fórmula lla o llb o IIc.

5 Después de Ia aminación reductiva, se utilizan agentes y condiciones de acilación conocidos para acilar Ia amina secundaria, con el objeto de proporcionar los compuestos de la fórmula (II). El Esquema 3 ilustra la aminación reductiva para proporcionar Vllla. La acilación de la amina, seguida por la desprotección de la ftalimida y la remoción de un grupo protector sobre el grupo hidroxilo libre, proporcionan el compuesto lla. Los grupos protectores adecuados para el hidroxilo incluyen, por ejemplo, benciI éteres, que se pueden remover mediante hidrogenólisis, y

10 los carbonatos de alquilo, que se pueden remover selectivamente con reactivos tales como yoduro de trimetilsililo. La masa medida del compuesto lla, determinada mediante espectrometría de masas de alta resolución, fue de 503,2609 para el ion [M+H]+, que es consistente con la fórmula molecular C27H33N4O2F3.

ESQUEMA 3

Este compuesto se caracteriza además por su espectro IR, que tiene bandas de absorción a 3500-2700 (br), 1641, 1591, 1508, 1491, 1162, y 1088 cm-1. Se caracteriza además mediante los siguientes datos de RMN:

#: 5 1H [ppm] n 1H Mult* # 5 13C [ppm]

1: 7,84 1 d 1 172,9

2: 7,74 1 m 2** 158,4

3: 7,38 2 t 3** 154,8

4: 7,34 - 7,27 4 m 4 144,4

5: 7,09 1 m 5 136,7

6: 5,71 1 s 6 131,6

7: 5,16 2 AB 7 128,5

8: 4,65 1 s, ancha 8 127,8

9: 4,21 2 AB 9 127,4

10: 3,72 2 d, t 10** 123,5

11: 3,55 1 t 11** 121,0

12: 2,41 1 m 12** 117,2

13: 1,43 2 s, ancha 13** 113,6

14: 0,96 1 m 14** 112,4

15: 0,91 3 s 15** 87,2

16: -0,77 1 m 16 59,9

17: 53,1

18**: 49,1

19: 48,5

20: 41,7

21: 37,1

22: 32,2

23: 27,3

*Multiplicidad AB (AB cuarteto), b (ancha), d (doblete), dd (doblete de dobletes), m (multiplete), s (singulete), t (triplete), **Cambio de punto medio del multiplete acoplado con 19F,

Observe que la estereoquímica absoluta de los centros quirales en esta molécula se identifica con base en la quiralidad de los materiales de partida o intermedios conocidos. Los datos de HPLC y RMN apoyan la conclusión de 5 que el proceso anterior proporciona el compuesto como un solo isómero.

Empleando los mismos métodos, se preparó el compuesto Ilc mediante el uso de un agente de acilación alfahidroxilo quiral conocido. Éste exhibió el espectro de masas esperado para la estructura asignada, incluyendo un ion molecular M+H con m/z = 517,3, y una HPLC analítica Rt = 3,70 minutos (fase inversa). Los datos de LC/ESI-MS se registraron utilizando un espectrómetro de masas Waters LCT Premier con una fuente de ionización por10 electroaspersión doble, y un cromatógrafo líquido Agilent 1100. La resolución del sistema de MS fue de aproximadamente 12000 (definición de FWHM). La separación mediante HPLC se llevó a cabo con una velocidad de flujo de 1,0 mL / minuto con un gradiente desde 10% hasta 95% en 2,5 minutos. Se utilizó formato de amonio 10 mM como aditivo modificador en la fase acuosa. Se utilizó la Sulfadimetoxina (Sigma; molécula protonada m/z 311,0814) como referencia, y se adquirió a través del canal LockSprayMR cada tercer barrido. Se encontró que la precisión de

15 masas del sistema es de lt; 5 ppm.

Los agentes de acilación y ácidos adecuados para la etapa de acilación incluyen haluros de acilo, anhídridos, y ácidos. Las condiciones adecuadas de acoplamiento de amida incluyen el uso de una variedad de reactivos de acoplamiento de amida para formar el enlace amida, tales como las carbodiimidas N,N’-diciclohexil-carbodiimida (DCC), N,N’-diisopropil-carbodiimida (DIPCDI), y 1-etiI-3-(3’-dimetiIam¡nopropil)-carbodiimida (EDCI). Las

20 carbodiimidas se pueden utilizar junto con aditivos tales como dimetilaminopiridina (DMAP) o benzotriazoles tales como 7-aza-1-hidroxibenzotriazol (HOAt), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), y 6-cloro-1-hidroxibenzotriazol (Cl-HOBt); las condiciones para tales formaciones enlazadas a amida son bien conocidas en el arte.

Reactivos de acoplamiento de amida adicionales también incluyen los reactivos basados en uronio y fosfonio. Las sales de uronio incluyen N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]-piridin-1-il25 metilen]-N-metil-uronio (HATU), N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(1H-benzotriazoI-1-il)-(dimetilamino)-metilen]-Nmetil-uronio (HBTU), N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(1H-6-cloro-benzotriazol-1-iI)-(dimetiIamino)-metilen]-Nmetil-uronio (HCTU), N-óxido de tetrafluoroborato de N-[(1H-benzotriazoI-1-il)-(dimetilamino)-metilen]-N-metil-uronio (TBTU), y N-óxido de tetrafluoroborato de N-[(1H-6-cIoro-benzotriazoI-1-il)-(dimetilamino)-metilen]-N-metil-uronio (TCTU). Las sales de fosfonio incluyen hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iI-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio (BOP),

30 hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1-iI-N-oxi-tris-(pirrolidino)-fosfonio (PyAOP), y hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iI-N-oxi-tris-(pirrolidino)-fosfonio (PyBOP).

La etapa de formación de amida se puede llevar a cabo en un solvente polar, tal como dimetilformamida (DMF), y también puede incluye una base orgánica, tal como diisopropiIetiIamina (DIEA) o dimetilaminopiridina (DMAP).

Los métodos para la selección, incorporación, y remoción de los grupos protectores adecuados para el hidroxilo durante la preparación de un compuesto de fórmula II son bien conocidos en el arte. Con base en el esquema de reacción anterior, los compuestos de la fórmula II son fácilmente preparados por una persona que tenga una experiencia ordinaria en la materia, que sepa cómo seleccionar materiales de partida adecuados para proporcionar los productos deseados.

Un “inhibidor de KSP” es un compuesto que es capaz de inhibir cualquier actividad medible de una proteína de huso de quinesina (KSP). De preferencia, un inhibidor de KSP tiene una lC50 de menos de 100 micromolar, más preferiblemente menos de 10 micromolar, y con frecuencia menos de 1 micromolar.

Una quot;enfermedad proliferativaquot; incluye cualquier enfermedad o condición que afecte a un vertebrado, que se caracteriza por células que proliferan en forma excesiva o indeseable. “Un método para el tratamiento de una enfermedad proliferativaquot;, de acuerdo con esta invención, incluye un método para el tratamiento (la inhibición) del crecimiento anormal de células, incluyendo las células transformadas, en un paciente que requiera de dicho tratamiento (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano), mediante la administración, de una manera concurrente o secuencial, de una cantidad efectiva de un inhibidor de KSP solo o en combinación con una cantidad efectiva de un agente quimioterapéutico y/o de radiación. El crecimiento anormal de células significa un crecimiento de células independiente de los mecanismos reguladores normales (por ejemplo, pérdida de inhibición por contacto), incluyendo el crecimiento anormal de células tumorales o de células benignas o malignas de otras enfermedades proliferativas.

Los términos quot;cáncerquot; y quot;cancerosoquot; se refieren, o describen, la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado.

“Tumorquot;, como se utiliza en la presente invención, se refiere a todo el crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. El término quot;tumor sólidoquot; se refiere a un cáncer o carcinoma de los tejidos corporales diferentes de la sangre, médula ósea, y sistema linfático. Los ejemplos de tumores sólidos pueden ser, pero no se limitan a, carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de piel, carcinoma de colon, carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma de hígado, carcinoma gástrico, cáncer de próstata, cáncer pancreático, carcinoma de células renales, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma cervical, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, y sarcomas.

Como se utiliza en la presente invención, el término quot;cáncer hematológicoquot; se refiere a un cáncer de la sangre, e incluye leucemia y trastornos Iinfoproliferativos malignos, entre otros. quot;Leucemiaquot; se refiere a un cáncer de la sangre, en donde se elaboran demasiados glóbulos blancos o glóbulos rojos sanguíneos, y, por consiguiente, inundan las otras partes que conforman la sangre, tales como las plaquetas y los glóbulos rojos sanguíneos normales. Se entiende que los casos de leucemia se clasifican como agudos o crónicos. Las células cancerosas en las leucemias agudas se bloquean en una etapa inmadura, y no obstante, continúan multiplicándose. En consecuencia, hay una gran acumulación de células inmaduras no funcionales, y la pérdida concomitante de células funcionales. Las leucemias crónicas progresan más lentamente, desarrollándose las células cancerosas hasta la madurez total. Adicionalmente, los glóbulos blancos pueden ser mielógenos o linfoideos. Por consiguiente, ciertas formas de leucemia pueden ser, a manera de ejemplo, leucemia linfocítica (o Iinfoblástica) aguda (LLA); leucemia mielógena aguda (LMA); leucemia linfocítica crónica (LLC); o leucemia mielógena crónica (LMC); y síndrome mielodisplásico. “Trastornos Iinfoproliferativos malignosquot; pueden referirse a un linfoma, tal como linfoma de Hodgkin, y linfoma no Hodgkin, o mieloma múltiple, entre otros.

Algunos tumores descritos en la presente invención pueden ser resistentes a diversos agentes terapéuticos. ‘Resistente’ significa que el cáncer no es sustancialmente afectado por un agente terapéutico en sus tasas de administración normales, o en tasas que son toleradas por el paciente. Una forma mayor de resistencia contra una variedad de agentes antineoplásicos involucra la función de un grupo de bombas de proteína de membrana que extruden estas moléculas citotóxicas. Las quot;bombas resistentes a múltiples fármacosquot; pueden referirse a la súperfamilia de las proteínas de Casete de Enlazamiento de ATP (ABC), presentes en los organismos desde las bacterias hasta los seres humanos. Las bombas transportadoras de ABC se localizan en la membrana plasmática de las células, o en la membrana de diferentes organelos celulares, y median la translocalización de diferentes moléculas a través de estas barreras. La mayoría de las bombas de ABC utilizan la energía de Ia hidrólisis del ATP para esta actividad de transporte (transportadores activos), pero algunas bombas forman canales de membrana específicos.

Numerosos estudios clínicos han revelado que el fenotipo de resistencia a múltiples fármacos en los tumores está asociado con la sobreexpresión de ciertas bombas de ABC, denominadas como proteínas resistentes a múltiples

fármacos (MDR). La resistencia a múltiples fármacos mediada por Ia glicoproteína P (denominada como P-gp, MDR1 o ABCB1), fue la primera que se descubrió (Juliano, R. L. y Ung, V., Biochim. Biophys. Acta, 455, 152 - 162 (1976); Chen, D. y colaboradores, Cell, 47, 381 - 389 (1986); Ueda, K. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3004 - 3008 (1987)), y probablemente todavía es el mecanismo más ampliamente observado en la resistencia clínica a múltiples fármacos (Endicott, J. A. y Ling, V., Annu. Rev. Biochem., 58,137 - 171 (1989); Higgins, C. E, Ann. Rev. Cell Biol., 8, 67 - 113 (1992); Gottesman, M. M. y Pastan, l., Annu. Rev. Biochem., 62, 385 - 427 (1993); Gottesman,

M. M. y colaboradores, Nat. Rev. Cancer, 2, 48 - 58 (2002)). Existen otras dos bombas de ABC, que han demostrado participar en la resistencia a múltiples fármacos de los tumores: la proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 (MRP1, ABCC1), y la proteína de resistencia a la mitoxantrona (MXR/BCRP, ABC G2) ((Gottesman, M. M. ibid, Cole,

S.P.c. y colaboradores, Science, 258, 1650 - 1654 (1992); Borst, P. y colaboradores, J. Natl. Cancer. Inst., 92, 1295 1302 (2000); Deeley, R. G. y Cole, S.P.c., Sem. Cancer Bio l., 8, 193 - 204 (1997); Litman, I y colaboradores, Cell. Mol. Life Sci., 58, 931 -959 (2001)). Adicionalmente, otras bombas de ABC humanas capaces de transportar activamente diferentes compuestos hacia fuera de las células, también pueden hacer parte en casos seleccionadosde resistencia a múltiples fármacos. Éstas incluyen ABCB4 (MDR3) y ABCB11 (P-gp hermana o BSEP), dos bombas que residen predominantemente en el hígado, con una función involucrada en la secreción de fosfatidil colina y ácidos biliares, respectivamente (Lecureur, V. y colaboradores, Toxicol., 152, 203 - 219 (2000); Paulusma, c.c. y colaboradores, Science, 271, 1126 - 1128 (1996); Paulusma, c. c. y colaboradores, Hepatology, 25, 1539 - 1542 (1997)). Se ha demostrado que la MDR3 transporta ciertos fármacos también (Smith, A. J. y colaboradores, J. Bio. Chem., 275, 23530 - 23539 (2000)). Además de MRP1, se han clonado cinco homólogos (MRP2 - MRP6). Definitivamente se demostró que la sobreexpresión de MRP2 (un transportador orgánico de aniones que también puede extrudir los compuestos hidrófobos) confiere el cáncer MDR9 (Kool, M y colaboradores, Cancer Res, 57, 3537

-: 3547 (1997)). MRP3, una bomba transportadora del conjugado orgánico, y MRP5, una bomba transportadora de nucleósidos, también son proteínas candidatas para causar ciertas formas de resistencia a fármacos (Borst, P. y colaboradores, ibíd.).

“Anticuerposquot; e quot;inmunoglobulinasquot; (lg) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos exhiben especificidad de enlace con un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto los anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno. Por ejemplo, los polipéptidos de la última clase son producidos en bajos niveles por el sistema linfático, y en mayores niveles por los mielomas.

La palabra quot;marcadorquot; cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente con el anticuerpo para generar un anticuerpo quot;marcadoquot;. El marcador puede ser detectable por si mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable. Los radionúclidos que pueden servir como marcadores detectables incluyen, por ejemplo, l-131, I-123, l-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, y Pd-109. El marcador también puede ser una entidad no radioactiva, tal como una toxina que sea detectable por sus actividades biológica

o bioquímica.

El término quot;antagonistaquot; se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe, o neutraliza parcial o completamente una actividad biológica de un objetivo nativo dado a conocer en la presente invención o la transcripción o traducción del mismo.

“Portadoresquot;, como se utilizan en la presente invención, incluyen portadores, excipientes, o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, que no son tóxicos para la célula o mamífero que están siendo expuestos a los mismos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con el pH regulado. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables comprenden reguladores tales como fosfato, citrato, succinato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contra iones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN, polietilén glicol (PEG), y Pluronic. La administración “en combinación conquot; uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. De preferencia, los agentes terapéuticos que se van a combinar en tales métodos están ambos presentes en niveles terapéuticamente relevantes de una manera simultánea en el cuerpo del sujeto tratado.

Una “célula huésped”, como se utiliza en la presente invención, se refiere a un microorganismo o a una célula eucariota o a una línea celular cultivada como una entidad unicelular que se puede utilizar, o que se ha utilizado, como un receptor para un vector recombinante o para otros polinucleótidos de transferencia, e incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula no necesariamente puede

ser completamente idéntica en la morfología o en el complemento genómico o de ADN total a la progenitora original, debido a mutaciones naturales, accidentales, o deliberadas.

“Tratamiento” se define en la presente invención como la aplicación o administración de un inhibidor de KSP a un sujeto, o la aplicación o administración de un inhibidor de KSP a un tejido aislado o a una línea celular de un sujeto, en donde el sujeto tiene un tumor sólido o cáncer hematológico, un síntoma asociado con un tumor sólido o cáncer hematológico, o una predisposición hacia el desarrollo de un tumor sólido o cáncer hematológico, en donde el propósito es sanar, curar, aliviar, liberar, alterar, remediar, aminorar, mejorar, o afectar el tumor sólido o el cáncer hematológico, cualquier de los síntomas asociados al tumor sólido o al cáncer hematológico, o la predisposición hacia el desarrollo del tumor sólido o cáncer hematológico. El sujeto puede ser un mamífero, y en algunas formas de realización, el sujeto es un ser humano. Con frecuencia, el sujeto es un ser humano que ha sido diagnosticado con cuando menos una de las condiciones descritas en la presente invención como adecuadas para el tratamiento con los compuestos y métodos de la invención. En las forma de realización específicas, el sujeto puede ser uno que tenga un cáncer que exprese una bomba de flujo de salida que promueva la resistencia a fármacos, tal como P-gp, o el sujeto puede ser uno que tenga un tumor que haya demostrado resistencia a fármacos como paclitaxel o SB715992.

Por “tratamiento” también se entiende la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende al inhibidor de KSP a un sujeto, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende al inhibidor de KSP a un tejido aislado o a una línea celular de un sujeto, que tenga un tumor sólido o cáncer hematológico, un síntoma asociado con un tumor sólido o cáncer hematológico, o una predisposición hacia el desarrollo de un tumor sólido o cáncer hematológico, en donde el propósito es sanar, curar, aliviar, liberar, alterar, remediar, aminorar, mejorar, o afectar el tumor sólido o el cáncer hematológico, cualquiera de los síntomas asociados del tumor sólido o del cáncer hematológico, o la predisposición hacia el desarrollo del tumor sólido o cáncer hematológico.

Por “actividad antitumoral” se entiende una reducción en el índice de proliferación o acumulación de células malignas, y por consiguiente, una declinación en el índice de crecimiento de un tumor existente o en un tumor que se presente durante la terapia, y/o la destrucción de células neoplásicas (tumorales) existentes o de células neoplásicas recién formadas, y por consiguiente, una disminución en el tamaño global de un tumor durante la terapia. La terapia con al menos un inhibidor de KSP provoca una respuesta fisiológica que es benéfica con respecto al tratamiento de tumores sólidos en un ser humano. La terapia con al menos un inhibidor de KSP provoca una respuesta fisiológica que es benéfica con respecto al tratamiento de tumores hematológicos en un ser humano. Se reconoce que los métodos de la invención pueden ser útiles en la prevención de crecimientos tumorales adicionales que se presenten durante la terapia.

De acuerdo con los métodos de la presente invención, se utiliza al menos un inhibidor de KSP, como se define en cualquier otra parte de la presente invención, para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto a un tumor sólido o cáncer hematológico. Por “respuesta terapéutica positiva” con respecto al tratamiento de cáncer, se entiende una mejora en la enfermedad en asociación con la actividad contra el cáncer de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, se puede observar un efecto antiproliferativo, la prevención de otros crecimientos tumorales, una reducción en el tamaño del tumor, una reducción en el número de células cancerosas, y/o una disminución en uno o más síntomas mediados por el estímulo de las células cancerosas. Por consiguiente, por ejemplo, una mejora en la enfermedad se puede caracterizar como una respuesta completa. Por “respuesta completa” se entiende una ausencia de enfermedad clínicamente detectable, con normalización de cualesquiera de los estudios radiográficos previamente anormales, de médula ósea, y de fluido cerebroespinal (FCE). Esta respuesta debe persistir durante al menos un mes después del tratamiento, de acuerdo con los métodos de la invención. Alternativamente, una mejora en la enfermedad se puede categorizar como una respuesta parcial. Por “respuesta parcial” se entiende al menos una disminución de aproximadamente el 50% en toda la carga tumoral medible (es decir, el número de células tumorales presentes en el sujeto), en ausencia de nuevas lesiones, y que persiste durante cuando menos un mes. Esta respuesta es aplicable a los tumores medibles solamente.

Se puede evaluar la respuesta del tumor por los cambios en la morfología del tumor (es decir, carga tumoral global, tamaño del tumor, y similares), empleando técnicas de cribado, tales como exploración con formación de imágenes de resonancia magnética (MRI), toma de imágenes radiográficas X, exploración tomográfica computarizada (CT), toma de imágenes bioluminiscentes, por ejemplo, toma de imágenes con Iuciferasa, toma de imágenes de exploración ósea, y muestreo de biopsia de tumor, incluyendo aspiración de médula ósea (AMO). Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que se está sometiendo a terapia con el inhibidor de KSP, puede experimentar el efecto benéfico de una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad.

Por “dosis o cantidad terapéuticamente efectivaquot; o “cantidad efectivaquot; se entiende una cantidad de inhibidor de KSP que, cuando se administra, provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con un tumor sólido o cáncer hematológico. Se reconoce que el método de tratamiento puede comprender una sola

administración de una dosis terapéuticamente efectiva, o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente efectiva del inhibidor.

El gen de la tirosina quinasa Bcr-Abl codifica una proteína de fusión, y es creado por la unión anormal de los genes BCR y ABL. Esta fusión se encuentra sobre el denominado cromosoma Filadelfia, causada por la translocalización recíproca t(9:22) que da como resultado la formación del gen de fusión Bcr-Abl, que provoca una expresión no regulada de la tirosina quinasa ABL. Se considera que la presencia del cromosoma Filadelfia es uno de los factores causantes tanto en LMC como en LLA (Abraham (2007) Community Oncology 4 (1) páginas 11 - 14). En la actualidad, la tirosina quinasa Bcr-Abl es el objetivo para una nueva clase de compuestos terapéuticos inhibidores de Bcr-Abl, tales como imatinib (Gleevec®, Novartis), dasatinib (Sprycel®, Bristol-Myers-Squibb), y nilotinib (AML107, Novartis). La tirosina quinasa Bcr-Abl actúa corriente arriba de la proteína KSP.

En algunas forma de realización preferidas, el inhibidor de KSP se administra en combinación con al menos otro “compuesto activo”, el cual puede ser una terapia contra el cáncer, incluyendo, pero sin limitarse a, cirugía, terapia de radiación, quimioterapia, terapia de citoquinas, u otro anticuerpo monoclonal pretendido para uso en el tratamiento del tumor sólido de interés, en donde la terapia adicional contra el cáncer se administra antes, durante, o posteriormente a la terapia inhibidora de KSP, y ambos agentes terapéuticos están presentes en niveles terapéuticos concurrentemente en el sujeto. Por consiguiente, cuando las terapias combinadas comprenden la administración del inhibidor de KSP en combinación con la administración de otro agente terapéutico, como con quimioterapia, terapia de citoquinas, u otro anticuerpo monoclonal, los métodos de la invención abarcan la administración conjunta, la utilización de formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde, de preferencia, hay un período de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen de una manera simultánea sus actividades terapéuticas. Cuando los métodos de la presente invención comprenden regímenes terapéuticos combinados, estas terapias se pueden suministrar de una manera simultánea, es decir, el inhibidor de KSP se administra de una manera concurrente, o dentro del mismo marco de tiempo, que la otra terapia contra el cáncer (es decir, las terapias están sucediendo de una manera concurrente, pero el inhibidor de KSP no se administra precisamente al mismo momento que la otra terapia contra el cáncer). Alternativamente, el inhibidor de KSP de la presente invención también se puede administrar antes, o posteriormente a la otra terapia contra el cáncer. La administración en secuencia de las diferentes terapias contra el cáncer se puede llevar a cabo independientemente de si el sujeto tratado responde al primer curso de la terapia para disminuir la posibilidad de remisión o recurrencia.

En algunas forma de realización de la invención, los inhibidores de KSP descritos en la presente invención se administran en combinación con quimioterapia o terapia de citoquinas, en donde el inhibidor de KSP y los agentes quimioterapéuticos o las citoquinas se pueden administrar en secuencia, en cualquier orden, o de una manera simultánea (es decir, concurrentemente o dentro del mismo marco de tiempo). Los ejemplos de los agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, CPT-11 (irinotecano), que se puede utilizar, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer colorrectal y de cáncer pulmonar de células no pequeñas; gemcitabina, que se puede utilizar, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de mama, y cáncer de ovario epitelial; y otros agentes quimioterapéuticos adecuados para el tratamiento de tumores sólidos. Las citoquinas de interés incluyen, pero no se limitan a, interferón alfa, interferón gamma, interleuquina 2 (IL-2), lL-12, lL-15, e lL-21, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), o las variantes biológicamente activas de estas citoquinas.

En otras forma de realización de la invención, los inhibidores de KSP descritos en la presente invención se administran en combinación con anticuerpos monoclonales pretendidos para el tratamiento del tumor sólido. Por consiguiente, por ejemplo, cuando el sujeto se está sometiendo a tratamiento para un cáncer gástrico o de colon, la terapia podría incluir la administración de cantidades efectivas de un inhibidor de KSP descrito en la presente invención, en combinación con la administración de cantidades efectivas de un anticuerpo monoclonal, tal como Erbitux® (también conocido como Cetuximab; lmClone Systems Incorporated, Nueva York, Nueva York, y Bristol Meyers Squibb, Princeton, Nueva Jersey). De una manera similar, cuando el sujeto se está sometiendo a tratamiento para cáncer colorrectal, la terapia podría incluir la administración de cantidades efectivas de un inhibidor de KSP, descrito en la presente invención, en combinación con la administración de cantidades efectivas del anticuerpo monoclonal humanizado AvastinaMR (también conocido como bevacizumab; Genentech, Inc., San Francisco, California), que se enlaza con, e inhibe, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), una proteína que tiene un papel crítico en la angiogénesis tumoral. De una manera alternativa, en un sujeto que se esté sometiendo al tratamiento para cáncer de mama, la terapia podría incluir la administración de cantidades efectivas de un inhibidor de KSP descrito en la presente invención, en combinación con una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal humanizado Herceptina® (también conocido como trastuzumab; Genentech, Inc., San Francisco, California). Otros ejemplos de anticuerpos monoclonales pretendidos para el tratamiento de tumores sólidos, que se pueden utilizar en combinación con los inhibidores de KSP de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-EGFR que dirige al receptor del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, IMC-C225 (lmClone Systems, Nueva York, Nueva York) (véase, por ejemplo, Mendelsohn y Baselga (2000) Oncogene 19: 6550 - 6565 y Solbach y colaboradores (2002) Int. J. Cancer 101: 390 - 394); un anticuerpo receptor de anti-IGF-1,

que dirige a la proteína receptora de IGF-1 (véase, por ejemplo, Maloney y colaboradores (2003) Cancer Res. 63: 5073 - 5083, y Hailey y colaboradores (2002) Mol. Cancer. Ther. 1: 1349 - 1353; un anticuerpo anti-MUC I, que se dirige al antígeno asociado con el tumor MUC1; anti-a5�1, anti-av�5, y anti-av�3, que dirigen estas integrinas respectivas, que regulan los procesos de adhesión y señalización celular involucrados en la proliferación y supervivencia celular (véase, por ejemplo, Laidler y colaboradores (2000) Acta Biochimica Polonica 47(4): 1159 1170, y Cruet-Hennequart y colaboradores (2003) Oncogene 22(11): 1688 - 1702), un anticuerpo anti-P-cadherina, que dirige este miembro de la familia de la cadherina (véase, por ejemplo, la solicitud de patente en trámite de los Estados Unidos Número 20030194406); y un anticuerpo anti-VE-cadherina, que dirige la función relacionada angiogénica de esta molécula de adhesión específica de las células endoteliales (véase, por ejemplo, Liao y colaboradores (2002) Cancer Res. 62: 2567 - 2557. En las forma de realización preferidas de estas combinaciones, el inhibidor de KSP es un compuesto de Fórmula (II), y puede ser un compuesto de Fórmula lla, llb, o Ilc.

Los inhibidores de KSP de la invención, y el anticuerpo monoclonal, se pueden administrar en secuencia, en cualquier orden, o de una manera simultánea (es decir, de una manera concurrente o dentro del mismo marco de tiempo). Cuando se administra más de un tipo de anticuerpo monoclonal, los métodos de la presente invención pueden comprender además la exposición a radiación y/o quimioterapia, como sea garantizado para el cáncer que se esté sometiendo a tratamiento, y como sea recomendado por el médico supervisor.

Ejemplos

Ejemplo 1: Ensayo para determinar la actividad de KSP

Los microtúbulos purificados obtenidos de cerebro bovino se adquirieron a través de Cytoskeleton Inc. (Denver, Colorado, EUA). El dominio motor de la KSP humana (Eg 5, KNSL1) se clonó, se expresó, y se purificó hasta una homogeneidad mayor al 95%. Biomol GreenMR se adquirió a través de Affinity Research Products Ltd. (Matford Court, Exeter, Devon, Reino Unido). Los microtúbulos y la proteína motora KSP (es decir, el dominio motor de KSP) se diluyeron en regulador de ensayo (Tris-HCI 20 mM (pH 7,5), MgCl2 1 mM, DTT 10 mM, y 0,25 mg / mL de albúmina de suero bovino), hasta una concentración final de 35 µg / mL de microtúbulos, y KSP 45 nM. La mezcla de microtúbulos / KSP se incubó previamente luego a 37 ºC durante 10 minutos, para promover el enlace de KSP con los microtúbulos.

A cada pozo de la placa de prueba (placa de 384 pozos) que contenía 1,25 µL de inhibidor o de compuesto de prueba en sulfóxido de dimetilo (o sulfóxido de dimetilo solamente, en el caso de los controles), se le agregaron 25 µL de solución de ATP (ATP diluido hasta una concentración de 300 µM en regulador de ensayo), y 25 µL de la solución de microtúbulos / KSP anteriormente descrita. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. En seguida de la incubación, se agregaron a cada pozo 65 µL de Biomol GreenMR (un colorante con base en verde de malaquita que detecta la liberación del fosfato inorgánico). Las placas se incubaron durante 5 a 10 minutos adicionales, y luego se determinó la absorbancia a 630 nm, utilizando un lector de placas Victor ll. La cantidad de absorbancia a 630 nm correspondió a la cantidad de actividad de KSP en las muestras. La lC50 de cada inhibidor o compuesto de prueba se determinó luego con base en la disminución en la absorbancia a 630 nm en cada concentración, por medio de regresión no lineal, utilizando ya sea un software de análisis de datos XLFit para Excel,

o Prism de GraphPad Software Inc.

Los compuestos preferidos de la invención tienen una actividad biológica, medida por una IC50 de menos de aproximadamente 1 mM, teniendo las forma de realización preferidas una actividad biológica de menos de aproximadamente 25 µM, teniendo las forma de realización particularmente preferidas una actividad biológica de menos de aproximadamente 1.000 nM, y teniendo las forma de realización muy preferidas una actividad biológica de menos de aproximadamente 100 nM. Los compuestos de la Fórmula ll se probaron en este ensayo, y se encontró que tienen valores IC50 por debajo de los límites de cuantificación para este ensayo (el estimado es de 2 - 4 nM).

Ejemplo 2: Inhibición de la proliferación celular en líneas celulares tumorales tratadas con el Compuesto lla

Las líneas celulares utilizadas fueron las siguientes: HCT-116 (National Cancer Institute’s DCTF Tumor Repository, catálogo # NCI 502568, Rockville, MD), HCT-15 (National Cancer Institutes DCTF Tumor Repository, catálogo # NCI 502711, Rockville, MD, disponible a través de la American Type Culture Collection, catálogo # CLL-225), KB-3-1 (disponible a través de DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares - Número de Catálogo ACC 158), KB-V1 (disponible a través de DSMZ - Número de Catálogo ACC 149), AGS (disponible a través de la American Type Culture Collection, Manassas VA, Número de Catálogo CRL-1739MR), N87 (disponible a través de la American Type Culture Collection, Manassas VA, Número de Catálogo CRL-5822), HeI92.1.7 (disponible a través de la American Type Culture Collection, Manassas VA, Número de Catálogo TIB 180), K562 (disponible a través de la American Type Culture Collection, Manassas VA, Número de Catálogo CRL-243MR), MV4;11 (American Tissue Culture Collection, Manassas VA, Número de Catálogo CRL-9591), y U937 (disponible a través de la American Type Culture Collection, Manassas VA, Número de Catálogo CRL-1593.2).

Las líneas de células se aplicaron a placas de 96 pozos, con densidades de aproximadamente 500 células por pozo, de una placa de 96 pozos y se dejaron crecer durante 24 horas. Entonces se trataron las células con diferentes concentraciones de los compuestos durante 72 horas. Luego se agregaron 100 µL del reactivo CeIITiter-Glo® (Promega Corporation). CeIITiter-Glo® se utiliza en un método homogéneo de determinación del número de células viables, utilizando el reactivo individual CeIITiter-Glo® para detectar ATP (patentes de los Estados Unidos Nos.

6.602.677 y 7.241.584) (véase Promega, Catálogo de producto #G7570). En seguida de la adición del reactivo CellTiter-GIo®, se incubaron las células en la oscuridad durante 30 minutos. Se determinó la cantidad de Iuminiscencia para cada pozo, utilizando un lector de placas Wallac Trilux, que se correlaciona con el número de células por pozo. El número de células viables en los pozos que reciben solamente DMSO (0,5%) sirvió como una indicación del % de inhibición, mientras que los pozos sin células sirvieron como inhibición del 100% del crecimiento celular. Se determinó gráficamente la concentración del compuesto que dio como resultado una inhibición del crecimiento del 50% (GI50) a partir de las curvas sigmoideas de dosis-respuesta de los valores de las dosis transformados por el log vs los recuentos celulares (porcentaje del control) a las 72 horas de la exposición continua al compuesto. Los datos se presentan más adelante en la Tabla 1. Se observaron amplios efectos anti-proliferativos (valores de GI50 de 0,1 a 6,5 nM) en todas las líneas celulares probadas. Esta amplia actividad es consistente con un compuesto que es un inhibidor mitótico.

Tabla 1 - Actividad antiproliferativa in vitro (valores de GI50 en nM) del Compuesto lla.

Tipo de tumor: Línea celular GI50 (nM) # de las pruebas Tiempo de duplicación (h)

Colon: HCT-116 0,1 4 22

Colon: HCT-15 0,3 9 34

Epidermoide: KB3.1 0,6 15 24

Epidermoide: KB8.5 0,5 16 24

Epidermoide: KBV1 6,5 11 29

Gástrico: AGS 0,2 4 20

Gástrico: N87 1,0 2 47

Leucemia: Hel92.1.7 0,5 4 18

Leucemia: K562 0,1 4 30

Leucemia: MV4-11 0,2 2 36,5

Leucemia: U937 0,1 4 24

La glicoproteína P (P-gp, también conocida como MDR1) es una bomba de flujo de salida que es un transportador de ABC, que media la resistencia a múltiples fármacos contra diferentes fármacos citotóxicos en las células que la expresan. Algunas líneas celulares utilizadas en este estudio (HCT-15, KBV1, y KBV8.5) expresan P-gp, y, como se puede observar en la Tabla 1, estas líneas celulares son sensibles a los inhibidores de KSP de la Fórmula II. El Ejemplo 12 que se encuentra más adelante, demuestra que los compuestos similares de la Fórmula I que carecen de un hidroxilo sobre la fracción de acilo, no son activos in vivo contra estos tumores.

Ejemplo 3: Efecto in vitro de los inhibidores de KSP sobre el perfil del ciclo celular en líneas celulares cancerosas

Las células de líneas celulares de linfoma se trataron con los inhibidores de KSP de la invención, y se analizaron mediante análisis FACS. Se recolectaron aproximadamente 2 x 105 células, se lavaron los precipitados celulares con PBS frío dos veces, y se resuspendieron en 500 µL de PBS frío. Se fijaron las células mediante la adición de 8 mL de etanol frío al 80%, mientras que se realizaba una agitación tipo vórtice lenta. Después de 15 minutos de incubación, se lavaron las células fijadas dos veces con PBS, y se resuspendieron las células precipitadas en 1 mL de regulador de coloración PI/ARNasa (BD PharmingenMR, catálogo # 550825), y se incubaron durante 15 minutos a 37 ºC protegidas de la luz. El yoduro de propidio (PI) es un colorante vital fluorescente que colorea tanto el ADN como el ARN. Por consiguiente, el ARN se debe removido mediante digestión con ribonucleasa (ARNasa). Las células teñidas se pasaron a través de un filtro de células hasta un tubo FACS, para reducir el número de agregados celulares (BD Falcon # 352235) antes del análisis FACS. EI contenido de ADN de las células fijadas y coloreadas se analizó mediante el citómetro de flujo BD FACSCaIibur utilizando el software CellQuest.

El tratamiento de las células cancerosas con los inhibidores de KSP dio como resultado la detención mitótica, pero el grado de detención, su duración, y las consecuencias después de la detención, pueden variar entre las líneas celulares. En seguida de la detención mitótica, las células tienen varias opciones, incluyendo salir de la detención y dividirse normalmente, sufrir apoptosis directamente, o salir de la mitosis sin citoquinesis (un fenómeno denominado como deslizamiento mitótico). Si las células sufren el deslizamiento mitótico, pueden entrar a una pseudo-G1, y luego continuar el ciclo, envejecer, o sufrir apoptosis. Algunas de estas diferencias se destacan en el tratamiento de las líneas celulares de linfoma SUDHL-4 (una línea celular de linfoma de células B obtenida a través de DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, número de catálogo ACC 495), y RL (una línea celular de linfoma no Hodgkin humano, American Type Culture Collection, Manassas VA, número de catálogo CRL-2261MR), con los inhibidores de KSP.

Ambas líneas celulares se detuvieron en la mitosis en respuesta al compuesto lla, pero las células SUDHL-4 sufrieron apoptosis después de 48 horas de tratamiento, como se indica mediante un incremento de las células con un contenido de ADN lt; 2 N, mientras que las células de linfoma de RL permanecieron detenidas en la mitosis, y no se presenta inducción de apoptosis ni deslizamiento mitótico. Véase la Figura 2.

Ejemplo 4: Ensayos de cribado del inhibidor de KSP

La identificación de los tipos de tumores que son los más sensibles a los inhibidores de KSP de la presente invención, se puede llevar a cabo utilizando un planteamiento no forzado, que utiliza varios ensayos basados en células. Los ensayos seleccionados fueron los siguientes:

• CelITiter-GIo®. Éste es un ensayo diseñado para medir la concentración de ATP en un cultivo celular, y se puede correlacionar con el número de células. Brevemente, el CellTiter-Glo® (Promega Corporation) es un método homogéneo que utiliza el único reactivo CellTiter-Glo® para detectar el ATP, en donde el ATP en el ensayo dirige la actividad de una Iuciferasa termoestable, para crear una señal Iuminiscente, la cual se puede medir luego y correlacionar con el número de células viables. En resumen, para las células adherentes, se sembraron en placa de

1.000 a 5.000 células/pozo en placas de 96 pozos (100 µL/pozo), y se dejó que se adhirieran durante 24 horas, antes de ser tratadas con el fármaco. Para las células no adherentes, se sembraron en placa de 1.000 a 10.000 células/pozo en placas de 96 pozos (100 µL/pozo), e inmediatamente se trataron con el fármaco. Las diluciones del fármaco se prepararon en DMSO a razón de 1.000 veces la concentración final. Estas diluciones se diluyeron luego hasta 1/6 en un medio de crecimiento, antes de ser añadidas a las células (11 µL/pozo), para alcanzar la concentración final deseada. Después de 48 horas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ºC, se procesaron las placas para el ensayo CellTiter-Glo®, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Protocolo para un ensayo de proliferación celular de 72 horas: el ensayo de 72 horas se llevó a cabo de la misma forma que el ensayo de 48 horas, excepto por las siguientes modificaciones: para las células adherentes, se sembraron en placa de 500 a

5.000 células/pozo en placas de 96 pozos (90 µL/pozo de medio de crecimiento celular), y se dejó que se adhirieran durante 24 horas antes de ser tratadas con el fármaco. Para las células no adherentes, se sembraron en placa de

1.000 a 10.000 células/pozo en placas de 96 pozos (90 µL/pozo de medio de crecimiento celular), y se trataron inmediatamente con el fármaco. Los valores de los datos presentados, representan la concentración del compuesto de prueba requerida para una reducción en el crecimiento del 50%.

•: Liberación de LDH. El ensayo de detección de citotoxicidad KitPLUS (LDH) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) mide la cantidad de LDH liberada en el medio mediante el teñido de las células; la LDH cataliza la conversión del lactato hasta piruvato. La reacción enzimática se acopla con una reacción química que utiliza una sal de tetrazolio para formar un formazano que es rojo y se puede detectar por su absorbancia a 490 nm. Este ensayo mide la cantidad de células muertas después del tratamiento con el fármaco. Las células se sembraron en placa a razón de 10.000 células/pozo en placas de 96 pozos (100 µL/pozo). Se dejó que las células adherentes se adhirieran durante 24 horas antes de ser tratadas con el fármaco, mientras que las células no adherentes se trataron inmediatamente con el fármaco. Las diluciones de fármacos se prepararon en DMSO a razón de 1.000 veces la concentración final. Estas diluciones se diluyeron luego en proporción 1/100 en el medio de crecimiento, antes de agregarse a las células (11 µL/pozo), para alcanzar la concentración final deseada. Después de 48 horas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ºC, las placas se procesaron para el ensayo de detección de citotoxicidad KitPLUS (LDH), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Únicamente los valores promedio se sustrajeron de todos los puntos de datos antes del análisis. Los valores de los datos presentados corresponden a la concentración del compuesto, en donde el resultado de LDH está en el nivel medio máximo.

•: Caspasa-Glo® 3/7. El Ensayo de Caspasa-Glo® 3/7 (Promega Corporation) es un ensayo Iuminiscente homogéneo que mide las actividades de la caspasa-3/7. El ensayo proporciona un sustrato pro-Iuminiscente de caspasa-3/7 DEDV-aminoIuciferina, y una Iuciferasa termoestable en un reactivo optimizado para la actividad de la caspasa-3/7, la actividad de la Iuciferasa, y la lisis celular. La adición del único reactivo de Caspasa-Glo® 3/7 traecomo resultado la lisis celular, seguida por la disociación de la caspasa del sustrato. Ésta libera la aminoIuciferina libre, la cual es consumida por la Iuciferasa, generando una señal Iuminiscente. La señal es proporcional a la actividad de la caspasa-3/7. Los valores de los datos presentados corresponden a la concentración del compuesto, en donde la actividad de la caspasa 3/7 está en el nivel medio máximo.

Se seleccionaron cinco líneas celulares con sensibilidades diferentes conocidas a los inhibidores de KSP de la invención, en un esfuerzo por demostrar la naturaleza predictiva de los ensayos de cribado. Las líneas son como sigue:

HCT-116 y HT29. HCT-116 es una línea celular derivada a partir de un carcinoma epitelial colónico humano, y se ha demostrado que es sensible a los inhibidores de KSP de la invención in vivo. HT29 (disponible a través de la MV4;11 (American Tissue Culture Collection (catálogo # CRL-9591, Rockville, MD)) es una línea celular de leucemia mielógena aguda (LMA).

5 CoIo205 (American Tissue Culture Collection (catálogo # HB-8307, Rockville, MD)) es una línea celular de cáncer colorrectal humano.

T47D (disponible a través de la American Tissue Culture Collection (catálogo # HTB-133, Rockville, MD)) es una línea celular derivada a partir de un carcinoma ductal de mama humano que parece tener un defecto en el punto de verificación del huso).

10 Los datos para el Compuesto lla se presentan a continuación en la Tabla 2. Los resultados demuestran que, en general, los ensayos están de acuerdo entre sí, y se pueden utilizar en amplios cribados de diferentes tipos de células para cribar inhibidores de KSP, y para cribar tipos de células sensibles.

Tabla 2 - Ensayos de cribado de proliferación / supervivencia.

Ensayo de CTG (nM): Ensayo de LDH (nM) Ensayo de Caspasa 3/7 (nM)

Línea celular: 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h

MV4;11: 0,05 0,04 0,04 NS 0,03 NS 0,02 0,03 NS

HCT- 116: gt;5 0,11 0,13 0,06 0,10 0,10 0,12 0,09 NS

Colo- 205: gt;5 0,18 0,19 NS 0,11 0,16 0,13 0,21 0,19

HT29: gt;5 gt;5 0,21 NS 0,35 0,27 NS NS NS

T47-D: gt;5 gt;5 0,45 NS 0,32 0,33 NS 0,39 0,40

Ensayo de CTG - Los resultados son los valores GI50, en donde el valor GI50 se calcula como la concentración del compuesto que da como resultado una tasa de supervivencia del 50%. Ensayo de LDH - Los resultados son los valores EC50, en donde los valores EC50 se calculan como la concentración del compuesto que da como resultado la mitad del efecto máximo. Ensayo de Caspasa 3/7 - Los resultados son los valores EC50, en donde los valores de EC50 se calculan como la concentración del compuesto que da como resultado la mitad del efecto máximo.

15 Ejemplo 5: Actividad de los inhibidores de KSP contra el panel de líneas celulares NCI60

El panel NCI-60 es un panel estandarizado de líneas celulares tumorales que se utiliza con frecuencia para investigar la sensibilidad de los tumores de diferentes orígenes a un agente dado (Shoemaker 2000 Nat. Rev. Cancer, 6: 813 - 23). El ensayo de CellTiter-Glo® descrito anteriormente se utilizó para medir la sensibilidad de una cantidad de líneas celulares derivadas de tumor, a los compuestos inhibidores de KSP. Los datos para el

20 Compuesto lla se presentan a continuación en la Tabla 3, y demuestran que muchas líneas celulares derivadas de tumor son sensibles a los inhibidores de KSP de la invención.

Tabla 3 - Resumen de los datos de CeIITiter-Glo para el Compuesto lla.

Panel celular: Línea celular GI50 Log(GI50) Diferencial

Leucemia: CCRF-CEM 0,215 -0,6676 0,999

Leucemia: HL-60 0,165 -0,7825 1,114

Leucemia: K-562 0,218 -0,6615 0,993

Leucemia: MOLT-4 0,331 -0,4802 0,811

Leucemia: RPMI-8226 0,351 -0,4547 0,786

Leucemia: SR 0,095 -1,0223 1,353

NSCL: A549 10 1,0000 -0,669

NSCL: EKVX 10 1,0000 -0,669

NSCL: HOP-62 10 1,0000 -0,669

NSCL: HOP-92 10 1,0000 -0,669

NSCL: NCI-H226 10 1,0000 -0,669

NSCL: NCI-H23 0,223 -0,6517 0,983

NSCL: NCI-H322M 10 1,0000 -0,669

NSCL: NCI-H460 0,378 -0,4225 0,754

NSCL: NCI-H522 0,166 -0,7799 1,111

Colon: COLO 205 10 1,0000 -0,669

Panel celular: Línea celular GI50 Log(GI50) Diferencial

Colon: HCC-2998 0,608 -0,2161 0,547

Colon: HCT-116 0,138 -0,8601 1,191

Colon: HCT-15 0,378 -0,4225 0,754

Colon: HT29 10 1,0000 -0,669

Colon: KM12 0,423 -0,3737 0,705

Colon: SW-620 0,236 -0,6271 0,958

CNS: SF-268 10 1,0000 -0,669

CNS: SF-295 0,162 -0,7905 1,122

CNS: SF-539 0,387 -0,4123 0,743

CNS: SNB-19 10 1,0000 -0,669

CNS: SNB-75 10 1,0000 -0,669

CNS: U251 0,239 -0,6216 0,953

Melanoma: LOX IMVI 10 1,0000 -0,669

Melanoma: MALME-3M 10 1,0000 -0,669

Melanoma: M14 0,209 -0,6799 1,011

Melanoma: SK-MEL-2 2,773 0,4429 -0,112

Melanoma: SK-MEL-28 10 1,0000 -0,669

Melanoma: SK-MEL-5 10 1,0000 -0,669

Melanoma: UACC-257 10 1,0000 -0,669

Melanoma: UACC-62 10 1,0000 -0,669

Melanoma: MDA-MB-435 0,152 -0,8182 1,149

Ovárica: IGROV1 10 1,0000 -0,669

Ovárica: OVCAR-3 10 1,0000 -0,669

Ovárica: OVCAR-4 10 1,0000 -0,669

Ovárica: OVCAR-5 10 1,0000 -0,669

Ovárica: OVCAR-8 0,324 -0,4895 0,821

Ovárica: SK-OV-3 0,421 -0,3757 0,707

Ovárica: NCI/ADR-RES 4,18 0,6212 -0,290

Renal: 786-0 10 1,0000 -0,669

Renal: A498 10 1,0000 -0,669

Renal: ACHN 10 1,0000 -0,669

Renal: CAKI-1 10 1,0000 -0,669

Renal: RXF 393 10 1,0000 -0,669

Renal: SN12C 10 1,0000 -0,669

Renal: TK-10 10 1,0000 -0,669

Renal: UO-31 10 1,0000 -0,669

Próstata: PC-3 10 1,0000 -0,669

Próstata: DU-145 0,435 -0,3615 0,693

Mama: MCF7 10 1,0000 -0,669

Mama: MDA-MB-231 0,333 -0,4776 0,809

Mama: HS 578T 0,22 -0,6576 0,989

Mama: BT-474 10 1,0000 -0,669

Mama: BT-549 0,809 -0,0921 0,423

Mama: T-47D 10 1,0000 -0,669

Media: 2,143 0,331

El valor Gl50 es la concentración del compuesto (expresada en nM) que da como resultado un índice de supervivencia del 50%. Diferencial: La diferencia entre el log (GI50) promedio (0.331) y el Log(Gl50) de cada línea celular. Promedio: La media geométrica para los valores Gl50, y la media aritmética para los valores Log(Gl50).

Ejemplo 6: Actividad de los inhibidores de KSP contra las líneas celulares derivadas a partir de malignidades hematológicas

Los datos presentados en la Tabla 3 demostraron que las líneas celulares Ieucémicas eran las más sensibles a los inhibidores de KSP de la invención. Por consiguiente, se probó un panel de varias líneas celulares derivadas a partir de malignidades hematológicas en el ensayo de CeIlTiter-GIo® descrito anteriormente, y se presentan en la Tabla 4 a continuación y en la Figura 1.

Enfermedad: Línea celular Número de catálogo GI50 (nM) Log(GI50) Diferencial

LMA: MV4;11 ATCC CRL-9591 0,08 -1,114 0,644

LMA: MV4;11Luc Derivada de MV4;11 0,11 -0,979 0,509

LMA: AML-193 ATCC CRL-9589 0,11 -0,959 0,489

LMA: Kasumi-1 ATCC CRL-2724 0,44 -0,357 -0,113

LMA: SET-2 Disponible a través de DSMZ ACC608 0,34 -0,469 -0,001

LMA: MOLM13-Luc Disponible a través de ATCC 30-2001 0,23 -0,645 0,175

LMA: HL60 Disponible a través de ATCC CCL-240 0,17 -0,783 0,313

LMA: HL60-Luc Disponible a través de ATCC 30-2001 0,51 -0,297 -0,173

LMA: HEL92 ATCC TIB-180 0,49 -0,310 -0,160

LMC: K562 Disponible a través de ATCC CCL-243 0,21 -0,680 0,210

LLA: CCRF-CEM ATCCCCL-119 0,16 -0,785 0,315

LLA: RS4;11 ATCC CRL-1873 0,10 -1,000 0,530

LLA: MOLT-4 Disponible a través de ATCC CRL- 1582 0,33 -0,480 0,010

LLA: SEM-Luc Disponible a través de ATCC 30-2001 0,15 -0,824 0,354

MM: KMS11 Véase Namba y colaboradores más abajo 0,48 -0,316 -0,154

MM: KMS11-Luc Derivada de KSM-11 0,29 -0,538 0,068

MM: KMS18-Luc Disponible a través de ATCC 30-2001 0,52 -0,286 -0,184

MM: OPM2 DSMZ Acc50 0,14 -0,870 0,400

MM: KMS26 Disponible a través de JCRB JCRB1187 0,24 -0,620 0,150

MM: L363 Disponible a través de DSMZ ACC49 0,13 -0,886 0,416

MM: LP1 Disponible a través de DSMZ ACC41 0,21 -0,688 0,218

MM: RPMI-8226 Disponible a través de ATCC CRL- 8658TM 0,26 -0,582 0,112

MM: H929 Disponible a través de ATCC CRL- 9068 0,34 -0,475 0,005

MM: H929-Luc Disponible a través de ATCC 30-2001 1,69 0,227 -0,697

NHL: RL ATCC CRL-226TM 20,00 1,301 -1,771

NHL: SuDHL-4 DSMZ ACC495 0,45 -0,350 -0,120

NHL: U937 Disponible a través de ATCC CRL- 1593.2 0,20 -0,699 0,229

NHL: SR Disponible a través de ATCC SLR- 2262 0,11 -0,957 0,487

NHL: Karpas-299-Luc Disponible a través de ATCC 30-2001 20,18 1,305 -1,775

HL: L428 DSMZ ACC197 20,00 1,301 -1,771

HL: KM-H2 DSMZ ACC 8 0,23 -0,632 0,162

Media: 0,34 -0,470

El valor Gl50 es la concentración del compuesto que da como resultado un índice de supervivencia del 50%. Diferencial: La diferencia entre el Log(Gl50) promedio (0,470) y el Log(GI50) de cada línea celular. Promedio: La media geométrica para los valores de Gl50, y la media aritmética para los valores Log(Gl50). (KMS-11, véase Namba y colaboradores (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25(8) páginas 723 - 729).

5 Ejemplo 7: Sensibilidad de los blastos celulares primarios a los inhibidores de KSP

Los datos de la Tabla 4 demuestran que varios tipos de líneas celulares de cáncer hematológico son sensibles a los inhibidores de KSP de la invención. Las células de blastos primarios de los pacientes con LMA se probaron para determinar su sensibilidad al Compuesto lla, como se muestra más adelante. Los blastos de LMA congelados de sangre periférica se obtuvieron a través de AlICelI LLC (Emeryville, CA). Se adquirieron tres viales congelados que 10 contenían aproximadamente 1x107 PBMC. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de tres pacientes con LMA recién diagnosticados, con un alto porcentaje de blastos (# 06 - 188, 80%; # 06 - 366, 88%; 06 503, 73%) se cultivaron durante varias semanas, y se trataron con los inhibidores de KSP. Los viales se descongelaron rápidamente, y se cultivaron las células en DMEM de Iscove complementado con suero bovino fetal al 10%, y las siguientes citoquinas, todas a razón de 10 ng / mL: GM-CSF, G-CSF, SCF, IL-3, e IL-6 (todas de R&D

15 Systems). Estos ensayos se llevaron a cabo sobre las células de la siguiente manera:

• Ensayo de CellTiter-Glo® sobre blastos de LMA. Las PBMC que contenían blastos de LMA se sembraron en placas de 96 pozos (5.000/pozo), y se trataron con diferentes concentraciones del compuesto lla (10 pM a 10 nM) durante 48 horas, antes de medir la supervivencia de las células como se describió anteriormente. Los valores de Gl50 (nM) se calcularon como para las líneas celulares.

20 • Análisis del ciclo celular utilizando coloración con yoduro de propidio. Las PBMC que contenían los blastos de LMA se sembraron en placas de 6 pozos (0,6 a 1x106 células/pozo), y se trataron con uno de los siguientes: DMSO (vehículo), Compuesto lla a 0,2 ó 2 nM, o Paclitaxel a 100 nM. Se cosecharon aproximadamente 2 x 105 células, los precipitados celulares se lavaron con PBS frío dos veces, y se volvieron a suspender en 500 µL de PBS frío. Las

células se fijaron mediante la adición de 8 mL de etanol frío al 80%, mientras que se hacía una agitación tipo vórtice lenta. Después de 15 minutos de incubación, se lavaron las células fijadas dos veces con PBS, y se volvieron a suspender los precipitados celulares en 1 mL de regulador de coloración PI / ARNasa (BD Biosciences # 550825) y se incubaron durante 15 minutos a 37 ºC, protegidas de la luz. El yoduro de propidio (PI) es un colorante vital fluorescente que tiñe tanto el ADN como el ARN. Por consiguiente, se debe remover el ARN mediante digestión con ribonucleasa (ARNasa). Las células teñidas se pasaron a través de un tamiz de células hacia un tubo FACS, para reducir el número de agregados celulares (BD Falcon # 352235), antes del análisis FACS. El contenido de ADN de las células fijadas y teñidas se analizó mediante el citómetro de flujo BD FACSCaIibur, utilizando el software CeIIQuest.

• Ensayo de formación de colonias en el medio que contiene metilcelulosa. El medio semisólido que contenía metilcelulosa se adquirió a través de StemCeII Technologies Inc. (MethocultMR GF+ H4435, Catálogo # 04435). Los blastos se sembraron con densidades en el intervalo de 1x103 a 1x105 células/pozo, en placas de seis pozos tratadas con cultivo sin tejido. Se agregó DMSO (vehículo) o el compuesto lla (0.1, 0.2, 0.5, 1 y 2 nM) al medio al mismo tiempo que las células. Se hizo recuento de las colonias bajo un microscopio después de dos semanas. Se tiñeron las células vivas con P-yodo-nitro-tetrazolio a razón de 750 µL / pozo, en una concentración de 1 mg / mL (Sigma Catálogo #18377); se tomaron fotografías después de una incubación durante la noche a 37 ºC.

Resultados: Aunque el tiempo de duplicación aparente de estos blastos fue más lento que aquél de la mayoría de las líneas celulares de LMA, 50 a 70 horas vs 30 a 50 horas, se obtuvieron valores de GI50 para el compuesto lla (0.12, 0.28, y 0.34 nM), que estaban en línea con lo que se mostró anteriormente para las líneas celulares de LMA. Se obtuvieron resultados similares utilizando el ensayo de formación de colonias, en donde el número de colonias se redujo notoriamente a 0,2 nM, y las colonias estaban ausentes a 0,5 nM y por encima para la muestra # 06866. Se obtuvieron resultados similares para las muestras # 06-188 y # 06-503, y en todos los casos las colonias estuvieron ausentes a 0,5 nM y por encima. El perfil del ciclo celular mostró que, para la muestra # 06-366 a las 24 horas, hubo un incremento en el número de células detenidas en la mitosis (población 4N), seguido a las 48 horas por un incremento en el número de células que estaban muriendo (población lt;2N). Estos cambios fueron más notorios en la concentración más alta (2 nM) que en la concentración más baja (0,2 nM), que es cercano al Gl50. Se utilizó una alta dosis de paclitaxel (100 nM) como control positivo, para una detención mitótica fuerte. Se obtuvieron resultados similares para las muestras # 06-188 y # 06-503. Para la muestra # 06-503, se recolectaron los datos en los instantes de tiempo a las 48 y 72 horas. El patrón a las 48 horas es similar al observado para la muestra # 06-366, y a las 72 horas el incremento en el número de células que están muriendo (población lt;2N) es más notorio, en especial a 2 nM. Véase la Figura 2. El hecho de que los valores Gl50 son aún muy bajos, indica que las células que entran al ciclo celular son aniquiladas muy efectivamente por el compuesto lla.

Ejemplo 8: Determinación de la eficacia in vivo de los inhibidores de KSP

La línea celular HCT-116 ha sido utilizada ampliamente en la evaluación de los inhibidores mitóticos, tales como los interruptores de microtúbulos, los inhibidores de quinasa mitótica, y los inhibidores de KSP. Se llevó a cabo un estudio de efectividad de múltiples dosis en un programa de dosificación de cuatro veces al día durante 3 días (q4d x 3). Los experimentos se llevaron a cabo utilizando ratones nu/nu atímicos producidos por mezcla de razas de aproximadamente 6 a 8 semanas de edad (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Después de arribar, los animales recibieron un implante de un microchip subcutáneo (AVID, Folsom, LA) en la región subescapular, para la identificación de los individuos. Se permitió que los animales se aclimataran durante una semana antes de iniciar cualquiera de los procedimientos experimentales. Los animales se alojaron a razón de 4 a 5 animales por jaula, en jaulas microaislantes de policarbonato transparente, con un ciclo de luz de 12 horas y 12 horas de oscuridad, a temperaturas de entre 70 y 80 grados Fahrenheit y una humedad relativa del 30 al 70%. Se proporcionó alimento (croquetas para roedores de Purina) y agua al gusto. Los ratones se manejaron de acuerdo con los reglamentos y lineamientos de la ACUC de Novartis, y con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de ILAR. Los experimentos se llevaron a cabo en una instalación acreditada por AAALAC de acuerdo con un protocolo aprobado por ACUC.

El compuesto lla (base libre) y el SB-715992 (Ispinesib, un inhibidor de KSP de Cytokinetics que está en los ensayos clínicos; como su base libre), se formularon en CaptisoI® al 20% para todas las dosis anteriores, para un volumen de dosis de 8 mL / kg. Las dosis se ajustaron al peso corporal de cada animal. Las formulaciones se hicieron una vez al principio del estudio, y se guardaron a temperatura ambiente. El paclitaxel de grado clínico se adquirió premezclado en un vehículo basado en cremóforo (Mayne Pharma, ahora Hospira, Lake Forest, IL, catálogo # NDC6170334209), y se diluyó en solución salina estéril para proporcionar un volumen de dosis de 16 mL / kg, para una dosis de 30 mg / kg administrada en forma intraperitoneal.

Las células de carcinoma de colon humano HCT116 se obtuvieron a través del National Cancer Institute’s DCTD Tumor Repository (catálogo # NCI 502568, Rockville, MD), y se analizaron para estar seguros de que estaban libres de Mycoplasma sp. y de virus de murino en el panel de ensayo de PCR IMPACT1 (RADIL, Universidad de Missouri, Columbia, MO). Las células HCT116 se cultivaron en RPMI1640 con L-glutamina 2 mM (Mediatech Inc., catálogo #

15-040-CV), complementado con suero bovino fetal al 10% (JRH Biosciences, catálogo # 12003-1000M). Estas células se cultivaron como cultivos adherentes, se mantuvieron a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5%. Las células se cultivaron por lo menos durante 10 pasadas antes de usarse. Las células se cosecharon con una confluencia del 95%, y se centrifugaron aproximadamente a 800 x g durante 5 minutos a 4 ºC, y luego se volvieron a suspender en un HBSS frío (Mediatech Inc., catálogo # 21-021-CV), en una concentración de 50 millones de células / mL para el implante subcutáneo (volumen de inyección de 0,1 mL).

Los ratones nu/nu hembras (Charles River, Hollister, CA) se inyectaron en forma subcutánea en el costado derecho con 5 millones de células tumorales HCT-116 suspendidas en solución salina balanceada de Hank (HBSS) en un volumen total de 0,1 mL / ratón. Para los estudios de eficacia, se seleccionaron los ratones en forma aleatoria 10 días después del implante. Se inscribieron 72 ratones en el Estudio 1, y 81 ratones en el Estudio 2, con un volumen tumoral promedio de aproximadamente 300 mm3. Los xenoinjertos de tumores se midieron en dos dimensiones (L x A) con calibradores digitales dos veces por semana desde el inicio de la dosificación en el Día 0. El volumen del tumor se calculó como (L x A2)/2. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana, y las observaciones clínicas se registraron diariamente. El volumen del tumor y los pesos corporales se capturaron y se almacenaron mediante el software StudyDirector (StudyLog, South San Francisco, CA). Los valores de porcentaje de tratamiento/control (T/C) se calcularon utilizando la siguiente fórmula:

%T/C = 100 x �T/�C

en donde:

T = volumen promedio del tumor del grupo tratado con fármaco el día final del estudio;

�T = volumen promedio del tumor del grupo tratado con fármaco el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo tratado con fármaco el día inicial de la dosificación;

C = volumen promedio del tumor medio del grupo de control en el día final del estudio; y

�C = volumen promedio del tumor del grupo de control el día final del estudio - volumen promedio del tumor del grupo de control el día inicial de la dosificación.

Todos los datos se expresaron como la media y SEM (error estándar de la media). Se llevaron a cabo comparaciones entre grupos para las mediciones finales de los tumores, utilizando un análisis por pares de ANOVA de una vía. La significancia se determinó utilizando el ANOVA de una vía de KruskaI-Wallis en un método de Ranks y Dunn para múltiples comparaciones por pares. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando SigmaStat (Systat Software Inc., San José, CA).

Se llevó a cabo un estudio de eficacia de múltiples dosis en un programa q4d x 3 para comparar la actividad antitumoral del compuesto lla con el SB-715992 y el paclitaxel. Los resultados se muestran en la Tabla 5. En este estudio, los animales tratados con las dosis más altas de 5 mg / kg del compuesto lla y de 15 mg / kg de SB-715992 solamente recibieron las primeras dos dosis del programa q4d x 3 planeado, debido a una pérdida de peso significativa, de la cual se recuperaron los ratones. Inclusive con solamente dos dosis, hubo una regresión significativa del tumor de una manera similar (regresión del 73%, p lt; 0,005 para cada uno). Las dos dosis más bajas de 2,5 y 1,25 mg / kg del compuesto lla y de 7.5 mg / kg de SB-715992 dadas en el programa q4d x 3, también provocaron en forma similar una regresión de los xenoinjertos del tumor HCT116 (regresión del 82%, del 66%, del 65%, p lt; 0,05, respectivamente). Sobretodo, el paclitaxel fue más efectivo que el compuesto lla; aunque los tumores tuvieron regresión inicialmente, el crecimiento se reasumió pronto después de cesar la dosificación.

Tabla 5 - Eficacia del Compuesto lla administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en el modelo de xenoinjerto de tumor HCT116.

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta T/C, Día 17 (%) L de volumen tumoral, Día 17 (mm3) % máximo de regresión (Día) L máximo de peso corporal (Día) (g) L máximo de peso corporal (Día) (%) Supervivencia (vivos / total)

Vehículo (20% de Captisol®): q4d x 3, i.v. 100 756 ± 95 - 0.9 ± 0.5 (D11) 3.4 ± 0.02 (D11) 9/9

Compuesto IIa: 1.25 mg/kg, i.v., q4d x 3 -* -173 ± 12 66 (D20) -0.7 ± 0.3 (D4) -2.9 ± 0.01 (D4) 9/9

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto IIa: 2.5 mg/kg, i.v., q4d x 3 -* -208 ± 17 82 (D20) -1.8 ± 0.2 (D11) -7.0 ± 0.03 (D11) 9/9

Compuesto IIa: 5 mg/kg, i.v., q4d x 3 -* -196 ± 11 73 (D20) -3.0 ± 0.2 (D7) -11.7 ± 0.02 (D7) 8/9 (pérdida de peso corporal)

SB-715992: 3.5 mg/kg, i.v., q4d x 3 5 39 ± 4 10 (D11) -0.7 ± 0.05 (D4) -2.7 ± 0.17 (D4) 9/9

SB-715992: 7.5 mg/kg i.v., q4d x 3 -* -177 ± 55 65 (D17) -0.3 ± 0.05 (D4) -1.3 ± 0.25 (D4) 9/9

SB-715992: 15 mg/kg, i.v., q4d x 3 -* -205 ± 24 73 (D20) -2.5 ± 0.2 (D7) -10.6 ± 0.75 (D7) 9/9

Paclitaxel: 30 mg/kg, i.p., q4d x 3 -* -80 ± 3 31 (D17) -1.3 ± 0.1 (D7) -5.0 ± 0.46 (07) 9/9

Debido a que una dosis tan baja como de 1,25 mg / kg en un programa q4d x 3 indujo la regresión de los

5 xenoinjertos HCT116, se repitió el estudio de efectividad con un intervalo de dosis de 2 a 0,125 mg / kg, para observar una respuesta a la dosis, y determinar qué tan baja se puede suministrar una dosis para inducir Ia regresión del tumor. Los resultados de Ia Tabla 6 indican que se observó la regresión de los tumores con dosis tan bajas como 1 mg / kg (regresión del 46%, p lt; 0,05, día 17), y se observó estasis del tumor con dosis tan bajas como 0,25 mg / kg del compuesto lla durante el intervalo de dosificación, pero no alcanzó un significado estadístico,

10 comparado con el grupo de control con vehículo. El efecto antitumoral del compuesto lla con 0,125 mg / kg no fue significativamente diferente del control con vehículo. Solamente la dosis de 7,5 mg / kg de SB-715992 indujo la regresión de los tumores. Adicionalmente, 72 horas después de la última dosis, se recolectó sangre para comparar los niveles de neutrófilos circulantes entre los grupos. Los neutrófilos se redujeron de una forma dependiente de la dosis, de una forma similar al efecto de la efectividad tumoral.

15 Tabla 6 - Eficacia de dosis bajas del Compuesto lla administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en el modelo de xenoinjerto de tumor HCT116.

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta T/C, Día 24 (%) L de volumen tumoral, Día 24 (mm3) % máximo de regresión (Día) Neutrófilos/µl 72 h después de la dosis +/- D. E. L máximo de peso corporal (Día) (g) L máximo de peso corporal (Día) (%) Superviv. (vivos / total)

Vehículo (20% de Captisol®): q4d x 3, i.v. 100 1104 ± 262 - 1227 +/- 257 -0,1 ± 0,2 (D3) -0,4 ± 0,86 (D3) 9/9

Compuesto IIa: 0,125 mg/kg, i.v., q4d x 3 81 809 ± 193 - 1346 +/- 427 -0,4 ± 0,16 (D3) -1,4 ± 0,59 (D3) 9/9

Compuesto IIa: 0.25 mg/kg, i.v., q4d x 3 35 382 ± 120 - 785 +/- 374 -0,6 ± 0,15 (D3) -2,3 ± 0,58 (D3) 9/9

Compuesto IIa: 0.5 mg/kg, i.v., q4d x 3 14 155 ± 145 8 (D14) 293 +/- 29 -0,7 ± 0,18 (D3) -2,7 ± 0,75 (D3) 9/9

Compuesto IIa: 1 mg/kg, i.v., q4d x 3 -* -34 ± 36 46 (D17) 343 +/- 255 -0.7 ± 0.23 (D3) -2.8 ± 0.83 (D3) 9/9

(continuación)

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto IIa: 2 mg/kg, i.v., q4d x 3 -* -141 ± 48 73 (D21) 193 +/- 125 -1.35 ± 0.87 (D10) 4.7 ± 1.17 (D3) 8/9 (perdida de peso corporal)

SB-715992: 1.75 mg/kg, i.v., q4d x 3 36 395 ± 84 - 1026 +/- 229 -0.6 ± 0.58 (D3) -2.3 ± 0.51 (D3) 9/9

SB-715992: 3.5 i.v., q4d x 3 15 165 ± 60 13 (D7) 731 +/- 391 -0.5 ± 0.37 (D3) -2.0 ± 0.44 (D3) 9/9

SB-715992: 7.5 mg/kg, i.v., q4d x 3 - -145 ± 25 65 (D21) 476 +/- 112 -0.7 ± 1.1 (D10) -3.0 ± 2.49 (D10) 9/9

Ejemplo 9: Eficacia de los inhibidores de KSP en el modelo de xenoinjerto de tumor HCT15

HCT15 es una línea celular de adenocarcinoma humano que también se sabe que expresa la bomba P-gp. Por consiguiente, se llevó a cabo un modelo de tumor de xenoinjerto utilizando esta línea celular, para verificar los resultados del Ejemplo 10.

Los experimentos se llevaron a cabo utilizando ratones nu/nu atímicos producidos por mezcla de razas (Charles River, Laboratories) de aproximadamente 6 a 8 semanas de edad. Cuando llegaron, los animales recibieron un implante de microchip subcutáneo (AVID, Folsom, LA) en la región subescapular, para la identificación de los individuos. Se dejaron aclimatar los animales durante 1 semana antes de iniciar cualquiera de los procedimientos experimentales. El cuidado animal de rutina y la garantía de bienestar fueron como se describió anteriormente.

Las células de carcinoma de colon humano HCT15 se obtuvieron a través del National Cancer lnstitute’s DCTD Tumor Repository (catálogo # NCI 502711, Flockville, MD). Las células HCT15 se cultivaron en RPMl1640 con Lglutamina 2 mM (Mediatech Inc., catálogo # 15-040-CV) complementado con suero bovino fetal al 10% (JRH Biosciences, catálogo # 12003-1000M). Las células se probaron para determinar si estaban libres de Mycoplasma sp. y de virus de murino en el panel de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa IMPACT1 (RADIL, Universidad de Missouri, Columbia, MO).

Estas células se cultivaron como cultivos adherentes, se mantuvieron a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5%. Las células se cultivaron por lo menos durante 10 pasadas antes de usarse. Las células se cosecharon con una confluencia del 95%, y se centrifugaron aproximadamente a 800 x g durante 5 minutos a 4 ºC, y luego se volvieron a suspender en un HBSS frío (Mediatech Inc., catálogo # 21-021-CV) más MatrigelMR en una concentración de 50 millones de células / mL para el implante subcutáneo (volumen de inyección de 0,2 mL).

Los tratamientos para los estudios de eficacia se iniciaron 10 días después del implante de las células tumorales, cuando los tumores eran de aproximadamente 300 mm3. El compuesto lla y SB-715992 se administraron en forma intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola, en un volumen de 8 mL / kg, en las dosis indicadas. El paclitaxel se administró en forma intraperitoneal (i.p.) en un volumen de 16 mL / kg, a razón de 30 mg / kg.

Para los estudios de eficacia, se seleccionaron los ratones en forma aleatoria 10 días después del implante, con un volumen tumoral promedio de aproximadamente 300 mm3. Los xenoinjertos de tumores se midieron en dos dimensiones (L x A) con calibradores digitales dos veces por semana desde el inicio de la dosificación en el Día 0. El volumen del tumor se calculó como (L x A2)/2. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana, y las observaciones clínicas se registraron diariamente. El volumen del tumor y los pesos corporales se capturaron y se almacenaron mediante el software StudyDirector (StudyLog, South San Francisco, CA). Los datos se analizaron como se describió anteriormente.

Los resultados mostrados en la Tabla 7 indicaron que el compuesto lla demostró una mayor eficacia antitumoral de HCT15 que el paclitaxel; con la dosis de 4 mg / kg, el porcentaje T/C fue del 26% (p lt; 0,05 vs el vehículo, y similar vs paclitaxel). Aunque los datos muestran una separación entre los grupos dosificados con 4 mg / kg de inhibidor de KSP, y 7,5 y 15 mg / kg de SB-715992, no se logró el significado estadístico debido a la variabilidad de los

volúmenes de los tumores en este modelo. En el día 10, se observó una diferencia estadísticamente significativa (p lt; 0,05) entre 4 mg / kg del compuesto lla, y la dosis de 7,5 mg / kg de SB-715992. El paclitaxel, un sustrato conocido para P-gp, tiene una actividad antitumoral muy baja en este modelo. No se observó una pérdida de peso corporal significativa ni signos de toxicidad externos en cualquiera de los ratones tratados. La mayor actividad antitumoral en el modelo de HCT15 demuestra la efectividad del compuesto lla en los modelos de xenoinjerto de tumor que expresan altos niveles de P-gp.

Tabla 7 - Eficacia del Compuesto lla administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en el modelo de xenoinjerto de tumor HCT15.

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta LT/ LC, Día 15 (%) Regresión (%) L del volumen del tumor, Día 15 (mm3) L máximo de peso corporal (Día) (g) L máximo de peso corporal (Día) (%) Superviv. (vivos / total)

Vehículo (20% de Captisol): 8 mL/kg, q4dx3, i.v. 100 - 1123 ± 84 0.3 ± 0.2 (D10) 1.4 ± 0.8 (D10) 9/9

COMPUESTO IIa: 1.25 mg/kg, q4d x 3, i.v 60 - 671 ± 172 -0.5 ± 0.4 (D3) -2.1 ± 0.6 (D3) 9/9

COMPUESTO IIa: 2.5 mg/kg, q4dx3, i.v 65 - 735± 159 0.6 ± 0.2 (D3) 2.3 ± 0.8 (D10) 9/9

COMPUESTO IIa: 4.0 mg/kg, q4dx3, i.v 26* - 99 ± 78 -0.8 ± 0.3 (D10) -3.2 ± 1.4 (D10) 9/9

SB-715992: 7.5 mg/kg, q4d x 3, i.v 87 - 647 ± 164 0.6 ± 0.2 (D8) 2.6 ± 1.0 (D8) 9/9

SB-715992: 15 mg/kg, q4d x 3, i.v 67 - 491 ± 109 -1.2 ± 0.4 (D10) -4.9 ± 1.4 (D10) 9/9

Paclitaxel: 30 mg/kg, q4d x 3, i.p 104 - 703 ± 198 0.8 ± 0.6 (D8) 3.3 ± 1.0 (D8) 9/9

Ejemplo 10: Eficacia de los inhibidores de KSP en el modelo de xenoinjerto de leucemia mielógena aguda (LMA)

Se evaluó la eficacia del compuesto lla contra el modelo de xenoinjerto de tumor MV4;11 (O’FarreII y colaboradores, 2003) en ratones atímicos. Primero se probó la eficacia en un modelo de xenoinjerto de tumor MV4;11 subcutáneo en ratones, y también, debido a que el microambiente de la médula ósea juega un papel importante en el crecimiento y supervivencia de las células de LMA, se evaluó adicionalmente la efectividad en un modelo de la enfermedad diseminada MV4;11-Iuc en ratones, en donde las células se hospedan y crecen en la médula ósea y en algunos órganos blandos. Debido a la expresión de Iuciferasa por parte de las células tumorales, se determinó un monitoreo comprensivo en serie del crecimiento de las lesiones de leucemia utilizando toma de imágenes de bioluminiscencia.

Los estudios de eficacia tumoral subcutánea se llevaron a cabo utilizando ratones nu/nu atímicos producidos por mezclas de razas de aproximadamente 6 - 8 semanas de edad (Charles River Laboratories, Hollister, CA). El estudio de eficacia en el modelo de la enfermedad diseminada se llevó a cabo utilizando ratones hembras NOD-SCID inmunodeficientes de aproximadamente 7 a 8 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). A la llegada, los animales recibieron un implante de microchip subcutáneo (AVID, Folsom, LA) en la región subescapular, para la identificación de los individuos. Se dejó aclimatar a los animales durante una semana antes de iniciar cualquiera de los procedimientos experimentales. El cuidado animal de rutina y la garantía del bienestar fueron como se describió anteriormente.

Las células de leucemia mielógena aguda MV4;11 humana se obtuvieron a través de la American Tissue Culture Collection (catálogo # CRL-9591, Rockville, MD), y se analizaron para garantizar que están libres de Mycoplasma sp. y de virus de murino en el panel de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa IMPACT1 (RADIL, Universidad de Missouri, Columbia, MO). Para el modelo de la enfermedad diseminada, se recibieron un grupo estable de células MV4;11 que expresaban el gen de Iuciferasa del Fangxian Sun at the Genomics Institute de la Fundación de Investigación de Novartis en San Diego, California (MV4;11-Iuc). Las células MV4;11 se cultivaron en un medio de Dulbecco modificado de lscove (Mediatech lnc., catálogo # 15-016-CV) complementado con suero bovino fetal al 10% (JRH Biosciences, catálogo # 12003-1000M), L-glutamina 4 mM, y 5 ng / mL de M-CSF de granulocitos humanos recombinantes (GM-CSF) (R&D Systems, catálogo # 215-GM). Las MV4;11-Iuc se cultivaron en el mismo medio, pero con la adición de 2 µg / mL de puromicina para la selección de la expresión de Iuciferasa. Estas células se cultivaron como cultivos en suspensión, se mantuvieron a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5%. Las células se cultivaron por lo menos durante 10 pasadas antes de usarse. Las células se cosecharon aproximadamente a razón de 2 millones de células/mL, y se centrifugaron a

aproximadamente 800 x g durante 5 minutos a 4 ºC, y luego se volvieron a suspender en un HBSS frío (Mediatech lnc., catálogo # 21-021-CV) en una concentración de 25 millones de células / mL (conteniendo MatrigelMR al 50%, BD Biosciences, catálogo # 354234), para implantación subcutánea (volumen de inyección de 0,2 mL), o a una concentración de 100 millones de células / mL para implantación intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola (volumen de inyección de 0,1 mL). Los ratones se irradiaron con 3 Gray durante 3 minutos 1 día antes del implante intravenoso de las células.

El compuesto lla (base libre) y el SB-715992 (base libre) se formularon en CaptisoI al 20% para un volumen de dosis de 8 mg / kg. Las dosis se ajustaron al peso corporal de cada animal. Las formulaciones se hicieron una vez al principio del estudio, y se guardaron a temperatura ambiente. El paclitaxel de grado clínico se adquirió previamente mezclado en vehículo con base en cremóforo (Mayne Pharma, ahora Hospira, LakeForest, IL, catálogo # NDC6170334209), y se diluyó en solución salina estéril, para proporcionar un volumen de dosis de 16 mL / kg, para una dosis de 30 mg / kg administrada en forma intraperitoneal.

Para las dos evaluaciones de eficacia en el modelo de tumor subcutáneo, se inyectaron 10 millones de células combinadas en una mezcla de 1:1 de HBSS y MatrigelMR en forma subcutánea en el costado derecho, en un volumen total de 0,2 mL / ratón. Los ratones se seleccionaron aleatoriamente 17 días después del implante, y los ratones se inscribieron con un volumen tumoral volumen tumoral promedio de aproximadamente 250 mm3. Los xenoinjertos de tumores se midieron en dos dimensiones (L x A) con calibradores digitales dos veces por semana desde el inicio de la dosificación en el Día 0. El volumen del tumor se calculó como (L x A2)/2. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana, y las observaciones clínicas se registraron diariamente. El volumen del tumor y los pesos corporales se capturaron y se almacenaron mediante el software StudyDirector (StudyLog, South San Francisco, CA).

Para la evaluación de la eficacia en el modelo de la enfermedad diseminada, los ratones NOD-SCID hembras recibieron irradiación en todo el cuerpo a 3 Gray, el día antes de la inyección en la vena de la cola de 10 millones de células en 0,1 mL de HBSS. Cuarenta ratones se seleccionaron aleatoriamente, y se inscribieron en el estudio 28 días después del implante, con un conteo de fotones promedio (vista dorsal + vista ventral) de aproximadamente 5x107 fotones/segundo, como se determinó mediante las imágenes de bioluminiscencia. Aproximadamente 10 minutos antes de tomar las imágenes, los ratones se inyectaron en forma intraperitoneal con 150 mg / kg de Iuciferina (Xenogen Corporation, Alameda, CA), seguidos por anestesia con isoflurano. La emisión de fotones se midió utilizando una cámara de un dispositivo acoplado de carga en el sistema de toma de imágenes IVIS (Xenogen Corporation). En resumen, se capturó una imagen en escala de grises de los ratones, seguida por una superposición de un mapa de bioluminiscencia que representaba la distribución espacial de los fotones detectados a partir de la Iuciferina disociada en las células cancerosas que expresaban la Iuciferasa. La intensidad de la señal se cuantificó utilizando una versión personalizada del software IGOR Pro versión 4.09A (WaveMetrics, Inc., Lake Oswego, OR), denominada Living Image versión 2.50.2 (Xenogen). Se determinó la suma de todos los recuentos de fotones detectados a partir de las vistas dorsal + ventral. La bioluminiscencia de las células cancerosas en los animales se midió tomando imágenes en los días designados, hasta que el primer ratón desarrolló parálisis del miembro trasero debido a la carga de la enfermedad, el punto final principal para cuando se sacrifican humanitariamente los ratones. Se registró el día de la eutanasia para cada ratón, y se graficó el porcentaje restante de ratones sobrevivientes con el tiempo (análisis de supervivencia de Kaplan-Meier). Los valores P se calcularon utilizando la prueba log-rank (Software Graph Pad Prism 4.0), para evaluar las diferencias entre los grupos tratados y de control (p lt; 0,05 se consideró significativo). Los pesos corporales se midieron dos veces por semana, y las observaciones clínicas se registraron diariamente. Los pesos corporales se capturaron y se almacenaron mediante el software StudyDirector (StudyLog, South San Francisco, CA). El análisis de datos se llevó a cabo como se describió anteriormente.

Resultados, modelo de tumor subcutáneo: Los estudios de eficacia en el modelo de tumor subcutáneo se realizaron para comparar la actividad de un intervalo de dosis del compuesto lla administrado q4d x 3. En el primer estudio, se evaluaron las dosis más altas toleradas en los ratones nu/nu; 4 mg / kg del compuesto lla, 15 mg / kg de SB-715992, y 30 mg / kg de paclitaxel. A los 4 ratones restantes con tumores se les administraron 0.625 mg / kg de inhibidor de KSP en el mismo programa. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Se observaron regresiones de los tumores en todos los grupos de tratamiento durante el intervalo de dosificación, con 9/9, 6/9, y 7/9 ratones con regresiones tumorales completas sostenidas (CR) durante más de 100 días en los grupos tratados con las dosis altas del compuesto lIa, SB-715992, y paclitaxel, respectivamente. Aunque los tumores tuvieron regresión en el grupo tratado con 0,625 mg / kg del compuesto lla, crecieron nuevamente aproximadamente 10 días después de Ia última dosis. Las dosis de los agentes de prueba fueron en general bien toleradas con una pérdida de peso media máxima lt;10%, aunque 2 ratones perdieron gt;20% del peso corporal en el grupo tratado con SB715992.

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta LT/ LC, Día 24 (%) Regresión máxima en % (Día) L del volumen del tumor, Día 24 (mm3) CR L máximo de peso corporal (Día) (g) L máximo de peso corporal (Día) (%) Superviv (vivos / total)

Vehículo (20% de Captisol): q4d x 3, i.v. 100 - 911 ± 101 0 0,23 ± 0,3 (D10) 1 ± 1,4 (D10) 9/9

COMPUESTO IIa: 0.625 mg/kg, q4d x 3, i.v. - 69 (D10) -32 ± 172 0 -0,5 ± 1,3 (D7) -1,7 ± 5,0 (D7) 4/4

COMPUESTO IIa: 4 mg/kg, q4d x 3, i.v. - 100, (D60) -176 ± 31 9 -1,5 ± 0,4 (D10) -5,9 ± 1,6 (D10) 9/9

SB-715992: 15 mg/kg, q4d x 3, i.v. - 98 (D60) -211±28 6 -1,4 ± 0,3 (D3) -5,6± 1,1 (D3) 7/9 (pérdida de peso corporal)

Paclitaxel: 1 mg/kg, q4d x 3, i.p. - 75 (D46) -151 ± 63 7 0,4 ± 0,3 (D10) 0,4 ± 1,1 (D10) 9/9

5 El segundo estudio de eficacia en el modelo de tumor subcutáneo se realizó comparando Ia actividad de un intervalo de dosis bajas del compuesto IIa administrado q4d x 3. La dosis más alta utilizada fue de 2 mg / mg, que es la mitad de la dosis más alta tolerada en los ratones sin pelo. La actividad del compuesto IIa se comparó con SB715992 a razón de 7,5 mg / kg, que es Ia mitad de su dosis más alta tolerada. Los resultados se muestran en Ia Tabla 9 y en Ia Figura 2. Se observó Ia regresión del tumor para diferentes grados en las dosis de 0.5, 1 y 2 mg / kg del

10 compuesto IIa, y de 1.75, 3.5, y 7.5 mg / kg de SB-715992. A los 5 días después de la última dosis, los tumores empezaron a crecer en los grupos tratados con 0,5 mg / kg del compuesto IIa y con 1,75 mg / kg de SB-715992. Luego, a los 30 días después de Ia dosificación, los tumores empezaron a crecer en el grupo tratados con 7,5 mg / kg de SB-715992. Las dosis de 1 y 2 mg / kg del compuesto IIa provocaron regresiones de largo plazo, con 6 y 5 regresiones tumorales completas durante más de 100 días, respectivamente. Las dosis de los agentes de prueba

15 fueron en general bien toleradas, con una pérdida de peso media máxima lt;10%.

Tabla 9 - Estudio 2: Resumen de la eficacia antitumoral y tolerabilidad del Compuesto lla contra tumores de xenoinjerto subcutáneo de LMA humana MV4;11

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta LT/ LC, Día 21 (%) Regresión máxima en % (Día) L del volumen del tumor, Día 21 (mm3) CR L máximo de peso corporal (Día) (g) L máximo de peso corporal (Día) (%) Superviv (vivos / total)

Vehículo (20% de Captisol): q4d x 3, i.v. 100 - 574 ± 84 0 0,3 ± 0,24 (D10) 1,1 ± 0,9, D10 9/9

COMPUESTO IIa: 0.13 mg/kg, q4d x 3, i.v 161 - 921 ± 341 0 -0,6 ± 1,0 (D10) 2,3 ± 1,7 (D10) 9/9

COMPUESTO IIa: 0.25 mg/kg, q4d x 3, i.v 133 - 765 ± 196 0 0,2 ± 0,14, (D10) 0,64 ± 0,5 (D10) 9/9

COMPUESTO IIa: 0.5 mg/kg, q4d x 3, i.v 20 55 (D10) 114 ±1 10 0 -0,6 ± 0,24 (D7) -2,5 ± 0,8 (D7) 9/9

COMPUESTO IIa: 1 mg/kg, q4d x 3, i.v - 89 (D63) -194 ± 27 6 -0,3 ± 0,2 (D7) -1,1 ± 0,7 (D7) 9/9

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

COMPUESTO IIa: 2 mg/kg, q4d x 3, i.v - 87 (D63) -201 ± 23 5 -0,1 ± 0,14 (D3) -0,4 ± 0,6 (D3) 9/9

SB-715992: 1.8 mg/kg, Q4dx3, i.v 59 - 339 ± 218 0 0,5 ± 0,4 (D10) 2,0 ± 1,0 (D10) 9/9

SB-715992: 3.5 mg/kg, Q4dx3, i.v 44 41 (D10) 251 ± 132 0 0,2 ± 0,3 (D3) 0,7 ± 0,3 (D3) 9/9

SB-715992: 7.5 mg/kg, Q4dx3, i.v -* 75 (D31) -204 ± 20 3 -0,4 ± 0,8 (D10) -1,4 ± 1,3 (D10) 9/9

Resultados, modelo de enfermedad de LMA diseminada: Se evaluó la actividad del compuesto lla en un modelo de

5 enfermedad de AML diseminada de V4;11-Iuc, en donde se implantaron células tumorales en forma intravenosa. La administración del tratamiento se inició 28 días después del implante celular, momento en el cual los animales están en una etapa avanzada de la enfermedad, como se indica por la extensa señal de bioluminiscencia. Los resultados se muestran en la Tabla 10. En la toma inicial de imágenes, se observó la señal de bioluminiscencia en el hueso (mandíbula, cráneo, columna vertebral, y huesos largos), pero también se diseminó a través de todo el cuerpo,

10 incluyendo el pulmón y el hígado. Por consiguiente, posteriormente se registró la emisión de fotones a partir de todo el cuerpo (vistas dorsal + ventral). Estas lesiones condujeron finalmente a parálisis de las extremidades posteriores, con una pérdida de peso corporal significativa ocasional debido a la carga tumoral, momento en el cual los ratones se sacrificaron. Esto se denominó como “supervivencia condicional”.

EI monitoreo serial del cuerpo entero de la emisión de fotones de MV4;11-Iuc en los ratones se realizó hasta que el

15 primer ratón sucumbió a la enfermedad, lo cual sucedió después del día 12 del estudio. Las dosis de 0,5 y 1 mg / kg del compuesto lla administradas q4d x 3, redujeron de una manera significativa la señal de bioluminiscencia, comparable con el grupo tratado con vehículo (p lt; 0,05), una medida de la carga de la enfermedad, mientras que el efecto del tratamiento con 0,25 mg / kg no fue significativamente diferente de aquél del vehículo. El compuesto lla fue bien tolerado en estas dosis. El compuesto lla retardó de una manera significativa la inducción de parálisis de las

20 extremidades posteriores, y mejoró la supervivencia de los ratones con las tres dosis, comparable con la cohorte tratada con vehículo (p lt; 0,05). La supervivencia media en el grupo tratado con vehículo fue de 15 días, mientras que aquélla de los grupos tratados con 0,25, 0,5, y 1 mg / kg del compuesto lla fue de 27, 31, y 30 días, respectivamente. La reducción dependiente de la dosis temprana en la carga tumoral (bioluminiscencia) que ocurrió durante el tiempo de la dosificación, no se tradujo en un incremento dependiente de la dosis en la supervivencia.

25 Parece que una vez que empeoró el efecto del compuesto, la enfermedad progresó rápidamente en todos los grupos.

Tabla 10 - Eficacia del Compuesto lla administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en el modelo de enfermedad diseminada MV4;11.

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta LT/ LC, Día 12 (%) Regresión, Día 12 (%) L de bioluminiscencia del tumor, Día 12 (fotones / s) Mediana de los días de supervivencia L máxima de peso corporal (Día) (g) L máxima de peso corporal (Día) (%)

Vehículo (20% de Captisol): q4d x 3, i.v. 100 - 9,2 x 108 ± 2,6 x 106 15 -0,64 ± 0,16 (D6) -3,6 ± 0,92 (D6)

COMPUESTO IIa: 0. 25 mg/kg, q4d x 3, i.v 46 - 4,3 x 108 ± 2,0 x1 08 27** 1,1 ± 0,44 (D5) 5,6 ± 1,3 (D5)

COMPUESTO IIa: 0.5 mg/kg, q4d x 3, i.v - 9* -4,0 x 106 ± 1,3 x 107 31** -0,57 ± 0,45 (D10) -2,6 ± 2,3 (D10)

(continuación)

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

COMPUESTO IIa: 1 mg/kg, q4d x 3, i.v - 80* -3,9 x 107 ± 1,4 x 107 30** -0,77 ± 0,32 (D10) -4,2 ± 1,7 (D10)

Ejemplo 11: Evaluación de la eficacia de los inhibidores de KSP en xenoinjertos de tumor KMS-11-Iuc de mieloma múltiple humano

Se evaluó la eficacia del compuesto lla contra xenoinjertos de tumor KMS-11-Iuc de mieloma múltiple humano. Primero se probó la eficacia en un modelo de xenoinjerto de tumor subcutáneo en ratones con esta línea, en donde el compuesto lla indujo un efecto antitumoral notorio. Debido a que el microambiente de la médula ósea juega un papel importante en el crecimiento y la supervivencia de las células de mieloma, se evaluó adicionalmente la efectividad en un modelo de la enfermedad diseminada KMS-11-Iuc en ratones, en donde las células preferencialmente se establecen y crecen en el sitio ortotópico de la médula ósea. La expresión del gen reportero de Iuciferasa en las células permitió monitorear de una manera comprensiva en serie el crecimiento de las lesiones de mieloma en el hueso, mediante la toma de imágenes de bioluminiscencia.

Los experimentos se llevaron a cabo utilizando ratones hembras SCID-Beige inmunodeficientes de aproximadamente 7 a 8 semanas de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). A su llegada, los animales recibieron un implante de microchip subcutáneo (AVID, Folsom, LA) en la región subescapular, para la identificación de los individuos. Se dejó que los animales se aclimataran durante una semana antes de iniciar cualquiera de los procedimientos experimentales. El cuidado animal de rutina y la garantía de bienestar fueron como se describió anteriormente.

Las células de mieloma múltiple KMS-11-Iuc humano se obtuvieron a través del laboratorio de Suzanne Trudel en la Universidad de Toronto (Ontario, Canadá), y se comprobó que estaban libres de Mycoplasma sp. y de virus de murino, en el panel de ensayo de PCR IMPACT1 (RADIL, Universidad de Missouri, Columbia, MO). Antes de que se recibiera esta línea celular, se había modificado por ingeniería genética en forma estable para expresar la Iuciferasa, mediante transfección retroviral del vector pGC-gfp/Iuc. Las células KMS-11-Iuc se cultivaron en un medio de Iscove complementado con 2 mmoles / L de L-glutamina (Mediatech, Inc., Hemdon, VA), y suero bovino fetal al 10% (JRH Biosciences, catálogo # 12003-1000M). Estas células se cultivaron como cultivos en suspensión, mantenidos a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5%. Las células se cultivaron por lo menos durante 10 pasadas antes de usarse. Las células se cosecharon aproximadamente a razón de 2 millones de células/mL, y se centrifugaron a aproximadamente 800 x g durante 5 minutos a 4 ºC, y luego se volvieron a suspender en una mezcla en proporción 1:1 de solución salina balanceada de Hank fría (HBSS) y MatrigelMR (Mediatech, Inc., catálogo # 2-O21-CV; BD Biosciences, catálogo # 354234, respectivamente), en una concentración de 50 millones de células / mL para el implante subcutáneo (volumen de inyección de 0,2 mL). Alternativamente, para el modelo de la enfermedad diseminada, las células se prepararon solamente en HBSS frío, en una concentración de 100 millones de células / mL para el implante intravenoso (i.v.) por medio de la vena de la cola (volumen de inyección de 0,1 mL).

El compuesto lla y el SB-715992 (base libre) se formularon en Captisol al 20 %, para un volumen de dosis de 8 mL / kg. Las dosis se ajustaron al peso corporal de cada animal. Las formulaciones se hicieron una vez al principio del estudio, y se guardaron a temperatura ambiente. EI paclitaxel de grado clínico se adquirió previamente mezclado en un vehículo basado en cremóforo (Mayne Pharma, ahora Hospira, Lake Forest, IL, catálogo # NDC-6170334209), y se diluyó en suero estéril para proporcionar un volumen de dosis de 16 mL / kg, para una dosis de 30 mg / kg administrada en forma intraperitoneal.

Para la evaluación de eficacia en el modelo de tumor subcutáneo, se inyectaron en forma subcutánea 10 millones de células combinadas en una mezcla en proporción 1:1 de HBSS y MatrigelMR en el costado derecho, en un volumen total de 200 mL / ratón. Los ratones se seleccionaron en forma aleatoria 11 días después del implante, y se inscribieron 54 ratones con un volumen tumoral promedio de aproximadamente 140 mm3. Los xenoinjertos de tumores se midieron en dos dimensiones (L x A) con calibradores digitales dos veces por semana desde el inicio de la dosificación en el Día 0. El volumen del tumor se calculó como (L x A2)/2. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana, y las observaciones clínicas se registraron diariamente. El volumen del tumor y los pesos corporales se capturaron y se almacenaron mediante el software StudyDirector (StudyLog, South San Francisco, CA). El análisis de datos fue como se describió anteriormente.

Para la evaluación de eficacia en el modelo de la enfermedad diseminada, se inyectaron en forma intravenosa 10 millones de células en HBSS por medio de la vena de la cola, en un volumen total de 100 mL / ratón. Cuarenta ratones se seleccionaron en forma aleatoria, y se inscribieron en el estudio 10 días después del implante, con un conteo de fotones medio en los huesos de la pata (derecha + izquierda) de aproximadamente 9 x 105 fotones/segundo, como se determinó mediante la toma de imágenes de bioluminiscencia. Aproximadamente 10 minutos antes de tomar las imágenes, se inyectaron los ratones en forma intraperitoneal con 150 mg / kg de Iuciferina (Xenogen Corporation, Alameda, CA), seguido por anestesia con isoflurano. La emisión de fotones se midió utilizando una cámara de un dispositivo acoplado de carga en el sistema de toma de imágenes IVIS (Xenogen Corporation). En resumen, se capturó una imagen en escala de grises de los ratones, seguida por una superposición de un mapa de bioluminiscencia que representaba la distribución espacial de los fotones detectados a partir de la Iuciferina disociada en las células cancerosas que expresaban la Iuciferasa. La intensidad de la señal se cuantificó utilizando una versión personalizada del software IGOR Pro versión 4.09A (WaveMetrics, Inc., Lake Oswego, OR), denominada Living Image versión 2.50.2 (Xenogen). Se determinó la suma de todos los recuentos de fotones detectados a partir de las vistas dorsal + ventral. La bioluminiscencia de las células cancerosas en los animales se midió tomando imágenes en los días designados, hasta que el primer ratón desarrolló parálisis del miembro trasero debido a la carga de la enfermedad, el punto final principal para cuando se sacrifican humanitariamente los ratones. Se registró el día de la eutanasia para cada ratón, y se graficó el porcentaje restante de ratones sobrevivientes con el tiempo (análisis de supervivencia de Kaplan-Meier). Los valores P se calcularon utilizando la prueba log-rank (Software Graph Pad Prism 4.0), para evaluar las diferencias entre los grupos tratados y de control (p lt; 0,05 se consideró significativo). Los pesos corporales se midieron dos veces por semana, y las observaciones clínicas se registraron diariamente. Los pesos corporales se capturaron y se almacenaron mediante el software StudyDirector (StudyLog, South San Francisco, CA). El análisis de datos se llevó a cabo como se describió anteriormente.

Resultados, modelo de xenoinjerto de tumor KMS-11-luc subcutáneo: El estudio de eficacia en el modelo de tumor subcutáneo evaluó la actividad de un intervalo de dosis del compuesto lla administradas en el programa q4d x 3, con una dosis alta de 1 mg / mg, que es aproximadamente la mitad de su más alta dosis tolerada en los ratones SClD-Bg. La actividad del compuesto lla se comparó con la del SB-715992 (Ispinesib, un inhibidor de KSP de Cytokinetics que está en estudios clínicos) a la mitad de su más alta dosis tolerada de 7,5 mg / kg, y el paclitaxel en su más alta dosis tolerada de 30 mg / kg 24d x 3. Los resultados se muestran en la Tabla 11. Se observó regresión del tumor hasta diferentes grados en todos los grupos de tratamiento durante el intervalo de dosificación; sin embargo, el crecimiento tumoral se reasumió después de terminar la dosificación. El nuevo crecimiento tumoral empezó más pronto, y procedió más rápidamente, en los ratones tratados con las dosis más bajas del compuesto lla. A los 8 días después del final del tratamiento, se observó el nuevo crecimiento tumoral en los grupos tratados con paclitaxel y con 0,5 mg / kg del compuesto lla. A los 13 días después del tratamiento, se observó el nuevo crecimiento tumoral en el grupo tratado con 0,5 mg / kg del compuesto lla. Las dosis de 1 mg / kg de compuesto lla y de 7,5 mg / kg de SB-715992 dieron como resultado la máxima regresión de los tumores KMS-11-Iuc en un 56% y en un 49% (p lt; 0,05), respectivamente, y no se presentó un nuevo crecimiento tumoral hasta aproximadamente 4 semanas después del final del tratamiento. Las dosis de los agentes de prueba fueron en general bien toleradas, con una pérdida de peso promedio máxima de lt;10%, con Ia excepción de Ia dosis de 1 mg / kg del compuesto IIa, que dio como resultado una pérdida de peso corporal promedio del 12% a los 10 días después del inicio de Ia dosificación. Un ratón de este grupo perdió el 20% del peso corporal, y se removió del estudio. Todos los demás ratones de ese grupo se recuperaron de cualquier pérdida de peso corporal después de la última dosis.

Tabla 11 - Eficacia del Compuesto IIa administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en el modelo de xenoinjerto de tumor KMS-11-luc subcutáneo.

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta T/C, Día 31 (%) Regresión máxima en % (Día) L del volumen del tumor, Día 31 (mm3) L máximo de peso corporal (Día) (g) L máximo de peso corporal (Día) (%) Superviv. (vivos / total)

Vehículo (20% de Captisol): Q4d x 3, i.v. 100 - 2150 ± 191 0,31 ± 0,33 (D10) 1,74 ± 1,37 (D10) 9/9

COMPUESTO IIa: 0. 25 mg/kg, Q4d x 3, i.v 25 24 (D7) 527 ± 152 -1,4 ± 1,2, (D10) -6,68 ± 1,67 (D10) 9/9

COMPUESTO IIa: 0.5 mg/kg, Q4d x 3, i.v 10 42 (D10) 221 ± 71 -0,94 ± 0,3 (D10) 4,58 ± 1,67 (D10) 9/9

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

COMPUESTO IIa: 1 mg/kg, Q4d x 3, i.v 0,1* 56 (D17) 1,5 ± 26 -2,76 ± 0,65 (D10) -12,69 ± 5,0 (D10) 8/9

SB-715992: 7.5 mg/kg, Q4dx3, i.v. -* (D14) 49, (D14) -46 ± 19 -0,96 ± 0,31 (D10) -4,8 ± 1,93 (D10) 9/9

Paclitaxel: 30 mg/kg, Q4dx3, i.p. 30 5 (D3) 640 ± 190 -0,63 ± 0,22 (D3) -2,95 ± 1,0 (D10) 9/9

Resultados del modelo de tumor KMS-11-Iuc diseminado: EI tratamiento con el fármaco se inició 10 días después

5 del implante celular. Las imágenes de bioluminiscencia mostraron una señal incrementada a través del tiempo en el grupo tratado con vehículo, sugiriendo la localización en las regiones fuera de la región esquelética, incluyendo pulmón, hígado, y bazo. Sin embargo, la señal de bioluminiscencia predominante pareció ser esquelética, con múltiples fuentes de señal, incluyendo los huesos largos, el cráneo, las raíces de los dientes/mandíbula, pelvis, y columna vertebral, en la mayoría de los ratones. Los análisis histológicos de los fémures recolectados de los

10 estudios anteriores con este modelo, han confirmado la infiltración de las células de mieloma hacia la médula ósea (Xin y colaboradores, 2006 Clin. Cancer Res. Aug. 15; 12(16): 4908 - 15). El progreso de la enfermedad condujo primordialmente a parálisis de las extremidades posteriores, con una pérdida de peso corporal significativa ocasional debida a la carga tumoral, en cuyo momento, los ratones se sacrificaron humanitariamente. Esto se denominó como “supervivencia condicional”.

15 Los resultados se muestran en la Tabla 12. Las dosis de 0,5 y 1 mg / kg del compuesto lla administradas q4d x 3, redujeron de una manera significativa la señal de bioluminiscencia, una medida de la carga global de la enfermedad; sin embargo, el grupo tratado con 0,25 mg / kg no fue estadísticamente diferente del grupo tratado con vehículo. El porcentaje de regresión de la señal del 47% el día 13 de los ratones tratados con la dosis de 1 mg / kg, fue acompañado por una pérdida de peso corporal de gt;20% el día 13 en un ratón de este grupo. Todos los demás

20 animales de ese grupo toleraron esta dosis. En las dosis más bajas, el compuesto lla fue bien tolerado.

Esta inhibición dependiente de la dosis de la carga de la enfermedad, medida mediante bioluminiscencia, dio como resultado una demora similar en la parálisis de las extremidades posteriores, y por lo tanto, una mejor supervivencia condicional de los ratones, comparable con la cohorte tratada con vehículo en todos los grupos. La supervivencia media en el grupo tratado con vehículo fue de 19 días, mientras que aquélla del grupo tratado con 0,25, 0,5, y 1 mg /

25 kg del compuesto lla fue de 29, 35, y 52 días, respectivamente.

Tabla 12 - Eficacia del Compuesto lla administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en el modelo de enfermedad diseminada KMS-11-Iuc.

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

Compuesto: Programa de dosis, ruta T/ C, Día 13 (%) Regresión, Día 13 (%) L de bioluminiscencia del tumor, Día 13 (fotones / s) Mediana de los días de supervivencia L máxima de peso corporal (Día) (g) L máxima de peso corporal (Día) (%)

Vehículo (20% de Captisol): q4d x 3, i.v. 100 - 1,5 x 108 ± 1,8 x 107 19** 1,3 ± 0,19 (D14) 5,9 ± 1,04 (D14)

COMPUESTO IIa: 0,25 mg/kg, q4d x 3, i.v. 15 - 2,2 x 107 ± 1,1 x 106 29** 2,1 ± 1,23 (D14) 5,0 ± 2,0 (D14)

COMPUESTO IIa: 0,5 mg/kg, q4d x 3, i.v. 0,7* - 1,1 x 106 ± 5,8 x 105 35** 2,5 ± 0,23 (D14) 6,7 ± 1,1 (D14)

(continuación)

Respuesta del tumor: Respuesta del huésped

COMPUESTO IIa: 1 mg/kg, q4d x 3, i.v. -* 47 -4,3 x 105 ± 1,7 x 105 52** -0,74 ± 0,75 (D13) -3,3 ± 4,0 (D13)

Ejemplo 12: Los compuestos de la Fórmula II son efectivos contra los tumores resistentes a fármacos

Los experimentos pre-clínicos in vivo han demostrado que los compuestos de la Fórmula II son inesperadamente superiores a los compuestos estructuralmente similares que no tengan un grupo hidroxilo o un grupo hidroxilo de profármaco en la fracción de acilo. Los modelos de tumor que expresan una bomba de flujo de salida, la glicoproteína P de membrana de plasma (P-gp), se analizaron para determinar su sensibilidad a los compuestos de la Fórmula II y a otros fármacos, incluyendo los compuestos estructuralmente similares que carecen del grupo hidroxilo (o del grupo aciloxi) que está presente en los compuestos de la Fórmula II. P-gp es un mecanismo de resistencia del tumor, y tal vez el ejemplo mejor entendido y más clásico de un mecanismo de resistencia al flujo de salida. Se seleccionó el modelo de xenoinjerto subcutáneo de carcinoma cervical humano KB8.5 para el cribado farmacológico y la posterior selección y evaluación de estos compuestos; corresponde a la línea celular KB3.1, y difiere solamente por tener la bomba de flujo de salida. Los compuestos de la Fórmula II se compararon con otros inhibidores de KSP, así como con el paclitaxel, que se sabe que es afectado por la P-gp. El estudio descrito en la presente invención demuestra que los compuestos de la Fórmula ll (por ejemplo, los compuestos lla y llc) son eficaces in vivo contra un tumor que expresa P-gp, y que es resistente a otros fármacos, mientras que un compuesto similar de Fórmula II que carecía del grupo hidroxilo, no fue activo contra este tumor.

Materiales

Tabla - 1 Características del Animal

Especie Cepa Vendedor Genero Peso Edad

Ratón (Mus musculus) nu/nu Charles River, Hollister, CA hembra 25 g 6 - 8 semanas

Los experimentos se llevaron a cabo utilizando ratones nu/nu atímicos producidos por mezcla de razas (Charles River Laboratories) de aproximadamente 6 a 8 semanas de edad. Cuando arribaron, los ratones recibieron un implante de microchip subcutáneo (AVID, Folsom, LA) en la región subescapular, para la identificación de los individuos. Se dejo aclimatarse a los ratones durante una semana antes de que se iniciara cualquier de los procedimientos experimentales.

Condiciones de Mantenimiento

Los ratones se alojaron a razón de 4 a 5 animales por jaula, en jaulas microaislantes de policarbonato transparente, con un ciclo de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad, a temperaturas de entre 70 y 80 grados Fahrenheit y con una humedad relativa del 30 - 70%. Se proporcionó alimento (croquetas para roedores de Purina) y agua al gusto.

Condiciones Experimentales

Las células KB8.5 se cultivaron en DMEM con L-glutamina 2 mM (Mediatech, catálogo # 10-013-CV) complementado con suero bovino fetal al 10% (JRH Biosciences, catálogo # 12003-1000M). Una vez que las células KB8.5 demostraron un buen índice de crecimiento, se agregaron 10 ng / mL de colchicina para mantener los niveles de expresión de P-gp.

Estas células se cultivaron como cultivos adherentes, se mantuvieron a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía dióxido de carbono al 5%. Las células se cultivaron por lo menos durante 10 pasadas antes de usarse. Las células se cosecharon con una confluencia del 95%, y se centrifugaron aproximadamente a 800 x g durante 5 minutos a 4 ºC, y luego se volvieron a suspender en una relación 1:1 de HBSS (Mediatech Inc., catálogo # 21-021

CV) más MatrigelMR en una concentración de 25 millones de células / mL para el implante subcutáneo de la línea KB8.5 (volumen de inyección de 0,2 mL).

Compuestos y Formulaciones

El compuesto lla, el compuesto Ilc, el compuesto la (mostrados más adelante), y el SB-715992, se formularon en una formulación basada en Captisol®. Las dosis se administraron en forma intravenosa (i. v.), y se ajustaron al peso corporal de cada animal. Las formulaciones se hicieron una vez al principio del estudio, y se guardaron a temperatura ambiente. El paclitaxel de grado clínico se adquirió previamente mezclado en un vehículo basado en cremóforo (Mayne Pharma, ahora Hospira, Lake Forest, IL, catálogo # NDC-6170334209), y se diluyó en suero estéril, para proporcionar un volumen de dosis de 16 mL / kg, para una dosis de 30 mg / kg administrada en forma intraperitoneal (i. p.):

El compuesto la es estructuralmente similar a los compuestos de Fórmula II, pero tiene un grupo metoxi en lugar de un grupo hidroxilo o de un grupo aciloxi, y su actividad in vitro contra la KSP es muy similar a las actividades de los compuestos lla y llc. Por ejemplo, en el ensayo de CellTiter-Glo®, el valor GI50 medido para el compuesto la sobre la célula HCT-15 fue de 0,3 nM, que es equivalente al del compuesto lla (véase el Ejemplo 2). De una manera similar, se midió un valor de 0,4 nM para las líneas celulares KB3.1 y KB8.5 para el compuesto la, mientras que se midieron valores de 0,6 nM y de 0,5 nM para el compuesto lla sobre estas mismas líneas (véase el Ejemplo 2). Sin embargo, los compuestos de la Fórmula II tienen un hidroxilo libre sobre el grupo acilo (o un grupo aciloxi que es un profármaco para un hidroxilo libre), mientras que el la tiene un metil éter en su lugar. El metil éter es bien tolerado por el sitio activo, como se demuestra por su actividad in vitro, y en particular también es muy efectivo sobre las líneas celulares resistentes a P-gp in vitro. Además, se podría esperar que sea menos susceptible a la activación metabólica que los compuestos de Fórmula II in vivo. En realidad, como lo ilustran los datos de la siguiente Tabla, la comparación de los parámetros farmacocinéticos muestra que el compuesto la exhibe una más alta exposición y una mayor estabilidad metabólica in vivo, que los compuestos de las Fórmula lla y llc. De una manera sorprendente, aunque los compuestos de Fórmula II son convenientes in vivo en relación con los compuestos conocidos en la técnica anterior contra los cánceres que expresan P-gp, debido a que el cáncer de xenoinjerto resistente a P-gp fue sensible a los compuestos de la Fórmula II, pero no al Compuesto la.

En forma interesante, también se encontró que los compuestos de la Fórmula II son significativamente más eficaces que los compuestos que carecen completamente del hidroxilo, por ejemplo, un compuesto de la Fórmula lb:

El compuesto lb es mucho menos activo in vitro que los compuestos de la Fórmula II, que tienen una IC50 de 22 nM, comparado con los compuestos lla y llc, que cada uno tiene una IC50 menor a 1 nM. El compuesto lb no se probó en

40 10

el modelo de xenoinjerto, debido a que su farmacocinética y su actividad in vitro eran demasiado desfavorables para esperar eficacia in vivo. Se había demostrado que tiene una disponibilidad in vivo mucho más baja, con base en los datos que muestran que exhibió una velocidad de eliminación más alta y una AUC más baja (“área debajo de la curva”, una forma estándar de medir la exposición in vivo de un sujeto de prueba a un compuesto), y también fue mucho menos activo en el sitio objetivo, como se muestra por su IC50 más alta. En comparación, los compuestos la, lla, y Ilc, exhibieron cada uno mejores efectos farmacocinéticos in vivo, así como una actividad in vitro superior, y se probaron en el cáncer de xenoinjerto.

Compuesto: Actividad in vitro (IC50 - nm) Tasa de eliminación in vivo (mL/min/kg) Vida media in vivo (min) AUC (ng-min/mL)

Ia: 0,6 29 117 160.000

Ib: 22 94 90 52.000

lla: 0,8 41 110 116.000

llc: 0,9 47 110 102.000

Por lo tanto, los compuestos de la Fórmula II son más efectivos in vitro y son más persistentes in vitro que el Compuesto lb, e inesperadamente se demostró que son efectivos sobre los cánceres resistentes a fármacos que expresan una bomba de flujo de salida de resistencia a múltiples fármacos (RMF), mientras que el compuesto la fue inefectivo contra el mismo cáncer RMF, a pesar de su igual potencia sobre las líneas celulares de P-gp in vitro, y su más alta disponibilidad en el animal de prueba (velocidad de eliminación más baja y AUC más alta).

Métodos del estudio

Para los estudios de eficacia, se inscribieron los ratones con un volumen tumoral medio de aproximadamente 300 mm3. Los xenoinjertos de tumores se midieron en dos dimensiones (L x A) con calibradores digitales dos veces por semana desde el inicio de la dosificación en el Día 0. El volumen del tumor se calculó como (L x A2)/2. Los pesos corporales se midieron dos veces por semana, y las observaciones clínicas se registraron diariamente. El volumen del tumor y los pesos corporales se capturaron y se almacenaron mediante el software StudyDirector (StudyLog, South San Francisco, CA).

Análisis de Datos

Se calcularon los valores de porcentaje de tratamiento/control ( T/ C) para los volúmenes tumorales, utilizando la siguiente Fórmula:

% T/AC = 100 x T/ C

en donde:

T = volumen promedio del tumor del grupo tratado con fármaco el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo tratado con fármaco el día inicial de la dosificación;

C = volumen promedio del tumor del grupo de control el día final del estudio - volumen promedio del tumor del grupo de control el día inicial de la dosificación.

Todos los datos se expresaron como la media y SEM. Se llevaron a cabo comparaciones entre grupos para las mediciones finales de los tumores, utilizando un análisis por pares de ANOVA de una vía. La significancia se determinó utilizando el ANOVA de una vía de KruskaI-Wallis en Ranks, seguido por una prueba post-hoc (método de Dunn para la prueba de Tukey) para múltiples comparaciones por pares. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando SigmaStat (Systat Software Inc., San José, CA).

Evaluaciones de eficacia en los modelos de xenoinjerto que expresan P-gp.

Se condujeron estudios de eficacia de múltiples dosis, con la misma dosis de 5 mg / kg, en un programa q4d x 3 en estos modelos, comparando la actividad del compuesto lla y el compuesto la. Para el compuesto Ilc, no se toleró bien la dosis de 2,5 mg / kg, y de esta manera, la comparación de efectividad fue con el nivel de dosis de 1,25 mg / kg. Los resultados en la Figura 3 y de la Tabla 13 indican que el Compuesto lla demuestra una eficacia antitumoral

significativa en el modelo, con un porcentaje LT/LC del 19 % (p lt; 0,05) en el modelo de xenoinjerto KB8.5 en el día

11.

Tabla 13. Eficacia del Compuesto lla administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en un modelo de xenoinjerto de tumor KB8.5.

Respuesta del tumor Respuesta del huésped

Compuesto Programa de dosis, LT/LC, Día 11 (%) L Supervivencia (vivos

ruta máxima de peso / total)

corporal en %, (Día) Vehículo i.v., q4dx3 100 6 (D7) 9/9 Compuesto IIa 5 mg/kg, i.v., q4dx3 19* -2 (D11) 9/9 SB-715992 15 mg/kg, i.v., q4dx3 56 4 (D7) 9/9 Paclitaxel 30 mg/kg, i.v., q4dx3 78 5 (D11) 9/9 Se establecieron las células KB8.5 en ratones nu/nu hembra (Charles River) mediante la inyección subcutánea de 5x106 células en 0,2 mL de una relación 1:1 de HBSS más MatrigelMR en el costado derecho de los ratones. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 300 mm3, se seleccionaron en forma aleatoria los ratones con base en los volúmenes tumorales, en los grupos de tratamiento (n = 9). Los compuestos se administraron en los niveles de dosis y en los programas indicados. El efecto del tratamiento sobre los volúmenes tumorales y los pesos corporales se presenta como la media ± SEM. El experimento se evaluó en el día 11 del tratamiento. *p lt; 0,05 vs el vehículo y SB-715992 (ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis sobre Ranks / Método de Dunn).

De la misma manera, los resultados de la Figura 4 y de la Tabla 14 indican que el compuesto llc demuestra una eficacia antitumoral significativa en este modelo, con un porcentaje de LT/LC del 39% (p lt; 0,05) en el día 11.

Tabla 14 - Eficacia del Compuesto Ilc administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en el modelo de xenoinjerto de tumor KB8.5.

Respuesta del tumor Respuesta del huésped Compuesto Programa de dosis, ruta LT/LC, Día 11 (%) L Supervivencia (vivos máxima de peso / total)

corporal en %, (Día) Vehículo i.v., q4dx3 100 +8 (D11) 9/9 Compuesto IIc 1,25 mg/kg, i.v., q4dx3 39* -5 (D11) 9/9 Compuesto IIc 2,5 mg/kg, i.v., q4dx3 No aplicable -10 (D8) Todos muertos el

Día 8 debido a que 4/9 ratones tenían 15% de pérdida de

peso o más SB-715992 15 mg/kg, i.v., q4dx3 77 -1 (D7) 9/9 Paclitaxel 30 mg/kg, i.v., q4dx3 87 +3 (D11) 9/9 Se establecieron las células KB8.5 en ratones nu/nu hembra (Charles River) mediante la inyección subcutánea de 5x106 células en 0,2 mL de una relación 1:1 de HBSS más MatrigelMR en el costado derecho de los ratones. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 339 mm3, se seleccionaron en forma aleatoria los ratones con base en los volúmenes tumorales, en los grupos de tratamiento (n = 9). Los compuestos se administraron en los niveles de dosis y en los programas indicados. El efecto del tratamiento sobre los volúmenes tumorales y los pesos corporales se presenta como la media ± SEM. El experimento se evaluó en el día 11 del tratamiento. *p lt; 0,05 vs el vehículo (ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis sobre Ranks / Prueba de Tukey).

En contraste, un compuesto similar que carecía de un hidroxilo sobre Ia fracción de acilo, y que tenía en su lugar un metoxi, el compuesto Ia, no fue eficaz en el modelo de xenoinjerto de tumor KB8.5, como se muestra en la Figura 5 Tabla 15.

Tabla 15 - Eficacia del Compuesto la administrado en un programa de dosificación q4d x 3 en modelos de xenoinjerto de tumor KB8.5.

Compuesto Vehículo Compuesto Ia Compuesto Ia: Programa de dosis, ruta i.v., q4dx3 1,25 mg/kg, i.v., q4dx3 2,5 mg/kg, i.v., q4dx3 Respuesta del tumor LT/LC, Día 11 (%) 100 84 61 Respuesta del huésped L máxima de peso corporal en %, (Día) Supervivencia (vivos / total) 4 (D11) 10/10 1 (D11) 10/10 -0,4 (D4) 10/10

42

(continuación)

Respuesta del tumor Respuesta del huésped

Compuesto Programa de dosis, ruta LT/LC, Día 11 (%) L Supervivencia (vivos

máxima de peso / total)

corporal en %, (Día) Compuesto Ia 5 mg/kg, i.v., q4dx3 66 -2 (D4) 10/10 SB-715992 15 mg/kg, i.v., q4dx3 60 -3 (D11) 10/10 Paclitaxel 30 mg/kg, i.v., q4dx3 60 -2 (D4) 10/10 Se establecieron las células KB8.5 en ratones nu/nu hembra (Charles River) mediante la inyección subcutánea de 5x106 células en 0,2 mL de una relación 1:1 de HBSS más MatrigelMR en el costado derecho de los ratones. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 285 mm3, se seleccionaron en forma aleatoria los ratones con base en los volúmenes tumorales, en los grupos de tratamiento (n = 10). Los compuestos se administraron en los niveles de dosis y en los programas indicados. El efecto del tratamiento sobre los volúmenes tumorales y los pesos corporales se presenta como la media ± SEM. El experimento se evaluó en el día 11 del tratamiento. Ninguno de los grupos fueron estadísticamente diferentes del grupo del vehículo (ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis sobre Ranks).

No se observó una pérdida de peso corporal significativa ni signos externos de toxicidad en ninguno de los ratones tratados, excepto por una pérdida de peso significativa en el grupo tratado con 2,5 mg / kg del compuesto Ilc. La mayor actividad antitumoral que se observa en el modelo de KB8.5 positivo para P-gp demuestra una ventaja inesperada de los compuestos de la Fórmula ll sobre un compuesto similar de la Fórmula I que carece de la función hidroxilo que caracteriza a los compuestos de la Fórmula II.

Ejemplo 13: Los compuestos de la Fórmula II son efectivos contra muchos explantes de tumor

Se probó el compuesto lla contra un panel de líneas celulares y explantes de tumor en un ensayo de agar blando, como se describe en Fiebig, H. H., Maier, A., y Burger, A. M. (Clonogenic assay with established human tumour xenografts: correlation of in vitro to in vivo activity as a basis for anticancer drug discovery, Eur. J. Cancer 40, 802 820 (2004). La Tabla 16 enlista el tipo de cáncer, el número de la muestra, su valor Gl50 (la concentración necesaria para alcanzar una inhibición del 50 por ciento) en el ensayo, el logaritmo de la Gl50 (Iog(Gl50)), y la sensibilidad relativa de cada muestra (Diferencial). El diferencial se calcula sustrayendo el log(GI50) para cada línea celular del Iog(GI50) promedio a través de todo el panel (0,236 en este caso); un valor positivo indica una muestra que es más sensible que el promedio, mientras que un valor negativo muestra que es menos sensible que el promedio.

La mayoría de las indicaciones tienen muestras que son sensibles. La mayoría de los cánceres sensibles basados en este ensayo son: cánceres hematológicos (leucemia y linfoma, 5/5), cáncer pulmonar de células pequeñas (SCLC; 5/5), de mama (7/10), de vejiga (4/6), y sarcomas (4/7).

Tabla 16 - Actividad del Compuesto lla en diferentes líneas celulares de cáncer.

Tipo de cáncer: Muestra de tumor GI50 (nM) log(GI50) Diferencial

Leucemia (LLA): CCRFCEM 0,287 -0,542 0,779

Leucemia (LLA): JURKAT 0,106 -0,975 1,211

Leucemia (LMC): K562 0,27 -0,569 0,805

Leucemia (LLA): MOLT4 0,877 -0,057 0,293

Linfoma (LNH): U937 0,086 -1,066 1,302

NSCLC: 1012 0,926 -0,033 0,270

NSCLC: 289 4,899 0,690 -0,454

NSCLC: 526 1,265 0,102 0,134

NSCLC: 629 10 1,000 -0,764

NSCLC: 677 1,162 0,065 0,171

NSCLC: 737 3,068 0,487 -0,250

NSCLC: 1422 0,728 -0,138 0,374

NSCLC: 211 0,216 -0,666 0,902

NSCLC: 1176 3 0,477 -0,241

NSCLC: 1647 16,752 1,224 -0,988

SCLC: 538 0,339 -0,470 0,706

SCLC: 573 0,587 -0,231 0,468

SCLC: 615 0,082 -1,086 1,323

SCLC: 650 0,376 -0,425 0,661

SCLC: H69 0,269 -0,570 0,807

Colorrectal: 1034 0,214 -0,670 0,906

Tipo de cáncer: Muestra de tumor GI50 (nM) log(GI50) Diferencial

Colorrectal: 1044 0,612 -0,213 0,450

Colorrectal: 1103 1 0,000 0,236

Colorrectal: 1299 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 1297 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 158 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 1729 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 1753 11,279 1,052 -0,816

Colorrectal: 1788 2,246 0,351 -0,115

Colorrectal: 1783 0,721 -0,142 0,378

Colorrectal: 1784 5,969 0,776 -0,539

Colorrectal: 233 0,238 -0,623 0,860

Colorrectal: 243 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 260 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 268 6,24 0,795 -0,559

Colorrectal: 280 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 504 0,273 -0,564 0,800

Colorrectal: 533 1,753 0,244 -0,007

Colorrectal: 609 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 647 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 676 10 1,000 -0,764

Colorrectal: 742 1,873 0,273 -0,036

Colorrectal: 94LX 19,52 1,290 -1,054

Colorrectal: 975 10 1,000 -0,764

Melanoma: 1341 10 1,000 -0,764

Melanoma: 462 10 1,000 -0,764

Melanoma: 989 12,722 1,105 -0,868

Ovario: 1353 10 1,000 -0,764

Ovario: 899 10,000 1,000 -0,764

Próstata: 22RV1 0,537 -0,270 0,506

Próstata: DU145 1 0,000 0,236

Próstata: MRIH1579 10 1,000 -0,764

Próstata: PC3M 0,424 -0,373 0,609

Mama: 1162 0,286 -0,544 0,780

Mama: 1322 1,402 0,147 0,090

Mama: 1384 2,666 0,426 -0,189

Mama: 1398 0,239 -0,622 0,858

Mama: 401 0,563 -0,249 0,486

Mama: 449 0,534 -0,272 0,509

Mama: 574 10 1,000 -0,764

Mama: 583 0,239 -0,622 0,858

Mama: 713 0,244 -0,613 0,849

Mama: 857 2,456 0,390 -0,154

Vejiga: 1036 0,115 -0,939 1,176

Vejiga: 1218 0,509 -0,293 0,530

Vejiga: 1228 0,315 -0,502 0,738

Vejiga: 1258 17,076 1,232 -0,996

Vejiga: 1352 0,972 -0,012 0,249

Vejiga: 439 10 1,000 -0,764

Gástrico: 1172 10 1,000 -0,764

Gástrico: 209 10 1,000 -0,764

Gástrico: 214 9 0,954 -0,718

Sarcoma: 117 0,249 -0,604 0,840

Sarcoma: 1186 0,327 -0,485 0,722

Sarcoma: 1301 0,235 -0,629 0,865

Sarcoma: 1410 2,246 0,351 -0,115

Sarcoma: 417 0,16 -0,796 1,032

Sarcoma: 463 19,122 1,282 -1,045

Sarcoma: 627 10 1,000 -0,764

Tipo de cáncer: Muestra de tumor GI50 (nM) log(GI50) Diferencial

Páncreas: 1657 26,952 1,431 -1,194

Páncreas: 1861 0,623 -0,206 0,442

Páncreas: 1869 10,865 1,036 -0,800

Páncreas: 1876 0,337 -0,472 0,709

Páncreas: 1872 0,282 -0,550 0,786

Páncreas: 1881 2,316 0,365 -0,128

Páncreas: 1887 10 1,000 -0,764

Páncreas: 1900 16,933 1,229 -0,992

Páncreas: 1912 0,112 -0,951 1,187

Páncreas: 1937 0,185 -0,733 0,969

Páncreas: 546 2,591 0,413 -0,177

Páncreas: 736 1,265 0,102 0,134

Media: 1,724 0,236

Ejemplo 14: Los compuestos de Ia Fórmula II son efectivos contra muchas líneas celulares de tumor sólido

Se probó el compuesto IIa contra un panel de líneas celulares derivadas a partir de tumores sólidos, como se

5 describe en véase también McDermott, U., Sharma, S. V., DoweII, L., Greninger, P., Montagut, C., Lamb, J., Archibald, H., Raudales, FL, Tam, A., Lee, D., Rothenberg, S. M., Supko, J. G., Sordella, H., Ulkus, L.E., Iafrate, A. J., Maheswaran, 8., Njauw, C. N., Tsao, H., Drew, L., Hanke, J. H., Ma, X. J., Erlander, M. G., Gray, N. S., Haber, D. A., y Settleman, J. (2007), Identification of genotype-correlated sensitivity to select/ve kinase inhibitors by using highthroughput tumor cell line profiling. Proc. NatI. Acad. Sci. EUA 104, 19936 - 19941 (2007)). Las células se trataron

10 con el compuesto durante 72 horas, y se reportó Ia fracción de células sobrevivientes, en comparación con un control no tratado. La Tabla 17 enlista el nombre de Ia línea celular, el órgano de origen, Ia fracción de células sobrevivientes en las tres concentraciones probadas (0,2 nM, 2,0 nM y 20 nM), y un puntaje de sensibilidad. EI puntaje de sensibilidad era de 5 (las más sensibles) hasta 1 (las menos sensibles), y el puntaje fue como sigue: 5 = fracción sobreviviente � 0,2 a 0,2 nM; 4 = 0,2 lt; fracción sobreviviente � 0,5 a 0,2 nM; 3 = fracción sobreviviente gt; 0,5

15 a 0,2 nM, y � 0,5 a 2,0 nM; 2 fracción sobreviviente gt; 0,5 a 2,0 nM y � 0.5 a 20 nM; 1 = fracción sobreviviente gt; 0,5 a 20 nM.

Todas las indicaciones tienen muestras que son sensibles. Una de las muchas maneras posibles de clasificar estos cánceres por la sensibilidad, es calcular el puntaje de sensibilidad promedio para cada indicación (suma de puntajes de sensibilidad / número de muestras). Si se toman criterios muy estrictos utilizando un puntaje promedio de 3 o

20 más, la mayoría de los cánceres sensibles basados en este ensayo son: ovario (3,38), estómago (3,32), cerebro (3,21), piel (3,02), cuello uterino (3,00), y tiroides (3,00).

Tabla 17 - Actividad del Compuesto lla en diferentes líneas celulares de tumor sólido.

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

SCaBER: Vejiga 0,6666 0,0383 0,0238 3

1A6: Vejiga 0,9359 0,0473 0,0309 3

RT112/84: Vejiga 1,0884 0,0457 0,0312 3

5637: Vejiga 1,1044 0,0595 0,0423 3

EJ138: Vejiga 1,1072 0,0888 0,0712 3

RT-112: Vejiga 0,925 0,099 0,0915 3

SW 780: Vejiga 0,7289 0,091 0,0981 3

RT4: Vejiga 0,5091 0,1175 0,1008 3

T24: Vejiga 0,723 0,131 0,102 3

647-V: Vejiga 0,721 0,185 0,141 3

VM-CUB1: Vejiga 0,8161 0,1594 0,1497 3

SW-1710: Vejiga 0,7185 0,1353 0,1546 3

KU-19-19: Vejiga 0,9247 0,1929 0,1985 3

UM-UC-3: Vejiga 0,9804 0,2219 0,2074 3

BFTC-905: Vejiga 1,089 0,264 0,223 3

HT 1376: Vejiga 1,1586 0,2837 0,233 3

CAL-29: Vejiga 0,967 0,282 0,256 3

J82: Vejiga 0,7211 0,3475 0,2914 3

639-V: Vejiga 0,961 0,37 0,31 3

TCCSUP: Vejiga 1,0148 0,5876 0,4752 2

HT-1197: Vejiga 1,0133 0,9855 0,8308 1

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

CSR1: Hueso 0,2156 0,0818 0,0769 4

CS1: Hueso 0,4253 0,1844 0,1903 4

Hs 888.T: Hueso 0,4945 0,4138 0,3803 4

MHH-ES-1: Hueso 0,687 0,032 0,017 3

SK-ES-1: Hueso 0,9862 0,0606 0,0516 3

KHOS-240S: Hueso 0,925 0,071 0,065 3

Saos-2: Hueso 0,6146 0,118 0,1008 3

HOS: Hueso 1,033 0,078 0,118 3

RD-ES: Hueso 0,6036 0,2671 0,1397 3

KHOS-312H: Hueso 1,103 0,284 0,231 3

U-2 OS: Hueso 1,0283 0,241 0,2322 3

NY: Hueso 1,293 0,341 0,3 3

CAL-72: Hueso 0,9276 0,3256 0,3065 3

HuO-3N1: Hueso 0,9177 0,3533 0,3165 3

MG-63: Hueso 0,815 0,57 0,502 1

H-EMC-SS: Hueso 0,8996 0,604 0,5042 1

MC-IXC: Cerebro 0,079 0,047 0,033 5

SK-N-SH: Cerebro 0,1798 0,0495 0,0574 5

NB69: Cerebro 0,0922 0,0639 0,0662 5

Hs 683: Cerebro 0,4152 0,0858 0,0278 4

SK-N-AS: Cerebro 0,357 0,0895 0,0819 4

M059J: Cerebro 0,4307 0,1343 0,0874 4

SH-SY5Y: Cerebro 0,4428 0,1183 0,0946 4

Daoy: Cerebro 0,4727 0,0556 0,1088 4

MOG-G-CCM: Cerebro 0,2092 0,1363 0,1564 4

YKG-1: Cerebro 0,3102 0,1764 0,1624 4

CCF-STTG1: Cerebro 0,3804 0,3579 0,2861 4

GOS-3: Cerebro 0,4488 0,3264 0,2977 4

SK-N-MC: Cerebro 0,5584 -0,0017 -0,0048 3

U-251 MG: Cerebro 0,8575 0,0313 0,0321 3

BE(2)-C: Cerebro 0,757 0,0224 0,033 3

LNZTA3WT4: Cerebro 0,5274 0,0814 0,052 3

LNZTA3WT11: Cerebro 0,6268 0,0841 0,0567 3

T98G: Cerebro 0,6311 0,0972 0,0718 3

LN-229: Cerebro 0,7177 0,1241 0,0965 3

MOG-G-UVW: Cerebro 0,7682 0,1238 0,1114 3

H4: Cerebro 0,5851 0,1689 0,12 3

PFSK-1: Cerebro 0,5585 0,1428 0,1766 3

SW 1783: Cerebro 0,7547 0,2518 0,1872 3

SF-295: Cerebro 0,5622 0,2393 0,191 3

DK-MG: Cerebro 0,5941 0,228 0,1916 3

A172: Cerebro 0,6374 0,22 0,1923 3

GAMG: Cerebro 1,2891 0,2385 0,1923 3

1321N1: Cerebro 0,7485 0,2015 0,1977 3

CHP-212: Cerebro 0,946 0,267 0,216 3

LN-18: Cerebro 0,9918 0,238 0,2181 3

U-118 MG: Cerebro 0,9433 0,2612 0,2391 3

U373 MG: Cerebro 0,5474 0,307 0,2442 3

SW 1088: Cerebro 0,7941 0,242 0,2644 3

DBTRG-05MG: Cerebro 0,8442 0,387 0,2789 3

KG-1-C: Cerebro 0,9548 0,3391 0,3367 3

SCCH-26: Cerebro 0,8806 0,351 0,3398 3

42-MG-BA: Cerebro 0,9486 0,4389 0,3783 3

SNB-19: Cerebro 1,0241 0,4679 0,4543 3

IPTP/98: Cerebro 0,8158 0,3799 0,4603 3

GMS-10: Cerebro 0,9262 0,6735 0,5424 1

U-138 MG: Cerebro 0,8028 0,4448 0,5689 1

LN-405: Cerebro 1,046 0,6715 0,7525 1

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

AU565: Mama 0,1024 0,0539 0,0297 5

HCC1954: Mama 0,2453 0,0742 0,0831 4

Hs 578T: Mama 0,287 0,075 0,085 4

CAL-85-1: Mama 0,2062 0,1707 0,1396 4

EFM-192B: Mama 0,3565 0,2746 0,1884 4

EFM-19: Mama 0,4888 0,2428 0,2227 4

HCC1143: Mama 0,3856 0,2969 0,2799 4

MDA-MB-415: Mama 0,4378 0,2779 0,2826 4

MB 157: Mama 0,919 0,03 0,013 3

MDA-MB-468: Mama 0,826 0,131 0,104 3

MCF7: Mama 0,7312 0,1175 0,106 3

MDA-MB-453: Mama 0,9677 0,1497 0,128 3

HCC1806: Mama 0,63 0,157 0,135 3

HCC38: Mama 0,799 0,198 0,135 3

CAL-148: Mama 0,8879 0,1778 0,1446 3

MDA-MB-436: Mama 0,9257 0,235 0,1588 3

EVSA-T: Mama 0,8101 0,1921 0,1617 3

JIMT-1: Mama 1,0342 0,2107 0,2045 3

CAL-120: Mama 0,7606 0,3094 0,2346 3

CAL-51: Mama 1,0399 0,252 0,2391 3

HCC1569: Mama 0,8118 0,3757 0,2706 3

MDA-MB-435S: Mama 0,736 0,4 0,369 3

KPL-1: Mama 0,8294 0,4721 0,3691 3

HCC70: Mama 1,029 0,4525 0,3868 3

MDA-MB-361: Mama 0,51 0,4185 0,4945 3

EFM-192C: Mama 1,1771 0,5303 0,2644 2

MDA-MB-175-VII: Mama 0,9252 0,6705 0,4413 2

UACC-893: Mama 0,578 0,635 0,474 2

BT-474: Mama 1,7649 0,4043 0,4842 2

BT-549: Mama 0,7005 0,6093 0,5628 1

T47D: Mama 1,1392 0,657 0,6325 1

ZR-75-30: Mama 0,979 0,7094 0,6879 1

MT-3: Mama 0,8962 0,6827 0,704 1

BT-483: Mama 0,8449 1,114 0,8657 1

C-4I: Cuello uterino 0,3791 0,0476 0,0328 4

CAL-39: Cuello uterino 0,3382 0,1481 0,1479 4

C-33 A: Cuello uterino 0,916 0,0127 -0,006 3

SISO: Cuello uterino 0,7157 0,0163 -0,002 3

HeLa: Cuello uterino 0,7398 0,048 0,0072 3

MS751: Cuello uterino 0,6941 0,0256 0,0552 3

BT-B: Cuello uterino 0,788 0,0821 0,0657 3

ME-180: Cuello uterino 0,9997 0,1521 0,1564 3

Ca Ski: Cuello uterino 0,7077 0,2047 0,1791 3

SKG-IIIb: Cuello uterino 0,718 0,2701 0,2185 3

DoTc2 4510: Cuello uterino 0,9503 0,2981 0,2597 3

SW756: Cuello uterino 0,9509 0,371 0,3384 3

SiHa: Cuello uterino 0,5524 0,3919 0,3415 3

C-4 II: Cuello uterino 0,8416 0,4293 0,4254 3

HT-3: Cuello uterino 0,8834 0,6888 0,6523 1

KYSE-50: Esófago 0,183 0,055 0,063 5

KYSE-410: Esófago 0,244 0,211 0,214 4

T.Tn: Esófago 0,4246 0,3322 0,2448 4

T.T: Esófago 0,8253 0,0649 0,0197 3

KYSE-180: Esófago 0,617 0,085 0,079 3

TE7: Esófago 0,718 0,113 0,113 3

KYSE-510: Esófago 0,671 0,223 0,129 3

KYSE-70: Esófago 0,824 0,201 0,158 3

KYSE-150: Esófago 1,166 0,213 0,163 3

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

OE21: Esófago 0,7539 0,2571 0,2117 3

KYSE-520: Esófago 1,111 0,386 0,356 3

KYSE-30: Esófago 0,7729 0,5353 0,4066 2

KYSE-270: Esófago 1,057 0,582 0,453 2

KYSE-140: Esófago 1,114 0,512 0,461 2

HCE7: Esófago 0,865 0,488 0,512 1

COLO-680N: Esófago 0,882 0,535 0,515 1

OE33: Esófago 1,006 0,5977 0,5259 1

KYSE-220: Esófago 0,833 0,626 0,661 1

OE19: Esófago 0,9684 0,8451 0,6916 1

JR 029: Cabeza y cuello 0,0671 0,0015 0,0021 5

PCI-38: Cabeza y cuello 0,2035 0,0781 0,0682 4

CAL 27: Cabeza y cuello 0,449 0,1068 0,069 4

CAL-33: Cabeza y cuello 0,5807 0,0516 0,0204 3

HSC-2: Cabeza y cuello 0,7659 0,0902 0,0707 3

PCI-15B: Cabeza y cuello 0,8113 0,0605 0,0753 3

HO-1-N-1: Cabeza y cuello 0,9323 0,095 0,096 3

PCI-6A: Cabeza y cuello 1,1429 0,1568 0,1195 3

H3118: Cabeza y cuello 0,8217 0,108 0,131 3

ACC2: Cabeza y cuello 1,1233 0,1636 0,1357 3

ACCS: Cabeza y cuello 0,7258 0,2017 0,1658 3

ACC3: Cabeza y cuello 0,887 0,186 0,168 3

BICR 78: Cabeza y cuello 1,0035 0,1602 0,1694 3

JR 028: Cabeza y cuello 1,0931 0,2299 0,2027 3

PCI-15: Cabeza y cuello 1,0668 0,1987 0,2061 3

SCC-9: Cabeza y cuello 0,5841 0,2727 0,272 3

SAT: Cabeza y cuello 0,854 0,302 0,307 3

SCC90: Cabeza y cuello 0,5915 0,3331 0,3358 3

HN: Cabeza y cuello 0,9124 0,3981 0,3481 3

PCI-15A: Cabeza y cuello 0,8516 0,3844 0,3675 3

JR 013: Cabeza y cuello 1,0158 0,3829 0,3766 3

PCI-4B: Cabeza y cuello 1,2078 0,4475 0,3808 3

PCI-30: Cabeza y cuello 0,8216 0,362 0,4064 3

UDSCC2: Cabeza y cuello 0,5716 0,4203 0,4394 3

JR 019: Cabeza y cuello 1,0805 0,4801 0,484 3

RPMI 2650: Cabeza y cuello 1,1239 0,5619 0,4435 2

JR 028EP: Cabeza y cuello 0,995 0,5386 0,4657 2

BHY: Cabeza y cuello 1,0468 0,5311 0,4897 2

PCI-4A: Cabeza y cuello 1,0214 0,6602 0,4984 2

HSC-3: Cabeza y cuello 1,069 0,3074 0,5475 1

ACC 8-2: Cabeza y cuello 1,1417 0,7519 0,5967 1

JR 022: Cabeza y cuello 1,0441 0,7332 0,6409 1

PCI-6B: Cabeza y cuello 1,1076 0,7016 0,6703 1

ACC112: Cabeza y cuello 0,9498 0,7645 0,916 1

GP5d: Intestino 0,185 0,116 0,0711 5

SW48: Intestino 0,471 0,028 0,053 4

T84: Intestino 0,462 0,068 0,058 4

LoVo: Intestino 0,2792 0,0659 0,0611 4

COLO 205: Intestino 0,8137 0,0578 0,0376 3

Hs 257.T: Intestino 0,8128 0,0699 0,0465 3

MDSTB: Intestino 0,7601 0,094 0,0774 3

CL-11: Intestino 0,9903 0,1858 0,1559 3

SW-948: Intestino 1,0249 0,2096 0,1757 3

CoCM-1: Intestino 1,062 0,227 0,191 3

LS174T: Intestino 0,8916 0,2634 0,2176 3

COLO 201: Intestino 1,029 0,204 0,24 3

SW620: Intestino 0,7593 0,2603 0,288 3

WiDr: Intestino 0,8917 0,3977 0,3243 3

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

LS180: Intestino 0,9989 0,4556 0,3266 3

SW837: Intestino 1,0342 0,4365 0,3773 3

SK-CO-1: Intestino 0,93 0,464 0,405 3

CL-14: Intestino 0,8508 0,6531 0,4248 2

HRT-18: Intestino 0,744 0,523 0,425 2

Caco-2: Intestino 0,769 0,538 0,496 2

COLO-206F: Intestino 1,075 0,651 0,543 1

SW 1417: Intestino 1,016 0,769 0,607 1

CL-34: Intestino 1,1299 0,4878 0,6107 1

RCM-1: Intestino 1,0188 0,8159 0,6594 1

COLO-678: Intestino 1,06 0,802 0,661 1

OUMS-23: Intestino 0,7971 0,9316 0,7076 1

SW 1116: Intestino 1,0852 1,0031 0,7353 1

SW 1463: Intestino 1,164 0,925 0,862 1

G-402: Riñón 0,4146 0,1885 0,1583 4

SW 156: Riñón 0,4381 0,3386 0,2802 4

CAL-54: Riñón 0,4808 0,3592 0,326 4

SW 13: Riñón 0,697 0,014 0,023 3

G-401: Riñón 0,857 0,081 0,073 3

NH-6: Riñón 0,9578 0,1525 0,1175 3

KMRM-M1: Riñón 1,072 0,139 0,126 3

SN-12C: Riñón 0,9117 0,1661 0,1382 3

Caki-1: Riñón 0,6522 0,1373 0,1431 3

786-O: Riñón 1,066 0,205 0,17 3

VMRC-RCW: Riñón 1,081 0,156 0,171 3

UO-31: Riñón 0,8695 0,3772 0,3758 3

769-P: Riñón 0,977 0,478 0,431 3

KMRC-20: Riñón 0,84 0,466 0,459 3

BFTC-909: Riñón 1,076 0,4325 0,4869 3

KMRC-1: Riñón 0,8824 0,6127 0,5558 1

VMRC-RCZ: Riñón 0,9492 0,6125 0,5913 1

ACHN: Riñón 1,005 0,623 0,6277 1

JHH-4: Hígado 0,4019 0,0719 0,0775 4

OCUG-1: Hígado 0,4247 0,115 0,0881 4

SNU-182: Hígado 0,3211 0,3009 0,2618 4

SNU-398: Hígado 0,7925 0,0572 0,048 3

JHH-7: Hígado 0,526 0,0621 0,049 3

SNU-475: Hígado 0,9855 0,1516 0,1274 3

JHH-6: Hígado 0,6033 0,1987 0,1906 3

HuCCT1: Hígado 0,731 0,2303 0,1941 3

EGI-1: Hígado 0,8992 0,2121 0,2415 3

huH-1: Hígado 0,637 0,3355 0,2569 3

SK-HEP-1: Hígado 0,7567 0,2521 0,2684 3

PLC/PRF/5: Hígado 0,7758 0,2551 0,3086 3

Hep G2: Hígado 0,8333 0,2949 0,311 3

SNU-423: Hígado 0,9714 0,304 0,3364 3

SNU-387: Hígado 0,6457 0,4265 0,3953 3

JHH-1: Hígado 0,6947 0,4443 0,4458 3

SNU-449: Hígado 1,0774 0,486 0,4864 3

C3A: Hígado 0,9439 0,4686 0,5087 1

JHH-2: Hígado 1,0593 0,7702 0,7744 1

A549: Pulmón 0,4707 0,0974 0,129 4

H290: Pulmón 0,4248 0,4081 0,3961 4

H2691: Pulmón 0,468 0,4411 0,4795 4

RERF-LC-MA: Pulmón 0,639 0,0854 0,0623 3

NCI-H841: Pulmón 0,8459 0,1149 0,1057 3

SBC-3: Pulmón 0,9716 0,2057 0,155 3

H2369: Pulmón 1,0518 0,172 0,1562 3

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

ChaGo-K-1: Pulmón 1,0137 0,1936 0,1726 3

H2804: Pulmón 0,8272 0,2981 0,195 3

NCI-H2286: Pulmón 0,8997 0,2979 0,2466 3

UMC-11: Pulmón 0,6174 0,2438 0,276 3

H2373: Pulmón 0,8795 0,3019 0,2853 3

H2461: Pulmón 0,8732 0,3484 0,2912 3

H2795: Pulmón 1,0282 0,3473 0,3436 3

NCI-H196: Pulmón 0,8976 0,3922 0,389 3

H2722: Pulmón 0,8473 0,4877 0,4089 3

H28: Pulmón 0,9309 0,4937 0,4124 3

H2803: Pulmón 0,6578 0,4814 0,4939 3

H2731: Pulmón 0,9841 0,5147 0,4912 2

H2591: Pulmón 1,0024 0,5897 0,5288 1

SW 1271: Pulmón 1,054 0,681 0,585 1

H2052: Pulmón 0,9018 0,7748 0,6495 1

H513: Pulmón 0,8696 0,747 0,7763 1

NCI-H2195: Pulmón 1,0695 0,7473 0,7937 1

VMRC-LCD: Pulmón:NSCLC 0,1083 0,0165 0,0206 5

NCI-H1703: Pulmón:NSCLC 0,0217 0,0234 0,0387 5

DV-90: Pulmón:NSCLC 0,1662 0,0939 0,0801 5

NCI-H520: Pulmón:NSCLC 0,1553 0,0853 0,0943 5

HCC-44: Pulmón:NSCLC 0,4828 0,0622 0,0573 4

LOU-NH91: Pulmón:NSCLC 0,2854 0,0649 0,0667 4

NCI-H1792: Pulmón:NSCLC 0,4287 0,1012 0,085 4

LU99A: Pulmón:NSCLC 0,3858 0,1388 0,1203 4

LU99B: Pulmón:NSCLC 0,3259 0,1927 0,1616 4

LCLC-103H: Pulmón:NSCLC 0,4592 0,1711 0,163 4

NCI-H2009: Pulmón:NSCLC 0,2163 0,1481 0,1764 4

NCI-H2170: Pulmón:NSCLC 0,477 0,2033 0,1894 4

CAL-12T: Pulmón:NSCLC 0,4345 0,2399 0,2003 4

SK-MES-1: Pulmón:NSCLC 0,2868 0,2316 0,2173 4

NCI-H2122: Pulmón:NSCLC 0,8339 0,0731 0,0601 3

NCI-H460: Pulmón:NSCLC 0,9368 0,0626 0,0624 3

NCI-H1437: Pulmón:NSCLC 1,0697 0,11 0,0878 3

ABC-1: Pulmón:NSCLC 0,7461 0,1129 0,0899 3

NCI-H1299: Pulmón:NSCLC 0,902 0,105 0,094 3

HCC-366: Pulmón:NSCLC 1,1043 0,0917 0,1002 3

LU65B: Pulmón:NSCLC 0,9138 0,1102 0,1013 3

VMRC-LCP: Pulmón:NSCLC 0,6195 0,1294 0,1061 3

NCI-H3122: Pulmón:NSCLC 0,664 0,1227 0,113 3

LU65A: Pulmón:NSCLC 0,5925 0,1313 0,1233 3

201T: Pulmón:NSCLC 1,1069 0,1758 0,1239 3

EBC-1: Pulmón:NSCLC 0,806 0,155 0,128 3

NCI-H1666: Pulmón:NSCLC 1 0,112 0,135 3

RERF-LC-MS: Pulmón:NSCLC 0,6674 0,141 0,1425 3

273T: Pulmón:NSCLC 0,8467 0,1865 0,159 3

NCI-H2110: Pulmón:NSCLC 0,929 0,244 0,194 3

NCI-H2085: Pulmón:NSCLC 1,0485 0,2496 0,2008 3

NCI-H358: Pulmón:NSCLC 1,1308 0,2687 0,2249 3

LU99C: Pulmón:NSCLC 0,5091 0,1845 0,2281 3

EPLC-272H: Pulmón:NSCLC 0,7924 0,2789 0,24 3

NCI-H2087: Pulmón:NSCLC 0,7317 0,2612 0,2452 3

NCI-H1915: Pulmón:NSCLC 1,1651 0,2784 0,25 3

COR-L23: Pulmón:NSCLC 1,0115 0,2364 0,2645 3

NCI-H1944: Pulmón:NSCLC 0,7625 0,2508 0,2692 3

LU65: Pulmón:NSCLC 1,0552 0,3022 0,2768 3

SW 1573: Pulmón:NSCLC 0,6665 0,3095 0,2782 3

SK-MES: Pulmón:NSCLC 0,7978 0,3101 0,3203 3

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

NCI-H2172: Pulmón:NSCLC 0,9469 0,4313 0,3324 3

NCI-H322: Pulmón:NSCLC 0,5775 0,4467 0,3978 3

NCI-H1623: Pulmón:NSCLC 0,8983 0,436 0,4131 3

NCI-H2030: Pulmón:NSCLC 0,9091 0,4382 0,4146 3

NCI-H1869: Pulmón:NSCLC 0,53 0,4401 0,4219 3

NCI-H1793: Pulmón:NSCLC 0,8914 0,4837 0,426 3

NCI-H2228: Pulmón:NSCLC 1,111 0,419 0,431 3

NCI-H1573: Pulmón:NSCLC 0,5795 0,4795 0,4416 3

HCC-15: Pulmón:NSCLC 1,081 0,4963 0,4502 3

RERF-LC-Ad2: Pulmón:NSCLC 0,5334 0,4658 0,4902 3

NCI-H838: Pulmón:NSCLC 1,043 0,5099 0,3182 2

NCI-H650: Pulmón:NSCLC 1,0045 0,5034 0,502 1

NCI-H2405: Pulmón:NSCLC 0,8472 0,497 0,5105 1

NCI-H2444: Pulmón:NSCLC 0,9104 0,601 0,5357 1

PC-3 [JPC-3]: Pulmón:NSCLC 0,7824 0,5818 0,5439 1

NCI-H1693: Pulmón:NSCLC 0,6644 0,6313 0,5467 1

COR-L 105: Pulmón:NSCLC 0,7921 0,5136 0,5478 1

SK-LU-1: Pulmón:NSCLC 0,8993 0,5272 0,582 1

HCC-78: Pulmón:NSCLC 0,865 0,666 0,595 1

H3255: Pulmón:NSCLC 0,894 0,686 0,598 1

NCI-H1781: Pulmón:NSCLC 0,8353 0,6108 0,6045 1

HCC-827: Pulmón:NSCLC 0,8265 0,6909 0,6187 1

HOP92: Pulmón:NSCLC 0,9934 0,695 0,6344 1

Calu-1: Pulmón:NSCLC 0,8105 0,6374 0,6643 1

NCI-H2342: Pulmón:NSCLC 0,8589 0,778 0,7798 1

NCI-H2347: Pulmón:NSCLC 0,9848 0,8783 0,845 1

LC-1 sq: Pulmón:NSCLC 1,9116 0,996 1,2191 1

JAR: Varios 0,0398 0,0104 0,0015 5

HT 1080: Varios 0,0583 0,0135 0,0141 5

TASK1: Varios 0,8609 0,0456 0,0344 3

GCT: Varios 0,6099 0,097 0,0732 3

STS 0421: Músculo 0,3838 0,1484 0,11 4

A673: Músculo 0,5523 0,0896 0,0731 3

OV-1063: Ovario 0,1051 -0,0465 -0,0045 5

TOV-112D: Ovario 0,059 0,0111 0,0122 5

A2780: Ovario 0,1745 0,0693 0,0442 5

OVMIU: Ovario 0,1776 0,138 0,1443 5

MDA-H2774: Ovario 0,2085 0,0117 0,0207 4

IGROV-1: Ovario 0,4271 0,1121 0,1124 4

RMG-I: Ovario 0,2666 0,2123 0,1716 4

SK-OV-3: Ovario 0,2853 0,2647 0,291 4

OAW42: Ovario 0,4569 0,3872 0,3435 4

OVTOKO: Ovario 0,4835 0,42 0,412 4

Caov-3: Ovario 0,5251 -0,0004 -0,0224 3

MCAS: Ovario 1,2885 -0,0085 -0,0142 3

PA-1: Ovario 0,636 0,005 0,005 3

ES-2: Ovario 0,9311 0,0747 0,0623 3

RKN: Ovario 1,0045 0,1482 0,1049 3

OVCAR-8: Ovario 0,7166 0,1442 0,1224 3

A2780ADR: Ovario 0,5276 0,1526 0,1356 3

TYK-nu: Ovario 0,7871 0,245 0,2265 3

NIH:OVCAR-3: Ovario 1,0723 0,2539 0,2416 3

OAW28: Ovario 0,8974 0,2001 0,2458 3

OVCAR-5: Ovario 0,7739 0,2162 0,2648 3

EFO-27: Ovario 0,8772 0,2627 0,3237 3

SW 626: Ovario 1,0372 0,3903 0,4064 3

OVISE: Ovario 0,6107 0,4587 0,4191 3

OVSAYO: Ovario 0,9829 0,4188 0,4195 3

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

EFO-21: Ovario 0,8922 0,4971 0,4502 3

OV-90: Ovario 1,175 0,4593 0,4735 3

FU-OV-1: Ovario 0,9593 0,5098 0,495 2

OVKATE: Ovario 1,0241 0,9374 0,8461 1

KP-4: Páncreas 0,1844 0,0203 0,0222 5

PANC-1: Páncreas 0,3146 0,1726 0,1474 4

KP-3: Páncreas 0,378 0,222 0,175 4

KP-1N: Páncreas 0,3155 0,1894 0,1894 4

Panc 03.27: Páncreas 0,702 0,111 0,117 3

HUP-T4: Páncreas 0,952 0,144 0,154 3

A2.1: Páncreas 1,339 0,186 0,208 3

HPAC: Páncreas 0,939 0,251 0,213 3

KP-1NL: Páncreas 0,702 0,287 0,219 3

BxPC-3: Páncreas 1,233 0,321 0,236 3

A13A: Páncreas 1,115 0,28 0,239 3

KP-3L: Páncreas 0,875 0,287 0,258 3

Panc 10.05: Páncreas 1,204 0,2845 0,267 3

HUP-T3: Páncreas 0,7682 0,2841 0,2686 3

HPAF-II: Páncreas 1,042 0,423 0,372 3

DAN-G: Páncreas 0,6668 0,3759 0,3811 3

KP-2: Páncreas 0,8359 0,4032 0,4095 3

YAPC: Páncreas 0,76 0,507 0,289 2

Capan-1: Páncreas 0,857 0,51 0,368 2

Panc 02.03: Páncreas 1,0158 0,5008 0,4159 2

AsPC-1: Páncreas 1,292 0,721 0,535 1

SU.86.86: Páncreas 1,1289 0,645 0,5435 1

PL4: Páncreas 0,929 0,651 0,544 1

SUIT-2: Páncreas 1,123 0,844 0,57 1

Panc 08.13: Páncreas 0,91 0,761 0,703 1

Capan-2: Páncreas 1,0128 0,7716 0,7456 1

Panc 04.03: Páncreas 0,994 0,798 0,77 1

DU 145: Próstata 0,931 0,049 0,044 3

MGH-BA-1: Piel 0,15 0,044 -0,013 5

WM1158: Piel 0,0594 0,0252 0,0321 5

IGR-1: Piel 0,1978 0,0714 0,0587 5

COLO-849: Piel 0,4553 -0,0091 0,0093 4

A2058: Piel 0,2671 0,0255 0,02 4

M-14: Piel 0,3071 0,0703 0,0561 4

MGH-ST-1: Piel 0,4152 0,074 0,0578 4

COLO 792: Piel 0,3273 0,1011 0,0917 4

VMRC-MELG: Piel 0,4605 0,1462 0,1194 4

MGH-BO-1: Piel 0,353 0,186 0,151 4

A375.S2: Piel 0,452 0,1896 0,1536 4

SK-MEL-39: Piel 0,4542 0,2968 0,2391 4

K19: Piel 0,323 0,3 0,247 4

IPC-298: Piel 0,4501 0,3059 0,2539 4

MGH-SW-1: Piel 0,2458 0,2558 0,271 4

A431: Piel 1,0122 0,022 0,0192 3

BU-ML: Piel 0,7451 0,0443 0,0244 3

CHL-1: Piel 0,8801 0,0514 0,0326 3

COLO 857: Piel 0,7565 0,0666 0,0529 3

SK-MEL-131: Piel 0,7317 0,0848 0,0599 3

UACC-62: Piel 0,5483 0,1094 0,124 3

Hs 944.T: Piel 0,7522 0,1316 0,1388 3

MGH-PO-1: Piel 0,7752 0,1548 0,1397 3

IGR-37: Piel 0,5675 0,1714 0,1429 3

UACC903: Piel 0,555 0,181 0,175 3

SK-MEL-37: Piel 0,536 0,2181 0,1784 3

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

MGH-MC-1: Piel 0,7186 0,1934 0,1994 3

C32: Piel 0,9511 0,2482 0,2055 3

G-MEL: Piel 0,6624 0,2227 0,2122 3

MEWO: Piel 0,991 0,255 0,214 3

IGR-39: Piel 0,834 0,2702 0,2141 3

MEL-JUSO: Piel 0,7127 0,1949 0,2211 3

451Lu: Piel 0,7217 0,2594 0,2265 3

WM35: Piel 0,8726 0,2125 0,2318 3

COLO 858: Piel 0,806 0,306 0,234 3

1205Lu: Piel 0,5617 0,2665 0,2484 3

K4: Piel 0,919 0,257 0,254 3

K1: Piel 0,6275 0,2832 0,2662 3

WM793B: Piel 0,6332 0,3606 0,3015 3

WM 266-4: Piel 0,7552 0,3436 0,3252 3

MM608: Piel 0,7646 0,3161 0,3265 3

MGH-TH-1: Piel 1,114 0,4408 0,3347 3

K2: Piel 0,97 0,33 0,36 3

Hs 939.T: Piel 0,7495 0,4148 0,3821 3

WM164: Piel 0,805 0,414 0,399 3

MGH-QU-1: Piel 0,97 0,46 0,433 3

SK-MEL-28: Piel 0,841 0,476 0,459 3

Hs 940.T: Piel 0,899 0,552 0,492 2

MEL-HO: Piel 0,8835 0,6098 0,5037 1

SK-MEL-119: Piel 0,8436 0,4805 0,5052 1

HMVII: Piel 0,7604 0,6097 0,5073 1

K8: Piel 0,762 0,468 0,509 1

MGH-MCC-1: Piel 1,03 0,73 0,573 1

WM239A: Piel 1,447 0,732 0,64 1

MM455: Piel 1,257 0,718 0,672 1

WM902B: Piel 1,401 0,99 0,805 1

AGS: Estómago 0,1829 0,0811 0,067 5

Takigawa: Estómago 0,1891 0,1612 0,1255 5

TMK-1: Estómago 0,334 0,0293 0,0321 4

AZ-521: Estómago 0,3819 0,0702 0,0601 4

MKN28: Estómago 0,3799 0,1106 0,0748 4

IM-95m: Estómago 0,4254 0,1195 0,0834 4

KATO II: Estómago 0,3873 0,2237 0,2532 4

HGC-27: Estómago 0,536 0,044 0,057 3

NUGC-3: Estómago 1,1004 0,09 0,0967 3

23132/87: Estómago 1,0523 0,1618 0,1552 3

MKN74: Estómago 1,0538 0,1651 0,1667 3

KATO II: Estómago 0,6955 0,1991 0,196 3

RERF-GC-1B: Estómago 0,8254 0,3142 0,2073 3

MKN7: Estómago 1,1909 0,2781 0,2612 3

NCI-N87: Estómago 0,8742 0,3371 0,29 3

IM-95: Estómago 0,902 0,311 0,292 3

OCUM-1: Estómago 0,8101 0,2168 0,3176 3

NUGC-4: Estómago 0,5093 0,3328 0,335 3

GTL-16: Estómago 0,7105 0,4124 0,3635 3

MKN45: Estómago 0,851 0,326 0,429 3

FU97: Estómago 0,7699 0,5171 0,404 2

MKN1: Estómago 1,024 0,5318 0,4098 2

KMH-2: Tiroides 0,343 0,017 0,0093 4

IHH-4: Tiroides 0,3912 0,0328 0,0391 4

FTC-133: Tiroides 0,3884 0,1596 0,1535 4

8505C: Tiroides 0,7694 0,1011 0,0742 3

FTC-238: Tiroides 0,5915 0,0995 0,0877 3

CAL-62: Tiroides 0,9829 0,1362 0,1365 3

Línea celular: Órgano 0,2 nM 2,0 nM 20 nM Sensibilidad

ONCO-DG-1: Tiroides 1,0952 0,3063 0,1977 3

TCO-1: Tiroides 0,7356 0,2228 0,1992 3

HTC-C3: Tiroides 0,7903 0,2916 0,2857 3

TT2609-C02: Tiroides 0,9862 0,3171 0,3136 3

8305C: Tiroides 0,7851 0,435 0,3771 3

ML-1: Tiroides 0,7562 0,4193 0,4005 3

BHT-101: Tiroides 1,0259 0,4909 0,4394 3

S-117: Tiroides 0,8908 0,4405 0,4683 3

RO82-W-1: Tiroides 0,7894 0,4013 0,4831 3

B-CPAP: Tiroides 1,378 0,763 0,49 2

ASH-3: Tiroides 0,7518 0,6432 0,5762 1

MFE-319: Útero 0,2338 0,0988 0,0843 4

HEC-1: Útero 0,2361 0,0976 0,1034 4

SNG-M: Útero 0,6532 0,0129 0,0117 3

Ishikawa: Útero 0,9421 0,0306 0,0209 3

MFE-296: Útero 0,6434 0,0852 0,0762 3

ESS-1: Útero 0,881 0,1059 0,0827 3

MES-SA: Útero 0,808 0,1341 0,1377 3

SKN: Útero 0,864 0,2716 0,1851 3

AN3CA: Útero 0,9261 0,2145 0,2207 3

Ishikawa (Heraklio) 02 ER-: Útero 0,88 0,242 0,225 3

MFE-280: Útero 0,9711 0,4052 0,3979 3

EFE-184: Útero 0,986 0,5066 0,426 2

EN: Útero 1,0579 0,6322 0,5471 1

Ejemplo 14: Los compuestos de la Fórmula II son efectivos contra muchas líneas celulares de tumor sólido

Se probó el compuesto lla contra un panel de líneas celulares derivadas a partir de malignidades hematológicas en un ensayo de supervivencia celular, utilizando el CeIlTiter-Glo® como lectura después de 48 horas en presencia del 10 compuesto. La Tabla 18 enlista el tipo de malignidad hematológica, el nombre de la muestra, su valor Gl50 (la concentración necesaria para alcanzar una inhibición del crecimiento del 50%) en el ensayo, el logaritmo de la GI50, (Iog(Gl50)), y la sensibilidad relativa de cada muestra (Diferencial). El diferencial se calcula sustrayendo el Iog(Gl50) para cada línea celular del Iog(Gl50) promedio a través de todo el panel (0,236 en este caso); un valor positivo indica una muestra que es más sensible que el promedio, mientras que un valor negativo indica una muestra que es menos

15 sensible que el promedio.

Las malignidades hematológicas sensibles son: leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), mieloma múltiple (MM), linfoma no Hodgkin (LNH), y linfoma de Hodgkin (LH).

Tabla 18 - Actividad del Compuesto lla en líneas celulares de cáncer hematológico.

Enfermedad: Línea celular GI50 (nM) Log(GI50) Diferencial

LMA: MV4;11 0,08 -1,114 0,747

LMA: MV4;11Luc 0,11 -0,979 0,613

LMA: LMA-193 0,11 -0,959 0,593

LMA: Kasumi-1 0,44 -0,357 -0,010

LMA: UKE-1 0,18 -0,757 0,391

LMA: SET-2 0,34 -0,469 0,102

LMA: MOLM13-Luc 0,23 -0,645 0,279

LMA: LH60 0,17 -0,783 0,416

LMA: LH60-Luc 0,51 -0,294 -0,072

LMA: HEL92 0,49 -0,310 -0,056

LMC: K562 0,21 -0,680 0,314

LLA: CCRF-CEM 0,16 -0,785 0,419

LLA: RS4;11 0,10 -1,000 0,634

LLA: MOLT-4 0,33 -0,480 0,114

LLA: SEM-Luc 0,15 -0,824 0,458

Enfermedad: Línea celular GI50 (nM) Log(GI50) Diferencial

LLA: MOLT-3 0,34 -0,475 0,109

LLA: REH 0,18 -0,745 0,379

LLA: SUP-B15 0,19 -0,721 0,355

LLA: CCRF-HSB-2 0,19 -0,733 0,367

LLA: 697 0,11 -0,979 0,613

LLA: NALM-6 0,14 -0,870 0,504

LLA: NALM-19 0,19 -0,721 0,355

LLA: TANOUE 10,00 1,000 -1,366

LLA: MHH-CLLA-2 0,32 -0,502 0,136

LLA: MHH-CLLA-3 0,20 -0,699 0,333

LLA: MHH-CLLA-4 10,00 1,000 -1,366

LLA: MUTZ-5 10,00 1,000 -1,366

LLA: YT 10,00 1,000 -1,366

MM: KMS11 0,48 -0,316 -0,050

MM: KMS11-Luc 0,29 -0,538 0,172

MM: KMS18-Luc 0,52 -0,286 -0,080

MM: OPM2 0,14 -0,870 0,504

MM: MM1-S 0,24 -0,620 0,254

MM: MM1-S-Luc 0,23 -0,638 0,272

MM: KMS26 0,24 -0,620 0,254

MM: KMS12 0,29 -0,538 0,172

MM: L363 0,13 -0,886 0,520

MM: LP1 0,21 -0,688 0,322

MM: INA-6 0,12 -0,921 0,555

MM: RPMI8226 0,26 -0,582 0,216

MM: H929 0,34 -0,475 0,109

MM: H929-Luc 1,69 0,227 -0,593

LNH: RL 20,00 1,301 -1,667

LNH: SuDLH-1 10,00 1,000 -1,366

LNH: SuDLH-4 0,45 -0,350 -0,016

LNH: SuDLH-6 0,16 -0,796 0,430

LNH: U937 0,20 -0,699 0,333

LNH: SR 0,11 -0,957 0,591

LNH: Karpas-299-Luc 20,18 1,305 -1,671

LNH: Karpas-299 0,20 -0,699 0,333

LNH: Karpas-422 5,14 0,711 -1,077

LNH: Ramos 0,16 -0,796 0,430

LNH: HuT78 0,28 -0,561 0,195

LNH: HH 0,22 -0,668 0,301

LNH: DEL 0,28 -0,548 0,182

LNH: SUP-M2 0,18 -0,745 0,379

LNH: DOHH2 0,24 -0,629 0,263

LNH: SUP-T1 5,57 0,746 -1,112

LH: HDLM-2 0,12 -0,921 0,555

LH: L-1236 3,67 0,564 -0,930

LH: L428 20,00 1,301 -1,667

LH: KM-H2 0,23 -0,632 0,266

Mean: 0,430 -0,366

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula (II):

en donde: R1c

se selecciona entre el grupo que consiste en etilo, isopropilo, t-butilo, fenilo, -CH(CH2)2O(oxetan-3-ilo) y CCH3(CH2)2O(3-metiloxetan-3-ilo); R2c es hidrógeno o metilo; 10 R15, R16, R17 y R18 se seleccionan cada uno independientemente entre H, halo, alquilo C1 - 4, haloalquilo C1 - 4, y CN; R19, R20 y R21 son cada uno independientemente H o acilo C1 - C10 opcionalmente sustituido; R22 es haloalquilo C1 - C4; p es un número entero de 1 a 3; y 15 q es un número entero de 1 - 3;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2.

El compuesto de la reivindicación 1, en donde R22 es fluorometilo.
3.

El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde p es 2.
4.

El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde q es 1.

20 5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde R2c y R15 son cada uno H.
6.

El compuesto de la reivindicación 5, en donde R17 y R18 son cada uno halógeno.
7.

El compuesto de la reivindicación 5, en donde R19, R20 y R21 son cada uno H.
8.

El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en donde R19 es H.
9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en donde R19 es acilo C1 - C10 opcionalmente 25 sustituido.
10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de Fórmula llb: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de Fórmula lla:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de Fórmula llc:

10 (S)-N-((S)-3-amino-4-fluorobutiI)-N-((R)-1-(1bencil-4-(2,5-difIuorofenil)-1H-imidazol-2-il)2,2-dimetiIpropiI)-2-hidroxipropanamida IIc

15 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, un tautómero de cualquiera de estos compuestos, una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de estos compuestos, una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero, o una mezcla de los mismos, para uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa seleccionada de un tumor sólido y un cáncer hematológico en un mamífero.

20 14. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha enfermedad proliferativa es un tumor sólido seleccionado del grupo que consiste de carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de piel, carcinoma de colon, carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma de hígado, carcinoma gástrico, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de pulmón de células pequeñas

25 (SCLC), carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello y sarcomas.
15.

Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el carcinoma de mama es carcinoma de mama metastático.
16.

Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde el tumor es un tumor resistente a múltiples fármacos.

5 17. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el tumor expresa un nivel elevado de glicoproteína P.
18. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha enfermedad proliferativa es un cáncer hematológico seleccionado del grupo que consiste de linfoma de Hodgkin (LH), linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia, leucemia mielógena, leucemia linfocítica, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica

10 (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia de células peludas y mieloma múltiple.
19. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho cáncer hematológico es leucemia mielógena aguda.
20. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho cáncer hematológico es mieloma 15 múltiple.
21.

Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho uso comprende la administración de un segundo compuesto terapéutico contra el cáncer.
22.

Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dicho segundo compuesto terapéutico

contra el cáncer se selecciona de irinotecano, topotecano, gemcitabina, imatinib, trastuzumab, 5-fluorouracilo, 20 leucovorina, carboplatino, cisplatino, docetaxel, paclitaxel, tezacitabina, ciclofosfamida, rituximab, y nilotinib.