EA032012B1 - {4-[5-(3-ХЛОРФЕНОКСИ)ОКСАЗОЛО[5,4-d]ПИРИМИДИН-2-ИЛ]-2,6-ДИМЕТИЛФЕНОКСИ}УКСУСНАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИИ ИЛИ ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК - Google Patents
{4-[5-(3-ХЛОРФЕНОКСИ)ОКСАЗОЛО[5,4-d]ПИРИМИДИН-2-ИЛ]-2,6-ДИМЕТИЛФЕНОКСИ}УКСУСНАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИИ ИЛИ ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК Download PDFInfo
- Publication number
- EA032012B1 EA032012B1 EA201690762A EA201690762A EA032012B1 EA 032012 B1 EA032012 B1 EA 032012B1 EA 201690762 A EA201690762 A EA 201690762A EA 201690762 A EA201690762 A EA 201690762A EA 032012 B1 EA032012 B1 EA 032012B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- compound
- aki
- oxazolo
- acetic acid
- pyrimidin
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 17
- WRBZNIUFAKIIQG-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[5-(3-chlorophenoxy)-[1,3]oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethylphenoxy]acetic acid Chemical compound CC1=C(OCC(O)=O)C(C)=CC(C=2OC3=NC(OC=4C=C(Cl)C=CC=4)=NC=C3N=2)=C1 WRBZNIUFAKIIQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 3
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 title description 4
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 title description 2
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 title description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 30
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 82
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 claims description 41
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 claims description 41
- -1 3-chlorophenoxy Chemical group 0.000 claims description 37
- 125000000246 pyrimidin-2-yl group Chemical group [H]C1=NC(*)=NC([H])=C1[H] 0.000 claims description 37
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 31
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 31
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 24
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 claims description 19
- 230000000329 lymphopenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 102100025750 Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 13
- 101710155454 Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 4
- DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N sphingosine 1-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 114
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 110
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 110
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 79
- JNLIKIBISICTMS-PEJBKAKVSA-N (e)-but-2-enedioic acid;1-[[4-[(e)-n-[[4-cyclohexyl-3-(trifluoromethyl)phenyl]methoxy]-c-methylcarbonimidoyl]-2-ethylphenyl]methyl]azetidine-3-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.CCC1=CC(C(\C)=N\OCC=2C=C(C(C3CCCCC3)=CC=2)C(F)(F)F)=CC=C1CN1CC(C(O)=O)C1.CCC1=CC(C(\C)=N\OCC=2C=C(C(C3CCCCC3)=CC=2)C(F)(F)F)=CC=C1CN1CC(C(O)=O)C1 JNLIKIBISICTMS-PEJBKAKVSA-N 0.000 description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 47
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 36
- KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N fingolimod Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CCC(N)(CO)CO)C=C1 KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 229960000556 fingolimod Drugs 0.000 description 30
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 23
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 230000008497 endothelial barrier function Effects 0.000 description 17
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 16
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 102000011011 Sphingosine 1-phosphate receptors Human genes 0.000 description 11
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 11
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 11
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 10
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 10
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 10
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 108050001083 Sphingosine 1-phosphate receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000000072 beta-Arrestins Human genes 0.000 description 9
- 108010080367 beta-Arrestins Proteins 0.000 description 9
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- OYMNPJXKQVTQTR-UHFFFAOYSA-N 5-[4-phenyl-5-(trifluoromethyl)-2-thiophenyl]-3-[3-(trifluoromethyl)phenyl]-1,2,4-oxadiazole Chemical compound FC(F)(F)C=1SC(C=2ON=C(N=2)C=2C=C(C=CC=2)C(F)(F)F)=CC=1C1=CC=CC=C1 OYMNPJXKQVTQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 8
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 8
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 6
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 6
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[2-[2-[5-[3-(acetyloxymethoxy)-2,7-difluoro-6-oxoxanthen-9-yl]-2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]-n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(OCOC(C)=O)=C(F)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 5
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000012959 renal replacement therapy Methods 0.000 description 5
- KIHYPELVXPAIDH-HNSNBQBZSA-N 1-[[4-[(e)-n-[[4-cyclohexyl-3-(trifluoromethyl)phenyl]methoxy]-c-methylcarbonimidoyl]-2-ethylphenyl]methyl]azetidine-3-carboxylic acid Chemical compound CCC1=CC(C(\C)=N\OCC=2C=C(C(C3CCCCC3)=CC=2)C(F)(F)F)=CC=C1CN1CC(C(O)=O)C1 KIHYPELVXPAIDH-HNSNBQBZSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010038540 Renal tubular necrosis Diseases 0.000 description 4
- 206010039020 Rhabdomyolysis Diseases 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 4
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N Fluo-4 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 101000693265 Homo sapiens Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 3
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 3
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 3
- 230000009084 cardiovascular function Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 210000003742 purkinje fiber Anatomy 0.000 description 3
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 3
- 230000002336 repolarization Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 3
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 3
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 3
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 3
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000003918 Acute Kidney Tubular Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 102000018623 Apolipoproteins M Human genes 0.000 description 2
- 108010027018 Apolipoproteins M Proteins 0.000 description 2
- 206010003671 Atrioventricular Block Diseases 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 2
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101100236683 Homo sapiens MBTPS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 208000004531 Renal Artery Obstruction Diseases 0.000 description 2
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 102100025747 Sphingosine 1-phosphate receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710155457 Sphingosine 1-phosphate receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 2
- 206010043087 Tachyphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 238000003339 best practice Methods 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000036471 bradycardia Effects 0.000 description 2
- 208000006218 bradycardia Diseases 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005063 microvascular endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 2
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 2
- 210000002254 renal artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 2
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 1
- 102100037324 Apolipoprotein M Human genes 0.000 description 1
- 101710095646 Apolipoprotein M Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010005746 Blood pressure fluctuation Diseases 0.000 description 1
- 101100256965 Caenorhabditis elegans sip-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003731 Caspase Glo 3/7 Assay Methods 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 239000012571 GlutaMAX medium Substances 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 1
- 101001124309 Homo sapiens Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFKWQGGENFBFO-IBGZPJMESA-N [(2s)-2-amino-2-(hydroxymethyl)-4-(4-octylphenyl)butyl] dihydrogen phosphate Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CC[C@](N)(CO)COP(O)(O)=O)C=C1 LRFKWQGGENFBFO-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000668 effect on calcium Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008753 endothelial function Effects 0.000 description 1
- 108091007231 endothelial receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000055702 human NOS3 Human genes 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008338 local blood flow Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N probenecid Chemical compound CCCN(CCC)S(=O)(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003081 probenecid Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000000718 qrs complex Methods 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000011470 radical surgery Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008327 renal blood flow Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000036390 resting membrane potential Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N risperidone Chemical compound FC1=CC=C2C(C3CCN(CC3)CCC=3C(=O)N4CCCCC4=NC=3C)=NOC2=C1 RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001534 risperidone Drugs 0.000 description 1
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 108010035597 sphingosine kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004654 survival pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003606 tin compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000009723 vascular congestion Effects 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
- A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения AKI (острого повреждения почек). Изобретение также относится к лекарственному средству для предупреждения или лечения AKI, содержащему {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль, и способу лечения AKI (острого повреждения почек).
Description
Настоящее изобретение относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин2-ил]-2,6-диметилфенокси (уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли при предупреждении или лечении острого повреждения почек (AKI) и фармацевтической композиции на их основе.
Соединение {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль и способ их получения описаны в патентной заявке WO 2011/086079. Данное соединение характеризуется аффинностью с рецепторами S1P1/EDG1.
Острое повреждение почек (AKI), ранее известное как острая почечная недостаточность, представляет собой частое и потенциально тяжелое нарушение, которое происходит при ряде условий, с клиническими проявлениями, варьирующими от временного повышения креатинина в сыворотке (SCr) до анурической хронической почечной недостаточности. AKI традиционно описывают как внезапное (в пределах 48 ч) понижение почечной функции, которое измеряют по повышениям креатинина в сыворотке. Последние руководства KDIGO (Заболевания почек: улучшение мировых результатов лечения) установили единую позицию относительно диагностических показателей на основе лабораторных и клинических величин, которые перечислены ниже (Working group of ERBP (European Renal Best Practice), 2012, NDT 27: 4263-4272). AKI определяют и устанавливают его стадию по любому из следующих параметров: повышение SCr на >0,3 мг/дл (>26,5 мкмоль/л) в пределах 48 ч;
или повышение SCr в >1,5 раза от исходного уровня, которое произошло или предполагается как имевшее место в течение 7 дней до этого;
или объем мочи <0,5 мл/кг/ч в течение 6 ч.
AKI имеет место у примерно 7% всех госпитализированных пациентов (Nash et al., 2002, Am J Kidney Dis 39: 930-936) и до 36-67% пациентов в критическом состоянии в зависимости от применяемого определения. Тяжелое AKI имеет место у 4-25% всех поступающих в отделение интенсивной терапии (ICU), и приблизительно 5% пациентов из ICU с AKI нуждаются в заместительной почечной терапии (Hoste et al. 2006, Crit Care 10: R73, Mehta et al., 2004, Kidney Int 66: 1613-1621; Uchino et al., 2005, Jama 294: 813-818; Uchino et al., 2006, Crit Care Med 34: 1913-1917; Ostermann et al., 2007, Crit Care Med 35: 1837-1843). Наиболее распространенными причинами AKI являются сепсис, радикальная хирургия, гиповолемия и лекарственные препараты. Факторы риска развития AKI включают пожилой возраст (>75 лет), хроническое заболевание почек (CKD, eGFR, расчетная скорость клубочковой фильтрации <60 мл/мин/1,73м2), атеросклеротическое заболевание периферических сосудов, сердечная недостаточность, заболевание печени, сахарный диабет и нефротоксические лекарственные препараты.
Несмотря на совершенствование превентивных стратегий и вспомогательных мер, AKI остается ассоциированным с высокой распространенностью и смертностью, особенно среди поступающих в ICU, где коэффициент смертности среди госпитализированных может превышать 50%. Помимо коэффициента смертности имеют место хронические последствия, которые включают высокий риск развития хронического заболевания почек (CKD) и ускоренное развитие терминальной стадии заболевания почек (ESRD) (Hsu et al., 2009, Clin J Am Soc Nephrol 4: 891-898; Ishani et al., 2009, JASN 20: 223-228; Coca et al., 2009, Am J Kidney Dis 53.: 961-973). Распространенность также ассоциирована с повышенными затратами и повышенной продолжительностью госпитализации.
В медицине имеет место явная нереализованная потребность, поскольку не существует одобренной терапии для предупреждения или для лечения AKI, независимо от этиологии. Контроль состояния является преимущественно поддерживающим при помощи заместительной почечной терапии (RRT) в качестве основного компонента ухода за пациентами с тяжелым AKI. Гидратация остается наиболее подходящей предупредительной мерой для контраст-индуцированной нефропатии (CIN).
Сфингозин-1-фосфат (S1P) является липидными медиатором, который связывается с пятью GPCR (связанными с G-белком рецепторами), называемыми S1P1-5 (Brinkman et al., 2007, Pharmacol Ther 115: 84-105). Циркулирующий S1P происходит преимущественно от эндотелиальных клеток, тромбоцитов и эритроцитов и, как обнаружено, связывается на высоком уровне с белками в плазме, в том числе АроМ (аполипопротеином М) в HDL (липопротеинах высокой плотности) (Hammad et al., 2012, J Lipids; Karuna et al., 2011, Atherosclerosis 219: 855-863) и альбумином. S1P1 широко экспрессируется, в том числе в эндотелиальных, иммунных и эпителиальных клетках почек. S1P1 регулирует многие физиологические функции, в том числе поддержание целостности эндотелиального барьера (перестройки цитоскелета), клеточный рост, выживаемость, дифференцировку, ангиогенез и направленную миграцию иммунных клеток. S1P1 характеризуется высоким уровнем экспрессии в мозговом слое (Zhu et al., 2011, Am J Physiol Renal Physiol 301: F35-F41), участке почки, где кровоток и обеспечение кислородом ограничены анатомией канальцево-сосудистой системы, которая служит главным образом для концентрирования мочи. Поскольку клетки в этом участке характеризуются высоким потреблением кислорода, мозговой слой особенно восприимчив к гипоксическому поражению. Кортикальное канальцевое поражение является следствием как повреждения мозгового слоя, так и прямого поражения проксимальных клеток почечных канальцев. Уровень S1P1 повышается после ишемически-реперфузионного повреждения почек (Awad et al., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524), и ожидается, что его активация сохранит почечную функцию посредством следующих трех основных механизмов:
- 1 032012 поддержание функции эндотелиального барьера; этот барьер поражен при AKI, что приводит к нарушению проницаемости сосудов и адгезивных свойств;
ограничение апоптоза проксимальных канальцевых эпителиальных клеток;
снижение инфильтрации воспалительных клеток.
Воспаление при AKI часто является следствием комбинированного повреждения канальцевых эпителиальных клеток и эндотелиального барьера. Роль пути S1P-S1P1 в регуляции целостности эндотелиального барьера была подробно задокументирована (Wang and Dudek, 2009, Microvasc Res 77: 39-45; Mc Verry and Garcia, 2005, Cell signalling 17: 131-139; Lucke and Levkau, 2010, Cell Phys Biochem 26: 87-96). Активация S1P1 улучшает барьерную функцию эндотелия путем активации пути PLC/Ca2+/FAK/pRac (Belvitch and Dudek, 2012, Microvasc Res 83: 22-30). Было показано, что S1P, ассоциированный с HDLApoM, пролонгирует барьерную функцию эндотелия путем активации eNOS (Wilkerson et al., 2012, JBC 287: 44645-44653; Christoffersen et al., 2011, PNAS 108.: 9613-9618; Argraves et al., 2008, JBC 283: 2507425081). В этой связи низкие уровни HDL в плазме были ассоциированы с риском развития AKI у пациентов, проходящих сосудистую хирургию (Miller GJ and Miller NE., 1975, Lancet 1: 16-19; Castelli WP, Garrison RJ, Wilson PW, et al., 1986, JAMA; 256:2835-2838).
Глобальная или эндотелиально-специфичная делеция S1P1 индуцирует летальность на эмбриональной стадии в связи с сильным кровотечением, поражающим ряд органов (Kono et al., 2004, JBC 279: 29367-29373). Идентичные патологии наблюдают у нокаутных мышей с удалением ферментов, ответственных за биосинтез S1P (сфингозинкиназ 1 и 2) (Mizugishi et al., 2005, Mol Cell Biol 25: 11113-11121). Аналогичным образом антагонисты S1P1 также увеличивают проницаемость сосудов. Несмотря на экстренные защитные эффекты функциональных антагонистов S1P1 в моделях AKI (Bajwa et al., 2010, JASN 21: 955-965; Awad et al., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524), длительное лечение при помощи таких функциональных антагонистов S1P1 существенно ухудшает пропотевание жидкости из сосудов в моделях повреждения легких и нарушает целостность эндотелиального барьера in vitro (Shea et al., 2010, Am J Respir Cell Mol Biol 43: 662-673). Подобные эндотелиальные паталогии также имитируют на мышах без S1P1 (Camerer et al., 2009, JCI 119: 1871-1879).
У пациентов и в моделях AKI цитокины по типу TNF-α высвобождаются из эндотелиальных клеток и активируют выработку молекул адгезии, таких как ICAM-1, VCAM-1 и Р/Е-селектины, которые способствуют инфильтрации воспалительных клеток в тубуло-интерстициальной паренхиматозной ткани (Bonventre et al., 2003, JASN 14: 2199-2210; Singbartl et al., 2000, Crit Care Med 28: 2507-2514; Sadik et al, 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81). Более того, в культивированных человеческих эндотелиальных клетках некоторые из таких эндотелиальных молекул адгезии активируются после гипоксии/реоксигенации (Lutz et al., 2008, J Mol Med 86: 1329-1339). Активация S1P1 подавляет выработку таких молекул адгезии и, таким образом, уменьшает инфильтрацию воспалительных клеток (Lien et al., 2006, Kidney Int .69.: 1601-1608). Основная роль S1P в сохранении эндотелиальной функции при остром повреждении почек была продемонстрирована при помощи условного удаления эндотелиального рецептора S1P1 у мышей (Ham А., 2013, Kidney Int, Sept).
Стимулирование S1P1 активирует эндотелиальную синтазу оксида азота (eNOS) путем фосфорилирования Akt, которая является ключевым ферментом, регулирующим локальное расширение сосудов посредством выработки NO (Morales-Ruiz et al., 2001, JBC 276: 19672-19677; Igarashi et al, 2000, JBC 275: 32363-32370; Igarashi et al, 2008, BBA 1781: 489-495). Таким образом, S1P индуцирует расширение сосудов в эндотелии и NO-зависимый характер действия (Roviezzo et al., 2006, FASEB J 20: 340). NO оказывает защитный эффект на функцию почек в животных моделях I/R-индурированного AKI (Garcia-Criado et al, 1998, Transplantation 66: 982-990). У крыс ингибирование eNOS уменьшает почечный кровоток на 35% со связанными понижениями GFR и повышенным почечным сосудистым сопротивлением (Cao et al, 2010, Am J Physiol Renal Physiol 299: F1056-F1064). S1P считается одним из наиболее эффективных активаторов эндотелиального оксида азота, который известен как улучшающий локальный кровоток, но также как ограничивающий активацию тромбоцитов и сосудистый застой, в частности в уязвимой кортикомедуллярной зоне. Этот механизм может быть важным для сохранения функции почек при AKI. Важно отметить, что уменьшенная биологическая доступность оксида азота ассоциирована с AKI у пациентов с сердечно-легочным шунтированием (СРВ) и у пациентов с сепсисом (Lema et al., 2009, J Cardio Thorac Vasc Anesth 23: 188-194; Sadik et al., 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81). Интересно то, что полиморфизм 786С в промоторе eNOS человека демонстрирует уменьшенную транскрипционную активность и ассоциирован с дисфункцией почек у пациентов, подвергающихся кардиохирургии, связанной с сердечнолегочным шунтированием (Popov et al., 2009, Eur J Cardio-Thorac Surgery 36: 651-656; Nakayama et al., 1999, Circulation 99: 2864-2870). Частота полиморфизма составляет около 50% и может быть представлена у значительной субпопуляции, которая не только в большей степени подвержена риску развития AKI, а также более чувствительна к лечению, которое восстанавливает уровни локального NO, например через активацию S1P1.
Более того, активация S1P1 непосредственно ограничивает апоптоз проксимальных канальцевых эпителиальных клеток посредством активации путей выживания с участием pERK и pAkt. Специфическое удаление S1P1 в проксимальных канальцевых эпителиальных клетках ослабляет дисфункцию почек
- 2 032012 после ишемически-реперфузионного повреждения (Bajwa et al., 2010, JASN 21: 955-965), а также некроз канальцев, что подчеркивает характер эндогенного S1P как амортизирующего тяжесть реперфузионного повреждения. Эти данные подчеркивают важность защитной роли системы S1P-S1P1 при AKI, как по эндотелиальному, так и эпителиальному направлениям.
S1P ответственен за выход лимфоцитов из лимфоузла в кровь посредством активации S1P1. Эта активация S1P1 вызывает интернализацию рецепторов с последующей рециркуляцией рецептора обратно на поверхность клетки, обеспечивая реактивацию. Тем не менее полагают, что функциональные антагонисты или антагонисты S1P1 вызывают развитие лимфопении в результате либо ингибирования рециркуляции интернализированных рецепторов S1P1 обратно на поверхность клетки, либо блокировки активации S1P1, и в результате вызывают значительные и длительные снижения уровня S1P1 на поверхности клеток. Вследствие этого последние средства демонстрируют большое и длительное снижение уровней лимфоцитов в крови, наблюдаемое в доклинических и клинических испытаниях.
В нескольких сообщениях указано, что в остром повреждении почек принимают участие Т лимфоциты. Наблюдение, что повреждение уменьшается при снижении уровня Т клеток и восстанавливается при адоптивном переносе CD4+ Т клеток, свидетельствует о том, что оно зависит от CD4+ Т клеток (Burne et al., 2001, J. Clin Invest 108: 1283-1290; Ysebaert et al., 2004, Kidney Int 66: 491-496). Поэтому неудивительно, что функциональные антагонисты S1P1, в том числе финголимод и SEW2871, оказывают защитный эффект в моделях острого повреждения почек в лимфопенических дозах (Lien et al., 2006, Kidney Int 69: 1601-1608).
Тем не менее, лимфопения является предрасполагающим фактором развития оппортунистических инфекций, в частности у очень чувствительных, ослабленных пациентов, таких как пациенты, подверженные высокому риску AKI (пожилой возраст, заболевания сердца, диабет и хроническое заболевание почек). Вследствие этого существует необходимость в селективном агонисте S1P1, который индуцирует развитие ограниченной лимфопении или, в лучшем случае, не индуцирует развитие лимфопении и обладает терапевтической полезностью при лечении AKI. К удивлению, соединение {4-[5-(3хлорфенокси)оксазоло[5,4^]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота отличается от других модуляторов S1P1 тем, что оно оказывает защитный эффект от AKI у млекопитающих в дозах, которые являются не вызывающими развитие лимфопении. Полагают, что это свойство {4-[5-(3хлорфенокси)оксазоло[5,4^]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты можно отнести к ее специфическому агонизму на рецепторе S1P1 с минимальными функциональным антагонизмом или десенсибилизирующими эффектами. Это может быть значительным преимуществом в отношении клинической безопасности для применения {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4^]пиримидин-2-ил]-2,6диметилфенокси}уксусной кислоты при лечении AKI.
Краткое описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4^]пиримидин2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения AKI (острого повреждения почек).
Настоящее изобретение также относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-
d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли, где {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4^]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота не индуцирует развитие лимфопении при введении защитной от AKI дозы и индуцирует развитие ограниченной лимфопении при введении более высокой дозы.
Настоящее изобретение также относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли в качестве не вызывающего развитие лимфопении средства при предупреждении или лечении AKI.
Настоящее изобретение также относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения AKI без лимфопенического эффекта при введении защитной от AKI дозы.
Настоящее изобретение также относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли, которое описано выше, где {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4^]пиримидин-2-ил]-2,6диметилфенокси}уксусная кислота оказывает защитный эффект от AKI при введении не вызывающей развитие лимфопении дозы.
Настоящее изобретение также относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения AKI (острого повреждения почек), где {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4^]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота является селективным агонистом S1P1, который не индуцирует десенсибилизацию рецепторов.
Настоящее изобретение также относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4d]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения AKI (острого повреждения почек), где {4-[5-(3-хлорфенокси)
- 3 032012 оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота является селективным агонистом S1P1, не вызывающим развитие лимфопении при защитных от AKI дозах.
Настоящее изобретение также относится к применению {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли без лимфопенического эффекта при предупреждении или лечении AKI.
Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему в качестве активного ингредиента {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6диметилфенокси}уксусную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.
Настоящее изобретение также относится к применению фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6диметилфенокси}уксусную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый наполнитель, для применения при предупреждении или лечении AKI.
Настоящее изобретение также относится к изделию, содержащему упаковочный материал;
фармацевтическую композицию, содержащую {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2ил]-2,6-диметилфенокси}уксусную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый наполнитель;
этикетку или листок-вкладыш, помещенные в упаковочный материал, на которых указано, что пациента можно лечить от AKI при помощи данной фармацевтической композиции.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения AKI у нуждающегося в этом пациента, предусматривающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества {4-[5-(3хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения AKI у нуждающегося в этом пациента, предусматривающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества {4-[5-(3хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли, где лечение является профилактическим.
Настоящее изобретение также относится к изделию, где на этикетке или листке-вкладыше, помещенных в упаковочный материал, указано, что пациента можно лечить от AKI при помощи упомянутой выше фармацевтической композиции без лимфопенического эффекта.
Настоящее изобретение также относится к изделию, где на этикетке или листке-вкладыше, помещенных в упаковочный материал, указано, что пациента можно лечить от AKI при помощи упомянутой выше фармацевтической композиции без лимфопенического эффекта, где лечение является профилактическим.
Определения
Для удобства и для облегчения прочтения соединение {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота было переименовано в соединение А в разделах настоящей заявки и на фигурах.
Для целей настоящего изобретения следующие слова следует понимать так, как описано ниже.
Селективный агонист S1P1 представляет собой соединение, которое является более активным на S1P1 по сравнению с другими 4 рецепторами S1P, S1P2-5. В дополнение к этому, соединение должно обладать минимальной активностью или вовсе не обладать активностью в широком спектре анализов с рецепторами, ферментами и ионными каналами.
Лимфопения представляет собой состояние с аномальным падением уровня лимфоцитов в крови, лейкоцитов с важными функциями в иммунной системе. У взрослых уровень лимфоцитов ниже 1500 клеток/мкл является диагностическим (подтверждением состояния), а у детей диагностическим является уровень лимфоцитов ниже 3000 клеток/мкл.
Лимфопения, опосредованная активацией S1P1, относится к лимфопеническому состоянию, вызванному при помощи модулятора S1P1. Поскольку S1P ответственен за S1P1-опосредованный выход лимфоцитов из лимфоузла в кровь, полагают, что более поздние средства вызывают развитие лимфопении в результате либо ингибирования рециркуляции интернализированных рецепторов S1P1 обратно на поверхность клеток, либо блокировки активации S1P1.
Ограниченная лимфопения представляет собой временное снижение уровня лимфоцитов в крови (абсолютного содержания лимфоцитов, выходящего за пределы нормального диапазона до лечения). Временный относится ко временному изменению уровня лимфоцитов, который возвращается к нормальному диапазону в пределах 24 или 48 ч.
Понятия не вызывающий развитие лимфопении или отсутствие лимфопении относятся к отсутствию временного или длительного снижения уровня лимфоцитов в крови (абсолютного содержания лимфоцитов, выходящего за пределы нормального диапазона до лечения). Временный относится ко временному изменению уровня лимфоцитов, который возвращается к нормальному диапазону в пределах 24 ч, тогда как длительный относится к снижению, которое сохраняется дольше 24 ч.
Защитная от AKI доза - доза {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6
- 4 032012 диметилфенокси}уксусной кислоты, которая обеспечивает значительное снижение уровня креатинина в плазме, составляющее по меньшей мере 30%.
Применяемое в настоящем документе понятие терапевтически эффективное количество означает количество фармацевтического соединения, такого как {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота, которое оказывает влияние на AKI.
Термин пациент означает пациента-человека.
Профилактический - тот, который служит для предупреждения или защиты от нежелательного эффекта и направлен на предупреждение проявления медицинского состояния, особенно заболевания.
Первым вариантом осуществления является {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль для применения при предупреждении или лечении AKI, где {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6диметилфенокси}уксусная кислота является не вызывающей развитие лимфопении при защитных от AKI дозах.
Вторым вариантом осуществления является {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2ил]-2,6-диметилфенокси (уксусная кислота или ее фармацевтически приемлемая соль для применения при предупреждении или лечении AKI, где защитные эффекты опосредованы активацией S1P1 без индуцирования развития лимфопении.
Другой вариант осуществления представляет собой изделие, которое описано выше, где на этикетке или листке-вкладыше, помещенных в упаковочный материал, указано, что пациентов, получающих лечение при помощи упомянутой выше фармацевтической композиции, можно лечить от AKI без индукции развития лимфопении.
Сокращения.
AKI - острое повреждение почек.
АроМ - аполипопротеин М.
CIN - контраст-индуцированная нефропатия.
CKD - хроническое заболевание почек.
DMSO - диметилсульфоксид.
ERBP - европейские стандарты по надлежащей практике лечения почек (European Renal Best Practice).
eGFR - расчетная скорость клубочковой фильтрации.
eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота.
ESRD - терминальная стадия заболевания почек.
FlipR - спектрофотометр для чтения планшетов для визуализации флуоресценции.
GPCRs - связанные с G-белком рецепторы.
HDL - липопротеины высокой плотности.
HDMEC - клетки микрососудистого эндотелия кожи человека.
HSC - звездчатые клетки печени.
ICU - отделение интенсивной терапии.
I/R - ишемия/реперфузия.
KDIGO - Заболевания почек: улучшение мировых результатов лечения.
PBS - фосфатный буферный раствор.
RRT - заместительная почечная терапия.
S1P - сфингозин-1-фосфат.
S1P1 - сфингозин-1-фосфат 1.
SCr - сывороточный креатинин.
s.e.m - стандартная ошибка среднего.
Примеры.
Приведенные далее примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Для удобства и для облегчения прочтения соединение {4-[5-(3-хлорфенокси)-оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота было переименовано в соединение А на фигурах и в разделе Результаты.
Были проведены статистические анализы и расчет р-значений, и на фигурах их обозначали символами либо *, либо # в зависимости от экспериментальных условий.
Фиг. 1 - эффект однократного или повторяемого введения соединения А и/или BAF-312 в крысиной модели ишемии-реперфузии (I/R). Крыс линии Fischer подвергали мнимой операции или 25 мин билатеральной обтурации почечной артерии и измеряли уровень креатинина в плазме после 24 ч реперфузии. Фиг. 1-А - соединение А оценивали в количестве 0,3, 1 и 3 мг/кг п.о., которое давали за 1 ч до обтурации. Фиг. 1-В - BAF-312 оценивали в количестве 3, 10 и 30 мг/кг п.о., которое давали за 1 ч до обтурации. Контрольной группе без соединения давали носитель за 1 ч до обтурации. *** р<0,001 - группа с I/R, обработанная носителем, в сравнении с группой мнимой операции. # р<0,05; ## р<0,01 - группа обработанных соединением в сравнении с группой носителя. Столбцы представляют собой среднее +/- s.e.m. Фиг.
- 5 032012
1-С - образцы почек собирали для оценки эффекта от соединения А на содержание кортикального альбумина после I/R-повреждения у крыс. Альбумин измеряли посредством вестерн-блоттинга в кортикальной области иллюстративных почек от подвергнутых мнимой операции крыс, крыс с I/R, обработанных носителем, или крыс с I/R, обработанных соединением А (3 мг/кг п.о.). Фиг. 1-D - соединение А (3 мг/кг п.о.) или носитель вводили два раза в день в течение 5 дней. Последнее введение производили за 1 ч до обтурации. ** р<0,01 - группа с I/R, обработанная носителем, в сравнении с группой мнимой операции. ### р<0,001 - группа обработанных соединением А в сравнении с группой носителя. Столбцы представляют собой среднее +/- s.e.m.
Фиг. 2 - эффект от соединения А на индуцированное рабдомиолизом повреждение от AKI у мышей. Соединение А (0,3, 1, 3 и 10 мг/кг) или носитель вводили перорально за 1 ч до внутримышечной инъекции (в задние конечности) глицерина (50% в PBS объем/объем) в количестве 8 мл/кг самцам мышей CD1. Группа мнимой операции получала соответствующий объем PBS. Уровень креатинина в плазме оценивали 24 ч спустя. ** р<0,01 - группа глицерина-носителя в сравнении с группой мнимой операции. # р<0,05 - группа обработанных соединением А в сравнении с группой, обработанной носителем. Столбцы представляют собой среднее +/-s.e.m.
Фиг. 3 - лимфоциты переферической крови у крыс линии Fischer после однократного введения (фиг.
3-А) или у крыс линии Sprague-Dawley после (фиг. 3-В) однократного введения или (фиг. 3-С) повторяемого введения. Соединение А вводили перорально в количестве либо 1, 3, 10 и 30 мг/кг крысам линии Fischer, либо 3 мг/кг крысам линии Sprague-Dawley. BAF-312 давали перорально в количестве либо 1 и 10 мг/кг крысам линии Fischer, либо 3 мг/кг крысам линии Sprague-Dawley (n=8). При протоколе повторяемого введения соединения вводили на протяжении 5 дней дважды в день. Лимфоциты крови представляли либо в виде площади под кривой (AUC) (фиг. 3-А), либо в виде процента от общего количества лейкоцитов в каждый момент времени (фиг. 3-В/С) и представляли как среднее +/- s.e.m. ** p<0,01 в сравнении с исходным уровнем.
Фиг. 3-D - взаимосвязь между защитой от AKI и лимфопенией у крыс линии Fischer. Отмечены столбцы, которые указывают на отсутствие лимфопении и полную защиту от AKI для соединения А в количестве 3 мг/кг, в то время как BAF-312 был лимфопеническим и демонстрировал частичную защиту от AKI.
Фиг. 4 - лимфоциты перефирической крови у мышей C57B16/J.
Соединение А вводили в количестве 1, 3, 10 и 30 мг/кг п.о. (n=8). Количество лимфоцитов крови в каждый момент времени выражено как процент от общего количества лейкоцитов и представлено как среднее +/- s.e.m. *** р<0,001 в сравнении с исходным уровнем.
Фиг. 5 - лимфоциты переферической крови у собак породы бигль. Получали исходные количества лимфоцитов, а затем собакам вводили однократную пероральную дозу соединения А в количестве 3, 10 и 30 мг/кг (n=8) или BAF-312 в количестве 10 мг/кг (n=4). За животными наблюдали на протяжении 7 дней (фиг. 5-А), а в случае BAF-312 на протяжении периода до 66 дней (фиг. 5-В). * р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001 в сравнении с исходным уровнем. Столбцы представляют собой среднее +/- s.e.m. Следует отметить, что соединение А не индуцировало никакой значительной лимфопении в любой из моментов времени при измерениях для дозы 3 мг/кг.
Фиг. 6 - пропотевание жидкости из сосудов легких у здоровых мышей C57B16/J и крыс линии Fischer. Мышей обрабатывали на протяжении 7 дней при помощи соединения А (3 и 10 мг/кг п.о. дважды в день), BAF-312 (1 и 3 мг/кг п.о. дважды в день) и финголимода (0,1 и 1 мг/кг п.о. дважды в день), n=5-8. Фиг. 6-А - проницаемость сосудов оценивали по просачиванию красителя Evans синий. Фиг. 6-В - масса легкого. Крыс обрабатывали на протяжении 7 дней при помощи соединения А (1, 3, 10, 30 и 100 мг/кг п.о. дважды в день) и BAF-312 (0,03, 0,1, 0,3, 3 и 30 мг/кг п.о. дважды в день). Фиг. 6-С - проницаемость сосудов оценивали по просачиванию красителя Evans синий. * р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001 в сравнении с контролем (без соединения) для мышей или носителем (метилцеллюлоза 0,6% - твин 80, 0,5% в воде) для крыс. Столбцы представляют собой среднее +/- s.e.m.
Фиг. 7 - десенсибилизация рецептора S1P1 на клетках микрососудистого эндотелия кожи человека (HDMEC) при помощи анализа сопротивления. HDMEC 1-й раз стимулировали на протяжении 1 ч при помощи либо S1P (1 мкМ), либо финголимода (100 нМ), либо соединения А (1 мкМ) с последующим 30 мин периодом вымывания. Эффект 1-го стимулирования на десенсибилизацию рецептора оценивали при помощи 2-го стимулирования S1P (3 концентрации) и измерения полученного в итоге сопротивления (n=3 эксперимента). Все концентрации 1-го стимулирования составляли >EC90. Столбцы представляют собой среднее +/- s.e.m.
Фиг. 8 - десенсибилизация рецептора S1P1 на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) при помощи анализа сопротивления. HUVEC 1-й раз стимулировали на протяжении 1 ч при помощи либо S1P (1 мкМ), соединения А (1 мкМ), финголимода (100 нМ) либо SEW2871 (1 мкМ) с последующим 30 мин периодом вымывания. Эффект 1-го стимулирования на десенсибилизацию рецептора оценивали при помощи 2-го стимулирования S1P (4 концентрации) и измерения полученного в итоге сопротивления (n=3 эксперимента). Все концентрации 1-го стимулирования составляли >ЕС90. Столбцы
- 6 032012 представляют собой среднее +/- s.e.m.
Фиг. 9 - десенсибилизация рецептора S1P1 на клетках СНО, сверхэкспрессирующих S1P1 (гибридный G-белок), при помощи анализа с FlipR. Фиг. 9-А - протокол предусматривал пятиминутное 1-е стимулирование при помощи S1P (100 нМ), соединения А, финголимода, BAF-312, понесимода в указанных концентрациях. Все концентрации 1-го стимулирования выбирали так, чтобы они составляли >ЕС90. После различных периодов вымывания десенсибилизацию рецептора оценивали путем 2-го стимулирования при помощи S1P (100 нМ). Фиг. 9-В - индуцированную S1P реакцию FlipR, выраженную как процент основной реакции, отображали для каждого соединения с различными периодами вымывания (от 15 до 60 мин, n=4 эксперимента). Столбцы представляют собой среднее +/-s.e.m.
Фиг. 10 - десенсибилизация рецептора S1P1 в звездчатых клетках печени человека (HSC) при помощи анализа с FlipR. Фиг. 10-А - протокол предусматривал 1-е стимулирование при помощи соединения А (10 мкМ) или BAF-312 (300 нМ). Все концентрации 1-го стимулирования выбирали так, чтобы они составляли >EC90. После периодов вымывания либо в 1 ч, либо в 3 ч десенсибилизацию рецептора оценивали при помощи 2-го стимулирования таким же соединением. Фиг. 10-В - индуцированную соединением А или BAF-312 реакцию FlipR, выраженную в виде единиц флуоресценции, отображали для каждого соединения с различными периодами вымывания (n=3 эксперимента). Столбцы представляют собой среднее +/- s^.m.
Фиг. 11 - динамика S1P в плазме после I/R-повреждения у мышей C57B16/J. Уровни S1P в плазме (набор Elisa от Echelon) оценивали после мнимой операции или после 22 мин билатеральной обтурации почечной артерии с последующей реперфузией. Контрольную группу (CTRL) не подвергали оперативному вмешательству. ### р<0,001 в сравнении с группой мнимой операции (сочетаемые по времени). * р<0,05; ** р<0,001; *** р<0,001 в сравнении с контролем (CTRL). Столбцы представляют собой среднее +/-s^.m.
Способы
Материалы.
Финголимод и SEW2871 являются коммерчески доступными. BAF-312 и понесимод синтезировали в соответствии с опубликованными способами в WO 04/103306 для BAF-312, WO 05/054215 для понесимода.
Соединение А синтезировали в соответствии со способами, описанными в патентном документе WO 2011/086079.
Все исследования in vivo осуществляли в соответствии со стандартами европейского сообщества по уходу и применению лабораторных животных и одобрением комитетом по уходу и применению животных Sanofi Research & Development.
Статистические анализы.
Исходя из нормальности распределения и однородности дисперсии (критерий Левена) использовали критерий Стьюдента или критерий Уилкоксона для сравнения группы мнимой операции/контрольной группы с обрабатываемой носителем группой с целью определения различий оцениваемого параметра. Затем осуществляли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) или двуфакторный ANOVA при помощи программного обеспечения Everst@t V6 для сравнения группы, обработанной носителем, с группой(группами), обработанной(ыми) соединением. При необходимости за данным первичным анализом следовал апостериорный тест Даннетта. В случае неоднородности дисперсии применяли критерий Крускала-Уоллиса. Различия между группами считали значимыми, если р<0,05.
1. Безопасность для сердечно-сосудистой функции.
а) Анализ hERG.
Рекомбинантную линию клеток СНО (яичник китайского хомячка), экспрессирующую ERG (ген специфических калиевых каналов сердца человека) калиевого канала человека (номер по каталогу Cytomyx: CYL3002), культивировали в соответствии с приведенным далее протоколом. В случае необходимости культуру восстанавливали из замороженных аликвот. Аликвоты замороженных клеток (1 мл) быстро нагревали до 37 °С и сперва пересевали на матрас в 75 см2 (Corning). Затем объем доводили до 10 мл при помощи α-минимально обогащенной среды (Gibco 32571-028), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Среду обновляли спустя 24 ч и добавляли 1% генетицина (G418, Gibco 10131) для предупреждения клеточной дифференцировки. Спустя два или три дня клетки высеивали в количестве l,5x106 клеток на матрас Т25. Матрасы помещали в инкубатор с 5% СО2 при 37°С на 1 ч, после чего их помещали в инкубатор с 5% СО2 при 28°С на 2 дня. Процедуру для выделения клеток осуществляли после 2 дней инкубирования при 28°С. Клетки собирали при помощи Accumax (Sigma; 1:4) или версена (Gibco) и помещали во внеклеточную среду.
На клетки выливали внеклеточный раствор PATCH (NaCl, 138 мМ; KCl, 4 мМ; CaCl2, 1,8 мМ; MgCl2, 1 мМ; глюкоза, 5,6 мМ, HEPES, 10 мМ).Доводили рН до 7,3 при помощи NaOH. Осмолярность доводили до 285 мосмоль. Внутренний раствор готовили следующим образом: KCl, 60 мМ; KF, 70 мМ; NaCl, 15 мМ; HEPES, 5 мМ; EGTA(K), 5 мМ; рН доводили до 7,25 при помощи KOH. Осмолярность доводили до 290 мосмоль.
- 7 032012
Ток hERG активировали в ответ на скачки напряжения (2 с) от исходного потенциала -80 мВ до тестового потенциала +20 мВ с последующей реполяризацией до -100 мВ. Скачки напряжения применяли с 20-секундными интервалами. Ток hERG измеряли как следовой дезактивизирующий ток при -100 мВ. После 3-минутного периода измерений на исходном уровне измеряли эффекты соединения А через 4-6 мин после замены раствора. В конце каждого эксперимента вливание специфического блокатора для hERG, т.е. рисперидона (который характеризуется IC50 приблизительно 0,7 мкМ), в концентрации 10 мкМ позволяло измерять 100% ингибирование hERG.
Токи анализировали при помощи базы данных и аналитического программного обеспечения DataXpress 1.0 (Axon Instruments/Molecular Devices). Линейный подсчет токов экстраполировали из периода измерения на исходном уровне, а процент ингибирования тока hERG после эффекта от лекарственного средства рассчитывали следующим образом:
процент ингибирования тока hERG (%)=100-[((I-Iрисперидон)/(Iисходный уровеньЛрисперидон)) х 100], где I представляло собой ток, измеренный после эффекта от лекарственного средства, 'Трисперидон представляло собой ток, измеренный после эффекта от специфического блокатора для hERG, и 1исходный уровень представляло собой ток, измеренный до вливания лекарственного средства.
b) Анализ волокон Пуркинье кролика.
Эффекты соединения А на параметры мембранного потенциала покоя и потенциала действия, записанные от выделенных волокон Пуркинье кролика (самец, новозеландские кролики, от 1,3 до 1,5 кг, возрастом 9-12 недель), оценивали с помощью микроэлектродной методики. Измеряли следующие параметры: потенциал покоя (RP в мВ), амплитуду потенциала действия (АРА в мВ), максимальную скорость роста потенциала действия (Умакс в В/с), продолжительность потенциала действия при 50 и 90% реполяризации (APD50 и APD90 в мс). На волокна выливали кислородсодержащий физиологический раствор, содержащий (в ммоль/л): NaCl, 120; KCl, 4; MgCl2, 1; NaH2PO4, 1,8; NaHCO3, 25; глюкоза, 11; CaCl2, 1,8; pH=7,4 при 36±1°С. Соединение А сначала растворяли в DMSO с получением маточного раствора с концентрацией 12 ммоль/л. Этот раствор дополнительно разводили в DMSO и затем вносили в физиологический раствор с получением соответствующих номинальных концентраций 0,3, 1, 3, 10 и 30 мкмоль/л (т.е. соответственно 0,1, 0,5, 1,4, 4,5 и 13,6 мкг/мл активного ингредиента). Итоговая концентрация DMSO в тестируемом составе сохранялась постоянной на уровне 0,25% (объем/объем) в физиологическом растворе. На волокна Пуркинье (n=4) сначала выливали физиологический раствор. После 30-минутного контрольного периода тестируемое соединение оценивали при последовательно применяемых повышающихся концентрациях каждые 30 мин. Для каждой тестируемой концентрации волокна стимулировали с основной частотой 1 импульс/с (1 Гц). В дополнение к этому частоту стимулирования снижали от 1 импульса/с (1 Гц) до 1 импульса каждые 4 с (0,25 Гц) на 3 мин, повышали снова до 1 импульса/с на 1 мин и в итоге повышали до 3 импульсов/с (3 Гц) на дополнительные 2 мин (между 19-й и 25-й минутами), как описано ниже.
| ВРЕМЯ (мжв.) | 19 | 3 |1| 2 | 6 I 1» I 3 |1| 2 | S | 19
| Частота | 3 | 3 | |||||||||
| стяхудлровдлмя | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | L 1 .. 1 | ||||
| (Гц) | 0.25 | 0,25 | |||||||||
| Контрольный период (30 мка) | Соегаше I“ шатнтрадп (30 | 2й Коки (30 ио.) |
Низкую частоту стимуляции применяли для содействия возникновению аномальных электрических явлений в течение фазы реполяризации потенциала действия и для содействия развитию ранних постдеполяризаций (EAD). Высокую частоту стимуляции применяли для оценки зависимой от применения блокады натриевых каналов. После наивысшей концентрации снова выливали физиологический раствор для оценки обратимости эффекта от лекарственного средства (вымывание).
с) Телеметрические исследования на собаках.
Целью этого исследования была оценка потенциального эффекта соединения А на сердечнососудистую функцию (давление крови, скорость сердцебиения и ECG) у бодрствующих собак с измеряемыми телеметрическими данными на протяжении 24-часового периода после введения дозы.
Бодрствующие собаки в условиях свободного поведения (Marshall Farms, n=4, 2 кобеля и 2 суки с массой тела от 6,9 до 10,8 кг и возрастом от 44 до 64 месяцев) получали пероральную или внутривенную дозу продукта, выступающего в роли отрицательного контроля, (т.е. водный раствор 0,5% (масса/масса) гидроксиэтилцеллюлозы/0,6% (масса/масса) полисорбата 80 пероральным путем или водный раствор 20% каптизола, рН от 7,5 до 8, с последующим получением соединения А в количестве 30 и 100 мг/кг пероральным путем как суспензии в группе продукта, вступающего в роли отрицательного контроля, или 10 и 30 мг/кг внутривенным путем как раствор в группе продукта, выступающего в роли отрицательного контроля, в соответствии со схемой исследования с повышающейся дозой по меньшей мере с 4-дневным периодом вымывания между каждым введением (5 мл/кг пероральном путем или на протяжении 30 мин вливания в яремную вену). Давление артериальной крови и II отведение ECG (датчики от Data Science,
- 8 032012
США) непрерывно записывали на каждый день обработки от приблизительно 2 ч до введения дозы и до 24 ч после введения дозы. Анализировали следующие параметры в нескольких моментах времени: артериальное кровяное давление (систолическое, диастолическое и среднее), частоту сердцебиения, электрокардиографические параметры RR, PQ (=PR), продолжительность интервала QT и продолжительность комплекса QRS, а также температуру тела. Интервал QT корректировали по различиям частоты сердцебиения в соответствии как с формулой Фридерика, так и с формулой ван де Ватера. Полный сигнал ECG непрерывно проверяли на любые нарушения ритма и морфологию формы колебаний сигнала, начиная от 30 мин и до 6 ч после введения дозы. В каждый день обработки проводили клинические наблюдения. Просматривали видеозаписи для выявления потенциальных крупных изменений поведения и потенциального влияния на сердечнососудистые параметры. После введения дозы моменты времени для анализа были следующими: 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16 и 24 ч.
2. Выявление отличий в отношении целостности эндотелиального барьера.
a) Исследование пропотевания жидкости из сосудов легкого у мыши.
Самцов мышей C57B16/J (n=5-8, 25-30 г) (Charles River Laboratory, Франция) обрабатывали перорально два раза в день на протяжении 7 дней при помощи соединения А в количестве 3 и 10 мг/кг, BAF312 в количестве 1 и 3 мг/кг, финголимода в количестве 0,1 и 1 мг/кг или продукта, представляющего собой носитель (метилцеллюлоза 0,6% - твин 80 0,5% в воде), с объемом введения 10 мл/кг. Число мышей, включенных в каждую группу, составляло от 5 до 8. Спустя 7 дней мышей подвергали анестезии при помощи внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Краситель Evans синий вводили внутривенной инъекцией в яремную вену в количестве 15 мг/кг в 1 мл/кг. Десять минут спустя физиологическую сыворотку вводили инъекцией в левый желудочек для промывания организма от остаточного красителя Evans синего. Ткань легких собирали и взвешивали, а затем погружали в чистый раствор формамида на 24 ч для извлечения красителя Evans синего из ткани и, таким образом, оценки проницаемости сосудов. Концентрацию красителя Evans синего оценивали при 630 нМ с помощью стандартной кривой и нормализовали по массе легкого. Результаты выражали как средние +/- s^.m.
b) Исследование пропотевания жидкости из сосудов легкого у крысы.
Самцов крыс линии Fischer (n=4-8, 280-350 г) (Charles River Laboratory, Франция) обрабатывали перорально два раза в день на протяжении 7 дней при помощи соединения А (1, 3, 10, 30 и 100 мг/кг), BAF312 (0,03, 0,1, 0,3, 3 и 30 мг/кг) или продукта, представляющего собой носитель (метилцеллюлоза 0,6% твин 80 0,5% в воде), с объемом введения 2 мл/кг. Спустя 7 дней крыс подвергали анестезии при помощи внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (50 мг/кг). Краситель Evans синий вводили внутривенной инъекцией в ретро-орбитальный синус в количестве 30 мг/кг в 1 мл/кг. Через пятнадцать минут физиологическую сыворотку вводили инъекцией в левый желудочек для промывания организма от остаточного количества внутрисосудистого красителя Evans синего. Ткань легкого собирали и взвешивали, а затем погружали в чистый раствор формамида (4 мл/г массы ткани) на 24 ч для извлечения красителя Evans синего из ткани и, таким образом, оценки проницаемости сосудов. Концентрацию красителя Evans синего оценивали при 630 нМ с помощью стандартной кривой. Результаты выражали как средние +/-s.e.m.
3. Выявление отличий в отношении лимфопенической активности.
a) Исследования лимфопении у крыс.
Самцы крыс линии Sprague-Dawley (n=8, от 250 до 350 г) (Charles River Laboratory, Франция) получали пероральное введение соединения A, BAF-312 в количестве 3 мг/кг или продукта, представляющего собой носитель (метилцеллюлоза 0,6% - твин 80 0,5% в воде), с объемом введения 2 мл/кг. Применяли два протокола: однократное или повторяемое введение дважды в день в течение 5 последовательных дней. Кровь собирали через 2, 6 и 24 ч после введения соединения (последнее введение по протоколу с повторениями) для гематологического анализа с целью определения содержания лимфоцитов в цельной крови. Результаты выражали как среднее +/-s.e.m.
Самцы крыс линии Fischer (n=8, от 250 до 350 г) (Charles River Laboratory, Франция) получали пероральное введение соединения А (1, 3, 10 и 30 мг/кг), BAF-312 (1 и 10 мг/кг) или продукта, представляющего собой носитель (метилцеллюлоза 0,6% - твин 80 0,5% в воде), с объемом введения 2 мл/кг. Кровь собирали через 2, 6 и 24 ч после введения соединения для гематологического анализа с целью определения содержания лимфоцитов в цельной крови. Результаты выражали как среднее +/-s.e.m.
b) Исследование лимфопении у мышей.
Самцы мышей C57B16/J (n=8, от 25 до 30 г) (Charles River Laboratory, Франция) получали однократное пероральное введение соединения А в количестве 1, 3, 10 и 30 мг/кг или продукта, представляющего собой носитель (метилцеллюлоза 0,6% - твин 80 0,5% в воде), с объемом введения 10 мл/кг. Кровь собирали через 2, 6 и 24 ч после введения соединения для гематологического анализа с целью определения содержания лимфоцитов в цельной крови. Результаты выражали как среднее +/-s.e.m.
c) Исследования лимфопении у собак.
Бодрствующие собаки в условиях свободного поведения (Marshall Farms, n=8, с массой тела от 10,5 до 14,3 кг) получали пероральную дозу продукта, выступающего в роли отрицательного контроля (т.е. водный раствор 0,5% (мас./мас.) гидроксиэтилцеллюлозы/0,6% (мас./мас.) полисорбата 80), или соединения А в количестве 3, 10 и 30 мг/кг, или BAF-312 в количестве 10 мг/кг как суспензии в группе продукта,
- 9 032012 выступающего в роли отрицательного контроля, в соответствии со схемой исследования с повышающейся дозой по меньшей мере с 7-дневным периодом вымывания между каждым введением (5 мл/кг). Кровь собирали через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 48 и 168 ч для обоих соединений (и вплоть до 66 дней для BAF-312) для гематологического анализа с целью определения содержания лимфоцитов в цельной крови. Результаты выражали как среднее +/-5.е.ш.
4. Фармакология in vitro.
а) Анализ мобилизации кальция (FlipR) в клетках яичника китайского хомячка (СНО), клетках Chem и HSC.
1) Клетки СНО.
Тестировали показатели активности соединения A, BAF-312 и финголимода после стабильной трансфекции Flp-In конструкцией гибрид hS1P1-G-белок клеток СНО (собственная разработка) и выборочно тестировали в отношении конструкций hS1P2 и гибрид hS1Pз-G-белок (собственная разработка). Создание линии клеток описано в патентном документе WO 2011/086079.
Активацию рецептора S1P1 посредством соединений определяли количественно по эффекту на высвобождение кальция, связанное с рецептором S1P1, в клеточном флуоресцентном анализе кальция с применением клеток СНО, у которых стабильно сверхэкспрссировался рецептор S1P1 человека (система Flp-In, Invitrogen). Для усиления связывания G-белка и управления передачей сигнала на высвобождение Са2+ сверхэкспрессированный рецептор дополнительно имел С-концевую последовательность модифицированного G-белка (Gai4qi4), WO 02/04665. Изменения внутриклеточного кальция определяли посредством флуоресцентного измерения при помощи чувствительного к кальцию красителя fluo-4 (Invitrogen) в спектрофотометре для чтения планшетов для визуализации флуоресценции (FlipR, Molecular Dynamics).
Клетки СНО, стабильно сверхэкспрессирующие рецептор S1P1 человека, высевали (40000 на лунку) в черные с прозрачным дном 96-луночные планшеты с покрытием поли-Э-лизином (Becton Dickinson, Biocoat cellware) примерно за 18-24 ч до экспериментов. Клетки выращивали в термостате при 37°С с 5% диоксида углерода и 95% влажностью в среде для культивирования клеток на основе среды F-12 GlutaMAX (Gibco № 31765), дополненной 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина (PAN, № P06-07100), 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS; Hyclone, FBS, обработанная активированным углем/декстраном, № SH30068) и гигромицином В (Invitrogen, № 10687-010), 300 мг/л (итоговые концентрации).
Перед экспериментом с FlipR клетки загружали сложным фтор-4-ацетоксиметиловым эфиром (fluo4 AM, Invitrogen, № F14202) на 60 мин в термостате при 37°С с 5% диоксида углерода и 95% влажностью в буфере для внесения красителя, состоящем из сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS; Invitrogen № 14065049), дополненного fluo-4 AM в количестве 2 мкМ (все данные приведены для итоговой концентрации), Pluronic® F-127 0,05% (объем/объем) (Invitrogen, № Р-3000МР), HEPES 20 мМ (Gibco № 15630), пробенецидом 2,5 мМ (Sigma № Р-8761) и альбумином бычьей сыворотки (BSA) 0,05% (Sigma № А-6003), рН доведен до 7,5 при помощи гидроксида натрия. В течение периода загрузки клеток fluo-4 AM отщеплялся внутриклеточной эстеразой, что приводило в результате к захвату клетками красителя fluo-4. Загрузку завершали посредством промывания клеток в промывной камере для клеток (промывная камера Tecan Power) три раза при помощи указанного выше буфера, но без fluo-4 AM и BSA. Этот последний буфер также применяли в качестве буфера в последующих клеточных измерениях флуоресценции.
Клетки с загруженным красителем и промытые затем стимулировали при помощи соответствующих соединений с различными концентрациями, добавленными в виде раствора в DMSO (0,3% объем/объем максимальной итоговой концентрации DMSO) или при помощи S1P (100 нМ итоговая концентрация) в DMSO лишь в соответствующей концентрации (положительный контроль).
Соединения, которые активировали рецептор S1P, вызывали высвобождение внутриклеточного кальция из внутренних резервов, что приводило в результате к большому временному повышению флуоресцентного сигнала fluo-4, который отслеживали на протяжении примерно 3 мин. Процент активации, обусловленной тестируемым соединением, определяли из максимальной реакции флуоресценции по сравнению с максимальной реакцией флуоресценции на положительный контроль S1P. Все значения флуоресценции корректировали по значениям флуоресценции на исходном уровне, полученным при помощи клеток, которые предварительно инкубировали только с DMSO и не обрабатывали при помощи S1P (контроль на исходном уровне). Все измерения выполняли в трех повторностях. Исходя из активации при различных концентрациях рассчитывали значение ЕС50.
2) Клетки Chem.
Анализы с GPCRProfiler® от Millipore применяли для определения ЕС50-активности соединения A, BAF-312 и финголимода на рецепторах S1P1, S1P2, S1P3, S1P4 или S1P5. В таких анализах применяли стабильные линии клеток GPCR ChemiScreen.
3) HSC.
- 10 032012
HSC человека (Sciencell) высевали в количестве 25х103 клеток на лунку в 96-луночный планшет, 100 мкл/лунка, и оставляли для прикрепления клеток к стенкам на 24 ч в полной среде (Sciencell SC5301) с 1% дополнительных компонентов (Sciencell SC5352) и 2% FCS. Культуральную среду заменяли на Sciencell Medium с 2% FCS, но без дополнительных компонентов еще на один 24-часовой период. Клетки промывали и помещали в 100 мкл аналитического буфера (HBSS, 0,8 мМ MgSO4, 20 мМ Hepes, 3,3 мМ Na2CO3, 1 мМ CaCl2, 10% BSA). Клетки загружали Fluo4-AM в присутствии плюрониловой кислоты на 1 ч при 37°С в темноте. Среду загрузки удаляли и заменяли на 200 мкл/лунка аналитического буфера. Клеткам позволяли стабилизироваться в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Культуральный планшет помещали в аппарат FlipR, добавляли соединение А или BAF-312 до объема 50 мкл (5Х раствор, итоговая концентрация 10 мкМ) и флуоресценцию кальция непрерывно записывали в течение 6 мин. Для экспериментов на десенсибилизацию после первого введения соединения А или BAF-312 культуральный планшет один раз промывали и позволяли восстанавливаться в течение 1 или 3 ч в аналитическом буфере перед вторым добавлением соединения А или BAF-312. Для контрольных экспериментов первое введение соединения А или BAF-312 заменяли на аналитический буфер, а второе введение соединения А или BAF-312 брали в качестве эталона сравнения. Результаты выражали в виде единиц флуоресценции (FU).
b) Анализ с β-аррестином.
Анализ с β-аррестином PathHunter® от DiscoverX применяли для определения ЕС50-активности соединения A, BAF-312 и финголимода на рецептор S1P1, S1P2, S1P3, S1P4 или S1P5. Соединения тестировали в аналитической среде, содержащей 0,5% FBS.
c) Анализ с GTPyS.
Этот способ описан в патентном документе WO 2011/086079.
d) Анализ интернализации.
Анализ интернализации при активации GPCR PathHunter® от DiscoverX применяли для определения ЕС50-активности соединения А, BAF-312 и финголимода на рецептор S1P1. Соединения тестировали в аналитической среде, содержащей 0,5% FBS.
e) Анализ с сАМР в клетках яичника китайского хомячка (СНО) и HUVEC.
1) Клетки СНО.
Анализ с сАМР Hit Hunter® от DiscoverX применяли для определения EC50-активности соединения A, BAF-312 и финголимода на S1P1. Соединения тестировали в аналитической среде, содержащей 0,5% FBS.
2) HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека).
Циклический AMP в ответ на соединение A, BAF-312 или финголимод оценивали в клетках HUVEC, обработанных форсколином, при помощи набора сАМР HTRF® (Cisbio). Вкратце, HUVEC (Lonza) высевали в количестве 5х103 клеток на лунку в белый 96-луночный планшет (половина объема) на 24 ч в среду EGM2 (Lonza). В начале эксперимента среду EGM2 заменяли на аналитический буфер, который состоял из HBSS, содержавшей Hepes (10 мМ), BSA (0,1%) и IBMX (0,5 мМ). Клеткам позволяли восстановиться в течение 15 мин. Соединение A, BAF-312 или финголимод (10 нМ - 100мкМ) добавляли к клеткам на 15 мин с последующим добавлением форсколина (FSK, 10 мкМ). После 45 мин обработки FSK реакцию останавливали посредством добавления MАb к сАМР-криптату и сАМР-02 на 1 ч. В конце инкубирования считывали флуоресценцию (Envision, Perkin Elmer) и рассчитывали соотношение FRET в соответствии с протоколом аналитического набора. При помощи программного обеспечения Sanofi BIOST@T-SPEED в соответствии с моделью логистического уравнения рассчитывали эффективность соединения A, BAF-312 или финголимода (ЕС50).
f) Фосфорилирования Akt и ERK1/2 в анализах клеток.
RPTEC (в основных условиях или после стимуляции туникамицином).
Клетки RPTEC (Lonza) высевали в количестве 0,3х106 клеток на лунку в 6-луночные планшеты по 2 мл на лунку полной среды REBM/REGM (Lonza) на 24 ч. Клетки подвергали сывороточному голоданию в течение дополнительного 24-часового периода в 900 мкл среды для поддержания клеток в неактивном состоянии. Повышающиеся концентрации соединения А (10Х) добавляли до объема 100 мкл в каждую лунку на 10 мин при 37°С. При необходимости за 30 мин до добавления соединения А добавляли туникамицин (100 мкл). После удаления среды клетки промывали при помощи холодного PBS и лизировали на льду в 100 мкл холодного буфера RIPA, содержащего 1% тритона, ингибиторы протеаз и фосфатаз. Для вестерн-блоттинга 30 мкг общего белкового лизата загружали в 4-12% бис-трис-гели (Invitrogen). После прогонки и переноса нитроцеллюлозные мембраны изучали при помощи антитела к фосфоAkt (фосфо^М73, Cst № 9271) и антитела к фосфо-ВАш (фосфо-Tyr202/Tyr204, Cst № 4377). Тубулиновое мечение при помощи антитела к α-тубулину (Cst № 2144) применяли для нормализации после денситометрического анализа пленок.
g) Фосфорилирования Akt и ERK1/2 в анализах клеток HUVEC в условиях голодания.
Клетки HUVEC (Lonza) высевали в количестве 0,3х106 клеток на лунку в 6-луночные планшеты по 2 мл на лунку полной среды EGM2 (Lonza) на 24 ч. Клетки подвергали сывороточному голоданию в те
- 11 032012 чение дополнительного 24-часового периода в 900 мкл среды для поддержания клеток в неактивном состоянии. Повышающиеся концентрации соединения A, BAF-312 или финголимода (10Х) добавляли до объема 100 мкл в каждую лунку на 10 мин при 37°С. После удаления среды клетки промывали при помощи холодного PBS и клетки лизировали на льду в 100 мкл буфера RIPA, содержащего 1% тритона, ингибиторы протеаз и фосфатаз. Для вестерн-блоттинга 30 мкг общего белкового лизата загружали в 412% бис-трис-гели (Invitrogen). После прогонки и переноса нитроцеллюлозные мембраны изучали при помощи антитела к фосфо-Akt (фосфо^М73, Cst № 2965) и антитела к фосфо-БАш (фосфоTyr202/Tyr204, Cst № 4377). Тубулиновое мечение при помощи антитела к α-тубулину (Cst № 2144) применяли для нормализации после денситометрического анализа пленок.
h) Анализ индуцированного туникамицином апоптоза.
Эффект соединения А на индуцированный туникамицином (TN) апоптоз у RPTEC измеряли посредством аналитического набора Caspase-Glo 3/7 (Promega). Вкратце, клетки RPTEC (Lonza) высевали в 96-луночные белые планшеты в количестве 30х103 клеток на лунку в REGM (среда REBM с добавлением 0,5% FCS и Single quots, Lonza) и оставляли для прикрепления клеток к стенкам на 24 ч. Спустя 24 ч полную среду заменяли на среду, не содержащую сыворотку и дополнительные компоненты (56 мкл/лунка). Клетки предварительно обрабатывали в течение 30 мин соединением А (итоговые концентрации 0,3-30 мкМ, 7 мкл) с последующим добавлением туникамицина (TN, итоговая концентрация 0,1 мкг/мл, 7 мкл). Спустя 24 ч при 37 °С с 5% СО2 добавляли 70 мкл реактива Caspase-Glo и культуральный планшет помещали на качалку на 1 ч. Люминесценцию регистрировали посредством ридера Envision (Perkin Elmer). Результаты выражали в виде процента ингибирования TN-индуцированного апоптоза.
i) Анализ TNFa-индуцированной сверхэкспрессии молекул адгезии.
Экспрессию ICAM-1, VCAM-1 и Р/Е-селектинов измеряли у HUVEC посредством ELISA. Клетки HUVEC высевали в 96-луночные планшеты в количестве 25х103 клеток на лунку до объема 100 мкл в среду EGM2 (Lonza), оставляли для прикрепления клеток к стенкам на 24 ч. Спустя 24 ч полную среду заменяли на среду для поддержания клеток в неактивном состоянии (EGM2 без дополнительных компонентов и сыворотки) на 3 ч. После этого клетки предварительно обрабатывали соединением А или BAF312 (1-30 мкМ) в течение 18 ч. Затем клетки обрабатывали при помощи TNF-a (3 нг/мл) в среде без факторов роста на протяжении дополнительного 6 ч периода. Среду удаляли, а клетки промывали и фиксировали при помощи 100 мкл раствора RLC2 на лунку (Alphelys № 01-RLC2-RTU30) в течение 20 мин при 4°С. Фиксированные клетки промывали два раза при помощи 100 мкл HBSS перед добавлением антител к ICAM-1 (№ BBA3, R&D System), антител к VCAM-1 (№ BBA5, R&D System) и антител к Р/Еселектинам (№ ВВА1, R&D system) на 1 ч. После тщательного промывания на 2 ч добавляли антитела к мышиному IgG с HRP (№ NA931, Amersham). После промывания и добавления субстрата для HRP (OPD, Sigma № P9187) считывали оптическую плотность при 450 нм (Envision). Результаты выражали в виде процента ингибирования TNF-a-индуцированной экспрессии молекул адгезии.
j) Анализ измерения сопротивления в клетках яичника китайского хомячка (СНО) и эндотелиальных клетках.
1) Клетки СНО.
Анализ сопротивления от CEREP применяли для определения EC50-активности соединения A, BAF312 и финголимода на S1P1.
2) Эндотелиальные клетки.
Соединение A, BAF-312, финголимод, SEW2871 и S1P (применяемый в качестве положительного контроля) тестировали в зависимости от концентрации в отношении их эффекта на изменение формы, которое выявляли посредством изменений электрического сопротивления (система X-celligence) с целью отслеживания десенсибилизации рецептора S1P1 как на клетках микрососудистого эндотелия кожи человека (HDMEC), так и на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). На 1 день первоначальные клетки высевали в 96-луночные е-планшеты, предварительно покрытые коллагеном-I, в количестве 20000 клеток на лунку. После 24 ч прикрепления клеток к стенкам и пролиферации HDMEC и HUVEC подвергали 1у стимулированию в течение 1 ч посредством либо S1P (1 мкМ), соединения А (1 мкМ для HDMEC; 0,1, 1, 10 мкМ для HUVEC), BAF-312 (1, 10, 100 нМ лишь в HUVEC), финголимода (100 нМ для HDMEC; 1, 10, 100 нМ для HUVEC), либо SEW2871 (0,1, 1, 10 мкМ, только в HUVEC). После инкубирования с агонистами S1PR клетки осторожно промывали два раза при помощи среды с последующим 5,5 ч периодом восстановления. Затем эффект предыдущего 1-го стимулирования на десенсибилизацию рецептора оценивали при помощи 2-го стимулирования повышающимися концентрациями S1P (0,1, 1 и 10 мкМ) и измерения полученного в результате сопротивления. Все измерения осуществляли по меньшей мере в трех повторностях. Все концентрации 1-го стимулирования составляли >ЕС90 в HDMEC. Результаты выражали в произвольных единицах сопротивления как среднее +/- s.e.m.
5. Фармакология in vivo.
а) Крысиная модель ишемически-реперфузионного (I/R) повреждения почек.
Самцы крыс линии Fischer (n=3-9, от 250 до 300 г) (Charles River Laboratory, Франция) получали пероральное введение соединения А в количестве 0,3, 1 и 30 мг/кг, или BAF-312 в количестве 3, 10 и 30 мг/кг,
- 12 032012 или продукта, представляющего собой носитель (метилцеллюлоза 0,6% - твин 80 0,5% в воде), с объемом введения 2 мл/кг за 1 ч до почечной ишемии. Во второй серии экспериментов соединение А вводили дваждый в день в течение 5 дней для оценки потенциальной тахифилаксии. Вкратце, животных подвергали мнимой операции (т.е. лапаротомии, изоляции почечной артерии) или 25-минутной билатеральной обтурации почечной артерии под анестезией пентобарбиталом (50 мг/кг и.п.). Внимательно отслеживали температуру тела (37-38°С) и гидратацию (брюшинная инъекция физиологической сыворотки) для стандартизации хирургической процедуры и ограничения межиндивидуальной вариабельности. В конце ишемического периода почки подвергали реперфузии путем удаления зажимов, а качество реперфузии контролировали до реализации плана наложения швов на мышцы и кожу (животных с недостаточной реперфузией немедленно исключали). Двадцать четыре часа спустя собирали кровь и почки. Кровь центрифугировали (3000 g, 10 мин), замораживали гепаринизированную плазму для оценки уровня креатинина при помощи биохимического анализатора (Р400, Horiba, Франция). Одну почку замораживали для вестерн-блоттинг анализов для оценки тканевого альбумина (антитело к альбумину, Santa Cruz) и тканевого HSP70 (моноклональное антитело к HSP70 от Santa Cruz № SC32239), а вторую почку фиксировали (10% нейтрально-буферизированным формалином) и заливали парафином для гистологических анализов на шлифы толщиной 5 мкм (количественная оценка острого канальцевого некроза при помощи классического окрашивания гематоксилин-эритрозин-шафраном, модифицированной окраски трихромом по Массону и перйодной кислотой-реактивом Шиффа, ассоциированными с синим альцином) и иммуногистохимических анализов (окрашивание макрофагов при помощи моноклонального антитела к CD68 от Acris, № ВМ4000 и окрашивание капилляров при помощи моноклонального антитела к РЕСАМ от Santa Cruz, № SC1506, при помощи робота Ventana, VMS Inc.). Острый канальцевый некроз выражали как процент канальцев, у которых наблюдали некроз клеток на 12-15 участках в почечной кортикомедуллярной области. Иммуномечение CD68 и РЕСАМ выражали как процент числа положительных пикселей (алгоритм Aperio) на всем участке. Уровень креатинина в плазме выражали как среднее +/^.е.ш.
b) Мышиная модель индуцированного рабдомиолизом повреждения почек.
Самцы мышей линии Swiss (CD1) (n=5-15, возрастом 13-14 недель) (Charles River Laboratory, Франция) получали пероральное введение соединения А в количестве 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг или продукта, представляющего собой носитель, (метилцеллюлоза 0,6% - твин 80, 0,5% в воде) с объемом введения 10 мл/кг за 1 ч. до инъекции глицерина. Внутримышечную инъекцию глицерина (50% в PBS объем/объем) или продукта, представляющего собой носитель (PBS), осуществляли в задние конечности (2 инъекции на лапу в икроножную и в прямую мышцу бедра) в количестве 8 мл/кг под анестезией пентобарбитала (33 мг/кг) и кетамина (40 мг/кг). Двадцать четыре часа спустя кровь собирали, центрифугировали (3000 g, 10 мин) и замораживали гепаринизированную плазму для оценки уровня креатинина при помощи биохимического анализатора (Р400, Horiba, Франция). Результаты выражали как среднее +/^.е.ш.
Результаты.
Соединение в соответствии с настоящим изобретением под названием соединение А подвергали различным экспериментам in vitro и in vivo для того, чтобы продемонстрировать его активность в условиях AKI и для выявления его отличий относительно функциональных антагонистов S1P1.
1. Безопасность для сердечно-сосудистой функции.
Несмотря на то, что соединение А является агонистом S1P1, у которого отсутствует функциональный антагонизм, потенциальные мишень-ориентированные проблемы могут быть схожи с таковыми при применении функциональных антагонистов S1P1. На сегодняшний день был получен огромный клинический опыт со смешанным соединением S1P1/3/4/5, финголимодом, который индуцирует атриовентрикулярную блокаду и брадикардию (Schmouder et al., 2006, J Clin Pharmacol 46: 895-904). Существует множество доклинических подтверждений, свидетельствующих о вовлеченности S1P3 в такие результаты кардиотоксичности, следовательно, область сместилась в сторону поиска селективных соединений для S1P1 для преодоления таких недостатков. Тем не менее, селективные соединения для S1P1, которые переходят на клиническую фазу испытаний, по-видимому, также индуцируют брадикардию (Gergely et al., 2012, BJP 167: 1035-1047), но их влияние на атриовентрикулярную блокаду до настоящего времени не известно. Поэтому в дополнение к обычным исследованиям был проведен ряд исследований для оценки потенциальной кардиотоксичности соединения А. В анализе с hERG IC50 для соединения А составляла >30 мкМ. В анализе с волокнами Пуркинье кролика значимый эффект соединения А, тестируемого в диапазоне от 0,3 до 10 мкМ, отсутствовал, хотя сокращение потенциала действия наблюдали при 26 мкМ.
Эффект на частоту сердцебиения, или атриовентрикулярную блокаду, или любые другие параметры ECG отсутствовал в телеметрическом исследовании на собаках в количестве 30 или 100 мг/кг п.о. и 10 или 30 мг/кг в.в. (инфузия на протяжении 30 мин). Значимое изменение давления крови при обеих дозах отсутствовало.
2. Почечная фармакология in vivo.
Крысиную модель ишемически-реперфузионного (I/R) повреждения почек применяли для моделирования повреждения почек, возникающего после операции на сердце у пациентов. В этой модели соединение А значительно уменьшало (85-90%) тяжесть AKI, что видно из ограничения роста уровня креатинина в сыворотке (клинически подтвержденный биомаркер). На фиг. 1А представлены результаты 5
- 13 032012 независимых исследований). Эффект был дозозависимым и статистически значимым при 1 и 3 мг/кг п.о. (фиг. 1А). Гистологический анализ показывал, что соединение А оказывает непосредственные эффекты на сосудистую систему посредством предупреждения экстравазации альбумина (фиг. 1С) и сохранения капилляров. Соединение А также защищало проксимальные канальцы почек от некроза, уменьшало инфильтрацию макрофагов и повышало уровень почечного белка HSP70 (маркер, ассоциированный с заживлением после ишемического повреждения почек). Соединение А не демонстрировало никаких признаков тахифилаксии, поскольку сходная активность сохранялась после 5 дней повторяемого введения BID по сравнению с однократным введением (фиг. 1D).
Рабдомиолиз является другой значительной причиной AKI у пациентов, и его воспроизводили у мышей посредством внутримышечной инъекции глицерина. Глицерин индуцировал прогрессивное мышечное повреждение с высвобождением миоглобина и последующей дисфункцией почек. Как видно на модели I/R, соединение А в значительной степени (~85% при 10 мг/кг п.о.) и дозозависимым образом предупреждало ухудшение функции почек в этой модели (n=3 независимых исследования, фиг. 2).
Эффекты соединения А сравнивали в модели ишемии-реперфузии почек с S1P1-селективным функциональным антагонистом, BAF-312. BAF-312 по меньшей мере в 10-раз более эффективный в большинстве in vitro анализов с S1P1 (в том числе анализах с эндотелиальными клетками - см. табл. 1) и оказывал схожее с соединением А воздействие на плазму/почку у крыс. Тем не менее, несмотря на улучшенные свойства эффективности/воздействия у BAF-312, он не мог демонстрировать более 40% уменьшения уровня креатинина в сыворотке в модели ишемия-реперфузия, даже при дозах до 30 мг/кг п.о. (фиг. 1В).
3. Выявление отличий в отношении лимфопенической активности.
S1P ответственен за выход лимфоцитов из лимфоузла в кровь посредством активации S1P1. Эта активация S1P1 вызывает интернализацию рецепторов с последующей рециркуляцией рецептора обратно на поверхность клетки, обеспечивая реактивацию. Однако функциональные антагонисты S1P1 (финголимод, BAF-312) вызывают разложение интернализированного S1P1 и, таким образом, вызывают значительные и долговременные уменьшения количеств S1P1 на поверхности клеток. Вследствие этого функциональные антагонисты S1P1 демонстрируют большое и длительное снижение уровней лимфоцитов в крови, наблюдаемое в доклинических и клинических испытаниях (Mandala et al., 2002, Science 296: 346349; Gergely et al., 2012, BJP 167: 1035-1047).
Как и предполагалось, BAF-312 индуцировал сильную (-80%) и длительную лимфопению у крыс (фиг. 3A, 3B). Это было очевидно даже при дозах до 1 мг/кг п.о. (наиболее низкая тестируемая доза). 2 дозы, которые были частично эффективными в крысиной модели AKI, были более высокими дозами (10 и 30 мг/кг п.о., фиг. 1В) и представляли собой дозы, вызывающие развитие лимфопении в значительной степени. В отличие от этого, соединение А в количестве 1 и 3 мг/кг п.о. не демонстрировало снижение уровня лимфоцитов даже после 5 дней повторяемого введения BID крысе (3 мг/кг перорально), фиг. 3C. Для более высоких доз соединения А выявляли дозозависимую лимфопению, но они были выше, чем необходимые дозы для полной защиты от AKI.
Аналогичным образом не наблюдали никакой лимфопенической активности для соединения А у мышей в количестве 3 и 10 мг/кг (фиг. 4), доз, которые были активными в модели индуцированного глицерином рабдомиолиза (фиг. 2).
Соединение А не вызывало развитие лимфопении у собак в количестве 3 мг/кг п.о. (фиг. 5А). Эта не вызывающая развитие лифопении доза у собак уже обеспечивала воздействие (Смакс и AUC), которое превышало воздействие, необходимое для полной защиты от AKI, у крыс (3 мг/кг), табл. 4. При более высоких дозах 10 и 30 мг/кг п.о. у собак соединение А индуцировало лишь временную лимфопению (фиг. 5А). В отличие от этого, BAF-312 индуцировал сильное (Гма^ ~80%) снижение уровня лимфоцитов в количестве 3 мг/кг п.о., которое длилось по меньшей мере 60 дней до восстановления (фиг. 5В).
Соединение А является уникальным агонистом S1P1, так как оно впервые демонстрирует сильную защиту от AKI в дозах, не вызывающих развитие лимфопении (фиг. 3D). Несмотря на то, что другие соединения для S1P1, такие как финголимод и SEW2871, также являются активными в моделях AKI, их эффекты проявляются при лимфопенических дозах (Awad et al., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524; Sanna et al., 2004, JBC 279: 13839-13848; Lai et al., 2007, Kidney Int 71: 1223-1231).
Такие данные in vivo подтверждают, что соединение А действует как агонист S1P1, индуцируя защиту от AKI в дозах, не вызывающих развитие лимфопении. Соединение А значительно отличается от BAF-312, который описан в настоящем документе, а также других функциональных антагонистов S1P1, которые специально разработаны в качестве способствующих развитию лимфопении средств, например, при аутоиммунных заболеваниях.
4. Выявление отличий в отношении целостности эндотелиального барьера.
Функциональный антагонизм S1P1 ассоциирован с эффектами, повреждающими эндотелиальный барьер. Отечность мышц и легких является выраженным побочным эффектом у пациентов с рассеянным склерозом, которые проходят лечение при помощи финголимода (Jain and Bhatti, 2012, 28.: 672-680).
Авторы настоящего изобретния обнаружили, что длительное пероральное введение здоровым мышам финголимода было способно проводить к значительному пропотеванию жидкости из сосудов (фиг. 6А, 6В) у линии с клиническими данными. Селективный агонист S1P1 BAF-312, в количестве 1 и 3 мг/кг дважды
- 14 032012 в день индуцировал даже большее пропотевание жидкости из сосудов в легком (фиг. 6А, 6В). Такие данные согласовываются с ранними сообщениями, демонстрирующими, что функциональные антагонисты S1P1 изменяли целостность эндотелиального барьера и стимулировали экстравазацию белков из сосудов в легком (Shea et al., 2010, Am J Respir Cell Mol Biol 43: 662-673). В отличие от этого, соединение А не демонстрировало повышение пропотевания жидкости из сосудов (в количестве 3 и 10 мг/кг (репрезентативные дозы, обеспечивающие почти полный защитный от AKI эффект у мышей), фиг. 6А, 6В. Аналогичным образом у крыс линии Fischer соединение А не индуцировало пропотевание жидкости из сосудов легкого в количестве 1 и 3 мг/кг (репрезентативные эффективные от AKI дозы) или даже в еще более высокой дозе (10 мг/кг). В отличие от этого, BAF-312 индуцировал пропотевание жидкости из сосудов у крыс как в количестве 3 мг/кг (неэффективная от AKI доза), а также в количестве 30 мг/кг (частично эффективная от AKI доза).
С учетом наблюдаемых повреждающих эндотелиальный барьер свойств у BAF-312 (фиг. 6) защитные свойства BAF-312 могут нейтрализоваться его отрицательными для эндотелиального барьера эффектами, что приводит в результате лишь к частичному наблюдаемому защитному эффекту (фиг. 1В). Повреждение эндотелиального барьера является отличительной особенностью множества функциональных антагонистов S1P1 (фиг. 6 и опубликованные данные). Таким образом, новый профиль соединения А обеспечивает возможность защиты от острого повреждения почек в дозах, которые являются скорее защитными для эндотелиального барьера, а не повреждающими.
5. Фармакология in vitro.
Было показано, что соединение А является эффективным агонистом S1P1. В клетках СНО, сверхэкспрессирующих S1P1 (гибрид с G-белком) человека ЕС50 составляла 31 нМ в анализе кальциевой мобилизации, 656 нМ в анализе с β-аррестином, 206 нМ в анализе с GTPyS и 213 нМ в анализе интернализации (табл. 1).
- 15 032012
Таблица 1.
Значения EC50 для соединения A, BAF-312 и финголимода, полученные при помощи различных анализов in vitro.
| АналиЭ | Тип клеток | Белки в аналити ческой среде | ЕСе0 в нМ | ||||
| Соединени е А | BAF- 312 | Фииголимо да фосфат | S1P | SEW287 1 | |||
| FLIPR | Chemlf | 0¾ | 86 | 29 | 26 | 9, 6 | - |
| СНО | 0¾ | 31 | 2,8 | 0, 14 | 7, 5 | 24 | |
| GTPyS | СНО | 0¾ | 206 | 6, 7 | 5 | 120 | 795 |
| β-аррестин | СНО | 0,5% FBS | 656* | 5,4* | 7 | 30, 9* | - |
| ИнтерналиЭац ИЯ | СНО | 0, 5% FBS | 213* | 0, 59* | 2, 72* | 48,1* | - |
| сАМР | СНО | 0, 5% FBS | 22,6 | 0,47 | - | 78 | - |
| сАМР | HUVEC | 0,1¾ BSA | 15,600 | 74 | 132 | - | - |
| pERKl/2 | HUVEC | 0, 1% FBS | 190 | 4,9 | 9, 4 | - | - |
| pAkt | HUVEC | 0, 1% FBS | 101 | 4,3 | 14,5 | - | - |
| С Фпрстивлени е | СНО | 10¾ FBS + 0,1¾ BSA | 65 | 0, 4 | - | 1, 5 | - |
| С опротивлени | HUVEC | 2¾ FBS | 172 | 0,21 | 0, 12 | - | 54 |
| е |
Были разработаны клетки Chem* и СНО для сверхэкспрессии S1P1 человека. HUVEC эндогенно экспрессируют S1P1. # - анализ ChemiScreen. - означает не определено.
* значения являются средними 2 отдельных экспериментов. Анализ с β-аррестином соед. А - 800 и 511, BAF-312 - 7,9 и 2,83, S1P - 41 и 20,8; анализ интернализации: соед. А - 160 и 266, BAF-312 - <0,5 и 0,67, финголимод-Р - 0,7 и 4,74, S1P -56 и 40,2.
Соединение А не отображало свойств функционального антагонизма и не индуцировало десенсибилизацию рецептора (фиг. 7-10). Это отличие было продемонстрировано в четырех независимых системах in vitro, в двух системах при помощи измерения сопротивления в эндотелиальных клетках HDMEC (клетках микрососудистого эндотелия кожи человека) и HUVEC (эндотелиальных клетках пупочной вены человека) и в двух системах при помощи анализа с FlipR в клетках СНО и клетках HSC (звездчатых клетках печени). Предварительная инкубация с соединением А (с последующим этапом промывания) обеспечивала почти полное 2-е стимулирование при помощи S1P (фиг. 7-9) или соединения А (фиг. 10). Тем не менее, предварительное инкубирование с функциональными антагонистами предупреждало полное 2-е стимулирование при помощи S1P (фиг. 7-9) или BAF-312 (фиг. 10). В анализе сопротивления HUVEC концентрация каждого такого соединения, которая начинала десенсибилизацию индуцированной S1P1 реакции по значению сопротивления, была сравнима с ее абсолютной ЕС50 в данном анализе. BAF-312 начинал десенсибилизацию при 5х ЕС50, SEW2871 при 20х ЕС50, в то время как не наблюдали десенсибилизацию для соединения А до 60х ЕС50.
Данные в фиг. 7-10 указывают на то, что функциональные антагонисты (финголимод, BAF-312, SEW2871 и понесимод) индуцировали длительную десенсибилизацию рецептора.
Соединение А демонстрировало различные относительные эффективности в отношении сигнально
- 16 032012 го пути S1P1 (табл. 1) по сравнению с BAF-312 или финголимодом. Так как условия анализа в отношении белка отличались в различных тестах, авторы настоящего изобретения исключали возможное влияние связывания белка на относительные эффективности при сравнении показателей эффективности в анализах на СНО в отношении сАМР, бета-аррестина и интернализации с применением одинаковых условий среды. Как показано в табл. 2, соединение А (относительно BAF-312 и S1P) является более специфическим по его активирующей способности в отношении сАМР по сравнению с интернализацией или βаррестином.
Таблица 2. Относительные значения ЕС50 соединения A, BAF-312 и S1P (нормализованные к анализу с сАМР). Среда содержала идентичные концентрации белка (0,5% FBS) в 3 тестах.
| αΑΜΡ | Интернализация | β- аррестин | |
| СНО | СНО | СНО | |
| Соединение А | 1 | 9, 4 | 29 |
| BAF-312 | 1 | 1,3 | 11, 5 |
| SIP | 1 | 0, 62 | 0, 40 |
Соединение А индуцировало маркеры выживаемости pERK и pAKt в эпителиальных клетках почечных канальцев человека (RPTEC) с ЕС50 около 3 мкМ в основных условиях или после повреждения туникамицином (ЕС50~10 мкМ) зависимым от концентрации образом. Такие эффекты выживаемости были более выраженными в эндотелиальных клетках человека после выращивания клеток в условиях сывороточного голодания с ЕС50, равной 101 нМ в отношении P-Akt и 190 нМ в отношении P-ERK1/2. Более того, соединение А ингибировало индуцированный туникамицином апоптоз в RPTEC, оцененный по активности каспазы 3/7 с ЕС50 около 3-10 мкМ.
Соединение А, в отличие от BAF-312, уменьшало TNFa-индуцированную сверхэкспрессию молекул адгезии, включая ICAM-I, VCAM-I и Р/Е селектины, на трех типах эндотелиальных клеток человека (НРАЕС, HUVEC и HRGEC). Известно, что такие маркеры эндотелиальной дисфункции повышены в образцах плазмы от пациентов с AKI (Sadik et al., 2012, Mol Cell Biochem 359:73-81) и вовлечены в процесс инфильтрации воспалительных клеток в тубуло-интерстициальное пространство.
Соединение А имело приемлемый профиль селективности в отношении других рецепторов в семействе S1PR (табл. 3), в отношении более 110 целей, в панели CEREP, в отношении более 216 киназ и в отношении более 5 целей в панели ионного канала. Как показано в табл. 3, соединение А является более селективным агонистом S1P1 по сравнению с финголимодом. Недостаток активности в отношении S1P2 и S1P3 является особенно важным, поскольку эти рецепторы, согласно сообщениям, препятствуют функции S1P1 на эндотелиальных клетках.
Таблица 3. Селективность соединения A, BAF-312 и финголимода относительно членов семейства сфингозиновых рецепторов
| ЕСво в мкМ | ||||||||
| S1P2 | S1P3 | S1P4 | S1P5 | |||||
| FlipR (Chem ) | βappec тин | FlipR (Chem ) | β- appec тин | FlipR (Chem ) | β- appec тин | FlipR (Chem ) | β- appec тин | |
| Соединение А | > 30 | > 10 | > 30 | > 10 | > 30 | 2,5 | 1,0 | 1, 3 |
| BAF-312 | > 30 | > 10 | > 30 | > 10 | > 30 | 2, 1 | 0, 30 | 0,035 |
| Финголимод | > 30 | - | 0, 82 | - | 0, 12 | - | 0, 12 | - |
означает не определено.
Избирательная активация некоторых сигнальных путей посредством соединения А (например, сАМР), несмотря на свойственную более слабую эффективность в отношении других (например, интернализации, β-аррестина), обеспечивает необходимый профиль для AKI (т.е. минимальную десенсибилизацию рецептора без длительной лимфопении, с эндотелиальной защитой). Это резко отличается от того, что необходимо для функциональных антагонистов S1P1 BAF-312 и финголимода при рассеянном склерозе (высокая десенсибилизация рецепторов, сильная лимфопения, при этом нежелательным побочным эффектом является повреждение эндотелиального барьера). Этот профиль определяет соединение А как новый класс специфического агониста S1P1.
Таблица 4. Фармакокинетические свойства соединения А в количестве 3 мг/кг п.о. у самца крысы линии
- 17 032012
Fisher и собаки породы бигль
Собака
Крыса
Смаке (мкг/мл)
2,56
AUC (мкг.ч/мл)
Вывод.
Эти данные доклинических исследований указывают на сильное влияние соединения А на многие ожидаемые результаты механизма AKI, в том числе значительное поддержание эндотелиальной барьерной функции, а также уменьшение канальцевого некроза и воспаления с участием макрофагов. Все защитные от AKI дозы соединения А (как у мышей, так и у крыс) не вызывали развития лимфопении, и при соответствующих воздействиях их достигали у собак, при этом соединение А все еще не вызывало развития лимфопении. Поскольку соединение А не вызывало развития лимфопении во всех защитных от AKI дозах, его механизм защиты от AKI не зависит от лимфопении. Соединение А демонстрировало непосредственные защитные эффекты на эндотелиальные и эпителиальные клетки, которые, вероятно, лежат в основе механизма действия при AKI.
Это резко отличается от существующих соединений для S1P1, которые имеют отличный сигнальный профиль и являются i) функциональными антагонистами S1P1, ii) повреждающими эндотелий и iii) проявляют лишь ограниченную активность в I/R-индуцированном AKI при дозах, которые являются лимфопеническими.
Соединение А обеспечивает новую возможность лечения пациентов от AKI без индукции развития лимфопении и, следовательно, с избеганием соответствующих побочных эффектов (в том числе инфекций). Следовательно, данное соединение может стать преобразующей терапией в области, где в настоя щее время не существует доступных пациентам лекарственных средств.
Claims (10)
1. Применение {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенок- си}уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения AKI (острого повреждения почек).
2. Применение по п.1, где {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси}уксусная кислота не индуцирует развитие лимфопении при введении защитной от AKI дозы и индуцирует развитие ограниченной лимфопении при введении более высокой дозы.
3. Применение по п.1 или 2 в качестве не вызывающего развитие лимфопении средства.
4. Применение по п.1 или 2, где она не оказывает лимфопенический эффект при введении защитной от AKI дозы.
5. Применение по п.1, где {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси (уксусная кислота оказывает защитный эффект от AKI при введении не вызывающей развитие лимфопении дозы.
6. Применение {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси(уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения AKI (острого повреждения почек), где {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси( уксусная кислота является селективным агонистом S1P1, который не индуцирует десенсибилизацию рецепторов.
7. Применение {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси(уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли без лимфопенического эффекта при предупреждении или лечении AKI.
8. Применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента {4[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин-2-ил]-2,6-диметилфенокси(уксусную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемые наполнители для предупреждения или лечения AKI (острого повреждения почек).
9. Способ лечения AKI у нуждающегося в этом пациента, предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества {4-[5-(3-хлорфенокси)оксазоло[5,4-б]пиримидин2-ил]-2,6-диметилфенокси (уксусной кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли.
10. Способ по п.9, где лечение является профилактическим.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20130306417 EP2862574A1 (en) | 2013-10-15 | 2013-10-15 | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4 d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury |
| PCT/EP2014/072078 WO2015055694A1 (en) | 2013-10-15 | 2014-10-15 | 4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201690762A1 EA201690762A1 (ru) | 2016-07-29 |
| EA032012B1 true EA032012B1 (ru) | 2019-03-29 |
Family
ID=49488539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201690762A EA032012B1 (ru) | 2013-10-15 | 2014-10-15 | {4-[5-(3-ХЛОРФЕНОКСИ)ОКСАЗОЛО[5,4-d]ПИРИМИДИН-2-ИЛ]-2,6-ДИМЕТИЛФЕНОКСИ}УКСУСНАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИИ ИЛИ ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9782411B2 (ru) |
| EP (2) | EP2862574A1 (ru) |
| JP (1) | JP6458016B2 (ru) |
| KR (1) | KR102348608B1 (ru) |
| CN (1) | CN105658220B (ru) |
| AR (1) | AR098028A1 (ru) |
| AU (1) | AU2014336254B9 (ru) |
| BR (1) | BR112016007669B1 (ru) |
| CA (1) | CA2926211C (ru) |
| CL (1) | CL2016000724A1 (ru) |
| CR (1) | CR20160172A (ru) |
| DK (1) | DK3057591T3 (ru) |
| EA (1) | EA032012B1 (ru) |
| ES (1) | ES2898403T3 (ru) |
| FI (1) | FI3057591T3 (ru) |
| IL (2) | IL244686B (ru) |
| MA (1) | MA39032B2 (ru) |
| MX (1) | MX383252B (ru) |
| PH (1) | PH12016500563A1 (ru) |
| PT (1) | PT3057591T (ru) |
| SG (1) | SG11201602263TA (ru) |
| TN (1) | TN2016000110A1 (ru) |
| TW (1) | TWI685340B (ru) |
| WO (1) | WO2015055694A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2859487T3 (es) * | 2016-10-05 | 2021-10-04 | Mitobridge Inc | Métodos para tratar las lesiones renales agudas |
| CN106905348B (zh) * | 2017-02-13 | 2018-12-04 | 牡丹江医学院 | 一种预防和治疗急性肾损伤的药物及其制备方法和用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130079358A1 (en) * | 2010-01-14 | 2013-03-28 | Sanofi | Carboxylic acid derivatives having a 2,5-substituted oxazolopyrimidine ring |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10033353A1 (de) | 2000-07-08 | 2002-01-24 | Aventis Pharma Gmbh | Breit einsetzbares Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von G-Protein gekoppelten Rezeptoren |
| MY150088A (en) | 2003-05-19 | 2013-11-29 | Irm Llc | Immunosuppressant compounds and compositions |
| USRE43728E1 (en) | 2003-11-21 | 2012-10-09 | Actelion Pharmaceuticals Ltd. | Thiazolidin-4-one derivatives |
-
2013
- 2013-10-15 EP EP20130306417 patent/EP2862574A1/en not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-10-15 TW TW103135715A patent/TWI685340B/zh active
- 2014-10-15 EA EA201690762A patent/EA032012B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-10-15 SG SG11201602263TA patent/SG11201602263TA/en unknown
- 2014-10-15 FI FIEP14784452.6T patent/FI3057591T3/fi active
- 2014-10-15 MA MA39032A patent/MA39032B2/fr unknown
- 2014-10-15 DK DK14784452.6T patent/DK3057591T3/da active
- 2014-10-15 EP EP14784452.6A patent/EP3057591B1/en active Active
- 2014-10-15 MX MX2016004778A patent/MX383252B/es unknown
- 2014-10-15 AU AU2014336254A patent/AU2014336254B9/en active Active
- 2014-10-15 US US15/027,964 patent/US9782411B2/en active Active
- 2014-10-15 WO PCT/EP2014/072078 patent/WO2015055694A1/en not_active Ceased
- 2014-10-15 PT PT147844526T patent/PT3057591T/pt unknown
- 2014-10-15 BR BR112016007669-9A patent/BR112016007669B1/pt active IP Right Grant
- 2014-10-15 CA CA2926211A patent/CA2926211C/en active Active
- 2014-10-15 TN TN2016000110A patent/TN2016000110A1/en unknown
- 2014-10-15 KR KR1020167011272A patent/KR102348608B1/ko active Active
- 2014-10-15 CN CN201480056551.8A patent/CN105658220B/zh active Active
- 2014-10-15 ES ES14784452T patent/ES2898403T3/es active Active
- 2014-10-15 AR ARP140103825A patent/AR098028A1/es unknown
- 2014-10-15 JP JP2016521603A patent/JP6458016B2/ja active Active
-
2016
- 2016-03-21 IL IL244686A patent/IL244686B/en active IP Right Grant
- 2016-03-28 PH PH12016500563A patent/PH12016500563A1/en unknown
- 2016-03-29 CL CL2016000724A patent/CL2016000724A1/es unknown
- 2016-04-14 CR CR20160172A patent/CR20160172A/es unknown
-
2021
- 2021-04-06 IL IL282097A patent/IL282097A/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130079358A1 (en) * | 2010-01-14 | 2013-03-28 | Sanofi | Carboxylic acid derivatives having a 2,5-substituted oxazolopyrimidine ring |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| GERGELY P, NUESSLEIN-HILDESHEIM B, GUERINI D, BRINKMANN V, TRAEBERT M, BRUNS C, PAN S, GRAY N S, HINTERDING K, COOKE N G, GROENEWE: "The selective sphingosine 1-phosphate receptor modulator BAF312 redirects lymphocyte distribution and has species-specific effects on heart rate.", BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY, JOHN WILEY & SONS LTD., GB, vol. 167, no. 5, 1 November 2012 (2012-11-01), GB, pages 1035 - 1047, XP002718009, ISSN: 1476-5381, DOI: 10.1111/j.1476-5381.2012.02061.x * |
| OKUSA, M.D. LYNCH, K.R.: "Targeting sphingosine 1 phosphate receptor type 1 receptors in acute kidney injury", DRUG DISCOVERY TODAY: DISEASE MECHANISMS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 4, no. 1, 1 March 2007 (2007-03-01), AMSTERDAM, NL, pages 55 - 59, XP022391045, ISSN: 1740-6765, DOI: 10.1016/j.ddmec.2007.07.001 * |
| P. J. GONZALEZ-CABRERA, S. M. CAHALAN, N. NGUYEN, G. SARKISYAN, N. B. LEAF, M. D. CAMERON, T. KAGO, H. ROSEN: "S1P1 Receptor Modulation with Cyclical Recovery from Lymphopenia Ameliorates Mouse Model of Multiple Sclerosis", MOLECULAR PHARMACOLOGY, vol. 81, no. 2, 1 February 2012 (2012-02-01), pages 166 - 174, XP055093574, DOI: 10.1124/mol.111.076109 * |
| Sanna G. et al: "Distinct S1P receptor subtypes S1P1 and S1P3 respectively regulate lymphocyte recirculation and heart rate", The Journal of Biological Chemistry 19 January 2004 (2004-01-19), XP002718008, Retrieved from the Internet: URL:http://www.jbc.org/content/early/2004/01/19/jbc.M311743200.full.pdf [retrieved on 2013-12-16] page 2, page 12, paragraph 2 - page 13, paragraph 2, page 15 - page 16, paragraph 1, page 17, paragraph 2 - page 18, paragraph 1, page 19, paragraph 1-2 * |
| Y-HH LIEN, K-C YONG, C CHO, S IGARASHI, L-W LAI: "S1P1-selective agonist, SEW2871, ameliorates ischemic acute renal failure", KIDNEY INTERNATIONAL, vol. 69, no. 9, 1 May 2006 (2006-05-01), pages 1601 - 1608, XP055092368, ISSN: 00852538, DOI: 10.1038/sj.ki.5000360 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Acin‐Perez et al. | Inhibition of ATP synthase reverse activity restores energy homeostasis in mitochondrial pathologies | |
| Barragan-Iglesias et al. | Activation of the integrated stress response in nociceptors drives methylglyoxal-induced pain | |
| US20230404949A1 (en) | Method of treating or preventing neurodegeneration | |
| CA2881990C (en) | Use of probenecid to treat acute decompensated heart failure | |
| KR101915016B1 (ko) | 자가포식 향상물질 및 그 용도 | |
| Moheimani et al. | P2Y12 receptor: platelet thrombus formation and medical interventions | |
| EA032012B1 (ru) | {4-[5-(3-ХЛОРФЕНОКСИ)ОКСАЗОЛО[5,4-d]ПИРИМИДИН-2-ИЛ]-2,6-ДИМЕТИЛФЕНОКСИ}УКСУСНАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИИ ИЛИ ЛЕЧЕНИИ ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК | |
| Itagaki et al. | Sphingosine 1-phosphate has dual functions in the regulation of endothelial cell permeability and Ca2+ metabolism | |
| AU2014336254A1 (en) | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury | |
| Kashihara et al. | β2-Adrenergic and M2-muscarinic receptors decrease basal t-tubular L-type Ca2+ channel activity and suppress ventricular contractility in heart failure | |
| NZ719089B2 (en) | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury | |
| HK1225611B (en) | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury | |
| Beltowski | Leptin Signaling in Blood Platelets as a Target for Therapeutic Intervention | |
| George et al. | The Na+/Ca2+ Exchanger Mediates the Effects of Oxidative Stress in Hypertension | |
| Marques | To beat or not to beat: detrimental autophagy contributes to gap junctions degradation in ischemic heart | |
| Chen | The Role of A-type Lamins in Normal Cardiac Function | |
| Cayzac | Role of polyamines in the carotid body | |
| Lee et al. | Differential Mechanisms of Hepatic Vascular Dysregulation with Mild vs Moderate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KZ |