ES2898403T3 - Acido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético para su uso en la prevención o tratamiento de la lesión renal aguda - Google Patents
Acido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético para su uso en la prevención o tratamiento de la lesión renal aguda Download PDFInfo
- Publication number
- ES2898403T3 ES2898403T3 ES14784452T ES14784452T ES2898403T3 ES 2898403 T3 ES2898403 T3 ES 2898403T3 ES 14784452 T ES14784452 T ES 14784452T ES 14784452 T ES14784452 T ES 14784452T ES 2898403 T3 ES2898403 T3 ES 2898403T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- compound
- phenoxy
- cells
- aki
- baf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 19
- WRBZNIUFAKIIQG-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[5-(3-chlorophenoxy)-[1,3]oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethylphenoxy]acetic acid Chemical compound CC1=C(OCC(O)=O)C(C)=CC(C=2OC3=NC(OC=4C=C(Cl)C=CC=4)=NC=C3N=2)=C1 WRBZNIUFAKIIQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 13
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 title description 17
- 230000006378 damage Effects 0.000 title description 12
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 title description 7
- 208000014674 injury Diseases 0.000 title description 7
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 title description 3
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 claims abstract description 73
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 claims abstract description 72
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 claims abstract description 72
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N sphingosine 1-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O DUYSYHSSBDVJSM-KRWOKUGFSA-N 0.000 claims description 122
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims description 108
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 108
- JNLIKIBISICTMS-PEJBKAKVSA-N (e)-but-2-enedioic acid;1-[[4-[(e)-n-[[4-cyclohexyl-3-(trifluoromethyl)phenyl]methoxy]-c-methylcarbonimidoyl]-2-ethylphenyl]methyl]azetidine-3-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.CCC1=CC(C(\C)=N\OCC=2C=C(C(C3CCCCC3)=CC=2)C(F)(F)F)=CC=C1CN1CC(C(O)=O)C1.CCC1=CC(C(\C)=N\OCC=2C=C(C(C3CCCCC3)=CC=2)C(F)(F)F)=CC=C1CN1CC(C(O)=O)C1 JNLIKIBISICTMS-PEJBKAKVSA-N 0.000 claims description 60
- 230000000329 lymphopenic effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 21
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 125000000246 pyrimidin-2-yl group Chemical group [H]C1=NC(*)=NC([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 claims description 2
- 101100012902 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FIG2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 34
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 33
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 33
- KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N fingolimod Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CCC(N)(CO)CO)C=C1 KKGQTZUTZRNORY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 229960000556 fingolimod Drugs 0.000 description 30
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 27
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 24
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 24
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 19
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 18
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 14
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 13
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 11
- 230000008497 endothelial barrier function Effects 0.000 description 11
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 11
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 10
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 10
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OYMNPJXKQVTQTR-UHFFFAOYSA-N 5-[4-phenyl-5-(trifluoromethyl)-2-thiophenyl]-3-[3-(trifluoromethyl)phenyl]-1,2,4-oxadiazole Chemical compound FC(F)(F)C=1SC(C=2ON=C(N=2)C=2C=C(C=CC=2)C(F)(F)F)=CC=1C1=CC=CC=C1 OYMNPJXKQVTQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 8
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 7
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 7
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 6
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 6
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000008052 Nitric Oxide Synthase Type III Human genes 0.000 description 5
- 108010075520 Nitric Oxide Synthase Type III Proteins 0.000 description 5
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 5
- QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[2-[2-[5-[3-(acetyloxymethoxy)-2,7-difluoro-6-oxoxanthen-9-yl]-2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]-n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(OCOC(C)=O)=C(F)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000012959 renal replacement therapy Methods 0.000 description 5
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 4
- 206010038540 Renal tubular necrosis Diseases 0.000 description 4
- 206010039020 Rhabdomyolysis Diseases 0.000 description 4
- 102000011011 Sphingosine 1-phosphate receptors Human genes 0.000 description 4
- 108050001083 Sphingosine 1-phosphate receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 4
- 210000003742 purkinje fiber Anatomy 0.000 description 4
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 4
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 4
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 206010003671 Atrioventricular Block Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N Fluo-4 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 206010048988 Renal artery occlusion Diseases 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 3
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 3
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 3
- 230000009084 cardiovascular function Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 3
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 3
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 3
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 3
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 3
- 230000002336 repolarization Effects 0.000 description 3
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- -1 {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-D]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}acetic acid compound Chemical class 0.000 description 3
- 208000003918 Acute Kidney Tubular Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 102100037324 Apolipoprotein M Human genes 0.000 description 2
- 101710095646 Apolipoprotein M Proteins 0.000 description 2
- 102000018623 Apolipoproteins M Human genes 0.000 description 2
- 108010027018 Apolipoproteins M Proteins 0.000 description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 2
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101100236683 Homo sapiens MBTPS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 102100025750 Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 2
- 206010043087 Tachyphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000036471 bradycardia Effects 0.000 description 2
- 208000006218 bradycardia Diseases 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 2
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000002847 impedance measurement Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 208000037806 kidney injury Diseases 0.000 description 2
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 230000001196 vasorelaxation Effects 0.000 description 2
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055510 ATP Binding Cassette Transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700005241 ATP Binding Cassette Transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 238000003731 Caspase Glo 3/7 Assay Methods 0.000 description 1
- 102000047934 Caspase-3/7 Human genes 0.000 description 1
- 108700037887 Caspase-3/7 Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241001069765 Fridericia <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 239000012571 GlutaMAX medium Substances 0.000 description 1
- 241000708754 Hauffenia media Species 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101100161481 Homo sapiens ABCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 1
- 101001124309 Homo sapiens Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- 101000693265 Homo sapiens Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001010792 Homo sapiens Transcriptional regulator ERG Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 238000001295 Levene's test Methods 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 1
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 description 1
- 206010025415 Macular oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 101150044441 PECAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 101710155454 Sphingosine 1-phosphate receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFKWQGGENFBFO-IBGZPJMESA-N [(2s)-2-amino-2-(hydroxymethyl)-4-(4-octylphenyl)butyl] dihydrogen phosphate Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(CC[C@](N)(CO)COP(O)(O)=O)C=C1 LRFKWQGGENFBFO-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000003339 best practice Methods 0.000 description 1
- 102000000072 beta-Arrestins Human genes 0.000 description 1
- 108010080367 beta-Arrestins Proteins 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000009992 cAMP activation Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 231100000457 cardiotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001451 cardiotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008753 endothelial function Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000055702 human NOS3 Human genes 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002780 ion channel assay Methods 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008338 local blood flow Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 201000010230 macular retinal edema Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001686 pro-survival effect Effects 0.000 description 1
- DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N probenecid Chemical compound CCCN(CCC)S(=O)(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003081 probenecid Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 238000000718 qrs complex Methods 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002254 renal artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008327 renal blood flow Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000036390 resting membrane potential Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N risperidone Chemical compound FC1=CC=C2C(C3CCN(CC3)CCC=3C(=O)N4CCCCC4=NC=3C)=NOC2=C1 RAPZEAPATHNIPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001534 risperidone Drugs 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 108010035597 sphingosine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004654 survival pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009723 vascular congestion Effects 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
- A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
Ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo [5,4-d]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en la prevención o el tratamiento de la AKI (lesión renal aguda).
Description
DESCRIPCIÓN
Ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético para su uso en la prevención o tratamiento de la lesión renal aguda
La presente invención se refiere al ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en la prevención o el tratamiento de la lesión renal aguda (AKI), y una composición farmacéutica de este. El compuesto del ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este y un método preparativo de este se describen en la solicitud de patente WO2011/086079. Este compuesto tiene afinidad por los receptores de S1P1/ EDG1.
La lesión renal aguda (AKI), anteriormente conocida como "insuficiencia renal aguda", es un trastorno frecuente y potencialmente grave que se presenta en una variedad de situaciones con manifestaciones clínicas que van desde la elevación transitoria de la creatinina sérica (SCr) hasta la insuficiencia renal anúrica definitiva. La AKI se ha descrito tradicionalmente como una disminución abrupta (dentro de las 48 horas) de la función renal medida por los aumentos de la creatinina sérica. Las guías recientes KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) establecieron un consenso en torno a los criterios de diagnóstico basados en los valores clínicos y de laboratorio que se enumeran a continuación (Grupo de trabajo de ERBP (European Renal Best Practice), 2012, NDT 27: 4263-4272). La AKI se define y organiza según cualquiera de los siguientes:
• Aumento de la SCr en >0,3 mg/dl (>26,5 pmol/l) dentro de 48 horas; o
• Aumento de la SCr a >1,5 veces el valor inicial, que se sabe o se presume que ha ocurrido dentro de los 7 días anteriores; o
• Volumen de orina <0,5 ml/kg/h durante 6 horas.
La AKI aparece en aproximadamente el 7% de todos los pacientes hospitalizados (Nash y cols., 2002, Am J Kidney Dis 39: 930-936) y hasta un 36-67% de los pacientes críticamente enfermos, dependiendo de la definición usada. La AKI grave ocurre en el 4 al 25% de todos los ingresos a la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) y aproximadamente en el 5% de los pacientes de la UCI con AKI requieren terapia de reemplazo renal (Hoste y cols. 2006, Crit Care 10: R73, Mehta y cols., 2004, Kidney Int 66: 1613-1621; Uchino y cols., 2005, Jama 294: 813-818; Uchino y cols., 2006, Crit Care Med 34: 1913-1917; Ostermann y cols., 2007, Crit Care Med 35: 1837-1843). Las causas más comunes de AKI son sepsis, cirugía mayor, hipovolemia y medicamentos. Los factores de riesgo para el desarrollo de AKI incluyen edad avanzada (> 75 años), enfermedad renal crónica (ERC, TFGe (Tasa de Filtración Glomerular estimada) <60 ml/min/1,73 m2), enfermedad vascular periférica aterosclerótica, insuficiencia cardíaca, enfermedad hepática, diabetes mellitus y medicamentos nefrotóxicos.
A pesar de los avances en las estrategias preventivas y las medidas de apoyo, la AKI sigue estando asociada con una alta morbilidad y mortalidad, especialmente en los ingresados en la UCI, donde las tasas de mortalidad intrahospitalaria pueden superar el 50%. Además de las tasas de mortalidad, existen consecuencias crónicas que incluyen un alto riesgo de desarrollar enfermedad renal crónica (ERC) y desarrollo acelerado de enfermedad renal en etapa terminal (ERT) (Hsu y cols., 2009, Clin J Am Soc Nephrol 4: 891-898; Ishani y cols., 2009, JASN 20: 223-228; Coca y cols., 2009, Am J Kidney Dis 53: 961-973). La morbilidad también se asocia con un aumento de los costos y una mayor duración de la estancia hospitalaria.
Existe una clara necesidad médica insatisfecha ya que no existe una terapia aprobada para la prevención o para el tratamiento de la AKI cualquiera que sea la etiología. El manejo de la afección es principalmente de apoyo, con la Terapia de Reemplazo Renal (TRR) como el componente central de la atención para los pacientes con AKI grave. La hidratación sigue siendo la medida preventiva más apropiada para la nefropatía inducida por contraste (NIC).
La esfingosina-1 -fosfato (S1P) es un mediador lipídico que se une a cinco GPCRs (receptores acoplados a la proteína G) denominados S1 P1-5 (Brinkman y cols., 2007, Pharmacol Ther 115: 84-105.). La S1P circulante se origina principalmente a partir de células endoteliales, plaquetas y eritrocitos y se encuentra altamente unida a proteínas plasmáticas que incluyen ApoM (Apolipoproteína M) en HDL (lipoproteínas de alta densidad) (Hammad y cols., 2012, J Lipids; Karuna y cols., 2011, Atherosclerosis 219: 855-863) y albúmina. El S1P1 está ampliamente expresado, incluyendo células endoteliales, inmunes y epiteliales renales. El S1P1 regula muchas funciones fisiológicas, que incluyen el mantenimiento de la integridad de la barrera endotelial (reordenamientos del citoesqueleto), el crecimiento celular, la supervivencia, la diferenciación, la angiogénesis y el tráfico de células inmunes. El S1P1 se expresa en gran medida en la médula renal (Zhu y cols., 2011, Am J Physiol Renal Physiol 301: F35-F41), una región del riñón donde el flujo sanguíneo y el suministro de oxígeno están restringidos por la anatomía túbulo vascular diseñada específicamente para la concentración urinaria. Dado que las células de esta región tienen un alto consumo de oxígeno, la médula es particularmente vulnerable al daño hipóxico. El daño de los túbulos corticales es una consecuencia tanto de la lesión de la médula como de las agresiones directas sobre las células de los túbulos proximales. El S1P1 se regula positivamente después de una lesión por reperfusión por isquemia renal (Awad y cols., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524) y se espera que su activación preserve la función renal a través de mecanismos principales:
• Mantenimiento de la función de la barrera endotelial. Esta barrera está dañada en la AKI, lo que da lugar a alteraciones de la permeabilidad vascular y de las propiedades de adhesión.
• Limitación de la apoptosis de las células epiteliales tubulares proximales,
• Reducción de la infiltración de células inflamatorias. La inflamación en la AKI es a menudo una consecuencia de la lesión combinada de las células tubulares epiteliales y de la barrera endotelial.
El papel de la vía S1P-S1P1 en la regulación de la integridad de la barrera endotelial ha sido ampliamente documentada (Wang y Dudek, 2009, Microvasc Res 77: 39-45; Mc Verry y García, 2005, Cell signaling 17: 131-139; Lucke y Levkau, 2010, Cell Phys Biochem 26: 87-96). La activación de S1P1 mejora la función de la barrera endotelial a través de la activación de la vía PLC/Ca2+/FAK/pRac (Belvitch y Dudek, 2012, Microvasc Res 83: 22-30). Se demostró que la S1P asociada a HDL-ApoM prolonga la función de la barrera endotelial a través de la activación de eNOS (Wilkerson y cols., 2012, JBC 287: 44645-44653; Christoffersen y cols., 2011, PNAS 108: 9613-9618; Argraves y cols., 2008, JBC 283: 25074-25081). En este sentido, los niveles bajos de HDL en plasma se han asociado con un riesgo de desarrollar AKI en pacientes sometidos a cirugía vascular (Miller GJ y Miller NE., 1975, Lancet 1: 16-19; Castelli WP, Garrison RJ, Wilson PW y cols., 1986, JAMA; 256: 2835-2838)
La supresión global o específica de endotelio de S1P1 induce la letalidad del embrión debida a una hemorragia masiva que afecta a múltiples órganos (Kono y cols., 2004, JBC 279: 29367-29373). Se observan defectos idénticos en ratones knockout con supresión de las enzimas responsables de la biosíntesis de S1P (esfingosina quinasas 1 y 2) (Mizugishi y cols., 2005, Mol Cell Biol 25: 11113-11121.). Del mismo modo, los antagonistas de S1P1 también aumentan la permeabilidad vascular. A pesar de los efectos protectores agudos de los antagonistas funcionales de S1P1 en modelos de AKI (Bajwa y cols., 2010, JASN 21: 955-965; Awad y cols., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524), el tratamiento crónico con estos antagonistas funcionales de S1P1 empeora drásticamente la extravasación vascular en modelos de lesión pulmonar y altera la integridad de la barrera endotelial in vitro (Shea y cols., 2010, Am J Respir Cell Mol Biol 43: 662-673). También se imitan defectos endoteliales similares en ratones con menos S1P (Camerer y cols., 2009, JCI 119: 1871 -1879).
En pacientes y modelos de AKI, las citoquinas como TNF-a se liberan de las células endoteliales y regulan positivamente moléculas de adhesión como ICAM-1, VCAM-1 y selectinas P/E que contribuyen a la infiltración de células inflamatorias en el parénquima túbulo-intersticial (Bonventre y cols., 2003, JAsN 14: 2199-2210; Singbartl y cols., 2000, Crit Care Med 28: 2507-2514; Sadik y cols., 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81). Además, en células endoteliales humanas cultivadas, varias de estas moléculas de adhesión endotelial se regulan positivamente después de la hipoxia/re-oxigenación (Lutz y cols., 2008, J Mol Med 86: 1329-1339). La activación de S1P1 regula a la baja estas moléculas de adhesión y, por lo tanto, reduce la infiltración de células inflamatorias (Lien y cols., 2006, Kidney Int 69: 1601-1608). Se ha demostrado un papel esencial de la S1P en la conservación de la función endotelial en la lesión renal aguda que usa una supresión condicional del receptor endotelial S1P1 en ratones (Ham A., 2013, Kidney Int, Sept.).
La estimulación de S1P1 activa la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) a través de la fosforilación de Akt, que es una enzima clave que regula la vasorrelajación local a través de la producción de NO (Morales-Ruiz y cols., 2001, JBC 276: 19672-19677; Igarashi y cols., 2000, JBC 275: 32363-32370; Igarashi y cols., 2008, BBA 1781: 489-495). Por lo tanto, la S1P induce vaso-relajación de una manera dependiente del endotelio y del NO (Roviezzo y cols., 2006, FASEB J 20: 340). El NO tiene un efecto protector sobre la función renal en modelos animales de AKI inducida por I/R (García-Criado y cols, 1998, Transplantation 66: 982-990). En ratas, la inhibición de la eNOS reduce el flujo sanguíneo renal en un 35%, con disminuciones asociadas en la TFG y aumento de la resistencia vascular renal (Cao y cols, 2010, Am J Physiol Renal Physiol 299: F1056-F1064). La S1P se considera uno de los activadores más eficaces del óxido nítrico endotelial, que se sabe que mejora el flujo sanguíneo local, pero también limita la activación plaquetaria y la congestión vascular, particularmente en la vulnerable región cortico-medular. Este mecanismo podría ser importante para preservar la función renal durante la AKI. Es importante destacar que la reducción de la biodisponibilidad del óxido nítrico se asocia con la AKI en pacientes con bypass cardiopulmonar (BCP) y con sepsis (Lema y cols., 2009, J Cardio Thorac Vasc Anesth 23: 188-194; Sadik y cols., 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81). Curiosamente, un polimorfismo 786C en el promotor de eNOS humana exhibe una actividad transcripcional reducida y se asocia con disfunción renal en pacientes de cirugía cardíaca con bypass cardiopulmonar (Popov y cols., 2009, Eur J Cardio-Thorac Surgery 36: 651-656; Nakayama y cols., 1999, Circulation 99: 2864-2870). La frecuencia del polimorfismo es de aproximadamente el 50% y podría representar una subpoblación significativa que no solo tiene más riesgo de desarrollar AKI, sino que también responde mejor a un tratamiento que restaura los niveles locales de NO, como a través de la activación de S1P1.
Además, la activación de S1P1 limita directamente la apoptosis de las células epiteliales tubulares proximales activando las vías de supervivencia pERK y pAkt. La supresión específica de S1P1 en las células epiteliales tubulares proximales empeora la disfunción renal después de una lesión por isquemia-reperfusión (Bajwa y cols., 2010, JASN 21: 955-965), así como la necrosis tubular, lo que subraya un patrón de S1P endógeno que amortigua la gravedad de la lesión por reperfusión. Estos datos subrayan la importancia de un papel protector para el sistema S1P-S1P1 en la AKI, tanto en eje endotelial como epitelial.
La S1P es responsable de la salida de linfocitos del ganglio linfático a la sangre a través de la activación de S1P1. Esta
activación de S1 Pi provoca la internalización del receptor seguida del reciclaje del receptor de vuelta a la superficie celular, lo que permite la reactivación. Sin embargo, se cree que los antagonistas funcionales o antagonistas de S1P1 causan linfopenia ya sea al inhibir el reciclaje de los receptores S1P1 internalizados de vuelta a la superficie celular o bloqueando la activación de S1P1, y, por lo tanto, origina reducciones dramáticas y prolongadas en el S1P1 de superficie celular. En consecuencia, los últimos agentes muestran una caída grande y prolongada de linfocitos sanguíneos como se observa preclínica y clínicamente.
Varios informes muestran que los linfocitos T contribuyen a la lesión renal aguda. La observación de que la lesión mejora con la depleción de las células T y se reconstituye con la transferencia adoptiva de células T CD4 es una evidencia de que depende de las células T CD4 (Burne y cols., 2001, J. Clin Invest 108: 1283-1290.; Ysebaert y cols., 2004, Kidney Int 66: 491-496). Por tanto, no es de extrañar que los antagonistas funcionales de S1P1 que incluyen fingolimod y SEW2871, sean protectores en modelos de lesión renal aguda a dosis linfopénicas (Lien y cols., 2006, Kidney Int 69: 1601-1608).
Sin embargo, la linfopenia es un factor predisponente para las infecciones oportunistas, especialmente en pacientes muy sensibles y debilitados, como los pacientes con alto riesgo de AKI (edad avanzada, enfermedades cardíacas, diabetes y enfermedad renal crónica). En consecuencia, existe una necesidad de un agonista selectivo de S1P1 que induzca linfopenia limitada, o en el mejor de los casos, ninguna linfopenia, y tenga utilidad terapéutica en el tratamiento de la AKI. De manera sorprendente, el compuesto del ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético difiere de otros moduladores de S1P1, por el hecho de que causa protección frente a la AKI en mamíferos a dosis no linfopénicas. Se cree que esta propiedad del ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D] pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético podría estar relacionada con su agonismo sesgado en el receptor S1P1, con mínimos efectos de antagonismo funcional o de desensibilización. Esto representaría una ventaja de seguridad clínica significativa para el uso del ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético en el tratamiento de la AKI.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere al ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en la prevención o el tratamiento de la AKI (lesión renal aguda).
La presente invención también se refiere al ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso como agente no linfopénico en la prevención o el tratamiento de la AKI.
Definiciones
Por razones de conveniencia y para facilitar la lectura, el compuesto del ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético ha sido renombrado como "compuesto A" en los capítulos de la solicitud actual y en las figuras.
Para la presente invención, las siguientes palabras se deben entender como corresponde:
• El agonista selectivo de S1P1 es un compuesto que es más potente sobre S1P1 en comparación con los otros 4 receptores de S1P, S1P2-5. Además, el compuesto debe tener una actividad mínima o nula en una amplia gama de ensayos de receptores, enzimas y canales iónicos.
• La linfopenia es la afección de tener una descenso anormal de linfocitos en sangre, una célula blanca de la sangre con funciones importantes en el sistema inmunológico. En los adultos, es diagnóstico un nivel de linfocitos por debajo de 1.500 células/microlitro (prueba de la afección), y en los niños, es diagnóstico un nivel de linfocitos por debajo de 3.000 células/microlitro.
La linfopenia mediada por la activación de S1P1 se refiere a una afección linfopénica causada por el uso de un modulador de S1P1. Dado que S1P es responsable de la salida de linfocitos mediada por S1P1 desde el ganglio linfático a la sangre, se cree que estos últimos agentes causan linfopenia ya sea al inhibir el reciclaje de los receptores S1P1 internalizados de vuelta a la superficie celular o bloqueando la activación de S1P1.
• La linfopenia limitada es una reducción transitoria de los linfocitos sanguíneos (el recuento absoluto de linfocitos se sale del rango normal antes del tratamiento). Transitorio se refiere a un cambio temporal en los linfocitos que regresa al rango normal en 24 h o 48 h.
• No-linfopénico o sin linfopenia se refiere a la ausencia de reducción transitoria o prolongada de linfocitos en sangre (recuento absoluto de linfocitos que cae fuera del rango normal antes del tratamiento). Transitorio se refiere a un cambio temporal en los linfocitos que regresa al rango normal dentro de las 24 h, mientras que prolongado se refiere a una reducción que persiste más allá de las 24 h. •
• Dosis protectora de AKI: una dosis de ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetilfenoxi} acético que proporciona un reducción significativa de la creatinina plasmática de al menos un 30%.
• Cantidad terapéuticamente eficaz, como se usa en esta memoria, significa una cantidad de un compuesto farmacéutico, tal como ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético que produce un efecto sobre la AKI.
• Paciente significa un paciente humano.
• Profiláctico: que sirve para prevenir o proteger frente a un efecto no deseado y está destinado a prevenir que se produzca una afección médica, especialmente una enfermedad.
Una primera realización es el ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en la prevención o el tratamiento de la AKI, en donde el ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético no es linfopénico en dosis protectoras de AKI. Una segunda realización es el ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en la prevención o el tratamiento de la AKI, en donde los efectos protectores están mediados por la activación de S1P1 sin inducir linfopenia.
Abreviaturas
AKI Lesión renal aguda
ApoM Apolipoproteína M
NIC Nefropatía Inducida por Contraste
ERC Enfermedad Renal Crónica
DMSO Dimetilsulfóxido
ERBP Mejores Prácticas Renales Europeas
TFGe Tasa de Filtración Glomerular estimada
eNOS óxido nítrico sintasa endotelial
ERT Enfermedad renal en etapa terminal
FlipR Lector de placas de imágenes de fluorescencia
GPCRs Receptores acoplados a proteínas G
HDL Lipoproteínas de alta densidad
HDMEC Células endoteliales microvasculares dérmicas humanas
HSC Células estrelladas hepáticas
UCI Unidad de Cuidados Intensivos
I/R Isquemia/Reperfusión
KDIGO Kidney Disease Improving Global Otcomes
PBS Solución salina de tampón de fosfato
TRR Terapia de reemplazo renal
S1P Esfingosina-1 -fosfato
S1P1 Esfingosina-1-fosfato 1
SCr Creatinina de suero
s.e.m error estándar de la media
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención y no pretenden limitar la invención. Por razones convenientes y para facilitar la lectura, el compuesto del ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético ha sido renombrado como "compuesto A" en las figuras y los resultados.
Se han realizado los análisis estadísticos y el cálculo de los valores p y están simbolizados por los símbolos "*" o "#" en las figuras, dependiendo de las condiciones experimentales.
Figura 1: Efecto de una administración única o repetida del compuesto A y/o BAF-312 en el modelo de isquemia-reperfusión (I/R) de rata. Las ratas Fischer se sometieron a cirugía simulada o a oclusión bilateral de la arteria renal durante 25 min y se midió la creatinina plasmática después de 24 h de la reperfusión. (Fig 1-A) Se evaluó
el compuesto A a 0,3, 1 y 3 mg/kg administrado p.o. 1 hora antes de la oclusión. (Figura 1-B) Se evaluó BAF-312 a 3, 10 y 30 mg/kg administrado p.o. 1 hora antes de la oclusión. Al grupo de control sin compuesto se le administró vehículo 1 hora antes de la oclusión. *** p <0,001 vehículo I/R frente al grupo simulado. # p <0,05; ## p <0,01 tratado con compuesto frente al grupo de vehículo. Las barras son medias /- s.e.m. (Fig. 1-C) Se recogieron muestras de riñón para evaluar el efecto del compuesto A sobre el contenido de albúmina cortical después de una lesión por I/R de rata. La albúmina se midió mediante transferencia de Western en el área cortical de los riñones representativos de ratas tratadas con operación simulada, tratadas con vehículo I/R o tratadas con compuesto A I/R (3 mg/kg p.o.). (Fig. 1 -D) Se administró el compuesto A (3 mg/kg p.o.) o el vehículo dos veces al día durante 5 días. La última administración se administró 1 hora antes de la oclusión. ** p <0,01 vehículo I/R frente al grupo simulado. ### p <0,001 tratado con compuesto A frente al grupo de vehículo. Las barras son medias /- s.e.m.
Figura 2: Efecto del compuesto A sobre la lesión por AKI inducida por rabdomiólisis en ratones. El compuesto A (0,3, 1, 3 y 10 mg/kg) o el vehículo se administraron por vía oral 1 hora antes de la inyección intramuscular (patas traseras) de glicerol (al 50% en PBS v/v) a 8 ml/kg en ratones machos CD1. El grupo simulado recibió el volumen correspondiente de PBS. Se evaluó la creatinina plasmática 24 h después. ** p <0,01 vehículo de glicerol frente al grupo simulado. # p <0,05 tratado con compuesto A frente al grupo de vehículo. Las barras son medias /- s.e.m.
Figura 3: Linfocitos de sangre periférica en ratas Fischer después de la administración única (Fig. 3-A) o en ratas Sprague-Dawley después de administración única (Figura 3-B) o administración repetida (Figura 3-C).
Se administró el compuesto A por vía oral a 1,3, 10 y 30 mg/kg ya sea a ratas Fischer o a 3 mg/kg a ratas Sprague-Dawley. Se administró BAF-312 por vía oral a 1 y 10 mg/kg a ratas Fischer o 3 mg/kg a ratas Sprague-Dawley (n = 8). En el protocolo de administración repetida, los compuestos se administraron durante 5 días dos veces al día. Los linfocitos sanguíneos se expresan ya sea como área bajo la curva (AUC) (Fig 3-A) o como un porcentaje del total de células blancas sanguíneas en cada punto de tiempo (Fig 3-B/C), y se representan como media /- s.e.m. ** p <0,01 frente al valor inicial. (Fig. 3-D) Relación entre la protección frente a la AKI y la linfopenia en ratas Fischer. Nótense los recuadros que indican la ausencia de linfopenia y la protección total frente la AKI para el compuesto A a 3 mg/kg, mientras que BAF-312 es linfopénico y muestra una protección parcial frente a la AKI.
Figura 4: Linfocitos de sangre periférica en ratones C57BI6/J. Se administró el compuesto A a 1,3, 10 y 30 mg/kg p.o. (n = 8). Los linfocitos sanguíneos en cada punto de tiempo se expresan como un porcentaje del total de células blancas sanguíneas y se representan como media /- s.e.m. *** p <0,001 frente al valor inicial.
Figura 5: Linfocitos de sangre periférica en perros beagle. Se tomaron los recuentos de linfocitos iniciales y luego se administró a los perros una única dosis oral de compuesto A, a 3, 10 y 30 mg/kg (n = 8), o BAF-312, a 10 mg/kg (n = 4). Los animales se monitorizaron durante 7 días (Fig. 5-A) y, en el caso de BAF-312, hasta 66 días (Fig. 5-B). * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 frente al valor inicial. Las barras son medias /- s.e.m. Téngase en cuenta que el compuesto A no indujo ninguna linfopenia significativa en ninguno de los puntos de tiempo medidos para la dosificación de 3 mg/kg.
Figura 6: Extravasación vascular pulmonar en ratones C57BI6/J y ratas Fischer sanos. Los ratones se trataron durante 7 días con compuesto A (3 y 10 mg/kg p.o. b.i.d.), BAF-312 (1 y 3 mg/kg p.o. b.i.d.) y fingolimod (0,1 y 1 mg/kg p.o. b.i.d.), n = 5-8. (Fig. 6-A) Permeabilidad vascular evaluada mediante la extravasación del azul de Evan. (Fig 6-B) Peso del pulmón. Las ratas se trataron durante 7 días con compuesto A (1, 3, 10, 30 y 100 mg/kg p.o. b.i.d.) y BAF-312 (0,03, 0,1,0,3, 3 y 30 mg/kg p.o. b.i.d.). (Fig. 6-C) Permeabilidad vascular evaluada mediante la extravasación del azul de Evan. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 frente al control (sin compuesto) para ratones o vehículo (metilcelulosa al 0,6% - tween 800,5% en agua) para ratas. Las barras son medias /- s.e.m.
Figura 7: Desensibilización del receptor S1P1 en células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) usando un ensayo de impedancia. Las HDMEC se estimularon primero durante 1 h con S1P (1 pM), fingolimod (100 nM) o compuesto A (1 pM), seguido de un período de lavado de 30 minutos. El efecto de la primera estimulación en la desensibilización del receptor se evaluó mediante una segunda estimulación de S1P (3 concentraciones) y medición de la impedancia resultante (n = 3 experimentos). Todas las concentraciones de la primera estimulación fueron > EC90. Las barras son medias /- s.e.m.
Figura 8: Desensibilización del receptor S1P1 en células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) usando un ensayo de impedancia. Las HUVEC se estimularon primero durante 1 h con S1P (1 pM), compuesto A (1 pM), fingolimod (100 nM) o SEW2871 (1 pM), seguido de un período de lavado de 30 minutos. El efecto de la primera estimulación en la desensibilización del receptor se evaluó mediante una segunda estimulación de S1P (4 concentraciones) y medición de la impedancia resultante (n = 3 experimentos). Todas las concentraciones de la primera estimulación fueron > EC90. Las barras son medias /- s.e.m.
Figura 9: Desensibilización del receptor S1P1 en células CHO que sobreexpresan S1P1 (fusión-G) usando un ensayo FlipR. (Fig. 9-A) El protocolo implicó 5 minutos de primera estimulación con S1P (100 nM), compuesto A, fingolimod, BAF-312, ponesimod a las concentraciones indicadas. Todas las concentraciones de la primera estimulación se eligieron para que fueran > EC90. Después de diferentes períodos de lavado, se evaluó la desensibilización del receptor mediante una segunda estimulación con S1P (100 nM). (Fig. 9-B) Se muestra la respuesta FlipR inducida por S1P, expresada como un porcentaje de la respuesta basal, para cada compuesto con
períodos de lavado variables (de 15 a 60 min, n = 4 experimentos). Las barras son medias /s.e.m.
Figura 10: Desensibilización del receptor S1Pi en células estrelladas hepáticas hum anas (HSC) usando un ensayo FlipR. (Fig.10-A) El protocolo implicó una primera estimulación con compuesto A (10 pM) o BAF-312 (300 nM). Todas las concentraciones de la primera estimulación se eligieron para que fueran > EC90. Después de periodos de lavado de 1 hora o 3 horas, se evaluó la desensibilización del receptor usando una segunda estimulación con el mismo compuesto. (Figura 10-B) Se muestra la respuesta FlipR inducida por el compuesto A o BAF-312, expresada como unidades de fluorescencia para cada compuesto con períodos de lavado variables (n = 3 experimentos). Las barras son medias /- s.e.m.
Figura 11: Evolución tem poral de la S1P plasm ática después de la lesión por I/R en ratones C57BI6/J. Se evaluaron los niveles plasmáticos de S1P (kit Elisa de Echelon) después de una cirugía simulada o después de 22 min de oclusión bilateral de la arteria renal seguida de reperfusión. El grupo de control (CTRL) no se sometió a cirugía. ### p <0,001 frente al grupo simulado (emparejado en el tiempo). * p <0,05; ** p <0,001; *** p <0,001 frente al control (CTRL). Las barras son medias /- s.e.m.
M étodos
Materiales:
Fingolimod y SEW2871 están disponibles comercialmente. BAF-312 y ponesimod se sintetizaron de acuerdo con métodos publicados:
• WO04/103306 para BAF-312,
• WO05/054215 para ponesimod.
El compuesto A se ha sintetizado de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO2011/086079.
Todos los estudios in vivo se realizaron de acuerdo con los Estándares de la Comunidad Europea sobre el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Sanofi Research & Development.
Análisis estadístico:
Sobre la base de la normalidad de la distribución y la homogeneidad de la varianza (prueba de Levene), se usó una prueba de Student o una prueba de Wilcoxon para comparar el grupo simulado/control con el grupo tratado con vehículo con el fin de evaluar las diferencias en el parámetro evaluado. A continuación, se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) o ANOVA de dos vías, usando el software Everst@t V6 para comparar el grupo tratado con vehículo con el(los) grupo(s) tratados con compuesto. Este análisis primario se continuó con una prueba post hoc de Dunnett cuando fue apropiado. En caso de no homogeneidad de la varianza, se aplicó una prueba de Kruskal-Wallis. Las diferencias entre los grupos se consideraron significativas si p <0,05.
1. Seguridad de la función cardiovascular
a) Ensayo de hERG
Se ha cultivado la línea celular CHO (Ovario de Hámster Chino) recombinante que expresa el canal de potasio ERG (gen relacionado con el éter-a-go-go) (Número de Catálogo Cytomyx: CYL3002) humano de acuerdo con el siguiente protocolo. Cuando fue necesario, se ha reiniciado un cultivo a partir de alícuotas congeladas. Las alícuotas de células congeladas (1 ml) se atemperaron rápidamente a 37 °C y se volvieron a plaquear primero en una matraz de 75 cm2 (Corning). A continuación, se ajustó el volumen a 10 ml con el Medio Esencial Mínimo a (Gibco 32571-028) que contenía suero de ternera fetal al 10%. El medio se ha renovado a las 24 h y se ha añadido genetina al 1% (G418, Gibco 10131) para evitar la derivación celular. Después de dos o tres días, las células se sembraron a 1,5x106 células por matraz T25. Los matraces se colocaron en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 1 hora; después de haber sido colocados a 28 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 2 días. El procedimiento de aislamiento celular se llevó a cabo después de 2 días de incubación a 28 °C. Las células se recolectaron con Accumax (Sigma; 1: 4) o versene (Gibco) y se colocaron en medio extracelular.
Las células se superfundieron con la solución extracelular PATCH (NaCl, 138 mM; KCl, 4 mM; CaCl2 , 1,8 mM; MgCl2 , 1 mM; glucosa, 5,6 mM, HEPES, 10 mM). El pH se ajusta a 7,3 con NaOH. La osmolaridad se ajusta a 285 mOsm. La solución interna se preparó como sigue: KCl, 60 mM; KF, 70 mM; NaCl, 15 mM; HEPES, 5 mM; EGTA(K), 5 mM; el pH se ajustó a 7,25 con KOH. La osmolaridad se ajusta a 290 mOsm.
Se activó la corriente hERG en respuesta a las etapas de voltaje (2 s) a partir de un potencial de retención de -80 mV a un potencial de prueba de 20 mV seguido de una repolarización a -100 mV. Se aplicaron etapas de voltaje a intervalos de 20 s. La corriente hERG se midió como la corriente de desactivación de cola a -100 mV. Después de un período de 3 minutos para las mediciones del valor inicial, se midieron los efectos del compuesto A 4-6 minutos después del cambio de solución. Al final de cada experimento, la superfusión de un bloqueante específico de hERG,
es decir, Risperidona (que exhibe un IC50 de aproximadamente 0,7 pM), a una concentración de 10 pM, permitió medir una inhibición del 100% de hERG.
Las corrientes se analizaron usando una base de datos y un software de análisis DataXpress 1.0 (Axon Instruments/Molecular Devices). El decaimiento lineal de las corrientes se extrapoló a partir del período de medición de inicio y se calculó el porcentaje de inhibición de la corriente hERG después del efecto del fármaco de la siguiente manera:
Porcentaje de inhibición de la corriente hERG (%) = 100 -[((I-Irisperidona)/(Ivalor inicial-Irisperidona)) x 100].
Donde "I" era la corriente medida después del efecto del fármaco, "Irisperidona" era la corriente medida después del efecto del bloqueante específico de hERG e "Ivalor inicial" era la corriente medida antes de la superfusión del fármaco.
b) Ensayo de fibras de Purkinje de conejo
Se evaluaron los efectos del compuesto A sobre el potencial de membrana en reposo y los parámetros del potencial de acción registrados a partir de fibras de Purkinje de conejo aisladas (machos, conejos New Zealand; 1,3 a 1,5 kg; 9 12 semanas de edad) mediante una técnica de microelectrodos. Se midieron los siguientes parámetros: potencial de reposo (RP en mV), amplitud del potencial de acción (APA en mV), tasa máxima de aumento del potencial de acción (Vmax en V/s), duración del potencial de acción al 50 y 90% de la repolarización (APD50 y APD90 en ms). Las fibras se superfundieron con una solución fisiológica oxigenada que contenía (en mmol/l): NaCl, 120; KCI, 4; MgCl2 , 1; NaH2 PÜ4 , 1,8; NaHCÜ3 , 25; glucosa, 11; CaCl2 , 1,8; pH = 7,4, a 36 ± 1 °C. El compuesto A se disolvió primero en DMSO para obtener una solución madre de 12 mmol/l. Esta solución se diluyó más en DMSO y luego se añadió a la solución fisiológica para obtener las concentraciones nominales adecuadas de 0,3, 1,3, 10 y 30 pmol/l (es decir, 0,1, 0,5, 1,4, 4,5 y 13,6 pg/ml de ingrediente activo, respectivamente). La concentración final de DMSO en la formulación de prueba se mantuvo constante al 0,25% (v/v) en la solución fisiológica. Las fibras de Purkinje (n = 4) se superfundieron primero con la solución fisiológica. Después de un período de control de 30 minutos, se evaluó el compuesto de prueba a concentraciones crecientes aplicadas secuencialmente, cada 30 minutos. Para cada concentración probada, las fibras se estimularon a la tasa basal de 1 pulso por segundo (1 Hz). Además, la tasa de estimulación se redujo de 1 pulso por segundo (1 Hz) a 1 pulso cada 4 segundos (0,25 Hz) durante 3 minutos, se aumentó de nuevo a 1 pulso por segundo durante 1 minuto y finalmente se aumentó a 3 pulsos por segundo (3 Hz) durante 2 minutos adicionales (entre los minutos 19 y 25), como se describe a continuación:
tiempo de medida * * * * * *
Se usó la baja tasa de estimulación para favorecer la aparición de eventos eléctricos anormales durante la fase de repolarización del potencial de acción y para facilitar el desarrollo de Posdespolarización Temprana (EAD). Se usó la alta tasa de estimulación para evaluar el bloqueo de los canales de sodio dependiente del uso. Después de la concentración más alta, se superfundió la solución fisiológica de nuevo para evaluar la reversibilidad del efecto del fármaco (lavado).
c) Estudios de telemetría en perros
El propósito de este estudio fue evaluar el efecto potencial del compuesto A sobre la función cardiovascular (presión arterial, frecuencia cardíaca y ECG) en perros conscientes con telemetría durante un período de 24 horas después de la dosificación.
Los perros conscientes que se movían libremente (Marshall Farms, n = 4, 2 machos y 2 hembras, de 6,9 a 10,8 kg de peso corporal y de 44 a 64 meses) recibieron una dosis oral o intravenosa del artículo de control negativo (es decir, solución acuosa de hidroxietilcelulosa al 0,5% (p/p) / polisorbato 80 al 0,6% (p/p) por vía oral, o solución acuosa de Captisol al 20%, pH 7,5 a 8) seguido de compuesto A 30 y 100 mg/kg por vía oral como suspensiones en artículo de control negativo, o 10 y 30 mg/kg por vía intravenosa como solución en el artículo de control negativo, de acuerdo con un diseño de estudio de dosis creciente con al menos un período de lavado de 4 días entre cada administración (5 ml/kg por vía oral o para infusión de 30 minutos en la vena yugular). Se registraron de modo continuo la presión arterial y las señales de ECG de la derivación II (Transmisores de Data Science, EE. UU.) en cada día de tratamiento desde aproximadamente 2 horas antes de la dosificación hasta 24 horas después de la dosificación. Se analizaron los siguientes parámetros en varios momentos: presión arterial (sistólica, diastólica y media), frecuencia cardíaca,
parámetros electrocardiográficos de duraciones de los intervalos RR, PQ (= PR), QT y duración del complejo QRS, así como la temperatura corporal. El intervalo QT se corrigió para las variaciones de la frecuencia cardíaca de acuerdo con las fórmulas de Fridericia y de van de Water. La señal de ECG completa se examinó latido a latido en busca de cualquier alteración del ritmo y morfología de la forma de onda desde 30 min hasta 6 h después de la dosificación. Se realizaron observaciones clínicas en cada día de tratamiento. Se revisó una grabación de video para identificar posibles cambios graves de comportamiento y una posible interferencia con los parámetros cardiovasculares. Después de la dosificación, los puntos de tiempo para el análisis fueron los siguientes: 0,5, 1,2, 3, 4, 6, 8, 12, 16 y 24 horas.
2. Diferenciación en la integridad de la barrera endotelial
a) Estudio de la extravasación vascular pulmonar en ratón
Se trataron ratones macho C57BI6/J (n = 5-8, 25-30 g) (Laboratorio Charles River, Francia), por vía oral y dos veces al día, durante 7 días con compuesto A 3 y 10 mg/kg, BAF-312 a 1 y 3 mg/kg, fingolimod a 0,1 y 1 mg/kg o artículo de vehículo (metilcelulosa al 0,6% - tween 80 al 0,5% en agua) en un volumen de administración de 10 ml/kg. El número de ratones incluidos en cada grupo fue entre 5 y 8. Después de 7 días, los ratones se anestesiaron usando una inyección i.p. de mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilasina (10 mg/kg). Se inyectó azul de Evans i.v. en la vena yugular a 15 mg/kg en 1 ml/kg. Diez minutos más tarde, el ventrículo izquierdo inyectó suero fisiológico para lavar el cuerpo del azul de Evans intravascular residual. Se recogió y pesó tejido pulmonar y luego se sumergió en una solución de formamida pura durante 24 h para extraer tejido de azul de Evans y, por lo tanto, evaluar la permeabilidad vascular. La concentración de azul de Evans se evaluó a 630 nM usando una curva estándar y se normalizó con el peso del pulmón. Los resultados se expresan como medias /- s.e.m.
b) Estudio de la extravasación vascular pulmonar en rata
Se trataron ratas Fischer macho (n = 4-8, 280-350 g) (Laboratorio Charles River, Francia), por vía oral y dos veces al día, durante 7 días con compuesto A (1,3, 10, 30 y 100 mg/kg ), BAF-312 (0,03, 0,1,0,3, 3 y 30 mg/kg) o artículo de vehículo (metilcelulosa al 0,6% - tween 80 al 0,5% en agua) en un volumen de administración de 2 ml/kg. Después de 7 días, las ratas se anestesiaron usando una inyección i.p. de pentobarbital (50 mg/kg). Se inyectó azul de Evans i.v. en el seno retroorbital a 30 mg/kg en 1 ml/kg. Quince minutos más tarde, el ventrículo izquierdo inyectó suero fisiológico para lavar el cuerpo del azul de Evans intravascular residual. Se recogió y pesó tejido pulmonar y luego se sumergió en una solución de formamida pura (4 ml/g de peso de tejido) durante 24 h para extraer tejido de azul de Evans y, por lo tanto, evaluar la permeabilidad vascular. La concentración de azul de Evans se evaluó a 630 nM usando una curva estándar. Los resultados se expresan como medias /- s.e.m.
3. Diferenciación en la actividad linfopénica
a) Estudios de linfopenia en ratas
Las ratas macho Sprague-Dawley (n = 8, 250 a 350 g) (Laboratorio Charles River, Francia) recibieron la administración oral de compuesto A, BAF-312 a 3 mg/kg o un artículo de vehículo (metilcelulosa al 0,6% - tween 80 al 0,5% en agua) en un volumen de administración de 2 ml/kg. Se usaron dos protocolos: administración única o administración repetida b.i.d. durante 5 días consecutivos. Se recogió sangre a las 2, 6 y 24 h después de la administración del compuesto (última administración para el protocolo repetido) para el análisis hematológico para determinar el recuento de linfocitos en sangre completa. Los resultados se expresan como media /- s.e.m.
Las ratas Fischer macho (n = 8, 250 a 350 g) (Laboratorio Charles River, Francia) recibieron una única administración oral de compuesto A (1, 3, 10 y 30 mg/kg), BAF-312 (1 y 10 mg/kg) o artículo de vehículo (metilcelulosa al 0,6% -tween 80 al 0,5% en agua) en un volumen de administración de 2 ml/kg. Se recogió sangre a las 2, 6 y 24 h después de la administración del compuesto para análisis hematológico para determinar el recuento de linfocitos en sangre completa. Los resultados se expresan como media /- s.e.m.
b) Estudios de linfopenia en ratones
Los ratones macho C57BI6/J (n = 8, 25-30 g) (Laboratorio Charles River, Francia) recibieron una única administración oral de compuesto A a 1, 3, 10 y 30 mg/kg o un artículo de vehículo (metilcelulosa al 0,6% - interpolación 80 al 0,5% en agua) en un volumen de administración de 10 ml/kg. Se recogió sangre a las 2, 6 y 24 h después de la administración del compuesto para análisis hematológico para determinar el recuento de linfocitos en sangre completa. Los resultados se expresan como media /- s.e.m.
c) Estudios de linfopenia en perros
Los perros machos conscientes que se movían libremente (Marshall Farms, n = 8, de 10,5 a 14,3 kg de peso corporal) recibieron una dosis oral del artículo de control negativo (es decir, una solución acuosa de hidroxietilcelulosa al 0,5% (p/p) / polisorbato 80 al 0,6% (p/p)) o compuesto A 3, 10 y 30 mg/kg o BAF-312 a 10 mg/kg, como suspensiones en un artículo de control negativo, de acuerdo con un diseño de estudio de dosis creciente con un período de lavado de al menos 7 días entre cada administración (5 ml/kg). Se recogió sangre a las 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 24, 48 y 168 h para ambos compuestos (y hasta 66 días para BAF-312) para análisis hematológico para determinar el recuento de
linfocitos en sangre completa. Los resultados se expresan como media /- s.e.m.
4. Farmacología in vitro
a) Ensayo de movilización de calcio (FlipR) en células de ovario de hámster chino (CHO), células Chem y HSC
1. Células CHO
Se probaron las actividades del compuesto A, BAF-312 y fingolimod en transfección estable de Flp-In con la construcción de fusión hS1P1-G en células CHO (patentada) y se probaron selectivamente sobre las construcciones de fusión hS1P2-G y hS1P3-G (patentadas). La generación de líneas celulares se describe en el documento WO2011/086079.
Se cuantificó la activación del receptor S1P1 por los compuestos mediante su efecto sobre la liberación de calcio relacionada con el receptor S1P1 en un ensayo de fluorescencia de calcio basado en células mediante el uso de células CHO en las que estaba sobreexpresado de forma estable el receptor S1P1 humano (sistema Flp-In, Invitrogen). Con el fin de reforzar el acoplamiento de proteína G y dirigir la señalización hacia la liberación de Ca2+ , el receptor sobreexpresado tenía además una secuencia C-terminal de una proteína G modificada (Gai4qi4) (documento WO 02/04665). Se determinaron los cambios en el calcio intracelular mediante la medición de la fluorescencia con el colorante sensible al calcio fluo-4 (Invitrogen) en un lector de placas de imágenes de fluorescencia (FlipR, Molecular Dynamics).
Se sembraron células CHO que sobreexpresan de forma estable el receptor S1P1 humano (40.000 por pocillo) en placas negras de fondo transparente de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (Becton Dickinson, Biocoat cellware) aproximadamente 18-24 h antes de los experimentos. Las células se cultivaron en una incubadora a 37 °C, dióxido de carbono al 5% y 95% de humedad en medio de cultivo celular basado en medio glutamax F-12 (Gibco # 31765) suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (v/v) (PAN, # P06-07100), suero de ternero fetal al 10% (v/v) (FCS; FBS tratado con Hyclone Charcoal/Dextran # SH30068) e higromicina B (Invitrogen, # 10687-010) a 300 mg/l (concentraciones finales).
Antes del experimento FlipR, las células se cargaron con fluo-4 acetoximetil éster (fluo-4 AM, Invitrogen, # F14202) durante 60 min en una incubadora a 37 °C, dióxido de carbono al 5% y 95% de humedad en tampón de carga de colorante que consiste en Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS; Invitrogen # 14065049) suplementada con fluo-4 AM a 2 pM (todos los datos se dan para la concentración final), Pluronic® F-127 al 0,05% (v/v) (Invitrogen, # P-3000MP), HEpES 20 mM (Gibco # 15630), probenecid 2,5 mM (Sigma # P-8761) y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,05% (Sigma # A-6003), ajustada a pH 7,5 con hidróxido de sodio. Durante la carga celular, el fluo-4 AM es escindido por la esterasa intracelular, lo que da como resultado el atrapamiento del colorante fluo-4 dentro de las células. La carga se terminó lavando las células en un lavador de células (Tecan Power Washer) tres veces con el tampón especificado anteriormente pero sin fluo-4 AM y BSA. Este último tampón también se usó como tampón en las siguientes mediciones de fluorescencia celular.
Las células cargadas con colorante y lavadas se estimularon con los compuestos respectivos con varias concentraciones añadidas como una solución en DMSO (concentración final máxima de DMSO al 0,3% v/v), o con S1P (concentración final 100 nM) en DMSO solo en la concentración respectiva (control positivo). Los compuestos que activaron el receptor de S1P dan lugar a la liberación de calcio intracelular de las reservas internas lo que da como resultado un gran aumento transitorio de la señal de fluorescencia fluo-4 que se monitorizó durante aproximadamente 3 min. Se determinó el porcentaje de activación causado por un compuesto de prueba a partir de la respuesta de fluorescencia máxima en comparación con la respuesta de fluorescencia máxima al control positivo S1P. Todos los valores de fluorescencia se corrigieron con respecto a los valores de fluorescencia de inicio obtenidos con las células que se incubaron previamente solo con DMSO y no se trataron con S1P (control de inicio). Todas las mediciones se realizaron por triplicado. Se calculó el valor de EC50 a partir de la activación a diversas concentraciones.
2. Células Chem
Se usó el ensayo GPCRProfiler® de Millipore para determinar la actividad EC50 del compuesto A, BAF-312 y fingolimod sobre los receptores S1P1, S1 P2 , S1 P3 , S1 P4 o S1 P5. Estos ensayos usaron líneas celulares estables GPCR ChemiScreen.
3. HSC
Se sembraron HSC humanas (Sciencell) a 25x103 células por pocillo en placas multipocillo de 96 pocillos, 100 pl/pocillo, y se dejaron adherir durante 24 horas en medio completo (Sciencell SC5301) con suplementos al 1% (Sciencell SC5352) y FCS al 2%. El medio de cultivo se reemplazó por medio Sciencell con FCS al 2% pero sin suplementos durante otro período de 24 horas. Las células se lavaron y se colocaron en 100 pl de tampón de ensayo (HBSS, MgSO4 0,8 mM, Hepes 20 mM, Na2CO3 3,3 mM, CaCl2 1 mM, BSA al 10%). Las células se cargaron con Fluo4-AM en presencia de ácido plurónico durante 1 hora a 37 °C en la oscuridad. El medio de carga se retiró y se reemplazó por 200 pl/pocillo de tampón de ensayo. Se dejó que las células se estabilizaran durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La placa de cultivo se colocó en el instrumento FlipR, se añadieron el
compuesto A o BAF-312 en un volumen de 50 pl (solución 5X, concentración final 10 pM) y se registró de forma continua la fluorescencia del calcio durante 6 minutos. Para los experimentos de desensibilización, después de la primera inyección del compuesto A o BAF-312, se lavó la placa de cultivo una vez y se dejó recuperar durante 1 o 3 horas en tampón de ensayo antes de la segunda adición del compuesto A o BAF-312. Para los experimentos de control, la primera inyección de compuesto A o BAF-312 se reemplazó por tampón de ensayo y se tomó como referencia la segunda inyección con compuesto A o BAF-312. Los resultados se expresan como unidades de fluorescencia (FU).
b) ensayo de p-arrestina
Se usó el ensayo PathHunter® p-Arrestin de DiscoverX para determinar la actividad EC50 del compuesto A, BAF-312 y fingolimod sobre los receptores S1P1, S1P2, S1P3, S1P4 o S1P5. Los compuestos se probaron en medio de ensayo que contenía FBS al 0,5%.
c) Ensayo de GTPyS
Este método se describe en el documento WO2011/086079.
d) Ensayo de internalización
Se usó el ensayo de internalización de GPCR activado PathHunter® de DiscoverX para determinar la actividad EC50 del compuesto A, BAF-312 y fingolimod sobre el receptor de S1P1. Los compuestos se probaron en medio de ensayo que contenía FBS al 0,5%.
e) ensayo de AMPc en células de ovario de hámster chino (CHO) y HUVEC
1. Células CHO
Se usó el ensayo Hit Hunter® cAMP de DiscoverX para determinar la actividad EC50 del compuesto A, BAF-312 y fingolimod sobre S1P1. Los compuestos se probaron en medio de ensayo que contenía FBS al 0,5%.
2. HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humanas)
Se evaluó el AMP cíclico en respuesta al compuesto A, BAF-312 o fingolimod en células HUVEC tratadas con forskolina mediante el kit cAMP HTRF® (Cisbio). Brevemente, se sembraron HUVEC (Lonza) a 5x103 células por pocillo en una placa multipocillo blanca de 96 pocillos (medio volumen) durante 24 horas en medio EGM2 (Lonza). Al comienzo del experimento, se reemplazó el medio EGM2 por tampón de ensayo que consistía en HBSS que contenía Hepes (10 mM), BSA (0,1%) e IBMX (0,5 mM). Se dejó que las células se recuperaran durante 15 min. Se añadió el compuesto A, BAF-312 o fingolimod (10 nM - 100 pM) a las células durante 15 min seguido de la adición de forskolina (FSK, 10 pM). Después de 45 min de tratamiento con FSK, la reacción se detuvo mediante la adición de MAb anti-cAMP-criptato y cAMP-D2 durante 1 hora. Al final de la incubación, se leyó la fluorescencia (Envision, Perkin Elmer) y se calculó la relación FRET de acuerdo con el protocolo del kit de ensayo. La potencia del compuesto A, BAF-312 o fingolimod (EC50) se calculó usando el software Sanofi BIOST@T-SPEED de acuerdo con el modelo de ecuación logística.
f) Fosforilaciones de Akt y ERK1/2 en ensayos de células RPTEC (en condiciones basales o después de la exposición a tunicamicina)
Se sembraron células RPTEC (Lonza) a 0,3 x 106 células por pocillo en placas multipocillo de 6 pocillos en 2 ml de medio completo REBM/REGM (Lonza) por pocillo durante 24 horas. Las células se privaron de suero durante un período adicional de 24 horas en 900 pl de medio quiescente. Se añadieron concentraciones crecientes de compuesto A (10X) bajo el volumen de 100 pl en cada pocillo durante 10 minutos a 37 °C. Cuando se usó, se añadió tunicamicina (100 pl) 30 min antes de la adición del compuesto A. Después de la eliminación del medio, las células se lavaron con PBS frío y se lisaron en hielo en 100 pl de tampón RIPA frío que contenía tritón al 1%, inhibidores de proteasas y fosfatasas. Para la transferencia de Western, se cargaron 30 pg de lisado de proteína total en geles de bis-tris al 4-12% (Invitrogen). Después de la migración y la transferencia, las membranas de nitrocelulosa se rastrearon con anti phospho-Akt (Phospho-Ser473, Cst # 9271) y anti phospho-Erk1/2 (phopsho-Tyr202/Tyr204, Cst # 4377). Se usó el marcaje de tubulina con antia-tubulina (Cst # 2144) para la normalización después del análisis densitométrico de las películas.
g) Fosforilaciones de Akt y ERK1/2 en ensayos de células HUVEC (en condiciones de privación)
Se sembraron células HUVEC (Lonza) a 0,3 x 106 células por pocillo en placas multipocillo de 6 pocillos en 2 ml de medio completo EGM2 (Lonza) durante 24 horas. Las células se privaron de suero durante un período adicional de 24 horas en 900 pl de medio quiescente. Se añadieron concentraciones crecientes de compuesto A, BAF-312 o fingolimod (10X) bajo el volumen de 100 pl en cada pocillo durante 10 minutos a 37 °C. Después de la eliminación del medio, las células se lavaron con PBS frío y las células se lisaron en hielo en 100 pl de tampón RIPA que contenía tritón al 1%, inhibidores de proteasas y fosfatasas. Para la transferencia de Western, se cargaron 30 pg de lisado de proteína total en geles de bis-tris al 4-12% (Invitrogen). Después de la migración y transferencia, las membranas de nitrocelulosa se rastrearon con anti phospho-Akt (Phospho-Ser473, Cst # 2965) y anti phospho-Erk1/2 (Phospho Tyr202/Tyr204, Cst #
4377). Se usó el mareaje de tubulina con anti a-tubulina (Cst # 2144) para la normalización después del análisis densitométrico de las películas.
h) Ensayo de apoptosis inducida por tunicamicina
Se midió el efecto del compuesto A sobre la apoptosis inducida por tunicamicina (TN) en RPTEC por medio del kit de ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega). Brevemente, se sembraron células RPTEC (Lonza) en placas blancas multipocillo de 96 pocillos a 30 x 103 células por pocillo en REGM (medio REBM más FCS al 0,5% más Single quots, Lonza) y se dejaron adherir durante 24 h. Después de 24 h, el medio completo se reemplazó por suero y medio libre de suplementos (56 pl/pocillo). Las células se trataron previamente durante 30 min con el compuesto A (concentraciones finales 0,3-30 pM, 7 pl) seguido de la adición de tunicamicina (TN, concentración final, 0,1 pg/ml, 7 pl). Después de 24 horas a 37 °C, CO2 , al 5%, se añadieron 70 pl de reactivo Caspase-Glo y la placa de cultivo se colocó con agitación durante 1 hora. Se registró la luminiscencia por medio del lector Envision (Perkin Elmer). Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de la apoptosis inducida por TN.
i) Ensayo de sobreexpresión de moléculas de adhesión inducida por TNFa
Se midió la expresión de ICAM-1, VCAM-1 y P/E-selectinas en HUVEC mediante ELISA. Las células HUVEC se sembraron en placas multipocillo de 96 pocilios a 25 x 103 células por pocillo bajo el volumen de 100 pl en medio EGM2 (Lonza) y se dejaron adherir durante 24 h. Después de 24 h, el medio completo se reemplazó por medio quiescente (EGM2 sin suplementos ni suero) durante 3 horas. Después de esto, las células se trataron previamente con compuesto A o BAF-312 (1-30 pM) durante 18 h. A continuación, las células se trataron con TNF-a (3 ng/ml) en medio libre de factores de crecimiento durante un período adicional de 6 h. Se eliminó el medio y las células se lavaron y fijaron con 100 pl de solución RLC2 por pocillo (Alphelys # 01-RLC2-RTU30) durante 20 min a 4 °C. Las células fijadas se lavaron dos veces con 100pl de HBSS antes de la adición de anticuerpos anti-ICAM-1 (# BBA3, R&D System), anti-VCAM-1 (# BBA5, R&D System) y anti-P/E-selectinas (# BBA1, R&D System) durante 1 hora. Después de un lavado extenso, se añadió anti-IgG de ratón HRP (n° NA931, Amersham) durante 2 horas. La densidad óptica se leyó a 450 nm (Envision) después del lavado y la adición de sustrato HRP (OPD, Sigma # P9187). Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de la expresión de la molécula de adhesión inducida por TNF-a.
j) Ensayo de medición de impedancia en células de ovario de hámster chino (CHO) y células endoteliales
1. Células CHO
Se usó el ensayo de impedancia de CEREP para determinar la actividad EC50 del compuesto A, BAF-312 y fingolimod sobre S1P1.
2. Células endoteliales
Se probaron el compuesto A, BAF-312, fingolimod, SEW2871 y S1P (usado como control positivo) en función de la concentración sobre sus efectos sobre el cambio de forma que se detecta por cambios en la impedancia eléctrica (sistema X-celligence), para monitorizar la desensibilización del receptor S1P1 tanto en células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) como en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). El día 1 se sembraron células primarias en e-placas de 96 pocillos previamente recubiertas con colágeno-I con 20.000 células por pocillo. Después de 24 h de adherencia y proliferación, las HDMEC y HUVEC se estimularon primero durante 1h con S1P (1 pM), compuesto A (1 pM para HDMEC; 0,1, 1, 10 pM para HUVEC), BAF-312 (1, 10, 100 nM solo en HUVEC), fingolimod (100 nM para h Dm EC ; 1, 10, 100 nM para HUv Ec ) o SEW2871 (0,1, 1, 10 pM, solo en HUVEC). Después de la incubación con los agonistas de S1PR, las células se lavaron cuidadosamente dos veces con medio seguido de un período de recuperación de 5,5 h. Se evaluó entonces el efecto de la primera estimulación anterior sobre la desensibilización del receptor mediante una segunda estimulación de concentraciones crecientes de S1P (0,1, 1 y 10 pM) y medición de la impedancia resultante. Todas las mediciones se realizaron al menos por triplicado. Todo las concentraciones de la primera estimulación fueron > EC90 en HDMEC. Los resultados se expresan en unidades de impedancia arbitrarias como media /- s.e.m.
5. Farmacología in vivo
a) Modelo de rata de lesión por reperfusión por isquemia renal (I/R)
Ratas Fischer macho (n = 3-9, 250 a 300 g) (Laboratorio Charles River, Francia) recibieron administración oral de compuesto A 0,3, 1 y 3 mg/kg o BAF-312 a 3, 10 y 30 mg/kg o artículo de vehículo (metilcelulosa al 0,6% - tween 80 al 0,5% en agua) en un volumen de administración de 2 ml/kg, una hora antes de la isquemia renal. En un segundo conjunto de experimentos, el compuesto A se administró dos veces al día durante 5 días para evaluar la taquifilaxia potencial. Brevemente, los animales se sometieron a cirugía simulada (es decir, laparotomía, aislamiento de las arterias renales) o a oclusión bilateral de la arteria renal durante 25 minutos bajo anestesia con pentobarbital (50 mg/kg i.p.). La temperatura corporal (37 °C- 38 °C) y la hidratación (inyección peritoneal de suero fisiológico) se controlaron cuidadosamente para estandarizar el procedimiento quirúrgico y limitar la variabilidad entre individuos. Al final del período isquémico, los riñones se reperfundieron retirando las pinzas y se controló la calidad de la reperfusión antes de suturar el plano muscular y cutáneo (los animales con mala reperfusión se excluyeron inmediatamente).
Veinticuatro horas después, se recogió sangre y riñones. La sangre se centrifugó (3.000 g, 10 min) y el plasma heparinizado se congeló para la evaluación de la creatinina usando un analizador bioquímico (P400, Horiba, Francia). Se congeló un riñón para análisis de transferencia de Western para la evaluación de albúmina tisular (anti-albúmina, Santa Cruz) y HSP70 tisular (anticuerpo monoclonal anti-HSP70 de Santa Cruz # SC32239) y el segundo se fijó (formalina tamponada neutra al 10%) y se sumergió en parafina para el análisis histológico en cortes de 5 pm de espesor (cuantificación de necrosis tubular aguda usando hematoxilina-eritrosina-Saffran clásica, tricrómica de Masson modificado y ácido peryódico de Schiff - asociado a alcina azul ) y análisis de inmunohistoquímico (tinción de macrófagos con anticuerpo monoclonal anti-CD68 de Acris # BM4000, y tinción capilar con anticuerpo monoclonal anti-PECAM de Santa Cruz # SC1506, usando el robot Ventana, VMS Inc.). La necrosis tubular aguda se expresa como porcentaje de túbulos que mostraron necrosis celular en 12-15 campos en la región cortico-medular renal. El marcaje inmunológico de CD68 y PECAM se expresan como porcentaje del recuento de píxeles positivos (algoritmo de Aperio) en toda la sección. La creatinina plasmática se expresa como media /- s.e.m.
b) Modelo de ratón de lesión renal inducida por rabdomiólisis
Ratones macho suizos (CD1) (n = 5-15, 13-14 semanas de edad) (Laboratorio Charles River, Francia) recibieron la administración oral de compuesto A 0,3, 1, 3 y 10 mg/kg o de artículo de vehículo (metilcelulosa al 0,6% - Tween 80 al 0,5% en agua) en un volumen de administración de 10 ml/kg, una hora antes de la inyección de glicerol. Se realizó una inyección intramuscular de glicerol (al 50% en PBS v/v) o de artículo de vehículo (PBS) en las patas traseras (2 inyecciones por pata, gastrocnemio y recto femoral) a 8 ml/kg bajo anestesia con pentobarbital (33 mg/kg) y ketamina (40 mg/kg). Veinticuatro horas después, se extrajo sangre, se centrifugó (3.000 g, 10 min) y se congeló el plasma heparinizado para evaluación de creatinina usando un analizador bioquímico (P400, Horiba, Francia). Los resultados se expresan como media /- s.e.m.
Resultados
El compuesto de acuerdo con la invención, concretamente el compuesto A, fue objeto de diversos experimentos in vitro e in vivo con el fin de demostrar su actividad en escenarios de AKI y su diferenciación sobre antagonistas funcionales de S1P1.
1- Seguridad de la función cardiovascular
Aunque el compuesto A es un agonista de S1P1 que carece de antagonismo funcional, los intereses potenciales basados en la diana podrían ser similares a los antagonistas funcionales de S1P1. La mayor experiencia clínica hasta la fecha se ha generado con el compuesto S1P mixto1/3/4/5, fingolimod, que induce bloqueo auriculo-ventricular y bradicardia (Schmouder y cols., 2006, J Clin Pharmacol 46: 895-904). Hay mucha evidencia preclínica que implica a S1P3 en estos hallazgos de cardio-toxicidad, por lo tanto, el campo se ha desplazado a la identificación de compuestos S1P1 selectivos para superar estas limitaciones. Sin embargo, los compuestos S1P1 selectivos, que siguen en la fase clínica parecen también inducir bradicardia (Gergely y cols., 2012, BJP 167: 1035-1047), pero sus efectos sobre el bloqueo auriculo-ventricular se desconocen actualmente. Por lo tanto, se realizaron varios estudios además de los estudios habituales para evaluar la cardiotoxicidad potencial del compuesto A. En el ensayo de hERG, la IC50 para el compuesto A fue > 30 pM. En el ensayo de fibra de Purkinje en conejo, no hubo un efecto significativo del compuesto A probado de 0,3 a 10 pM, aunque se observó un acortamiento del potencial de acción a 26 pM.
No se observó ningún efecto sobre la frecuencia cardíaca o el bloqueo aurículo-ventricular o cualquier otro parámetro del ECG en un estudio de telemetría en perros, a 30 o 100 mg/kg p.o. y 10 o 30 mg/kg i.v. (infusión durante 30 min). No hubo cambios significativos en la presión arterial con ambas dosis.
2- Farmacología renal in vivo
Se usó un modelo de rata de lesión por reperfusión por isquemia renal (I/R) para imitar la lesión renal que surge después de la cirugía cardíaca en los pacientes. En este modelo, el compuesto A redujo notablemente (85-90%) la gravedad de la AKI, como se refleja al limitar el aumento de la creatinina sérica (un biomarcador clínicamente validado) (la Fig 1A es representativa de 5 estudios independientes). El efecto fue dependiente de la dosis y estadísticamente significativo a 1 y 3 mg/kg p.o. (figura 1A). El análisis histológico mostró que el compuesto A tenía efectos directos sobre la vasculatura al prevenir la extravasación de albúmina (figura 1C) y preservar los capilares. El compuesto A también protegió los túbulos renales proximales de la necrosis, redujo la infiltración de macrófagos y aumentó la proteína HSP70 renal (un marcador asociado con la reparación después de una lesión isquémica renal). El compuesto A no mostró signos de taquifilaxia ya que se mantuvo una actividad similar después de 5 días de administración repetida BID en comparación con una administración única (figura 1D).
La rabdomiólisis es otra causa importante de AKI en pacientes y se reproduce en ratones mediante la inyección intramuscular de glicerol. El glicerol induce una lesión muscular progresiva con liberación de mioglobina y posterior disfunción renal. Como se observó en el modelo I/R, el compuesto A previno notablemente (~85% a 10 mg/kg p.o) y dependiente de la dosis el deterioro de la función renal en este modelo (n = 3 estudios independientes) (figura 2).
Los efectos del compuesto A se compararon en el modelo de reperfusión de isquemia renal con un antagonista funcional selectivo de S1P1, BAF-312. BAF-312 es al menos 10 veces más potente en la mayoría de ensayos in vitro
de S1 Pi (incluidos los ensayos endoteliales, véase tabla 1) y tiene una exposición similar en plasma/riñón al compuesto A en ratas. Sin embargo, a pesar de las propiedades mejoradas de potencia/exposición de BAF-312, no logró mostrar una reducción de más del 40% en la creatinina sérica en el modelo de isquemia-reperfusión, incluso a dosis de hasta 30 mg/kg p.o. (figura 1B).
3- Diferenciación sobre la actividad linfopénica
S1P es responsable de la salida de linfocitos del ganglio linfático a la sangre a través de la activación de S1P1. Esta activación de S1P1 provoca la internalización del receptor seguida del reciclaje del receptor de vuelta a la superficie celular, lo que permite la reactivación. Sin embargo, los antagonistas funcionales de S1P1 (fingolimod, BAF-312) provocan la degradación del S1P1 internalizado y, por lo tanto, provocan reducciones dramáticas y prolongadas en el S1P1 de superficie celular. En consecuencia, los antagonistas funcionales de S1P1 muestran una caída grande y prolongada en los linfocitos sanguíneos como se observa preclínica y clínicamente (Mandala y cols., 2002, Science 296: 346-349; Gergely y cols., 2012, BJP 167: 1035-1047).
Como era de esperar, BAF-312 indujo una linfopenia profunda (-80%) y prolongada en ratas (figura 3A, 3B). Esto fue evidente incluso a dosis tan bajas como 1 mg/kg p.o. (la dosis más baja probada). Las 2 dosis que fueron parcialmente eficaces en el modelo de AKI de rata fueron dosis más altas (10 y 30 mg/kg p.o., figura 1B) y representan dosis altamente linfopénicas. Por el contrario, el compuesto A 1 y 3 mg/kg p.o. no mostró reducción de linfocitos, incluso después de 5 días de administración repetida BID (3 mg/kg p.o) en ratas (figura 3C). Las dosis más altas de compuesto A revelaron una linfopenia dependiente de la dosis, pero estas representan dosis más altas que las requeridas para una protección total frente a la AKI.
De manera similar, no se observó actividad linfopénica del compuesto A en ratones a 3 y 10 mg/kg (figura 4), dosis que eran activas en el modelo de rabdomiólisis inducida por glicerol (figura 2).
El compuesto A no fue linfopénico en perros a 3 mg/kg p.o. (figura 5A). Esta dosis no linfopénica en perros ya proporciona una exposición (Cmax y AUC) que excede la exposición requerida para una protección total frente a la AKI en ratas (3 mg/kg) (tabla 4). A las dosis más altas de 10 y 30 mg/kg p.o en perros, el compuesto A indujo solo una linfopenia transitoria (figura 5A). Por el contrario, BAF-312 indujo una profunda (Imax ~80%) reducción de linfocitos a 3 mg/kg p.o. que tardó al menos 60 días en recuperarse (figura 5B).
El compuesto A es un agonista de S1P1 único porque demuestra por primera vez una fuerte protección frente a la AKI a dosis no linfopénicas (figura 3D). Aunque otros compuestos de S1P1, como fingolimod y SEW2871, también son activos en modelos de AKI, sus efectos se producen a dosis linfopénicas (Awad y cols., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524; Sanna y cols., 2004, JBC 279: 13839-13848; Lai y cols., 2007, Kidney Int 71: 1223-1231).
Estos datos in vivo apoyan que el compuesto A actúa como un agonista de S1P1 que induce protección de la AKI a dosis no linfopénicas. El compuesto A difiere notablemente de BAF-312, como se describe en esta memoria, así como de otros antagonistas funcionales de S1P1 que están diseñados específicamente para ser agentes linfopénicos, por ejemplo, para enfermedades autoinmunes.
4- Diferenciación en la integridad de la barrera endotelial
El antagonismo funcional de S1P1 se asocia con efectos dañinos para el endotelio. El edema macular y pulmonar son eventos adversos prominentes en pacientes con esclerosis múltiple tratados con fingolimod (Jain y Bhatti, 2012, 78: 672-680).
Se encontró que la administración oral crónica en ratones sanos de fingolimod fue capaz de producir una extravasación vascular significativa (figura 6A, 6B), en línea con los hallazgos clínicos. El agonista selectivo de S1P1, BAF-312 a 1 y 3 mg/kg b.i.d. indujo una extravasación vascular aún mayor en el pulmón (figura 6A, 6B). Estos hallazgos están de acuerdo con informes anteriores que demuestran que los antagonistas funcionales de S1P1 alteraron la integridad de la barrera endotelial y promovieron la extravasación de proteínas vasculares en el pulmón (Shea y cols., 2010, Am J Respir Cell Mol Biol 43: 662-673). Por el contrario, el compuesto A no mostró un aumento en la extravasación vascular (a 3 y 10 mg/kg (que representan dosis que proporcionan hasta el efecto protector total de la AKI en ratones) (figura 6A, 6B). De manera similar, en ratas Fisher, el compuesto A no indujo extravasación vascular pulmonar a 1 y 3 mg/kg (que representan dosis eficaces de AKI) o incluso a una dosis más alta (10 mg/kg). Por el contrario, BAF-312 indujo extravasación vascular en ratas tanto a 3 mg/kg (dosis no eficaz de AKI ) así como a 30 mg/kg (dosis de AKI parcialmente eficaz).
Dadas las propiedades de daño endotelial observadas de BAF-312 (figura 6), las propiedades protectoras de BAF-312 podrían contrarrestarse por sus efectos deletéreos endoteliales que dan como resultado el efecto protector parcial observado (figura 1B). El daño endotelial es una característica notable de múltiples antagonistas funcionales de S1P1 (Figura 6 y datos publicados). Por lo tanto, el nuevo perfil del compuesto A brinda la oportunidad de proteger frente a la lesión renal aguda en dosis que son protectoras endoteliales en lugar de dañinas.
5- Farmacología in vitro
Se demostró que el compuesto A es un potente agonista de S1 Pi . En células CHO que sobreexpresan S1 Pi humana (G-fusión), la EC50 fue de 31 nM en un ensayo de movilización de calcio, 656 nM en un ensayo de p-arrestina, 206 nM en un ensayo de GTPyS y 213 nM en un ensayo de internalización (tabla 1).
Tabla 1: Valores de EC50 para el compuesto A, BAF-312 y fingolimod usando varios ensayos in vitro . Las células Chem* y CHO se diseñaron para sobreexpresar S1P1 humano. Las HUVEC expresan endógenamente S1P1. # Ensayo ChemiScreen. "-" significa no determinado.
* Los valores son medias de 2 experimentos separados. Ensayo de p-arrestina: Cpd A - 800 & 511, BAF-312 - 7,9 & 2,83, S1P - 41 & 20,8; ensayo de internalización: Cpd A - 160 & 266, BAF-312 - <0,5 & 0,67, fingolimod-P - 0,7 & 4,74, S1P - 56 & 40,2.
El compuesto A no mostró propiedades de antagonismo funcional ni indujo desensibilización del receptor (figuras 7 10). Esta diferenciación se demostró en cuatro sistemas independientes in vitro, dos sistemas que usaban la medición de impedancia en células endoteliales HDMEC (células endoteliales microvasculares dérmicas humanas) y HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana), y dos sistemas que usaban el ensayo FlipR en células CHO y células HSC (células estrelladas hepáticas). La incubación previa con el compuesto A (seguida de una etapa de lavado) permitió una segunda estimulación casi completa con S1P (figuras 7-9) o con compuesto A (figura 10). Sin embargo, la incubación previa con los antagonistas funcionales previno de una segunda estimulación completa con S1P (figuras 7-9) o BAF-312 (figura 10). En el ensayo de impedancia de HUVEC, se comparó la concentración en la que cada compuesto comenzó a desensibilizar la respuesta de impedancia inducida por S1P1 con su EC50 absoluta en el ensayo. BAF-312 comenzó la desensibilización a 5 veces la EC50 , SEW2871 a 20 veces la EC50 , mientras que no se observó desensibilización para el compuesto A hasta 60 veces la EC50.
Los datos de las figuras 7-10 indican que los antagonistas funcionales (fingolimod, BAF-312, SEW2871 y ponesimod) indujeron una desensibilización prolongada del receptor.
El compuesto A mostró diferentes potencias relativas en las vías de señalización de S1P1 (tabla 1) en comparación con BAF-312 o fingolimod. Dado que las condiciones de ensayo con respecto a la proteína diferían entre las pruebas, excluimos la posible influencia de la unión de proteína en las potencias relativas comparando las potencias en los ensayos de CHO para AMPc, beta arrestina e internalización usando las mismas condiciones de medio. Como se muestra en la tabla 2, el compuesto A (en relación con BAF-312 y S1P) está más sesgado en su activación de AMPc en comparación con la internalización o con la p-arrestina.
Tabla 2: Valores relativos de EC50 del compuesto A, BAF-312 y S1P (normalizados al ensayo de AMPc). Los medios contenían concentraciones de proteínas idénticas (FBS al 0,5%) en las 3 pruebas
El compuesto A indujo marcadores de supervivencia, pERK y pAKt, en células epiteliales tubulares renales humanas (RPTEC) con una EC50 de aproximadamente3 pM en condiciones basales, o después de una lesión por tunicamicina (EC50 ~ 10 pM) de una manera dependiente de la concentración. Estos efectos a favor de la supervivencia fueron más potentes en células endoteliales humanas después de la privación de suero, con una EC50 de 101 nM en P-Akt y de 190 nM en P-ERK1/2. Además, el compuesto A inhibió la apoptosis inducida por tunicamicina en RPTEC evaluada mediante la actividad de caspasa 3/7 con una EC50 de aproximadamente 3-10 pM.
El compuesto A, a diferencia de BAF-312, redujo la sobreexpresión de moléculas de adhesión inducida por TNFa, incluidas las ICAM-I, VCAM-I y P/E selectinas, en tres tipos de células endoteliales humanas (HPAEC, HUVEC y HRGEC). Se sabe que estos marcadores de disfunción endotelial están regulados positivamente en muestras de plasma de pacientes con AKI (Sadik y cols., 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81), e implicados en el proceso de infiltración de células inflamatorias en el espacio túbulo-intersticial.
El compuesto A tenía un perfil de selectividad atractivo sobre los otros receptores de la familia S1PR (tabla 3), en más de 110 dianas en un panel CEREP, en más de 216 quinasas y en más de 5 dianas en un panel de canal iónico. Como se muestra en la tabla 3, el compuesto A es un agonista de S1P1 más selectivo en comparación con fingolimod. La carencia de actividad en S1P2 y S1P3 es particularmente importante ya que se informa que estos receptores se oponen a la función de S1P1 en células endoteliales.
Tabla 3: Selectividad del compuesto A, BAF-312 y fingolimod frente a miembros de la familia de receptores de esfingosina.
"-" significa no determinado.
La activación preferencial de algunas vías de señalización por el compuesto A (p. ej., AMPc), mientras que tiene una potencia más débil en otras (p. ej., internalización, p-arrestina), proporciona el perfil deseado para la AKI (es decir, desensibilización mínima del receptor, sin linfopenia prolongada, protección endotelial). Esto contrasta con lo deseado para los antagonistas funcionales de S1P1, BAF-312 y fingolimod en la esclerosis múltiple (alta desensibilización del receptor, fuerte linfopenia, siendo el daño endotelial el efecto secundario no deseado). Este perfil define el compuesto A como una nueva clase de agonista sesgado de S1P1.
Tabla 4: Propiedades farmacocinéticas del compuesto A 3 mg/kg p.o. en rata Fisher macho y perro beagle.
Conclusión
Estos datos preclínicos demuestran un profundo impacto del compuesto A en múltiples criterios de valoración mecanísticos en la AKI, incluido un marcado mantenimiento de la función de la barrera endotelial, así como una reducción de la necrosis tubular y la inflamación de los macrófagos. Todas las dosis protectoras de AKI del compuesto A (tanto en ratones como en ratas) eran no linfopénicas y cuando se alcanzaron las exposiciones correspondientes en perros, el compuesto A todavía no era linfopénico. Dado que el compuesto A no fue linfopénico en todas las dosis protectoras de la AKI, su mecanismo de protección frente a la AKI es independiente de la linfopenia. El compuesto A mostró efectos protectores directos sobre las células endoteliales y epiteliales, que probablemente sean el mecanismo de acción en la AKI.
Esto está en contraste con compuestos S1P1 existentes que tienen un perfil de señalización diferente y son i) antagonistas funcionales de S1 P1, ii) que dañan el endotelio y iii) muestran solo una actividad limitada en la AKI inducida por I/R a dosis linfopénicas.
El compuesto A proporciona la nueva oportunidad de tratar a pacientes con AKI sin inducir linfopenia y, por tanto, evitar los efectos secundarios correspondientes (incluidas las infecciones). En consecuencia, este compuesto tiene el potencial de ser una terapia transformadora en un campo donde actualmente no hay medicamentos disponibles para los pacientes.
Claims (2)
1. Ácido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo [5,4-d]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en la prevención o el tratamiento de la AKI (lesión renal aguda).
2. Ácido {{4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo [5,4-d]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso de acuerdo con a la reivindicación 1 como un agente no linfopénico.
FIG 1-A FIG 1-B
Simulada l/R Simulada l/R
- 0,3 1 3 3 10 30
Compuesto A (mg/kg) BAF-312 (mg/kg)
FIG 1-C
l/R
l/R Compuesto A
SIMULADA Vehículo 3mg/kg
Córtex
Ċ
FIG 2
FIG 3-A
140
FIG 3-B- Administración oral única
100
FIG 3-D
FIG 4
FIG 5-A
Tiempo (horas)
FIG 5-B
Tiempo (días)
FIG 6-A FIG 6-B
FIG 7
1a estimulación con
10nM 100nM 1pM Esfingosina-1-fosfato
(2a estimulación)
FIG 8-A
[esfingosina-1-fosfato]
2a estimulación en Ig [ ]/M
FIG 8-B
12 Preincubación con:
Esfingosina-1-Fosfato
[2a estimulación en M]
FIG 9-A
lavado 1 hora lavado 3 horas
FIG 11
9 -i B Simulada (n=4-6)
CTRL 0,5 1 2 4 6 16 24 48
Tiem po (horas)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20130306417 EP2862574A1 (en) | 2013-10-15 | 2013-10-15 | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4 d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury |
| PCT/EP2014/072078 WO2015055694A1 (en) | 2013-10-15 | 2014-10-15 | 4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2898403T3 true ES2898403T3 (es) | 2022-03-07 |
Family
ID=49488539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14784452T Active ES2898403T3 (es) | 2013-10-15 | 2014-10-15 | Acido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético para su uso en la prevención o tratamiento de la lesión renal aguda |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9782411B2 (es) |
| EP (2) | EP2862574A1 (es) |
| JP (1) | JP6458016B2 (es) |
| KR (1) | KR102348608B1 (es) |
| CN (1) | CN105658220B (es) |
| AR (1) | AR098028A1 (es) |
| AU (1) | AU2014336254B9 (es) |
| BR (1) | BR112016007669B1 (es) |
| CA (1) | CA2926211C (es) |
| CL (1) | CL2016000724A1 (es) |
| CR (1) | CR20160172A (es) |
| DK (1) | DK3057591T3 (es) |
| EA (1) | EA032012B1 (es) |
| ES (1) | ES2898403T3 (es) |
| FI (1) | FI3057591T3 (es) |
| IL (2) | IL244686B (es) |
| MA (1) | MA39032B2 (es) |
| MX (1) | MX383252B (es) |
| PH (1) | PH12016500563A1 (es) |
| PT (1) | PT3057591T (es) |
| SG (1) | SG11201602263TA (es) |
| TN (1) | TN2016000110A1 (es) |
| TW (1) | TWI685340B (es) |
| WO (1) | WO2015055694A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2859487T3 (es) * | 2016-10-05 | 2021-10-04 | Mitobridge Inc | Métodos para tratar las lesiones renales agudas |
| CN106905348B (zh) * | 2017-02-13 | 2018-12-04 | 牡丹江医学院 | 一种预防和治疗急性肾损伤的药物及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10033353A1 (de) | 2000-07-08 | 2002-01-24 | Aventis Pharma Gmbh | Breit einsetzbares Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von G-Protein gekoppelten Rezeptoren |
| MY150088A (en) | 2003-05-19 | 2013-11-29 | Irm Llc | Immunosuppressant compounds and compositions |
| USRE43728E1 (en) | 2003-11-21 | 2012-10-09 | Actelion Pharmaceuticals Ltd. | Thiazolidin-4-one derivatives |
| PT2523962E (pt) * | 2010-01-14 | 2014-02-06 | Sanofi Sa | Derivados de ácidos carboxílicos com um anel oxazolopirimidina substituído em 2,5 |
-
2013
- 2013-10-15 EP EP20130306417 patent/EP2862574A1/en not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-10-15 TW TW103135715A patent/TWI685340B/zh active
- 2014-10-15 EA EA201690762A patent/EA032012B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-10-15 SG SG11201602263TA patent/SG11201602263TA/en unknown
- 2014-10-15 FI FIEP14784452.6T patent/FI3057591T3/fi active
- 2014-10-15 MA MA39032A patent/MA39032B2/fr unknown
- 2014-10-15 DK DK14784452.6T patent/DK3057591T3/da active
- 2014-10-15 EP EP14784452.6A patent/EP3057591B1/en active Active
- 2014-10-15 MX MX2016004778A patent/MX383252B/es unknown
- 2014-10-15 AU AU2014336254A patent/AU2014336254B9/en active Active
- 2014-10-15 US US15/027,964 patent/US9782411B2/en active Active
- 2014-10-15 WO PCT/EP2014/072078 patent/WO2015055694A1/en not_active Ceased
- 2014-10-15 PT PT147844526T patent/PT3057591T/pt unknown
- 2014-10-15 BR BR112016007669-9A patent/BR112016007669B1/pt active IP Right Grant
- 2014-10-15 CA CA2926211A patent/CA2926211C/en active Active
- 2014-10-15 TN TN2016000110A patent/TN2016000110A1/en unknown
- 2014-10-15 KR KR1020167011272A patent/KR102348608B1/ko active Active
- 2014-10-15 CN CN201480056551.8A patent/CN105658220B/zh active Active
- 2014-10-15 ES ES14784452T patent/ES2898403T3/es active Active
- 2014-10-15 AR ARP140103825A patent/AR098028A1/es unknown
- 2014-10-15 JP JP2016521603A patent/JP6458016B2/ja active Active
-
2016
- 2016-03-21 IL IL244686A patent/IL244686B/en active IP Right Grant
- 2016-03-28 PH PH12016500563A patent/PH12016500563A1/en unknown
- 2016-03-29 CL CL2016000724A patent/CL2016000724A1/es unknown
- 2016-04-14 CR CR20160172A patent/CR20160172A/es unknown
-
2021
- 2021-04-06 IL IL282097A patent/IL282097A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Acin‐Perez et al. | Inhibition of ATP synthase reverse activity restores energy homeostasis in mitochondrial pathologies | |
| Clark et al. | Selective activation of microglia facilitates synaptic strength | |
| Sandri et al. | Signalling pathways regulating muscle mass in ageing skeletal muscle. The role of the IGF1-Akt-mTOR-FoxO pathway | |
| Mickle et al. | Induction of thermal and mechanical hypersensitivity by parathyroid hormone–related peptide through upregulation of Trpv1 function and trafficking | |
| Miller et al. | Rapid Report: Acute hypoxia occludes hTREK‐1 modulation: re‐evaluation of the potential role of tandem P domain K+ channels in central neuroprotection | |
| Liu et al. | Actin-related protein 2/3 complex plays a critical role in the aquaporin-2 exocytotic pathway | |
| ES2898403T3 (es) | Acido {4-[5-(3-cloro-fenoxi)-oxazolo[5,4-D]pirimidin-2-il]-2,6-dimetil-fenoxi} acético para su uso en la prevención o tratamiento de la lesión renal aguda | |
| Moheimani et al. | P2Y12 receptor: platelet thrombus formation and medical interventions | |
| Pfleger et al. | Detection of caveolin-3/caveolin-1/P2X7R complexes in mice atrial cardiomyocytes in vivo and in vitro | |
| Bessa-Gonçalves et al. | Blockage of the adenosine A2B receptor prevents cardiac fibroblasts overgrowth in rats with pulmonary arterial hypertension | |
| AU2014336254A1 (en) | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury | |
| Kashihara et al. | β2-Adrenergic and M2-muscarinic receptors decrease basal t-tubular L-type Ca2+ channel activity and suppress ventricular contractility in heart failure | |
| NZ719089B2 (en) | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury | |
| HK1225611B (en) | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4-d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury | |
| Podyacheva et al. | Biocompatibility of Different Nicotinamide Riboside Doses Administered Intravenously to Rats | |
| Zampieri et al. | The ERG1 Potassium Channel is More Abundant in Skeletal Muscle from Cachectic than Healthy Humans | |
| Bessa‑Gonçalves et al. | Blockage of the adenosine A | |
| Zhou | PMP22 Regulates Lipid Metabolism and Cholesterol Trafficking: The Implication for Hereditary Peripheral Neuropathies | |
| Ganapathi | Regulation of HERG potassium channels: implications of gating modification for cancer therapy | |
| Laprano | Metabolic alterations in a murine model of Barth syndrome | |
| Abel et al. | The α7β1 Integrin Accelerates Fiber Hypertrophy and 2 Myogenesis Following a Single Bout of Eccentric Exercise 3 | |
| de Oliveira | The molecular mechanisms of autosomal dominant polycystic kidney disease | |
| O'donnell | Glutamate transport affects mitochondria and calcium signaling in astrocytic processes under normal and pathological conditions | |
| Huangl et al. | ONTOGENY OF EXCITATION-CONTRACTION COUPLING IN THE MAMMALIAN HEART | |
| Kupittayanant | Characterization of sarcolemmal calcium fluxes in single cardiac myocytes |