EP0551460B2 - Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv - Google Patents

Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv Download PDF

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EP0551460B2
EP0551460B2 EP92913343A EP92913343A EP0551460B2 EP 0551460 B2 EP0551460 B2 EP 0551460B2 EP 92913343 A EP92913343 A EP 92913343A EP 92913343 A EP92913343 A EP 92913343A EP 0551460 B2 EP0551460 B2 EP 0551460B2
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EP
European Patent Office
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seq
peptide
hcv
antigens
sequence
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EP92913343A
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EP0551460B1 (de
EP0551460A1 (de
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Christoph Seidel
Gertraud Ehrlich-Weinreich
Hubert Bayer
Ursula-Henrike Wienhues
Günther-Gerhard JUNG
Hans Georg Ihlenfeldt
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Roche Diagnostics GmbH
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Roche Diagnostics GmbH
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to new HCV peptide antigens, a method for producing these peptide antigens, and a Method for determining HCV using the peptide antigens.
  • NANB hepatitis The occurrence of viral hepatitis in the absence of serological markers from previously known hepatotropic ones Agents (e.g. hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis ⁇ virus, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus) referred to as Non-A, Non-B hepatitis (NANB hepatitis).
  • NANB hepatitis is again divided into parenteral and sporadically transmitted non-A, non-B hepatitis and enterally transmitted non-A, non-B hepatitis.
  • HCV hepatitis C virus isolated (Choo Q.-L. et. al. Science 244 (1989) 359-362 and Kuo, G. et. al. Science 244 (1989) 362-364).
  • HCV is a major cause of NANB hepatitis worldwide and is caused by contaminated blood or blood products, Blood transfers or through close personal contact.
  • the amino acid sequence of the HCV virus proteins is from EP-A 0 318 216, EP-A 0 363 025, EPA 388 232 and EP-A 0 396 748.
  • the HCV genome is 10.862 nt in length.
  • the resulting from translation Proteins have a total length of approx. 3000 amino acids.
  • the proteins can be broken down into structural proteins (envelope and Divide core proteins) and non-structural proteins (NS1 - NS5).
  • HCV is expediently determined in that antibodies against in Body fluids HCV are detected. Binding partners are therefore used for such immunological tests needed for anti-HCV antibodies.
  • the post-published EP-A-0 468 527 discloses HCV peptide antigens from the env and NS range.
  • the peptides have a length of 22 to 121 amino acids.
  • Post-published EP-A-0 442 394 discloses short HCV peptide antigens from the NS4 range.
  • the invention Peptides according to SEQ ID NO: 1-10 and SEQ ID NO: 11, as well as partial sequences thereof, are not disclosed.
  • the post-published EP-A-0 445 801 also discloses short HCV peptide antigens which are not associated with any of the invention Peptide antigens according to SEQ ID NO: 1-32 have homology.
  • Post-published EP-A-0 464 287 discloses the HCV nucleotide sequence bp 333 to 9362, as well as those thereof deduced amino acid sequence. Short preferred partial sequences according to the sequence protocols SEQ ID NO: 1-11 of the present application are not disclosed.
  • Post-published EP-A-0 484 787 discloses short peptide antigens from the HCV NS4 range.
  • the object of the present invention is therefore to provide peptide antigens which are specific for Anti-HCV antibodies are and are suitable for immunological tests for anti-HCV antibodies.
  • HCV peptide antigens with the amino acid sequences in accordance with the sequence protocols SEQ ID NO: 1-10. Furthermore, the problem is solved by the HCV peptide antigens with the amino acid sequence according to the sequence listing SEQ ID NO: 11 or partial sequences thereof with a length of at least 4 amino acids.
  • the peptide antigens of the sequences are suitable or peptide antigens which are partial sequences of these peptide antigens of at least four, preferably of at least seven, amino acids in length.
  • Suitable partial sequences are shown in the sequence listing and with letter / number combinations (e.g. B. 6 a, 2 b).
  • Partial sequences with a maximum length of 9 amino acids are particularly preferred. In particular are this is the sequences 6b, 6d, 6e, 2e, 2f, 2d, 2g, 4a.
  • the peptide antigens with the sequences 1-3 are in the C 100-3 range of the HCV proteins and contain the peptide antigens with the sequences 4-8, 10-13 in the env / core region of the HCV proteins.
  • the peptide antigens according to the invention with the sequences 1-8, 10-13 and the peptide antigen of the sequence 9 are by the sequence protocols SEQ ID NO: 1-32.
  • Anti-HCV antibody detection is carried out according to the methods familiar to the person skilled in the art.
  • Another object of the invention is therefore a method for the determination of HCV antibodies, which thereby is characterized in that the sample with a combination of at least two peptide antigens from the group of the sequences with SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 25, 29 - 32) or peptide antigens, the partial sequences different this SEQ ID NOS. are at least four, preferably at least 7, amino acids in length, where at least one sin peptide antigen is selected from the group of the sequences with the SEQ ID NO: 1, 2, 11, incubated and under conditions that allow the formation of an antibody-antigen complex, the amount of the peptide antigen-bound anti-HCV antibody is determined.
  • a combination of at least two of the peptide antigens or partial sequences according to the invention of it used. It is particularly preferred that the peptide antigens of the sequences 1-3 (SEQ ID NO: 1- 11) of which with at least one peptide antigen from the group of the sequences 4-13 (SEQ ID NO: 12-32) or To combine partial sequences of it.
  • Suitable partial sequences of sequence 9 are:
  • the antigens can be combined, for example, by using several individual peptide antigens or that peptide antigens are covalent, expediently via an amino acid bridge that differs from natural amino acid sequence sequences occurring in HCV proteins or a peptide linker are bound.
  • the antigens are preferably used in approximately the same molar amounts.
  • the combination of the antigens with the sequences 11, 12, 8a is particularly suitable for the detection of sera from patients in whom an HCV infection has healed (convalescence sera)
  • the antigens are preferred individually, without covalent binding to one another, or covalently bound to one another using a peptide linker used.
  • heterogeneous immunoassays Because of the increased sensitivity that is necessary with the HCV infection parameter, are preferred used to detect heterogeneous immunoassays. These heterogeneous tests allow washing steps that significantly reduce the measurement signal background, which increases the sensitivity.
  • the determination can be carried out by a radio immunoassay, enzyme immunoassay or by immunofluorescence respectively.
  • the peptide antigen is usually immobilized for this purpose.
  • the sample which is based on anti-HCV antibodies is to be examined, is added and the antibodies bound to the antigen via a labeled Anti-human immunoglobulin antibody determined.
  • Immobilization of the peptide antigen according to the invention can be adsorbent, covalent or via a biological binding pair such as biotin / streptavidin, antibody / antigen, or Sugar / lectin done.
  • the peptide antigen is covalently bound to this partner.
  • the peptide antigens according to the invention can preferably be familiar to those skilled in the art for immunoassays Methods, for example on beads, plastic tubes or microtiter plates (preferably polystyrene or Copolymers of polystyrene). This is preferably done in that the peptide antigen is non-specific is adsorbed on the surface or covalently bound to functionalized or activated surfaces.
  • the nonspecific adsorption can be improved by combining the peptide antigen with a protein Linked conjugate and this conjugate used for adsorption (see e.g. EP-A 0 269 092).
  • the bond can too via an immobilized antibody.
  • the peptide antigen should be changed so that the epitope is not blocked by the binding of the antibody e.g. by forming a peptide-protein conjugate.
  • the peptide antigen is preferably conjugated to the binding partner via a spacer.
  • This spacer Expediently contains 10-50, preferably 10-30 atoms and is also preferably an essentially linear one Molecule. Examples include spacers made from alkyl, polyether or polyamide chains. In a particularly preferred one
  • One embodiment is a peptide antigen 4-9 amino acids in length through a linear spacer 10-30 Atoms bound to the carrier. If a spacer of amino acids is to be used, this is expedient from amino acids that do not follow the sequence in the immediate vicinity of the peptide antigen in the HCV gene correspond.
  • the peptide antigen according to the invention is covalently bound to biotin, the immobilization takes place via an avidin / streptavidin solid phase.
  • Determination methods in which the detection does not use a labeled antibody, but via a labeled, further peptide antigen sequences 1-13 or partial sequences thereof.
  • the peptide antigens according to the invention can be prepared by the methods familiar to the person skilled in the art Peptide synthesis possible.
  • Another object of the invention is therefore a method for producing the invention Peptide antigen which consists in that the amino acid forming the C-terminal end is attached to a Carrier is bound, the peptide antigen is gradually built up from the C-terminal end and then from the carrier is split off.
  • an amino acid is converted to an insoluble, easily filterable one, for example via its carboxy group Polymer linked, and then the peptide chain gradually built up from the C-terminal end.
  • an N-protected amino acid is reacted with a reactive grouping of the synthetic resin.
  • the N ⁇ protecting group is removed from the amino acid covalently anchored to the carrier particle and the resulting one Aminoacyl polymer reacted with the next N-protected amino acid.
  • the Na protecting group is removed and the resulting aminoacyl polymer with the next N-protected Amino acid implemented.
  • the peptide antigens according to the invention can be prepared according to Merrifield, JACS 85 (1964) 2146 become. Any biotinylation that may be required can be carried out, for example, according to PNAS USA 80 (1983) 4045.
  • a preferred biotinylating agent for this is biotinylaminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester.
  • a preferred method for the production of biotinylated peptide antigens is the introduction of the biotin residue at the N-terminus during solid phase synthesis of the peptide antigen.
  • This method is preferably used when the peptide antigen contains several ⁇ -lysine amino groups, that should not be biotinylated. This is the case, for example, if N- ⁇ -Fmoc-N- ⁇ -biotinyl-aminocaproyl) lysine, N- ⁇ -Fmoc-N- ⁇ -biotinyl lysine or, in the case of biotinylation of the N-terminal amino acids, biotin, biotinylaminocaproic acid or dimethoxytritylbiotin with an activating reagent such as dicyclohexylcarbodiimide or as an active tester.
  • an activating reagent such as dicyclohexylcarbodiimide or as an active tester.
  • a detection antibody is used, for example against the Fc part of human IgG is immobilized.
  • a monoclonal antibody is preferably used for this.
  • the peptide antigen is then in solution.
  • the antibody (analyte) to be detected and all other antibodies the sample liquid is bound by the wall antibody.
  • the bound antibody can then be the analyte bind with a suitable detection system, e.g. competitive with a peptide antigen-enzyme conjugate can be demonstrated.
  • Another object of the invention is therefore a method for producing antibodies, which thereby is characterized in that a mammal with a peptide according to the invention, which is optionally attached to a carrier is bound, is immunized and the antibodies are prepared by known methods e.g. obtained from the serum or spleen become.
  • B lymphocytes of the immunized animals are transformed in the presence of Agents fused to an appropriate cell line, the cell line that produces the desired antibodies, cloned and cultured and the monoclonal antibodies obtained from the cells or the culture supernatant.
  • Another object of the invention is therefore a method for the determination of HCV viruses, which is characterized in that the sample with a antibodies according to the invention are incubated under conditions which permit antigen-antibody complex formation, and the amount of the antibody-antigen complex formed is determined.
  • Another object of the invention is a method for producing vaccines using the Peptide antigens according to the invention and a vaccine for the treatment of HCV infections, containing as an immunogen an optionally carrier-bound peptide antigen of sequences 1-8, 10-13 or partial sequences thereof or at least two peptide antigens of sequences 1-13 or partial sequences thereof in a pharmacologically effective Dose and in a pharmaceutically acceptable formulation.
  • peptide antigens are first lyophilized and then suspended, optionally with the addition of auxiliaries.
  • Vaccination with the vaccine or vaccine combinations according to the invention can be carried out by those familiar to the person skilled in the art Methods are used, for example intradermally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously and intranasally.
  • the vaccine can be used, for example, in physiological saline be suspended.
  • the vaccine for example in the form of a Sprays or an aqueous solution can be used.
  • administration it is often necessary temporarily protect the immunogens against inactivation, for example against proteolytic enzymes in the Oral cavity or in the stomach.
  • Such temporary protection can be achieved, for example, by encapsulating the immunogens respectively.
  • This encapsulation can, for example, be covered with a protective agent (microencapsulation) or when embedding a large number of immunogens according to the invention in a protective carrier (macroencapsulation) respectively.
  • the encapsulation material can be semi-permeable or when introduced into human or animal Bodies become semi-permeable. Usually a biodegradable substance is used as the carrier for the encapsulation used.
  • sequence SEQ ID NO 1 1 2 2 2a 3 2 B 4 2c 5 2d 6 2e 7 2f 8th 2 g 9 2h 10 3 11 4 12 4a 13 4b 14 5 15 6 16 6a 17 6b 18 6c 19 6d 20 6e 21 7 22 8th 23 8 a 24 9 25 9 a 26 9b 27 9c 28 10 29 11 30 12 31 13 32
  • the peptide was prepared using Fmoc (fluorenyloxycarbonyl) solid phase synthesis. The reactions were performed on a Labortec (Switzerland) SP 640 peptide synthesizer. The coupling reactions were regarding Fmoc-amino acid derivative with 2.4 equivalents of dicyclohexylcarbodiimide and 2.2 equivalents of N-hydroxybenzotriazole performed during 90 minutes. Dimethylformamide was used as the reaction medium. The Fmoc group was split off with 20% piperids in DMF in 10 and 20 minutes.
  • the peptide was loaded on 5 g Wang resin (polystyrene / 1% divinylbenzene) of 0.50 mmol / g (JACS 95 (1973) 1328). After the synthesis, the degree of loading was still 0.39 mmol / g.
  • the release of the peptide was treated with 200 ml of trifluoroacetic acid, 200 ml of dichloromethane, 10 ml of ethanedithiol, 10 ml of m-cresol, 5 ml of ethyl methyl sulfide and 5 ml of water in 30 minutes at room temperature.
  • the separation solution was concentrated several times with toluene, then precipitated the peptide with diethyl ether.
  • the raw material was passed through a Sephadex G 10 column cleaned. After lyophilization, 3.2 g of material with a purity of 42% (RP-HPLC) were obtained. To the material To bring the final purity of> 95%, 400 mg of peptide were on a preparative RP-HPLC column (40mmx250mm) filled with C18 material (5 microns, 300 angstroms) and a water / trifluoroacetic acid, acetonitrile / trifluoroacetic acid gradient cleaned. After lyophilization, 118 mg of 96.5% (HPLC) white material fell on. The identity of the material was checked using FAB-MS.
  • reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature under argon with constant control analytical RP-HPLC. If ⁇ 5% educt was present, the reaction was made directly to a preparative RP-HPLC column and the product material using a 0.1% trifluoroacetic acid / water to 0.1% trifluoroacetic acid / Acetonitrile gradient (gradient: 0% to 100% in 90 minutes) cleaned. The product material was through Concentrate and lyophilize the product fractions. The yields were between 40% and 90%.
  • HCV antibodies are determined in a 2-step sandwich immunoassay.
  • the reagents are used for detection with the following
  • Serum 1 was negative in the Ortho HCV antibody ELISA test system from ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC. however positive due to the clinical picture.
  • Sera 2-5 were tested by Ortho Laboratories, sera 6 and 7 with the ABBOTT HCV EIA, Cat.No. 3 A53-24, ABBOTT LABORATORIES INC. identified as positive.
  • the peptide antigens 1-6 were solid-phase biotinylated with dimethoxytrityl-biotin on the ⁇ -amino group of an additional L-terminally introduced lysine.
  • the peptide antigen mixtures 1 + 4 and 3 + 6 were used in a molar mixing ratio of 1: 1.
  • Serum (1:10 diluted in 50 ⁇ l incubation buffer) is added to each well (well) of a microtiter plate coated with streptavidin and 100 ul reagent 1 added. It is incubated for one hour at room temperature and then washed five times with 200 ul washing solution. 150 ul reagent 2 are added, one hour at room temperature incubated and washed three times with 200 ul washing solution. 150 ⁇ l of color reagent are added, one Incubated for 1 hour at room temperature and the absorbance measured photometrically at 420 nm.
  • the peptide mixtures each contained 50 ng of the individual peptides.
  • the cutoff for a positive signal in the immunoassay as example 3 is defined as the mean absorbance at 420 nm plus 2 standard deviations of a collective of 6 negative control sera.
  • the samples are diluted 1: 100 with incubation buffer).
  • TYPE OF SEQUENCE peptide SEQUENCE LENGTH: 15 amino acids
  • TYPE OF SEQUENCE peptide SEQUENCE LENGTH: 18 amino acids

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Description

Die Erfindung betrifft neue HCV Peptidantigene, ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptidantigene, sowie ein Verfahren zur Bestimmung von HCV unter Verwendung der Peptidantigene.
Das Vorkommen von Virushepatitis in Abwesenheit serologischer Marker von bisher bekannten hepatotropen Agenzien (z.B. Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-Δ-Virus, Cytomegalie-Virus und Epstein-Barr-Virus) wird als Non-A, Non-B-Hepatitis (NANB-Hepatitis) bezeichnet. NANB-Hepatitis wird wiederum unterteilt in parenteral und sporadisch übertragene Non-A, Non-B-Hepatitis und enteral übertragene Non-A, Non-B-Hepatitis. Für die parenteral und sporadisch übertragene NANB-Hepatitis wurde vor kurzem das ursächliche Agenz, das Hepatitis-C-Virus (HCV) isoliert (Choo Q.-L. et. al. Science 244 (1989) 359 - 362 und Kuo, G. et. al. Science 244 (1989) 362 - 364).
HCV ist weltweit eine wichtige Ursache von NANB-Hepatitis und wird durch kontaminiertes Blut oder Blutprodukte, Blutübertragungen oder durch engen persönlichen Kontakt übertragen.
Die Aminosäuresequenz der HCV-Virusproteine ist aus EP-A 0 318 216, EP-A 0 363 025, EPA 388 232 und EP-A 0 396 748 bekannt. Das Genom des HCV hat eine Länge von 10,862 nt. Die durch Translation hervorgehenden Proteine besitzen eine Gesamtlänge von ca. 3000 Aminosäuren. Die Proteine lassen sich in Strukturproteine (Hülleund Kernproteine) und Nicht-Strukturproteine (NS1 - NS5) einteilen.
Die Bestimmung von HCV erfolgt zweckmäßig dadurch, daß durch immunologische Tests Antikörper gegen in Körperflüssigkeiten HCV nachgewiesen werden. Für derartige immunologische Tests werden deshalb Bindepartner für Anti-HCV-Antikörper benötigt.
So ist es bekannt, in immunologischen Tests beispielsweise das nicht-strukturelle C 100-3-HCV-Protein als Bindepartner zu verwenden (Tests von ABBOTT LABORATORIES, USA und ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC., USA; Science 244 (1989) 359 - 364; Van der Poel C. L. et. al. Lancet 337(1991)317; Alter H.J. J. Gastroent. Hepatol. (suppl.) 1990, 78).
Nachteil dieser Tests ist, daß als Antigen ein rekombinantes Protein verwendet wird. Proteine sind wegen ihrer Denaturierungsanfälligkeit und damit verringerter Löslichkeit und Funktion in diagnostischen Tests schwer zu handhaben. Auch die Größe des Meßsignals ist aufgrund der niedrigen Epitopdichte auf einem Protein geringer als bei einem Test, bei dem ein kurzkettiges Peptidantigen als Bindepartner des Antikörpers verwendet wird. Weiter können bei Verwendung von Proteinen oder langkettigen Peptiden als Antigene in einem immunologischen Test vermehrt Kreuzreaktivitäten und unspezifische Bindungen von Antikörpern auftreten. Reaktionen mit Proteinen sind zudem oft diffusionskontrolliert, was den erwünschten kurzen Zeiten für immunologische Tests entgegensteht. Außerdem ist die Herstellung von für die Diagnostik einsetzbarem Protein in ausreichender Menge und Qualität zeitraubend und kostenintensiv. Peptide sind durch Synthese leicht zugänglich und sind definierte Moleküle.
Es ist demzufolge vorteilhaft, in einem immunologischen Test auf Anti-HCV-Antikörper möglichst kurzkettige Peptidantigene, die nur Ausschnitte der gesamten Proteine darstellen, zu verwenden. Ein derartiges immunologisches Verfahren ist von Okamoto (Japan J. Exp. Met. 60 (1990) 223 - 234) beschrieben. Es hat sich jedoch gezeigt, daß das dort beschriebene kurzkettige Peptidantigen (Sequenz 9), welches aus der core-Region stammt, nicht ausreichend sensitiv für HCV ist.
Die nachveröffentlichte EP-A-0 468 527 offenbart HCV-Peptidantigene aus dem env- und NS-Bereich. Die Peptide besitzen eine Länge von 22 bis 121 Aminosäuren.
Die nachveröffentlichte EP-A-0 442 394 offenbart kurze HCV-Peptidantigene aus dem NS4-Bereich. Die erfindungsgemäßen Peptide gemäß SEQ ID NO: 1-10 sowie SEQ ID NO: 11, sowie Teilsequenzen hiervon werden nicht offenbart.
Die nachveröffentlichte EP-A-0 445 801 offenbart ebenfalls kurze HCV-Peptidantigene, die mit keiner der erfindungsgemäßen Peptidantigene gemäß SEQ ID NO: 1-32 eine Homologie besitzen.
Die nachveröffentlichte EP-A-0 464 287 offenbart die HCV-Nukleotidsequenz bp 333 bis 9362, sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Kurze bevorzugte Teilsequenzen entsprechend den Sequenzprotokollen SEQ ID NO: 1-11 der vorliegenden Anmeldung werden nicht offenbart.
Die nachveröffentlichte EP-A-0 484 787 offenbart kurze Peptidantigene aus dem HCV NS4-Bereich. Die HCV-Peptidantigene entsprechend den Sequenzprotokollen SEQ ID NO: 1-11 und Teilsequenzen aus SEQ ID NO: 11 werden nicht offenbart.
Die nachveröffentlichte EP-A-0 489 968 offenbart Peptide aus dem HCV NS4-Bereich. Keines der Peptide entspricht den erfindungsgemäßen Peptiden SEQ ID NO: 1-11 oder Teilsequenzen aus SEQ ID NO: 11.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, Peptidantigene zur Verfugung zu stellen, die spezifisch für Anti-HCV-Antikörper sind und für immunologische Tests auf Anti-HCV-Antikörper geeignet sind.
Die Aufgabe wird gelöst durch HCV-Peptidantigene mit dem Aminosäuresequenzen entsprechend den Sequenzprotokollen SEQ ID NO: 1-10. Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch die HCV-Peptidantigene mit der Aminosäuresequenz entsprechend dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 11 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 4 Aminosäuren Länge.
Geeignet sind die Peptidantigene der Sequenzen
Figure 00020001
oder Peptidantigene, die Teilsequenzen dieser Peptidantigene von mindestens vier, vorzugsweise von mindestens sieben, Aminosäuren Länge darstellen.
Geeignete Teilsequenzen sind in den Sequenzprotokollen dargestellt und mit Buchstaben/Zahl-Kombinationen (z. B. 6 a, 2 b) bezeichnet.
Besonders bevorzugte Teilsequenzen sind:
aus Sequenz 2:
Figure 00020002
HisLeuProTyrIleGlu (Sequenz 2d)
Figure 00020003
Figure 00030001
aus Sequenz 4:
Figure 00030002
aus Sequenz 6:
Figure 00030003
Besonders bevorzugt werden Teilsequenzen, deren Länge maximal 9 Aminosäuren beträgt. Insbesondere sind dies die Sequenzen 6b, 6d, 6e, 2e, 2f, 2d, 2g, 4a.
Die Peptidantigene mit den Sequenzen 1 - 3 (entspricht SEQ ID NO: 1 - 11), sind im C 100-3-Bereich der HCV-Proteine und die Peptidantigene mit den Sequenzen 4 - 8, 10 - 13 im env/core-Bereich der HCV-Proteine enthalten. Die erfindungsgemäßen Peptidantigene mit den Sequenzen 1 - 8, 10 - 13 und das Peptidantigen der Sequenz 9 (ArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGluArgSerGln-ProArgGlyArgArgGlnProIleProLy-sAlaArgArgProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpPro, Okamoto loc. cit) sind durch die Sequenzprotokolle SEQ ID NO: 1 - 32 beschrieben.
Die Durchführung eines Anti-HCV-Antikörper-Nachweis erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Bestimmung von HCV-Antikörpern, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probe mit einer Kombination von mindestens zwei Peptidantigenen aus der Gruppe der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 25, 29 - 32) oder Peptid-antigenen, die Teilsequenzen unterschiedlicher dieser SEQ ID NOS. von mindestens vier, vorzugsweise von mindestens 7, Aminosäuren Länge darstellen, wobei jeweils mindestens sin Peptidantigen aus der Gruppe der Sequenzen mit der SEQ ID NO: 1,2, 11 ausgewählt wird, inkubiert und unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigenkomplexes ermöglichen, die Menge der an das Peptidantigen gebundenen Anti-HCV-Antikörper bestimmt wird.
Erfindungsgemäß wird eine Kombination von mindestens zwei der erfindungsgemäßen Peptidantigene oder Teilsequenzen davon verwendet. Besonders bevorzugt ist es, die Peptidantigene der Sequenzen 1 - 3 (SEQ ID NO: 1 - 11) davon mit mindestens einem Peptidantigen aus der Gruppe der Sequenzen 4 - 13 (SEQ ID NO: 12 - 32) oder Teilsequenzen davon zu kombinieren.
Geeignete Teilsequenzen von Sequenz 9 sind:
Figure 00040001
Die Kombination der Antigene kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß mehrere einzelne Peptidantigene verwendet werden oder daß Peptidantigene kovalent, zweckmäßig über eine Aminosäurenbrücke, die sich von natürlicherweise in HCV-Proteinen vorkommenden Aminosäuren-Sequenzfolgen unterscheidet oder einen Peptid-Linker, aneinander gebunden sind.
Besonders bevorzugt sind Kombinationen der Antigene:
  • Sequenz 2b, 4 und 6
  • Sequenz 2b, 2c, 4 und 6
  • Sequenz 2a, 2b, 2c, 4 und 6
  • Sequenz 2a, 2b, 2c, 4, 6, 9a und 9b
  • Sequenz 2a, 2b, 4, 6, 9a und 3
  • Sequenz 2a, 2b, 4, 6 und 9a
  • Sequenz 2e, 2g, 4a, 6d, 6e
  • Sequenz 2d, 2f, 4a, 6c, 9c
    • In Kombinationen werden die Antigene bevorzugt in etwa gleichen molaren Mengen verwendet.
    Die Kombination der Antigene mit den Sequenzen 11, 12, 8a ist besonders geeignet zur Erkennung von Seren von Patienten, bei denen eine HCV-Infektion ausgeheilt ist (Rekonvaleszenzseren) Vorzugsweise werden die Antigene einzeln, ohne kovalente Bindung aneinander, oder kovalent aneinander gebunden unter Verwendung eines Peptid-Linkers eingesetzt.
    Auf Grund der erhöhten Empfindlichkeit, die bei dem Infektionsparameter HCV notwendig ist, werden vorzugsweise zum Nachweis heterogene Immunoassays verwendet. Diese heterogenen Tests erlauben Waschschritte, die den Meßsignal-Hintergrund erheblich reduzieren wodurch die Empfindlichkeit gesteigert wird.
    Beispielsweise kann die Bestimmung durch einen Radio-lmmunoassay, Enzym-Immunoassay oder durch Immunfloureszenz erfolgen. Üblicherweise wird hierzu das Peptidantigen immobilisiert. Die Probe, welche auf Anti-HCV-Antikörper untersucht werden soll, wird zugegeben und die an das Antigen gebundenen Antikörper über einen markierten Anti-Human-Immunglobulin-Antikörper bestimmt. Die Immobilisierung des erfindungsgemäßen Peptidantigens kann adsorbtiv, kovalent oder über ein biologisches Bindungspaar wie Biotin/Streptavidin, Antikörper/Antigen, oder Zucker/Lektin erfolgen. Dabei wird das Peptidantigen an diesen Partner kovalent gebunden.
    Die erfindungsgemäßen Peptidantigene können für Immunoassays vorzugsweise nach dem Fachmann geläufigen Methoden, beispielsweise an Kugeln (beads), Kunststoffröhrchen oder Mikrotiterplatten (bevorzugt Polystyrol oder Copolymere von Polystyrol), immobilisiert werden. Dies erfolgt vorzugsweise dadurch, daß das Peptidantigen unspezifisch an der Oberfläche adsorbiert oder kovalent an funktionalisierte oder aktivierte Oberflächen gebunden wird. Die unspezifische Adsorption kann dadurch verbessert werden, daß man das Peptidantigen mit einem Protein zu einem Konjugat verknüpft und dieses Konjugat zur Adsorption verwendet (vgl. z.B. EP-A 0 269 092). Die Bindung kann auch über einen immobilisierten Antikörper erfolgen. Dazu sollte das Peptidantigen so verändert werden, daß das Epitop nicht durch die Bindung des Antikörpers blockiert wird z.B. durch Bildung eines Peptid-Protein-Konjugats.
    Die Konjugation des Peptidantigens an den Bindungspartner erfolgt vorzugsweise über einen Spacer. Dieser Spacer enthält zweckmäßig 10 - 50, vorzugsweise 10 - 30 Atome und ist ebenfalls bevorzugt ein im wesentlichen lineares Molekül. Beispiele hierfür sind Spacer aus Alkyl-, Polyether- oder Polyamidketten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Peptidantigen einer Länge von 4 - 9 Aminosäuren über einen linearen Spacer von 10 - 30 Atomen an den Träger gebunden. Falls ein Spacer aus Aminosäuren verwendet werden soll, besteht dieser zweckmäßig aus Aminosäuren, die nicht der Sequenzfolge in unmittelbarer Umgebung des Peptidantigens im HCV-Gen entsprechen.
    In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Peptidantigen kovalent an Biotin gebunden, wobei die Immobilisierung über eine Avidin/Streptavidin-Festphase erfolgt.
    Ebenso geeignet sind Bestimmungsverfahren, bei denen die Detektion nicht über einen markierten Antikörper, sondern über ein markiertes, weiteres Peptidantigen Sequenzen 1 - 13 oder Teilsequenzen davon erfolgt.
    Die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptidantigene ist nach den dem Fachmann geläufigen Methoden zur Peptidsynthese möglich. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Peptidantigens, welches darin besteht, daß die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger gebunden wird, vom C-terminalen Ende das Peptidantigen schrittweise aufgebaut und anschließend vom Träger abgespalten wird.
    Im einzelnen wird dazu eine Aminosäure beispielsweise über ihre Carboxygruppe an ein unlösliches, leicht filtrierbares Polymer geknüpft, und dann vom C-terminalen Ende her die Peptidkette schrittweise aufgebaut. Zu diesem Zweck wird eine N-geschützte Aminosäure mit einer reaktiven Gruppierung des Kunstharzes zur Reaktion gebracht. Von der am Trägerpartikel kovalent verankerten Aminosäure wird die Nα-Schutzgruppe entfernt und das resultierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Von dem am Trägerharz kovalent gebundenen Dipeptid wird die Na-Schutzgruppe entfernt und das resultierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Alle überschüssigen Reagentien und Beiprodukte werden durch einfaches Filtrieren entfernt.Ist die gewünschte Peptidsequenz auf diese Weise hergestellt, wird die kovalente Bindung zwischen der C-terminalen Aminosäure und der Ankergruppierung des polymeren Trägers gespalten. Der unlösliche Träger wird durch einfache Filtration von dem nun in Lösung befindlichen Peptid entfernt. Das Peptid wird mittels chromatographischer Methoden gereinigt.
    Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Peptidantigene nach Merrifield, JACS 85(1964)2146 hergestellt werden. Eine gegebenenfalls erforderliche Biotinylierung kann beispielsweise nach PNAS USA 80 (1983) 4045 erfolgen. Ein bevorzugtes Biotinylierungsmittel hierfür ist Biotinylaminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester.
    Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von biotinylierten Peptidantigenen ist die Einführung des Biotinrestes am N-Terminus während einer Festphasensynthese des Peptidantigens.
    Dieses Verfahren wird bevorzugt dann verwendet, wenn das Peptidantigen mehrere ε-Lysin-Aminogruppen enthält, die nicht biotinyliert werden sollen. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn man N-α-Fmoc-N-ε-biotinyl-aminocaproyl)lysin, N-α-Fmoc-N-ε-Biotinyllysin oder bei Biotinylierung der N-terminalen Aminosäuren Biotin, Biotinylaminocapronsäure oder Dimethoxytritylbiotin mit einem Aktivierungsreagenz wie zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid oder als Aktivester einsetzt.
    In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nachweisantikörper der beispielsweise gegen den Fc-Teil von humanem IgG gerichtet ist, immobilisiert. Vorzugsweise wird hierzu ein monoklonaler Antikörper verwendet. Das Peptidantigen befindet sich dann in Lösung. Der nachzuweisende Antikörper (Analyt) und auch alle anderen Antikörper der Probenflüssigkeit werden vom Wandantikörper gebunden. Der gebundene Antikörper kann dann den Analyten binden, der mit einem geeigneten Nachweissystem, z.B. kompetitiv mit einem Peptidantigen-Enzymkonjugat nachgewiesen werden kann.
    Mit den erfindungsgemäßen Peptidantigenen ist es auch möglich, durch die dem Fachmann geläufigen Verfahren der Immunisierung Antikörper zu erhalten, mit denen das Virus selbst in einem immunologischen Test nachgewiesen werden kann.
    Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Säugetier mit einem erfindungsgemäßen Peptid, welches gegebenenfalls an einen Träger gebunden ist, immunisiert wird und die Antikörper nach bekannten Verfahren z.B. aus dem Serum oder der Milz gewonnen werden.
    In einer bevorzugten Ausführungsform werden B-Lymphozyten der immunisierten Tiere in Gegenwart von transformierenden Agenzien mit einer geeigneten Zellinie fusioniert, die Zellinie, welche die gewünschten Antikörper produziert, kloniert und kultiviert und aus den Zellen oder dem Kulturüberstand die monoklonalen Antikörper gewonnen.
    Mit diesem Antikörper ist es möglich, HCV-Viren direkt zu bestimmen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Bestimmung von HCV-Viren, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die eine Antigen-Antikörperkomplexbildung erlauben, inkubiert, und die Menge des gebildeten Antikörper-Antigenkomplexes bestimmt wird.
    Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptidantigene sowie ein Vakzin zur Behandlung von HCV-Infektionen, enthaltend als Immunogen ein gegebenenfalls trägergebundenes Peptidantigen der Sequenzen 1 - 8, 10 - 13 oder Teilsequenzen davon oder mindestens zwei Peptidantigene der Sequenzen 1 - 13 oder Teilsequenzen davon in einer pharmakologisch effektiven Dosis und in einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung.
    Die Herstellung dieser Impfstoffe kann nach den bekannten Methoden durchgeführt werden. Bevorzugt werden jedoch die Peptidantigene zunächst lyophilisiert und anschließend, ggf. unter Zusatz von Hilfsstoffen, suspendiert.
    Die Impfung mit dem erfindungsgemäßen Vakzin oder Vakzinkombinationen kann durch die dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen, beispielsweise intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan und intranasal.
    Zur intramuskulären oder subkutanen Gabe kann das Vakzin beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert sein. Zur intranasalen oder intraoccularen Applikation kann das Vakzin, beispielsweise in Form eines Sprays oder einer wäßrigen Lösung angewendet werden. Für lokale, beispielsweise orale Gabe ist es häufig erforderlich, die Immunogene zeitweise gegen Inaktivierung zu schützen, beispielsweise gegen proteolytische Enzyme in der Mundhöhle oder im Magen. Ein derartiger vorübergehender Schutz kann beispielsweise durch Verkapselung der Immunogene erfolgen. Diese Verkapselung kann beispielsweise durch Überziehen mit einem Schutzmittel (Mikroverkapselung) oder bei Einbettung einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Immunogenen in einen schützenden Träger (Makroverkapselung) erfolgen.
    Das Verkapselungsmaterial kann semipermiabel sein oder beim Einbringen in den menschlichen oder tierischen Körper semipermeabel werden. Üblicherweise wird für die Verkapselung eine biologisch abbaubare Substanz als Träger verwendet.
    Die nachfolgenden Beispiele und Sequenzprotokolle erläutern die Erfindung weiter.
    In den Sequenzprotokollen bedeuten:
    Sequenz SEQ ID NO
    1 1
    2 2
    2a 3
    2b 4
    2c 5
    2d 6
    2e 7
    2f 8
    2 g 9
    2h 10
    3 11
    4 12
    4a 13
    4b 14
    5 15
    6 16
    6a 17
    6b 18
    6c 19
    6d 20
    6e 21
    7 22
    8 23
    8 a 24
    9 25
    9 a 26
    9b 27
    9c 28
    10 29
    11 30
    12 31
    13 32
    Beispiel 1 Synthese von H-ProArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArgOH
    Das Peptid wurde mittels Fmoc(Fluorenyloxycarbonyl)-Festphasensynthese hergestellt. Die Reaktionen wurden an einem Labortec (Schweiz) SP 640 Peptidsynthesizer durchgeführt. Die Kupplungsreaktionen wurden bezüglich Fmoc-Aminosäure-Derivat mit 2.4 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 2.2 Äquivalenten N-Hydroxybenzotriazol während 90 Minuten durchgeführt. Als Reaktionsmedium kam Dimethylformamid zum Einsatz. Die Fmoc-Gruppe wurde mittels 20 % Piperiden in DMF in 10 und 20 Minuten abgespalten. 2.0 Äquivalente von den folgenden AminosäureDerivaten kamen zum Einsatz: Pro, Arg(mit PMC (Pentamethylchroman)-Schutzgruppe), Gly, Ser(mit tert.-Butyl-Schutzgruppe), Trp, Thr(mit tert.-Butyl-Schutzgruppe), Asp(mit tert.-Butylester-Schutzgruppe). Die Kupplungsreaktionen wurden mit der Hälfte der Reagentien wiederholt. Der Kupplungserfolg wurde mittels Kaiser-Test (Anal. Biochemistry 34(1970)595) geprüft, die Harzbeladung wurde mittels UV-Absorption der freigesetzten Fulven-Gruppe nach jeder Piperidin-Spaltung ermittelt. Das Peptid wurde an 5 g Wang-Harz (Polystyrol/1 % Divinylbenzol) mit einer Ladung von 0.50 mMol/g synthetisiert (JACS 95(1973)1328). Nach der Synthese betrug der Beladungsgrad noch 0.39 mMol/g.
    Die Freisetzung des Peptids wurde mit 200 ml Trifluoressigsäure, 200 ml Dichlormethan, 10 ml Ethandithiol, 10 ml m-Kresol, 5 ml Ethylmethylsulfid und 5 ml Wasser in 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Abspaltlösung wurde mehrmals mit Toluol eingeengt, dann das Peptid mit Diethylether gefällt.
    Zur Entfernung der Scavenger und anderer kleiner Moleküle wurde das Rohmaterial über eine Sephadex G 10-Säule gereinigt. Es wurden nach Lyophilisieren 3.2 g Material einer Reinheit von 42 % (RP-HPLC) erhalten. Um das Material auf die Endreinheit von >95 % zu bringen, wurden 400 mg Peptid über eine präparative RP-HPLC-Säule (40mmx250mm) gefüllt mit C18-Material (5 Mikrometer, 300 Angström) und einem Wasser/Trifluoressigsäure-, Acetonitril/Trifluoressigsäure-Gradienten gereinigt. Es fielen nach Lyophilisation 118 mg 96.5 %iges (HPLC) weißes Material an. Die Identität des Materials wurde mittels FAB-MS geprüft.
    Beispiel 2
    Zur Biotinylierung des Peptidantigens aus Beispiel 1 wurde ein Moläquivalent möglichst konzentriert (Löslichkeit ist von der Aminosäuresequenz abhängig) in Argon-gesättigtem Kaliumphosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 8,0) gelöst und mit 3 Äquivalenten D-Biotinyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester gelöst in Argon-gesättigtem Dimethylformamid (Lösung von 1 µmol Reagenz in 5 µl DMF) versetzt.
    Man rührte das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon unter ständiger Kontrolle mittels analytischer RP-HPLC. Wenn < 5% Edukt vorhanden waren, wurde der Reaktionsansatz direkt auf eine präparative RP-HPLC-Säule gegeben und das Produktmaterial mittels einem 0.1% Trifluoressigsäure/Wasser- zu 0.1% Trifluoressigsäure/ Acetonitril-Gradienten (Steigung: 0% auf 100% in 90 Minuten) gereinigt. Das Produktmaterial wurde durch Einengen und Lyophilisation der Produktfraktionen erhalten. Die Ausbeuten lagen zwischen 40 % und 90%. Als Analytik dienten für die Reinheit HPLC, HPCE und TLC, für die Identität FAB-MS (Molpeak) und TLC mit spezifischen Anfärbereagentien (p-Dimethylaminozimtaldehyd auf Biotin) und Gehaltsbestimmung über Mikroanalyse (Nitrogen).
    Beispiel 3 HCV-Antikörper werden in einem 2-Schritt-Sandwich-Immunoassay bestimmt. Zum Nachweis werden die Reagentien mit folgender Zusammensetzung verwendet: Reagenz 1:
  • 0.10 µg/ml (Peptidantigene 1,3,4,5,6) oder 0.25 µg/ml (Peptidantigene 2,4,7), biotinyliertes Peptidantigen oder eine 1:1 Mischung solcher Peptidantigene
  • 40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7.0
  • 0.9 Gew.-% NaCl
  • 10 Vol.-% Rinderserum
    • Reagenz 2:
    20 mU/ml eines Konjugats aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) und Peroxidase
  • 40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7.0
  • 0.05 Gew.-% Tween® 20
  • 0.2% Rinderserumalbumin
  • 0.2% Rinder-IgG
    • In einem mit Streptavidin beschichteten Polystyrolröhrchen (hergestellt nach Beispiel 1 von EP-A 0 344 578) werden 1 ml Reagenz 1 und 10 µl Probe eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird dreimal mit Leitungswasser gewaschen und mit 1 ml Reagenz 2 für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird dreimal mit Leitungswasser gewaschen. Zur Nachweisreaktion werden 1 ml ABTS® (2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat(6)]-Diammoniumsalz, 1,9 mmol/l, in 100 mmol/l Phosphatcitratpuffer pH 4.4 mit 3.2 mmol/l Natrium-perborat) zugegeben. Nach 60 min wird die Extinktion bei 420 nm photometrisch gemessen. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 1:
    Serum Peptidantigene (Sequenz Nr.)
    9 1 2 3 4 5 6 7 8 1+4 3+6
    1 + - + + + + + - + + +
    2 - - - - + + + - - + +
    2 - + - - - - + - - + +
    4 + - + + + - + + + + +
    5 - - + - + - - - + + +
    6 + - + + + + + - + + +
    7 + + + - + - + + + + +
    Erläuterungen zu Tabelle 1:
    -/+: negativ/positiv (Der Cutoff für ein positives Signal im ELISA ist definiert als die mittlere Extinktion bei 420 nm plus 3 Standardabweichungen eines Kollektivs von 10 negativen Kontrollseren. Die Proben wurden bei einer Probenverdünnung von 1:250 vermessen).
    Serum 1 war negativ im Test im Ortho-HCV-Antikörper ELISA-Test-system von ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC. jedoch positiv aufgrund des klinischen Bildes.
    Die Seren 2 - 5 wurden nach dem Test von Ortho Laboratories, die Seren 6 und 7 mit dem ABBOTT HCV EIA, Kat.No. 3 A53-24, ABBOTT LABORATORIES INC. als positiv identifiziert.
    Die Peptidantigene 1 - 6 wurden mit Dimethoxytrityl-Biotin festphasenbiotinyliert an der ε-Aminogruppe eines zusätzlich N-terminal eingeführten Lysins.
    Die Peptidantigenmischungen 1 + 4 und 3 + 6 wurden in einem molaren Mischungsverhältnis von 1:1 eingesetzt.
    Beispiel 4
    Es wurden weitere Seren mit Peptiden und Peptidmischungen in einem Zweischritt-Sandwich-Immunoassay auf mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten geprüft.
    Die Durchführung der Bestimmung erfolgte weitgehend analog Beispiel 3. Dabei wurden folgende Reagentien verwendet:
    Reagenz 1:
    50 ng Peptid (oder die in den Tabellenerklärungen genannten Mengen) in 100 µl Inkubationspuffer (40 mmol/I Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,9 Gew.-% NaCl, 10 Vol.-% Rinderserum.
    Reagenz 2:
    Konjugat aus polyklonalem Antikörper gegen humanes Immunglobulin (Schaf) und Peroxidase (Peroxidaseaktivität 20 mU/ml), 40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,05 Gew.-% Tween
    Figure 00080001
    20, 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Rinder-lgG.
    Waschlösung
    40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0, 0,9 Gew.-% Natriumchlorid, 0,05 Gew.-% Tween 20.
    Farbreagenz
    10 mg ABTS , 80 µl 0,4 % H2O2 in 10 ml Citrat-Phosphatpuffer (pH 4,4, 100 mmol/l).
    Pro Napf (well) einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte werden Serum (1 : 10 verdünnt in 50 µl Inkubationspuffer und 100 µl Reagenz 1 zugegeben. Es wird eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend fünfmal mit je 200 µl Waschlösung gewaschen. Es werden 150 µl Reagenz 2 zugegeben, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit je 200 µl Waschlösung gewaschen. Es werden 150 µl Farbreagenz zugegeben, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und die Extinktion bei 420 nm photometrisch gemessen.
    Die Tabellen II, III, IV, V, VI und VII zeigen die Ergebnisse.
    In den Tabellen bedeuten:
    Ortho relative Größe des Meßsignals im Test von Ortho (vgl. Beispiel 3.
    leeres Feld Meßwert kleiner als zweifacher Leerwert oder identisch mit Leerwert (bestimmt mit biotinyliertem, mit HCV-Antikörpern nicht reaktivem Peptid (nonsens-Sequenz)).
    voller Kreis Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf.
    leerer Kreis Meßwert zweifacher Leerwert bei 50 ng Peptid pro Napf
    volles Quadrat Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 250 ng Peptid pro Napf.
    leeres Quadrat
    *    		 Meßwert zweifacher Leerwert oder größer bei 250 ng Peptid pro Napf.
    Negativkontrollen
    leeres Feld wie Tabelle II
    voller Kreis Meßwert vierfacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf.
    leerer Kreis Meßwert dreifacher Leerwert oder größer bei 50 ng Peptid pro Napf.
    n.t. Messung nicht durchgeführt
    2a, 2b, 3, 4, 6
    *    		 Anstelle eines einzelnen Peptidantigens wurde in Reagenz 1 eine Mischung aus je 10 ng der genannten Peptide verwendet.
    Negativkontrollen
    Tabelle IV
    Die Bedeutung der Symbole entspricht den Angaben zu Tabelle II.
    Die Peptidmischungen enthielten jeweils 50 ng der einzelnen Peptide.
    Beispiel 5: Tabellen V, VI und VII
    Ergebnisse von Immunoassays analog Beispiel 3, wobei im Reagenz 1 folgende Peptidkonzentrationen eingesetzt wurden:
    Bei Verwendung von mehreren Antigenen in Kombination werden die Einsatzmengen entsprechend der Anzahl der verschiedenen Antigene reduziert.
    Sequenz 2a 50 µg/ml
    Sequenz 2b 50 µg/ml
    Sequenz 2d 100 µg/ml
    Sequenz 2f 100 µg/ml
    Sequenz 2h 100 µg/ml
    Sequenz 4 400 µg/ml
    Sequenz 4a 350 µg/ml
    Sequenz 4b 250 µg/ml
    Sequenz 4c 300 µg/ml
    Sequenz 6 350 µg/ml
    Sequenz 6a 350 µg/ml
    Sequenz 6b 350 µg/ml
    Sequenz 6c 250 µg/ml
    Sequenz 6d 300 µg/ml
    Sequenz 8a 900 µg/ml
    Sequenz 9a 350 µg/ml
    Sequenz 9c 350 µg/ml
    Sequenz 11 300 µg/ml
    Sequenz 12 550 µg/ml
    +/-: pos./neg. (Der Cutoff für ein positives Signal im Immunoassay wie Beispiel 3 ist definiert als die mittlere Extinktion bei 420 nm plus 2 Standardabweichungen eines Kollektivs von 6 negativen Kontrollseren. Die Proben sind mit Inkubationspuffer 1 : 100 verdünnt).
    Figure 00110001
    Figure 00120001
    Peptidantigene
    Serum 2b,4,6 2b,2c,4,6 2a,2b,2c,4,6 2a,2b,2c,4,6,9a,9b,
    S1
    S2
    S3
    S4(*)
    S5
    S6
    S7
    S8 ○
    S9
    S10 ○ ○
    S11
    S12
    S13
    S14
    S15
    S16
    S17
    S18
    S19 (*)
    S20 ○
    S21
    S22
    S23
    S24
    Figure 00140001
    Figure 00150001
    Figure 00150002
    SEQ ID NO: 1
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
    Figure 00150003
    SEQ ID NO: 2
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 33 Aminosäuren
    Figure 00160001
    SEQ ID NO: 3
    ART DER SEQUENZ= Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
    Figure 00160002
    SEQ ID NO: 4
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
    Figure 00160003
    SEQ ID NO: 5
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
    Figure 00160004
    SEQ ID NO: 6
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 6 Aminosäuren
    Figure 00160005
    SEQ ID NO: 7
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
    Figure 00170001
    SEQ ID NO: 8
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 7 Aminosäuren
    Figure 00170002
    SEQ ID NO: 9
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
    Figure 00170003
    SEQ ID NO: 10
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 10 Aminosäuren
    Figure 00170004
    SEQ ID NO: 11
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 19 Aminosäuren
    Figure 00170005
    SEQ ID NO: 12
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
    Figure 00170006
    SEQ ID NO: 13
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 9
    Figure 00180001
    SEQ ID NO: 14
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 10 Aminosäuren
    Figure 00180002
    SEQ ID NO: 15
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
    Figure 00180003
    SEQ ID NO: 16
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 16 Aminosäuren
    Figure 00180004
    SEQ ID NO: 17
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 12 Aminosäuren
    Figure 00180005
    SEQ ID NO: 18
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
    Figure 00190001
    SEQ ID NO: 19
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 12 Aminosäuren
    Figure 00190002
    SEQ ID NO: 20
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
    Figure 00190003
    SEQ ID NO: 21
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 9 Aminosäuren
    Figure 00190004
    SEQ ID NO: 22
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
    Figure 00190005
    SEQ ID NO: 23
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 47 Aminosäuren
    Figure 00200001
    SEQ ID NO: 24
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
    Figure 00200002
    SEQ ID NO: 25
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 45 Aminosäuren
    Figure 00200003
    SEQ ID NO: 26
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
    Figure 00200004
    SEQ ID NO: 27
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 20 Aminosäuren
    Figure 00210001
    SEQ ID NO: 28
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
    Figure 00210002
    SEQ ID NO: 29
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 11 Aminosäuren
    Figure 00210003
    SEQ ID NO: 30
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
    Figure 00210004
    SEQ ID NO: 31
    ART DER SEQUENZ= Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 18 Aminosäuren
    Figure 00220001
    SEQ ID NO: 32
    ART DER SEQUENZ: Peptid
    SEQUENZLÄNGE: 16 Aminosäuren
    Figure 00220002

    Claims (12)

    1. HCV-Peptidantigene mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 1-10.
    2. HCV-Peptidantigene mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 4 Aminosäuren Länge.
    3. Kombination von HCV-Peptidantigenen aus
      SEQ ID NO: 4, 12, 16
      SEQ ID NO: 4, 5, 12 und 16
      SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 und 16
      SEQ ID NO: 3, 4, 4, 5, 12, 16, 26 und 27
      SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 und 26
      SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 und 26
      SEQ ID NO: 7, 9, 13, 20, 21
      SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28
    4. Verfahren zur Herstellung von Peptidantigenen nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger gebunden wird, vom C-terminalen Ende das Peptidantigen schrittweise aufgebaut und anschließend vom Träger abgespalten wird.
    5. Verfahren zur Bestimmung von HCV-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer Kombination von mindestens zwei Peptidantigenen aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 15, 16, 22, 23, 25, 29-32 oder Peptidantigenen, die Teilsequenzen unterschiedlicher dieser SEQ ID NOs mit mindestens 4 Aminosäuren Länge darstellen, wobei jeweils mindestens ein Peptidantigen aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, 2, 11 ausgewählt wird, inkubiert und, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigenkomplexes ermöglichen, die Menge der an das Peptidantigen gebundenen HCV-Antikörper bestimmt wird.
    6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kombination von mindestens zwei HCV-Antigenen aus der Gruppe SEQ ID NO: 1-32 verwendet wird, wobei mindestens ein Peptidantigen aus der Gruppe SEQ ID NO: 1-11 ausgewählt wird.
    7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Kombinationen
      SEQ ID NO: 4, 12, 16
      SEQ ID NO: 4, 5, 12 und 16
      SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 und 16
      SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12, 16, 26 und 27
      SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 und 26
      SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 und 26
      SEQ ID NO: 7, 9, 13, 20, 21
      SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28
      verwendet werden.
    8. Verfahren zur Herstellung von Antikörpem gegen HCV-Antigene, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem gegebenenfalls trägergebundenen Peptidantigen gemäß Ansprüchen 1-2 immunisiert wird, polyklonale Antikörper gewonnen werden oder Zellen dieser Tiere, die Antikörper produzieren, zu Zellinien immortalisiert werden und aus diesen Zellinien monoklonale Antikörper gewonnen werden.
    9. Verfahren zur Bestimmung von HCV-Viren, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem Antikörper nach Anspruch 8 unter Bedingungen, die eine Antigen-Antikörperkomplexbildung erlauben, inkubiert wird, und die Menge des gebildeten Antikörper-Antigenkomplexes bestimmt wird.
    10. Vakzin zur Behandlung von HCV-Infektionen, enthaltend ein gegebenenfalls trägergebundenes Peptidantigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 oder mindestens zwei Peptidantigene SEQ ID NO: 1-32 als Immunogen, wobei mindestens ein Peptidantigen aus den SEQ ID NO: 1-11 ausgewählt wird, in einer pharmakologisch effektiven Dosis und in einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung.
    11. Vakzin nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Peptidantigene, die Teilsequenzen
      SEQ ID NO: 4, 12, 16
      SEQ ID NO: 4, 5, 12 und 16
      SEQ ID NO: 3, 4, 5, 12 und 16
      SEQ ED NO: 3, 4, 5, 12, 16, 26 und 27
      SEQ ID NO: 3, 4, 11, 12, 16 und 26
      SEQ ID NO: 3, 4, 12, 16 und 26
      SEQ ID NO: 7, 9, 13, 20, 21
      SEQ ID NO: 6, 8, 13, 19, 28
      verwendet werden.
    12. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung der Peptidantigene gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 oder von mindestens zwei der Peptidantigene SEQ ID NO: 1-32 als Immunogene, wobei mindestens ein Peptidantigen aus den SEQ ID NO: 1-11 ausgewählt wird.
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    Families Citing this family (23)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    CA2049679C (en) * 1990-08-24 2005-06-21 Sushil G. Devare Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens
    DE4209215A1 (de) 1991-07-04 1993-01-07 Boehringer Mannheim Gmbh Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv
    KR100317509B1 (ko) * 1992-07-16 2002-02-20 야스모토 토루 C형간염바이러스를분류하기위한항원성펩티드,이펩티드를포함하는키트및이펩티드를사용하는c형간염바이러스를분류하는방법
    DE4240980A1 (de) * 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV
    JP3751315B2 (ja) 1993-05-05 2006-03-01 コモン サーヴィシス エージェンシー Ｃ型肝炎ウイルス４、５及び６型
    ES2197170T3 (es) * 1993-11-04 2004-01-01 Innogenetics N.V. Epitopos de celulas t humanas inmunologicamente dominantes del virus de la hepatitis c.
    DE69517521T2 (de) * 1994-04-08 2001-03-08 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Rockville Peptid aus dem inneren des hepatitis-c-virus brauchbar für die stimulation cytotoxischer t-lymphocyten und die diagnose des hcv-kontaktes
    JP3217600B2 (ja) * 1994-07-12 2001-10-09 株式会社先端生命科学研究所 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ
    EP1845108A3 (de) 1994-07-29 2007-10-24 Innogenetics N.V. Monoklonale Antikörper gegen gereinigte Hüllproteine des Hepatitis-C-Virus für diagnostische und therapeutische Zwecke
    WO1996034013A1 (en) * 1995-04-28 1996-10-31 Srl, Inc. Antigen peptide compound and immunoassay method
    EP0947525A1 (de) * 1998-03-27 1999-10-06 Innogenetics N.V. Epitope in der viralen Hüllproteine und spezifische Antikörper gegen diese Epitope: Verwendung für die detektion von viralantigene im empfängergewebe
    ATE412904T1 (de) * 1998-07-30 2008-11-15 Advanced Life Science Inst Inc Verfahren zur bestimmung von hepatitis c viren
    DK1222266T3 (da) * 1999-09-29 2006-07-10 Diagnocure Inc PCA3-messenger-RNA i benigne og maligne prostatavæv
    US7049060B2 (en) * 2001-11-05 2006-05-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. HCV anti-core monoclonal antibodies
    EP1357127A1 (de) * 2002-04-10 2003-10-29 Immusystems GmbH CD4+ T-Lymphozyten spezifische Hepatitis C Virus-Epitope
    US20060115860A1 (en) * 2004-11-26 2006-06-01 Cabrera Robert M Immunologic assay for detection of autoantibodies to folate binding protein
    US8865398B2 (en) 2006-09-01 2014-10-21 Abbott Laboratories Combination hepatitis C virus antigen and antibody detection method
    EP2201023A2 (de) * 2007-09-14 2010-06-30 GENimmune N.V. Affinitäts-tag
    JP5775451B2 (ja) 2008-06-19 2015-09-09 バリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイティド インフルエンザを処置するための組成物および方法
    US20100104555A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Scripps Research Institute HCV neutralizing epitopes
    JP6069212B2 (ja) 2010-12-02 2017-02-01 ビオノール イミュノ エーエスＢｉｏｎｏｒ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓ ペプチド骨格設計
    WO2013072768A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Variation Biotechnologies, Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
    FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c

    Family Cites Families (22)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    DE3640412A1 (de) 1986-11-26 1988-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz
    US5306620A (en) * 1987-07-08 1994-04-26 The Scripps Research Institute Antibodies that bind to a ligand-induced binding site on integrin and induce integrin activation
    WO1989004669A1 (en) 1987-11-18 1989-06-01 Chiron Corporation Nanbv diagnostics and vaccines
    US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
    US5191064A (en) 1988-09-30 1993-03-02 The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide
    US5106727A (en) * 1989-04-27 1992-04-21 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequences as primers
    US6596476B1 (en) * 1989-12-22 2003-07-22 Abbott Laboratories Hepatitis C assay
    KR940000755B1 (ko) * 1990-02-16 1994-01-29 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드
    US5747239A (en) * 1990-02-16 1998-05-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV, diagnosis of HCV infection and preventions thereof as vaccines
    US5106726A (en) * 1990-02-16 1992-04-21 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV
    EP0445801A3 (en) * 1990-03-08 1992-07-01 Kuraray Co., Ltd. Peptide and its use
    AU660925B2 (en) * 1990-04-06 1995-07-13 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis C virus epitopes
    AU635124B2 (en) * 1990-04-16 1993-03-11 United Biomedical Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV, diagnosis of HCV infection and prevention thereof as vaccines
    EP0933426A1 (de) * 1990-06-25 1999-08-04 The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University Non-A, Non-B Hepatitis Virus genomisches DNS und Antigenpolypeptide
    CA2047792C (en) * 1990-07-26 2002-07-02 Chang Y. Wang Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to hcv, diagnosis of hcv infection and prevention thereof as vaccines
    US6172189B1 (en) * 1990-08-24 2001-01-09 Abbott Laboratories Hepatitis C assay utilizing recombinant antigens
    DK0770679T4 (da) * 1990-11-03 2010-05-10 Siemens Healthcare Diagnostics HCV-specifikke peptider, sammensætninger dertil og anvendelse deraf
    ATE185350T1 (de) * 1990-12-14 1999-10-15 Innogenetics Nv Synthetische antigene zum nachweis von antikörpern gegen hepatitis c virus
    AU1459792A (en) * 1991-01-14 1992-08-27 James N. Gamble Institute Of Medical Research Basic structural immunogenic polypeptides having epitopes for hcv, antibodies, polynucleotide sequences, vaccines and methods
    US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
    DE4209215A1 (de) 1991-07-04 1993-01-07 Boehringer Mannheim Gmbh Hcv peptidantigene und verfahren zur bestimmung von hcv
    IL124567A (en) * 1998-05-20 2008-08-07 Abic Biolog Lab Ltd DNA sequences of HEMORRHAGIC ENTERITIS virus, proteins encoded by them and their various uses

    Also Published As

    Publication number Publication date
    CA2089576A1 (en) 1993-01-05
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    US6183949B1 (en) 2001-02-06
    DE4209215A1 (de) 1993-01-07

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