EP1534864A2 - Verfahren zum nachweis von nukleinsäuresequenzen mittels spaltbarer sondenmoleküle - Google Patents

Verfahren zum nachweis von nukleinsäuresequenzen mittels spaltbarer sondenmoleküle

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Publication number
EP1534864A2
EP1534864A2 EP03793600A EP03793600A EP1534864A2 EP 1534864 A2 EP1534864 A2 EP 1534864A2 EP 03793600 A EP03793600 A EP 03793600A EP 03793600 A EP03793600 A EP 03793600A EP 1534864 A2 EP1534864 A2 EP 1534864A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
probe molecules
dna
nucleic acid
genomic dna
cytosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03793600A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Philipp Schatz
Matthias Schuster
Kurt Berlin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1534864A2 publication Critical patent/EP1534864A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of nucleic acid sequences in nucleic acids.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing because 5-
  • Methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosines carry is completely lost.
  • a newer method is also the detection of cytosine methylation by means of a Taqman PCR, which has become known as MethylLight (WO-A 00/70090).
  • Genomic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Mass-labeled oligonucleotides (www.quiagengenomics.com), which are easy to prepare and do not fragment, have been used in many cases for labeling amplicons.
  • Trityl groups with different masses used (Shchepinov, M.S., Southern E.M. Trityl mass-tags for encoding in combinatorial oligonucleotide synthesis (1999), Nucleic Acids Symposium Series 42: 107-108)
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry is a very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons Chem. 1988 Oct. 15; 60 (20): 2299-301).
  • An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is vaporized by a short laser pulse and the analyte molecule is thus transported unfragmented into the gas phase. The ionization of the analyte is achieved by collisions with matrix molecules.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones. The flight time is converted into the mass of the ions.
  • Phosphorothioate nucleic acids in which the usual phosphates of the backbone are substituted by thiophosphates can be converted into a charge-neutral DNA by simple alkylation chemistry (Gut, IG and Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Coupling a "charge tag" to this modified DNA results in an increase in sensitivity by the same amount as is found for peptides. Another advantage of "charge tagging" is the increased stability of the analysis against impurities, which Completely complicate the detection of unmodified substrates.
  • PNAs and methylphosphonate oligonucleotides have been examined with MALDI and can thus be analyzed.
  • This technology is currently able to distinguish molecules with a mass difference of 1 Da in the mass range from 1,000 to 4,000 Da. Due to the natural distribution of isotopes, most biomolecules are already about 5 Da wide.
  • this mass spectrometric method is ideally suited for the analysis of biomolecules.
  • the products to be analyzed that are to be differentiated must be at least 5 Da apart. In this mass range, 600 molecules could be distinguished.
  • PNA and LNA have also been described many times as probe molecules in the literature.
  • the PNA is a synthetic nucleic acid analogue, where the sugar-phosphate backbone is replaced by a peptide-like polyamide. Instead of 5 'and 3' ends, PNAs have N and C ends. Like the LNAs (Locked Nucleic Acids) (see www.cureon.com/technology/aboutlna), the PNAs have a high stability towards nucleases and a high binding affinity towards complementary DNA.
  • Koster et al. (WO-A 98/20166) suggested the use of cleavable bonds.
  • prime oligonucleotides were immobilized, which were then hybridized with genomic DNA. After the subsequent extension reaction, the resulting products were specifically cleaved from the surface and analyzed by mass spectrometry.
  • the use of photolytically cleavable oligonucleotide probes on an array has been proposed (Jaschke, A., Hausch, F.
  • the object of the present invention is to provide a method for the detection of nucleic acid sequences.
  • probe molecules are to be hybridized in a sequence-specific manner to one or more solid phases immobilized nucleic acids. These probe molecules are to be provided with a cleavable bond and a specific mass label. The hybridized probe molecules are then to be contacted with a substance or a mixture of substances which cleaves the cleavable bonds and at the same time serves as a matrix in a MALDI mass spectrometer. The mass markings should finally be detected at the positions on the solid phase at which the nucleic acids were bound.
  • the probe molecules become sequence-specific hybridizes to the nucleic acid sample, the probe molecules being provided with a cleavable bond and a mass label which is specific for the probe molecule. The non-hybridized probe molecules are then removed.
  • the probe molecules become sequence-specific hybridizes to the nucleic acid sample, the probe molecules being provided with a cleavable bond and a mass label which is specific for the probe molecule. The non-hybridized probe molecules are then removed.
  • the hybridized probe molecules are contacted with a matrix which cleaves the cleavable bonds and at the same time serves as a matrix in a MALDI mass spectrometer.
  • the mass label is detected in the last step of the procedure at the positions at which the nucleic acid sample was bound.
  • a nucleic acid is preferably composed of cell lines, blood, sputum, stool, urine, brain-spinal cord fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from the eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung , Breast or liver, histological slides or any combination of these.
  • the nucleic acid is amplified, this preferably being done by means of enzymatic pri extension, PCR, rolling circle amplification, ligase chain reaction or other methods.
  • the amplification of several different fragments is carried out in one reaction vessel.
  • At least one nucleic acid is bound to a solid phase, which can preferably also serve as a sample carrier for a mass spectrometer.
  • the solid phase or solid phase surface particularly preferably consists of non-conductive materials such as glass. Also particularly preferred are conductive materials such as such as Teflon, Silicon or Black Conductive Polypropylene. Other materials such as polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold are also preferred.
  • the binding of the nucleic acid to the surface can be both covalent (for example by a primer which carries a thiol at the 5 'end and is bound to a surface activated with bromoacetic acid) and non-covalently by van der Waals forces or hydrogen bonds (for example by heat mobilization or incubation).
  • a plurality of nucleic acids are preferably arranged on a solid phase surface in the form of a rectangular or hexagonal grid. Alternatively, it is preferred that at least one nucleic acid is arranged on a plurality of surfaces. These solid phases can particularly preferably be used in the sample holder of a MALDI mass spectrometer.
  • the nucleic acids to be detected are preferably DNA sequences and, in particular, sequences which can be changed between different samples and which contain SNPs, point mutations, deletions, inversions or insertions.
  • the nucleic acid sequences to be detected are particularly preferably chemically pretreated DNA sequences which serve for the detection of DNA methylation at certain CpG positions.
  • the chemical treatment is preferably carried out after embedding the DNA in agarose. It is likewise preferred that a reagent denaturing the DNA duplex and / or a radical scavenger is present during the chemical treatment.
  • probe molecules required for binding to nucleic acids to be detected are often produced combinatorially in the prior art in the form of libraries (EP1036202), which are also preferably used in the method according to the invention.
  • the probe molecules are particularly preferably provided with a cleavable bond and a mass marking which is specific for the respective probe molecule.
  • markings can be, for example, 6-
  • the mass of a marking preferably differs from the mass of all other markings used in an experiment by at least 1 Da.
  • the probe molecules preferably comprise at least one CG, TG or CA dinucleotide.
  • the different mass can particularly preferably also be the result of an enzymatic reaction.
  • the probe is synthesized with a mass label and then modified enzymatically, whereby the mass changes.
  • the mass marking is particularly preferably only connected to the probe molecule as a result of an enzymatic modification.
  • the probe is manufactured chemically without mass marking and then enzymatically provided with a mass marking.
  • the probe is preferably chemically provided with a mass label and not changed enzymatically.
  • it is preferred according to the invention that the probe provided with a mass marking is changed chemically. This can be done for example with acid or with a treatment according to Maxam and Gilbert.
  • probe molecules which particularly preferably consist of DNA or modified DNA, are hybridized to the nucleic acids in a sequence-specific manner.
  • the probe molecules RNA, LNA, PNA or corresponding hybrids thereof are preferably also combined with DNA or modified DNA.
  • the non-hybridized probe molecules are removed.
  • the remaining hybridized probe molecules are preferably modified enzymatically after the hybridization by primer extension or ligation.
  • thermosquenase or Taq poly erase are suitable as enzymes for the primer extension, whereas ampligase DNA ligase, Pfu or Taq DNA ligase are used for the ligation.
  • the amplification products are preferably hybridized to two classes of probe molecules, each with at least one member, the probe molecules of the first class preferably hybridizing to the sequence which results from the chemical treatment of the genomic DNA when a cytosine to be examined is methylated in the genomic DNA and wherein the probe molecules of the second class preferentially hybridize to the sequence which results from the chemical treatment of the genomic DNA if a cytosine to be examined were present unmethylated in the genomic DNA.
  • the probe molecules of the first class preferably hybridizing to the sequence which results from the chemical treatment of the genomic DNA if a cytosine to be examined is methylated in the genomic DNA and less preferably to the sequence which results from the chemical treatment of the genomic DNA, if a cytosine to be examined is unmethylated in the genomic DNA and the oligomers of the second class hybridize to the amplificate to be examined essentially independently of the methylation of said particular cytosine in the genomic DNA.
  • Hybridization is preferably carried out on two classes of probe molecules, each with at least one member, the probe molecules of the first class preferably hybridizing to the sequence that results from the chemical treatment of the genomic DNA if a cytosine to be examined was present in the genomic DNA unmethylated and less preferably to the sequence which results from the chemical treatment of the genomic DNA, if a cytosine to be investigated were methylated in the genomic DNA and the oligomers of the second class of the amplificate to be examined are essentially independent of the methylation of the particular cytosine in question hybridize the genomic DNA.
  • the non-hybridized probe molecules are then removed.
  • the hybridized probe molecules are contacted with a matrix (eg by spraying, pipetting, spotting), which cleaves the cleavable bonds and at the same time serves as a matrix in a MALDI mass spectrometer.
  • a matrix eg by spraying, pipetting, spotting
  • THA trihydroxyacetophenone
  • 3-HPA 3-hydroxypicolinic acid
  • THA matrix according to the invention being diluted with ter acid such as TFA (trifluoroacetic acid) is added.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the detection limit can be significantly reduced by the size of the oligonucleotide gap product.
  • protective groups which can be removed from acid are monomethoxytrityl or 4-methyltrityl.
  • the oligonucleotides can also be cleaved in a structure-specific manner by adding a flap endonuclease such as Cleavage VIII.
  • Endonucleases can also be used for cleavage, which cleave the probe from the center, for example mung bean nuclease or T7 endonuclease I.
  • sequence-specific endonucleases can be used for cleavage, for example the enzymes Tsp 5091 or Msel can be used for this , In addition, the digestion with a 3'-
  • Exonucleases possible, preferably after adding acidic matrix. Exonucleases are also used for cleavage.
  • a 3 '-5' exonuclease such as exonuclease I cleaves the single-stranded probe from the 3 'end to a modification (e.g. phosphothioate).
  • a 5 '-3' exonuclease such as T7 exonuclease accordingly cleaves the single-stranded probe from the 5 'end until a modification.
  • the mass labels are detected at the positions at which the nucleic acid was bound. This detection is particularly preferably carried out using MALDI-TOF mass spectrometry. The detection limit is decisively reduced by the preferred loading of the mass marking of simply positive or simply negative.
  • the method described above is preferably used for the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, these adverse events being at least one of the following Include categories: adverse drug effects; Cancers; CNS malfunction, damage or illness; Symptoms of aggression or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and damage; Malfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Malfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and etabolic malfunction, damage or disease; Headache or sexual malfunction.
  • the method described above is preferably used to distinguish cell types or tissues or to study cell differentiation.
  • kits comprising a solid phase for immobilizing the nucleic acid, probe molecules, components for carrying out the mass spectrometric
  • a genomic sequence is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a way that all cytosines not methylated at the 5-position of the base are changed in such a way that a base which is different with regard to the base pairing behavior is formed, while the in the 5-position methylated cytosines remain unchanged.
  • bisulfite hydrogen sulfite, disulfite
  • an addition takes place at the unmethylated cytosine bases.
  • a denaturing reagent or solvent and a radical scavenger must be present. Subsequent alkaline hydrolysis then leads to the conversion of unmethylated cytosine nucleobases into uracil.
  • the treated nucleic acid is diluted with water or an aqueous solution. Desulfonation of the DNA is then preferably carried out.
  • the nucleic acid is amplified in a polymerase chain reaction, preferably with a heat-resistant DNA polymerase. The PCR reactions were carried out in a thermal cycler (Eppendorf GmbH). 40 ng DNA, 0.07 ⁇ mol / l of each primer oligonucleotide 1 mmol / 1 dNTPs and four units of Hotstar Taq were used for a 100 ⁇ l mixture. The other conditions were chosen according to the manufacturer's instructions.
  • the PCR denaturation was first carried out for 15 minutes at 96 ° C., then 40 cycles (60 seconds at 96 ° C., 75 seconds at 56 ° C. and 75 seconds at 65 ° C.) and a final EL water or an aqueous solution , Desulfonation of the DNA is then preferably carried out.
  • the nucleic acids are amplified in a polymerase chain reaction, preferably with a heat-resistant DNA polymerase.
  • the PCR reactions were carried out in a Thermocyc-1er (Eppendorf GmbH). It was for one
  • cytosines from the potential promoter region of the MDRI gene are examined. With sequences of this gene, a patient's response to a
  • Chemotherapy can be followed.
  • a defined fragment with a length of 242 bp is amplified with the specific primer oligonucleotides SH-TAA GTA TGT TGA AGA AAG ATT ATT GTA G (Seq. ID 1.) and CGC ATC AAC TAA ATC ATT AAA A (Seq. ID 2.).
  • SH-TAA GTA TGT TGA AGA AAG ATT ATT GTA G Seq. ID 1.
  • CGC ATC AAC TAA ATC ATT AAA A Seq. ID 2.
  • Polylysine-coated glass slides are cleaned beforehand in ultrasound and activated for 1 h in 20 mmol / 1 bromoacetic acid, 20 mmol / 1 dicylohexylcarbodiimide, 2 mmol / 1 4- (dimethylamino) pyridine solution. Binding with the PCR product takes place in a 0.18 mol / 1 triscarboxyethylphosphine, 200 mmol / 1 NaH2P04 buffer solution for 2 hours in a 25 ° C humid chamber. The PCR products are denatured with 0.05 mol / 1 NaOH and then analyzed.
  • the single-stranded PCR product was hybridized with an oligonucleotide to form a duplex structure.
  • Acid-labile modified oligonucleotides were used for this: 5 '-TAT AAA CAC GTC TTT CApnA-Amino-3 ⁇ (Seq. ID 3.) or 5 '-TAT AAA CAC ATC TTT CapnA-Amino-3 ⁇ (Seq. ID 4.) with the cytosine to be detected at position 198 of the amplificate.
  • the adenosine at the penultimate position of both oligonucleotides is a 5 'amino adenosine which is easily hydrolyzed by acid.
  • a 6-triethylammonium hexyryl-N-hydroxysuccinimidyl ester (199 Da) (CT1) or a 6-trimethylammonium hexyryl-N-hydroxysuccinimidyl ester (129 Da) (CT2) is coupled to the amino function at the 3 'end beforehand. This means that the masses of the two smaller fission products differ by 70 Da.
  • the methylated cytosine is detected with the oligonucleotide (Seq. ID 3.), whereas the unmethylated state, which is represented by a thymine, is detected with the oligonucleotide (Seq. ID 4.). Both oligonucleotides hybridize on the complementary strand.
  • the acid-labile cleavage site is hydrolyzed by applying 350 mmol / l of 3-HPA in acetonitrile with 1.5% trifluoroacetic acid.
  • the detection of the hybridization product is based on the detection of the mass of the cleavage products using MALDI-TOF mass spectrometry. The detection limit is decisively reduced by the size of the oligonucleotide cleavage product and the defined charge of simply positive.
  • a hybridization reaction of the amplified DNA with the probe (Seq. ID3., Seq. ID 4.) occurs only if a methylated cytosine is present at this point in the bisulfit-treated DNA. The methylation status of the respective cytosine to be examined thus decides on the hybridization product and thus on the mass detected.
  • Example 2 The single-stranded PCR product was hybridized with an oligonucleotide to form a duplex structure. Modified oligonucleotides were used for this: 5'Amino-TAT AAA CAC GTC TTT CAA (Seq. ID 5.) or
  • 5'Amino-TAT AAA CAC ATC TTT CAA (Seq. ID 6.)
  • a 6-triethylammonium hexyryl-N-hydroxysuccinimidyl ester (199 Da) (CTI) or a 6- is added to the amino function at the 5 'end.
  • the methylated cytosine is detected with the oligonucleotide (Seq. ID 5.), whereas the unmethylated state, which is represented by a Thy in, is detected with the oligonucleotide (Seq.
  • Both oligonucleotides hybridize on the complementary strand.
  • the oligonucleotides are then subjected to Maxam and Gilbert treatment. By applying dimethyl sulfate and heating in an alkaline pH, all adenosines and guanosines are split.
  • the detection of the hybridization product is based on the detection of the mass of the cleavage products using MALDI-TOF mass spectrometry. In this case, a mass of (498 Da + 199 Da (CTl + dT), or + 129 Da (CT2 + dT)) 697 or 627 Da is observed.
  • the detection limit is significantly reduced by the size of the oligonucleotide cleavage product.
  • a hybridization reaction of the amplified DNA with the probe occurs only if a methylated cytosine has been present at this point in the bisulfite-treated DNA.
  • the methylation status of the respective cytosine to be examined thus decides on the hybridization product and thus on the mass detected.
  • Splits can be ridin the cytosine and thymidine with hydrazine and pipe- then a 3 ⁇ -modified Oligonukleo- be examined tidpärchen.
  • all possible fission products are loaded several times.
  • Example 3 The single-stranded PCR product was hybridized with an oligonucleotide to form a duplex structure. Modified oligonucleotides were used for this: 5-Amino-TAT AAA CAC GTC TTT CAA (Seq. ID 7th) or 5 ⁇ - Amino-5 ⁇ -TAT AAA CAC ATC TTT CAA (Seq. ID 8th) To the amino function At the 5 'end, an acid-releasable protective group such as 4-methyltrityl (258 Da) or monomethoxytrityl (289 Da) is coupled beforehand. As a result, the masses of the two smaller fission products differ by 14 Da.
  • an acid-releasable protective group such as 4-methyltrityl (258 Da) or monomethoxytrityl (289 Da
  • the methylated cytosine is detected with the oligonucleotide (Seq. ID 7.), whereas the unmethylated state, which is represented by a thymine, is detected with the oligonucleotide (Seq. ID 8.).
  • Both oligonucleotides hybridize on the complementary strand.
  • the oligonucleotides are covered with an acidic 2 ⁇ 4 ⁇ 6 trihydroxyacetophenone matrix and measured in the MALDI-TOF.
  • the oligonucleotides are separated from their mass labels.
  • the detection of the hybridization product is based on the detection of the mass of the protective group using MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the detection limit is decisively reduced by the size of the protective group and the defined charge of +1.
  • a hybridization reaction of the amplified DNA with the probe only occurs if there is a methylated cytosine in the bisulfite-treated DNA at this point (Seq. ID 7th, Seq. ID 8th).
  • the methylation status of the respective cytosine to be examined thus decides on the hybridization product and thus on the mass detected.
  • Example 4 The single-stranded PCR product was hybridized with an oligonucleotide to form a duplex structure. Modified oligonucleotides were used for this: 5 5 -AminoTmptAT AAA CAC GTC TTT CAA-3 (Seq. ID 9.) or 5 ⁇ -AminoTmptAT AAA CAC ATC TTT CAA-3 (Seq. ID 10.).
  • the mpt is a methyl phosphonate.
  • the product is based on the detection of the mass of the remaining dT and the charge tag using MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the detection limit is decisively reduced by the size of the mass marking and the defined charge of -1. Only if in the bisulfite
  • 25 treated DNA has a methylated cytosine at this point, there is a hybridization reaction of the amplified DNA with the probe (Seq. ID 9th, Seq. ID 10th).
  • the methylation status of the respective cytosine to be examined thus decides on the hybridization
  • Example 5 The single-stranded PCR product was hybridized with two consecutive oligonucleotides to form a duplex structure. Modified oligonucleotides were used for this: ⁇ '-TTC AAC TTA TAT AAA CAmtpC-3 * (Seq. ID 11.) and 5 ⁇ TmtpTC TTT CAA AAT TCA CAT-3 (Seq. ID 12.) or 5 GmtpTC TTT CAA AAT TCA CAT-3 (Seq. ID 13.) The abbreviation mtp stands for methylphosphonate. The methylated cytosine is by the ligation of Seq. ID 11th and Seq. ID 12.
  • oligonucleotides hybridize on the complementary strand.
  • the oligonucleotides are digested by 3 - endoglycosidase and 5 endoglycosidase.
  • the detection of the ligation product is based on the detection of the mass of the remaining nucleotides (AmtpCp-T tpC or AmtpCp-TmtpC) using MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the detection limit is significantly reduced by the size of the products and the defined charge of simply negative. The mass can be shifted further by additional methylphosphonates.
  • Example 6 The single-stranded PCR product was hybridized with two consecutive oligonucleotides to form a duplex structure. Modified oligonucleotides were used for this: 5 -TTC AAC TTA TAT AAA CApnC-3 (Seq. ID 14.) and 5 ⁇ ATmtpC TTT CAA AAT TCA CAT-3 ⁇ (Seq. ID 15.) or
  • mtp stands for methylphosphonate.
  • the methylated cytosine is by the ligation of Seq. ID 14. and Seq. ID 15. detected, whereas the unmethylated state, which is represented by a thymine, was identified by the ligation of Seq. ID 14 and Seq. ID 15 is proven. Both oligonucleotides hybridize on the complementary strand.
  • the oligonucleotides are digested by adding acidic 3-HPA (3-hydroxypicolinic acid) matrix with 0.3% TFA (trifluoroacetic acid) and digestion with a 3 ⁇ - endoglycosidase.
  • the detection of the ligation product is based on the detection of the mass of the remaining nucleotides (NH3 + -Cp-Ap-TmtpC or NH3 + -Cp-Gp-TmtpC) using MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the detection limit is significantly reduced by the size of the products and the defined charge of simply negative.
  • an NP (nitrogen-phosphorus) bond ie a 3 'amino guaonside or 3' amino thymidine, can also be used in the second oligonucleotide at the second position at the 5 'end.
  • An NH3 + -Cp- ANH3 + is formed.
  • the single-stranded PCR product was hybridized with two consecutive oligonucleotides to form a duplex structure.
  • the two oligonucleotides overlap. Modified oligonucleotides were used for this:
  • Triethylammoniumhexyryl-N-hydroxysuccinimidyl ester (199 Da) (CT1), or a 6-trimethylammonium hexanoic acid-N-hydroxysuccinimidyl ester (129 Da) (CT2).
  • CT1 Triethylammoniumhexyryl-N-hydroxysuccinimidyl ester
  • 129 Da 6-trimethylammonium hexanoic acid-N-hydroxysuccinimidyl ester
  • the methylated cytosine is by the ligation of Seq. ID 17th and Seq. ID 18. detected, whereas the unmethylated form, which is represented by a thymine, by the ligation of Seq. ID 18 and Seq. ID 19 is proven. Both oligonucleotides hybridize on the complementary strand.
  • the oligonucleotides are added by adding a flap endonuclease (Clevase VIII Endonuclease) cleaved.
  • the detection of the ligation product is based on the detection of the mass of the remaining nucleotides (CT1 + dC or CT2 + dC) using MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the detection limit is significantly reduced by the size of the products and the defined charge of simply negative.
  • a defined fragment with a length of 242 bp was amplified with the specific primer oligonucleotides TAA GTA TGT TGA AGA AAG ATT ATT GTA G and phosphate-CGC ATC AAC TAA ATC ATT AAA A.
  • sequence ID 22 was ligated and detected by its MMT group.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeich-net, dass folgende Schritte ausgeführt werden: a) mindestens eine Nukleinsäure wird auf einer Festphase gebunden; b) Sondenmoleküle werden sequenzspezifisch an die Nuk-leinsäure hybridisiert, wobei die Sondenmoleküle mit ei-ner spaltbaren Bindung und einer Massenmarkierung verse-hen sind, welche für das Sondenmolekül spezifisch ist; c) Entfernung der nicht hybridisierten Sondenmoleküle; d) Kontaktieren der hybridisierten Sondenmoleküle mit ei-ner Matrix, die besagte spaltbaren Bindungen spaltet und zugleich als Matrix in einem MALDI-Massenspektrometer dient; e) Nachweis der Massenmarkierung an den Positionen, an denen die Nukleinsäure gebunden wurde.

Description

Verfahren zum Nachweis von Nu leinsäuresequenzen mittels spaltbarer Sondenmoleküle
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in Nukleinsäuren.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe- nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar .
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei- spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-
Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in üracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Met ylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch /Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällung- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and im- proved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15;24 (24) : 5064-6) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht wer- den, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylie- rungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May 15;26(10) .2255-64. Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Dörfler W, Hor- sthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic me- thylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hu Ge- net. 1997 Mar-Apr; 5 (2) : 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifi- ziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-i plantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov. ; 17 (3) : 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) . Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12) : 2529-31, WO-A 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12) : 2532-4) nachgewiesen. Zu- dem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO-A 99/28498).
Ein neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin- Methylierung mittels einer Taqman PCR, das als Methyl- Light bekannt geworden ist (WO-A 00/70090) . Mit diesem
Verfahren ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nachzuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse der Produkte erübrigt.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual, 1989. Für die Markierung von Amplifikaten sind vielfach massenmarkierte Oligonukleotide verwendet worden (www.quiagengenomics.com), die einfach herzustellen sind und nicht fragmentieren.
Als Massenmarkierungen werden z.B. Tritylgruppen mit verschiedenen Massen verwendet (Shchepinov, M.S., Southern E.M. Trityl mass-tags for encoding in combinatorial oli- gonucleotide synthesis (1999), Nucleic Acids Symposium Series 42: 107-108)
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka- ras M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of pro- teins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. A- nal Chem. 1988 Oct . 15; 60 (20) : 2299-301) . Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere. Die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet.
Technische Neuerungen der Hardware haben die Methode sig- nifikant verbessert. Erwähnenswert ist hierbei die „de- layed extraction"-Methode (DE) . Für DE wird die Beschleunigungsspannung mit einer Verzögerung zum Laserpuls eingeschaltet und dadurch eine verbesserte Auflösung der Signale erreicht, weil die Zahl der Stöße verringert wird. MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur A- nalyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995) , DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ioniza- tion Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Inno- vations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373) . Die Kopplung eines „Charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfind- lichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „Charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren. PNAs und Methylphosphonatoligonukleotide sind mit MALDI untersucht worden und lassen sich so analysieren. Derzeit ist diese Technologie in der Lage, im Massenbereich von 1.000 bis 4.000 Da, Moleküle mit einer Massendifferenz von 1 Da zu unterscheiden. Durch die natürliche Verteilung von Isotopen sind die meisten Biomoleküle jedoch schon etwa 5 Da breit. Technisch ist diese mas- senspektrometrische Methode also vorzüglich für die Analyse von Biomolekülen geeignet. Vernünftigerweise müssen zu analysierende Produkte, die unterschieden werden sol- len, also mindestens 5 Da auseinander liegen. In diesem Massenbereich könnten also 600 Moleküle unterschieden werden.
Als Sondenmoleküle sind in der Literatur neben DNA auch PNA und LNA vielfach beschrieben worden. Bei der PNA handelt es sich um ein synthetisches Nukleinsäureanalog, wo das Zucker-Phosphat Rückgrat ersetzt ist durch ein Peptid ähnliches Polyamid. Anstelle von 5'- und 3' -Enden haben PNAs N- und C-Enden. Wie die LNAs (Locked Nucleic Acids) (siehe www.cureon.com/technology/aboutlna) verfügen die PNAs über eine hohe Stabilität gegenüber Nukleasen und eine hohe Bindungsaffinität gegenüber komplementärer DNA.
Beschrieben sind photospaltbare Bausteine für MALDI-TOF- Messungen, die eine lichtgesteuerte Freisetzung der Proben erlauben (Olejnik et al., 1998, Nucleic Acids Res., 3572-3576) . Koster et al. (WO-A 98/20166) schlugen die Verwendung von spaltbaren Bindungen vor. Dazu sind Prime- roligonukleotide immobilisiert worden, die dann mit geno- mischer DNA hybridisiert wurden. Nach der anschließenden Extensionsreaktion wurden die entstandenen Produkte spezifisch von der Oberfläche gespalten und massenspektro- metrisch analysiert. Wiederum ähnlich wurde die Verwendung von photolytisch spaltbaren Oligonukleotidsonden auf einem Array vorgeschlagen (Jäschke, A. , Hausch, F.
EP1138782), wobei eine Multiplex Sequenzabhängige Modifi- kation der Oligonukleotidsonden durchgeführt wird und die Massen der modifizierten Sonden direkt auf dem Array gemessen werden. Das Gemisch der Zielsequenzen wird dabei durch die definierten Positionen der Sonden auf dem Array getrennt .
Matrixinduzierte Fragmentierung von P3 ' -N5 ' Phosphorami- dat enthaltende DNA ist in der Literatur beschrieben (Shchepinov, M., Denissenko, M., 2001, Nucleic Acids Res., 3864-3872). Dabei kann die P-N Bindung unter sauren Bedingungen gespalten werden.
Aufgabenstellung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen. Dazu sollen Sondenmoleküle sequenzspezifisch an eine oder mehrere Festphasen immobilisierte Nukleinsäuren hybridisiert werden. Diese Sondenmoleküle sollen mit einer spaltbaren Bindung und einer spezifischen Massenmarkie- rung versehen werden. Anschließend sollen die hybridisierten Sondenmoleküle mit einer Substanz oder einem Substanzgemisch kontaktiert werden, die die spaltbaren Bindungen spaltet und zugleich als Matrix in einem MALDI- Massenspektrometer dient. Die Massenmarkierungen sollen abschließend an den Positionen auf der Festphase nachgewiesen werden, an denen die Nukleinsäuren gebunden wurden.
Beschreibung der Erfindung Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen. Dieses Verfahren ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:
Im ersten Schritt des Verfahrens wird mindestens eine Nukleinsäureprobe auf einer Festphase gebunden. Die Sondenmoleküle werden im nächsten Schritt sequenzspezifisch an die Nukleinsäureprobe hybridisiert, wobei die Sondenmoleküle mit einer spaltbaren Bindung und einer Massenmarkierung versehen sind, welche für das Sondenmolekül spezifisch ist. Anschließend werden die nicht hybridi- sierten Sondenmoleküle entfernt. In einem weiteren
Schritt des Verfahrens werden die hybridisierten Sondenmoleküle mit einer Matrix kontaktiert, die die spaltbaren Bindungen spaltet und zugleich als Matrix in einem MALDI- Massenspektrometer dient. Die Massenmarkierung werden im letzten Schritt des Verfahrens an den Positionen nachgewiesen, an denen die Nukleinsäureprobe gebunden wurde.
Im folgenden ist dieses Verfahren detailliert beschrieben: Eine Nukleinsäure wird bevorzugt aus Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern oder allen ög- liehen Kombinationen hiervon erhalten.
Die Nukleinsäure wird amplifiziert, wobei dies bevorzugt mittels enzymatischer Pri erverlängerung, PCR, Rolling Circle Amplifikation, Ligase-Kettenreaktion oder anderen Verfahren erfolgt.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird die Amplifikation mehrerer unterschiedlicher Fragmente in einem Reaktionsgefäß durchgeführt.
Auf einer Festphase, die vorzugsweise auch als Probenträger eines Massenspektrometers dienen kann, wird mindestens eine Nukleinsäure gebunden. Die Festphase oder Festphasenoberfläche besteht besonders bevorzugt aus nicht- leitenden Materialen wie beispielsweise Glas. Besonders bevorzugt sind ferner leitende Materialien wie beispiels- weise Teflon, Silizium oder Black Conductive Polypropylen. Bevorzugt sind auch weitere Materialen wie Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
Erfindungsgemäß kann die Bindung der Nukleinsäure an die Oberfläche sowohl kovalent (z.B. durch einen Primer, der am 5 ' -Ende ein Thiol trägt und an eine mit Bromessigsäure aktivierte Oberfläche gebunden wird) als auch nichtkova- lent durch van der Waals Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen (z.B. durch Hitzei mobilisierung oder Inkubation) erfolgen.
Bevorzugt sind mehrere Nukleinsäuren auf einer Festpha- senoberflache in Form eines rechtwinkligen oder hexagona- len Rasters angeordnet. Alternativ bevorzugt ist es, dass auf einer Mehrzahl von Oberflächen jeweils zumindest eine Nukleinsäure angeordnet ist. Diese Festphasen können besonders bevorzugt in den Probenträger eines MALDI- Massenspektrometers eingesetzt werden.
Bei den nachzuweisenden Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um DNA-Sequenzen und insbesondere zwischen unterschiedlichen Proben veränderliche Sequenzen, die SNPs, Punktmutationen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen enthalten. Besonders bevorzugt sind die nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen chemisch vorbehandelte DNA- Sequenzen, welche zum Nachweis von DNA-Methylierung an bestimmten CpG Positionen dienen.
Besonders bevorzugt führt man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durch. Dabei werden alle nicht im Kontext CpG vorhandenen Cytosine in Thymidine umgewandelt, wodurch die Untersuchung indi- vidueller CpG Positionen ermöglicht wird. 1 U
Bevorzugt erfolgt die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose. Ebenfalls bevorzugt ist es, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.
Die für die Bindung an nachzuweisende Nukleinsäuren erforderlichen Sondenmoleküle werden im Stand der Technik oft kombinatorisch in Form von Bibliotheken hergestellt (EP1036202) , die auch in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt Anwendung finden.
Besonders bevorzugt werden die Sondenmoleküle mit einer spaltbaren Bindung und einer Massenmarkierung versehen, welche für das jeweilige Sondenmolekül spezifisch ist. Solche Markierungen können beispielsweise 6-
Triethylammoniumhexyryl-, 6-Trimethylammoniumhexyryl- o- der säurelabile Monomethoxytrityl- oder 4- Methyltritylschutzgruppen sein.
Die Masse einer Markierung unterscheidet sich vorzugsweise jeweils von der Masse aller anderen in einem Experiment verwendeten Markierungen um mindestens 1 Da. Die Sondenmoleküle umfassen bevorzugt mindestens ein CG, TG oder CA Dinukleotid.
Die unterschiedliche Masse kann besonders bevorzugt auch Resultat einer enzymatischen Reaktion sein. Hierbei wird die Sonde mit einer Massenmarkierung synthetisiert und anschließend enzymatisch modifiziert, wobei sich die Mas- se ändert.
Die Massenmarkierung wird besonders bevorzugt erst infolge einer enzymatischen Modifikation mit dem Sondenmolekül verbunden. In diesem Fall wird die Sonde chemisch ohne Massenmarkierung hergestellt und anschließend enzymatisch mit einer Massenmarkierung versehen. Bevorzugt wird die Sonde chemisch mit einer Massenmarkierung versehen und nicht enzymatisch verändert. Darüber hinaus ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die mit ei- ner Massenmarkierung versehene Sonde chemisch verändert wird. Das kann beispielsweise durch Säure erfolgen oder mit einer Behandlung nach Maxam und Gilbert.
Diese Sondenmoleküle, die besonders bevorzugt aus DNA o- der modifizierter DNA bestehen, werden sequenzspezifisch an die Nukleinsäuren hybridisiert. Bevorzugt sind die Sondenmoleküle RNA, LNA, PNA oder entsprechende Hybride davon, auch mit DNA oder modifizierter DNA kombiniert. Die nicht hybridisierten Sondenmoleküle werden entfernt. Die verbleibenden hybridisierten Sondenmoleküle werden vorzugsweise nach der Hybridisierung enzymatisch durch Primerverlängerung oder Ligation modifiziert. Als Enzyme für die Primerverlängerung kommen beispielsweise Thermo- sequenase oder Taq-Poly erase in Frage, wohingegen für die Ligation beispielsweise Ampligase DNA Ligase, Pfu o- der Taq DNA Ligase Anwendung finden.
Bevorzugt erfolgt die Hybridisierung der Amplifikate an zwei Klassen von Sondenmolekülen mit jeweils mindestens einem Mitglied, wobei die Sondenmoleküle der ersten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und wobei die Sondenmoleküle der zwei- ten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA unmethyliert vorläge.
Bevorzugt erfolgt eine Hybridisierung an zwei Klassen von Sondenmolekülen mit jeweils mindestens einem Mitglied, wobei die Sondenmoleküle der ersten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und weniger bevorzugt an die Sequenz, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA unmethyliert vorläge und wobei die Oligomere der zweiten Klasse an das zu untersuchende Amplifikat im wesentlichen unabhängig von der Methylierung besagten bestimmten Cyto- sins in der genomischen DNA hybridisieren.
Bevorzugt erfolgt eine Hybridisierung an zwei Klassen von Sondenmolekülen mit jeweils mindestens einem Mitglied, wobei die Sondenmoleküle der ersten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA unmethyliert vorläge und weniger bevorzugt an die Sequenz, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und wobei die Oligomere der zweiten Klasse an das zu untersuchende Amplifikat im wesentlichen unabhängig von der Methylierung besagten bestimmten Cyto- sins in der genomischen DNA hybridisieren.
Anschließend werden die nicht hybridisierten Sondenmoleküle entfernt .
Die hybridisierten Sondenmoleküle werden mit einer Matrix kontaktiert (z.B. durch sprühen, pipettieren, spotten), die die spaltbaren Bindungen spaltet und zugleich als Matrix in einem MALDI-Massenspektrometer dient. Dazu kommt beispielsweise eine 2' , 4' , 6' -Trihydroxyacetophenon (THA) Matrix oder 3-HPA (3-Hydroxypicolinsäure) Matrix in Frage, wobei die THA Matrix erfindungsgemäß mit verdünn- ter Säure wie TFA (Trifluoressigsäure) versetzt wird. Durch die Größe des Oligonukleotidspaltprdukts kann die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt werden. Beispiele für säureabspaltbare Schutzgruppen sind Monometho- xytrityl oder 4-Methyltrityl .
Die Spaltung der Oligonukleotide kann auch strukturspezifisch durch Zugabe einer Flap-Endonuklease wie Cleavage VIII erfolgen. Weiter können Endonukleasen zur Spaltung eingesetzt werden, die die Sonde aus der Mitte heraus spalten wie beispielsweise Mung Bean Nuklease oder T7 En- donuklease I. Weiter ist der Einsatz von sequenzspezifischen Endonukleasen zur Spaltung möglich, beispielsweise können dafür die Enzyme Tsp 5091 oder Msel eingesetzt werden. Darüber hinaus ist der Verdau mit einer 3'-
Endonuklease möglich, bevorzugt nach Zugabe saurer Matrix. Ferner werden Exonukleasen zur Spaltung eingesetzt. Eine 3' -5' -Exonuklease wie beispielsweise Exonuklease I spaltet die einzelsträngige Sonde vom 3' -Ende her bis zu einer Modifikation (z. B. Phosphothioat) . Eine 5' -3'- Exonuklease wie beispielsweise T7 Exonuklease spaltet entsprechend die einzelsträngige Sonde vom 5' -Ende her bis zu einer Modifikation.
Die Massenmarkierungen werden an denjenigen Positionen nachgewiesen, an denen die Nukleinsäure gebunden wurde. Besonders bevorzugt erfolgt dieser Nachweis mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie. Durch die bevorzugte Ladung der Massenmarkierung von einfach positiv oder ein- fach negativ wird die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt.
Das vorstehend beschriebene Verfahrens wird vorzugsweise verwendet zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Er- eignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin- testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krank- heit des At ungsSystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und etabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Das vorstehend beschriebene Verfahrens wird vorzugsweise verwendet zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Bevorzugt ist auch ein Kit, umfassend eine Festphase zur Immobilisierung der Nukleinsäure, Sondenmolekülen, Kompo- nenten für die Durchführung der massenspektrometrischen
Messung sowie eine Anleitung zur Durchführung des Verfahrens .
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren:
Durchführung der Methylierungsanalyse im Gen MDRl mittels einer spaltbaren Sonde
Beispiel: Anbindung der Zielsequenz an die Festphase Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base me- thylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hin- sichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinba- sen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin- Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrens- schritt verdünnt man die behandelte Nukleinsäure mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die Nukleinsäure in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Die PCR Reaktionen wurden in einem Thermocycler (Eppendorf GmbH) durchgeführt. Es wurden für einen 100 μl Ansatz 40 ng DNA, 0.07μmol/l von jedem Primeroligonukleotid 1 mmol/1 dNTPs und vier Einheiten HotstarTaq eingesetzt. Die übrigen Bedingungen wurden gemäß Herstellerangaben gewählt. Für die PCR wurde zuerst eine Denaturierung für 15 Minuten bei 96 °C durchgeführt, danach 40 Zyklen (60 Sekunden bei 96°C, 75 Sekunden bei 56 °C und 75 Sekunden bei 65 °C) und eine abschließenden El Wasser oder einer wässrigen Lösung. Be- vorzugt wird anschließend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die Nukleinsäre in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA- Polymerase. Die PCR Reaktionen wurden in einem Thermocyc- 1er (Eppendorf GmbH) durchgeführt. Es wurden für einen
100 μl Ansatz 40 ng DNA, 0.07μmol/l von jedem Primeroli- gonukleotid 1 mM dNTPs und vier Einheiten HotstarTaq eingesetzt. Die übrigen Bedingungen wurden gemäß Herstellerangaben gewählt. Für die PCR wurde zuerst eine Denaturierung für 15 Minuten bei 96 °C durchgeführt, danach 40 Zyklen (60 Sekunden bei 96°C, 75 Sekunden bei 56 °C und
75 Sekunden bei 65 °C) und eine abschließenden Elongation von 10 Minuten bei 72 °C. Das Vorhandensein der PCR Produkte wurde auf Agarosegelen überprüft. Einer der beiden Primeroligonukleotide war an seinem 5 ' -Ende Thiol (im folgenden Beispiel 8 stattdessen 5 ' -Ende Phosphat) modifiziert .
Im vorliegenden Fall werden Cytosine aus der potentiellen Promotorregion des Gens MDRl untersucht. Mit Sequenzen dieses Gens kann die Reaktion eines Patienten auf eine
Chemotherapie verfolgt werden. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden SH-TAA GTA TGT TGA AGA AAG ATT ATT GTA G (Seq. ID 1.) und CGC ATC AAC TAA ATC ATT AAA A (Seq. ID 2.) ein definiertes Fragment der Länge 242 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat wird mit seiner Thiol Modifizierung an einer Bromessigsäure behandelten Polyly- sin Festphase gebunden. Polylysinbeschichtete Glasobjektträger werden vorher in Ultraschall gereinigt und 1 h in 20 mmol/1 Bromessigsäure, 20 mmol/1 Dicylohexylcarbodii- mid, 2 mmol/1 4- (Dimethylamino) pyridin-Lösung aktiviert. Die Bindung mit dem PCR-Produkt erfolgt in einer 0,18 mol/1 Triscarboxyethylphosphin, 200 mmol/1 NaH2P04 Pufferlösung 2h in einer 25 °C warmen feuchten Kammer. Die PCR-Produkte werden mit 0,05 mol/1 NaOH denaturiert und dann analysiert.
Beispiel 1:
Das einzelsträngige PCR-Produkt wurde mit einem Oligo- nukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridi- siert. Dazu wurden säurelabile modifizierte Oligonukleotide verwendet: 5 ' -TAT AAA CAC GTC TTT CApnA-Amino-3 λ (Seq. ID 3.) oder 5 ' -TAT AAA CAC ATC TTT CapnA-Amino-3 Λ (Seq. ID 4.) wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 198 des Amplifikats befindet. Bei dem Adenosin an der vorletzten Position beider Oligonukleotide handelt es sich um ein 5 'Amino-Adenosin, welches durch Säure leicht hydrolysiert wird. An die Aminofunktion am 3 ' -Ende wird vorher ein 6-Triethylammoniumhexyryl-N- hydroxysuccinimidylester (199 Da) (CT1) , bzw. ein 6- Trimethylammoniumhexyryl-N-hydroxysuccinimidylester (129 Da) (CT2) gekoppelt. Dadurch unterscheiden sich die Massen der beiden kleineren Spaltprodukte um 70 Da. Das me- thylierte Cytosin wird mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 3.) nachgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustandsform, die durch ein Thymin repräsentiert wird, mit dem Oligo- nukleotid (Seq. ID 4. ) nachgewiesen wird. Beide Oligonukleotide hybridisieren an dem jeweils komplementären Strang. Durch Aufbringen von 350 mmol/1 3-HPA in Aceto- nitril mit 1,5% Trifluoressigsäure wird die säurelabile Spaltstelle hydrolisiert . Der Nachweis des Hybridisie- rungsprodukts beruht auf dem Nachweis der Masse der Spaltprodukte mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie. Durch die Größe des Oligonukleotidspaltproduktes und die definierte Ladung von einfach positiv wird die Nachweisgrenze entscheidend herabgesetzt. Nur wenn in der Bisul- fit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungs- reaktion der amplifizierten DNA mit der Sonde (Seq. ID3., Seq. ID 4.). Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybri- disierungsprodukt und damit über die detektierte Masse.
Durch den Einbau der PN-Bindung direkt am 3 Λ-Ende hat man zusätzlich den Vorteil eine nicht geladene Massenmarkierung verwenden zu können. Zum Beispiel lässt sich dann ein Peptid ankoppeln.
Beispiel 2 Das einzelsträngige PCR-Produkt wurde mit einem Oligo- nukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert. Dazu wurden modifizierte Oligonukleotide verwendet: 5'Amino-TAT AAA CAC GTC TTT CAA (Seq. ID 5.) oder
5'Amino-TAT AAA CAC ATC TTT CAA (Seq. ID 6.) An die Ami- nofunktion am 5 ' -Ende wird vorher ein 6- Triethylammoniumhexyryl-N-hydroxysuccinimidylester (199 Da) (CTl) , bzw. ein 6-Trimethylammoniumhexyryl-N- hydroxysuccinimidylester (129 Da) (CT2) gekoppelt. Dadurch unterscheiden sich die Massen der beiden kleineren Spaltprodukte um 70 Da. Das methylierte Cytosin wird mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 5.) nachgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustandsform, die durch ein Thy in reprä- sentiert wird, mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 6.) nachgewiesen wird. Beide Oligonukleotide hybridisieren an dem jeweils komplementären Strang. Die Oligonukleotide werden dann einer Behandlung nach Maxam und Gilbert unterzogen. Durch das Aufbringen von Dimethylsulfat und Erhitzen im alkalischen pH werden alle Adenosine und Guanosine gespalten. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf dem Nachweis der Masse der Spaltprodukte mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie. In diesem Fall beobachtet man eine Masse von (498 Da + 199 Da(CTl + dT) , bzw. + 129 Da(CT2 + dT) ) 697, bzw. 627 Da. Durch die Größe des Oli- gonukleotidspaltproduktes wird die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit der Sonde (Seq. ID 5., Seq. ID 6.). Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisie- rungsprodukt und damit über die detektierte Masse. Spaltet man die Cytosine und Thymidine mit Hydrazin und Pipe- ridin kann anschließend ein 3 Λ-modifiziertes Oligonukleo- tidpärchen untersucht werden. Als Spaltprodukte ergäben sich in diesem Fall dAdA-CTl und dAdA-CT2. Alle denkbaren Spaltprodukte sind jedoch mehrfach geladen.
Beispiel 3: Das einzelsträngige PCR-Produkt wurde mit einem Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert. Dazu wurden modifizierte Oligonukleotide verwendet : 5 -Amino-TAT AAA CAC GTC TTT CAA (Seq. ID 7. ) oder 5λ- Amino-5Λ-TAT AAA CAC ATC TTT CAA (Seq. ID 8. ) An die Ami- nofunktion am 5 ' -Ende wird vorher eine säureabspaltbare Schutzgruppe wie 4-Methyltrityl (258 Da), bzw. Monometho- xytrityl (289 Da) gekoppelt. Dadurch unterscheiden sich die Massen der beiden kleineren Spaltprodukte um 14 Da. Das methylierte Cytosin wird mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 7. ) nächgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustandsform, die durch ein Thymin repräsentiert wird, mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 8. ) nachgewiesen wird. Beide Oligonukleotide hybridisieren an dem jeweils komplementären Strang. Die Oligonukleotide werden mit einer säurehaltigen 2 \ 4 \ 6 -Trihydroxyacetophenon Matrix überdeckt und im MALDI-TOF vermessen. Dabei werden die Oligonukleotide von ihren Massenmarkierungen getrennt. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf dem Nachweis der Masse der Schutzgruppe mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie . Durch die Größe der Schutzgruppe und die definierte Ladung von +1 wird die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit der Sonde (Seq. ID 7. , Seq. ID 8.). Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt und damit über die detektierte Masse.
Beispiel 4 Das einzelsträngige PCR-Produkt wurde mit einem Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert. Dazu wurden modifizierte Oligonukleotide verwendet : 5 5 -AminoTmptAT AAA CAC GTC TTT CAA-3 (Seq. ID 9.) oder 5Λ-AminoTmptAT AAA CAC ATC TTT CAA-3 (Seq. ID 10.). Das mpt ist ein Methylphosphonat . An die Aminofunktion am 5'- Ende wird vorher ein 6-Triethylammoniumhexyryl-N- hydroxysuccinimidylester (199 Da) (CT1) , bzw. ein 6-
10 Trimethylammoniumhexyryl-N-hydroxysuccinimidylester (129 Da) (CT2) gekoppelt. Dadurch unterscheiden sich die Massen der beiden kleineren Spaltprodukte um 70 Da. Das me- thylierte Cytosin wird mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 9.) nachgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustandsform,
15. die durch ein Thymin repräsentiert wird, mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 10.) nachgewiesen wird. Beide Oligonukleotide hybridisieren an dem jeweils komplementären Strang. Die Oligonukleotide werden mit einer 3 - Endoglykosidase verdaut. Der Nachweis des Hybridisie-
20 rungsprodukts beruht auf dem Nachweis der Masse des verbleibenden dT und des Charge tags mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie. Durch die Größe der Massenmarkierung und die definierte Ladung von -1 wird die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt. Nur wenn in der Bisulfit
25 behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit der Sonde (Seq. ID 9., Seq. ID 10.). Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisie-
30. rungsprodukt und damit über die detektierte Masse. Man kann das Methylphosphonat auch ganz ans 3Λ-Ende des Oli- gonukleotids setzten und erhält dann auch ohne Charge tag ein einfach negativ geladenes Molekül.
35 Beispiel 5: Das einzelsträngige PCR-Produkt wurde mit zwei in der Sequenz auf einander folgende Oligonukleotide unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert. Dazu wurden modifizierte Oligonukleotide verwendet: δ'-TTC AAC TTA TAT AAA CAmtpC-3 * (Seq. ID 11.) und 5ΛTmtpTC TTT CAA AAT TCA CAT-3 (Seq. ID 12.) oder 5 GmtpTC TTT CAA AAT TCA CAT-3 (Seq. ID 13.) Die Abkürzung mtp steht für Methylphosphonat. Das methylierte Cytosin wird durch die Ligation von Seq. ID 11. und Seq. ID 12. nachgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustandsform, die durch ein T ymin repräsentiert wird, durch die Ligation von Seq. ID 11 und Seq. ID 13 nachgewiesen wird. Beide Oligonukleotide hybridisieren an dem jeweils komplementären Strang. Die Oligonukleotide werden durch 3 - Endoglykosidase und 5 Endoglykosidase verdaut. Der Nachweis des Ligationsprodukts beruht auf dem Nachweis der Masse der verbleibenden Nukleotide (AmtpCp-T tpC oder AmtpCp-TmtpC) mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie. Durch die Größe der Produkte und die definierte Ladung von einfach negativ wird die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt. Durch weitere Methylphosphonate kann die Masse weiter verschoben werden.
Beispiel 6: Das einzelsträngige PCR-Produkt wurde mit zwei in der Sequenz auf einander folgende Oligonukleotide unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert. Dazu wurden modifizierte Oligonukleotide verwendet: 5 -TTC AAC TTA TAT AAA CApnC-3 (Seq. ID 14.) und 5ΛATmtpC TTT CAA AAT TCA CAT-3 Λ (Seq. ID 15.) oder
5λGmtpTC TTT CAA AAT TCA CAT -3 Λ (Seq. ID 16.) Die Abkürzung mtp steht hier für Methylphosphonat. Das methylierte Cytosin wird durch die Ligation von Seq. ID 14. und Seq. ID 15. nachgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustands- form, die durch ein Thymin repräsentiert wird, durch die Ligation von Seq. ID 14 und Seq. ID 15 nachgewiesen wird. Beide Oligonukleotide hybridisieren an dem jeweils komplementären Strang. Die Oligonukleotide werden durch Zugabe saurer 3-HPA (3-Hydroxypicolinsäure) Matrix mit 0,3% TFA (Trifluoressigsäure) und Verdau mit einer 3Λ- Endoglykosidase verdaut. Der Nachweis des Ligationspro- dukts beruht auf dem Nachweis der Masse der verbleibenden Nukleotide (NH3+-Cp-Ap-TmtpC oder NH3+-Cp-Gp-TmtpC) mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie. Durch die Größe der Produkte und die definierte Ladung von einfach negativ wird die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt. Anstelle des Methylphosphonates kann man im zweiten Oligonukleotid an der zweiten Position am 5 ' -Ende auch eine NP (Stickstoff-Phosphor) -Bindung, also ein 3 'Amino- Guaonsid bzw. 3 'Amino-Thymidin. Es entsteht ein NH3+-Cp- ANH3+.
Beispiel 7:
Das einzelsträngige PCR-Produkt wurde mit zwei in der Sequenz aufeinander folgende Oligonukleotide unter Ausbil- düng einer Duplexstruktur hybridisiert. Die beiden Oligonukleotide überlappen sich. Dazu wurden modifizierte Oligonukleotide verwendet:
5Λ-TTC AAC TTA TAT AAA CAC-3 λ (Seq. ID 17.) und 5 ΛAmino- CATC TTT CAA AAT TCA CAT-3 Λ (Seq. ID 18.) oder 5 ΛAmino- CGTC TTT CAA AAT TCA CAT-3 (Seq. ID 19.). An die Amino- funktion am 5 ' -Ende wird vorher ein 6-
Triethylammoniumhexyryl-N-hydroxysuccinimidylester (199 Da) (CT1) , bzw. ein 6-Trimethylammoniumhexansäure-N- hydroxysuccinimidylester (129 Da) (CT2) gekoppelt. Das methylierte Cytosin wird durch die Ligation von Seq. ID 17. und Seq. ID 18. nachgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustandsform, die durch ein Thymin repräsentiert wird, durch die Ligation von Seq. ID 18 und Seq. ID 19 nachgewiesen wird. Beide Oligonukleotide hybridisieren an dem jeweils komplementären Strang. Die Oligonukleotide werden durch Zugabe einer Flap-Endonuklease (Clevase VIII Endonuklease) gespalten. Der Nachweis des Ligationspro- dukts beruht auf dem Nachweis der Masse der verbleibenden Nukleotide (CT1 + dC oder CT2 + dC) mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie. Durch die Größe der Produkte und die definierte Ladung von einfach negativ wird die Detektionsgrenze entscheidend herabgesetzt.
Beispiel 8:
Hier wurde mit den spezifischen Primeroligonukleotiden TAA GTA TGT TGA AGA AAG ATT ATT GTA G und Phosphat-CGC ATC AAC TAA ATC ATT AAA A ein definiertes Fragment der Länge 242 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat wurde mit lambda-Exonuklease verdaut, so dass der 5" -Phosphat modifizierte Strang abgedaut wurde und nur noch ssDNA (ss=single stranded) vorlag. Diese wurde nun an ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5 -Phosphat-TC TTT CAA AAT TCA CAT-Amino-3Λ (Seq. ID 20) unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert. Dieses Oligonukleotid ist über seine 3 ' -Aminomodifikation an eine aktivierte Ober- fläche gebunden. Dann wurde ein Ligationsmix hinzugefügt, der Ligase, Ligasepuffer und eines der folgenden zwei 0- ligonukleotide enthielt: 5 ' -DMT-ACT-3 ' (Seq. ID 21) oder 5 -MMT-ACG-3" (Seq. ID 22) (DMT=Dimethyltrityl, MMT=Monomethyltrityl) „ Das methylierte Cytosin wurde durch die Ligation von Seq. ID 20 und Seq. ID 21 nachgewiesen. Dabei wurde die Tritylgruppe durch die Zugabe von saurer Matrix abgespalten und deren Masse im Mas- senspektrometer analysiert. Bei einer unmethylierten Probe wurde während der Bisulfitreaktion ein T anstelle ei- nes C eingebaut, die Sequenz ID 22 ligiert und durch ihre MMT-Gruppe nachgewiesen. Durch die Verwendung weiterer Tritylgruppen können alle möglichen CpG Positionen in der beschriebenen Ligasereaktion untersucht werden.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte ausgeführt werden:
a) mindestens eine Nukleinsäure wird auf einer Fest- phase gebunden;
b) Sondenmoleküle werden sequenzspezifisch an die Nukleinsäure hybridisiert, wobei die Sondenmoleküle mit einer spaltbaren Bindung und einer Massenmarkierung versehen sind, welche für das Sondenmolekül spe- zifisch ist;
c) Entfernung der nicht hybridisierten Sondenmoleküle;
d) Kontaktieren der hybridisierten Sondenmoleküle mit einer Matrix, die besagte spaltbaren Bindungen spaltet und zugleich als Matrix in einem MALDI- Massenspektrometer dient;
e) Nachweis der Massenmarkierung an den Positionen, an denen die Nukleinsäure gebunden wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen DNA- Sequenzen und insbesondere zwischen unterschiedlichen Nukleinsäuen veränderliche Sequenzen sind, die SNPs, Punktmutationen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen enthalten.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen ehe- misch vorbehandelte DNA-Sequenzen sind und insbesondere mit Bisulfit behandelte Sequenzen, welche zum Nachweis von DNA-Methylierung an bestimmten CpG Positionen dienen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure vor der Bindung an die Festphase amplifiziert wird, wobei dies bevorzugt mittels enzymatischer Primerverlängerung, PCR, Rolling Circle Amplfikation, Ligase-Kettenreaktion oder anderen Verfahren erfolgen kann.
5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase der Pro- benträger eines Massenspektrometers ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase in den Probenträger eines MALDI-Massenspektrometers eingesetzt werden kann.
8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Nukleinsäuren auf der Festphasenoberfläche in Form eines rechtwin - ligen oder hexagonalen Rasters angeordnet sind.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle DNA oder modifizierte DNA sind.
10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle LNA, PNA oder entsprechende Hybride davon, auch mit DNA oder modifizierter DNA, sind.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle nach der Hybridisierung enzymatisch durch Primerverlängerung modifiziert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle nach der Hybridisierung enzymatisch durch Ligation modifiziert werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, da- durch gekennzeichnet, dass die Massenmarkierung erst infolge der enzymatischen Modifikation mit dem Sondenmolekül verbunden ist .
14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Massenmarkierung eine einzelne positive oder eine einzelne negative Ladung trägt .
15. Verfahren nach einem voranstehenden Ansprüche, da- durch gekennzeichnet, dass die Massen einer Markierung sich jeweils von der Masse aller anderen in einem Experiment verwendeten Markierung um mindestens 1 Da unterscheidet.
16. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle mindestens ein CG, TG oder CA Dinukleotid umfassen.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine Hybridisierung der Amplifikate an zwei Klassen von Sondenmole- külen mit jeweils mindestens einem Mitglied erfolgt, wobei die Sondenmoleküle der ersten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und wobei die Sondenmoleküle der zweiten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cy- tosin in der genomischen DNA unmethyliert vorläge.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine Hybridisierung an zwei Klassen von Sondenmolekülen mit jeweils mindestens einem Mitglied erfolgt, wobei die Sondenmoleküle der ersten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und weniger bevorzugt an die Sequenz, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA unmethyliert vorläge und wobei die Oligomere der zweiten Klasse an das zu untersuchende Amplifikat im wesentlichen unabhängig von der Methylierung besagten bestimmten Cytosins in der genomischen DNA hybridisieren.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine Hybridisierung an zwei Klassen von Sondenmolekülen mit jeweils mindestens einem Mitglied erfolgt, wobei die Sondenmoleküle der ersten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA unmethyliert vorläge und weniger bevorzugt an die Sequenz, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn ein zu untersuchendes Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und wobei die Oli- gomere der zweiten Klasse an das zu untersuchende
Amplifikat im wesentlichen unabhängig von der Methylierung besagten bestimmten Cytosins in der genomischen DNA hybridisieren.
20. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure aus Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern oder allen möglichen Kombinationen hiervon erhalten wurde.
21. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressions- Symptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin- testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion,
Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des y
Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabo- lische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
22. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Unterscheidung von Zelltypen o- der Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
23. Kit, umfassend ein Festphase zur Immobilisierung der Nukleinsäure, Sondenmolekülen sowie Komponenten für die Durchführung der massenspektrometrischen Messung sowie eine Anleitung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche .
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