EP1537236A2 - Verbesserte verfahren zur synthese von nukleinsäuren - Google Patents

Verbesserte verfahren zur synthese von nukleinsäuren

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Publication number
EP1537236A2
EP1537236A2 EP03750483A EP03750483A EP1537236A2 EP 1537236 A2 EP1537236 A2 EP 1537236A2 EP 03750483 A EP03750483 A EP 03750483A EP 03750483 A EP03750483 A EP 03750483A EP 1537236 A2 EP1537236 A2 EP 1537236A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymerase
rna polymerase
rna
synthesis
ntps
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03750483A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Guido Krupp
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AMPTEC GmbH
Original Assignee
ARTUS GESELLSCHAFT fur MOLEKULARBIOLOGISCHE DIAGNOSTIK und ENTWICKLUNG MBH
ARTUS GES fur MOLEKULARBIOLOG
Artus Gesellschaft fur Molekularbiologische Diagnostik und Entwicklung Mbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ARTUS GESELLSCHAFT fur MOLEKULARBIOLOGISCHE DIAGNOSTIK und ENTWICKLUNG MBH, ARTUS GES fur MOLEKULARBIOLOG, Artus Gesellschaft fur Molekularbiologische Diagnostik und Entwicklung Mbh filed Critical ARTUS GESELLSCHAFT fur MOLEKULARBIOLOGISCHE DIAGNOSTIK und ENTWICKLUNG MBH
Publication of EP1537236A2 publication Critical patent/EP1537236A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Definitions

  • the present invention relates to improved methods for the synthesis of nucleic acids, in which a polymerase, a nucleic acid which can serve as a template for the polymerase, NTPs and Mn 2+ are incubated under conditions which enable the synthesis of a nucleic acid strand, the conditions being characterized in that are that they have a Mn 2+ / NTP molar ratio of not more than 0.7.
  • the invention relates in particular to methods for the production of RNA, in which a DNA is used as a template and an amplification rate of at least 1000-fold is achieved.
  • the present invention relates to kits which comprise components necessary for carrying out the method according to the invention.
  • nucleic acids in vitro are required for a large number of molecular biological methods, for example for cloning, sequence analysis, in vitro expression, etc. Accordingly, methods have been developed by means of which Nucleic acids can be synthesized in vitro. The processes can generally be distinguished by the reaction product, DNA or RNA.
  • In vitro transcription is a process for the synthesis of RNA, usually starting from a double-stranded DNA template.
  • RNA polymerase and NTPs for an enzymatic reaction in the
  • Mg + is thus an important component of the reaction and is usually added in excess compared to the NTP concentration (Milligan and Uhlenbeck, Methods in Enzymology, Vol. 180 (1989), 51-62; and yatt et al. , Biotechniques, Voll. 11 (1991), 764-769).
  • US Pat. No. 5,256,555 suggests using the nucleotides in the reaction in a concentration of more than 16 mM.
  • the Mg + required for the reaction should be used in a concentration which is not more than 10% above the concentration of the sum of all nucleotides.
  • Inorganic pyrophosphatase should also be present in the reaction mixture.
  • PCR polymerase chain reaction
  • single-stranded primers oligonucleotides with a chain length of usually 12 to 24 nucleotides
  • the primers are extended to a double strand by means of a DNA polymerase and the deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs, namely dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
  • dNTPs deoxyribonucleoside triphosphates
  • the double strand is separated into single strands by exposure to heat.
  • the temperature is lowered to such an extent that single-strand primers attach again to the DNA single-strands.
  • the primers are elongated again into a second strand by the DNA polymerase.
  • reaction conditions can be selected in such a way that a double strand is formed from almost every single DNA strand during each reaction run, which is subsequently split back into two single strands, which again serve as a matrix for further strands.
  • a reverse transcription is carried out before this method, in which a DNA single strand (the so-called cDNA) is formed from an RNA by means of an RNA-dependent DNA polymerase, the PCR reaction can also be carried out directly on the multiplication of nucleic acids from a RNA sequence applicable (cf. EP 201 184).
  • DE 101 43 106.6 and DE 102 24 200.3 describe both methods for the amplification of ribonucleic acids, which comprise a combination of individual steps of the PCR reaction and a transcription.
  • the term “molar ratio Mn 2 + / NTP” is used to represent the quotient of the molar concentra- tion ratio of the MMnn ++ iimm ratio to the molar concentration of all NTPs as a number.
  • the conditions for the synthesis of the nucleic acid strand are selected such that the molar ratio of Mn 2+ / NTP is from 0.2 to 0.6, preferably from 0.3 to 0.5.
  • the total concentration of the NTPs is preferably 4 to 24 mM; when using four different NTPs, 1 to 6mM each.
  • Mn + of 0.8 M molar ratio of 0.2 when the NTPs are 4mM
  • 14.4 mM molar ratio of 0.6 when the NTPs are 24mM
  • RNA polymerases in particular of DNA-dependent RNA polymerase, which require a DNA as template which contains a promoter for the synthesis of RNA, are particularly preferred for all embodiments of the invention. It can thus be, for example, a T7 RNA polymerase, a T3 RNA polymerase, or an SP6 RNA polymerase.
  • the RNA polymerase can be an RNA-dependent or a DNA-dependent polymerase. Most of the naturally DNA-dependent RNA polymerases can also recognize RNA as a template if a suitable structure is present (cf. Konarska, MM and Sharp, PA, CellVol. 57 (1989), 423-431; and Konarska, MM and Sharp, PA, 1990, Cell Vol. 63: 609-618).
  • the polymerase and the nucleic acid, which serves as the template, must match.
  • the nucleic acid, which can serve as a template for an RNA polymerase must have, for example, recognition sequences or recognition structures which enable the RNA polymerase to start the synthesis.
  • DNA is preferably used as a template for the RNA polymerase.
  • Corresponding DNA can contain a promoter region which can be recognized by the RNA polymerase and used for the start of the synthesis.
  • the DNA can form a recognition structure that enables the RNA polymerase to initiate the synthesis.
  • Corresponding recognition structures are described, for example, in Krupp (Nucleic Acids Res. Vol. 17 (1989), 3023-3036) and in Kuhn et al. (Nature Vol. 344 (1990), 559-562).
  • the nucleic acid used as a template for the polymerase can be present in a very low concentration.
  • the template can be used, for example, in the form of DNA or mRNA in an amount of at least 0.1 picogram, or 0.2 attomol in a batch of 20 ⁇ l, thus a concentration of at least 10 femtomolar.
  • the reaction mixture contains NTPs, ATP, UTP, CTP and GTP usually being used when using an RNA polymerase. In the case of a transcription customary in the prior art, all of the NTPs mentioned here are used in one reaction mixture. However, it may also be desirable or advantageous to use only one or some of the NTPs.
  • dNTPs can also be used when carrying out the method according to the invention using the RNA or DNA polymerase.
  • This procedure has the particular advantage that the transcript receives all or part of the DNA properties, i.e. it becomes nuclease resistant and provides a better template for RNA polymerase.
  • DATP, dTTP, dCTP and / or dGTP are usually used as dNTPs.
  • NTPs and / or the dNTPs can be present as a modified compound or derivatives.
  • Derivatizations customary in the prior art include the coupling of biotin or a fluorescent marker, which can simplify, for example, the detection of the synthesis products.
  • the reaction time and other reaction conditions can be easily selected by the person skilled in the art depending on the polymerase used and the amplification rate to be achieved.
  • the incubation period can be, for example, from 1 to 24 hours, preferably from 4 to 16 hours.
  • T7 RNA polymerase it makes sense to carry out the reaction in the range from 30 ° C to 45 ° C.
  • the method according to the invention enables a surprising improvement in the amplification rate.
  • the ratio of the amount of synthetically produced nucleic acids to the amount of the template originally present is referred to as the amplification rate.
  • the method according to the invention enables an amplification rate of at least 1000, preferably at least 2000. With optimal reaction conditions, an amplification rate of 2500 was even achieved.
  • the methods according to the invention can be used for a variety of purposes.
  • the improved methods for producing nucleic acids can be used, for example, in the methods described in DE 101 43 106.6 and DE 102 24 200.3 for the amplification of ribonucleic acids.
  • the nucleic acids obtained by means of the method according to the invention can be bound to a chip as probes.
  • the methods can be used for in vitro transcription, for the investigation of interactions with nucleic acid binding factors, as aptamers for the specific binding of molecules, as ribozmye, etc.
  • kits for the synthesis of nucleic acids which comprise, in one or more containers, a polymerase, NTPs, dNTPs and / or their derivatives (for example biotinylated or fluorescence-linked NTPs or dNTPs) and Mn + .
  • the polymerase is preferably a DNA-dependent RNA polymerase which, for the synthesis of RNA, requires a DNA as a template which contains a promoter.
  • the RNA polymerase is the T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, or SP6 RNA polymerase.
  • Corresponding kits preferably also contain instructions for performing one of the methods according to the invention.
  • Corresponding instructions or manuals describe exactly the amount in which the individual components of the reaction have to be mixed with one another in order to obtain optimum synthesis performance.
  • the transcription performance of the RNA polymerase was determined as a function of different concentrations of Mn 2 ' + and Mg + .
  • Inhibitor 40 U T7 RNA polymerase, 4 mM NTPs (each; gives a total of 16 mM) and Mn 2+ or Mg 2+ in a concentration of 4 mM to 10 mM and pipetted together and incubated for 16 hours.
  • the aim of this example was to determine the optimal NTP concentration depending on the Mn / NTP ratio.
  • Example 2 For this purpose, series of experimental approaches for in vitro transcription as in Example 1 were created.
  • the concentration of the individual NTPs was from 2 mM to 10 mM and the concentration of the MnCl 2 was from 2.4 mM to 24 mM. This results in Mn / NTP ratios of 0.3 to 0.6.
  • the amount of transcript (in ng) obtained from the transcription was determined by ethidium bromide staining of the gel and a series of RNA dilutions as the standard in the gel.
  • the amplification rate of the in vitro transcription was determined as a function of time.
  • an in vitro transcription reaction was first prepared as described in Example 1, using 4.8 mM MnCl 2 and 4 mM NTP (total 16 mM) (corresponds to a ratio of 0.3).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren, bei dem man eine Polymerase, eine Nukleinsäure, die als Matrize für die Polymerase dienen kann, NTPs und Mn<2+> unter Bedingungen inkubiert, welche die Synthese eines Nukleinsäurestranges ermöglichen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Bedingungen ein Molverhältnis von Mn<2+>/NTP von nicht mehr als 0,7 umfassen.

Description

Verbesserte Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren, bei denen man eine Polymerase, eine Nukleinsaure, die als Matrize für die Polymerase dienen kann, NTPs und Mn2+ unter Bedingungen inkubiert, welche die Synthese eines Nukleinsaurestranges ermöglichen, wobei die Bedingungen dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Molverhältnis von Mn2+/NTP von nicht mehr als 0,7 umfassen.
Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von RNA, bei denen eine DNA als Matrize verwendet wird und eine Amplifikationsrate von mindestens 1000-fach erzielt wird. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Kits, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren notwendigen Bestandteile umfassen.
Die Vermehrung von Nukleinsäuren in vitro ist für eine Vielzahl molekularbiologischer Verfahren, beispielsweise für die Klonie- rung, Sequenzanalyse, in vitro Expression, etc. erforderlich. Dementsprechend sind Verfahren entwickelt worden, mittels derer Nukleinsäuren in vitro synthetisch hergestellt werden können. Die Verfahren lassen sich dabei im Allgemeinen durch das Reaktions- produkt, DNA oder RNA, unterscheiden.
Die in vitro Transkription ist ein Verfahren zur Synthese von RNA üblicherweise ausgehend von einer doppelsträngigen DNA-Matrize.
Dabei werden isolierte Bestandteile der zellulären Transkription
(RNA-Polymerase und NTPs) für eine enzymatische Reaktion im
Reagenzglas genutzt. Man geht dabei davon aus, dass das Substrat für die Synthesereaktion ein Komplex aus Mg + und NTP ist. Mg + ist somit ein wichtiger Bestandteil der Reaktion und wird üblicherweise im Vergleich zu der NTP-Konzentration in einem Überschuß zugegeben (Milligan und Uhlenbeck, Methods in Enzymolo- gy, Vol. 180 (1989), 51-62; und yatt et al . , Biotechniques, Voll. 11 (1991), 764-769).
Zur Optimierung der Amplifikationsrate bei der in vitro Transkription schlägt die US 5,256,555 beispielsweise vor, die Nukleotide in einer Konzentration von insgesamt mehr als 16 mM in die Reaktion einzusetzen. Gleichzeitig soll das für die Reaktion notwendige Mg + in einer Konzentration eingesetzt werden, die nicht mehr als 10 % oberhalb der Konzentration der Summe aller Nukleotide beträgt. Ferner soll anorganische Pyro- phosphatase in der Reaktionsmischung vorliegen.
Das bekannteste Verfahren zur Synthese von DNA ist die Polymera- se-Ketten-Reaktion ( "polymerase chain reaction" oder PCR) , welche Mitte der 80er Jahre von Kary Mullis entwickelt wurde (vgl. Saiki et al., Science, Vol. 230 (1985), 1350-1354; und EP 201 184).
Bei der PCR-Reaktion lagern sich Einzelstrang-Primer (Oligo- nukleotide mit einer Kettenlänge von üblicherweise 12 bis 24 Nukleotiden) an eine komplementäre, einzelsträngige DNA-Sequenz an. Die Primer werden mittels einer DNA- olymerase und den Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs, nämlich dATP, dCTP, dGTP, dTTP) zu einem Doppelstrang verlängert. Der Doppelstrang wird durch Hitzeeinwirkung in Einzelstränge aufgetrennt. Die Temperatur wird so weit gesenkt, dass sich erneut Einzelstrang- Primer an die DNA-Einzelstränge anlagern. Die Primer werden durch die DNA-Polymerase erneut zu einem Zweitstrang elongiert.
Bei Wiederholung der obigen Schritte ist eine exponentielle Vermehrung der Ausgangs-DNA-Stränge möglich, da die Reaktionsbedingungen so gewählt werden können, dass aus nahezu jedem DNA- Einzelstrang bei jedem Reaktionsdurchlauf ein Doppelstrang gebildet wird, der nachfolgend wieder in zwei Einzelstränge aufgespalten wird, welche wiederum als Matrize für weitere Stränge dienen.
Sofern vor diesem Verfahren eine reverse Transkription durchgeführt wird, bei der mittels einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase ein DNA-Einzelsträng (die sogenannte cDNA) aus einer RNA gebildet wird, kann die PCR-Reaktion auch unmittelbar auf die Vermehrung von Nukleinsäuren ausgehend von einer RNA-Sequenz anwendbar (vgl. EP 201 184) .
Zu den genannten Reaktions-Grundschemata wurden eine Vielzahl von Alternativen entwickelt, die sich in Abhängigkeit des Aus- gangsmaterials (RNA, DNA, Einzelstränge, Doppelstränge) und des Reaktionsproduktes (Vermehrung spezifischer RNA- oder DNA- Sequenzen in einer Probe oder Vermehrung aller Sequenzen) voneinander unterscheiden.
Die DE 101 43 106.6 und DE 102 24 200.3 beschreiben beide Verfahren zur Vermehrung von Ribonukleinsäuren, welche eine Kombination aus einzelnen Schritten der PCR-Reaktion und einer Transkription umfassen.
Trotz der beschriebenen Fortschritte besteht nach wie vor ein Bedürfnis an verbesserten Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren, insbesondere an Verfahren, die eine hohe Syntheseleistung und -ausbeute bei einem geringen Verbrauch der Chemikalien ermöglichen. Diese Aufgabe wurde nunmehr durch Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren gelöst, bei denen man eine Polymerase, eine Nukleinsaure, die als Matrize für die Polymerase dienen kann, NTPs und Mn2+ unter Bedingungen inkubiert, welche die Synthese eines Nukleinsaurestranges ermöglichen, wobei die Bedingungen dadurch gekennzeichnet sind, dass diese ein Molverhältnis von Mn +/NTP von nicht mehr als 0,7 umfassen.
Erfindungsgemäß wurde somit überraschenderweise festgestellt, dass eine deutlich verbesserte Syntheserate der Polymerase bereits durch die Auswahl des genannten Molverhältnisses von Mn2+/NTP erzielt werden kann. Gleichzeitig werden durch die geringere Konzentration der einzusetzenden NTPs Kosten gespart. Eine hohe Amplifikationsrate läßt sich somit auf einfache und kostengünstige Art und Weise erzielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird der Begriff "Molver- hältnis Mn 2+/NTP" verwendet, um den Quotienten der molaren Konzzeennttrraattiioonn ddeess MMnn ++ iimm VVeerrhhääJltnis zur molaren Konzentration aller NTPs als Zahl darzustellen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungs- gemäßen Verfahren werden die Bedingungen für die Synthese des Nukleinsaurestranges so gewählt, dass das Molverhältnis von Mn2+/NTP von 0,2 bis 0,6, vorzugsweise von 0,3 bis 0,5 beträgt.
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Molverhältnisse beträgt die Gesamtkonzentration der NTPs vorzugsweise 4 bis 24mM; bei Verwendung vier verschiedener NTPs somit je 1 bis 6mM.
Daraus ergibt sich für Mn + ein bevorzugter Konzentrationsbereich von 0,8 M (MolVerhältnis von 0,2 bei Konzentration der NTPs von 4mM) bis 14,4 mM (Molverhältnis von 0,6 bei Konzentration der NTPs von 24mM) .
Als Polymerase kann in den erfindungsgemäßen Verfahren eine beliebige Polymerase eingesetzt werden, wobei die Verwendung von RNA-Polymerasen, insbesondere von DNA-abhängigen RNA-Polymerase, welche für die Synthese von RNA eine DNA als Matrize benötigen, die einen Promotor enthält, für alle Ausführungsformen der Erfindung besonders bevorzugt ist. Es kann sich somit beispiels- weise um eine T7 RNA- olymerase, eine T3 RNA-Polymerase, oder eine SP6 RNA- olymerase handeln.
Bei der RNA-Polymerase kann es sich um eine RNA-abhängige oder eine DNA-abhängige Polymerase handeln. Die meisten der natürli- cherweise DNA-abhängigen RNA-Polymerasen können auch RNA als Matrize erkennen, wenn eine geeignete Struktur vorliegt (vgl. Konarska, M.M. und Sharp, P.A., CellVol. 57 (1989), 423-431; und Konarska, M.M. und Sharp, P.A., Cell Vol. 63 (1990), 609-618).
Die Polymerase und die Nukleinsaure, die als Matrize dient, müssen zueinander passen. Die Nukleinsaure, die als Matrize für eine RNA-Polymerase dienen kann, muss beispielsweise Erkennungs- Sequenzen oder Erkennungsstrukturen aufweisen, welche der RNA- Polymerase den Synthesestart ermöglichen. Vorzugsweise wird DNA als Matrize für die RNA-Polymerase eingesetzt. Entsprechende DNA kann eine Promotorregion enthalten, welche von der RNA-Polymerase erkannt und für den Synthesestart genutzt werden kann. Alternativ dazu kann die DNA eine Erkennungsstruktur ausbilden, welche es der RNA-Polymerase ermöglicht, die Synthese zu initiieren. Entsprechende ErkennungsStrukturen werden beispielsweise in Krupp (Nucleic Acids Res . Vol. 17 (1989) , 3023-3036) und in Kuhn et al . (Nature Vol. 344 (1990), 559-562) beschrieben.
Da die erfindungsgemäßen Verfahren eine besonders hohe Amplifika- tionsrate ermöglichen, kann die Nukleinsaure, die als Matrize für die Polymerase eingesetzt wird, in sehr geringer Konzentration vorliegen. Die Matrize kann beispielsweise in Form von DNA oder mRNA in einer Menge von mindestens 0,1 picogramm, bzw. 0,2 attomol in einem Ansatz von 20μl, somit einer Konzentration von mindestens 10 femtomolar eingesetzt werden. Der Reaktionsansatz uss NTPs enthalten, wobei bei Verwendung einer RNA-Polymerase üblicherweise ATP, UTP, CTP und GTP eingesetzt werden. Bei einer im Stand der Technik üblichen Transkription werden alle hier genannten NTPs in einem Reaktions- ansatz eingesetzt. Es kann jedoch auch wünschenswert oder vorteilhaft sein, lediglich eines oder einige der NTPs einzusetzen.
Alternativ oder zusätzlich zu den NTPs können bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der RNA- oder DNA-Polymerase ferner dNTPs eingesetzt werden. Dieses Vorgehen weist den besonderen Vorteil auf, dass das Transkript vollständig oder teilweise DNA-Eigenschaften erhält, d.h. es wird Nuklease- resistent und bietet eine bessere Matrize für die RNA-Polymerase. Als dNTPs werden üblicherweise dATP, dTTP, dCTP und/oder dGTP eingesetzt.
Alle oder einige der NTPs und/oder der dNTPs können als modifizierte Verbindung oder Derivate vorliegen. Im Stand der Technik übliche Derivatisierungen umfassen die Kopplung von Biotin oder eines Floureszenzmarkers, welche beispielsweise den Nachweis der Syntheseprodukte vereinfachen können.
Die Reaktionszeit und weiteren Reaktionsbedingungen (Temperatur, pH-Wert, etc.) können vom Fachmann in Abhängigkeit der verwendeten Polymerase und der zu erzielenden Amplifikationsrate einfach gewählt werden. Die Inkubatinoszeit kann beispielsweise von 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise von 4 bis 16 Stunden betragen. Bei Verwendung der T7-RNA-Polymerase bietet es sich an, die Reaktion in dem Bereich von 30°C bis 45°C durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine überraschende Verbesserung der Amplifikationsrate. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird das Verhältnis der Menge synthetisch hergestellter Nukleinsäuren zu der Menge der ursprünglich vorliegenden Matrize als Amplifikationsrate bezeichnet. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine Amplifiktionsrate von mindestens 1000, vor- zugsweise mindestens 2000. Bei optimalen Reaktionsbedingungen wurde sogar eine Amplifikationsrate von 2500 erzielt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können für eine Vielzahl von Zwecken zum Einsatz gelangen. Die verbesserten Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren können beispielsweise in den in DE 101 43 106.6 und DE 102 24 200.3 beschriebenen Verfahren zur Vermehrung von Ribonukleinsäuren eingesetzt werden. Die mittels der erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Nukleinsäuren können als Sonden an einen Chip gebunden werden. Die Verfahren können für die in vi tro Transkription, für die Untersuchung von Wechselwirkungen mit Nukleinsäurebindungsfaktoren, als Aptamere zur spezifischen Bindung von Molekülen, als Ribozmye, etc. eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich Kits zur Synthese von Nukleinsäuren, die in einem oder mehreren Behältern eine Polymerase, NTPs, dNTPs und/oder deren Derivate (beispielsweise biotinylierte oder mit Floureszenzmarkern gekoppelte NTPs oder dNTPs) und Mn+ umfassen. Bei der Polymerase handelt es sich vorzugsweise um eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, welche für die Synthese von RNA eine DNA als Matrize benötigt, die einen Promotor enthält. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der RNA-Polymerase um die T7 RNA- Polymerase, T3 RNA-Polymerase, oder SP6 RNA-Polymerase.
Entsprechende Kits enthalten ferner vorzugsweise eine Anweisung zur Durchführung eines der erfindungsgemäßen Verfahren. In entsprechenden Anweisungen oder Handbüchern wird genau beschrie- ben, in welcher Menge die einzelnen Bestandteile der Reaktion miteinander vermischt werden müssen, um optimale Syntheseleistungen zu erhalten. Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 In vitro Transkription unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von Mn + und Mg +; Bestimmung des optima- len Verhältnisses Mn +/NTPs und Vergleich mit Mg +.
Fig. 2 Bestimmung der optimalen NTP-Konzentration bei verschiedenen Mn/NTP-Verhältnissen.
Fig. 3 Bestimmung der Amplifikationsrate
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde die Transkriptionsleistung der RNA- Polymerase in Abhängigkeit verschiedener Konzentrationen von Mn 2' + sowie Mg + ermittelt .
Dafür wurde in einem Reaktionsansatz 20 μl, 40 mM Tris-HCl
(pH 8), 10 mM DTT, 2 mM Spermidin, 0,01% Triton X-100, 10 ng
Nukleinsaure Matrize (Plasmid pTRI-Xef) , 10 U RNasin- (RNase-
Inhibitor) , 40 U T7 RNA-Polymerase, 4 mM NTPs (jedes; ergibt gesamt 16 mM) und Mn2+ oder Mg2+ in einer Konzentration von 4 mM bis 10 mM zusammen pipettiert und für 16 Stunden inkubiert.
Aliquote Teilmengen von 5 μl wurden auf einem l%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und nach Anfärbung mit Ethidium- bromid photographiert . Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt. In Abhängigkeit der Konzentration des Mn + oder Mg + ergibt sich ein Verhältnis aus Mn2+/NTPs von 0,25 bis 0,625.
Fig. 1 zeigt eindeutig, dass die Gegenwart von Mn + im Vergleich zu der Gegenwart von Mg + in allen Versuchsansätzen eine bessere Amplifikationsrate erzielte, Beispiel 2
Das Ziel dieses Beispiels bestand darin, die optimale NTP- Konzentration in Abhängigkeit des Mn/NTP-Verhältnisses zu ermitteln.
Zu diesem Zweck wurden Reihen von Versuchsansätzen für die in vitro-Transkription wie in Beispiel 1 erstellt. Die Konzentration der einzelnen NTPs betrug dabei von 2 mM bis 10 mM und die Konzentration des MnCl2 betrug von 2,4 mM bis 24 mM. Daraus ergeben sich Verhältnisse von Mn/NTP von 0,3 bis 0,6.
Die durch die Transkription erhaltene Menge an Transkript (in ng) wurde durch Ethidiumbromidfärbung des Gels und einer RNA- Verdünnungsreihe als Standard im Gel bestimmt.
Das Ergebnis ist in Fig. 2 zusammengefasst und zeigt, daß bereits bei einer Konzentration von 4mM je NTP (gesamt also 16mM) eine maximale Syntheserate erbrachten. Die besten Ergebnisse wurden bei der Kombination von 4 mM je NTP und 6,4 mM MnCl2 erhalten
(entspricht einem Verhältnis von 0,4).
Beispiel 3
In diesem Beispiel wurde die Amplifikationsrate der in vitro- Transkription in Abhängigkeit der Zeit bestimmt. Dafür wurde zunächst eine in vitro-Transkriptionsreaktion wie in Beispiel 1 beschrieben erstellt, wobei 4,8 mM MnCl2 und 4 mM NTP (Summe 16 mM) eingesetzt wurden (entspricht einem Verhältnis von 0,3) .
Zu den in Fig. 3 genannten Zeiten wurden je 5 μl entnommen und auf einem 1 % nativen Agarosegel analysiert . Die Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt und lassen erkennen, dass in allen Reaktionsansätzen ein Amplifikationsfaktor von mehr als 1500 erzielt wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren, bei dem man eine Polymerase, eine Nukleinsaure, die als Matrize für die Polymerase dienen kann, NTPs und Mn + unter Bedingungen inkubiert, welche die Synthese eines Nukleinsaurestranges ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass die Bedingungen ein Molverhältnis von Mn +/NTP von nicht mehr als 0,7 umfassen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine RNA-Polymerase ist, vorzugsweise eine DNA- abhängige RNA-Polymerase, welche für die Synthese von RNA eine DNA als Matrize benötigen, die einen Promotor enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von M +/NTP von 0,2 bis 0,6 beträgt, vorzugsweise 0,3 bis 0,5.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtkonzentration der NTPs 4 bis 24mM beträgt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Mn + mindestens 3mM, vorzugsweise mindestens 3,5mM oder mindestens 4mM beträgt .
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Konzentration des Mn2+ von 4 bis 17 mM beträgt.
7. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man als Polymerase eine T7 RNA-Polymerase, eine T3 RNA- Polymerase, oder eine SP6 RNA-Polymerase einsetzt.
8. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei dem man als Nukleinsaure, die als Matrize für die RNA-Poly- merase dienen kann, DNA oder RNA einsetzt .
9. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Nukleinsaure, die als Matrize für die RNA-Polymerase dienen kann, RNA oder DNA in einer Menge von mindestens 0,1 picogramm (bzw. 0,2 attomol) oder einer Konzentration von mindestens 10 femtomolar vorliegt.
10. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei dem ATP, UTP, CTP und/oder GTP als NTPs eingesetzt werden.
11. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei dem ferner dNTPs eingesetzt werden.
12. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei dem dATP, dTTP, dCTP und/oder dGTP als dNTPs eingesetzt werde .
13. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die NTPs oder dNTPs als Derivate, beispielsweise als biotinylierte oder mit einem Floureszenzmarker-gekoppelte Derivate, eingesetzt werden.
14. Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei dem eine Amplifiktionsrate von mindestens 1000-fach, vorzugsweise mindestens 2000-fach, erzielt wird.
15. Kit zur Synthese von Nukleinsäuren, das in einem Behälter oder in mehreren getrennten Behältern eine Polymerase, NTPs und Mn + umfasst.
16. Kit gemäß Anspruch 15, in dem die RNA-Polymerase eine DNA- abhängige RNA- olymerase ist, welche für die Synthese von RNA eine DNA als Matrize benötigt, die einen Promotor enthält, wobei es sich vorzugsweise bei der RNA-Polymerase um die T7 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase, oder SP6 RNA-Polymerase handelt.
17. Kit gemäß Anspruch 15 oder 16, in dem ATP, UTP, CTP und/oder GTP als NTPs vorliegen.
18. Kit gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, in dem ferner dNTPs vorliegen.
19. Kit gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, in dem dATP, dTTP, dCTP und/oder dGTP als dNTPs vorliegen.
20. Kit gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, in dem die NTPs oder dNTPs als Derivate, beispielsweise als biotinylierte oder mit einem Floureszenzmarker-gekoppelte Derivate, vorliegen.
21. Kit gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, das ferner eine Anweisung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 umfasst.
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