EP1124947A2 - Konstruktion von produktionsstämmen für die herstellung von substituierten phenolen durch gezielte inaktivierungen von genen des eugenol- und ferulasäure-katabolismus - Google Patents

Konstruktion von produktionsstämmen für die herstellung von substituierten phenolen durch gezielte inaktivierungen von genen des eugenol- und ferulasäure-katabolismus

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Publication number
EP1124947A2
EP1124947A2 EP99953892A EP99953892A EP1124947A2 EP 1124947 A2 EP1124947 A2 EP 1124947A2 EP 99953892 A EP99953892 A EP 99953892A EP 99953892 A EP99953892 A EP 99953892A EP 1124947 A2 EP1124947 A2 EP 1124947A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
inactivated
pseudomonas
ferulic acid
eugenol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99953892A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Rabenhorst
Alexander Steinbüchel
Horst Priefert
Jörg Overhage
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Symrise AG
Original Assignee
Haarmann and Reimer GmbH
Symrise AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Haarmann and Reimer GmbH, Symrise AG filed Critical Haarmann and Reimer GmbH
Publication of EP1124947A2 publication Critical patent/EP1124947A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01016—Acetyl-CoA C-acyltransferase (2.3.1.16)

Definitions

  • the present invention relates to the construction of production strains and a method for the production of substituted methoxyphenols, in particular vanillin.
  • DE-A 4 227 076 (process for the preparation of substituted methoxyphenols and a suitable microorganism) describes the preparation of substituted methoxyphenols with a new Pseudomonas sp.
  • the starting material here is eugenol and the products are ferulic acid, vanillic acid, coniferyl alcohol and coniferyl aldehyde.
  • the enzymes for the conversion of tra / w-ferulic acid to trc s-feruloyl-SCoA ester and further to vanillin, as well as the gene for the cleavage of the ester were from
  • the object of the present invention is therefore to construct organisms which are able to convert the inexpensive raw material eugenol into vanillin in a one-step process.
  • This object is achieved by the construction of production strains of single or multicellular organisms, which are characterized in that enzymes of eugenol and / or ferulic acid catabolism are inactivated such that an accumulation of the intermediates coniferyl alcohol, coniferyl aldehyde, ferulic acid, vanillin and / or Vanillic acid takes place.
  • the production strain can be single-cell or multi-cell. Accordingly, the subject of the invention can be microorganisms, plants or animals. In addition, extracts obtained from the production master can also be used. According to the invention, single-celled organisms are preferably used. These can be microorganisms, animal or plant cells. The use of fungi and bacteria is particularly preferred according to the invention. Bacteria are highly preferred. Among the bacteria, Rhodococcus, Pseudomonas and Esche ichia species in particular can be used after changing the eugenol and / or ferulic acid catabolism. In the simplest case, the organisms which can be used according to the invention can be obtained by means of known, conventional microbiological methods.
  • the enzyme activity of the proteins involved in the catabolism of eugenol and / or ferulic acid can be changed by the use of enzyme inhibitors.
  • the enzyme activity of the proteins involved in the eugenol and / or ferulic acid catabolism can be changed by mutating the genes coding for these proteins.
  • Such mutations can be generated undirected using classic methods, such as, for example, UV radiation or chemicals that trigger mutations.
  • Genetic engineering methods for obtaining the organisms according to the invention are also suitable, such as deletions, insertions and / or nucleotide exchanges.
  • the genes of the organisms can be inactivated with the help of other DNA elements ( ⁇ elements).
  • the intact genes can be exchanged for modified and / or inactivated gene structures by means of suitable vectors.
  • the genes to be inactivated and the DNA elements used for the inactivation can be obtained by classic cloning techniques or by polymerase chain reactions (PCR).
  • the eugenol and ferulic acid catabolism can be changed by inserting ⁇ elements or introducing deletions into corresponding genes.
  • the functions of the genes which code for dehydrogenases, synthetases, hydratase aldolases, thiolases or demethylases can be inactivated using the abovementioned genetic engineering methods, so that the production of the enzymes in question is blocked.
  • genes which code for coniferyl alcohol dehydrogenases, coniferyl aldehyde dehydrogenases, ferulic acid-CoA synthetases, enoyl-CoA hydratase aldolases, beta-ketothiolases, vanillin dehydrogenases or vanillinic acid demethylases are preferably the genes which code for coniferyl alcohol dehydrogenases, coniferyl aldehyde dehydrogenases, ferulic acid-CoA synthetases, enoyl-CoA hydratase aldolases, beta-ketothiolases, vanillin dehydrogenases or vanillinic acid demethylases.
  • Genes which encode the amino acid sequences given in EP-A 0845532 and / or their nucleotide sequences encoding allelic variations are very particularly preferred.
  • the invention accordingly also relates to gene structures for producing transformed organisms and mutants.
  • Gene structures are preferably used to obtain the organisms and mutants in which the nucleotide sequences coding for dehydrogenases, synthetases, hydratase aldolases, thiolases or demethylases are inactivated. Particularly preferred are gene structures in which the nucleotide sequences coding for coniferyl alcohol dehydrogenases, coniferyl aldehyde dehydrogenases, ferulic acid-CoA synthetases, enoyl-CoA hydratase aldolases, beta-ketothiolases, vanillin dehydrogenases or vanillic acid demethylases are inactive. Gene structures which have the structures given in FIGS. 1a to 1r with the nucleotide sequences shown in FIGS. 2a to 2r and / or their allele variations coding nucleotide sequences are very particularly preferred. Nucleotide sequences from 1 to 18 are particularly preferred.
  • the invention also includes the partial sequences of these gene structures as well as functional equivalents.
  • Functional equivalents are to be understood as those derivatives of DNA in which individual nucleobases have been exchanged (Wobbe exchanges) without changing their function. Also at the protein level,
  • Amino acids can be exchanged without changing the function.
  • One or more DNA sequences can be connected upstream and / or downstream of the gene structures.
  • plasmids or vectors are obtainable which are suitable for the transformation and / or transfection of an organism and / or for the conjugative transfer into an organism.
  • the invention further relates to plasmids and / or vectors for producing the transformed organisms and mutants according to the invention. Accordingly, these contain the gene structures described.
  • the present invention relates to accordingly also organisms which contain the plasmids and / or vectors mentioned.
  • plasmids and / or vectors depends on their intended use. To z. For example, to be able to exchange the intact genes of eugenol and / or ferulic acid catabolism in pseudomonas against the genes inactivated by omega elements, vectors are required which can be transferred on the one hand in pseudomonads (conjugatively transferable plasmids) but on the other hand there cannot be replicated and are therefore unstable in pseudomonas (so-called suicide plasmids). DNA sections which are transferred into pseudomonads with the aid of such a plasmid system can only be preserved if they are integrated into the genome of the bacterial cell by homologous recombination.
  • genes can preferably be changed and / or inactivated such that the organisms in question are able to produce coniferyl alcohol, coniferyl aldehyde, ferulic acid, vanillin and / or vanillic acid.
  • Production strains constructed in accordance with the invention are, for example, mutants of the strain Pseudomonas sp. HR199 (DSM 7063), which was described in detail in DE-A 4 227 076 and EP-A 0845532, where, among other things, the corresponding gene structures result from FIGS. 1a to 1r in conjunction with FIGS. 2a to 2r: 1.
  • Pseudomonas sp. HR199c ⁇ 4 ⁇ Km containing the ⁇ Km inactivated calA gene instead of the intact c ⁇ 4 gene coding for coniferyl alcohol dehydrogenase (Fig. La; Fig. 2a).
  • Pseudomonas sp. HR199ecb ⁇ Km containing the ⁇ Km inactivated ecb gene instead of the intact ecb gene coding for enoyl-CoA hydratase aldolase (Fig.lj; Fig. 2j).
  • Pseudomonas sp. HR199ecb ⁇ Gm containing the ecb gene inactivated by ⁇ Gm instead of the intact ecb gene coding for enoyl-CoA hydratase aldolase (FIG. 1k; FIG. 2k).
  • Pseudomonas sp. HR199 ⁇ t ⁇ Km containing the aat gene inactivated by ⁇ Km instead of the intact aat gene coding for beta-ketothiolase (Fig. Im; Fig. 2m).
  • Pseudomonas sp. HR199 t ⁇ Gm containing the ⁇ t gene inactivated by ⁇ Gm instead of the intact ⁇ t gene coding for beta-ketothiolase (Fig. In; Fig. 2n).
  • Pseudomonas sp. HR199v b ⁇ containing the deletion inactivated vdh gene instead of the intact v b gene coding for vanillin dehydrogenase (Fig.lr; Fig. 2r).
  • the invention also relates to a method for the biotechnical production of organic compounds.
  • alcohols, aldehydes and organic acids can be produced with this process. These are preferably coniferyl alcohol, coniferyl aldehyde, ferulic acid, vanillin and vanillic acid.
  • the organisms described above are used in the process according to the invention.
  • the most particularly preferred organisms include bacteria, especially the Pseudomonas species.
  • the above-mentioned Pseudomonas species can preferably be used for the following processes:
  • the preferred substrate is eugenol.
  • the addition of further substrates or even the replacement of the eugenol with another substrate may be possible.
  • Synthetic, semi-synthetic or complex culture media can be used as the nutrient medium for the organisms used according to the invention. These can contain carbon-containing and nitrogen-containing compounds, inorganic salts, optionally trace elements and vitamins.
  • Carbohydrates, hydrocarbons or basic organic chemicals can be considered as carbon-containing compounds.
  • Examples of compounds which can preferably be used are sugars, alcohols or sugar alcohols, organic acids or complex mixtures.
  • the preferred sugar is glucose.
  • Citric acid or acetic acid can preferably be used as organic acids.
  • the complex mixtures include e.g. B. malt extract, yeast extract, casein or casein hydrolyzate.
  • Inorganic compounds are suitable as nitrogen-containing substrates. Examples include nitrates and ammonium salts. Organic nitrogen sources can also be used. These include yeast extract, soy flour, casein, casein hydrolyzate and corn steep liquor.
  • the inorganic salts that can be used include, for example, sulfates, nitrates, chlorides, carbonates and phosphates. The salts mentioned preferably contain sodium, potassium, magnesium, manganese, calcium, zinc and iron as metals.
  • the temperature for cultivation is preferably in the range of 5 to 100 ° C.
  • the range from 15 to 60 ° C. is particularly preferred, and 22 to 60 ° C. is most preferred
  • the pH of the medium is preferably 2 to 12.
  • the range from 4 to 8 is particularly preferred.
  • bioreactors known to the person skilled in the art can be used to carry out the method according to the invention.
  • All devices suitable for submerged processes are preferred.
  • the former include e.g. B. shakers, bubble column or loop reactors.
  • the latter preferably include all known devices with stirrers in any configuration.
  • the process according to the invention can be carried out continuously or batchwise.
  • the duration of the fermentation until a maximum amount of product is reached depends on the particular type of organism used. Basically, however, the times of fermentation are between 2 and 200 hours.
  • genes calA, calB, fcs, ech, aat, vdh, adh, vdhB, vanA and vanB which are for coniferyl alcohol dehydrogenase, coniferylaldehyde dehydrogenase, ferulic acid-CoA synthetase, enoyl-CoA hydratase-aldolase, beta-ketothiolase, vanillin Dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, vanillin dehydrogenase II and vanillic acid demethylase were encoded starting from genomic DNA of the strain Pseudomonas sp.
  • mutants had only the inactivated gene, so that mutants with only one defective gene and multiple mutants in which several genes were inactivated in this way were obtained.
  • These mutants were used for the biotransformation of a) eugenol to coniferyl alcohol , Coniferyl aldehyde, ferulic acid, Va nillin and / or
  • Vanillic acid b) coniferyl alcohol to coniferyl aldehyde, ferulic acid, vanillin and / or vanillic acid; c) coniferyl aldehyde to ferulic acid, vanillin and / or vanillic acid; d) ferulic acid to vanillin and / or vanillic acid and e) vanillin to vanillic acid. material and methods
  • Pseudomonas sp Cells grown on eugenol. HR199 were washed in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0, resuspended in the same buffer and disrupted by passing twice through a French press (Amicon, Silver Spring, Maryland, USA) at a pressure of 1000 psi. The cell homogenate was subjected to ultracentrifugation (1 h, 100,000 x g, 4 ° C.), whereby the soluble
  • the soluble fraction of the crude extract was dialyzed overnight against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0.
  • the dialysate was made up to a 10 mM
  • the column was rinsed with two BV 10 mM sodium phosphate buffers, pH 6.0.
  • VDH-II vanillin dehydrogenase-II
  • VDH activity was determined at 30 ° C. by means of an optically enzymatic test.
  • the reaction mixture with a volume of 1 ml contained 0.1 mmol potassium phosphate (pH 7.1), 0.125 ⁇ mol vanillin, 0.5 ⁇ mol NAD, 1.2 ⁇ mol pyruvate (Na salt), lactate dehydrogenase (1 U; from pig heart) and enzyme solution.
  • the CADH activity was determined at 30 ° C. using an optical enzymatic test according to Jaeger et al. (Jaeger, E., L. Eggeling and H. Sahm. 1981. Current Microbiology. 6: 333-336).
  • the reaction mixture with a volume of 1 ml contained 0.2 mmol Tris / HCl (pH 9.0), 0.4 ⁇ mol coniferyl alcohol, 2 ⁇ mol NAD, 0.1 mmol semicarbazide and enzyme solution.
  • the enzyme activity was given in units (U), where 1 U corresponds to the amount of enzyme that converts 1 ⁇ mol substrate per minute.
  • the protein concentrations in the samples were determined according to Lowry et al. (Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193: 265-275).
  • the CALDH activity was determined at 30 ° C. by means of an optically enzymatic test.
  • the reaction mixture with a volume of 1 ml contained 0.1 mmol Tris / HCl (pH 8.8), 0.08 ⁇ mol coniferylaldehyde, 2.7 ⁇ mol NAD and enzyme solution.
  • FCS activity was determined at 30 ° C. by an optically enzymatic test, modified according to Zenk et al. (Zenk et al. 1980. Anal. Biochem. 101: 182-
  • the reaction mixture with a volume of 1 ml contained 0.09 mmol potassium Phosphate (pH 7.0), 2.1 ⁇ mol MgCl2, 0.7 ⁇ mol ferulic acid, 2 ⁇ mol ATP, 0.4 ⁇ mol coenzyme A and enzyme solution.
  • the enzyme activity was given in units (U), where 1 U corresponds to the amount of enzyme that converts 1 ⁇ mol substrate per minute.
  • the protein concentrations in the samples were checked
  • the gels were buffered for 20 min in 100 mM KP buffer (pH 7.0) and then at 30 ° C in the same buffer the 0.08% (wt / vol) NAD, 0.04 % (wt / vol) p-nitroblue tetrazolium chloride, 0.003% »(wt / vol) phenazine methosulfate and 1 mM of the respective substrate had been added until appropriate color bands became visible.
  • N-terminal amino acid sequences were determined using a protein peptide sequencer (type 477 A, Applied Biosystems, Foster City, USA) and a PTH analyzer according to the manufacturer's instructions. Isolation and manipulation of DNA.
  • Genomic DNA was isolated using the method of Marmur (Marmur, J. 1961. J. Mol. Biol. 3: 208-218). The isolation and analysis of other plasmid DNA or of DNA restriction fragments was carried out according to standard methods (Sambrook, JEF Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York.).
  • Cells of the recipient were applied in one direction as an inoculation line. After 5 minutes, cells from the donor strains were then applied as inoculation lines, the recipient line being crossed. After incubation for 48 h at 30 ° C, the transconjugants grew directly behind the
  • Nucleotide sequences were determined using the dideoxy chain termination method of Sanger et al. (Sanger et al. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) "non-radioactive" with a "LI-COR DNA Sequencer Model 4000L” (LI-COR Inc., Biotechnology Division, Lincoln , NE, .USA) using a "Thermo Sequenase fluorescent labeled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP" (Amersham Life Science, Amersham International pls, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) each according to the manufacturer's instructions.
  • the 2099 bp 5g / l fragment of the transposon Tn5 (Auerswald EA, G. Ludwig and H. Schaller. 1981. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 107-113; Beck E., G. Ludwig, EA Auerswald, B. Reiss and H. Schaller. 1982. Gene 19: 327-336; Mazodier P., P. Cossart, E. Giraud and F. Gasser. 1985. Nucleic Acids Res. 13 : 195-205.) Preparatively isolated. The fragment was shortened to approximately 990 bp by treatment with the nuclease Bal-31.
  • This fragment which only comprised the kanamycin resistance gene (coding for an aminoglycoside-3'-O-phosphotransferase), was then cut with Smally cut pSKsym-DNA (pBluescript SK derivative, which has a symmetrically constructed multiple cloning site [Sall, Hindlll, EcoRI, Sm ⁇ l, EcoRI, Hindl ⁇ l, Sall] contains) ligated.
  • the ⁇ Km element could be reisolated from the resulting plasmid as a Smal, EcoRI, HwdIII or So / I fragment.
  • Plasmids pBBRlMCS-5 (Kovach M. ⁇ ., P. ⁇ . Elzer, DS Hill, GT Robertson, MA Farris, RM Roop and KM Peterson. 1995. Gene 166: 175-176.) Were preparatively isolated and then with mung bean nuclease (Digestion of single-stranded DNA molecule ends) treated. This fragment, which only comprised the gentamycin resistance gene (coding for a gentamycin-3-acetyltransferase), was then ligated with Smal cut pSKsym-DNA (see above). The ⁇ Gm element could be re-isolated from the resulting plasmid as a Smal, EcoRI, H dlll or Sall fragment.
  • Example 2 Example 2
  • Plasmid p ⁇ 207 and the 3700 bp EcoRI / S ⁇ / I fragment of plasmid p ⁇ 5-l were cloned together in pBluescript SK in such a way that both fragments were connected to one another via the EcoRI ends.
  • the 6050 bp S ⁇ I fragment was isolated and shortened to about 2480 bp by treatment with the nuclease Bal-31.
  • ligated to the fragment ends / sfl linker and the fragment after Pstl digestion was cloned into pBluescript SK " (pSK ⁇ s).
  • pSK ⁇ s After transformation of E. coli XLl-Blue, clones were obtained which expressed the fcs gene and one FCS activity of 0.2 U / mg protein.
  • the 3800 bp Hmdlll / EcoRI fragment of the plasmid p ⁇ 207 was preparatively isolated and shortened to approximately 1470 bp by treatment with the nuclease Bal-31. Then EcoRI linkers were ligated to the fragment ends and the fragment was cloned into pBluescript SK " after EcoRI digestion (pSKecb).
  • Plasmids p ⁇ 207 isolated preparatively. After cloning in pBluescript SK " that was
  • the 3700 bp EcoRI / S ⁇ / I fragment of the plasmid p ⁇ 5-l was preparatively isolated and shortened to approximately 1590 bp by treatment with the nuclease Bal-31. Then EcoRI linkers were ligated to the fragment ends and the fragment was cloned into pBluescript SK " (pSKaat) after EcoRI digestion.
  • the plasmid pSKfcs which contained the fcs gene, was included digested, whereby a 1290 bp fragment was cut out of the ⁇ cs gene.
  • the deletion derivative of the fcs gene (fcsA) (see Figs. Li and 2i) cloned in pBluescript SK " (pSK / ⁇ sA) was obtained.
  • the omega elements ⁇ Km and ⁇ Gm on the fragment were cut out
  • the plasmid pSKecb which contained the ecb gene, was digested with NrwI, whereby a 53 bp and a 430 bp fragment was excised from the ecb gene. After religation, the deletion derivative of the ecb gene (ecb ⁇ , see FIGS. 11 and 21) was obtained cloned in pBluescript SK " (pSKecb ⁇ ) after cutting out the fragments, the omega elements ⁇ Km and ⁇ Gm were inserted in their place.
  • the plasmid pSKvJb which contained the vJb gene, was digested with ⁇ ssHII, whereby a 210 bp fragment was excised from the vdh gene. After religation, the deletion derivative of the vdh gene (vdhA, see Figs. Lo and 2o) was obtained cloned in pBluescript SK (pSKvdh ⁇ ). In addition, after cutting out the fragment, the omega elements _ ⁇ Km and ⁇ Gm were inserted in its place.
  • the plasmid pSK ⁇ t which contained the aat gene, was digested with ⁇ wHII, whereby a 59 bp fragment was cut out of the aat gene. After religation, the deletion derivative of the ⁇ ⁇ t gene (aatA, see Fig. Lr and
  • the "suicide plasmid" was pSUP202 (Simon et al. 1983. In: A. Pühler. Molecular genetics of the bacteria-plant interaction. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 98-106.) used.
  • the inactivated genes fcs ⁇ Km and c ⁇ Gm were isolated from the plasmids pSK / ⁇ s ⁇ Km and pSK / c ⁇ ⁇ Gm after stl digestion and ligated with PstL cut pSUP202 DNA. The ligation batches were transformed to E. coli S17-1. The selection was made on LB medium containing tetracycline with kanamycin or gentamycin. Kanamycin-resistant transformants were obtained whose hybrid plasmid (pSUP / cs ⁇ Km) contained the inactivated yes ⁇ Km gene. The corresponding hybrid plasmid (pSUP / ⁇ s ⁇ Gm) of the gentamycin-resistant transformants contained the inactivated Genevacs ⁇ Gm.
  • the inactivated genes ecb ⁇ Km and ecb ⁇ Gm were isolated from the plasmids pSKecb ⁇ Km and pSKecb ⁇ Gm after EcoRI digestion and ligated with EcoRI cut pSUP202 DNA.
  • the ligation batches were transformed according to E. coli S17-1. The selection was made on LB medium containing tetracycline with kanamycin or gentamycin. Kanamycin-resistant transformants were obtained, whose Hybrid plasmid (pSUPecb ⁇ Km) containing the inactivated ecb ⁇ Km gene.
  • the corresponding hybrid plasmid (pSUPecb ⁇ Gm) of the gentamycin-resistant transformants contained the inactivated gene ecb ⁇ Gm.
  • the inactivated genes vJb ⁇ Km and vJb ⁇ Gm were isolated from the plasmids pSKv ⁇ b ⁇ Km and pSKvtib ⁇ Gm after EcoRI digestion and ligated with EcoRI cut pSUP202 DNA.
  • the ligation batches were transformed according to E. coli S17-1. The selection was made on LB medium containing tetracycline with kanamycin or gentamycin. Kanamycin-resistant transformants were obtained whose hybrid plasmid (pSUPvdb ⁇ Km) contained the inactivated gene v b ⁇ Km.
  • the corresponding hybrid plasmid (pSUPvJb ⁇ Gm) of the gentamycin-resistant transformants contained the inactivated gene vJb ⁇ Gm.
  • the inactivated genes aat ⁇ Km and ⁇ t ⁇ Gm were isolated from the plasmids pSK ⁇ t ⁇ Km and pSK ⁇ t ⁇ Gm after EcoRI digestion and ligated with EcoRI cut pSUP202 DNA. The ligation batches were transformed according to E. coli S17-1. The selection was made on LB medium containing tetracycline with kanamycin or gentamycin. Kanamycin-resistant transformants were obtained whose hybrid plasmid (pSUP ⁇ t ⁇ Km) contained the inactivated gene aat ⁇ Km. The corresponding hybrid plasmid (pSUP ⁇ t ⁇ Gm) of the gentamycin-resistant transformants contained the inactivated gene ⁇ t ⁇ Gm.
  • the plasmid After conjugative transfer of this hybrid plasmid into a pseudomonad, the plasmid is integrated into the genome by homologous recombination at the point at which the intact gene is located (first "cross over”). In this way, a "heterogeneous" strain is created which has both an intact and a deletion-inactivated gene, which are separated from one another by the pHE55 DNA.
  • Strains have the resistance encoded by the vector and also have an active sacB gene.
  • second homologous recombination event second "cross over"
  • the pHE55 DNA together with the intact gene is now to be separated from the genomic DNA.
  • This recombination event creates a strain that only has the inactivated gene.
  • the inactivated gene fcs A was isolated from the plasmid pSK / cs ⁇ after stl digestion and ligated with Pstl cut pHE55 DNA. The ligation mixture was transformed into E. coli S17-1. The selection was made on LB containing tetracycline Medium. Tetracycline-resistant transformants were obtained whose hybrid plasmid (pHEfcsA) contained the inactivated GenevacsA.
  • the inactivated echA gene was isolated from the plasmid pSKecb ⁇ after EcoRI digestion and treated with mung bean nuclease (generation of smooth
  • the fragment was ligated with BamHl cut and mung bean nuclease treated pHE55 DNA.
  • the ligation mixture was transformed into E. coli S17-1.
  • the selection was made on LB medium containing tetracycline. Tetracycline-resistant transformants were obtained whose hybrid plasmid (pHEecb ⁇ ) contained the inactivated gene echA.
  • the inactivated gene vdhA was isolated from the plasmid pSKvüfb ⁇ after EcoRI digestion and treated with mung bean nuclease. The fragment was ligated with BamHl cut and Mung Bean nuclease treated pH ⁇ 55 DNA. The ligation mixture was transformed into E. coli S17-1. The selection was made on
  • Tetracycline-resistant transformants were obtained whose hybrid plasmid (pHEv b ⁇ ) contained the inactivated gene vJb ⁇ .
  • the inactivated gene aatA was isolated from the plasmid pSK ⁇ t ⁇ after EcoRI digestion and treated with mung bean nuclease. The fragment was made with
  • the Pseudomonas sp. HR199 was used as a recipient in conjugation experiments in which strains of E. coli S17-1 were used as donors, which contained the hybrid plasmids of pSUP202 listed below.
  • the transconjugants were selected on mineral medium containing gluconate, which contained the antibiotic corresponding to the ⁇ element. "Homogenote” (exchange of the intact gene for the gene inactivated by ⁇ -element insertion by double “cross over”) and "heterogenote” (integration of the hybrid plasmid into the genome by simple "cross over”) transconjugants could be coded using pSUP202 Tetracycline resistance can be distinguished.
  • the mutants Pseudomonas sp. HR199 c.s ⁇ Km and Pseudomonas sp. HR199 fcs ⁇ Gm were conjugated by Pseudomonas sp. Get HR199 with E. coli S17-1 (pSUP / cs ⁇ Km) or E. coli S17-1 (pSUP / ⁇ Gm).
  • the exchange of the intact fcs gene for the gene inactivated by ⁇ Km or ⁇ Gm (fcs ⁇ Km or fcs ⁇ Gm) was verified by means of DNA sequencing.
  • the mutants Pseudomonas sp. HR199 ecb ⁇ Km and Pseudomonas sp. HR199 ech ⁇ Gm were conjugated from Pseudomonas sp. Receive HR199 with E. coli S17-1 (pSUPecb ⁇ Km) or E. coli S17-1 (pSUPecb ⁇ Gm).
  • the exchange of the intact ecb gene for the gene inactivated by ⁇ Km or ⁇ Gm (ecb ⁇ Km or ecb ⁇ Gm) was verified by means of DNA sequencing.
  • ⁇ Gm were obtained after conjugation of Pseudomonas sp. Receive HR199 with E. coli S17-1 (pSUPv b ⁇ Km) or E. coli S17-1 (pSUPvJb ⁇ Gm). The exchange of the intact vJb gene against the gene inactivated by ⁇ Km or ⁇ Gm (wtTz ⁇ Km or vJb ⁇ Gm) was verified by means of DNA sequencing.
  • the mutant Pseudomonas sp. HR199 cs ⁇ KmvJb ⁇ Gm were conjugated by Pseudomonas sp. HR199 / cs ⁇ Km obtained with E. coli S17-1 (pSUPvJb ⁇ Gm).
  • the exchange of the intact vdh gene for the gene inactivated by ⁇ Gm (vdh ⁇ Gm) was verified by DNA sequencing.
  • the mutant Pseudomonas sp. HR199 vJb ⁇ Km ⁇ t ⁇ Gm were after conjugation of Pseudomonas sp. HR199 viib ⁇ Km with E. coli S17-1 (pSUP ⁇ t ⁇ Gm) obtained.
  • the exchange of the intact ⁇ t gene for the gene inactivated by ⁇ Gm (aat ⁇ Gm) was verified by means of DNA sequencing.
  • the mutant Pseudomonas sp. HR199 vJb ⁇ Kmecb ⁇ Gm were conjugated to Pseudomonas sp. HR199 vtib ⁇ Km obtained with E. coli S17-1 (pSUPecb ⁇ Gm).
  • the exchange of the intact ecb gene for the gene inactivated by ⁇ Gm (ech ⁇ Gm) was verified by DNA sequencing.
  • the Pseudomonas sp. HR199 ⁇ s ⁇ Km, Pseudomonas sp. HR199 ecb ⁇ Km, Pseudomonas sp. HR199 vdh ⁇ K and Pseudomonas sp. HR199 aat ⁇ Km were used as a recipient in conjugation experiments in which strains of E. coli S17-1 were used as donors, which contained the hybrid plasmids of pHE55 listed below.
  • the "heterogeneous" transconjugants were selected on mineral medium containing gluconate, which contained the antibiotic corresponding to the ⁇ element in addition to tetracycline (resistance coded pHE55).
  • transconjugants After streaking on sucrose-containing mineral medium, transconjugants were obtained which had eliminated the vector DNA by a second recombination event (second "cross over”).
  • second "cross over” By spreading on mineral medium without antibiotics or with the antibiotic corresponding to the ⁇ element, it was possible to identify the mutants in which the gene inactivated by ⁇ element had been replaced by the gene inactivated by deletion (no antibiotic resistance).
  • the mutant Pseudomonas sp. HR199 ⁇ c.sA was obtained after conjugation of Pseudomonas sp. HR199 cs ⁇ Km obtained with E. coli S17-1 (pHEfcsA).
  • the exchange of the gene inactivated by ⁇ Km (fcs ⁇ K) for the gene inactivated by deletion (fcsA) was verified by means of DNA sequencing.
  • the mutants Pseudomonas sp. HR199 echA was conjugated to Pseudomonas sp. HR199 ecb ⁇ Km obtained with E. coli S17-1 (pHEecb ⁇ ).
  • the exchange of the gene inactivated by ⁇ Km (ecb ⁇ Km) for the gene inactivated by deletion (echA) was verified by means of DNA sequencing.
  • the mutants Pseudomonas sp. HR199 vdhA was conjugated to Pseudomonas sp. HR199 vdh ⁇ Km. obtained with E. coli S17-1 (pHEvJb ⁇ ).
  • the exchange of the gene inactivated by ⁇ Km (vdh ⁇ Km) for the gene inactivated by deletion (vdhA) was verified by means of DNA sequencing.
  • the mutants Pseudomonas sp. HR199 aatA was conjugated to Pseudomonas sp. HR199 ⁇ t ⁇ Km obtained with E. coli S17-1 (pHE ⁇ / ⁇ ).
  • the exchange of the gene inactivated by ⁇ Km ( ⁇ t ⁇ Km) for the gene inactivated by deletion (aatA) was verified by means of DNA sequencing.
  • the production fermenter was inoculated with 10 g / 1 yeast extract and 0.37 g / 1 acetic acid.
  • the fermenter contained 9.9 liters of medium with the following composition: 1.5 g / 1 yeast extract, 1.6 g / 1 KH 2 PO 4 , 0.2 g / 1 NaCl, 0.2 g / 1 MgSO 4 .
  • the pH was adjusted to pH 7.0 with sodium hydroxide solution. After sterilization, 4 g of eugenol was added to the medium.
  • the temperature was 32 ° C, the ventilation 3
  • FIG. la to lr
  • calA * part of the inactivated gene of the coniferyl alcohol dehydrogenase calB *: part of the inactivated gene of the coniferylaldehyde dehydrogenase fcs *: part of the inactivated gene of the ferulic acid-CoA synthetase ech *: part of the inactivated gene of the enoyl-CoA hydratase aldolase vdh * : Part of the inactivated gene of vanillin dehydrogenase aat *: Part of the inactivated gene of beta-ketothiolase
  • restriction enzyme interfaces provided with "*" were used for the construction, but are no longer functional in the resulting construct.
  • FIG. 2a nucleotide sequence of the calA ⁇ Km gene structure
  • FIG. 2b nucleotide sequence of the gene structure calA ⁇ Gm
  • FIG. 2c nucleotide sequence of the calAA gene structure
  • FIG. 2d Nucleotide sequence of the gene structure calB ⁇ Km
  • FIG. 2e nucleotide sequence of the calB ⁇ Gm gene structure
  • FIG. 2f Nucleotide sequence of the gene structure calBA
  • FIG. 2g nucleotide sequence of the gene structure fcs ⁇ Km
  • FIG. 2h nucleotide sequence of the gene structure fcs ⁇ Gm
  • FIG. 2i nucleotide sequence of the gene structure fcsA
  • FIG. 2j nucleotide sequence of the gene structure ecb ⁇ Km
  • FIG. 2k nucleotide sequence of the gene structure ecb ⁇ Gm
  • FIG. 21 Nucleotide sequence of the gene structure echA
  • FIG. 2m nucleotide sequence of the gene structure vtib ⁇ Km
  • FIG. 2n nucleotide sequence of the gene structure vJb ⁇ Gm
  • FIG. 2o Nucleotide sequence of the gene structure vdhA
  • FIG. 2p nucleotide sequence of the gene structure aat ⁇ Km
  • FIG. 2q nucleotide sequence of the gene structure aat ⁇ Gm
  • FIG. 2r nucleotide sequence of the gene structure aatA

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen transformierten und/oder mutagenisierten ein- oder mehrzelligen Organismus, der dadurch gekennzeichnet ist, dass Enzyme des Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus derart inaktiviert sind, dass eine Akkumulation der Intermediate Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und/oder Vanillinsäure erfolgt.

Description

Konstruktion von Produktionsstämmen für die Herstellung von substituierten Phenolen durch gezielte Inaktivierungen von Genen des Eugenol- und Ferulasäure-Katabolismus
Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion von Produktionsstämmen und ein Verfahren für die Herstellung substituierter Methoxyphenole, insbesondere Vanillin.
Die DE-A 4 227 076 (Verfahren zur Herstellung substituierter Methoxyphenole und dafür geeigneter Mikroorganismus) beschreibt die Herstellung substituierter Methoxyphenole mit einer neuen Pseudomonas sp.. Ausgangsmaterial ist hier Eugenol und die Produkte sind Ferulasäure, Vanillinsäure, Coniferylalkohol und Coni- ferylaldehyd.
Ebenfalls 1995 erscheint ein umfangreiches Review über die Biotransformationsmöglichkeiten mit Ferulasäure von Rosazza et al. (Biocatalytic transformation of ferulic acid: an abundant aromatic natural product; J. Ind. Microbiol. 15:457-471).
Die Gene und Enzyme zur Synthese von Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd,
Ferulasäure, Vanillin und Vanillinsäure aus Pseudomonas sp. wurden in EP-A 0 845 532 beschrieben.
Die Enzyme zur Umsetzung von tra/w-Ferulasäure zu trc s-Feruloyl-SCoA Ester und weiter zum Vanillin, sowie das Gen für die Spaltung des Esters wurden vom
Institute of Food Research, Norwich, GB, in WO 97/35999 beschrieben. 1998 erscheint der Inhalt des Patents auch als wissenschaftliche Publikationen (Gasson et al. 1998. Metabolism of ferulic acid to vanillin. J. Biol. Chem. 273:4163-4170; Narbad and Gasson 1998. Metabolism of ferulic acid via vanillin using a novel CoA- dependent pathway in a newly isolated strain of Pseudomonas fluorescens. Micro- biology 144: 1397 - 1405). Die DE-A 195 32 317 beschreibt die fermentative Gewinnung von Vanillin aus Ferulasäure mit Amycolatopsis sp. in hohen Ausbeuten.
Die bekannten Verfahren haben den Nachteil, daß entweder nur sehr geringe Ausbeuten an Vanillin erzielt werden, oder von relativ teuren Edukten ausgegangen wird. Bei dem letztgenannten Verfahren (DE-A 195 32 317) werden zwar hohe Ausbeuten erzielt, jedoch bedingt der Einsatz von Pseudomonas sp. HR199 und Amycolatopsis sp. HR167 für die Biotransformation von Eugenol zu Vanillin eine zweistufige Fermentationsführung und somit einen erheblichen Kosten- und Zeitaufwand.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Organismen zu konstruieren, die in der Lage sind den preiswerten Rohstoff Eugenol in einem einstufigen Prozeß zu Vanillin umzusetzen.
Diese Aufgabe wird durch die Konstruktion von Produktionsstämmen ein- oder mehrzelliger Organismen gelöst, die dadurch gekennzeichnet sind, daß Enzyme des Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus derart inaktiviert sind, daß eine Akkumulation der Intermediate Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und/oder Vanillinsäure erfolgt.
Der Produktionsstamm kann einzellig oder mehrzellig sein. Demgemäß können Gegenstand der Erfindung Mikroorganismen, Pflanzen oder Tiere sein. Darüber hinaus können auch Extrakte die aus dem Produktionsstamm gewonnen werden zum Einsatz kommen. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise einzellige Organismen eingesetzt. Hierbei kann es sich um Mikroorganismen, tierische oder pflanzliche Zellen handeln. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß der Einsatz von Pilzen und Bakterien. Höchst bevorzugt sind Bakterienarten. Unter den Bakterien können insbesondere Rhodococcus-, Pseudomonas- und Esche ichia- Arten nach Veränderung des Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus zum Einsatz kommen. Die Gewinnung der erfindungsgemäß einsetzbaren Organismen kann im einfachsten Fall mittels bekannter, konventioneller mikrobiologischer Methoden erfolgen. So kann die Enzymaktivität der am Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus beteiligten Proteine durch den Einsatz von Enzym-Hemmstoffen verändert werden. Darüber hinaus kann die Enzymaktivität der am Eugenol- und/oder Ferulasäure- Katabolismus beteiligten Proteine durch Mutation der für diese Proteine kodierenden Gene verändert werden. Derartige Mutationen können nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV -Bestrahlung oder muta- tionsauslösende Chemikalien.
Ebenso sind gentechnische Methoden zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Organismen geeignet, wie Deletionen, Insertionen und/oder Nukleotid- Austausche. So können beispielsweise die Gene der Organismen mit Hilfe von anderen DNA-Elementen (Ω-Elemente) inaktiviert werden. Ebenso können mittels geeigneter Vektoren Austausche der intakten Gene gegen veränderte und/oder inaktivierte Gen- Strukturen durchgeführt werden. Die zu inaktivierenden Gene und die für die Inaktivierung eingesetzten DNA-Elemente können dabei durch klassische Klonierungstechniken oder durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) gewonnen werden.
In einer möglichen Ausgestaltung der Erfindung kann beispielsweise der Eugenol- sowie der Ferulasäure-Katabolismus durch Ω-Element-Insertion oder Einführen von Deletionen in entsprechende Gene verändert werden. Hierbei können die Funktionen der Gene, die für Dehydrogenasen, Synthetasen, Hydratasen-Aldolasen, Thiolasen oder Demethylasen kodieren, mittels der oben genannten gentechnischen Methoden inaktiviert werden, so daß die Erzeugung der betreffenden Enzyme blockiert ist. Vorzugsweise handelt es sich um die Gene, die für Coniferylalkohol-Dehydrogenasen, Coniferylaldehyd-Dehydrogenasen, Ferulasäure-CoA-Synthetasen, Enoyl-CoA- Hydratasen-Aldolasen, beta-Ketothiolasen, Vanillin-Dehydrogenasen oder Vanillin- säure-Demethylasen kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind Gene, die die in der EP-A 0845532 angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren und/oder deren Allel- variationen kodierenden Nukleotidsequenzen. Gegenstand der Erfindung sind demgemäß auch Gen-Strukturen zur Herstellung transformierter Organismen und Mutanten.
Vorzugsweise werden Gen-Strukturen zur Gewinnung der Organismen und Mutanten eingesetzt, bei denen die für Dehydrogenasen, Synthetasen, Hydratasen-Aldolasen, Thiolasen oder Demethylasen kodierenden Nukleotidsequenzen inaktiviert sind. Besonders bevorzugt sind Gen-Strukturen, bei dene die für Coniferylalkohol- Dehydrogenasen, Coniferylaldehyd-Dehydrogenasen, Ferulasäure-CoA-Synthetasen, Enoyl-CoA-Hydratasen- Aldolasen, beta-Ketothiolasen, Vanillin-Dehydrogenasen oder Vanillinsäure-Demethylasen kodierenden Nukleotidsequenzen inaktiviert sind. Ganz besonders bevorzugt sind Gen-Strukturen, die die in den Figuren la bis lr angegebenen Strukturen mit den in den Figuren 2a bis 2r wiedergegebenen Nukleotidsequenzen und/oder deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequen- zen aufweisen. Besonders bevorzugt sind hierbei Nukleotidsequenzen von 1 bis 18.
Die Erfindung schließt auch die Teilsequenzen dieser Gen-Strukturen sowie funktio- nelle Äquivalente ein. Unter funktionellen Äquivalenten sind solche Derivate der DNA zu verstehen, bei denen einzelne Nukleobasen ausgetauscht worden sind (Wobbeiaustausche), ohne die Funktion zu ändern. Auch auf Proteinebene können
Aminosäuren ausgetauscht werden, ohne daß eine Veränderung der Funktion die Folge ist.
Den Gen-Strukturen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nach- geschaltet sein. Durch Klonierung der Gen-Strukturen sind Plasmide bzw. Vektoren erhältlich, die zur Transformation und/oder Transfektion eines Organismus und/oder zur konjugativen Übertragung in einen Organismus geeignet sind.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Plasmide und/oder Vektoren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transformierten Organismen und Mutanten. Diese enthalten demgemäß die beschriebenen Gen-Strukturen. Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß auch Organismen, die die genannten Plasmide und/oder Vektoren enthalten.
Die Art der Plasmide und/oder Vektoren hängt von deren Einsatzzweck ab. Um z. B. die intakten Gene des Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus in Pseudomona- den gegen die durch Omega-Elemente inaktivierten Gene austauschen zu können, benötigt man Vektoren, die einerseits in Pseudomonaden übertragen werden können (konjugativ übertragbare Plasmide), andererseits dort jedoch nicht repliziert werden können und somit in Pseudomonaden instabil sind (sogenannte Suizid-Plasmide). DNA- Abschnitte, die mit Hilfe eines solchen Plasmidsystems in Pseudomonaden übertragen werden, können nur erhalten bleiben, wenn sie durch homologe Rekombination in das Genom der Bakterienzelle integriert werden.
Die beschriebenen Gen-Strukturen, Vektoren und Plasmide können zur Herstellung verschiedener transformierter Organismen oder Mutanten verwendet werden. Mittels der gennanten Gen-Strukturen können intakte Nukleinsäuresequenzen gegen veränderte und/oder inaktivierte Gen-Strukturen ausgetauscht werden. In den durch Transformation oder Transfektion oder Konjugation erhältlichen Zellen erfolgt durch homologe Rekombination ein Austausch des intakten Gens gegen die veränderte und/oder inaktivierte Gen-Struktur, wodurch die resultierenden Zellen nur noch über die veränderte und/oder inaktivierte Gen-Struktur im Genom verfügen. So können erfindungsgemäß vorzugsweise Gene derart verändert und/oder inaktiviert werden, daß die betreffenden Organismen Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und/oder Vanillinsäure zu erzeugen vermögen.
Erfindungsgemäß derart konstruierte Produktionsstämme sind beispielsweise Mutanten des Stammes Pseudomonas sp. HR199 (DSM 7063) der in der DE-A 4 227 076 und der EP-A 0845532 genau beschrieben wurde, wobei sich unter anderem die entsprechenden Genstrukturen aus den Figuren la bis lr in Verbindung mit den Figuren 2a bis 2r ergeben: 1. Pseudomonas sp. HR199cα 4ΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte calA-Gen an Stelle des intakten cα 4-Gens kodierend für Coniferylalkohol- Dehydrogenase (Fig. la; Fig. 2a).
2. Pseudomonas sp. HR199cα/ylΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte calA-Gen an Stelle des intakten calA-Gens kodierend für Coniferylalkohol-
Dehydrogenase (Fig. lb; Fig. 2b).
3. Pseudomonas sp. HR199cα/^4Δ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte calA-Gen an Stelle des intakten calA-Gens kodierend für Coniferylalkohol- Dehydrogenase (Fig. lc; Fig. 2c). 4. Pseudomonas sp. HR199cα/JδΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte calB-Gen an Stelle des intakten calB-Gens kodierend für Coniferylaldehyd- Dehydrogenase (Fig. ld; Fig. 2d)
5. Pseudomonas sp. HR199cα/\BΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte calB-Gen an Stelle des intakten cα/5-Gens kodierend für Coniferylaldehyd- Dehydrogenase (Fig. le; Fig. 2e).
6. Pseudomonas sp. HR199cα/5Δ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte cα/5-Gen an Stelle des intakten calB-Gens kodierend für Coniferylaldehyd- Dehydrogenase(Fig.lf; Fig. 2f).
7. Pseudomonas sp. HR199/αsΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte fcs- Gen an Stelle des intakte «-Gens kodierend für Ferulasäure-CoA-Synthe- tase ( Fig.lg; Fig. 2g).
8. Pseudomonas sp. HR199/αsΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte fcs- Gen an Stelle des intakten fcs-Gens kodierend für Ferulasäure-CoA-Synthe- tase (Fig.lh; Fig. 2h). 9. Pseudomonas sp. HR199/csΔ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte fcs-
Gen an Stelle des intakten ^cs-Gens kodierend für Ferulasäure-CoA-Synthe- tase (Fig.li; Fig. 2i).
10. Pseudomonas sp. HR199ecbΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte ecb-Gen an Stelle des intakten ecb-Gens kodierend für Enoyl-CoA- Hydratase-Aldolase (Fig.lj; Fig. 2j). 11. Pseudomonas sp. HR199ecbΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte ecb-Gen an Stelle des intakten ecb-Gens kodierend für Enoyl-CoA-Hydra- tase-Aldolase (Fig.lk; Fig. 2k).
12. Pseudomonas sp. HR199ecbΔ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte ech- Gen an Stelle des intakten ecb-Gens kodierend für Enoyl-CoA-Hydratase-
Aldolase (Fi.ll; Fig. 21).
13. Pseudomonas sp. HR199 αtΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte aat-Gen an Stelle des intakten aat-Gens kodierend für beta-Ketothiolase (Fig. Im; Fig. 2m). 14. Pseudomonas sp. HR199 tΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte α t-Gen an Stelle des intakten ααt-Gens kodierend für beta-Ketothiolase (Fig. In; Fig. 2n).
15. Pseudomonas sp. HR199ααtΔ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte aat- Gen an Stelle des intakten ααt-Gens kodierend für beta-Ketothiolase (Fig.lo; 2o).
16. Pseudomonas sp. HR199vJbΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte vdh-Gen an Stelle des intakten vdb-Gens kodierend für Vanillin-Dehydroge- nase (Fig.lp; Fig. 2p).
17. Pseudomonas sp. HR199vrfbΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte vJb-Gen an Stelle des intakten vdh-Gens kodierend für Vanillin-Dehydroge- nase (Fig.lq; Fig. 2q).
18. Pseudomonas sp. HR199v bΔ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte vdh-Gen an Stelle des intakten v b-Gens kodierend für Vanillin-Dehydroge- nase (Fig.lr; Fig. 2r). 19. Pseudomonas sp. HR199ve?b5ΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte väfbß-Gen an Stelle des intakten vdhB-Gens kodierend für Vanillin-Dehydro- genase II.
20. Pseudomonas sp. HR199vtib5ΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte vdhB-Gen an Stelle des intakten vdhB-Gens kodierend für Vanillin-Dehydro- genäse II. 21. Pseudomonas sp. HR199v b5Δ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte vdhB-Gen an Stelle des intakten vJbß-Gens kodierend für Vanillin-Dehydro- genase II.
22. Pseudomonas sp. HR199αdbΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte adh-Gen an Stelle des intakten adh-Gens kodierend für Alkohol-Dehydroge- nase.
23. Pseudomonas sp. HR199α<ibΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte adh-Gen an Stelle des intakten adh-Gens kodierend für Alkohol-Dehydroge- nase. 24. Pseudomonas sp. HR199α<ibΔ enthaltend das durch Deletion inaktivierte adh-
Gen an Stelle des intakten Jb-Gens kodierend für Alkohol-Dehydrogenase. 25. Pseudomonas sp. HR199vα« ΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte vanA-Gen an Stelle des intakten vanA-Gens kodierend für die α-Untereinheit der Vanillinsäure-Demethylase. 26. Pseudomonas sp. \Rλ99vanAQ.Gnx, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte vanA-Gen an Stelle des intakten vanA-Gens kodierend für die α-Untereinheit der Vanillinsäure-Demethylase.
27. Pseudomonas sp. HR199vα«^4Δ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte vanA-Gen an Stelle des intakten vanA-Gens kodierend für die α-Untereinheit der Vanillinsäure-Demethylase.
28. Pseudomonas sp. HR199vα«5ΩKm, enthaltend das durch ΩKm inaktivierte vanB-Gen an Stelle des intakten vαnß-Gens kodierend für die ß-Untereinheit der Vanillinsäure-Demethylase.
29. Pseudomonas sp. HR199wm5ΩGm, enthaltend das durch ΩGm inaktivierte vanB-Gen an Stelle des intakten vanB-Gens kodierend für die ß-Untereinheit der Vanillinsäure-Demethylase.
30. Pseudomonas sp. HR199vα/ιBΔ, enthaltend das durch Deletion inaktivierte vanB-Gen an Stelle des intakten vanB-Gens kodierend für die ß-Untereinheit der Vanillinsäure-Demethylase. Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von organischen Verbindungen. Insbesondere können mit diesem Verfahren Alkohole, Aldehyde und organische Säuren hergestellt werden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und Vanillinsäure.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die oben beschriebenen Organismen eingesetzt. Zu den ganz besonders bevorzugten Organismen gehören Bakterien, insbesondere die Pseudomonas-Arten. Im einzelnen können die oben genannten Pseu- domonas- Arten vorzugsweise für folgende Verfahren eingesetzt werden:
1. Pseudomonas sp. HR199cα//lΩKm, Pseudomonas sp. HR199cύ7 ΩGm und Pseudomonas sp. HR199cα 4Δ zur Herstellung von Coniferylalkohol aus Eugenol.
2. Pseudomonas sp. HR199cα/5ΩKm, Pseudomonas sp. HR199cα/£ΩGm und Pseudomonas sp. HR199cα/5Δ zur Herstellung von Coniferylaldehyd aus Eugenol oder Coniferylalkohol.
3. Pseudomonas sp. HR199/csΩKm, Pseudomonas sp. HR199/csΩGm, Pseudomonas sp. HR199fcsΔ, Pseudomonas sp. HR199ecbΩKm, Pseudomonas sp. HR199ecbΩGm und Pseudomonas sp. HR199ecbΔ zur Herstellung von Ferulasäure aus Eugenol oder Coniferylalkohol oder Coniferylaldehyd.
4. Pseudomonas sp. HR199v bΩKm, Pseudomonas sp. HR199v bΩGm, Pseudomonas sp. WRl99vdhA, Pseudomonas sp. HR199vJbΩGmvc b5ΩKm, Pseudomonas sp. HR199v<ibΩKmvJb5ΩGm, Pseudomonas sp. HR199vc/bΔvdbßΩGm und Pseudomonas sp. HR199vJbΔvJb£ΩKm zur Herstellung von Vanillin aus Eugenol oder Coniferylalkohol oder Coni- ferylaldehyd oder Ferulasäure. 5. Pseudomonas sp. HR199vα«y4ΩKm, Pseudomonas sp. HR199v ΩGm,
Pseudomonas sp. HR199vα«y4Δ, Pseudomonas sp. HR199v< ßΩKm, Pseudomonas sp. HR199v n5ΩGm und Pseudomonas sp. HR199v «Z?Δ zur Herstellung von Vanillinsäure aus Eugenol oder Coniferylalkohol oder Coniferylaldehyd oder Ferulasäure oder Vanillin.
Bevorzugtes Substrat ist Eugenol. Jedoch kann der Zusatz weiterer Substrate oder sogar der Austausch des Eugenol gegen ein anderes Substrat möglich sein.
Als Nährmedium für die erfindungsgemäß eingesetzten Organismen kommen synthetische, halbsynthetische oder komplexe Kulturmedien in Betracht. Diese können kohlenstoffhaltige und stickstoffhaltige Verbindungen, anorganische Salze, gegebenenfalls Spurenelemente sowie Vitamine enthalten.
Als kohlenstoffhaltige Verbindungen können Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe oder organische Grundchemikalien in Betracht kommen. Beispiele für vorzugsweise verwendbare Verbindungen sind Zucker, Alkohole bzw. Zuckeralkohole, organische Säuren oder komplexe Gemische.
Als Zucker kommt vorzugsweise Glucose in Betracht. Als organische Säuren können vorzugsweise Zitronensäure oder Essigsäure zum Einsatz kommen. Zu den komplexen Gemischen zählen z. B. Malzextrakt, Hefeextrakt, Casein oder Caseinhydro- lysat.
Als stickstoffhaltige Substrate kommen anorganische Verbindungen in Betracht. Beispiele hierfür sind Nitrate und Ammoniumsalze. Ebenso können organische Stickstoffquellen zum Einsatz kommen. Hierzu zählen Hefeextrakt, Sojamehl, Casein, Caseinhydrolysat und Maisquellwasser. Zu den einsetzbaren anorganischen Salzen zählen beispielsweise Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate. Als Metalle enthalten die genannte Salze vorzugsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Calcium, Zink und Eisen.
Die Temperatur für die Kultivierung liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 100°C.
Besonders bevorzugt ist der Bereich von 15 bis 60°C, höchst bevorzugt sind 22 bis
37°C.
Der pH-Wert des Mediums beträgt bevorzugt 2 bis 12. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 4 bis 8.
Grundsätzlich können für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens alle dem Fachmann bekannten Bioreaktoren eingesetzt werden. Vorzugsweise kommen alle für Submersverfahren geeigneten Vorrichtungen in Betracht. Das heißt, es können erfindungsgemäß Gefäße ohne oder mit mechanischer Mischeinrichtung eingesetzt werden. Zu ersteren zählen z. B. Schüttelapparaturen, Blasensäulen- oder Schlaufenreaktoren. Zu letzteren gehören vorzugsweise alle bekannten Vorrichtungen mit Rührern in beliebiger Gestaltung.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Die Dauer der Fermentation bis zum Erreichen einer maximalen Produktmenge hängt von der speziellen Art des eingesetzten Organismus ab. Grundsätzlich liegen die Zeiten der Fermentation jedoch zwischen 2 und 200 Stunden.
Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele näher erläutert:
Von dem Eugenol verwertenden Stamm Pseudomonas sp. HR199 (DSM 7063) wurden gezielt Mutanten erzeugt, wobei spezifisch Gene des Eugenol-Katabolismus durch Insertion von Omega-Elementen oder durch Einführen von Deletionen inakti- viert wurden. Als Omega-Elemente dienten DNA- Abschnitte die für Antibiotikaresistenzen gegen Kanamycin (ΩKm) und Gentamycin (ΩGm) codierten. Diese Resistenzgene wurden ausgehend von Tn5 und dem Plasmid pBBRlMCS-5 mit Hilfe von Standardmethoden isoliert. Die Gene calA, calB, fcs, ech, aat, vdh, adh, vdhB, vanA und vanB, die für Coniferylalkohol-Dehydrogenase, Coniferylaldehyd- Dehydrogenase, Ferulasäure-CoA Synthetase, Enoyl-CoA Hydratase-Aldolase, beta- Ketothiolase, Vanillin-Dehydrogenase, Alkohol-Dehydrogenase, Vanillin-Dehydro- genase II und Vanillinsäure-Demethylase codieren wurden ausgehend von genomischer DNA des Stammes Pseudomonas sp. HR199 mit Hilfe von Standardmethoden isoliert und in pBluescript SK" kloniert. Aus diesen Genen wurden durch Verdauung mit geeigneten Restriktionsendonukleasen DNA-Abschnitte entfernt (Deletion), bzw durch Ω-Elemente substituiert (Insertion), wodurch das jeweilige Gen inaktiviert wurde. Die auf diese Weise mutierten Gene wurden in konjugativ übertragbare Vektoren umkloniert und anschließend in den Stamm Pseudomonas sp. HR199 eingeführt. Durch geeignete Selektion wurden Transkonjuganten erhalten, die das jeweils funktionsfähige wildtyp-Gen gegen das neu eingebrachte inaktivierte Gen ausge- tauscht hatten. Die so erhaltenen Insertions- und Deletionsmutanten wiesen nur noch das jeweils inaktivierte Gen auf. Auf diese Weise wurden sowohl Mutanten mit nur einem defekten Gen als auch Mehrfachmutanten, in denen mehrere Gene auf diese Weise inaktiviert wurden, erhalten. Diese Mutanten wurden für die Biotransformation von a) Eugenol zu Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und/oder
Vanillinsäure; b) Coniferylalkohol zu Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und/oder Vanillinsäure; c) Coniferylaldehyd zu Ferulasäure, Vanillin und/oder Vanillinsäure; d) Ferulasäure zu Vanillin und/oder Vanillinsäure und e) Vanillin zu Vanillinsäure eingesetzt. Material und Methoden
Wachstumsbedingungen der Bakterien.
Stämme von Escher ichia coli wurden bei 37°C in Luria-Bertani (LB) oder M9-Mine- ralmedium (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.) angezogen. Stämme von Pseudomonas sp. wurden bei 30°C in Nutrient Broth (NB, 0,8%, wt/vol) oder in Mineralmedium (MM) (Schlegel, H. G. et al. 1961. Arch. Mikrobiol. 38:209-222) bzw. HR-Mineralmedium (HR-MM) (Rabenhorst, J. 1996. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:470-474.) angezogen. Ferulasäure, Vanillin, Vanillinsäure und Protocatechusäure wurden" in Dimethylsulfoxid gelöst, und dem jeweiligen Medium in einer Endkonzentration von 0.1% (wt/vol) zugesetzt. Eugenol wurde dem Medium direkt in einer Endkonzentration von 0.1% (vol/vol) zugesetzt, bzw. in den Deckel von MM-Agarplatten auf Filterpapier (Rundfilter 595, Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) appliziert. Bei der
Anzucht von Transkonjuganten und Mutanten von Pseudomonas sp. wurde Tetra- cyclin, Kanamycin, und Gentamycin in Endkonzentrationen von 25 μg/ml bzw. 100 μg/ml bzw. 7,5 μg/ml eingesetzt.
Qualitativer und quantitativer Nachweis von Stoffwechselintermediaten in Kulturüberständen.
Kulturüberstände wurden direkt, bzw. nach Verdünnung mit H2θ-bidest. mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (Knauer-HPLC) analysiert. Die Chromatographie erfolgte an Nucleosil-100 C18 (7 μm, 250 x 4 mm). Als Lösungsmittel diente 0.1 % (vol/vol) Ameisensäure und Acetonitril. Der verwendete Gradient zur
Elution der Substanzen verlief wie folgt:
00:00 - 06:30 → 26% Acetonitril 06:30 - 08:00 → 100% Acetonitril 08:00 - 12:00 → 100% Acetonitril
12:00 - 13:00 → 26% Acetonitril 13:00 - 18:00 → 26% Acetonitril Reinigung der Vanillin-Dehydrogenase-II.
Die Aufreinigung erfolgte bei 4°C.
Rohextrakt.
Auf Eugenol angezogene Zellen von Pseudomonas sp. HR199 wurden in 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6.0 gewaschen, im gleichen Puffer resuspendiert und durch zweimalige Passage einer French-Presse (Amicon, Silver Spring, Maryland, USA) bei einem Druck von 1000 psi aufgeschlossen. Das Zellhomogenat wurde einer Ultrazentrifugation (1 h, 100 000 x g, 4°C) unterzogen, wodurch die lösliche
Fraktion des Rohextraktes als Überstand erhalten wurde.
Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sephacel.
Die lösliche Fraktion des Rohextraktes wurde über Nacht gegen 10 mM Natrium- phosphat-Puffer, pH 6.0 dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine mit 10 mM
Natriumphosphat-Puffer, pH 6.0 äquilibrierte DEAE-Sephacel-Säule (2,6 cm x 35 cm, Bettvolumen[BV]: 186 ml) mit einer Durchflußrate von 0.8 ml/min aufgetragen.
Die Säule wurde mit zwei BV 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6.0 gespült. Die
Elution der Vanillin-Dehydrogenase-II (VDH-II) erfolgte mit einem linearen Salz- gradient von 0 bis 400 mM NaCl in 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6.0 (750 ml). Es wurden 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Fraktionen mit hoher VDH-II-Akti- vität wurden zum DEAE-Pool vereinigt.
Bestimmung der Vanillin-Dehydrogenase-Aktivität. Die Bestimmung der VDH-Aktivität erfolgte bei 30°C durch einen optisch enzyma- tischen Test. Der Reaktionsansatz mit einem Volumen von 1 ml enthielt 0.1 mmol Kalium-Phosphat (pH 7.1), 0.125 μmol Vanillin, 0.5 μmol NAD, 1.2 μmol Pyruvat (Na-Salz), Lactat-Dehydrogenase (1 U; aus Schweineherz ) und Enzymlösung. Die Oxidation von Vanillin wurde bei λ = 340 nm verfolgt (εvanillin = 1 ,6 cm^/μmol). Die Enzymaktivität wurde in Einheiten (U) angegeben, wobei 1 U der Enzymmenge entspricht, die 1 μmol Vanillin pro Minute umsetzt. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden nach Lowry et al. (Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193:265-275) bestimmt.
Bestimmung der Coniferylalkohol-Dehydrogenase-Aktivität.
Die Bestimmung der CADH- Aktivität erfolgte bei 30°C durch einen optisch enzy- matischen Test nach Jaeger et al. (Jaeger, E., L. Eggeling und H. Sahm. 1981. Current Microbiology. 6:333-336). Der Reaktionsansatz mit einem Volumen von 1 ml enthielt 0.2 mmol Tris/HCl (pH 9.0), 0.4 μmol Coniferylalkohol, 2 μmol NAD, 0.1 mmol Semicarbazid und Enzymlösung. Die Reduktion von NAD wurde bei λ = 340 nm verfolgt (ε = 6.3 cm^/μmol). Die Enzymaktivität wurde in Einheiten (U) angegeben, wobei 1 U der Enzymmenge entspricht, die 1 μmol Substrat pro Minute umsetzt. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden nach Lowry et al. (Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193:265-275) bestimmt.
Bestimmung der Coniferylaldehyd-Dehydrogenase-Aktivität.
Die Bestimmung der CALDH-Aktivität erfolgte bei 30°C durch einen optisch enzy- matischen Test. Der Reaktionsansatz mit einem Volumen von 1 ml enthielt 0.1 mmol Tris/HCl (pH 8.8), 0.08 μmol Coniferylaldehyd, 2.7 μmol NAD und Enzymlösung. Die Oxidation von Coniferylaldehyd zu Ferulasäure wurde bei λ = 400 nm verfolgt
(ε = 34 cm.2/μmol). Die Enzymaktivität wurde in Einheiten (U) angegeben, wobei 1 U der Enzymmenge entspricht, die 1 μmol Substrat pro Minute umsetzt. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden nach Lowry et al. (Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193:265-275) bestimmt.
Bestimmung der Ferulasäure-CoA-Synthetase (Ferulasäure-Thiokinase)-Aktivi- tät.
Die Bestimmung der FCS-Aktivität erfolgte bei 30°C durch einen optisch enzyma- tischen Test, modifiziert nach Zenk et al. (Zenk et al. 1980. Anal. Biochem. 101: 182-
187). Der Reaktionsansatz mit einem Volumen von 1 ml enthielt 0.09 mmol Kalium- Phosphat (pH 7.0), 2.1 μmol MgCl2, 0.7 μmol Ferulasäure, 2 μmol ATP, 0.4 μmol Coenzym A und Enzymlösung. Die Entstehung des CoA-Esters aus Ferulasäure wurde bei λ = 345 nm verfolgt (ε = 10 cmNμmol). Die Enzymaktivität wurde in Einheiten (U) angegeben, wobei 1 U der Enzymmenge entspricht, die 1 μmol Sub- strat pro Minute umsetzt. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden nach
Lowry et al. (Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193:265-275) bestimmt.
Electrophoretische Methoden. Die Auftrennung von proteinhaltigen Extrakten erfolgte in 7.4% (wt/vol) Poly- acrylamidgelen unter nativen Bedingungen nach der Methode von Stegemann et al. (Stegemann et al. 1973. Z. Naturforsch. 28c:722-732) und unter denaturierenden Bedingungen in 11.5% (wt/vol) Polyacrylamidgelen nach der Methode von Laemmli (Laemmli, U. K. 1970. Nature (London) 227:680-685). Zur unspezifischen Protein- färbung wurde Serva Blue R verwendet. Zur spezifischen Anfärbung der Coniferylalkohol-, Coniferylaldehyd- und Vanillin-Dehydrogenase wurden die Gele für 20 min in 100 mM KP-Puffer (pH 7.0) umgepuffert und anschließend bei 30°C im gleichen Puffer dem 0.08% (wt/vol) NAD, 0.04% (wt/vol) p-Nitroblau-Tetrazolium- chlorid, 0.003%» (wt/vol) Phenazine-Methosulfat und 1 mM des jeweiligen Substrates zugesetzt worden war inkubiert, bis entsprechende Farbbanden sichtbar wurden.
Transfer von Proteinen aus Polyacrylamidgelen auf PVDF-Membranen. Proteine wurden aus SDS-Polyacrylamidgelen mit Hilfe eines Semidry-Fasfblot Gerätes (B32/33, Biometra, Göttingen, Deutschland) nach Herstellerangaben auf PVDF- Membranen (Waters-Milipore, Bedford, Mass., USA) übertragen.
Bestimmung von N-terminalen Aminosäuresequenzen.
Die Bestimmung von N-terminalen Aminosäuresequenzen erfolgte mit Hilfe eines Protein Peptide Sequenzers (Typ 477 A, Applied Biosystems, Foster City, USA) und eines PTH- Analysers nach Herstellerangaben. Isolierung und Manipulation von DNA.
Die Isolierung von genomischer DNA erfolgte nach der Methode von Marmur (Marmur, J. 1961. J. Mol. Biol. 3:208-218). Die Isolierung und Analyse von anderer Plasmid-DNA bzw. von DNA-Restriktionsfragmenten erfolgte nach Standardmetho- den (Sambrook, J. E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York.).
Transfer von DNA. Die Präparation und Transformation von kompetenten Escherichia co/ -Zellen erfolgte nach der Methode von Hanahan (Hanahan, D. 1983. J. Mol. Biol. 166:557- 580). Konjugativer Plasmidtransfer zwischen Plasmid-tragenden Escherichia coli S 17- 1 -Stämmen (Donor) und Pseudomonas sp. -Stämmen (Rezipient) erfolgte auf NB-Agarplatten nach der Methode von Friedrich et al. (Friedrich, B. et al. 1981. J. Bacteriol. 147: 198-205), oder durch eine "Minikomplementations-Methode" auf
MM-Agarplatten mit 0.5%> (wt/vol) Gluconat als C-Quelle und 25 μg/ml Tetracyclin oder 100 μg/ml Kanamycin. Dabei wurden Zellen des Rezipienten in einer Richtung als Impfstrich aufgetragen. Nach 5 min wurden dann Zellen der Donor-Stämme als Impfstriche aufgetragen, wobei der Rezipienten-Impfstrich gekreuzt wurde. Nach einer Inkubation für 48 h bei 30°C wuchsen die Transkonjuganten direkt hinter der
Kreuzungsstelle, wohingegen weder Donor- noch Rezipienten-Stamm zum Wachstum in der Lage war.
Hybridisierungsexperimente. DNA-Restriktionsfragmente wurden in einem 0.8% (wt/vol) Agarose-Gel in 50 mM
Tris- 50 mM Borsäure- 1.25 mM EDTA-Puffer (pH 8.5) elektrophoretisch aufgetrennt (Sambrook, J. E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York.). Die Übertragung der denaturierten DNA aus dem Gel auf eine positiv geladene Nylonmembran (Porengröße: 0.45 μm, Pall Filtrationstechnik, Dreieich, Deutschland), die anschließende Hybridisierung mit biotinylierten, bzw. Digoxigenin-markierten DNA-Sonden und die Herstellung dieser DNA-Sonden erfolgte nach Standardmethoden (Sambrook, J. E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York.).
DNA-Sequenzierung.
Die Bestimmung von Nukleotidsequenzen erfolgte nach der Didesoxy-Kettenab- bruch-Methode von Sanger et al. (Sanger et al. 1977. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467) "nicht-radioaktiv" mit einem "LI-COR DNA-Sequencer Modell 4000L" (LI-COR Inc., Biotechnology Division, Lincoln, NE,.USA) unter Verwendung eines "Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP" (Amersham Life Science, Amersham International pls, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) jeweils nach Vorschrift des Herstellers.
Mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden wurde nach der "Primer-hopping
Strategie" von Strauss et al. (Strauss, E. C. et al. 1986. Anal. Biochem. 154:353-360) sequenziert.
Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme. Restriktionsenzyme, T4 DNA-Ligase, Lambda-DNA und Enzyme bzw. Substrate für die optisch enzymatischen Tests wurden von C. F. Boehringer & Söhne (Mannheim, Deutschland) oder von GIBCO/BRL (Eggenstein, Deutschland) bezogen, [γ- 32p]ATP kam von Amersham/Buchler (Braunschweig, Deutschland). Oligonukleo- tide wurden von der Firma MWG-Biotech GmbH (Ebersberg, Deutschland) bezogen. Agarose vom Typ NA wurde von Pharmacia-LKB (Uppsala, Schweden) bezogen.
Alle anderen Chemikalien waren von Haarmann & Reimer (Holzminden, Deutschland), E. Merck AG (Darmstadt, Deutschland), Fluka Chemie (Buchs,, Schweiz), Serva Feinbiochemica (Heidelberg, Deutschland) oder Sigma Chemie (Deisenhofen, Deutschland). Beispiele
Beispiel 1
Konstruktion von Omega-Elementen, die Resistenzen gegenüber Kanamycin (Ω
Km) bzw. Gentamycin( ΩGm) vermitteln.
Für die Konstruktion des ΩKm-Elements wurde das 2099 bp 5g/I-Fragment des Transposons Tn5 (Auerswald E. A., G. Ludwig und H. Schaller. 1981. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 107-113; Beck E., G. Ludwig, E. A. Auerswald, B. Reiss und H. Schaller. 1982. Gene 19:327-336; Mazodier P., P. Cossart, E. Giraud und F. Gasser. 1985. Nucleic Acids Res. 13: 195-205.) präparativ isoliert. Das Fragment wurde durch Behandlung mit der Nuklease Bal-31 auf ca. 990 bp verkürzt. Dieses Fragment, das nur noch das Kanamycin-Resistenzgen (codierend für eine Aminoglycosid-3'-O-Phosphotransferase) umfaßte, wurde anschließend mit Smal geschnittener pSKsym-DNA (pBluescript SK -Derivat, welches eine symetrisch aufgebaute multiple Klonierungsstelle [Sall, Hindlll, EcoRI, Smαl, EcoRI, Hindlϊl, Sall] enthält) ligiert. Aus dem resultierenden Plasmid konnte das ΩKm-Εlement als Smal-, EcoRI-, HwdIII- oder So/I-Fragment reisoliert werden.
Für die Konstruktion des ΩGm-Εlements wurde das 983 bp Eαel-Fragment des
Plasmids pBBRlMCS-5 (Kovach M.Ε., P. Η. Elzer, D. S. Hill, G. T. Robertson, M. A. Farris, R. M. Roop und K. M. Peterson. 1995. Gene 166:175-176.) präparativ isoliert und anschließend mit Mung Bean Nuklease (Abdauen von einzelsträngigen DNA-Molekülenden) behandelt. Dieses Fragment, das nur noch das Gentamycin- Resistenzgen (codierend für eine Gentamycin-3-Acetyltransferase) umfaßte, wurde anschließend mit Smal geschnittener pSKsym-DNA (s.o.) ligiert. Aus dem resultierenden Plasmid konnte das ΩGm-Element als Smal-, EcoRI-, H dlll- oder Sall- Fragment reisoliert werden. Beispiel 2
Klonierung der Gene aus Pseudomonas sp. HR199 (DSM7063), die durch Inser- tion von Ω-Elementen oder durch Deletionen inaktiviert werden sollten. Die separaten Klonierungen der Gene fcs, ech, vdh und aat erfolgte ausgehend von den E. coli S17-1 Stämmen DSM 10439 und DSM 10440 mit den Plasmiden pE207 und pE5-l (siehe EP-A 0845532). Aus diesen Plasmiden wurden die angegebenen Fragmente präparativ isoliert und wie im weiteren beschrieben behandelt:
Für die Klonierung desfcs-Gens wurde das 2350 bp große Sα/I/EcoRI-Fragment des
Plasmids pΕ207 und das 3700 bp große EcoRI/Sα/I-Fragment des Plasmids pΕ5-l zusammen in pBluescript SK in einer Weise kloniert, daß beide Fragmente über die EcoRI-Enden miteinander verbunden waren. Ausgehend von dem resultierenden Hybridplasmid wurde das 6050 bp Sα I-Fragment präparativ isoliert und durch Behandlung mit der Nuklease Bal-31 auf ca. 2480 bp verkürzt. Anschließend wurden an die Fragment-Enden / sfl-Linker ligiert und das Fragment nach Pstl-Verdauung in pBluescript SK" kloniert (pSK αs). Nach Transformation von E. coli XLl-Blue wurden Klone erhalten, die das fcs-Gen exprimierten und eine FCS-Aktivität von 0.2 U/mg Protein aufwiesen.
Für die Klonierung des ecb-Gens wurde das 3800 bp große Hmdlll/EcoRI-Fragment des Plasmids pΕ207 präparativ isoliert und durch Behandlung mit der Nuklease Bal- 31 auf ca. 1470 bp verkürzt. Anschließend wurden an die Fragment-Enden EcoRI - Linker ligiert und das Fragment nach EcoRI-Verdauung in pBluescript SK" kloniert (pSKecb).
Für die Klonierung des vJb-Gens wurde das 2350 bp große Sα/I/EcoRI-Fragment des
Plasmids pΕ207 präparativ isoliert. Nach Klonierung in pBluescript SK" wurde das
Fragment mit Hilfe eines Exonuklease 111/ Mung Bean Nukleasesystems einseitig um ca. 1530 bp verkürzt. Anschließend wurde an das Fragmentende ein EcoRI- Linker ligiert und das Fragment nach EcoRI-Verdauung in pBluescript SK kloniert (pSKvdh). Nach Transformation von E. coli XLl-Blue wurden Klone erhalten, die das vJb-Gen exprimierten und eine VDH- Aktivität von 0.01 U/mg Protein aufwiesen.
Für die Klonierung des aat-Gens wurde das 3700 bp große EcoRI/Sα/I-Fragment des Plasmids pΕ5-l präparativ isoliert und durch Behandlung mit der Nuklease Bal-31 auf ca. 1590 bp verkürzt. Anschließend wurden an die Fragment-Enden EcoRI- Linker ligiert und das Fragment nach EcoRI-Verdauung in pBluescript SK" kloniert (pSKaat).
Beispiel 3
Inaktivierung der oben beschriebenen Gene durch Insertion von Ω-Εlementen, bzw durch Deletion von Teilbereichen dieser Gene.
Das Plasmid pSKfcs, welches das fcs-Gen enthielt wurde mit verdaut, wodurch ein 1290 bp großes Fragment aus dem ^cs-Gen herausgeschnitten wurde. Nach Religation wurde das Deletions-Derivat desfcs-Gens (fcsA) (siehe Abb. li und 2i) kloniert in pBluescript SK" (pSK/αsA) erhalten. Darüber hinaus wurden nach Herausschneiden des Fragments die Omega-Εlemente ΩKm und ΩGm an dessen
Stelle einligiert. Dadurch entstanden die Ω-inaktivierten Derivate des/c -Gens (fcsΩ Km, siehe Abb. lg und 2g) und (fcsΩ.Gm, siehe Abb. lh und 2h) kloniert in pBluescript SK" (pSK csΩKm und pSK/αsΩGm). In Rohextrakten der erhaltenen E. coli Klone, deren Hybridplasmide ein durch Deletion bzw. Ω-Εlement-Insertion inaktiviertes/cs-Gen aufwiesen, konnte keine FCS-Aktivität nachgewiesen werden.
Das Plasmid pSKecb, welches das ecb-Gen enthielt, wurde mit Nrwl verdaut, wodurch ein 53 bp und ein 430 bp großes Fragment aus dem ecb-Gen herausgeschnitten wurde. Nach Religation wurde das Deletions-Derivat des ecb-Gens (ecbΔ, siehe Abb. 11 und 21) kloniert in pBluescript SK" (pSKecbΔ) erhalten. Darüber hinaus wurden nach Herausschneiden der Fragmente die Omega-Elemente ΩKm und ΩGm an deren Stelle einligiert. Dadurch entstanden die Ω-inaktivierten Derivate des ecb-Gens (ecbΩKm und ecbΩGm) kloniert in pBluescript SK (pSKecbΩKm und pSKecbΩGm).
Das Plasmid pSKvJb, welches das vJb-Gen enthielt wurde mit ÄssHII verdaut, wodurch ein 210 bp großes Fragment aus dem vdh-Gen herausgeschnitten wurde. Nach Religation wurde das Deletions-Derivat des vdh-Gens (vdhA, siehe Abb. lo und 2o) kloniert in pBluescript SK (pSKvdhΔ) erhalten. Darüber hinaus wurden nach Herausschneiden des Fragments die Omega-Elemente _ ΩKm und ΩGm an dessen Stelle einligiert. Dadurch entstanden die Ω-inaktivierten Derivate des vdh- Gens (vdhΩKm und vdhΩGm) kloniert in pBluescript SK (pSKvdhΩKm, siehe Abb. Im und 2m) und (pSKvöfbΩGm, siehe Abb. In und 2n). In Rohextrakten der erhaltenen E. coli Klone, deren Hybridplasmide ein durch Deletion bzw. Ω-Element- Insertion inaktiviertes vtib-Gen aufwiesen, konnte keine VDH-Aktivität nachgewiesen werden.
Das Plasmid pSKααt, welches das aat-Gen enthielt wurde mit ÄwHII verdaut, wodurch ein 59 bp großes Fragment aus dem aat-Gen herausgeschnitten wurde. Nach Religation wurde das Deletions-Derivat des α^t-Gens (aatA, siehe Abb. lr und
2r) kloniert in pBluescript SK (pSKααtΔ) erhalten. Darüber hinaus wurden nach Herausschneiden des Fragments die Omega-Elemente ΩKm und ΩGm an dessen Stelle einligiert. Dadurch entstanden die Ω-inaktivierten Derivate des ααt-Gens (aat ΩKm, siehe Abb. lp und 2p) und (ααtΩGm, siehe Abb. Iq und 2q) kloniert in pBluescript SK" (pSKααtΩKm und pSKααtΩGm). Beispiel 4
Umklonieren der durch Ω-Elemente inaktivierten Gene in das konjugativ übertragbare "Suizid-Plasmid" pSUP202. Um die durch Ω-Elemente inaktivierten Gene in Pseudomonas sp. HR199 gegen die intakten Gene austauschen zu können, benötigt man einen Vektor, der einerseits in Pseudomonaden übertragen werden kann (konjugativ übertragbare Plasmide), andererseits dort jedoch nicht repliziert werden kann und somit in Pseudomonaden instabil ist ("Suizid-Plasmid"). DNA- Abschnitte, die mit Hilfe eines solchen Plasmid- Systems in Pseudomonaden übertragen werden, können nur erhalten bleiben, wenn sie durch homologe Rekombination (RecA-abhängige Rekombination) in das Genom der Bakterienzelle integriert werden. Im vorliegenden Fall wurde das "Suizid- Plasmid" pSUP202 (Simon et al. 1983. In: A. Pühler. Molecular genetics of the bacteria-plant interaction. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, S. 98- 106.) eingesetzt.
Die inaktivierten Gene fcsΩKm und cΛΩGm wurden nach stl-Verdauung aus den Plasmiden pSK/αsΩKm und pSK/c^ΩGm isoliert und mit Pstl geschnittener pSUP202 DNA ligiert. Die Ligationsansätze wurden nach E. coli S17-1 transfor- miert. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin-haltigem LB-Medium mit Kanamycin bzw. Gentamycin. Es wurden Kanamycin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pSUP/csΩKm) das inaktivierte Gen yesΩKm enthielt. Das entsprechende Hybridplasmid (pSUP/αsΩGm) der Gentamycin- resistenten Transformanden enthielt das inaktivierte GenfcsΩGm.
Die inaktivierten Gene ecbΩKm und ecbΩGm wurden nach EcoRI-Verdauung aus den Plasmiden pSKecbΩKm und pSKecbΩGm isoliert und mit EcoRI geschnittener pSUP202 DNA ligiert. Die Ligationsansätze wurden nach E. coli S17-1 transformiert. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin-haltigem LB-Medium mit Kanamycin bzw. Gentamycin. Es wurden Kanamycin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pSUPecbΩKm) das inaktivierte Gen ecbΩKm enthielt. Das entsprechende Hybridplasmid (pSUPecbΩGm) der Gentamycin- resistenten Transformanden enthielt das inaktivierte Gen ecbΩGm.
Die inaktivierten Gene vJbΩKm und vJbΩGm wurden nach EcoRI-Verdauung aus den Plasmiden pSKv^bΩKm und pSKvtibΩGm isoliert und mit EcoRI geschnittener pSUP202 DNA ligiert. Die Ligationsansätze wurden nach E. coli S17-1 transformiert. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin-haltigem LB-Medium mit Kanamycin bzw. Gentamycin. Es wurden Kanamycin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pSUPvdbΩKm) das inaktivierte Gen v bΩKm enthielt. Das entsprechende Hybridplasmid (pSUPvJbΩGm) der Gentamycin- resistenten Transformanden enthielt das inaktivierte Gen vJbΩGm.
Die inaktivierten Gene aatΩKm und ααtΩGm wurden nach EcoRI-Verdauung aus den Plasmiden pSKααtΩKm und pSKααtΩGm isoliert und mit EcoRI geschnittener pSUP202 DNA ligiert. Die Ligationsansätze wurden nach E. coli S17-1 transformiert. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin-haltigem LB-Medium mit Kanamycin bzw. Gentamycin. Es wurden Kanamycin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pSUP αtΩKm) das inaktivierte Gen aatΩKm enthielt. Das entspre- chende Hybridplasmid (pSUPααtΩGm) der Gentamycin- resistenten Transformanden enthielt das inaktivierte Gen αtΩGm.
Beispiel 5
Umklonieren der durch Deletion inaktivierten Gene in das konjugativ übertragbare "Suizid-Plasmid" mit "sαcß-Selektionssystem" pHE55.
Um die durch Deletion inaktivierten Gene in Pseudomonas sp. HR199 gegen die intakten Gene austauschen zu können, benötigt man einen Vektor, der die schon für pSUP202 beschriebenen Eigenschaften aufweist. Da im Gegensatz zu den durch Ω- Element inaktivierten Genen bei durch Deletion inaktivierten Genen keine Selek- tionsmöglichkeit (keine Antibiotika-Resistenz) für den erfolgten Austausch der Gene in Pseudomonas sp. HR199 besteht, mußte ein anderes Selektionssystem zur Anwendung kommen. Bei dem "raαß-Selektionssystem" wird das auszutauschende, durch Deletion inaktivierte Gen in einem Plasmid kloniert, welches neben einem Antibiotika-Resistenzgen auch über das sacB-Gen verfügt. Nach konjugativer Übertragung dieses Hybridplasmids in einen Pseudomonaden wird das Plasmid durch homologe Rekombination an der Stelle in das Genom integriert, an der sich das intakte Gen befindet (erster "Cross over"). Auf diese Weise entsteht ein "heteroge- noter" Stamm, der sowohl über ein intaktes als auch über ein durch Deletion inakti- viertes Gen verfügt, welche durch die pHE55-DNA voneinander getrennt sind. Diese
Stämme weisen die durch den Vektor codierte Resistenz auf und besitzen darüber hinaus ein aktives sacB-Gen. Durch ein zweites homologes Rekombinationsereignis (zweiter "Cross over"), soll nun die pHE55-DNA zusammen mit dem intakten Gen aus der genomischen DNA ausgegliedert werden. Durch dieses Rekombinations- ereignis entsteht ein Stamm, der nur noch über das inaktivierte Gen verfügt. Darüber hinaus kommt es zum Verlust der pHE55 -codierten Antibiotika-Resistenz und des .sαcS-Gens. Streicht man Stämme auf Saccharose-haltigen Medien aus, werden Stämme die das sacB-Gen exprimieren im Wachstum gehemmt, da das Genprodukt Saccharose zu einem Polymer umsetzt, welches im Periplasma der Zellen akkumuliert wird. Zellen, die durch das zweite Rekombinationsereignis das sacB-
Gen nicht mehr tragen, werden somit nicht im Wachstum gehemmt. Um eine phänotypische Selektionsmöglichkeit auf die Integration des durch Deletion inaktivierten Gens zu besitzen, tauscht man dieses nicht gegen ein intaktes Gen aus, sondern man bedient sich eines Stammes, in dem das auszutauschende Gen bereits durch Insertion eines Ω-Elements "markiert" vorliegt. Bei erfolgreichem Austausch verliert der resultierende Stamm die durch das Ω-Element codierte Antibiotika- Resistenz.
Das inaktivierte Gen fcs A wurden nach stl-Verdauung aus dem Plasmid pSK/csΔ isoliert und mit Pstl geschnittener pHE55 DNA ligiert. Der Ligationsansatz wurde nach E. coli S17-1 transformiert. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin-haltigem LB- Medium. Es wurden Tetracyclin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pHEfcsA) das inaktivierte GenfcsA enthielt.
Das inaktivierte Gen echA wurden nach EcoRI-Verdauung aus dem Plasmid pSKecbΔ isoliert und mit Mung Bean Nuklease behandelt (Erzeugung von glatten
Enden ["blunt ends"]). Das Fragment wurde mit BamHl geschnittener und Mung Bean Nuklease behandelter pHE55 DNA ligiert. Der Ligationsansatz wurde nach E. coli S17-1 transformiert. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin-haltigem LB- Medium. Es wurden Tetracyclin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pHEecbΔ) das inaktivierte Gen echA enthielt.
Das inaktivierte Gen vdhA wurden nach EcoRI-Verdauung aus dem Plasmid pSKvüfbΔ isoliert und mit Mung Bean Nuklease behandelt. Das Fragment wurde mit BamHl geschnittener und Mung Bean Nuklease behandelter pHΕ55 DNA ligiert. Der Ligationsansatz wurde nach E. coli S17-1 transformiert. Die Selektion erfolgte auf
Tetracyclin-haltigem LB-Medium. Es wurden Tetracyclin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pHEv bΔ) das inaktivierte Gen vJbΔ enthielt.
Das inaktivierte Gen aatA wurden nach EcoRI-Verdauung aus dem Plasmid pSKααtΔ isoliert und mit Mung Bean Nuklease behandelt. Das Fragment wurde mit
BamHl geschnittener und Mung Bean Nuklease behandelter pHΕ55 DNA ligiert. Der Ligationsansatz wurde nach E. coli S17-1 transformiert. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin-haltigem LB-Medium. Es wurden Tetracyclin-resistente Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid (pHEααtΔ)das inaktivierte Gen aatA enthielt. Beispiel 6
Erzeugung von Mutanten des Stammes Pseudomonas sp. HR199, bei denen spezifisch Gene des Eugenol-Katabolismuses durch Insertion eines Ω-EIementes inaktiviert wurden.
Der Stamm Pseudomonas sp. HR199 wurde als Rezipient in Konjugationsexperimenten eingesetzt, bei denen Stämme von E. coli S17-1 als Donoren eingesetzt wurden, die die unten aufgeführten Hybridplasmide von pSUP202 enthielten. Die Transkonjuganten wurden auf Gluconat-haltigem Mineralmedium selektiert, welches das dem Ω-Element entsprechende Antibiotikum enthielt. "Homogenote" (Austausch des intakten Gens gegen das durch Ω-Element-Insertion inaktivierte Gen durch doppeltes "Cross over") und "heterogenote" (Integration des Hybridplasmids in das Genom durch einfachen "Cross over") Transkonjuganten konnten anhand der durch pSUP202 codierten Tetracyclin-Resistenz unterschieden werden.
Die Mutanten Pseudomonas sp. HR199 c.sΩKm und Pseudomonas sp. HR199 fcsΩ Gm wurden nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 mit E. coli S17-1 (pSUP/csΩKm) bzw. E. coli S17-1 (pSUP/∞ΩGm) erhalten. Der Austausch des intakten fcs-Gens gegen das durch ΩKm bzw. ΩGm inaktivierte Gen (fcsΩKm bzw. fcsΩGm) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Mutanten Pseudomonas sp. HR199 ecbΩKm und Pseudomonas sp. HR199 echΩ Gm wurden nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 mit E. coli S17-1 (pSUPecbΩKm) bzw. E. coli S17-1 (pSUPecbΩGm) erhalten. Der Austausch des intakten ecb-Gens gegen das durch ΩKm bzw. ΩGm inaktivierte Gen (ecbΩKm bzw. ecbΩGm) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Mutanten Pseudomonas sp. HR199 vJbΩKm und Pseudomonas sp. HR199 vdh
ΩGm wurden nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 mit E. coli S17-1 (pSUPv bΩKm) bzw. E. coli S17-1 (pSUPvJbΩGm) erhalten. Der Austausch des intakten vJb-Gens gegen das durch ΩKm bzw. ΩGm inaktivierte Gen (wtTzΩKm bzw. vJbΩGm) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Mutanten Pseudomonas sp. HR199 αötΩKm und Pseudomonas sp. HR199 aatΩ Gm wurden nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 mit E. coli S17-1
(pSUPαα/ΩKm) bzw. E. coli S17-1 (pSUPααtΩGm) erhalten. Der Austausch des intakten aat-Gens gegen das durch ΩKm bzw. ΩGm inaktivierte Gen (ααtΩKm bzw. ααtΩGm) wurde mittels DNA- Sequenzierung verifiziert.
Die Mutante Pseudomonas sp. HR199 csΩKmvJbΩGm wurden nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 /csΩKm mit E. coli S17-1 (pSUPvJbΩGm) erhalten. Der Austausch des intakten vdh-Gens gegen das durch ΩGm inaktivierte Gen (vdhΩ Gm) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Mutante Pseudomonas sp. HR199 vJbΩKmααtΩGm wurden nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 viibΩKm mit E. coli S17-1 (pSUPααtΩGm) erhalten. Der Austausch des intakten ααt-Gens gegen das durch ΩGm inaktivierte Gen (aatΩ Gm) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Mutante Pseudomonas sp. HR199 vJbΩKmecbΩGm wurden nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 vtibΩKm mit E. coli S17-1 (pSUPecbΩGm) erhalten. Der Austausch des intakten ecb-Gens gegen das durch ΩGm inaktivierte Gen (echΩ Gm) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 7
Erzeugung von Mutanten des Stammes Pseudomonas sp. HR199, bei denen spezifisch Gene des Eugenol-Katabolismuses durch Deletion eines Teilbereiches inaktiviert wurden.
Die Stämme Pseudomonas sp. HR199 αsΩKm, Pseudomonas sp. HR199 ecbΩKm, Pseudomonas sp. HR199 vdhΩK und Pseudomonas sp. HR199 aatΩKm wurden als Rezipient in Konjugationsexperimenten eingesetzt, bei denen Stämme von E. coli S17-1 als Donoren eingesetzt wurden, die die unten aufgeführten Hybridplasmide von pHE55 enthielten. Die "heterogenoten" Transkonjuganten wurden auf Gluconat- haltigem Mineralmedium selektiert, welches neben Tetracyclin (pHE55 codierte Resistenz) das dem Ω-Element entsprechende Antibiotikum enthielt. Nach Ausstreichen auf Saccharose-haltigem Mineralmedium wurden Transkonjuganten erhalten, die durch ein zweites Rekombinationsereignis (zweiter "Cross over") die Vektor- DNA eliminiert hatten. Durch Ausstreichen auf Mineralmedium ohne Antibiotika bzw. mit dem Ω-Element entsprechenden Antibiotikum konnten die Mutanten erkannt werden, bei denen das durch Ω-Element inaktivierte Gen gegen das durch Deletion inaktivierte Gen ausgetauscht worden war (keine Antibiotika-Resistenz).
Die Mutante Pseudomonas sp. HR199^c.sA wurde nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 csΩKm mit E. coli S17-1 (pHEfcsA) erhalten. Der Austausch des durch ΩKm inaktivierten Gens (fcsΩK ) gegen das durch Deletion inaktivierte Gen (fcsA) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Mutanten Pseudomonas sp. HR199 echA wurde nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 ecbΩKm mit E. coli S17-1 (pHEecbΔ) erhalten. Der Austausch des durch ΩKm inaktivierten Gens (ecbΩKm) gegen das durch Deletion inaktivierte Gen (echA) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert. Die Mutanten Pseudomonas sp. HR199 vdhA wurde nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 vdhΩKm. mit E. coli S17-1 (pHEvJbΔ) erhalten. Der Austausch des durch ΩKm inaktivierten Gens (vdhΩKm) gegen das durch Deletion inaktivierte Gen (vdhA) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Mutanten Pseudomonas sp. HR199 aatA wurde nach Konjugation von Pseudomonas sp. HR199 αtΩKm mit E. coli S17-1 (pHEαα/Δ) erhalten. Der Austausch des durch ΩKm inaktivierten Gens (ααtΩKm) gegen das durch Deletion inaktivierte Gen (aatA) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 8
Biotransformation von Eugenol zu Vanillin mit der Mutante Pseudomonas sp. HR199 vdhΩKm. Der Stamm Pseudomonas sp. HR199 bΩKm wurde in 50 ml HR-MM mit 6 mM
Eugenol bis zu einer optischen Dichte von ca. ODόOOnm = 0.6 angezogen. Nach 17 h waren 2.9 mM Vanillin, 1.4 mM Ferulasäure und 0.4 mM Vanillinsäure im Kulturüberstand nachweisbar.
Beispiel 9
Biotransformation von Eugenol zu Ferulasäure mit der Mutante Pseudomonas sp. HR199 vrf/iΩGmöαtΩKm.
Der Stamm Pseudomonas sp. HR199 vtibΩGmααtΩKm wurde in 50 ml HR-MM mit 6 mM Eugenol bis zu einer optischen Dichte von ca. ODόOOnm = 0.6 angezogen.
Nach 18 h waren 1.9 mM Vanillin, 2.4 mM Ferulasäure und 0.6 mM Vanillinsäure im Kulturüberstand nachweisbar. Beispiel 10
Biotransformation von Eugenol zu Coniferylalkohol mit der Mutante Pseudomonas sp. HR199 vd/iΩGmaatΩKm. Der Stamm Pseudomonas sp. HR199 vöbΩGmααtΩKm wurde in 50 ml HR-MM mit
6 mM Eugenol bis zu einer optischen Dichte von ca. ODόOOnm = 0.4 angezogen. Nach 15 h waren 1.7 mM Coniferylalkohol, 1.4 mM Vanillin, 1.4 mM Ferulasäure und 0.2 mM Vanillinsäure im Kulturüberstand nachweisbar.
Beispiel 11
Fermentative Produktion von natürlichem Vanillin aus Eugenol im 10 1 Fermenter mit der Mutante Pseudomonas sp. HR 199 vdhΩKm.
Mit 100 ml einer 24 Stunden alten Vorkultur, die auf einer Schüttelmaschine (120 Upm) bei 32°C in einem auf pH 7,0 eingestellten Medium aus 12,5 g/1 Glyzerin,
10 g/1 Hefeextrakt und 0,37 g/1 Essigsäure angezogen wurde, wurde der Produktions- fermenter beimpft. Der Fermenter enthielt 9,9 1 Medium mit folgender Zusammensetzung: 1,5 g/1 Hefeextrakt, 1,6 g/1 KH2PO4, 0,2 g/1 NaCl, 0,2 g/1 MgSO4. Der pH- Wert wurde mit Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt. Nach der Sterilisation wurde dem Medium 4 g Eugenol zugefügt. Die Temperatur betrug 32°C, die Belüftung 3
Nl/min und die Rührerdrehzahl 600 Upm. Der pH- Wert wurde mit Natronlauge bei pH 6,5 gehalten.
Vier Stunden nach dem Animpfen wurde mit der kontinuierlichen Zugabe von Eugenol begonnen, so daß am Ende der Fermentation nach 65 Stunden 255 g Eugenol zur Kultur gegeben worden waren. Außerdem wurden während der Fermentation 40 g Hefeextrakt zugefüttert. Die Konzentration an Eugenol lag am Ende der Fermentation bei 0,2 g/1. Der Gehalt an Vanillin betrug 2,6 g/1. Zusätzlich lagen noch 3,4 g/1 Ferulasäure vor. Das so erhaltene Vanillin kann durch bekannte physikalische Verfahren wie Chromatographie, Destillation und/oder Extraktion isoliert und zur Herstellung natürlicher Aromen verwendet werden.
Erläuterungen zu den Figuren:
FIG. la bis lr:
Gen- Strukturen zur Gewinnung von Organismen und Mutanten
calA *: Teil des inaktivierten Gens der Coniferylalkohol-Dehydrogenase calB*: Teil des inaktivierten Gens der Coniferylaldehyd-Dehydrogenase fcs*: Teil des inaktivierten Gens der Ferulasäure-CoA Synthetase ech*: Teil des inaktivierten Gens der Enoyl-CoA Hydratase-Aldolase vdh* : Teil des inaktivierten Gens der Vanillin-Dehydrogenase aat*: Teil des inaktivierten Gens der beta-Ketothiolase
Die mit "*" versehenen Restriktionsenzym-Schnittstellen kamen für die Konstruktion zum Einsatz, sind jedoch in dem resultierenden Konstrukt nicht mehr funktionsfähig.
FIG. 2a: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur calAΩKm FIG. 2b: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur calAΩGm: FIG. 2c: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur calAA FIG. 2d: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur calBΩKm FIG. 2e: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur calBΩGm
FIG. 2f: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur calBA FIG. 2g: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur fcsΩKm FIG. 2h: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur fcsΩGm FIG. 2i: Nukleotidsequenz der Gen- Struktur fcsA FIG. 2j: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur ecbΩKm
FIG. 2k: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur ecbΩGm FIG. 21: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur echA FIG. 2m: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur vtibΩKm FIG. 2n: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur vJbΩGm FIG. 2o: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur vdhA
FIG. 2p: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur aatΩKm FIG. 2q: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur aatΩGm FIG. 2r: Nukleotidsequenz der Gen-Struktur aatA

Claims

Patentansprttche
1. Transformierter und/oder mutagenisierter ein- oder mehrzelliger Organismus, der dadurch gekennzeichnet ist, daß Enzyme des Eugenol- und/oder Ferula- säure-Katabolismus derart inaktiviert sind, daß eine Akkumulation der
Intermediate Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und oder Vanillinsäure erfolgt.
2. Organismus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus durch Ω-Elemenf-Insertion oder Einführen von Deletionen in entsprechende Gene verändert ist.
3. Organismus nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Gene, die für die Enzyme Coniferylalkohol-Dehydro- genasen, Coniferylaldehyd-Dehydrogenasen, Ferulasäure-CoA Synthetasen,
Enoyl-CoA Hydratasen-Aldolasen, beta-Ketothiolasen, Vanillin-Dehydro- genasen oder Vanillinsäure-Demethylasen Enzyme kodieren, verändert und/oder inaktiviert sind.
4. Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er einzellig, vorzugsweise ein Mikroorganismus oder eine pflanzliche oder eine tierische Zelle ist.
5. Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Bakterium, vorzugsweise eine Pseudomonas- Art ist.
6. Gen-Strukturen, bei denen die für die Enzyme Coniferylalkohol-Dehydroge- nasen, Coniferylaldehyd-Dehydrogenasen, Ferulasäure-CoA Synthetasen, Enoyl-CoA Hydratasen-Aldolasen, beta-Ketothiolasen, Vanillin-Dehydroge- nasen oderVanillinsäure-Demethylasen oder zweier oder mehrerer dieser Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen verändert und/oder inaktiviert sind.
7. Gen-Strukturen mit den in Figur la bis lr angegebenen Strukturen.
8. Gen-Strukturen mit den in Figur 2a bis 2r angegebenen Sequenzen.
9. Vektoren enthaltend wenigstens eine Gen-Struktur nach einem der Ansprüche 6 bis 8.
10. Transformierter Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens einen Vektor gemäß Anspruch 9 enthält.
1 1. Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens eine Gen-Struktur nach einem der Ansprüche 6 bis 8 an Stelle des jeweiligen intakten Gens im Genom integriert enthält.
12. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von organischen Verbindungen, insbesondere von Alkoholen, Aldehyden und organischen Säuren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 10 bis 11 eingesetzt wird.
13. Verfahren zur Herstellung der Organismen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung des Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus mittels an sich bekannter mikrobiologischer Züchtungsmethoden erzielt wird.
14. Verfahren zur Herstellung eines Organismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung des Eugenol- und/oder Ferulasäure-Katabolismus und/oder die Inaktivierung der entsprechenden Gene mittels gentechnischer Methoden erzielt wird.
15. Verwendung der Organismen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 10 bis 1 1 zur Herstellung von Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und/oder Vanillinsäure.
16. Verwendung von Gen-Strukturen nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder eines Vektors nach Anspruch 9 zur Herstellung transformierter und/oder mutagenisierter Organismen.
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