EP2115111A1 - Carboxylgruppen tragende benzophenon- oder benzoesäureanilid-derivate als enzymstabilisatoren - Google Patents

Carboxylgruppen tragende benzophenon- oder benzoesäureanilid-derivate als enzymstabilisatoren

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Publication number
EP2115111A1
EP2115111A1 EP07847764A EP07847764A EP2115111A1 EP 2115111 A1 EP2115111 A1 EP 2115111A1 EP 07847764 A EP07847764 A EP 07847764A EP 07847764 A EP07847764 A EP 07847764A EP 2115111 A1 EP2115111 A1 EP 2115111A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
washing
protease
cleaning agent
group
cooh
Prior art date
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Application number
EP07847764A
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English (en)
French (fr)
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EP2115111B1 (de
Inventor
Andreas Michels
Robin Ghosh
Cornelius Bessler
Daniela Lowis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
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Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
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Publication of EP2115111A1 publication Critical patent/EP2115111A1/de
Application granted granted Critical
Publication of EP2115111B1 publication Critical patent/EP2115111B1/de
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Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38663—Stabilised liquid enzyme compositions

Definitions

  • the present invention relates to detergents and cleaners containing carboxyl group-bearing benzophenone or benzoic acid anilide derivatives which act as protease inhibitors and are thus suitable enzyme stabilizers.
  • enzymes in detergents and cleaners serve to extend the range of services of the funds concerned according to their specific activities. These include in particular hydrolytic enzymes such as proteases, amylases, lipases and cellulases. The first three hydrolyze proteins, starches and fats and thus contribute directly to soil removal. Cellulases are used in particular because of their tissue effect.
  • Another group of washing and cleaning agent enzymes are oxidative enzymes, in particular oxidases, which, if appropriate, in combination with other components, are preferably used to bleach soiling or to produce the bleaching agents in situ.
  • enzymes which are subjected to constant optimization, further enzymes are constantly being made available for use in detergents and cleaners in order to be able to optimally address particular soiling, such as pectinases, ⁇ -glucanases, mannanases or other hemicellulases for the hydrolysis, in particular more specifically vegetable polymers.
  • proteases and in particular serine proteases, which include the subtilases. They cause the degradation of protein-containing stains on the items to be cleaned. However, they also hydrolyze themselves (auto-proteolysis) and all other proteins contained in the agents concerned, i. especially other enzymes. This happens especially during the cleaning process, i. in the aqueous wash liquor, if comparatively favorable reaction conditions are present. However, this also happens during the storage of the respective agents, which is why with increasing storage time always a certain loss of enzyme activities, such as the protease activity, accompanied.
  • the enzyme activity in the washing or cleaning agent is inversely proportional to the storage time, with increasing storage time, the enzyme activity decreases more and more. This is particularly problematic in gel or liquid and in particular in water-containing formulations, because in this with the water contained both the reaction medium and the hydrolysis reagent are available.
  • One goal in the development of detergents and cleaners is therefore to stabilize the enzymes contained, especially during storage.
  • the protection understood against various unfavorable influences such as against denaturation or decay by physical influences or oxidation.
  • One focus of these developments is the protection of the contained proteins and / or enzymes against proteolytic cleavage. This can be done by the construction of physical barriers, such as by encapsulation of the enzymes in special enzyme granules or by packaging the means in two- or multi-chamber systems.
  • Another frequently approached approach is to add chemical compounds to the agents which inhibit the proteases and thus act collectively as stabilizers for the proteases and the other proteins and enzymes contained. It must be reversible protease inhibitors, since the protease activity is only temporarily, especially during storage, but not be suppressed during the cleaning process.
  • Polyols in particular glycerol and 1,2-propylene glycol, benzamidine hydrochloride, borax, boric acids, boronic acids or their salts or esters are established as reversible protease inhibitors in the prior art.
  • These include, in particular, derivatives with aromatic groups, for example ortho, meta or para-substituted phenylboronic acids, in particular 4-formylphenylboronic acid (4-FPBA) or the salts or esters of the compounds mentioned.
  • 4-FPBA 4-formylphenylboronic acid
  • peptidal deuteres ie oligopeptides with reduced C-terminus, in particular those of 2 to 50 monomers, are described for this purpose.
  • peptidic reversible protease inhibitors include ovomucoid and leupeptin.
  • specific, reversible peptide inhibitors and fusion proteins from proteases and specific peptide inhibitors are used for this purpose.
  • polyols such as glycerol and 1, 2-propylene glycol have proved to be unfavorable due to their high levels of use necessary concentrations, because the other active ingredients of the respective agents can thus be contained only in proportionally smaller proportions.
  • Boric acid derivatives occupy an outstanding position among the serine protease inhibitors, which are effective at comparatively low concentrations.
  • international patent application WO 96/21716 A1 discloses that boric acid derivatives acting as protease inhibitors are also suitable for stabilizing enzymes in detergents and cleaners.
  • a selection of particularly powerful stabilizers are disclosed in International Patent Application WO 96/41859 A1.
  • boric acid derivatives have a decisive disadvantage.
  • a protease is to be understood as meaning all enzymes which are capable of hydrolyzing acid amide linkages of proteins.
  • the proteases are also detailed below.
  • the compound represented by the general structural formula is an aromatic compound having two benzene rings linked by a keto or an acid amide group according to the feature (a). It is thus a benzophenone or a benzoic acid anilide derivative.
  • This benzophenone derivative can according to the features (b) and (c) in both rings as radicals R1, R2, R3, R4 and R5 (in ring 1) or R6, R7, R8, R9 and R10 (in ring 2) Hydrogen (H), a carboxyl (COOH), a methyl (CH 3 ), an ethyl (C 2 H 5 ), a hydroxyl (OH), a hydroxy methyl (CH 2 OH), an amino group (NH 2 ) and / or carry a halogen.
  • the prerequisite is that in each of the two rings at least one carboxyl group (COOH) is present.
  • rings 1 and 2 can be distinguished, ring 1 being the one which can be attributed to the benzoic acid or its substitution product, and ring 2 being the one which can be attributed to the aniline or its substitution product.
  • a benzophenone or benzoic acid anilide derivative which has in one of the two rings 1 or 2 as possible substituents two of the radicals R 1 to R 10 (A) and (B) which are ortho-stable with one another ( A) a compulsory or optionally further carboxyl group (COOH) mentioned in (b) and / or (c) and (B) are a hydroxymethyl group which are present as such groups or optionally as a grouping -CH 2 -O-CO- and thus together represent a five-membered lactone with the C atoms of the ring carrying them.
  • a compulsory or optionally further carboxyl group (COOH) mentioned in (b) and / or (c) and (B) are a hydroxymethyl group which are present as such groups or optionally as a grouping -CH 2 -O-CO- and thus together represent a five-membered lactone with the C atoms of the ring carrying them.
  • two of the possible substituents (A) and (B) according to (b) and (c) are a carboxyl group (COOH) or a hydroxymethyl group, in a ring immediately adjacent to one another. beard, ie orthostatic to each other and present in the form of the hydroxyl group and the carboxymethyl group side by side.
  • these two groups together form a lactone and bind in lactone form to the protease to be inhibited. It is also possible that the binding takes place without prior formation of the lactone form.
  • the realization of the present invention to predetermine the lactone form during the synthesis and to add the already formed lactone as stabilizer to the agent in question.
  • the most suitable form is to be determined experimentally on the basis of the protease to be inhibited and of the envisaged stabilizer, which does not pose any fundamental difficulties for the person skilled in the art.
  • this lactone carboxyl group is counted as a carboxyl group according to feature (b) and (c), respectively but may also be present in addition to another, carboxyl group.
  • a thiophene ring may be present instead of one of the two Bonzolringe.
  • This embodiment allows via the aromatic thiophene ring a similar, in some cases even better non-covalent interaction with the protease to be inhibited.
  • the contained sulfur atom in particular via the lone pairs of electrons further interactions, which may be advantageous in individual cases.
  • the compounds which are particularly suitable for this purpose are to be examined for their kinetic parameters on the basis of the protease to be inhibited concretely and to be optimized by means of a suitable selection and arrangement of the substituents. For this purpose, it is possible to fall back on the experiences made on the basis of the compounds with benzene rings.
  • the present invention encompasses the compounds mentioned in all protonated and / or deprotonated forms.
  • the carboxyl group (s) (COOH) and optionally the amino group (s) (NH 2 ) are present depending on the pH of the surrounding medium as carboxylate (COO " ) or as ammonium groups (NH 3 + ) oppositely charged cations (H + , Na + , K + or the like) or anions (Cl " , Br " , formate, acetate, etc.) present in all these forms, the interaction between the invention-relevant compound and the invention to be inhibited / - stabilizing protease.
  • the compounds relevant to the invention form a complex with the protease to be inhibited / stabilized according to the invention.
  • the active site of the protease is blocked by a compound which is not hydrolyzable by this enzyme and is not available for hydrolysis of other proteins present.
  • the equilibrium coefficient of this reaction is called the inhibition constant or K 1 .
  • the first advantage of the compounds relevant to the invention over the prior art, in addition to their lower volume requirement compared with the polyols, is that they have favorable inhibition constants with respect to the proteases which can be used in detergents and cleaners. This applies, for example, to serine proteases, but also to metalloproteases.
  • the inhibitors thus bind reversibly, i. they do not interfere with solid and not too loose transient interactions with the enzyme.
  • the majority of the protease relevant to the invention is thus present during storage in the form of a protease-inhibitor complex.
  • the protease and possibly other proteins contained, in particular other enzymes are protected in this way against proteolysis by this enzyme (stabilized against proteolysis).
  • the binding equilibrium is shifted towards dissociation, so that the complex dissolves and most of the protease relevant protease is proteolytically active.
  • the compounds relevant to the invention are functioning protease inhibitors and thus enzyme stabilizers for detergents and cleaners in accordance with the task formulated.
  • the second advantage of the invention relevant compounds over the prior art is that they have as elements only C, H, N and O and optionally halides and / or sulfur and in particular are free of boron. Thus, they do not form the undesirable boron-derived by-products with other detergent or cleaning ingredients.
  • the compounds mentioned are presumed to act as reversible inhibitors because they bind the substrate of the proteases, in particular with regard to the acid to be hydrolyzed. amide bond, structurally the same.
  • basically all proteases can be inhibited by the compounds relevant to the invention, so that they are suitable as protease inhibitors according to the invention.
  • a washing or cleaning process in which a protease is inhibited which is inhibited and / or stabilized with a compound described above;
  • washing or cleaning agent for washing and / or cleaning textiles and / or hard surfaces; such as
  • the stabilizing compound is selected from one of the following stabilizers:
  • those detergents or cleaners are preferred in which the stabilizing compound has an inhibition constant (Ki) of 0.01 to 10 mM, preferably 0.1 to 5, particularly preferably 0.5 to 2, with respect to the protease contained.
  • Ki inhibition constant
  • the inhibition constant K can be determined in the following way:
  • K describes the equilibrium between enzyme, inhibitor and enzyme-inhibitor complex for reversible binding.
  • the enzyme-inhibitor complex is catalytically inactive and inhibits the reaction by reducing the concentration of free enzyme that is still available for binding of substrate.
  • the ki is accordingly defined as:
  • [E], [I] and [El] denote the respective molar equilibrium concentrations of enzyme (E), inhibitor (I) and the enzyme-inhibitor complex (El). According to this definition, a substance with a small Ki is a good inhibitor under the respective test conditions.
  • the determination of K is made on the basis of the activity test of the protease in the presence of the corresponding inhibitor.
  • Michaelis-Menten kinetics (Leonor Michaelis, Maud Menten (1913), The Inverting Effect Kinetics, Biochem., Z. 49: 333-369) established in the prior art describe the enzymatic parameters K m , and k cat in the presence of various concentrations of the inhibitor. The following applies for a Michaelis-Menten kinetics:
  • K m k.- ⁇ / ki (Michaelis-Menten case, given if k 2 ki) or more generally
  • K m k_i + k 2 / ki (Briggs-Haldane situation, given in the case that k 2 can not be neglected over ki).
  • vmax maximum velocity [mol 1-1 s-1]
  • Km Michaelis-Menten constant [mol 1-1]
  • S substrate concentration [mol 1-1]
  • K using the Cheng-Prusoff equation (Equation 2, Cheng Y., Prusoff WH (1973) Biochem. Pharmacol., 22, 3099-3108) can be determined via the IC 50 value.
  • the determination of the IC 50 via the determination of the catalytic activity to a substrate in the presence of various concentrations of the inhibitor and the fitting of the experimental data to a sigmoidal dose-response with variable slope equation (pseudo-Hill slopes). It is the inhibitor concentration needed to achieve 50% inhibition.
  • [S] is the substrate concentration in the assay and K d is the dissociation constant for the substrate, which at the IC 50 concentration of the inhibitor can be considered to be identical to K m for the substrate.
  • a protease namely the Bacillus lentus alkaline protease F49 (according to WO 95/23221 A1) was determined in the presence of an inhibitor. Since this is a typical subtilisin protease, the values obtained with this enzyme are also typical of other serine proteases, in particular other subtilisin proteases. The exact value for a protease of interest must be determined in doubt on the basis of each specific protease.
  • the protease is especially in a content of 2 .mu.g to 20 mg per g of the composition, preferably from 5 ⁇ g to 17.5 mg per g of the agent, more preferably from 20 ⁇ g to 15 mg per g of the agent, most preferably from 50 ⁇ g to 10 ⁇ g of the agent.
  • the stabilizer is contained in agents according to the invention in particular in a content of up to 50 mg per g of the agent, preferably up to 10 mg, more preferably up to 7 mg, most preferably up to 5 mg per g of the agent.
  • the stabilizer in a content of 0.01 to 100 x K, (based on the protease contained), preferably 0.1 to 10 x K, more preferably 1 to 5 x K, is included.
  • the molar ratio of stabilizer to protease is preferably in the range from 1: 1 to 1000: 1, in particular from 1: 1 to 500: 1, particularly preferably from 1: 1 to 100: 1, very particularly preferably from 1: 1 to 20 :1.
  • an agent according to the invention may contain at least one further stabilizer.
  • the washing or cleaning agent is thus characterized in that it contains at least one further stabilizer.
  • these compounds act synergistically, i. the stabilization effect achieved by both compounds exceeds the sum of the two individual stabilization effects.
  • the stabilizer (s) are one or more polyols, in particular glycerol or 1,2-ethylene glycol, an antioxidant, lactate or one or more lactate derivatives or combinations thereof.
  • those enzyme-stabilizing or inhibiting compounds disclosed in international patent applications WO 07/113241 A1 or WO 02/008398.
  • the protease stabilized or reversibly inhibited according to the invention is preferably a serine protease, in particular a subtilase, more preferably a subtilisin.
  • subtilisins BPN 'and Carlsberg examples of such proteases are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K which can no longer be assigned to the subtilisins in the narrower sense and the proteases TW3 and TW7.
  • Subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from Novozymes A / S, Bagsvaerd, Denmark.
  • the subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase®, and Savinase® by the company Novozymes.
  • Other proteases are, for example, under the trade names Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ®, Kannase® ® and Ovozymes ® from Novozymes, under the trade names Purafect ®, Purafect ® OxP and Properase.RTM ® from Genencor , under the trade name Protosol® ® from Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi ® from Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, under the trade names Proleather® ® and protease P ® from Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and the enzyme available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
  • proteases are particularly well stabilized or reversibly inhibited by the compounds described.
  • certain variants of proteases i. also variants of said proteases, stabilized by these compounds particularly advantageous.
  • Such protease variants are part of the invention described below.
  • a protease stabilized or reversibly inhibited according to the invention can be a wild-type enzyme or a protease variant.
  • wild-type enzyme is to be understood that the enzyme is present in a naturally occurring organism or in a natural habitat can be isolated from this.
  • enzymes are modifiable and sometimes selectively modified, in particular in order to adapt their properties to the intended uses or to influence their catalytic activity. These changes often occur by altering the amino acid sequence of the enzyme. Such changes can be targeted and thus local or random, for example, by random mutagenesis done.
  • An enzyme variant is understood as meaning enzymes which have been generated from an initial enzyme, for example a wild-type enzyme, by altering the amino acid sequence.
  • the alteration of the amino acid sequence is preferably carried out by mutations, wherein amino acid substitutions, deletions, insertions or combinations thereof may be made.
  • the incorporation of such mutations into proteins is well known in the art and to those skilled in the art of enzyme technology. In principle, all enzymes can be changed in this way.
  • Protease variants are preferred according to the invention. These were generated from an initial protease, for example a wild-type protease, by altering the amino acid sequence, preferably amino acid substitutions, deletions, insertions or combinations thereof.
  • proteases or variants described further preferred is the wild-type enzyme or the starting enzyme of the variant:
  • Subtilisin 147 and / or subtilisin 309 (Savinase)
  • the alkaline protease from Bacillus lentus preferably from Bacillus lentus DSM 5483,
  • the alkaline protease from Bacillus alcalophilus (DSM 11233),
  • alkaline protease from Bacillus sp. (DSM 14390) or at least 98.5% identical alkaline protease
  • alkaline protease from Bacillus sp. (DSM 14392) or an at least 98.1% identical alkaline protease
  • the alkaline protease from Bacillus gibsonii (DSM 14393) or an at least 70% identical alkaline protease.
  • sequence comparisons are known to the person skilled in the art of enzyme technology.
  • sequence comparisons for example, the identity or homology values are determined for sequences to be compared.
  • Such a comparison is accomplished by associating similar sequences in the nucleotide or amino acid sequences of the proteins of interest. This is called homologization.
  • a tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment.
  • alignments are created using computer programs, such as the algorithms FASTA or BLAST; This procedure is described, for example, by DJ Lipman and WR Pearson (1985) in Science, Vol. 227, pp. 1435-1441.
  • a summary of all matching positions in the compared sequences is called a consensus sequence.
  • Such a comparison also allows a statement about the similarity or homology of the compared sequences to each other. This is represented in percent identity, that is the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions. A broader concept of homology includes the conserved amino acid substitutions in this value. It then speaks of percent similarity. Such statements can be made about whole proteins or genes or only over individual areas.
  • homologous regions of different proteins are defined by matches in amino acid sequence. These can also be identified by identical function. It goes as far as complete identities in the smallest areas, so-called boxes, which contain only a few amino acids and usually perform essential functions for the overall activity.
  • the functions of the homologous regions are to be understood as the smallest partial functions of the function carried out by the entire protein, such as, for example, the formation of individual hydrogen bonds for the complexation of a substrate or transition complex.
  • sequence comparisons or alignments also serve to determine mutually corresponding positions in different molecules.
  • positions in the respective amino acid or nucleic acid sequence correspond to one another, even if the respective sequences have, for example, different total lengths or different domains or partial sequences or if additional amino acids or nucleotides are present within a sequence are.
  • a specific position in a first sequence can therefore be concretely assigned to a corresponding position in a second sequence, whereby it is quite possible for the positions corresponding to one another to be located at different locations in the molecule.
  • different amino acid residues may be present at the corresponding positions. Therefore, for such sequence comparisons or for determining a Specifically stated position, which position it is and which enzyme is assumed, that is, which counting method of determining position is to be based.
  • the washing or cleaning agent is characterized in that the protease was obtained from an initial protease by at least one change of an amino acid, the change being a substitution or insertion of an amino acid in that region of the amino acid sequence corresponding to the positions 95 to 103 of the alkaline protease from Bacillus lentus is assigned in an alignment.
  • Such a protease variant is particularly preferably a variant with an insertion of a single amino acid according to one or more of the positions 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 and / or 103 and very particularly preferably between positions 97 and 98 and / or positions 99 and 100.
  • the washing or cleaning agent is characterized in that the protease has been obtained from an initial protease by at least one modification of an amino acid which corresponds to the positions 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69 , 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 21 1, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 and 268 of the Bacillus lentus alkaline protease are associated in an alignment, wherein the alteration is a substitution, insertion or deletion of an amino acid.
  • an amino acid change relative to the parent molecule occurs in one or more of the following positions: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224, 250 and 253 (count according to Bacillus lentus alkaline protease), more preferably with one or more of the amino acid substitutions X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211L, X211D, X211E, X21 1G, X211N or X21 1Q, X224V, X250G and / or X253N.
  • the protease is a variant with a point mutation at position 211, preferably with a substitution of a single amino acid in this position, more preferably with the amino acid substitution X211 L
  • the above position information relates in turn to those amino acid residues which are assigned to said positions of the alkaline protease from Bacillus lentus in an alignment.
  • Agents according to the invention may contain, in addition to the protease, one or more further enzymes, in particular from the following group: one or more further proteases, amylases, hemicellulases, cellulases, lipases and oxidoreductases.
  • the amylase is preferably an ⁇ -amylase.
  • the hemicellulase is preferably a ⁇ -glucanase, a pectinase, a pullulanase and / or a mannanase.
  • the cellulase is preferably a cellulase mixture or a one-component cellulase, preferably or predominantly an endoglucanase and / or a cellobiohydrolase.
  • the oxidoreductase is preferably an oxidase, in particular a choline oxidase, or a perhydrolase.
  • Agents according to the invention preferably comprise at least one complexing agent and / or builder substances, the builder being in particular a zeolite builder, and / or a nonionic surfactant, the nonionic surfactant preferably being a hydroxy mixed ether, and / or optical Brightener, wherein the optical brightener is diphenyl compounds, in particular distyryl biphenyl derivatives, and / or stilbentriazine derivatives.
  • V1 is the strongest and thus most suitable protease inhibitor or stabilizer, followed by V2, V3, V4 (practically as good as V3) and V5.

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend Carboxylgruppen tragende Benzophenon- oder Benzoesäureanilid-Derivate, die als Proteaseinhibitoren wirken und als Enzymstabilisatoren geeignet sind. Weitere Gegenstände sind die Verwendung solcher Verbindungen als reversible Inhibitoren einer Protease und somit als Stabilisatoren im Rahmen einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur sowie weitere in einem Zusammenhang hiermit stehende Verfahren und Verwendungen.

Description

Carboxylgruppen tragende Benzophenon- oder Benzoesäureanilid-Derivate als
Enzymstabilisatoren
Die vorliegende Erfindung betrifft Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend Carboxylgruppen tragende Benzophenon- oder Benzoesäureanilid-Derivate, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit geeignete Enzymstabilisatoren sind.
Der Einsatz von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfernung bei. Cellulasen werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Eine weitere Gruppe von Wasch- und Reinigungsmittelenzymen sind oxidative Enzyme, insbesondere Oxidasen, die ggf. im Zusammenspiel mit anderen Komponenten vorzugsweise dazu dienen, Anschmutzungen zu bleichen oder die bleichenden Agentien in situ zu erzeugen. Neben diesen Enzymen, die einer fortwährenden Optimierung unterworfen werden, werden laufend weitere Enzyme für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln bereitgestellt, um insbesondere spezielle Anschmutzungen optimal angehen zu können, wie beispielsweise Pektinasen, ß-Glucanasen, Mannanasen oder weitere Hemicellulasen zur Hydrolyse insbesondere spezieller pflanzlicher Polymere.
Die am längsten etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme sind Proteasen und hierunter insbesondere Serin- Proteasen, zu denen auch die Subtilasen zählen. Sie bewirken den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Allerdings hydrolysieren sie auch sich selbst (Auto- proteolyse) und alle anderen in den betreffenden Mitteln enthaltenen Proteine, d.h. insbesondere auch weitere Enzyme. Dies geschieht besonders während des Reinigungsvorgangs, d.h. in der wässrigen Waschflotte, wenn vergleichsweise günstige Reaktionsbedingungen vorliegen. Dies geschieht aber auch während der Lagerung der betreffenden Mittel, weshalb mit zunehmender Lagerdauer immer auch ein gewisser Verlust von Enzymaktivitäten, beispielsweise der Protease- aktivität, einhergeht. In der Regel ist die Enzymaktivität in dem Wasch- oder Reinigungsmittel umgekehrt proportional zur Lagerdauer, mit fortschreitender Lagerdauer nimmt die Enzymaktivität immer weiter ab. Besonders problematisch ist dies in gelförmigen oder flüssigen und insbesondere in wasserhaltigen Rezepturen, weil in diesem mit dem enthaltenen Wasser sowohl das Reaktionsmedium als auch das Hydrolyse-Reagenz zur Verfügung stehen.
Ein Ziel bei der Entwicklung von Wasch- und Reinigungsmitteln besteht somit darin, die enthaltenen Enzyme besonders während der Lagerung zu stabilisieren. Darunter wird der Schutz gegen verschiedene ungünstige Einflüsse verstanden, wie beispielsweise gegen Denaturierung oder Zerfall durch physikalische Einflüsse oder Oxidation. Ein Schwerpunkt dieser Entwicklungen besteht im Schutz der enthaltenen Proteine und/oder Enzyme gegen proteolytische Spaltung. Diese kann durch den Aufbau physikalischer Barrieren erfolgen, etwa durch Verkapselung der Enzyme in speziellen Enzymgranulaten oder durch Konfektionierung der Mittel in Zwei- oder Mehrkammersystemen. Ein anderer vielfach beschrittener Weg besteht darin, den Mitteln chemische Verbindungen zuzusetzen, die die Proteasen inhibieren und somit insgesamt als Stabilisatoren für die Proteasen und die anderen enthaltenen Proteine und Enzyme wirken. Es muss sich dabei um reversible Proteaseinhibitoren handeln, da die Proteaseaktivität nur vorübergehend, insbesondere während der Lagerung, nicht aber mehr während des Reinigungsprozesses unterbunden werden soll.
Als reversible Proteaseinhibitoren sind im Stand der Technik Polyole, insbesondere Glycerin und 1 ,2-Propylenglycol, Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester etabliert. Darunter sind vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa Ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren zu erwähnen, insbesondere 4-Formylphenyl- Boronsäure (4-FPBA) beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Ein besonders guter Schutz ergibt sich, wenn Borsäurederivate zusammen mit Polyolen eingesetzt werden, da sie dann einen das Enzym stabilisierenden Komplex bilden können. Auch Peptidalde- hyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren, sind zu diesem Zweck beschrieben. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren werden hierfür eingesetzt.
Polyole wie Glycerin und 1 ,2-Propylenglycol haben sich jedoch aufgrund ihrer hohen notwendigen Einsatzkonzentrationen als unvorteilhaft erwiesen, weil die übrigen Wirkstoffe der betreffenden Mittel damit nur noch in entsprechend geringeren Anteilen enthalten sein können.
Unter den bereits in vergleichsweise niedriger Konzentration wirksamen Serin-Protease-Inhibitoren nehmen Borsäurederivate eine herausragende Stellung ein. Beispielsweise offenbart die internationale Patentanmeldung WO 96/21716 A1 dass als Proteaseinhibitoren wirkende Borsäurederivate auch geeignet sind, Enzyme in Wasch- und Reinigungsmitteln zu stabilisieren. Eine Auswahl besonders leistungsfähiger Stabilisatoren sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 96/41859 A1.
Unabhängig von ihrer stabilisierenden Wirkung weisen die Borsäurederivate jedoch einen entscheidenden Nachteil auf. Viele Borsäurederivate, wie beispielsweise Borat, bilden mit einigen anderen Wasch- bzw. Reinigungsmittelinhaltsstoffen unerwünschte Nebenprodukte, so dass diese in den betreffenden Mitteln nicht mehr für den erwünschten Reinigungsszweck zur Verfügung stehen oder sogar als Verunreinigung auf dem Waschgut zurückbleiben.
Es stellte sich somit die Aufgabe, borfreie chemische Verbindungen zu identifizieren, die als Proteaseinhibitoren wirken und somit als Enzymstabilisatoren in Wasch- und Reinigungsmitteln geeignet sind.
Hierbei war der Einsatz in insgesamt flüssigen, gelförmigen oder pastösen Wasch- und Reinigungsmitteln von besonderem Interesse, und darunter insbesondere in solchen, die Wasser enthalten.
Diese Aufgabe wird durch folgende Mittel gelöst:
Wasch- oder Reinigungsmittel, enthaltend eine Protease und eine Verbindung der allgemeinen
Strukturformel:
in der
(a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
(b) R1 , R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1 ) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
(C) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
(d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen. Unter einem Wasch- oder Reinigungsmittel sind erfindungsgemäß alle Mittel zu verstehen, die sich zum Waschen oder Reinigen von insbesondere Textilien und/oder festen Oberflächen eignen. Hierfür geeignete Inhaltsstoffe werden weiter unten detailliert ausgeführt.
Unter einer Protease sind erfindungsgemäß alle Enzyme zu verstehen, die in der Lage sind, Säureamidverknüpfungen von Proteinen zu hydrolysieren. Auch die Proteasen werden weiter unten detailliert ausgeführt.
Bei der in der allgemeinen Strukturformel dargestellten Verbindung handelt es sich um eine aromatische Verbindung mit zwei Benzolringen, die gemäß Merkmal (a) über eine Keto- oder eine Säureamidgruppe verknüpft sind. Es handelt sich somit um ein Benzophenon- oder ein Benzoe- säureanilid-Derivat.
Dieses Benzophenon-Derivat kann gemäß den Merkmalen (b) und (c) in beiden Ringen als Reste R1 , R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1 ) bzw. R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxy- methyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen tragen. Voraussetzung ist, daß in jedem der beiden Ringe mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt.
Das gleiche gilt für ein derartiges Benzoesäureanilid-Derivat. Hierbei können die Ringe 1 und 2 unterschieden werden, wobei Ring 1 derjenige ist, der sich auf die Benzoesäure bzw. deren Substitutionsprodukt zurückführen läßt, und Ring 2 derjenige, der sich auf das Anilin bzw. dessen Substitutionsprodukt zurückführen läßt. Auch dieses Benzoesäureanilid-Derivat kann als R1 , R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1) bzw. R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen tragen. Voraussetzung ist wiederum, daß in jedem der beiden Ringe mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt.
Erfindungsrelevant ist gemäß Merkmal (d) auch ein derartiges Benzophenon- oder Benzoesäureanilid-Derivat, welches in einem der beiden Ringe 1 oder 2 als mögliche Substituenten zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B) aufweist, die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O- CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen.
Es ist also möglich, dass zwei der gemäß (b) und (c) möglichen Substituenten (A) und (B) eine Carboxylgruppe (COOH) bzw. eine Hydroxymethylgruppe sind, in einem Ring unmittelbar benach- bart, d.h. zueinander orthoständig sind und in Form der Hydroxylgruppe und der Carboxymethyl- gruppe nebeneinander vorliegen. In diesem Fall kann es dazu kommen, dass diese beiden Gruppen miteinander ein Lacton ausbilden und In Lactonform an die zu inhibierende Protease binden. Es ist auch möglich, dass die Bindung ohne vorherige Ausbildung der Lactonform stattfindet. Es ist zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung auch möglich, bereits bei der Synthese die Lactonform vorzugeben und das bereits gebildete Lacton als Stabilisator dem betreffenden Mittel zuzugeben. Die am besten geeignete Form ist anhand der zu inhibierenden Protease und des ins Auge gefassten Stabilisators experimentell zu ermitteln, was dem Fachmann keine grundlegenden Schwierigkeiten bereitet.
Bei der Zählung der Carboxylgruppen gemäß den Merkmalen (b) und (c) und den bevorzugten Ausführungsformen, die auf die Anzahl der pro Molekül enthaltenen Carboxylgruppen bezug nehmen, wird diese Lacton-Carboxylgruppe als Carboxylgruppe gemäß Merkmal (b) bzw. (c) mitgezählt, kann aber auch zusätzlich neben einer weiteren, Carboxylgruppe vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann anstelle eines der beiden Bonzolringe auch ein Thiophenring vorliegen. Die Belegung der darin möglichen Substituenten 1 ', 2', 3' ist analog den oben gemachten Ausführungen zu den Merkmalen (b), (c) und (d) möglich.
Diese Ausführungsform ermöglicht über den aromatischen Thiophenring eine ähnliche, in Einzelfällen sogar bessere nicht-kovalente Wechselwirkung mit der zu inhibierenden Protease. Zudem ermöglicht das enthaltene Schwefel-Atom, insbesondere über die freien Elektronenpaare weitere Wechselwirkungen, die im Einzelfall vorteilhaft sein können. Die hierunter besonders geeigneten Verbindungen sind anhand der konkret zu inhibierenden Protease auf ihre kinetischen Parameter zu untersuchen und über eine geeignete Auswahl und Anordnung der Substituenten zu optimieren. Hierfür kann auf die anhand der Verbindungen mit Benzolringen gemachten Erfahrungen zurückgegriffen werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die genannten Verbindungen in allen protonierten und/oder deprotonierten Formen. Insbesondere die Carboxylgruppe(n) (COOH) und ggf. die Aminogruppe(n) (NH2) liegen je nach pH-Wert des umgebenden Mediums als Carboxylat- (COO") bzw. als Ammoniumgruppen (NH3 +) vor. Gegebenenfalls sind entgegengesetzt geladene Kationen (H+, Na+, K+ oder ähnliche) bzw. Anionen (Cl", Br", Formiat, Acetat etc.) anwesend. In all diesen Formen kann die vorliegende Erfindung verwirklicht werden. Entscheidend ist jeweils die Wechselwirkung zwischen der erfindungsrelevanten Verbindung und der erfindungsgemäß zu inhibierenden/- stabilisierenden Protease. Ohne an diese Theorie gebunden sein wollen, wird erfindungsgemäß davon ausgegangen, daß die erfindungsrelevanten Verbindungen mit der erfindungsgemäß zu inhibierenden/stabilisierenden Protease einen Komplex ausbilden. Dieser sieht wahrscheinlich so aus, daß sich die erfindungsrelevante Verbindung in die Substratbindungstasche der Protease einlagert und dort nicht-kovalent gebunden wird. Auf diese Weise wird das aktive Zentrum der Protease durch eine nicht durch dieses Enzym hydrolysierbare Verbindung blockiert und steht nicht für eine Hydrolyse anderer zugegener Proteine zur Verfügung. Hierbei handelt es sich um eine reversible Bindung, d.h. um ein Gleichgewicht zwischen Assoziation und Dissoziation. Der Gleichgewichtskoeffizient dieser Reaktion wird als Inhibitionskonstante oder K1 bezeichnet.
Der erste Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik besteht neben ihrem gegenüber den Polyolen geringeren Volumenbedarf darin, daß sie günstige Inhibitionskonstanten bezüglich der in Wasch- und Reinigungsmitteln einsetzbaren Proteasen aufweisen. Dies gilt beispielsweise für Serin-Proteasen, aber auch für Metalloproteasen. Die Inhibitoren binden somit reversibel, d.h. sie gehen nicht zu feste und nicht zu lose vorübergehende Wechselwirkungen mit dem Enzym ein. Vorteilhafterweise liegt damit während der Lagerung der Großteil der erfindungsrelevanten Protease in Form eines Protease-Inhibitor-Komplexes vor. Die Protease und ggf. weitere enthaltene Proteine, insbesondere weitere Enzyme werden auf diese Weise gegenüber einer Proteolyse durch dieses Enzym geschützt (gegen Proteolyse stabilisiert). Andererseits wird im Augenblick der Verdünnung des erfindungsgemäßen Mittels mit Wasser zur Herstellung einer wäßrigen Wasch- bzw. Reinigungsflotte während des Reinigungsvorgangs das Bindungsgleichgewicht in Richtung Dissoziation verschoben, so daß sich der Komplex auflöst und der Großteil der erfindungsrelevanten Protease proteolytisch aktiv wird. Es handelt sich bei den erfindungsrelevanten Verbindungen also gemäß der formulierten Aufgabe um funktionierende Protease-Inhibitoren und somit Enzym-Stabilisatoren für Wasch- und Reinigungsmittel.
Der zweite Vorteil der erfindungsrelevanten Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, daß sie als Elemente lediglich C, H, N und O und gegebenenfalls Halogenide und/oder Schwefel aufweisen und insbesondere frei von Bor sind. Sie bilden somit nicht die unerwünschten, auf Bor zurückzuführenden Nebenprodukte mit anderen Wasch- oder Reinigungsmittelinhaltsstoffen.
Ferner verfügen sie insbesondere aufgrund der in jedem aromatischen Ring enthaltenen Carboxyl- gruppen über eine gute Wasserlöslichkeit, so daß sie in entsprechende Mittel einfach eingearbeitet werden können und ein Ausfällen während der Lagerung vermieden wird.
Grundsätzlich wirken die genannten Verbindungen vermutlich deshalb als reversible Inhibitoren, weil sie dem Substrat der Proteasen, insbesondere hinsichtlich der zu hydrolysierenden Säure- amidbindung, strukturell gleichen. Umgekehrt lassen sich also grundsätzlich alle Proteasen durch die erfindungsrelevanten Verbindungen inhibieren, so diese erfindungsgemäß als Protease- Inhibitoren geeignet sind. Dies gilt insbesondere für Serin-Proteasen, wie anhand der Beispiele zur vorliegenden Anmeldung mit der positiven Wirkung der dort experimentell beschriebenen Verbindungen anhand von Serin-Proteasen, konkret Subtilasen, noch spezieller Subtilisinen gezeigt worden ist, und zwar anhand einer Variante des Subtilisins aus Bacillus lentus DSM 5483.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen:
- die Verwendung einer oben beschriebenen Verbindung als reversibler Inhibitor und/oder Stabilisator einer Protease, im Rahmen einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur;
- Wasch- oder Reinigungsverfahren, in dem eine Protease zur Wirkung kommt, die mit einer oben beschriebenen Verbindung inhibiert und/oder stabilisiert ist;
- die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien und/oder harten Oberflächen; sowie
- die Verwendung einer Protease und einer oben beschriebenen Verbindung zur Herstellung eines Wasch- oder Reinigungsmittels.
Besonders bevorzugt wird in allen erfindungsgemäßen Aspekten die stabilisierende Verbindung aus einem der folgenden Stabilisatoren ausgewählt:
Strukturformel Name
a) H02 2-(4-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
H O 2 C - - C O 2 H b) 3,3'-Carbonylbis-Benzoesäure
c) 2-(3-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
Erfindungsgemäß sind solche Wasch- oder Reinigungsmittel bevorzugt, in denen die stabilisierende Verbindung bezüglich der enthaltenen Protease eine Inhibitionskonstante (Ki) von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise 0,1 bis 5, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 aufweist.
Die Inhibitionskonstante K, kann auf folgende Weise ermittelt werden:
Für die Charakterisierung eines reversiblen Inhibitors der enzymatischen Aktivität, ist die Inhibitionskonstante K, eine charakteristische und entscheidende Größe. K, beschreibt das Gleichgewicht zwischen Enzym, Inhibitor und Enzym-Inhibitor Komplex für eine reversible Bindung. Der Enzym-Inhibitor Komplex ist dabei katalytisch nicht aktiv und inhibiert die Reaktion durch Herabsetzung der Konzentration von freiem Enzym, das noch zur Bindung von Substrat zur Verfügung steht. Der Ki ist dementsprechend definiert als:
K, = [I] x [E]/[EI]
Darin bedeuten [E], [I] und [El] die jeweiligen molaren Gleichgewichtskonzentrationen von Enzym (E), Inhibitor (I) und dem Enzym-Inhibitor-Komplex (El). Dieser Definition entsprechend ist eine Substanz mit einem kleinen Ki unter den jeweiligen Testbedingungen ein guter Inhibitor. Die Bestimmung des K, erfolgt auf der Grundlage des Aktivitätstests der Protease in Anwesenheit des entsprechenden Inhibitors. Über die im Stand der Technik etablierte und dem Fachmann bekannte Michaelis-Menten-Kinetik (Leonor Michaelis, Maud Menten (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung, Biochem. Z. 49:333-369) werden die enzymatischen Parameter Km, und kcat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors bestimmt. Für eine Michaelis-Menten- Kinetik gilt vereinfacht:
k,
E + S ^"^ ES > E + P k-i
Hierin bedeuten: E: Enzym
S: Substrat
ES: Enzym-Substrat-Komplex
P: Produkt k1 : ,k_i,k2: Geschwindigkeitskonstanten
Hierin ist k2 ein Maß der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung (Vmax), auch Wechselzahl, molekulare Aktivität, „turnover number" oder kcat genannt (kcat = Vmax/ [Eo], wobei [Eo] die Ausgangskonzentration des Enzyms ist). Die Michaeliskonstante (d.h. die Substratkonzentration, die bei der Halbsättigung vorliegt, bei der die Umsatzgeschwindigkeit also v = Vmax/2 beträgt), ergibt sich zu
Km = k.-ι / k-i (Michaelis-Menten-Fall, gegeben wenn k2« k-i) oder bzw. allgemeiner zu
Km = k_i + k2 / k-i (Briggs-Haldane-Situation, gegeben für den Fall, dass k2 gegenüber k-i nicht vernachlässigt werden kann).
Die Sättigungsfunktion eines "Michaelis-Menten Enzyms" ergibt sich unter Verwendung der Parameter Km und Vmax wie folgt:
.. yls]
Hierin bedeutet: v: Bildungsgeschwindigkeit von P (v = "Geschwindigkeit") [mol 1-1 s-1] vmax: maximale Geschwindigkeit [mol 1-1 s-1] Km: Michaelis-Menten-Konstante [mol 1-1] [S]: Substratkonzentration [mol 1-1] Durch die Bestimmung der Anfangskatalyse-Rate (vAnf ) - für Proteasen der Anfangshydrolyse-Rate - bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] und Einpassung der experimentellen Daten in nachstehende Gleichung 1 wird die Inhibitionskonstante K, erhalten.
Gleichung 1 : vAnf = k^ x [S] x E0 / (Km x (1+ [I]/K,)+S)
Hierin steht [I] wiederum für die Inhibitor-Konzentration.
Alternativ kann K, unter Verwendung der Cheng-Prusoff-Gleichung (Gleichung 2, Cheng Y., Prusoff W. H. (1973) Biochem.Pharmacol. 22, 3099-3108) über den IC50-Wert bestimmt werden. Die Bestimmung des IC50-Werts erfolgt über die Bestimmung der katalytischen Aktivität an einem Substrat in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen des Inhibitors und der Anpassung der experimentellen Daten an eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Gleichung mit variabler Steigung (Pseudo-Hill-Steigungen). Es handelt sich dabei um die Inhibitor-Konzentration, die nötig ist, um eine 50%ige Inhibition zu erreichen.
K, ergibt sich damit aus folgender Gleichung 2:
Gleichung 2: K, = IC50/(1+ [S]/Kd)
Darin bedeuten [S] die Substratkonzentration im Test und Kd die Dissoziationskonstante für das Substrat, die bei der IC50-Konzentration des Inhibitors als identisch mit Km für das Substrat gesetzt werden kann.
Die auf diese Weise bestimmbaren K-Werte kennzeichnen die Verbindung in Bezug auf das eingesetzte Enzym. In Beispiel 1 wurde die Restaktivität einer Protease, nämlich die Bacillus lentus- Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1) in Gegenwart eines Inhibitors bestimmt. Da es sich dabei um eine typische Subtilisin-Protease handelt, sind die mit diesem Enzym erhaltenen Werte auch für andere Serin-Proteasen, insbesondere andere Subtilisin-Proteasen typisch. Der exakte Wert für eine interessierende Protease muß im Zweifel anhand der jeweils konkreten Protease ermittelt werden.
In erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln, die in einer bevorzugten Ausführung in überwiegend fester Form vorliegen und in einer zweiten Ausführung in überwiegend flüssiger, pastöser oder Gelform vorliegen, ist die Protease insbesondere in einem Gehalt von 2 μg bis 20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 μg des Mittels enthalten. Der Stabilisator ist in erfindungsgemäßen Mitteln insbesondere in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Stabilisator in einem Gehalt von 0,01 bis 100 x K, (bezogen auf die enthaltene Protease), vorzugsweise 0,1 bis 10 x K, besonders bevorzugt 1 bis 5 x K, enthalten ist.
Vorzugsweise liegt das molare Verhältnis von Stabilisator zur Protease im Bereich von 1 :1 bis 1.000:1 , insbesondere von 1 :1 bis 500:1 , besonders bevorzugt von 1 :1 bis 100:1 , ganz besonders bevorzugt von 1 :1 bis 20:1.
Neben dem Stabilisator gemäß der oben angegebenen allgemeinen Formel kann ein erfindungsgemäßes Mittel mindestens einen weiteren Stabilisator enthalten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel somit dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen weiteren Stabilisator enthält. In einem solchen Mittel sind daher mindestens zwei Verbindungen vorhanden, die eine Stabilisierung eines enthaltenen Enzyms, vorzugsweise einer Protease, bewirken. Bevorzugt wirken diese Verbindungen synergistisch, d.h. die durch beide Verbindungen erreichte Stabilisierungswirkung übersteigt die Summe der beiden einzelnen Stabilisierungswirkungen. In einer bevozugten Ausführungsform handelt es sich bei dem/den Stabilisator(en) um ein oder mehrere Polyole, insbesondere um Glycerin oder 1 ,2-Ethylenglycol, um ein Antioxidans, um Lactat oder ein oder mehrere Lactatderivate oder Kombinationen hiervon. Ebenfalls bevorzugt handelt es sich um eine oder mehrere derjenigen enzymstabilisierenden bzw. -inhibierenden Verbindungen, die in den internationalen Patentanmeldungen WO 07/113241 A1 oder WO 02/008398 offenbart sind.
Bei der erfindungsgemäß stabilisierten beziehungsweise reversibel inhibierten Protease handelt es sich vorzugsweise um eine Serin-Protease, insbesondere um eine Subtilase, besonders bevorzugt um ein Subtilisin.
Beispiele für solche Proteasen sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Protease-Varianten ab. Weitere Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozymes® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect®OxP und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass solche Proteasen besonders gut durch die erläuterten Verbindungen stabilisiert bzw. reversibel inhibiert werden. Zudem werden auch bestimmte Varianten von Proteasen, d.h. auch Varianten der genannten Proteasen, durch diese Verbindungen besonders vorteilhaft stabilisiert. Solche Protease-Varianten sind Teil der nachfolgend beschriebenen Erfindungsgegenstände.
Eine erfindungsgemäß stabilisierte beziehungsweise reversibel inhibierte Protease kann ein Wildtypenzym oder eine Protease-Variante sein. Unter Wildtypenzym ist zu verstehen, dass das Enzym in einem natürlich vorkommenden Organismus bzw. in einem natürlichen Habitat vorhanden ist aus diesem isoliert werden kann. Enzyme sind jedoch veränderbar und werden zum Teil gezielt verändert, insbesondere um ihre Eigenschaften den vorgesehenen Einsatzzwecken anzupassen oder um ihre katalytische Aktivität zu beeinflussen. Diese Veränderungen erfolgen durch oftmals durch Änderung der Aminosäuresequenz des Enzyms. Solche Veränderungen können dabei gezielt und somit ortsgerichtet oder zufällig, beispielsweise durch Zufallsmutageneseverfahren, erfolgen. Unter einer Enzym-Variante werden Enzyme verstanden, die aus einem Ausgangsenzym, beispielsweise einem Wildtyp-Enzym, durch Veränderung der Aminosäuresequenz erzeugt wurden. Die Veränderung der Aminosäuresequenz erfolgt vorzugsweise durch Mutationen, wobei Aminosäure- Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen hiervon vorgenommen sein können. Das Einbringen solcher Mutationen in Proteine ist Stand der Technik und dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie hinlänglich bekannt. Grundsätzlich können alle Enzyme derartig verändert sein. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Protease-Varianten. Diese wurden aus einer Aus- gangsprotease, beispielsweise einer Wildtyp-Protease, durch Veränderung der Aminosäuresequenz erzeugt, wobei bevorzugt Aminosäure-Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen hiervon vorgenommen wurden. Die Ausgangsprotease muss jedoch nicht zwingend eine natürlich vorkommende Wildtyp-Protease sein, auch eine aus dem Stand der Technik bekannte Protease, an der bereits Veränderungen vorgenommen wurden, kann weiterentwickelt werden und daher erneut als Ausgangsprotease zur Erzeugung weiter Protease-Varianten dienen. Somit können beispielsweise alle der vorstehend beschriebenen Proteasen unverändert in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt sein und durch die beschriebenen Verbindungen stabilisert sein. Sie können aber auch das Ausgangsenzym für eine Variante darstellen, welche dann in einem erfindungsgemäßen Mittel enthalten und durch die beschriebenen Verbindungen stabilisiert ist.
Unter allen beschriebenen Proteasen bzw. Varianten weiter bevorzugt ist das Wildtypenzym bzw. das Ausgangsenzym der Variante:
- Die Alkalische Protease aus Bacillus amyloliquefaciens (BPN'),
- Die Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis (Subtilisin Carlsberg),
- Die Alkalische Protease PB92,
- Subtilisin 147 und/oder Subtilisin 309 (Savinase)
- Die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, vorzugsweise aus Bacillus lentus DSM 5483,
- Die Alkalische Protease aus Bacillus alcalophilus (DSM 11233),
- die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391 ) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease,
- die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14390) oder eine hierzu mindestens zu 98,5% identische Alkalische Protease,
- die Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) oder eine hierzu mindestens zu 98,1 % identische Alkalische Protease,
- die Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) oder eine hierzu mindestens zu 70% identische Alkalische Protease.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel daher dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist, und sie zu der Ausgangsprotease auf Aminosäureebene zu mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 92,5%, besonders bevorzugt mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97,5% identisch ist.
Verfahren zur Durchführung und Erstellung von Sequenzvergleichen, sogenannte Alignments, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt. Durch solche Sequenzvergleiche werden für zu vergleichende Sequenzen beispielsweise die Identitäts- oder Homologiewerte ermittelt. Solch ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der betrachteten Proteine einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriert- heit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon- Usage). Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435-1441 beschrieben.
Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen wiedergegeben. Ein weiter gefasster Homologiebegriff bezieht die konservierten Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.
Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind durch Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz definiert. Diese können auch durch identische Funktion gekennzeichnet sein. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.
Insbesondere dienen solche Sequenzvergleiche bzw. Alignments auch zur Ermittlung von einander entsprechenden Positionen in unterschiedlichen Molekülen. So kann beispielsweise in einem Alignment von unterschiedlichen Enzymen festgestellt werden, welche Positionen in der jeweiligen Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz einander entsprechen, auch wenn die jeweiligen Sequenzen beispielsweise unterschiedliche Gesamtlängen oder unterschiedliche Domänen bzw. Teilsequenzen aufweisen oder wenn innerhalb einer Sequenz zusätzliche Aminosäuren bzw. Nukleotide vorhanden sind. Einer bestimmten Position in einer ersten Sequenz kann daher eine entsprechende Position in einer zweiten Sequenz konkret zugeordnet werden, wobei es durchaus möglich ist, dass sich die einander entsprechenden Positionen an unterschiedlichen Stellen im Molekül befinden. Ferner können an den entsprechenden Positionen unterschiedliche Aminosäurereste vorhanden sein. Daher wird für solche Sequenzvergleiche bzw. zur Bestimmung einer Position konkret angegeben, um welche Position es sich handelt und von welchem Enzym ausgegangen wird, d.h. welche Zählweise der Positionsbestimmung zu Grunde zu legen ist.
Für die nachfolgenden Erfindungsgegenstände wird zur Positionsbestimmung die Aminosäuresequenz des reifen (mature) Proteins der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 verwendet, die in der internationalen Offenleg ungsschrift WO 91/02792 A1 offenbart ist und eine Länge von 269 Aminosäureresten aufweist (in der vorliegenden Anmeldung bezeichnet als Alkalischen Protease aus Bacillus lentus).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution oder Insertion einer Aminosäure in demjenigen Bereich der Aminosäuresequenz ist, der den Positionen 95 bis 103 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet ist.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei einer solchen Protease-Variante um eine Variante mit einer Insertion einer einzelnen Aminosäure nach einer oder mehrerer der Positionen 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102 und/oder 103 und ganz besonders bevorzugt zwischen den Positionen 97 und 98 und/oder den Positionen 99 und 100.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 21 1 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist.
Besonders bevorzugt erfolgt eine Aminosäureänderung gegenüber dem Ausgangsmolekül in einer oder mehreren der folgenden Positionen: 3, 4, 43, 61 , 188, 193, 199, 211 , 224, 250 und 253 (Zählung gemäß der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus), besonders bevorzugt mit einem oder mehreren der Aminosäureaustausche X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211 L, X211 D, X211 E, X21 1G, X211 N oder X21 1Q, X224V, X250G und/oder X253N. Insbesondere handelt es sich bei der Protease um eine Variante mit einer Punktmutation in Position 211 , vorzugsweise mit einer Substitution einer einzelnen Aminosäure in dieser Position, besonders bevorzugt mit der Aminosäuresubstitution X211 L Die vorstehenden Positionsangaben beziehen sich wiederum auf diejenigen Aminosäurereste, die den genannten Positionen der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind.
Erfindungsgemäße Mittel können neben der Protease ein oder mehrere weitere Enzyme enthalten, insbesondere aus folgender Gruppe: eine oder mehrere weitere Proteasen, Amylasen, Hemicellulasen, Cellulasen, Lipasen und Oxidoreduktasen. Bei der Amylase handelt es sich vorzugsweise um eine α-Amylase. Bei der Hemicellulase handelt es sich vorzugsweise um eine ß- Glucanase, eine Pektinase, eine Pullulanase und/oder eine Mannanase. Bei der Cellulase handelt es sich vorzugsweise um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponentencellulase, vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder eine Cellobiohydrolase. Bei der Oxido- reduktase handelt es sich vorzugsweise um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine Perhydrolase.
Erfindungsgemäße Mittel enthalten vorzugsweise mindestens einen Komplexbildner und/oder Buildersubstanzen, wobei es sich bei dem Builder insbesondere um einen Zeolith-Builder handelt, und/oder ein nichtionisches Tensid, wobei es sich bei dem nichtionischen Tensid vorzugsweise um einen Hydroxymischether handelt, und/oder optischen Aufheller, wobei es sich bei dem optischen Aufheller um Diphenylverbindungen, insbesondere um Distyryl-Biphenylderivate, und/oder um Stilbentriazin-Derivate handelt.
Beispiele
Beispiel 1
Untersuchung der Protease-Restaktivität in Gegenwart eines Inhibitors
Zum Nachweis, dass die unten aufgeführten Verbindungen eine die Protease-Aktivität inhibierende Wirkung ausüben, wurde die proteolytische Restaktivität der Bacillus lentus-Alkalische Protease F49 (gemäß WO 95/23221 A1) in Anwesenheit dieser Verbindungen ermittelt.
In parallelen Reaktionsansätzen wurden in 100 mM Tris-Puffer, pH 6,8, 0,1 % (w/v) BrijTM35 das Substrat Succinyl Alanin-Alanin-Prolin-Phenylalanin-para-Nitroanilid (AAPFpNA; Bachern L-1400) und 5 x 10~9 bzw. 1 x 10~8 M der Protease vorgelegt. Hinzu kamen die in Tabelle 1 aufgeführten zu testenden Verbindungen in einer Endkonzentration von 10 mM. Sie waren jeweils in wasserfreiem DMSO gelöst, wobei Effekte von DMSO auf die enzymatische Aktivität über die entsprechende Referenz mit derselben Menge DMSO, aber ohne die betreffende Verbindung korrigiert wurden. Die Inkubation erfolgte für 5 min bei pH 8,6 und 250C. Dabei entspricht 1 U 1 μmol gespaltenem Substrat pro Minute.
Auf diese Weise wurden folgende Verbindungen untersucht:
V1 : 2-[[(3-carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
V2 : 2-[(2-carboxybenzoyl )ami no]-Benzoesäu re
V3: 2-[[(4-carboxyphenyl)amino]carbonyl]-Benzoesäure
V4: 2-(4-carboxybenzoyl)-Benzoesäure
V5: 4-(2-carboxybenzoyl)-1 ,2-Benzoldicarboxylsäure
Sie führten alle zu einer Restaktivität der Protease von 50% oder weniger. Hierunter ist V1 der stärkste und damit am besten geeigente Protease-Inhibitor bzw. Stabilisator, gefolgt von V2, V3, V4 (praktisch genauso gut wie V3) und V5.
Aufgrund dieser Ergebnisse sind diese Verbindungen auch dazu geeignet, die enzymatischen
Aktivitäten in Protease enthaltenden Wasch- und Reinigungsmitteln während der Lagerung zu stabilisieren.
Beispiel 2
Untersuchung der Lagerstabilität proteasehaltiger Wasch- und Reinigungsmittel in Gegenwart von
Protease-Inhibitoren Als Basisrezeptur wurde ein Flüssigwaschmittel mit folgender Zusammensetzung angesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3-0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS, 24-28% Nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP, 0-0,4% PVP, 0- 0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest: demineralisiertes Wasser.
Diese Rezeptur wurde mit den zu testenden, inhibierenden Verbindungen und 1.275.000 HPE/I B. lentus-Alkalische Protease F 49 versetzt. Die in HPE angegebene Protease-Aktivität (Henkel- Protease-Einheiten) wurde nach van Raay, Saran und Verbeek, gemäß der Veröffenlichung „Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), Band 7, S. 125 - 132, bestimmt.
Die Lagerung erfolgte über verschieden lange Zeiträume in luftdicht verschlossenen Gefäßen bei 3O0C.
Zur Auswertung wurden die Anfangswerte für die proteolytische Aktivität des betreffenden Mittels mit den nach der Lagerung bestimmten Werten verglichen. Je höher die nach der Lagerung verbleibende Aktivität war, desto besser war die enthaltene Protease während der Lagerung inaktiviert und desto besser eignet sich die betreffende Verbindung als erfindungsgemäßer Stabilisator.
Alle untersuchten Verbindungen zeigten eine eindeutig stabilisierende Wirkung.

Claims

Patentansprüche
1. Wasch- oder Reinigungsmittel, enthaltend eine Protease und eine Verbindung der allgemeinen Strukturformel:
in der
(a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
(b) R1 , R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1 ) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
(c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
(d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen.
2. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 , wobei die stabilisierende Verbindung in jedem der beiden aromatischen Ringe 1 bis 3, vorzugsweise 1 oder 2, ganz besonders bevorzugt in beiden Ringen zusammen 2 oder 3 Carboxylgruppen trägt, wobei eine gemäß (d) in ein Lacton eingebundene Carboxylgruppe mitgerechnet wird.
3. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die stabilisierende Verbindung bezüglich der enthaltenen Protease eine Inhibitionskonstante (K1) von 0,01 bis 10 mM, vorzugsweise 0,1 bis 5, besonders bevorzugt 0,5 bis 2 aufweist.
4. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die stabilisierende Verbindung aus einem der folgenden Stabilisatoren ausgewählt ist:
Strukturformel Name
a) HO2 C- HO2 C- 2-(4-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
H02 C- - C02 H b) 3,3'-Carbonylbis-Benzoesäure
2-(3-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
d) 4,4'-Carbonylbis-Benzoesäure
2,2'-Carbonylbis-Benzoesäure
3-(4-Carboxybenzoyl)-Benzoesäure
5. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in überwiegend fester Form.
6. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in überwiegend flüssiger, pastöser oder Gelform.
7. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Protease in einem Gehalt von 2 μg bis 20 mg pro g des Mittels, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg pro g des Mittels, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg pro g des Mittels, ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 μg des Mittels enthalten ist.
8. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Stabilisator in einem Gehalt bis zu 50 mg pro g des Mittels, vorzugsweise bis zu 10 mg besonders bevorzugt bis zu 7 mg ganz besonders bevorzugt bis zu 5 mg pro g des Mittels enthalten ist.
9. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das molare Verhältnis von Stabilisator zur Protease im Bereich von 1 :1 bis 1.000:1 , insbesondere von 1 :1 bis 500:1 , besonders bevorzugt von 1 :1 bis 100:1 , ganz besonders bevorzugt von 1 :1 bis 20:1 liegt.
10. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Stabilisator in einem Gehalt von 0,01 bis 100 x K, (bezogen auf die enthaltene Protease), vorzugsweise 0,1 bis 10 x K, besonders bevorzugt 1 bis 5 x K, enthalten ist.
11. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei der Protease um eine Serin-Protease, vorzugsweise um eine Subtilase, besonders bevorzugt um ein Subtilisin handelt.
12. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist, und sie zu der Ausgangsprotease auf Aminosäureebene zu mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 92,5%, besonders bevorzugt mindestens 95% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97,5% identisch ist.
13. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, wobei die Veränderung eine Substitution oder Insertion einer Aminosäure in demjenigen Bereich der Aminosäuresequenz ist, der den Positionen 95 bis 103 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet ist.
14. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease aus einer Ausgangsprotease durch mindestens eine Veränderung einer Aminosäure erhalten wurde, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus in einem Alignment zugeordnet sind, wobei die Veränderung eine Substitution, Insertion oder Deletion einer Aminosäure ist.
15. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 14, enthaltend mindestens einen weiteren Stabilisator.
16. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem/den Stabilisator(en) um ein oder mehrere Polyole, insbesondere um Glycerin oder 1 ,2- Ethylenglycol, um ein Antioxidans, um Lactat oder ein oder mehrere Lactatderivate oder Kombinationen hiervon handelt.
17. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 16, enthaltend ein oder mehrere weitere Enzyme, insbesondere aus folgender Gruppe: eine oder mehrere weitere Proteasen, Amylasen, Hemicellulasen, Cellulasen, Lipasen und Oxidoreduktasen.
18. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 17, wobei es sich bei der Amylase um eine α- Amylase handelt.
19. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 17 oder 18, wobei es sich bei der Hemicellulase um eine ß-Glucanase, eine Pektinase, eine Pullulanase und/oder eine Mannanase handelt.
20. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei es sich bei der Cellulase um ein Cellulase-Gemisch oder eine Einkomponentencellulase, vorzugsweise bzw. überwiegend um eine Endoglucanase und/oder eine Cellobiohydrolase handelt.
21. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei es sich bei der Oxidoreduktase um eine Oxidase, insbesondere eine Cholin-Oxidase, oder um eine Perhydrolase handelt.
22. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , enthaltend mindestens einen Komplexbildner und/oder Buildersubstanzen.
23. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 22, wobei es sich bei dem Builder um einen Zeolith-Builder handelt.
24. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 23, enthaltend ein nichtionisches Tensid.
25. Mittel nach Anspruch 24, wobei es sich bei dem nichtionischen Tensid um einen Hydroxymischether handelt.
26. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 25, enthaltend optischen Aufheller.
27. Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 26, wobei es sich bei dem optischen Aufheller um Diphenylverbindungen, insbesondere um Distyryl-Biphenylderivate, und/oder um Stilbentriazin-Derivate handelt.
28. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel:
in der
(a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
(b) R1 , R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1 ) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
(c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
(d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen, als reversibler Inhibitor einer Protease im Rahmen einer Wasch- oder
Reinigungsmittelrezeptur.
29. Wasch- oder Reinigungsverfahren, in dem eine Protease zur Wirkung kommt, die mit einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel inhibiert und/oder stabilisiert ist:
in der
(a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
(b) R1 , R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1 ) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
(c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
(d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen.
30. Wasch- oder Reinigungsverfahren nach Anspruch 29, wobei ein Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zum Einsatz kommt.
31. Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zum Waschen und/oder Reinigen von Textilien und/oder harten Oberflächen.
32. Verwendung einer Protease und einer Verbindung der allgemeinen Strukturformel:
in der
(a) X für eine Carbonylgruppe (C=O) oder eine Säureamidgruppe (NHCO) steht,
(b) R1 , R2, R3, R4 und R5 (in Ring 1 ) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt,
(c) R6, R7, R8, R9 und R10 (in Ring 2) für Wasserstoff (H), eine Carboxyl- (COOH), eine Methyl- (CH3), eine Ethyl- (C2H5), eine Hydroxyl- (OH), eine Hydroxymethyl- (CH2OH), eine Aminogruppe (NH2) und/oder ein Halogen stehen, wobei in diesem Ring mindestens eine Carboxylgruppe (COOH) vorliegt, und
(d) optional zwei der Reste R1 bis R10 (A) und (B), die zueinander orthoständig sind, (A) eine in (b) und/oder (c) genannte obligatorische oder gegebenenfalls weitere Carboxylgruppe (COOH) und (B) eine Hydroxymethylgruppe sind, die als solche Gruppen oder optional als Gruppierung -CH2-O-CO- vorliegen und somit zusammen mit den sie tragenden C-Atomen des Rings ein fünfgliedriges Lacton darstellen. zur Herstellung eines Wasch- oder Reinigungsmittels.
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