ES2471447T3 - Derivados de benzofenona o anilida de ácido benzoico que llevan grupos carboxilo como estabilizantes de enzimas - Google Patents
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Abstract
Agente de lavado que contiene una proteasa y un compuesto de la fórmula estructural general:**Fórmula** en la que (a) X representa un grupo carbonilo (C>=O) o un grupo amida de ácido (NHCO), (b) R1, R2, R3, R4 y R5 (en el anillo 1) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH), (c) R6, R7, R8, R9 y R10 (en el anillo 2) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH) y (d) opcionalmente dos de los restos R1 a R10 (A) y (B), que están en posición orto entre sí, (A) es un grupo carboxilo (COOH) mencionado en (b) y/o (c) obligatorio o dado el caso adicional y (B) un grupo hidroximetilo, que están presentes como tales grupos u opcionalmente como agrupación -CH2-O-CO- y, por tanto, representan junto con los átomos de C que los llevan del anillo una lactona de cinco miembros.
Description
Derivados de benzofenona o anilida de ácido benzoico que llevan grupos carboxilo como estabilizantes de enzimas
5 La presente invención se refiere a agentes de lavado que contienen derivados de benzofenona o anilida de ácido benzoico que llevan grupos carboxilo, que actúan como inhibidores de proteasa y, por tanto, son estabilizantes de enzimas adecuados.
El empleo de enzimas en agentes de lavado est� establecido en el estado de la técnica. Sirven para ampliar el espectro de rendimiento de los respectivos agentes correspondientemente a sus actividades especiales. A esto pertenecen, en particular, enzimas hidrol�ticas tales como proteasas, amilasas, lipasas y celulasas. Las primeras tres mencionadas hidrolizan proteínas, almidón y grasas y, por tanto, contribuyen directamente a la eliminación de suciedad. Las celulasas se emplean en particular debido a su efecto en tejidos. Otro grupo de enzimas de agentes de lavado son enzimas oxidantes, en particular oxidasas que, dado el caso interaccionando con otros componentes,
15 sirven preferentemente para blanquear ensuciamientos o generar in situ los agentes blanqueadores. Además de estas enzimas, que se someten a una optimización constante, se facilitan permanentemente otras enzimas para el empleo en agentes de lavado para poder abordar de forma óptima en particular ensuciamientos especiales, tales como, por ejemplo, pectinasas, 1-glucanasas, mananasas u otras hemicelulasas para la hidrólisis, en particular, de pol�meros vegetales especiales.
Las enzimas establecidas desde hace más tiempo y contenidas prácticamente en todos los agentes de lavado modernos potentes son las proteasas y, entre las mismas, en particular las serina proteasas, a las que pertenecen también las subtilasas. Provocan la degradación de ensuciamientos que contienen proteínas sobre el producto de limpieza. No obstante, también se hidrolizan a s� mismas (autoprote�lisis) y a todas las demás proteínas contenidas
25 en los respectivos agentes, es decir, en particular también otras enzimas. Esto ocurre en particular durante el proceso de limpieza, es decir, en el baño de lavado acuoso cuando existen condiciones de reacción comparativamente adecuadas. Pero esto también ocurre durante el almacenamiento de los respectivos agentes, por lo que una duración creciente de almacenamiento conlleva siempre también una cierta pérdida de actividades enzim�ticas, por ejemplo de la actividad proteasa. Por norma general, la actividad enzim�tica en el agente de lavado es inversamente proporcional a la duración de almacenamiento, con una duración creciente de almacenamiento cada vez disminuye más la actividad enzim�tica. Esto es particularmente problem�tico en formulaciones en forma de gel o líquidas y en particular que contienen agua, debido a que en las mismas con el agua contenida est�n disponibles tanto el medio de reacción como el reactivo de hidrólisis.
35 Por tanto, un objetivo durante el desarrollo de agentes de lavado consiste en estabilizar las enzimas contenidas en particular durante el almacenamiento. Por ello se entiende la protección frente a distintas influencias desfavorables tales como, por ejemplo, frente a desnaturalización o descomposición por influencias físicas u oxidación. Un punto clave de estos desarrollos radica en la protección de las proteínas y/o enzimas contenidas frente a escisión proteol�tica. Esta se puede realizar por la generación de barreras físicas, por ejemplo, mediante encapsulaci�n de las enzimas en granulados de enzimas especiales o mediante confección de los agentes en sistemas de dos o más cámaras. Otra vía seguida muchas veces consiste en añadir compuestos químicos a los agentes, que inhiben las proteasas y, por tanto, en su totalidad actúan como estabilizantes para las proteasas y las demás proteínas y enzimas contenidas. A este respecto se tiene que tratar de inhibidores de proteasa reversibles, ya que la actividad proteasa se ha de reprimir solo temporalmente, en particular durante el almacenamiento, pero ya no durante el
45 proceso de limpieza.
Como inhibidores de proteasa reversibles en el estado de la técnica est�n establecidos los polioles, en particular glicerol y 1,2-propilenglicol, clorhidrato de benzamidina, bórax, ácidos bóricos, ácidos bor�nicos o sus sales o ésteres. Entre los mismos se han de mencionar sobre todo derivados con grupos aromáticos, por ejemplo, ácidos fenilbor�nicos sustituidos en posición orto, meta o para, en particular ácido 4-formilfenil-bor�nico (4-FPBA) o las sales o ésteres de los compuestos mencionados. Se obtiene una protección particularmente buena cuando los derivados de ácido bor�nico se emplean junto con polioles, ya que entonces pueden formar un complejo que estabiliza la enzima. Con este fin se han descrito también aldeh�dos pept�dicos, es decir, oligop�ptidos con extremo C reducido, en particular aquellos de 2 a 50 mon�meros. A los inhibidores de proteasa reversibles pept�dicos
55 pertenecen, entre otras cosas, ovomucoide y leupeptina. Para esto se emplean también inhibidores de p�ptidos reversibles específicos as� como proteínas de fusión de proteasas e inhibidores de p�ptidos específicos.
Sin embargo, los polioles tales como glicerol y 1,2-propilenglicol han resultado desventajosos a causa de sus altas concentraciones de uso necesarias, debido a que los restantes principios activos de los respectivos agentes, por tanto, pueden estar contenidos ya solo en partes correspondientemente menores.
Entre los inhibidores de serina proteasa eficaces ya en una concentración comparativamente reducida, los derivados de ácido bor�nico ocupan una posición destacada. Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 96/21716 A1 desvela que los derivados de ácido bor�nico que actúan como inhibidores de proteasa también son adecuados
65 para estabilizar enzimas en agentes de lavado. En la solicitud de patente internacional WO 96/41859 A1 se desvela una selección de estabilizantes particularmente potentes.
Independientemente de su efecto estabilizante, sin embargo, los derivados de ácido bor�nico presentan una desventaja decisiva. Muchos derivados de ácido bor�nico, tales como, por ejemplo, borato, forman con algunos otros ingredientes del agente de lavado productos secundarios indeseados, de tal manera que los mismos en los respectivos agentes ya no est�n disponibles para el fin deseado de limpieza o incluso permanecen en el artículo
5 lavado como impureza.
Por tanto, se había planteado el objetivo de identificar compuestos químicos sin boro que actuasen como inhibidores de proteasa y que fuesen, por tanto, adecuados como estabilizantes de enzimas en agentes de lavado.
10 En este caso era de particular interés el empleo en agentes de lavado en conjunto líquidos, en forma de gel o pastosos y, entre estos, en particular en aquellos que contienen agua.
Este objetivo se resuelve mediante los siguientes agentes:
15 Agentes de lavado que contienen una proteasa y un compuesto con la fórmula estructural general:
en la que
20 (a) X representa un grupo carbonilo (C=O) o un grupo amida de ácido (NHCO),
- (b)
- R1, R2, R3, R4 y R5 (en el anillo 1) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH),
- (c)
- R6, R7, R8, R9 y R10 (en el anillo 2) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo
25 (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH) y
(d) opcionalmente dos de los restos R1 a R10 (A) y (B), que est�n en posición orto entre s�, (A) es un grupo carboxilo (COOH) mencionado en (b) y/o (c) obligatorio o dado el caso adicional y (B) un grupo hidroximetilo, que est�n presentes como tales grupos u opcionalmente como agrupación -CH2-O-CO- y, por tanto, representan
30 junto con los átomos de C que los llevan del anillo una lactona de cinco miembros.
Por un agente de lavado se ha de entender, de acuerdo con la invención, todos los agentes que son adecuados para el lavado en particular de materiales textiles. Los ingredientes adecuados para esto se indican detalladamente más adelante.
35 Por una proteasa se ha de entender, de acuerdo con la invención, todas las enzimas que est�n en disposición de hidrolizar enlaces de amida de ácido de proteínas. También las proteasas se indican de forma detallada más adelante.
40 En el caso del compuesto representado en la fórmula estructural general se trata de un compuesto aromático con dos anillos de benceno que, de acuerdo con la característica (a), est�n enlazados a través de un grupo ceto o amida de ácido. Por tanto, se trata de un derivado de benzofenona o de anilida de ácido benzoico.
Este derivado de benzofenona de acuerdo con las características (b) y (c) en ambos anillos como restos R1, R2, R3,
45 R4 y R5 (en el anillo 1) o R6, R7, R8, R9 y R10 (en el anillo 2) puede llevar hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno. La condición es que en cada uno de los dos anillos est� presente al menos un grupo carboxilo (COOH).
Lo mismo se aplica para un derivado de este tipo de anilida de ácido benzoico. En este caso, los anillos 1 y 2 se
50 pueden diferenciar, siendo el anillo 1 aquel que se puede deber al ácido benzoico o su producto de sustitución y el anillo 2 aquel que se puede deber a la anilina o su producto de sustitución. También este derivado de anilida de ácido benzoico puede llevar como R1, R2, R3, R4 y R5 (en el anillo 1) o R6, R7, R8, R9 y R10 (en el anillo 2) hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno. A su vez, la condición es que en cada uno de los dos anillos est� presente al menos un grupo carboxilo (COOH).
Es relevante para la invención de acuerdo con la característica (d) también un derivado de benzofenona o de anilida 5 de ácido benzoico de este tipo que, en uno de los dos anillos 1 o 2, como posibles sustituyentes presenta dos de los restos R1 a R10 (A) y (B) que tienen posición orto entre s�, (A) es un grupo carboxilo (COOH) mencionado en (b) y/o
(c) obligatorio o dado el caso adicional y (B) un grupo hidroximetilo, que est�n presentes como tales grupos u opcionalmente como agrupación -CH2-O-CO- y, por tanto, representan junto con los átomos de C que los llevan del anillo una lactona de cinco miembros.
10 Por tanto, es posible que dos de los sustituyentes (A) y (B) posibles de acuerdo con (b) y (c) sean un grupo carboxilo (COOH) o un grupo hidroximetilo, est�n directamente adyacentes en un anillo, es decir, tengan posición orto entre s� y est�n presentes uno al lado de otro en forma del grupo hidroxilo y del grupo carboximetilo. En este caso puede ocurrir que estos dos grupos configuren una lactona entre s� y en forma de lactona se unan a la proteasa a inhibir.
15 También es posible que la unión tenga lugar sin la configuración previa de la forma de lactona. Para llevar a la práctica la presente invención también es posible predefinir ya durante la síntesis la forma de lactona y añadir la lactona ya formada como estabilizante al respectivo agente. La forma más adecuada se ha de establecer experimentalmente mediante la proteína a inhibir y el estabilizante considerado, lo que no plantea ninguna dificultad fundamental al experto.
20 Durante la enumeración de los grupos carboxilo de acuerdo con las características (b) y (c) y las formas de realización preferentes que hacen referencia a la cantidad de los grupos carboxilo contenidos por molécula, este grupo lactona-carboxilo también se cuenta como grupo carboxilo de acuerdo con la característica (b) o (c), pero también puede estar presente adicionalmente además de otro grupo carboxilo.
25 La presente invención comprende los compuestos mencionados en todas las formas protonadas y/o desprotonadas. En particular el grupo o los grupos carboxilo (COOH) y dado el caso el grupo o los grupos amino (NH2) est�n presentes, dependiendo del valor de pH del medio circundante, como grupos carboxilato (COO-) o amonio (NH3+). Dado el caso est�n presentes cationes (H+, Na+, K+ o similares) o aniones (Cl-, Br-, formiato, acetato, etc.) de carga
30 opuesta. En todas estas formas se puede llevar a la práctica la presente invención. Es determinante, respectivamente, la interacción entre el compuesto relevante para la invención y la proteasa a inhibir/estabilizar de acuerdo con la invención.
Sin quedar ligado a esta teoría, de acuerdo con la invención se parte de que los compuestos relevantes para la
35 invención configuran un complejo con la proteasa a inhibir/estabilizar de acuerdo con la invención. Este, probablemente, tiene tal aspecto que el compuesto relevante para la invención se introduce en el bolsillo de unión a sustrato de la proteasa y all� se une de forma no covalente. De este modo, el centro activo de la proteasa se bloquea por un compuesto no hidrolizable por esta enzima y no est� disponible para una hidrólisis de otras proteínas presentes. En este caso se trata de una unión reversible, es decir, de un equilibrio entre asociación y disociaci�n. El
40 coeficiente de equilibrio de esta reacción se denomina constante de inhibición o Ki.
La primera ventaja de los compuestos relevantes para la invención frente al estado de la técnica radica, además de en su menor necesidad de volumen frente a los polioles, en que presentan constantes de inhibición adecuadas en relación con las proteasas que se pueden emplear en agentes de lavado. Esto se cumple, por ejemplo, para serina
45 proteasas, pero también para metaloproteasas. De este modo, los inhibidores se unen de forma reversible, es decir, establecen interacciones temporales no demasiado fuertes y no demasiado débiles con la enzima. Por tanto, ventajosamente durante el almacenamiento la gran parte de la proteasa relevante para la invención est� presente en forma de un complejo de proteasa-inhibidor. La proteasa y dado el caso otras proteínas contenidas, en particular otras enzimas, de este modo se protegen por esta enzima frente a una prote�lisis (se estabilizan frente a prote�lisis).
50 Por otro lado, en el momento de la dilución del agente de acuerdo con la invención con agua para la preparación de un baño de lavado o limpieza acuoso durante el proceso de limpieza, el equilibrio de la unión se desplaza en dirección a disociaci�n, de tal manera que se deshace el complejo y gran parte de la proteasa relevante para la invención se hace proteol�ticamente activa. Por tanto, en el caso de los compuestos relevantes para la invención de acuerdo con el objetivo formulado se trata de inhibidores de proteasa que funcionan y, por tanto, estabilizantes de
55 enzima para agentes de lavado.
La segunda ventaja de los compuestos relevantes para la invención frente al estado de la técnica consiste en que como elementos presentan únicamente C, H, N y O y, dado el caso, halogenuros y/o azufre y en particular est�n exentos de boro. Por tanto, no forman los productos secundarios indeseados que se deben a boro con otros
60 ingredientes del agente de lavado.
Adem�s disponen, en particular a causa de los grupos carboxilo contenidos en cada anillo aromático, de una buena solubilidad en agua, de tal manera que se pueden incluir de forma sencilla en los correspondientes agentes y se evita una precipitación durante el almacenamiento.
65 Básicamente, los compuestos mencionados actúan como inhibidores reversibles probablemente debido a que son estructuralmente iguales al sustrato de las proteasas, en particular en relación con el enlace de amida de ácido a hidrolizar. A la inversa, por tanto, básicamente se pueden inhibir todas las proteasas por los compuestos relevantes para la invención, de tal manera que los mismos de acuerdo con la invención son adecuados como inhibidores de
5 proteasa. Esto se cumple en particular para serina proteasas, como se ha mostrado mediante los ejemplos de la presente solicitud con el efecto positivo de los compuestos descritos experimentalmente all� mediante serina proteasas, en concreto subtilasas, más especialmente subtilisinas y, de hecho, mediante una variante de la subtilisina de Bacillus lentus DSM 5483.
10 Otros objetos de la presente invención se refieren a:
- -
- el uso de un compuesto que se ha descrito anteriormente como inhibidor reversible y/o estabilizante de una proteasa en el marco de una formulación de agente de lavado;
- -
- procedimientos de lavado en los que actúa una proteasa que se ha inhibido y/o estabilizado con un compuesto 15 que se ha descrito anteriormente;
- -
- el uso de un agente de lavado de acuerdo con la invención para el lavado y/o la limpieza de materiales textiles as� como
- -
- el uso de una proteasa y un compuesto que se ha descrito anteriormente para la preparación de un agente de lavado.
20 De forma particularmente preferente, en todos los aspectos de acuerdo con la invención el compuesto estabilizante se selecciona de uno de los siguientes estabilizantes: De acuerdo con la invención se prefieren los agentes de lavado en los que el compuesto estabilizante presenta, en relación con la proteasa contenida, una constante de inhibición (Ki) de 0,01 a 10 mM, preferentemente de 0,1 a 5, de forma particularmente preferente de 0,5 a 2.
- F�rmula estructural
- Nombre
- a)
- ácido 2-(4-carboxibenzoil)-benzoico
- b)
- ácido 3,3'-carbonilbis-benzoico
- c)
- ácido 2-(3-carboxibenzoil)-benzoico
- d)
- ácido 4,4'-carbonilbis-benzoico
- e)
- ácido 2,2'-carbonilbis-benzoico
- f)
- ácido 3-(4-carboxibenzoil)-benzoico
- g)
- ácido 2-[[(3-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
- h)
- ácido 2-[[(4-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
- F�rmula estructural
- Nombre
- i)
- ácido 2-[(2-carboxibenzoil)amino]-benzoico
- j)
- ácido 2-amino-2',4-carbonilbis-benzoico
- k)
- ácido 3-[[(4-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
- l)
- ácido 4-[(4-carboxibenzoil)amino]-benzoico
- m)
- ácido 4-(2-carboxibenzoil)-1,2-bencenodicarbox�lico
- n)
- ácido 2-(2-carboxibenzoil)-1,4-bencenodicarbox�lico
- o)
- ácido 2-(4-carboxibenzoil)-1,4-bencenodicarbox�lico
- p)
- ácido 4-(3-carboxibenzoil)-1,2-bencenodicarbox�lico
- r)
- ácido 2-[[(1,3-dihidro-3-oxo-5- isobenzofuranil)amino]carbonil]benzoico
- s)
- ácido 2-[[(1,3-dihidro-1-oxo-5- isobenzofuranil)amino]carbonil]benzoico
5
La constante de inhibición Ki se puede establecer del siguiente modo:
Para la caracterización de un inhibidor reversible de la actividad enzim�tica, la constante de inhibición Ki es una variable característica y decisiva. Ki describe el equilibrio entre enzima, inhibidor y complejo de enzima-inhibidor
10 para un enlace reversible. A este respecto, el complejo de enzima-inhibidor catal�ticamente no es activo e inhibe la reacción mediante reducción de la concentración de enzima libre que est� todavía disponible para la unión de sustrato. La Ki por consiguiente est� definida como:
5 En la misma, [E], [I] y [EI] se refieren a las respectivas concentraciones de equilibrio molares de enzima (E), inhibidor
(I) y el complejo de enzima-inhibidor (EI). De forma correspondiente a esta definición, una sustancia con una pequeña Ki en las respectivas condiciones de ensayo es un buen inhibidor.
10 La determinación de la Ki se realiza basándose en el ensayo de actividad de la proteasa en presencia del correspondiente inhibidor. A través de la cinética, establecida en el estado de la técnica y conocida por el experto, de Michaelis-Menten (Leonor Michaelis, Maud Menten (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung, Biochem. Z. 49: 333-369) se determinan los parámetros enzim�ticos Km y kcat en presencia de distintas concentraciones del inhibidor. Para una cinética de Michaelis-Menten se aplica de forma simplificada:
En la misma significan:
E: enzima
20 S: sustrato ES: complejo de enzima-sustrato
P: producto
k1,k-1,k2: constantes de velocidad
25 Aquí, k2 es una medida de la máxima velocidad de reacción con saturación de sustrato (Vm�x), también denominada número de cambio, actividad molecular, "número de renovación" o kcat (kcat = Vm�x/[Eo], siendo [Eo] la concentración de partida de la enzima). La constante de Michaelis (es decir, la concentración de sustrato que est� presente con la semisaturaci�n a la que, por tanto, la velocidad de reacción asciende a v = Vm�x/2) se obtiene con Km = k-1 / k1 (caso de Michaelis-Menten, dado cuando k2<<k1) o respectivamente de forma más general con
30 Km = k-1 + k2 / k1 (situación de Briggs-Haldane dado para el caso en que k2 no se pueda despreciar frente a k1).
La función de saturación de una "enzima de Michaelis-Menten" se obtiene mediante el uso de los parámetros Km y Vm�x:
Aqu� significa: v: velocidad de formación de P (v = "velocidad") [mol l-1 s-1]
vm�x: máxima velocidad [mol l-1 s-1] 40 Km: constante de Michaelis-Menten [mol l-1] [S]: concentración de sustrato [mol l-1]
Mediante la determinación de la velocidad de catálisis inicial (Vini.) -para proteasas de la velocidad de hidrólisis inicial- con distintas concentraciones de sustrato [S] y ajuste de los datos experimentales en la siguiente ecuación 1 45 se obtiene la constante de inhibición Ki.
Ecuaci�n 1: vini. = kcat x [S] x E0 / (Km x (1+ [I]/Ki)+S)
Aqu� a su vez [i] se refiere a la concentración de inhibidor.
50 Como alternativa, KI se puede determinar mediante el uso de la ecuación de Cheng-Prusoff (ecuación 2, Cheng Y., Prusoff W. H. (1973) Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108) a través del valor de CI50. La determinación del valor del CI50 se realiza a través de la determinación de la actividad catalítica de un sustrato en presencia de distintas concentraciones del inhibidor y la adaptación de los datos experimentales a una ecuación de dosis-efecto sigmoidea
55 con pendiente variable (pseudo-pendientes de Hill). A este respecto se trata de la concentración de inhibidor que es necesaria para conseguir una inhibición del 50 %.
Ki, por tanto, se obtiene a partir de la siguiente ecuación 2:
Ecuaci�n 2: Ki = CI50/(1+ [S]/Kd)
5 En la misma significan [S] la concentración de sustrato en el ensayo y Kd la constante de disociaci�n para el sustrato que con la concentración de CI50 del inhibidor se puede poner como idéntica a Km para el sustrato.
Los valores de KI determinables de este modo caracterizan el compuesto en relación con la enzima empleada. En el
10 Ejemplo 1 se determin� la actividad residual de una proteasa, en concreto la proteasa alcalina de Bacillus lentus F49 (de acuerdo con el documento WO 95/23221 A1) en presencia de un inhibidor. Ya que a este respecto se trata de una proteasa subtilisina típica, los valores obtenidos con esta enzima también son t�picos para otras serina proteasas, en particular otras proteasas subtilisina. El valor exacto para una proteasa de interés en caso de duda se tiene que establecer mediante la proteasa respectivamente concreta.
15 En agentes de lavado de acuerdo con la invención que, en una realización preferente est�n presentes en forma principalmente sólida y en una segunda realización en forma sobre todo líquida, pastosa o de gel, la proteasa est� contenida en particular con un contenido de 2 !g a 20 mg por g del agente, preferentemente de 5 !g a 17,5 mg por g del agente, de forma particularmente preferente de 20 !g a 15 mg por g del agente, de forma muy particularmente
20 preferente de 50 !g a 10 !g del agente.
El estabilizante est� contenido en los agentes de acuerdo con la invención en particular con un contenido de hasta 50 mg por g del agente, preferentemente hasta 10 mg, de forma particularmente preferente hasta 7 mg, de forma muy particularmente preferente hasta 5 mg por g del agente. Además se prefiere que el estabilizante est� contenido
25 con un contenido de 0,01 a 100 x Ki (en la relación con la proteasa contenida), preferentemente de 0,1 a 10 x KI, de forma particularmente preferente de 1 a 5 x Ki.
Preferentemente, la proporción molar de estabilizante a proteasa se encuentra en el intervalo de 1:1 a 1.000:1, en particular de 1:1 a 500:1, de forma particularmente preferente de 1:1 a 100:1, de forma muy particularmente 30 preferente de 1:1 a 20:1.
Adem�s del estabilizante de acuerdo con la fórmula general que se ha indicado anteriormente, un agente de acuerdo con la invención puede contener al menos otro estabilizante. En otra forma de realización de la invención, por tanto, el agente de lavado est� caracterizado por que contiene al menos otro estabilizante. En un agente de este 35 tipo, por tanto, est�n presentes al menos dos compuestos que causan una estabilizaci�n de una enzima contenida, preferentemente de una proteasa. Preferentemente, estos compuestos actúan de forma sin�rgica, es decir, el efecto estabilizante conseguido a través de ambos compuestos supera la suma de ambos efectos estabilizantes individuales. En una forma de realización preferente, en el caso del/los estabilizantes se trata de uno o varios polioles, en particular de glicerol o 1,2-etilenglicol, de un antioxidante, de lactato o de uno o varios derivados de
40 lactato o combinaciones de los mismos. Asimismo de forma preferente se trata de uno o varios de los compuestos estabilizantes o inhibidores de enzima que est�n desvelados en las solicitudes de patente internacionales WO 07/113241 A1 o WO 02/008398.
En el caso de la proteasa estabilizada o inhibida de forma reversible de acuerdo con la invención se trata 45 preferentemente de una serina proteasa, en particular de una subtilasa, de forma particularmente preferente de una subtilisina.
Son ejemplos de tales proteasas las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB92, las subtilisinas 147 y 309, la proteasa alcalina de Bacillus lentus, la subtilisina DY y las enzimas a asignar a las subtilasas, pero ya no a las
50 subtilisinas en el sentido más riguroso termitasa, proteinasa K y las proteasas TW3 y TW7. La subtilisina Carlsberg est� disponible en forma perfeccionada con el nombre comercial Alcalase� de la empresa Novozymes A/S, Bagsv�rd, Dinamarca. Las subtilisinas 147 y 309 se comercializan con el nombre comercial Esperase� o Savinase� por la empresa Novozymes. De la proteasa de Bacillus lentus DSM 5483 se derivan las variantes de proteasa comercializadas con la denominación BLAP�.
55 Otras proteasas son, por ejemplo, las enzimas disponibles con los nombres comerciales Durazym�, Relase�, Everlase�, Nafizym, Natalase�, Kannase� y Ovozymes� de la empresa Novozymes, con el nombre comercial Purafect�, Purafect� OxP y Properase� de la empresa Genencor, con el nombre comercial Protosol� de la empresa Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, con el nombre comercial Wuxi� de la empresa Wuxi Snyder Bioproducts
60 Ltd., China, con el nombre comercial Proleather� y Protease P� de la empresa Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japón y con la denominación proteinasa K-16 de la empresa Kao Corp., Tokio, Japón.
Sorprendentemente, se comprob� que tales proteasas se estabilizan o inhiben de forma reversible de forma particularmente buena por los compuestos explicados. Además también determinadas variantes de proteasas, es decir, también variantes de las proteasas mencionadas, se estabilizan de forma particularmente ventajosa por estos compuestos. Tales variantes de proteasa son parte de los objetos de la invención descritos a continuación.
Una proteasa estabilizada o inhibida reversiblemente de acuerdo con la invención puede ser una enzima de tipo
5 natural o una variante de proteasa. Por enzima de tipo natural se ha de entender que la enzima est� presente en un organismo de origen natural o en un h�bitat natural y se puede aislar del mismo. Sin embargo, las enzimas son modificables y en parte se modifican de forma dirigida, en particular para adaptar sus propiedades a los fines previstos de uso o para influir en su actividad catalítica. Estas modificaciones se realizan frecuentemente mediante cambio de la secuencia de amino�cidos de la enzima. A este respecto, tales cambios se pueden realizar de forma
10 dirigida y, por tanto, con especificidad de lugar o aleatoriamente, por ejemplo mediante procedimientos de mutag�nesis aleatoria. Por una variante de enzima se entiende enzimas que se han creado a partir de una enzima de partida, por ejemplo, una enzima de tipo natural, mediante modificación de la secuencia de amino�cidos. La modificación de la secuencia de amino�cidos se realiza, preferentemente, mediante mutaciones, pudiéndose haber efectuado sustituciones, deleciones, inserciones de amino�cidos o combinaciones de las mismas. La introducción de
15 tales mutaciones en proteínas es estado de la técnica y es suficientemente conocida por el experto en el campo de la tecnología de enzimas. Básicamente pueden haberse modificado de este modo todas las enzimas. Se prefieren de acuerdo con la invención variantes de proteasa. Estas se han creado a partir de una proteasa de partida, por ejemplo, una proteasa de tipo natural, mediante modificación de la secuencia de amino�cidos, habiéndose efectuado preferentemente sustituciones, deleciones, inserciones de amino�cidos o combinaciones de las mismas. Sin
20 embargo, la proteasa de partida no tiene que ser obligatoriamente una proteasa de tipo natural de origen natural, también una proteasa conocida por el estado de la técnica, en la que ya se han efectuado modificaciones, se puede perfeccionar y servir, por tanto, de nuevo como proteasa de partida para la generación de otras variantes de proteasa. De este modo, por ejemplo, todas las proteasas que se han descrito anteriormente se pueden emplear sin modificaciones en agentes de acuerdo con la invención y estar estabilizadas por los compuestos descritos. Sin
25 embargo, pueden representar también la enzima de partida para una variante que, entonces, est� contenida en un agente de acuerdo con la invención y est� estabilizada mediante los compuestos descritos.
Entre todas las proteasas o variantes descritas se prefiere adicionalmente la enzima de tipo natural o la enzima de partida de la variante:
- -
- la proteasa alcalina de Bacillus amyloliquefaciens (BPN'),
- -
- la proteasa alcalina de Bacillus licheniformis (subtilisina Carlsberg),
- -
- la proteasa alcalina PB92,
- -
- subtilisina 147 y/o subtilisina 309 (Savinase) 35 -la proteasa alcalina de Bacillus lentus, preferentemente de Bacillus lentus DSM 5483,
- -
- la proteasa alcalina de Bacillus alcalophilus (DSM 11233),
- -
- la proteasa alcalina de Bacillus gibsonii (DSM 14391) o una proteasa alcalina con una identidad de al menos el 70 % con la misma,
- -
- la proteasa alcalina de Bacillus sp. (DSM 14390) o una proteasa alcalina con una identidad de al menos el 98,5 40 % con la misma,
- -
- la proteasa alcalina de Bacillus sp. (DSM 14392) o una proteasa alcalina con una identidad de al menos el 98,1 % con la misma,
- -
- la proteasa alcalina de Bacillus gibsonii (DSM 14393) o una proteasa alcalina con una identidad de al menos el 70 % con la misma.
45 En otra forma de realización de la invención, por tanto, el agente de lavado est� caracterizado por que la proteasa se ha obtenido a partir de una proteasa de partida mediante al menos una modificación de un amino�cido, siendo la modificación una sustitución, inserción o deleci�n de un amino�cido y tiene una identidad con la proteasa de partida en el plano de los amino�cidos de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 92,5 %, de forma particularmente
50 preferente al menos el 95 % y de forma muy particularmente preferente al menos el 97,5 %.
Los procedimientos para llevar a cabo y crear comparaciones de secuencias, los denominados alineamientos, son conocidos por el experto en el campo de la tecnología de enzimas. Mediante tales comparaciones de secuencias se establecen, para secuencias a comparar, por ejemplo, los valores de identidad u homología. Una comparación de 55 este tipo ocurre asignándose sucesiones similares en las secuencias de nucleótidos o amino�cidos de las proteínas consideradas unas a otras. Esto se denomina homologación. Una asignación tabulada de las respectivas posiciones se denomina alineamiento. A su vez, en el análisis de secuencias de nucleótidos se han de tener en cuenta ambas cadenas complementarias y respectivamente las tres posibles fases de lectura; asimismo la degeneración del código genético y el uso específico de organismo de los codones (uso de codones). Entretanto se crean alineamientos a
60 través de programas inform�ticos, tales como, por ejemplo, por los algoritmos FASTA o BLAST; esta forma de proceder se describe, por ejemplo, por D. J. Lipman y W. R. Pearson (1985) en Science, volumen 227, pág. 14351441.
Una compilación de todas las posiciones coincidentes en las secuencias comparadas se denomina secuencia 65 consenso.
Una comparación de este tipo permite también una afirmación acerca de la similitud u homología de las secuencias comparadas entre s�. Esta se reproduce en porcentaje de identidad, es decir, la parte de los nucleótidos o restos de amino�cidos idénticos en las mismas o en un alineamiento de posiciones correspondientes entre s�. Un término de homología más amplio incluye las sustituciones de amino�cidos conservativas en este valor. Se habla entonces de
5 porcentaje de similitud. Tales afirmaciones se pueden hacer acerca de proteínas o genes completos o solo acerca de zonas individuales.
Las zonas homólogas de distintas proteínas est�n definidas por coincidencias en la secuencia de amino�cidos. Estas pueden estar caracterizadas también por función idéntica. Van hasta identidades completas en las zonas más
10 pequeñas, las denominadas cajas, que comprenden solo pocos amino�cidos y que la mayoría de las veces ejercen funciones esenciales para la actividad global. Por las funciones de las zonas homólogas se ha de entender las subfunciones más pequeñas de la función ejercida por toda la proteína, tales como, por ejemplo, la configuración de enlaces individuales de puente de hidrógeno para el complejado con un sustrato o complejo de transición.
15 En particular, tales comparaciones de secuencias o alineamientos sirven también para el establecimiento de posiciones correspondientes entre s� en diferentes moléculas. De este modo, por ejemplo, en un alineamiento de diferentes enzimas se puede comprobar qué posiciones en la respectiva secuencia de amino�cidos o de ácido nucleico se corresponden entre s�, incluso cuando las respectivas secuencias, por ejemplo, presentan diferentes longitudes totales o diferentes dominios o subsecuencias o cuando dentro de una secuencia est�n presentes
20 amino�cidos o nucleótidos adicionales. Por tanto, a una determinada posición en una primera secuencia se puede asignar una posición correspondiente en una segunda secuencia de forma concreta, siendo desde luego posible que las posiciones correspondientes entre s� se encuentren en puntos diferentes en la molécula. Además, en las correspondientes posiciones pueden estar presentes diferentes restos de amino�cidos. Por tanto, para tales comparaciones de secuencias o para la determinación de una posición de forma concreta se indica de qué posición
25 se trata y de qué enzima se parte, es decir, en qué forma de recuento se tiene que basar la determinación de la posición.
Para los siguientes objetos de la invención, para la determinación de la posición se usa la secuencia de amino�cidos de la proteína madura (mature) de la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, que est� desvelada en la
30 solicitud publicada de patente internacional WO 91/02792 A1 y que presenta una longitud de 269 restos de amino�cidos (en la presente solicitud denominada proteasa alcalina de Bacillus lentus).
En otra forma de realización de la invención, el agente de lavado est� caracterizado por que la proteasa se ha obtenido de una proteasa de partida mediante al menos una modificación de un amino�cido, siendo la modificación
35 una sustitución o inserción de un amino�cido en la zona de la secuencia de amino�cidos que est� asignada a las posiciones 95 a 103 de la proteasa alcalina de Bacillus lentus en un alineamiento.
De forma particularmente preferente, en el caso de una variante de proteasa de este tipo se trata de una variante con una inserción de un amino�cido individual detrás de una o varias de las posiciones 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,
40 102 y/o 103 y, de forma particularmente preferente, entre las posiciones 97 y 98 y/o las posiciones 99 y 100.
En otra forma de realización de la invención, el agente de lavado est� caracterizado por que la proteasa se ha obtenido a partir de una proteasa de partida mediante al menos una modificación de un amino�cido, que est� asignado a las posiciones 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141,
De forma particularmente preferente se realiza un cambio de amino�cidos frente a la molécula de partida en una o varias de las siguientes posiciones: 3, 4, 43, 61, 188, 193, 199, 211, 224, 250 y 253 (enumeración de acuerdo con la 50 proteasa alcalina de Bacillus lentus), de forma particularmente preferente con una o varias de las sustituciones de amino�cidos X3T, X4I, X43V, X61A, X188P, X193M, X199I, X211L, X211D, X211E, X211G, X211N o X211Q, X224V, X250G y/o X253N. En particular, en el caso de la proteasa se trata de una variante con una mutación puntual en la posición 211, preferentemente con una sustitución de un único amino�cido en esta posición, de forma particularmente preferente con la sustitución de amino�cido X211 L. Las anteriores indicaciones de la posición a su
55 vez se refieren a los restos de amino�cidos que est�n asignados a las posiciones mencionadas de la proteasa alcalina de Bacillus lentus en un alineamiento.
Los agentes de acuerdo con la invención pueden contener, además de la proteasa, una o varias enzimas adicionales, en particular del siguiente grupo: una o varias de otras proteasas, amilasas, hemicelulasas, celulasas,
60 lipasas y oxidorreductasas. En el caso de la amilasa se trata, preferentemente, de una a-amilasa. En el caso de la hemicelulasa se trata, preferentemente, de una 1-glucanasa, una pectinasa, una pululanasa y/o una mananasa. En el caso de la celulasa se trata, preferentemente, de una mezcla de celulasas o de una celulasa de un componente, preferentemente o sobre todo de una endoglucanasa y/o una celobiohidrolasa. En el caso de la oxidorreductasa se trata, preferentemente, de una oxidasa, en particular de una colina oxidasa o de una perhidrolasa.
65 Los agentes de acuerdo con la invención contienen, preferentemente, al menos un complejante y/o sustancias soporte, tratándose en el caso del soporte en particular de un soporte de zeolita y/o un tensioactivo no iónico, tratándose en el caso del tensioactivo no iónico, preferentemente, de un hidroxi�ter mixto y/o agentes de aclaramiento óptico, tratándose en el caso del agente de aclaramiento óptico de compuestos de difenilo, en
5 particular de derivados de diestiril-bifenilo y/o de derivados de estilbentriazina.
Ejemplo 1
Examen de la actividad residual de proteasa en presencia de un inhibidor
Para la comprobación de que los compuestos indicados más adelante ejercen un efecto inhibidor de la actividad proteasa se estableció la actividad residual proteol�tica de la proteasa alcalina de Bacillus lentus F49 (de acuerdo
15 con el documento WO 95/23221 A1) en presencia de estos compuestos.
En preparaciones de reacción paralelas se dispusieron en tampón Tris 100 mM, pH 6,8, 0,1 % (p/v) de BrijTM35 el sustrato succinil alanina-alanina-prolina-fenilalanina-para-nitroanilida (AAPFpNA; Bachem L-1400) y 5 x 10-9 o 1 x 108 M de la proteasa. A esto se añadieron los compuestos a ensayar indicados en la Tabla 1 en una concentración final de 10 mM. Estaban disueltos, respectivamente, en DMSO sin agua, corrigiéndose los efectos de DMSO sobre la actividad enzim�tica a través de la correspondiente referencia con la misma cantidad de DMSO, pero sin el respectivo compuesto. La incubaci�n se realizó durante 5 min a pH 8,6 y 25 �C. A este respecto, 1 U se corresponde con 1 !mol de sustrato escindido por minuto.
25 De este modo se examinaron los siguientes compuestos:
V1: ácido 2-[[(3-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
V2: ácido 2-[(2-carboxibenzoil)amino]-benzoico
V3: ácido 2-[[(4-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
V4: ácido 2-(4-carboxibenzoil)-benzoico
V5: ácido 4-(2-carboxibenzoil)-1,2-bencenodicarbox�lico
Todos condujeron a una actividad residual de la proteasa del 50 % o menos. Entre los mismos, V1 es el más fuerte y, por tanto, más adecuado inhibidor de proteasa o estabilizante, seguido por V2, V3, V4 (prácticamente igual de
35 bueno que V3) y V5.
A causa de estos resultados, estos compuestos también son adecuados para estabilizar las actividades enzim�ticas en agentes de lavado y limpieza que contienen proteasa durante el almacenamiento.
Ejemplo 2
Examen de la estabilidad en almacenamiento de agentes de lavado y limpieza que contienen proteasa en presencia de inhibidores de proteasa
45 Como formulación de base se prepar� un agente de lavado líquido con la siguiente composición (todas las indicaciones en porcentaje en peso): 0,3-0,5 % de goma xantana, 0,2-0,4 % de antiespumante, 6-7 % de glicerol, 0,3-0,5 % de etanol, 4-7 % de FAEOS, 24-28 % de tensioactivos no iónicos, 1 % de ácido bórico, 1-2 % de citrato sádico (dihidrato), 2-4 % de carbonato de sodio, 14-16 % de ácidos grasos de nuez de coco, 0,5 % de HEDP, 0-0,4 % de PVP, 0-0,05 % de agente de aclaramiento óptico, 0-0,001 % de colorante, resto: agua desmineralizada.
Esta formulación se mezcl� con los compuestos inhibidores a ensayar y 1.275.000 UPH/I de proteasa alcalina de B. lentus F 49. La actividad de proteasa indicada en UPH (unidades de proteasa de Henkel) se determin� según van Raay, Saran y Verbeek de acuerdo con la publicación "Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivit�t in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Sp�l- und Reinigungsmitteln" en Tenside (1970), volumen 7, pág. 125
55 132.
El almacenamiento se realizó a lo largo de periodos de tiempo de diferente longitud en recipientes cerrados de forma hermética al aire a 30 �C.
Para la evaluación, los valores iniciales para la actividad proteol�tica del respectivo agente se compararon con los valores determinados después del almacenamiento. Cuanto mayor era la actividad remanente después del almacenamiento, mejor inactivada estaba la proteasa contenida durante el almacenamiento y más adecuado era el respectivo compuesto como estabilizante de acuerdo con la invención.
65 Todos los compuestos examinados mostraron un efecto inequívocamente estabilizante.
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Agente de lavado que contiene una proteasa y un compuesto de la fórmula estructural general:5 en la que
- (a)
- X representa un grupo carbonilo (C=O) o un grupo amida de ácido (NHCO),
- (b)
- R1, R2, R3, R4 y R5 (en el anillo 1) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3),
10 uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH),(c) R6, R7, R8, R9 y R10 (en el anillo 2) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH) y15 (d) opcionalmente dos de los restos R1 a R10 (A) y (B), que est�n en posición orto entre s�, (A) es un grupo carboxilo (COOH) mencionado en (b) y/o (c) obligatorio o dado el caso adicional y (B) un grupo hidroximetilo, que est�n presentes como tales grupos u opcionalmente como agrupación -CH2-O-CO- y, por tanto, representan junto con los átomos de C que los llevan del anillo una lactona de cinco miembros.20 2. Agente de lavado de acuerdo con la reivindicación 1, llevando el compuesto estabilizante en cada uno de los dos anillos aromáticos de 1 a 3, preferentemente 1 o 2, de forma muy particularmente preferente en ambos anillos conjuntamente 2 o 3 grupos carboxilo, contándose un grupo carboxilo incluido de acuerdo con (d) en una lactona. - 3. Agente de lavado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, presentando el compuesto estabilizante en relación con25 la proteasa contenida una constante de inhibición (Ki) de 0,01 a 10 mM, preferentemente de 0,1 a 5, de forma particularmente preferente de 0,5 a 2.
- 4. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, estando seleccionado el compuestoestabilizante de uno de los siguientes estabilizantes: 30
- F�rmula estructural
- Nombre
- a)
- ácido 2-(4-carboxibenzoil)-benzoico
- b)
- ácido 3,3'-carbonilbis-benzoico
- c)
- ácido 2-(3-carboxibenzoil)-benzoico
- d)
- ácido 4,4'-carbonilbis-benzoico
- F�rmula estructural
- Nombre
- e)
- ácido 2,2'-carbonilbis-benzoico
- f)
- ácido 3-(4-carboxibenzoil)-benzoico
- g)
- ácido 2-[[(3-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
- h)
- ácido 2-[[(4-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
- i)
- ácido 2-[(2-carboxibenzoil)amino]-benzoico
- j)
- ácido 2-amino-2',4-carbonilbis-benzoico
- k)
- ácido 3-[[(4-carboxifenil)amino]carbonil]-benzoico
- l)
- ácido 4-[(4-carboxibenzoil)amino]-benzoico
- m)
- ácido 4-(2-carboxibenzoil)-1,2-bencenodicarbox�lico
- n)
- ácido 2-(2-carboxibenzoil)-1,4-bencenodicarbox�lico
- o)
- ácido 2-(4-carboxibenzoil)-1,4-bencenodicarbox�lico
- F�rmula estructural
- Nombre
- p)
- ácido 4-(3-carboxibenzoil)-1,2-bencenodicarbox�lico
- r)
- ácido 2-[[(1,3-dihidro-3-oxo-5isobenzofuranil)amino]carbonil]-benzoico
- s)
- ácido 2-[[(1,3-dihidro-1-oxo-5isobenzofuranil)amino]carbonil]-benzoico
- 5. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 en forma sobre todo sólida.
- 6. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 en forma sobre todo líquida, pastosa o de gel. 5
- 7. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, estando contenida la proteasa con un contenido de 2 !g a 20 mg por g del agente, preferentemente de 5 !g a 17,5 mg por g del agente, de forma particularmente preferente de 20 !g a 15 mg por g del agente, de forma muy particularmente preferente de 50 !g a 10 !g del agente.
- 8. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, estando contenido el estabilizante con un contenido de hasta 50 mg por g del agente, preferentemente hasta 10 mg, de forma particularmente preferente hasta 7 mg, de forma muy particularmente preferente hasta 5 mg por g del agente.15 9. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, encontrándose la proporción molar de estabilizante a proteasa en el intervalo de 1:1 a 1.000:1, en particular de 1:1 a 500:1, de forma particularmente preferente de 1:1 a 100:1, de forma muy particularmente preferente de 1:1 a 20:1.
- 10. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, estando contenido el estabilizante con un20 contenido de 0,01 a 100 x Ki (en relación con la proteasa contenida), preferentemente de 0,1 a 10 x Ki, de forma particularmente preferente de 1 a 5 x Ki.
- 11. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, tratándose en el caso de la proteasa deuna serina proteasa, preferentemente de una subtilasa, de forma particularmente preferente de una subtilisina. 25
- 12. Agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que(a) la proteasa se ha obtenido de una proteasa de partida mediante al menos una modificación de un amino�cido, siendo la modificación una sustitución, inserción o deleci�n de un amino�cido y teniendo una30 identidad con la proteasa de partida en el plano de los amino�cidos de al menos el 90 %, preferentemente al menos el 92,5 %, de forma particularmente preferente al menos el 95 % y de forma muy particularmente preferente al menos el 97,5 % y/o(b) la proteasa se ha obtenido de una proteasa de partida mediante al menos una modificación de un amino�cido, siendo la modificación una sustitución o una inserción de un amino�cido en la zona de la secuencia35 de amino�cidos que est� asignada a las posiciones 95 a 103 de la proteasa alcalina de Bacillus lentus en un alineamiento y/o(c) la proteasa se ha obtenido de una proteasa de partida mediante al menos una modificación de un amino�cido que est� asignado a las posiciones 3, 4, 36, 42, 43, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237, 242, 243, 250, 253, 255 y 268 de la40 proteasa alcalina de Bacillus lentus en un alineamiento, siendo la modificación una sustitución, inserción o deleci�n de un amino�cido.
- 13. Uso de un compuesto con la fórmula estructural general:en la que 5
- (a)
- X representa un grupo carbonilo (C=O) o un grupo amida de ácido (NHCO),
- (b)
- R1, R2, R3, R4 y R5 (en el anillo 1) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH),
10 (c) R6, R7, R8, R9 y R10 (en el anillo 2) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH) y(d) opcionalmente dos de los restos R1 a R10 (A) y (B), que est�n en posición orto entre s�, (A) es un grupo carboxilo (COOH) mencionado en (b) y/o (c) obligatorio o dado el caso adicional y (B) un grupo hidroximetilo, que15 est�n presentes como tales grupos u opcionalmente como agrupación -CH2-O-CO- y, por tanto, representan junto con los átomos de C que los llevan del anillo una lactona de cinco miembros,como inhibidor reversible de una proteasa en el marco de una formulación de agente de lavado.20 14. Uso de un agente de lavado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12 para el lavado y/o la limpieza de materiales textiles. - 15. Uso de una proteasa y un compuesto con la fórmula estructural general:25 en la que
- (a)
- X representa un grupo carbonilo (C=O) o un grupo amida de ácido (NHCO),
- (b)
- R1, R2, R3, R4 y R5 (en el anillo 1) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3),
30 uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH),(c) R6, R7, R8, R9 y R10 (en el anillo 2) representan hidrógeno (H), un grupo carboxilo (COOH), uno metilo (CH3), uno etilo (C2H5), uno hidroxilo (OH), uno hidroximetilo (CH2OH), uno amino (NH2) y/o un halógeno, existiendo en este anillo al menos un grupo carboxilo (COOH) y35 (d) opcionalmente dos de los restos R1 a R10 (A) y (B), que est�n en posición orto entre s�, (A) es un grupo carboxilo (COOH) mencionado en (b) y/o (c) obligatorio o dado el caso adicional y (B) un grupo hidroximetilo, que est�n presentes como tales grupos u opcionalmente como agrupación -CH2-O-CO- y, por tanto, representan junto con los átomos de C que los llevan del anillo una lactona de cinco miembros,40 para la preparación de un agente de lavado.
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