ES2329874T3 - Estabilizacion de enzimas. - Google Patents
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Abstract
Un método para estabilizar una o más enzimas proteasas de especies de Bacillus en un medio líquido, que consiste en: formular en dicho medio líquido una sal de haluro de metal alcalino a un nivel de al menos 4% en peso en combinación con un disolvente de poliol a un nivel de al menos 30% en peso.
Description
Estabilización de enzimas.
La presente invención se refiere a métodos para
estabilizar una o más enzimas proteasas de especies de Bacillus en
un medio líquido, y a formulaciones enzimáticas líquidas
estabilizadas, con las enzimas proteasas estabilizadas.
La estabilización de la actividad enzimática es
un problema persistente en todas las áreas de la tecnología en las
que hay posibilidad de que se apliquen enzimas. La estabilidad, en
este sentido, incluye la resistencia a la disminución en la
actividad enzimática antes de la utilización, p.ej., bajo
condiciones de almacenamiento. La estabilización de enzimas en
formulaciones líquidas es particularmente un problema. Por ejemplo,
un concentrado líquido de enzimas preformulado puede ser almacenado
a veces durante semanas o meses antes de ser mezclado finalmente
hasta un producto final (p.ej., un producto para el cuidado
personal, tal como una crema de manos; o un producto de limpieza,
tal como un detergente líquido). De manera similar, los productos
líquidos formulados que contienen enzimas pueden reposar en
almacenamiento durante largos periodos de tiempo antes de su uso,
así mismo. Por diversas razones, la actividad de las enzimas en las
formulaciones líquidas disminuye, por regla general, a lo largo del
tiempo.
La técnica anterior ha intentado hacer frente a
este problema. Por ejemplo, a menudo se añaden compuestos orgánicos,
tales como formiato de sodio y propilenglicol o glicerol, a
formulaciones líquidas de enzimas. La patente de EE.UU. Nº
3.296.094, de Theodore Cayle, expedida el 3 de enero de 1967,
describe disoluciones acuosas de una enzima proteolítica, en
particular papaína, que son estabilizadas contra la pérdida de
actividad proteolítica en el almacenamiento incorporando una
combinación de glicerol y colágeno parcialmente hidrolizado y
solubilizado. La solicitud de patente internacional WO 00/12663 A
describe una composición líquida de enzimas estable para limpiar
lentes de contacto, que comprende una enzima, tal como subtilisina,
uno o más poliol(es), un compuesto de borato/ácido bórico,
iones de calcio y agua. La patente de EE.UU. Nº 4.318.818, de Letton
et al., expedida el 9 de marzo de 1982, describe detergentes
líquidos que contienen enzimas y un sistema estabilizador de
enzimas que comprende iones de calcio y un ácido carboxílico o sal
de bajo peso molecular, preferiblemente un formiato. La composición
contiene preferiblemente un tensioactivo aniónico y un ácido graso
saturado. La patente de EE.UU. Nº 4.404.115, de Tai, expedida el 13
de septiembre de 1983, describe composiciones de limpieza que
contienen enzimas, pentaborato de metal alcalino, sulfito de metal
alcalino y un poliol. Aunque un tanto eficaces, los aditivos tales
como el formiato y otras sales orgánicas son por desgracia costosos,
y, por tanto, aumentan significativamente el coste del concentrado
líquido de enzimas y el producto final. Además, en algunos casos se
desean formulaciones que sean aceptables para el uso alimentario,
farmacéutico o cosmético, y ciertas sales como el formiato de sodio
pueden no ser aceptables o adecuadas para este propósito.
El uso de sales inorgánicas como agentes de
estabilización para enzimas se conoce en la técnica. Por ejemplo, la
patente de EE.UU. Nº 5.460.658, de Nakagawa et al, expedida
el 24 de octubre de 1995, describe una disolución para la limpieza
de lentes de contacto basada en enzimas de la que se dice que es
estabilizada con una combinación de un alcohol polihidroxilado
(5-30%) y una sal de un metal alcalino
(1-5%). La patente de Nakagawa et al. enseña
que los niveles del alcohol polihidroxilado son menores que 30% para
mantener la actividad de las enzimas en la aplicación de la
disolución para lentes de contacto. La xilanasa fue estabilizada con
un poliol (20-40%) y formiato o cloruro de potasio
(4-8%) como se describe en un estudio titulado
"Development of A Method for the Stabilization and Formulation of
Xylanase from Trichoderma Using Experimental Design", R.
Spencer Fisk y Curran Simpson, reportado en Studies in Organic
Chemistry, vol. 47, Stability and Stabilization of Enzymes,
Elservier, editado por W. J. J. Van Den Tweel, A. Harder, R. M.
Buitellar, 1992. Este estudio describe el uso de no más que 40% de
poliol para mantener la actividad de la xilanasa.
Una formulación cosmética que tiene una enzima
estabilizada usando un poliol que se une al agua al
30-99% y que está parcial o totalmente complejado
con un polímero acrílico o metacrílico se describe en la patente de
EE.UU. Nº 5.830.449, de Afriat et al., expedida el 3 de
noviembre de 1998, y la patente de EE.UU. Nº 5.703.041, de Afriat
et al., expedida el 30 de diciembre de 1997. La formulación
cosmética también puede incluir una sal inorgánica (2 a 12%) como
agente de estabilización secundario.
Claramente, hay una continua necesidad de
formulaciones líquidas que contengan enzimas que estén estabilizadas
y exhiban una alta actividad a lo largo del tiempo. Particularmente,
hay una necesidad de formulaciones líquidas estabilizadas de
proteasa que sean fáciles de procesar, altamente eficaces, baratas
de producir en relación a las formulaciones estabilizantes usadas
con anterioridad, relativamente inactivas hasta que se incluyan
finalmente como ingrediente en una aplicación seleccionada, y
también útiles para formulaciones que sean bien toleradas
fisiológica-
mente.
mente.
Se ha descubierto que la combinación de un alto
nivel de sales de haluros de metales alcalinos, tales como cloruro
de sodio (al menos 4% ó 5% en peso, o más alto), en combinación con
un disolvente de poliol, tal como glicerol, propilenglicol,
sacarosa, etc. (30% en peso, o más alto) proporciona un alto nivel
de estabilidad térmica para formulaciones de proteasa (producida a
partir de especies de Bacillus, p.ej., subtilisina).
La presente invención proporciona un método para
estabilizar una o más enzimas proteasas de especies de Bacillus en
un medio líquido. En una realización, el método de la invención
consiste en formular en el medio líquido un alto nivel de una sal
de haluro de metal alcalino en combinación con un disolvente de
poliol.
La sal de haluro de metal alcalino puede ser,
por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, y fluoruro o
bromuro de sodio o de potasio. También se pueden usar sales de
litio. Adicionalmente, se pueden usar otras sales inorgánicas,
tales como sales de sulfatos o sulfitos, carbonatos, fosfatos,
silicatos o nitratos. Una realización preferida contempla al menos
entre 4-12% (p.ej., al menos 4%, al menos 5%, al
menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al
menos 11% y/o al menos 12%) de cloruro de sodio. En una realización,
el cloruro de sodio comprende entre aproximadamente
5-12%, preferiblemente entre aproximadamente
8-12% en peso, de la formulación
líquida.
líquida.
El poliol puede estar presente, por ejemplo, a
un nivel de al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%,
al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y/o al menos 95%. Por
ejemplo, una realización contempla entre 50 y 98% de poliol,
preferiblemente entre 55 y 95% de poliol, preferiblemente entre 80 y
90% de poliol, y lo más preferiblemente de 50 a 80% de poliol. Los
polioles adecuados incluyen, por ejemplo, glicerol, propilenglicol,
sacarosa, entre otros.
Entre las enzimas proteasas de especies de
Bacillus que pueden ser estabilizadas mediante las enseñanzas de la
presente memoria, una enzima preferida es una subtilisina.
El medio líquido de la invención puede ser, por
ejemplo, un concentrado líquido de enzimas o un producto formulado
que incluye al menos una proteasa. En una realización, el medio
líquido es un producto formulado seleccionado del grupo que consiste
en productos para el cuidado personal, productos para el cuidado de
la salud y productos de limpieza/detergencia. El medio líquido se
puede usar, por ejemplo, en la formulación de cremas de manos,
detergentes líquidos y similares.
La presente invención proporciona además una
formulación líquida que proporciona un entorno estabilizante de
enzimas. En una realización, la formulación incluye una o más
proteasas de una especie de Bacillus, un alto nivel de una sal de
haluro de metal alcalino y un disolvente de poliol.
La sal de haluro de metal alcalino puede ser,
por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, y fluoruro o
bromuro de sodio o de potasio. También se pueden usar sales de
litio. Adicionalmente, se pueden usar otras sales inorgánicas,
tales como sales de sulfatos o sulfitos, carbonatos, fosfatos,
silicatos o nitratos. En una realización, el cloruro de sodio está
presente a un nivel de entre 4-12% (p.ej., al menos
4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos
9%, al menos 10%, al menos 11%, hasta e incluyendo 12%). En un
ejemplo de formulación, el cloruro de sodio comprende
aproximadamente 8-12% en peso de la formulación
líquida.
El poliol está presente preferiblemente, por
ejemplo, a un nivel de al menos 30%. Ciertas realizaciones
contemplan un nivel de poliol de al menos 30%, al menos 40%, al
menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%
y/o al menos 95%. Una realización contempla entre 50 y 98% de
poliol, preferiblemente entre 55 y 95% de poliol, preferiblemente
entre 80 y 90% de poliol, y lo más preferiblemente de 50 a 80% de
poliol. Los polioles adecuados incluyen, por ejemplo, glicerol,
propilenglicol, sacarosa, entre otros.
Entre las una o más proteasas de una especie de
Bacillus que son estabilizadas en la formulación, una realización
preferida contempla la inclusión de una subtilisina.
En una realización, la formulación líquida es un
concentrado líquido de enzimas o un producto formulado que incluye
al menos una proteasa producida a partir de especies de Bacillus,
tal como una subtilisina. La formulación líquida puede ser, por
ejemplo, un producto formulado tal como un producto para el cuidado
personal, un producto para el cuidado de la salud, un producto de
limpieza, un producto de detergencia, entre otros.
La presente invención también proporciona una
formulación líquida de enzimas estabilizada, que incluye: (i) una
proteasa de especies de Bacillus, tal como subtilisina; (ii) al
menos 5% en peso de una sal de haluro de metal alcalino, tal como
cloruro de sodio, cloruro de potasio, fluoruro o bromuro de sodio o
de potasio, o sales de litio. Adicionalmente, se pueden usar otras
sales inorgánicas, tales como sales de sulfatos o sulfitos,
carbonatos, fosfatos, silicatos o nitratos; y (iii) al menos 30% en
peso de un disolvente de poliol, tal como un glicol.
Preferiblemente, la formulación incluye una subtilisina que es
estabilizada para exhibir al menos aproximadamente el 98% de
actividad remanente después de 22 días a 37 grados C. En una
realización, la subtilisina estabilizada incluye una substitución
de aminoácidos en la posición 217 (p.ej., Y217L).
Estos y otros rasgos, aspectos y ventajas de la
presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la
siguiente descripción detallada, junto con las reivindicaciones
anexas.
La presente invención proporciona métodos para
estabilizar enzimas proteasas de especies de Bacillus y
formulaciones líquidas que incluyen las enzimas estabilizadas
utilizando un poliol y una sal de haluro de metal alcalino.
Los porcentajes en la presente memoria se
expresan como porcentaje en peso de la formulación líquida.
Los inventores de la misma han determinado que
la combinación de un alto nivel de una sal de haluro de metal
alcalino (p.ej., cloruro de sodio) en combinación con un disolvente
de poliol (p.ej., glicol) proporciona un alto nivel de estabilidad
térmica para formulaciones líquidas de enzimas (p.ej., proteasas
producidas a partir de especies de Bacillus).
Las formulaciones de la presente invención
incluyen al menos aproximadamente 30% de poliol o alcohol
polihidroxilado; por ejemplo entre aproximadamente 50 y
aproximadamente 98%, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 95%,
entre aproximadamente 80 y aproximadamente 90%, y/o entre
aproximadamente 50-80% de poliol. Un ejemplo de
formulación líquida adecuada para su inclusión en aplicaciones para
el cuidado personal, como se contempla en la presente memoria,
incluye entre aproximadamente 50% y aproximadamente 80% de glicerol.
Otros polioles adecuados incluyen, y no se limitan a,
propilenglicol, etilenglicol, sorbitol, manitol, eritritol, dulcitol
e inositol. Tal formulación líquida se puede formular
adicionalmente hasta, por ejemplo, una crema de manos, o similar.
Una formulación líquida para aplicaciones de detergentes líquidos,
como se contempla en la presente memoria, incluye entre
aproximadamente 33 y aproximadamente 40% de propilenglicol. Otro
ejemplo de formulación líquida para aplicaciones para el cuidado
personal incluye aproximadamente 60% de glicerol. El nivel de
poliol es aproximadamente 50-80% para producir un
compuesto que tenga enzimas relativamente inactivas hasta que tal
compuesto es incluido finalmente en una aplicación específica.
Las formulaciones de la presente invención
incluyen al menos aproximadamente 5% de una sal de haluro de metal
alcalino, tal como cloruro de sodio, cloruro de potasio, y fluoruro
o bromuro de sodio o de potasio, o sales de litio. Adicionalmente,
se pueden usar otras sales inorgánicas, tales como sales de sulfatos
o sulfitos, carbonatos, fosfatos, silicatos o nitratos. En una
realización preferida, la sal de haluro de metal alcalino es
cloruro de sodio. El cloruro de sodio puede estar presente, por
ejemplo, a un nivel de al menos aproximadamente 5%, al menos
aproximadamente 6%, al menos aproximadamente 7%, al menos
aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 9%, al menos
aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, y/o al menos
aproximadamente 12%. En una realización, una formulación líquida de
enzimas incluye entre aproximadamente 5% y aproximadamente 12% de
cloruro de sodio (p.ej., preferido a aproximadamente 8% de cloruro
de sodio). En otra realización preferida, la formulación líquida de
enzimas incluye aproximadamente 10% de cloruro de sodio.
Las enzimas para uso en la presente invención
incluyen proteasas producidas a partir de cualquier especie de
Bacillus, e incluyen mutantes que retienen su estructura y función
similares a las de las proteasas de Bacillus.
Las proteasas de especies de Bacillus preferidas
incluyen, por ejemplo, Purafect y Properase, de Genercor
International, Inc., o Savinase, Esperase, Alcalase disponibles en
Novozymes A/S. Se pueden incluir una o más enzimas en las
formulaciones de la presente invención.
Las formulaciones líquidas de enzimas
estabilizadas de la presente invención se pueden aplicar en diversos
campos, incluyendo los campos del cuidado personal (p.ej., proteasa
para uso en cremas de manos, y similares), y limpieza (p.ej.,
proteasa para uso en detergentes líquidos, y similares), entre
otros. Por ejemplo, las formulaciones líquidas de enzimas pueden ser
concentrados líquidos de enzimas que son útiles para una formulación
posterior hasta productos finales, y/o pueden ser productos
formulados finales, tales como cremas para la piel, lociones,
jabones líquidos, detergentes líquidos, etc.
Las formulaciones líquidas de enzimas de la
presente invención son particularmente eficaces en la estabilización
de enzimas durante el almacenamiento, dentro de un intervalo de
temperaturas de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40
grados Celsius, p.ej. a o alrededor de la temperatura ambiente
(22-25 grados Celsius).
Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no
pretenden limitar la invención.
Se formuló subtilisina BPN' Y217L a
5-7 gE/l en una base de 80-90% de
glicerol, KH2PO4 1 mM a pH 5,0. El método de formulación implica, de
manera general, lo siguiente: se añadió el reactivo de CaCl_{2} 1
mM al reactivo de glicerol, seguido de la adición de la enzima
seleccionada. Después se añadió agua y la mezcla resultante se dejó
disolver durante una noche a 4ºC. La concentración de la sal
seleccionada se preparó disolviendo la sal en NaOAc 1 M antes de su
adición a la enzima disuelta. Después, se añadió carbón CP al 3% a
la combinación de enzima y sal y el compuesto resultante se mezcló
a 22ºC durante aproximadamente 6 horas. Después, se filtró el
compuesto y la disolución resultante se almacenó para los estudios
de estabilidad expuestos más adelante.
Como se muestra en la Tabla 1, la formulación
fue ensayada sin estabilización adicional y con estabilización
usando tres estabilizantes (acetato de sodio, cloruro de sodio y
formiato de sodio).
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Se hizo un seguimiento de los niveles de
actividad para todas las formulaciones anteriores, como exhiben los
datos de la Tabla 2, la cual demuestra que el cloruro de sodio es un
agente muy eficaz para la estabilización de la subtilisina (nótese,
en particular, B1). La actividad enzimática remanente a los 22 días
utilizando los tres estabilizantes mostrados estuvo entre
96-98%, comparado con un valor de sólo 81% en las
formulaciones restantes que no incluyeron acetato de sodio, cloruro
de sodio o formiato de sodio.
Se encontró que la muestra de NaCl al 8% tenía
una alta estabilidad (más de 98% de actividad remanente después de
22 días a 37 grados C y 100% después de 23 días a 37 grados C). El
dato demuestra además que siguió habiendo un alto nivel de
actividad (al menos 90%) en presencia de cloruro de sodio a los 94
días.
La Tabla 3 que se presenta a continuación
representa el mismo ejemplo que el anterior, realizado a 25ºC.
El Ejemplo 2 ilustra los resultados de un
estudio diseñado para aumentar la deseabilidad comercial de
formulaciones líquidas de enzimas y para facilitar la fabricación
de tales formulaciones. Por consiguiente, el Ejemplo 2 ilustra los
sorprendentes resultados conseguidos reduciendo la concentración de
glicerol y aumentando la concentración de sal en la
formulación.
La subtilisina BPN' Y217L se formuló como se
expone en la Tabla 4 que se presenta a continuación en una base de
70-82% de glicerol y KH2PO4 1 mM.
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Como muestran los sorprendentes datos de la
Tabla 5 que se presenta a continuación, se puede conseguir una
formulación de glicerol/sal estable que se fabrica fácilmente
aumentando la concentración de sal, permitiendo de este modo una
reducción en la cantidad de glicerol en la formulación. La Tabla 5
ilustra que una formulación con 60% de glicerol y 10% de sal es
excepcionalmente estable.
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Los Ejemplos 1 y 2 midieron la actividad
utilizando un ensayo de proteasa con
N-succinil-L-Ala-L-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida
(suc-AAPF-pNA). El ensayo está
basado en la escisión por proteasas del enlace amida entre la
fenilalanina y la p-nitroanilina del reactivo
N-succinílico. La p-nitroanilina es
monitorizada espectrofoto- métricamente a 410 nm y la velocidad de
la aparición de p-nitroanilina es una medida de la actividad
proteolítica. Una unidad de proteasa se define como la cantidad de
enzima proteasa que aumenta la absorbancia a 410 nm en una unidad
de absorbancia (UA)/min de una disolución patrón de
suc-AAPF-pNA 1,6 mM en Amortiguador
Tris 0,1 M a 25ºC en una cubeta con una longitud de camino óptico
de 1 cm. El glicerol se obtuvo en JT Baker.
Claims (20)
1. Un método para estabilizar una o más enzimas
proteasas de especies de Bacillus en un medio líquido, que consiste
en:
formular en dicho medio líquido una sal de
haluro de metal alcalino a un nivel de al menos 4% en peso en
combinación con un disolvente de poliol a un nivel de al menos 30%
en peso.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha sal de haluro de metal alcalino comprende cloruro de sodio,
estando presente dicho cloruro de sodio a un nivel de al menos 4% en
peso.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho cloruro de sodio está presente a un nivel de entre 5% en peso
y 12% en peso.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho poliol está presente a un nivel de al menos 50% en peso.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
dicho poliol está presente a un nivel de entre 50% en peso y 80% en
peso.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho disolvente de poliol se selecciona del grupo que consiste en
glicerol, propilenglicol, sacarosa y cualquier combinación de los
mismos.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha una o más enzimas proteasas es una subtilisina.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho medio líquido es un concentrado líquido de enzimas o un
producto formulado.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
dicho medio líquido es un producto formulado seleccionado del grupo
que consiste en productos para el cuidado personal, productos para
el cuidado de la salud, productos de limpieza y productos de
detergencia.
10. Una formulación líquida de enzimas
estabilizada, que consiste en una o más proteasas de una especie de
Bacillus, al menos 4% en peso de una sal de haluro de metal
alcalino, y al menos 30% en peso de un disolvente de poliol en un
medio líquido.
11. La formulación de la reivindicación 10, en
la que dicha sal de metal alcalino comprende cloruro de sodio,
estando presente dicho cloruro de sodio a un nivel de al menos 4% en
peso.
12. La formulación de la reivindicación 11, en
la que dicho cloruro de sodio está presente a un nivel de entre 5%
en peso y 12% en peso.
13. La formulación de la reivindicación 10, en
la que dicho poliol está presente a un nivel de al menos 50% en
peso.
14. La formulación de la reivindicación 13, en
la que dicho poliol está presente a un nivel de entre 50% en peso y
80% en peso.
15. La formulación de la reivindicación 10, en
la que dicho disolvente de poliol se selecciona del grupo que
consiste en glicerol, propilenglicol, sacarosa y cualquier
combinación de los mismos.
16. La formulación de la reivindicación 10, en
la que dichas una o más enzimas proteasas incluyen una
subtilisina.
17. La formulación de la reivindicación 16, en
la que dicha subtilisina tiene al menos 98% de actividad remanente
después de 22 días a 37ºC.
18. La formulación de la reivindicación 16, en
la que dicha subtilisina incluye una substitución de aminoácidos en
la posición 217.
19. La formulación de la reivindicación 10, en
la que dicha formulación líquida es un concentrado líquido de
enzimas o un producto formulado.
20. La formulación de la reivindicación 19, en
la que dicha formulación líquida es un producto formulado
seleccionado del grupo que consiste en productos para el cuidado
personal, productos para el cuidado de la salud, productos de
limpieza y productos de detergencia.
Applications Claiming Priority (2)
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