EP3347038A1 - Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique - Google Patents

Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique

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EP3347038A1
EP3347038A1 EP16775294.8A EP16775294A EP3347038A1 EP 3347038 A1 EP3347038 A1 EP 3347038A1 EP 16775294 A EP16775294 A EP 16775294A EP 3347038 A1 EP3347038 A1 EP 3347038A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
albumin
composition
therapeutic use
human albumin
human
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16775294.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Damien BATAILLE
Michel Nogre
Guillaume CHEVREUX
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LFB SA
Original Assignee
LFB SA
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Filing date
Publication date
Application filed by LFB SA filed Critical LFB SA
Publication of EP3347038A1 publication Critical patent/EP3347038A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A61K38/385—Serum albumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K47/02—Inorganic compounds
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    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
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    • A61K9/08—Solutions
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    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism

Definitions

  • Liquid composition of human albumin for therapeutic use Liquid composition of human albumin for therapeutic use
  • the invention relates to a liquid composition of human albumin for therapeutic use, with improved activity.
  • Albumin is a highly soluble plasma protein produced by the liver. Its primary structure consists of a polypeptide chain of 585 amino acids, among which 35 cysteine residues, of which only one (cysteine 34, or Cys34) is in the reduced state.
  • the daily albumin synthesis amounts to about 120 mg.kg- 1 , allowing a daily turnover of about 5% of the protein Albumin represents more than 50% of the proteins of the human or animal blood plasma.
  • Plasma is known to have a multitude of beneficial roles, including albumin helping to maintain oncotic pressure by maintaining the proper distribution of fluid between blood vessels and tissues or interstitial media.
  • albumin This binding capacity also allows the albumin to play a role of neutralizer of toxic substances (benzene). ne, aflatoxin Gl, etc.) that it sequesters and renders harmless to the body.
  • albumin has antioxidant properties mainly due to its ability to bind many ligands and the free thiol group at the residue Cys34 which also allows it to trap free radicals.
  • Albumin is already used in the treatment of several pathologies for its oncotic and colloidal properties. For example, albumin is used as an emergency treatment to restore or maintain circulating blood volume in a patient with hypovolemic shock. It is also used in the treatment of cirrhosis, extensive burns, respiratory distress in adults, haemolytic disease in newborns, etc.
  • the oxidized form of albumin generally has a sulfinic (R-S02H) or sulphonic (R-S03H) group.
  • truncated forms of albumin have a C-terminal end and / or N-terminaie truncated of one or more amino acids.
  • Some albumins may be in oxidized and truncated form.
  • the truncated forms also exhibit reduced activity compared to the native form.
  • the loss of aspartate and alanme residues in the N-terminal deprives the albumin molecule of its ability to bind copper and free radicals.
  • albumin compositions for therapeutic use available to date have been found to contain only a small proportion of unoxidized and non-truncated albumin. The effectiveness of these compositions is thus not optimal (Vincent et al, Critical Care 2014,18 (4): 231 "Albumin administration in the acutely ill: what is new and where nexî?").
  • compositions based on therapeutically active human albumin There is therefore a need for improved compositions based on therapeutically active human albumin.
  • the subject of the invention is therefore a human albumin composition for therapeutic use in which at least 50% by weight of the albumin is in native form, that is to say has a molecular weight of approximately 66.438Da. that is to say 66,438 Da +/- 5 Da, preferably +/- 2 Da, said composition further comprising at least one sodium salt.
  • composition according to the invention thus comprises at least 50% by weight of albumin with a molecular weight of between 66,433 Da and 66,443 Da, preferably between 66,436 Da and 66,440 Da.
  • the albumin used to prepare such a composition is advantageously obtained by a purification process free of ethanolic precipitation step.
  • the albumin is obtained by a purification process comprising only one ethanolic precipitation step, said step being carried out at a low concentration of ethanol, that is to say less than 10% of ethanol. ethanol.
  • This step advantageously makes it possible to extract the fibrinogen from the composition.
  • the subject of the invention is also such a composition for its use in the treatment of renal failure, hepatic deficit, neurodegenerative disease, hypovolemic shock, respiratory distress syndrome in the body. adult (ARDS), a hemolytic disease of the newborn.
  • FIG. 1 Deconvolution of the mass spectrum of albumin on the eluate, after the positive chromatography step (HEA Hypercel);
  • Figure 2 Deconvolution of the mass spectrum of albumin after the ion exchange chromatography step (NA + L DEAE Macroprep);
  • Figure 3 Deconvolution of the mass spectrum of albumin after the mixed mode chromatography step (NA MEP Hypercel);
  • FIG. 4 Deconvolution of the mass spectrum of albumin after the heat treatment step
  • FIG. 5 SDS-PAGE gel of the successive products from the plasma fraction to the heat-treated product comprising more than 90% of albumin, obtained by the multicolumn continuous extraction process.
  • Figure 6 Mass spectrum of a albumin composition of the state of the art (Albuminar® from CSL); Figure 7: Mass spectrum of an albumin composition according to the invention.
  • native albumin is understood to mean human albumin in non-oxidized and non-truncated form, that is to say having 585 amino acids, of which the cysteine residue at position 34 from the end N terminal includes a reduced free SH group.
  • Oxidized albumin is used to designate an albumin lacking an SH group at the level of Cys-34.
  • Oxidized albumin includes, in particular, cysteinyl albumin (of which Cys-34 is bound to a cysteine).
  • a "truncated albumin” refers to an albumin whose N-terminal and / or C-terminal end is truncated, that is to say that at least one amino acid is missing at one of the ends of the protein.
  • albumin It is possible to easily discriminate between different forms of albumin by molecular weight. Indeed, native albumin has a molecular weight of about 66,438 Da. In contrast, a truncated albumin has a molecular weight of less than 66,400 Da, whereas an oxidized albumin has a molecular weight generally greater than 66,450 Da.
  • the measurement methods used to determine the molecular weight of the molecule of albumin have sufficient precision to discriminate variations due to oxidation or truncation.
  • the molecular weight of the albumin molecule is measured by mass spectrometry, preferably by electrospray mass spectrometry.
  • mass spectrometry analysis is performed on a device of the ESI-Q-TOF type (Synapt, waters). If necessary, the protein of interest is first subjected to positive chromatography and then eluted, the mass spectrometric analysis being then performed on the eluate (Marie AL et al., Capillary zone electrophoresis and capillary electrophoresis-mass spectrometry for analyzing qualitative and quantitative variations in therapeutic albumin, Anal Chem Acta, 2013 Oct 24, 800: 103-10, doi: 10.1016 / j.aca.2013.09.023, Epub 2013 Sep 14.)
  • a composition "rich in albumin” designates a composition of biological origin, such as blood plasma or a transgenic milk, originally comprising a high concentration of albumin, and in particular at least 30%, preferably at least 40% .
  • albumin enriched composition designates a composition whose albumin concentration has been increased following a treatment step, in particular purification, such as chromatography.
  • the expression “approximately” encompasses the considered value +/- 5, and preferentially +/- 2.
  • the Applicant has shown that the removal of certain ethanolic fractionation steps during the purification of albumin from blood plasma, or any other solution rich in human albumin, preserves the native form of the molecule.
  • an albumin concentrate mainly comprising albumin in native form, by subjecting the albumin-rich solution exclusively to successive chromatography steps.
  • the chromatographies can be indifferently ion exchange chromatography or affinity chromatography. It is also possible to alternate between ion exchange chromatography and affinity chromatography.
  • the albumin concentrate thus obtained can then be used to produce the pharmaceutical composition based on human albumin according to the invention.
  • the albumin composition according to the invention is obtained by a purification method comprising no precipitation step.
  • the albumin composition according to the invention is obtained by a purification process comprising one or more ethanolic precipitation stages carried out at a low concentration of ethanol, advantageously less than 50%, of ethanol less than 45% ethanol, less than 40% ethanol, less than 35% ethanol, less than 30%; ethanol, less than 25% ethanol, less than 20% ethanol, less than 15% ethanol, less than 10% ethanol, less than 5% ethanol.
  • the albumin composition according to the invention is obtained by a purification process comprising one or more ethanolic precipitation steps carried out at a low concentration of ethanol, advantageously less than 45% by weight. ethanol.
  • the albumin composition according to the invention is obtained by a purification process comprising one or more ethanolic precipitation steps carried out at a low concentration of ethanol, advantageously less than 30% by weight. ethanol.
  • the albumin composition according to the invention is obtained by a purification process comprising one or more ethanolic precipitation steps carried out at a low concentration of ethanol, advantageously less than 10% of ethanol. ethanol.
  • the albumin used in the pharmaceutical composition according to the invention was obtained by purification process of a solution rich in human albumin successively comprising a positive chromatography step and a negative chromatography step. Positive chromatography first allows the albumin to be retained on the column, to eliminate the majority of the impurities, then the second chromatography makes it possible, in a second step, to retain on the column the remaining impurity fraction and to recover the enriched fraction. in albumen.
  • any cryoprecipitation step may also be omitted from the albumin purification process.
  • the chromatographies are made directly from said plasma rather than from cryocant.
  • the human albumin composition for therapeutic use according to the invention has been obtained by a method of fractionating blood plasma comprising the steps of: a) Subjecting blood plasma to a chromato-graphy exchange agent. anions at a pH greater than or equal to 5, preferably at pH greater than or equal to 6, greater than or equal to 7, greater than or equal to 8;
  • step b) subjecting the fraction eluted from step a) to a first ion exchange chromatography or mixed mode
  • step b) Subjecting the non-retained fraction from step b) to a second ion exchange chromatography or mixed mode, and optionally
  • step d) subjecting the non-retained fraction from step c) to a heat treatment, in particular to a pasteurization, at a temperature of between 50 ° C. and 70 ° C., preferably around 60 ° C., for a time of between 1 ° C. hour and 15 hours, preferably at least 10 hours.
  • a heat treatment in particular to a pasteurization
  • the human albumin composition for therapeutic use according to the invention has been obtained by a method of fractionating blood plasma comprising the steps of: a) Subjecting blood plasma to anion exchange chromatography at pH 6, b) subjecting the eluted fraction resulting from step a) to a first ion exchange chromatography or mixed mode,
  • step b) Subjecting the non-retained fraction from step b) to a second ion exchange chromatography or mixed mode, and optionally
  • step d) subjecting the non-retained fraction from step c) to a pasteurization at a temperature of between 50 ° C. and 70 ° C., preferably around 60 ° C., for a time of between 1 hour and 15 hours, preferably at at least 10 hours.
  • an ultrafiltration step is performed before the chromatography step a).
  • a formulation step is performed before step d) heat treatment such as pasteurization.
  • the elution of the column before step b) is carried out at a pH greater than 3.5, and in particular at a pH of about 4.
  • the human albumin composition for therapeutic use according to the invention has been obtained by a method of fractionation of blood plasma cryovacant comprising the steps of: a) Subjecting cryo-supernatant to anion exchange chromatography at a pH greater than or equal to 5, preferably at least pH greater than or equal to 6, greater than or equal to 7, greater than or equal to 8;
  • step b) subjecting the fraction eluted from step a) to a first ion exchange chromatography or mixed mode
  • step b) Subjecting the non-retained fraction from step b) to a second ion exchange chromatography or mixed mode, and optionally
  • step d) subjecting the non-retained fraction from step c) to a heat treatment, in particular to a pasteurization, at a temperature of between 50 ° C. and 70 ° C., preferably around 60 ° C., for a time of between 1 ° C. hour and 15 hours, preferably at least 10 hours.
  • a heat treatment in particular to a pasteurization
  • the albumin is purified from a recombinant human albumin concentrate.
  • the albumin is purified from a transgenic milk of a non-human mammal.
  • the purification process then comprises a preliminary delipidation step before any chromatography step.
  • the albumin is purified from a recombinant cell culture supernatant expressing human albumin.
  • the albumin concentrate from these purification processes is subjected to one or more viral inactivation steps, such as pasteurization and / or nanofiltration.
  • the albumin concentrate is subjected to a pasteurization step.
  • the step of Pasteurization is carried out under conditions which make it possible to limit the N-terminal and C-terminal cleavage and / or to limit the cysteinylation phenomena.
  • the pasteurization step is advantageously carried out by keeping the temperature constant (approximately 60 ° C.) throughout the duration of the pasteurization step (approximately 10 h) and / or by controlling the addition of the stabilizing excipients such as caprylate and / or tryptophanate.
  • the albumin composition is advantageously subjected to a distribution step in storage and / or administration containers, such as flasks, bags, syringes, or any other device allowing storage and / or administration of the product to patients.
  • the distribution step is performed so as to limit the oxidation phenomena of the albumin composition.
  • the distribution step is carried out in a controlled atmosphere, advantageously in the absence of oxygen and / or in the presence of an inert gas such as nitrogen.
  • the distribution in the storage and / or administration container comprises a step of inerting (replacing the air contained in the dead volume of the container with an inert gas and preferably the nitrogen) and / or capping under inert gas, for example under nitrogen.
  • the storage and / or administration container of the albumin composition is advantageously constituted by non-oxygen permeable materials.
  • albumin resulting from such purification processes is mainly recovered in native form, that is to say unoxidized and not truncated. It is then possible to produce albumin compositions for therapeutic use having a very high antioxidant activity and anti-free radicals compared to currently available albumin compositions.
  • the invention provides a human albumin liquid composition for therapeutic use comprising human albumin and a sodium salt, at least 50% by weight of said albumin being in native form, that is to say presenting molecular weight of about 66,438 Da.
  • at least 60%, preferably at least 65% by weight of said albumin is in native form, and preferably at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%.
  • % by weight of said albumin is in native form.
  • the composition may comprise between 10 and 300 mg / ml of albumin, ie between 1% and 30% by weight of albumin relative to the total weight of the composition.
  • the composition may conventionally comprise between 40 and 50 mg / ml or between 200 and 250 mg / ml of albumin.
  • albumin since the majority of the albumin present in said composition has an increased activity compared to albumin of the currently available compositions, it may be advantageous to provide for the treatment of certain pathologies of lower concentrations, and in particular of the order 10, 15, 20, 25, 30 or 35 mg / mL.
  • the composition advantageously comprises less than 30% of albumin in oxidized form and / or less than 20% of truncated albumin.
  • the composition advantageously comprises less than 30% of albumin in oxidized form, preferably less than 25% of albumin in oxidized form and preferentially less than 22%, 20%, 18%, 15%, 10%, 5% of albumin in oxidized form.
  • the composition advantageously comprises less than 20% of truncated albumin, preferably less than 15% of albumin in oxidized form and preferably less than 12%, 10%, 8%, 5% or more. % of albumin in truncated form.
  • the albumin composition also comprises pharmaceutically acceptable excipients, in particular excipients which make it possible to limit the oxidation phenomena, such as the natural antioxidants of the organism, by N-acetyl-methionine, N-acetyl-methionine sodium octanoate, reduced glutathione, uric acid, alpha-lipoic acid, disodium EDTA, flavonoids, in particular flavonols such as rutin, which quench, or neutralize, reactive oxygen species, such as type I and type II free radicals.
  • excipients such as the natural antioxidants of the organism, by N-acetyl-methionine, N-acetyl-methionine sodium octanoate, reduced glutathione, uric acid, alpha-lipoic acid, disodium EDTA, flavonoids, in particular flavonols such as rutin, which quench, or neutralize, reactive oxygen species, such as type I and type II free radical
  • the albumin composition of the invention further comprises at least one sodium salt, preferably selected from sodium chloride, sodium caprylate, sodium carbonate and sodium acetyltryptophanate.
  • the human albumin composition for therapeutic use according to the invention comprises between 2.5 and 3.5 mg / ml of sodium salt.
  • the subject of the invention is in particular a human albumin composition for therapeutic use comprising water, approximately 40 mg / ml of albumin and approximately 3.5 mg / ml of sodium salt, preferentially sodium chloride and sodium caprylate, wherein at least 60% of the albumin has a molecular weight of about 66.438 Da.
  • the subject of the invention is also a human albumin composition for therapeutic use comprising water, approximately 50 mg / ml of albumin and approximately 3.5 mg / ml of sodium salt, preferably sodium chloride and sodium caprylate. wherein at least 60% of the albumin has a molecular weight of about 66.438 Da.
  • the subject of the invention is also a human albumin composition for therapeutic use comprising water, approximately 200 mg / ml of albumin and approximately 3.5 mg / ml of sodium salt, preferably sodium chloride and sodium caprylate. wherein at least 60% of the albumin has a molecular weight of about 66.438 Da.
  • the composition may further comprise one or more plasma proteins among transferrin, immunoglobulins G and haptoglobin, generally co-purified with the albumin.
  • Transferrin and haptoglobin may advantageously enhance the antioxidant character of the albumin composition without inducing significant side effects, whereas immunoglobulin G may be able to limit bacterial or viral infections.
  • the albumin composition according to the invention is preferably an aqueous solution.
  • the albumin composition of the invention is useful in therapy, and especially in injectable form, intravenously.
  • the invention also relates to a human albumin composition for therapeutic use as described above for its use in the treatment and / or prevention of numerous diseases and in particular renal deficits, liver deficits, neurodegenerative diseases, shocks hypovolemic, respiratory distress syndromes in adults (ARDS), hemolytic diseases of the newborn.
  • ARDS respiratory distress syndromes in adults
  • the composition according to the invention is particularly useful for the treatment or prevention of neurodegenerative diseases, and in particular Alzheimer's.
  • the composition according to the invention can be particularly effective in the treatment and prevention of diseases related to heavy metals, such as Menkes disease whose subjects have a copper transporter deficiency, or Wilson's disease whose affected subjects have a copper overload in the tissues.
  • the plasma albumin is adsorbed after depletion of the immunoglobulins on a chromatography medium whose chemical ligand is a primary amine: the HEA-Hypercel gel.
  • Plasma depleted in IgG, recovered at the end of the IgG purification process according to a continuous extraction process by multicolumn affinity chromatography is used, the albumin not being fixed at all to the affinity gel used. .
  • the depleted plasma of IgG was obtained according to the following steps:
  • Table 1 The composition of the buffer solutions used during the various steps of the multicolumn affinity chromatography method is summarized in Table 1 below.
  • Table 1 Buffer solutions for multicolumn affinity chromatography
  • a CaptureSelect FcXL affinity gel from Life Technologies (Ref 1943280 IL, Lot No. 200814-03) was used.
  • the affinity ligand used is a ligand of the company BAC (BioAffinityCompany), which specifically binds the CH3 domain of the 4 subclasses of human IgGs.
  • the 4 columns were driven sequentially by the automaton with a plasma charge corresponding to 21 g of IgG.L "1 of gel, a contact time of 3 to 4 minutes, at pH 1 of adsorption of the unmodified plasma. between 7.1 and 7.8, the elution being carried out with a solution of acetic acid at pH 3.0
  • the gel was regenerated after each chromatography
  • the working rate was 76.4 ml.min -1 which corresponds to a contact time of 3.3 min during adsorption.
  • Table 2 Stages of multicolumn affinity chromato graphy
  • the non-retained fraction can then be passed on a column dedicated to the purification of fibrinogen.
  • a conventional ion exchange gel (DEAE-Macroprep) previously observed to have no albumin reactivity at pH 6.5 was first used.
  • a sample of the non-adsorbed fraction (reference: NA + L DEAE-Macroprep) was collected. Concentration on an ultrafiltration membrane (Biomax lOkD Merck Millipore) made it possible to reconcentrate the albumin at 40 g / l before passing over a second chromatography gel capturing albumin contaminants also at pH 6.5.
  • the final yield of albumin is 76%.
  • the SDS PAGE profile corresponding to these tests shows that the pasteurized product has a purity greater than 90% in SDS PAGE (FIG. 5).
  • the albumin is injected on a C4 reverse phase column and analyzed in ESI-MS. Electrospray mass spectrometry provides a precise mass measurement sufficient to evaluate the heterogeneity of albumin. Experimental masses are compared to theoretical masses.
  • the eluate is analyzed online by mass spectrometry on an ESI-Q-TOF type device (Synapt, Waters).
  • Table 6 summarizes the experimental masses obtained for deconvoluted mass spectra of albumin at each purification step.
  • the majority form corresponds to an albumin with reduced free cysteine (native, unoxidized and non-truncated form), the minority forms correspond to truncated forms (N-ter and C-form). ter), oxidized (cystenylated and cystenylated / glycated) and glycated.
  • Table 7 Percentage of different forms of albumin in the albumin composition obtained from the purification process
  • Example 3 Characterization of the Contaminating Proteins in the Albumin Concentrate
  • the albumin concentrate of Example 1 was analyzed to determine the other plasma proteins present.
  • the obtained peptide mixture is separated and analyzed by nanoLC-MS / MS.
  • the result is then reprocessed by the Peaks studio software and sent to databases to analyze the accompanying proteins present at the end of the process.
  • the eluate is analyzed on-line by mass spectrometry on an LTQ Orbitrap type device (Thermo).
  • Table 8 shows all the results obtained after treatment of the result.
  • Table 8 List of proteins present in the final heat-treated albumin concentrate
  • the albumin concentrate according to the invention has a low level of contaminating proteins, making it advantageous for its therapeutic use.
  • Example 4 Preparation of Human Albumin Compositions for Therapeutic Use
  • Example 5 Comparison of the albumin composition obtained in Example 1 with an albumin composition of the prior art
  • the albumin composition obtained in Example 1 and a product of the prior art were analyzed by mass spectrometry.
  • the mobile phases used are: 3 ⁇ 40 to 0.1% TFA (A) and acetonitrile containing 0.1% TFA (B). Elution was performed using a phase B gradient at a flow rate of 200 ⁇ L / min.
  • the eluate was analyzed on-line by mass spectrometry on a device of the ESI-Q-TOF type (Synapt, Waters).
  • FIG. 6 spectrum of albuminar albumin composition of CSL Behring
  • FIG. 7 spectrum of the albumin composition according to the invention, obtained in example 1).
  • the analysis of the spectra shows a high proportion of the oxidized and cysteinylated forms in the Albuminar® product, compared to the composition according to the invention.
  • composition according to the invention comprises a larger amount of unoxidized, non-cysteninylated and non-cleaved N / C-ter albumin than the composition of the prior art.

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Abstract

L'invention concerne une composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique, dans laquelle au moins 50% de l'albumine présente un poids moléculaire de 66.438 Da, plus ou moins 5 Da, préférentiellement plus ou moins 2 Da, ladite composition comprenant en outre un sel de sodium.

Description

Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique
L'invention a trait à une composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique, à activité améliorée.
Arrière-plan technologique L'albumine est une protéine plasmatique hautement soluble, produite par le foie. Sa structure primaire consiste en une chaîne polypeptidique de 585 acides aminés, parmi lesquels 35 résidus cystéine, dont un seul (la cystéine 34, ou Cys34) se trouve à l'état réduit. La synthèse journalière d'albumine s'élève à environ 120 mg.kg"1, permettant un renouvellement quotidien d'environ 5% de la protéine. L'albumine représente plus de 50% des protéines du plasma sanguin humain ou animal. Cette protéine plasmatique est connue pour avoir une multitude de rôles bénéfiques. Notamment, l'albumine participe au maintien de la pression oncotique en maintenant la bonne répartition des liquides entre les vaisseaux sanguins et les tissus ou le milieu interstitiel. L'albumine joue également un rôle dans le transport de diverses substances endogènes, telles que les acides gras, des ions métalliques (cuivre, zinc), des hormones thyroïdiennes et stéroïdes, des acides aminés (le tryptophane et la cystéine principalement) et exogènes, telles que les vitamines, les substances médicamenteuses (ibuprofène, diazepane, etc.). Cette capacité de fixation permet également à l'albumine déjouer un rôle de neutralisateur de substances toxiques (benzène, aflatoxin Gl, etc.) qu'elle séquestre et rend inoffensives pour l'organisme. En outre, l'albumine présente des propriétés antioxydantes principalement dues à sa capacité de fixation de nombreux ligands et au groupement thiol libre au niveau du résidu Cys34 qui lui permet en outre de piéger des radicaux libres.
L'albumine est déjà utilisée dans le traitement de plusieurs pathologies pour ses propriétés oncotiques et colloïdales. Par- exemple, l'albumine est utilisée en traitement d'urgence pour rétablir ou maintenir le volume de sang circulant chez un patient en choc hypovolémique. Elle est également utilisée dans le cadre du traitement de la cirrhose, des brûlures étendues, en cas de détresse respiratoire de l'adulte, de maladie hémolytique chez le nouveau-né, etc.
Par ailleurs, ses propriétés anti-oxydantes et anti-radicaux libres en font une molécule pharmacologique potentiellement intéressante pour le traitement de très nombreuses autres maladies. Ainsi, des études récentes ont montré l'intérêt de l'administration d'albumine dans le cadre du traitement de maladies diverses, telles que les insuffisances cardiaques ischémiques chroniques (Ellidag et al. Redox Report 2014 ; Vol.0. N.O : 1-6), les accidents cardiovasculaires ischémiques et cardioemboliques (Xu W-H et al. Stroke 2014 ; 45 :00-00), les polyneuropathies amyloidotiques fami liales (Kugimiya T et al. 2011 ; Laboratory Investigation 1- 10), le lupus érythémateux systémique (Sheikh Z et ai. Autoimmunity 2007 ; 40(7) :512-520), le diabète (Koga M et al. The Journal Of Médical Investigation 2013 ; 60 ;40-45), les maladies rénales chroniques (Matsumava Y. Clin ExpL Nephroi. 2009), l'hypertension (Oda E. Intem Med 2014 ; 53 :655-66Q), les maladies du foie en général (Arroyo V. et al. Journal of Hepatology 2014.04,012), la maladie d'Alzheimer (Cankurtaran et al. JAD, 2012 - Stanyon et al. J Biological Chemistry. 2012 - Milojevic J et al. Journal of Alzheimer' s Disease 38 (2014) 753- 765). II a été montré que l'albumine présente dans le plasma sanguin, bien que majoritairement sous forme native non-dégradée, peut également être sous forme oxydée et/ou tronquée. Dans la forme non-oxydée (ou forme réduite), la Cys-34 présente un groupement S H libre, A l'inverse, la forme oxydée de l'albumine présente généralement un groupement sulfinique (R-S02H) ou suifonique (R-S03H) au niveau de la Cys-34, Les formes tronquées de l'albumine présentent quant à elles une extrémité C-terminale et/ou N-terminaie tronquée d'un ou plusieurs acides aminés. Certaines albumines peuvent être sous forme oxydée et tronquée. Ces modifications de Sa molécule d' lbumine in-vivo s'expliquent principalement par des modifications post- translationnelles dues à des stress oxydatifs, Or, la conversion de la forme réduite à certaines formes oxydées est irréversible faisant perdre de manière irrévocable ses propriétés anti- oxydantes à la molécule. En outre, Les formes tronquées présentent également une activité réduite comparativement à la forme native. Par exemple, la perte des résidus aspartate et alanme en N-terminale prive la molécule d'albumine de sa capacité à lier le cuivre et les radicaux libres.
Or, les compositions d'albumine à usage thérapeutique disponibles à ce jour s'avèrent ne contenir qu'une faible proportion d'albumine non-oxydée et non-tronquées. L'efficacité de ces compositions n'est ainsi pas optimum (Vincent et al, Critical Care 2014,18(4) :231 "Albumin administration in the acutely ill : what is new and where nexî ? »).
Il existe donc un besoin en compositions améliorées à base d'albumine humaine thérapeutiquement active.
Résumé de l'invention De façon surprenante, il est apparu à la Demanderesse qu'il est possible de préserver l'albumine purifiée à partir d'une solution riche en albumine humaine, en supprimant du procédé de purification tout ou partie des étapes de précipitation éthanolique. La Demanderesse est ainsi parvenue à purifier de l'albumine à partir de plasma sanguin en préservant sa forme native, non- oxydée et non-tronquée, et à préparer des compositions à base d'albumine humaine à usage thérapeutique comprenant majoritairement une telle albumine native. Les compositions d'albumine selon l'invention présentent ainsi une activité anti-oxydante et de transport renforcée par rapport aux compositions actuellement disponibles.
L'invention a donc pour objet une composition d'albumine humaine à usage thérapeutique dans laquelle au moins 50% en poids de l'albumine est sous forme native, c'est-à-dire présente un poids moléculaire d'environ 66.438Da, c'est-à-dire de 66.438 Da +/- 5 Da, préférentiellement +/- 2 Da, ladite composition comprenant en outre au moins un sel de sodium.
La composition selon l'invention comprend ainsi au moins 50% en poids d'albumine de poids moléculaire compris entre 66.433Da et 66.443 Da, préférentiellement compris entre 66.436 Da et 66.440 Da.
L'albumine utilisée pour préparer une telle composition est avantageusement obtenue par un procédé de purification exempt d'étape de précipitation éthanolique. Dans un autre exemple, l'albumine est obtenue par un procédé de purification ne comprenant qu'une seule étape de précipitation éthanolique, ladite étape étant réalisée à basse concentration d'éthanol, c'est-à- dire inférieure à 10% d'éthanol. Cette étape permet avantageusement d'extraire le fibrinogène de la composition. L'invention a également pour objet une telle composition pour son utilisation dans le traitement d'un déficit rénal, d'un déficit hépatique, d'une maladie neurodégénérative, d'un choc hypovolémique, d'un syndrome de détresse respiratoire chez l'adulte (ARDS), d'une maladie hémolytique du nouveau-né.
Brève description des figures Figure 1 : Déconvolution du spectre de masse de l'albumine sur l'éluat, après l'étape de chromatographie positive (HEA Hypercel) ;
Figure 2 : Déconvolution du spectre de masse de l'albumine après l'étape de chromatographie échangeuse d'ions (NA+L DEAE Macroprep) ; Figure 3 : Déconvolution du spectre de masse de l'albumine après l'étape de chromatographie mode mixte (NA MEP Hypercel) ;
Figure 4 : Déconvolution du spectre de masse de l'albumine après l'étape de traitement thermique ; Figure 5 : Gel SDS-PAGE des produits successifs depuis la fraction plasmatique jusqu'au produit traité thermiquement comprenant plus de 90% d'albumine, obtenus par le procédé d'extraction en continu multicolonnes.
Figure 6 : Spectre de masse d'une composition d'albumine de l'état de la technique (Albuminar® de CSL) ; Figure 7 : Spectre de masse d'une composition d'albumine selon l'invention.
Description détaillée
Définitions
Dans le contexte de l'invention, on entend par « albumine native » l'albumine humaine sous forme non-oxydée et non-tronquée, c'est-à-dire présentant 585 acides aminés parmi lesquels le résidu cystéine en position 34 depuis extrémité N terminale comprend un groupement SH libre réduit.
Le terme « albumine oxydée » est utilisé pour désigner une albumine dépourvue de groupement SH au niveau de la Cys-34. L'albumine oxydée englobe notamment l'albumine cystéinylée (dont la Cys-34 est liée à une cystéine). Une « albumine tronquée » désigne quant à elle une albumine dont l'extrémité N-terminale et/ou C-terminale est tronquée, c'est-à-dire qu'il manque au moins un acide aminé à l'une des extrémités de la protéine.
Il est possible de discriminer facilement les différentes formes d'albumine par le poids moléculaire. En effet, l'albumine native a un poids moléculaire d'environ 66.438 Da. A l'inverse, une albumine tronquée présente un poids moléculaire inférieur à 66.400 Da, tandis qu'une albumine oxydée présente un poids moléculaire généralement supérieur à 66.450 Da. Les méthodes de mesure utilisées pour déterminer le poids moléculaire de la molécule d'albumine ont une précision suffisante pour discriminer les variations dues aux oxydations ou troncatures. De préférence, le poids moléculaire de la molécule d'albumine est mesurée par spectrométrie de masse, préférentiellement par spectrométrie de masse électrospray. Par exemple, l'analyse de la spectrométrie de masse est réalisée sur un appareil de type ESI-Q-TOF (Synapt, waters). Si nécessaire, la protéine d'intérêt est préalablement soumise à une chromatographie positive puis éluée, l'analyse par spectrométrie de masse étant alors réalisée sur l'éluat (Marie AL et al. « Capillary zone electrophoresis and capillary electrophoresis-mass spectrometry for analyzing qualitative and quantitative variations in therapeutic albumin",_Anal Chim Acta. 2013 Oct 24;800: 103-10. doi: 10.1016/j.aca.2013.09.023. Epub 2013 Sep 14.). Une composition « riche en albumine » désigne une composition d' origine biologique, telle que du plasma sanguin ou un lait transgénique, comprenant de manière originelle une concentration importante en albumine, et notamment au moins 30%, préférentiellement au moins 40%. Une composition « enrichie en albumine » désigne une composition dont la concentration en albumine a été augmentée suite à une étape de traitement, en particulier de purification, telle qu'une chromatographie.
D'une manière générale, et sauf indication contraire, les pourcentages s'entendent en poids par rapport au poids total de l'élément considéré.
Dans le contexte de l'invention, l'expression « environ » englobe la valeur considérée +/- 5, et préférentiellement +/- 2. En travaillant sur un nouveau procédé de fractionnement des protéines plasmatiques, la Demanderesse a mis en évidence que la suppression de certaines étapes de fractionnement éthanolique lors de la purification de l'albumine à partir de plasma sanguin, ou de toute autre solution riche en albumine humaine, permet de préserver la forme native de la molécule. Ainsi, il est possible d'obtenir un concentré d'albumine comprenant majoritairement de l'albumine sous forme native, en soumettant la solution riche en albumine exclusivement à des étapes de chromatographies successives. Les chromatographies peuvent être indifféremment des chromatographies échangeuses d'ions ou des chromatographies d'affinité. Il est également possible d'alterner les chromatographies échangeuses d'ions et les chromatographies d'affinité. Le concentré d'albumine ainsi obtenu peut alors être utilisé pour réaliser la composition pharmaceutique à base d'albumine humaine selon l'invention. Avantageusement, la composition d'albumine selon l'invention est obtenue par un procédé de purification ne comprenant aucune étape de précipitation.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition d'albumine selon l'invention est obtenue par un procédé de purification comprenant une ou plusieurs étapes de précipitation éthanolique réalisées à basse concentration d'éthanol, avantageusement inférieure à 50%, d'éthanol inférieure à 45% d'éthanol, inférieure à 40% d'éthanol, inférieure à 35% d'éthanol, inférieure à 30%; d'éthanol, inférieure à 25% d'éthanol, inférieure à 20% d'éthanol, inférieure à 15% d'éthanol, inférieure à 10% d'éthanol, inférieure à 5% d'éthanol.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition d'albumine selon l'invention est obtenue par un procédé de purification comprenant une ou plusieurs étapes de précipitation éthanolique réalisées à basse concentration d'éthanol, avantageusement inférieure à 45% d'éthanol.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition d'albumine selon l'invention est obtenue par un procédé de purification comprenant une ou plusieurs étapes de précipitation éthanolique réalisées à basse concentration d'éthanol, avantageusement inférieure à 30% d'éthanol.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition d'albumine selon l'invention est obtenue par un procédé de purification comprenant une ou plusieurs étapes de précipitation éthanolique réalisées à basse concentration d'éthanol, avantageusement inférieure à 10% d'éthanol.
Dans un mode de réalisation particulier, l'albumine utilisée dans la composition pharmaceutique selon l'invention a été obtenue par procédé de purification d'une solution riche en albumine humaine comprenant successivement une étape de chromatographie positive et une étape de chromatographie négative. La chromatographie positive permet dans un premier temps de retenir l'albumine sur la colonne, pour éliminer la majorité des impuretés, puis la seconde chromatographie permet dans un second temps de retenir sur la colonne la fraction d'impuretés restante et de récupérer la fraction enrichie en albumine.
Avantageusement, afin de réduire encore les risques de dénaturer la protéine, toute étape de cryoprécipitation peut être également supprimée du procédé de purification de l'albumine. Ainsi, dans le cas où l'albumine est purifiée à partir de plasma sanguin, les chromatographies sont réalisées avantageusement directement à partir dudit plasma plutôt qu'à partir de cryo- surnageant.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'invention a été obtenue par un procédé de fractionnement de plasma sanguin comprenant les étapes consistant à : a) Soumettre du plasma sanguin à une chromato graphie échangeuse d'anions à un pH supérieur ou égal à 5, avantageusement à pH supérieur ou égal à 6, supérieur ou égal à 7, supérieur ou égal à 8 ;
b) Soumettre la fraction éluée issue de l'étape a) à une première chromatographie échangeuse d'ions ou mode mixte,
c) Soumettre la fraction non retenue issue de l'étape b) à une seconde chromatographie échangeuse d'ions ou mixe mode, et optionnellement
d) Soumettre la fraction non retenue issue de l'étape c) à un traitement thermique, en particulier à une pasteurisation, à une température comprise entre 50°C et 70°C, préférentiellement environ 60°C, pendant un temps compris entre 1 heure et 15 heures, préférentiellement au moins 10 heures.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'invention a été obtenue par un procédé de fractionnement de plasma sanguin comprenant les étapes consistant à : a) Soumettre du plasma sanguin à une chromatographie échangeuse d'anions à un pH6, b) Soumettre la fraction éluée issue de l'étape a) à une première chromatographie échangeuse d'ions ou mode mixte,
c) Soumettre la fraction non retenue issue de l'étape b) à une seconde chromatographie échangeuse d'ions ou mixe mode, et optionnellement
d) Soumettre la fraction non retenue issue de l'étape c) à une pasteurisation, à une température comprise entre 50°C et 70°C, préférentiellement environ 60°C, pendant un temps compris entre 1 heure et 15 heures, préférentiellement au moins 10 heures.
Dans un mode de réalisation particulier, une étape d'ultrafiltration est réalisée avant l'étape a) de chromatographie. Dans un mode de réalisation particulier, une étape de formulation est réalisée avant l'étape d) de traitement thermique telle qu'une pasteurisation.
Avantageusement, l'élution de la colonne avant l'étape b) est réalisée à un pH supérieur à 3.5, et notamment à un pH d'environ 4. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'invention a été obtenue par un procédé de fractionnement de cryo- surnageant de plasma sanguin comprenant les étapes consistant à : a) Soumettre du cryo-surnageant à une chromatographie échangeuse d'anions à un pH supérieur ou égal à 5, avantageusement à pH supérieur ou égal à 6, supérieur ou égal à 7, supérieur ou égal à 8 ;
b) Soumettre la fraction éluée issue de l'étape a) à une première chromatographie échangeuse d'ions ou mode mixte,
c) Soumettre la fraction non retenue issue de l'étape b) à une seconde chromatographie échangeuse d'ions ou mixe mode, et optionnellement
d) Soumettre la fraction non retenue issue de l'étape c) à un traitement thermique, en particulier à une pasteurisation, à une température comprise entre 50°C et 70°C, préférentiellement environ 60°C, pendant un temps compris entre 1 heure et 15 heures, préférentiellement au moins 10 heures.
Selon l'invention, il est également possible de purifier l'albumine à partir d'un concentré d'albumine humaine recombinante. Dans un mode de réalisation particulier, l'albumine est purifiée à partir d'un lait transgénique d'un mammifère non-humain. Avantageusement, le procédé de purification comprend alors une étape préliminaire de délipidation avant toute étape de chromatographie. Dans un autre mode de réalisation, l'albumine est purifiée à partir d'un surnageant de culture de cellules recombinantes exprimant l'albumine humaine.
D'une manière générale, le concentré d'albumine issu de ces procédés de purification est soumis à une ou plusieurs étapes d'inactivation virale, telle qu'une pasteurisation et/ou une nanofiltration.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le concentré d'albumine est soumis à une étape de pasteurisation. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape de pasteurisation est réalisée dans des conditions permettant de limiter le clivage N-terminal et C- terminal et/ou de limiter les phénomènes de cystéinylation. Ainsi, l'étape de pasteurisation est avantageusement mise en œuvre en maintenant constante la température (environ 60°C) pendant toute la durée de l'étape de pasteurisation (environ lOh) et/ou en contrôlant l'ajout des excipients stabilisants tels que le caprylate et/ou le tryptophanate.
A l'issu du procédé de fractionnement, la composition d'albumine est avantageusement soumise à une étape de répartition dans des contenants de stockage et/ou d'administration, tels que des flacons, des poches, des seringues, ou tout autre dispositif permettant le stockage et/ou l'administration du produit aux patients. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étape de répartition est effectuée de manière à limiter les phénomènes d'oxydation de la composition d'albumine. Par exemple, l'étape de répartition est réalisée en atmosphère contrôlée, avantageusement en l'absence d'oxygène et/ou en présence d'un gaz inerte tel que l'azote. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la répartition en contenant de stockage et/ou d'administration comprend une étape d' inertage (remplacement de l'air contenu dans le volume mort du contenant par un gaz inerte et préférentiellement l'azote) et/ou de bouchage sous gaz inerte, par exemple sous azote.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le contenant de stockage et/ou d'administration de la composition d'albumine est avantageusement constitué de matériaux non perméables à l'oxygène.
L'albumine issue de tels procédés de purification est majoritairement récupérée sous forme native, c'est-à-dire non-oxydée et non tronquée. Il est alors possible de réaliser des compositions d'albumine à usage thérapeutique présentant une très grande activité antioxydante et anti-radicaux libres comparativement aux compositions d'albumine actuellement disponibles.
Ainsi, l'invention propose une composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique comprenant de l'albumine humaine et un sel de sodium, au moins 50% en poids de ladite albumine étant sous forme native, c'est-à-dire présentantun poids moléculaire d'environ 66.438 Da. Dans un mode de réalisation particulier, au moins 60%, préférentiellement au moins 65% en poids de ladite albumine est sous forme native, et préférentiellement au moins 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% en poids de ladite albumine est sous forme native. Selon les besoins, la composition peut comprendre entre 10 et 300 mg/mL d'albumine, soit entre 1% et 30% en poids d'albumine par rapport au poids total de la composition. Notamment, la composition peut comprendre de manière classique entre 40 et 50 mg/mL ou entre 200 et 250 mg/mL d'albumine. Cependant, dans la mesure où la majorité de l'albumine présente dans ladite composition présente une activité accrue comparativement à albumine des compositions actuellement disponibles, il peut être intéressant de prévoir pour le traitement de certaines pathologies des concentrations moindre, et notamment de l'ordre de 10, 15, 20, 25, 30 ou 35 mg/mL.
Selon l'invention, la composition comprend avantageusement moins de 30% d'albumine sous forme oxydée et/ou moins de 20% d'albumine tronquée.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend avantageusement moins de 30% d'albumine sous forme oxydée, préférentiellement moins de 25% d'albumine sous forme oxydée et préférentiellement moins de 22%, 20%, 18%, 15%, 10%, 5% d'albumine sous forme oxydée. Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend avantageusement moins de 20% d'albumine tronquée, préférentiellement moins de 15% d'albumine sous forme oxydée et préférentiellement moins de 12%, 10%, 8%, 5% d'albumine sous forme tronquée.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition d'albumine comprend en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, en particulier des excipients permettant de limiter les phénomènes d'oxydation, tels que les anti-oxydants naturels de l'organisme, en particulier la N-acétyle-méthionine, la N-acétyle-méthionine sodium octanoate, le glutathion réduit, l'acide urique, l'acide alpha-lipoïque, le disodium EDTA, les flavonoïdes, en particulier les flavonols tels que la rutine, qui quenchent, ou neutralisent, les espèces oxygénées réactives, tels que les radicaux libres de types I et II.
La composition d'albumine de l'invention comprend en outre au moins un sel de sodium, préférentiellement choisi parmi le chlorure de sodium, le caprylate de sodium, le carbonate de sodium et l'acétyltryptophanate de sodium.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'invention comprend entre 2.5 et 3.5 mg/mL de sel de sodium. L'invention a notamment pour objet une composition d'albumine humaine à usage thérapeutique comprenant de l'eau, environ 40 mg/mL d'albumine et environ 3.5 mg/mL de sel sodium, préférentiellement de chlorure de sodium et caprylate de sodium, dans laquelle au moins 60% de l'albumine a un poids moléculaire d'environ 66.438 Da. L'invention a également pour objet une composition d'albumine humaine à usage thérapeutique comprenant de l'eau, environ 50 mg/mL d'albumine et environ 3.5 mg/mL de sel sodium, préférentiellement de chlorure de sodium et caprylate de sodium, dans laquelle au moins 60% de l'albumine a un poids moléculaire d'environ 66.438 Da.
L'invention a également pour objet une composition d'albumine humaine à usage thérapeutique comprenant de l'eau, environ 200 mg/mL d'albumine et environ 3.5 mg/mL de sel sodium, préférentiellement de chlorure de sodium et caprylate de sodium, dans laquelle au moins 60% de l'albumine a un poids moléculaire d'environ 66.438 Da.
Dans le cas où l'albumine de la composition selon l'invention est issue de plasma sanguin, la composition peut en outre comporter une ou plusieurs protéines plasmatiques parmi la transferrine, les immunoglobulines G et l'haptoglobine, généralement co-purifiées avec l'albumine. La transferrine et l'haptoglobine peuvent avantageusement renforcer le caractère antioxydant de la composition d'albumine sans induire d'effets secondaires notables, tandis que les immunoglobulines G peuvent permettre de limiter les infections bactériennes ou virales.
La composition d'albumine selon l'invention est préférentiellement une solution aqueuse. La composition d'albumine de l'invention est utile en thérapie, et notamment sous forme injectable, par voie intraveineuse.
L'invention vise également une composition d'albumine humaine à usage thérapeutique telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de nombreuses maladies et notamment les déficits rénaux, les déficits hépatiques, les maladies neurodégénératives, les chocs hypovolémiques, les syndromes de détresse respiratoire chez l'adulte (ARDS), les maladies hémolytiques du nouveau-né.
Du fait de son activité anti-oxydante et anti-radicaux libres accrue, la composition selon l'invention est particulièrement utile pour le traitement ou la prévention des maladies neurodégénératives, et notamment Alzheimer. De même, du fait de la préservation de l'extrémité N-terminale de l'albumine, la composition selon l'invention peut s'avérer particulièrement efficace dans le traitement et la prévention des maladies liés aux métaux lourds, telles que maladie de Menkès dont les sujets atteints présentent un déficit en transporteur du cuivre, ou la maladie de Wilson dont les sujets atteints présentent une surcharge en cuivre dans les tissus.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d'un concentré d'albumine à partir de plasma sanguin Principe
Dans cet exemple, l'albumine du plasma est adsorbée après déplétion des immunoglobulines sur un support de chromatographie dont le ligand chimique est une aminé primaire : le gel HEA- Hypercel.
Du plasma dépiété en IgG, récupéré à l'issu du procédé de purification des IgG selon un procédé d'extraction en continu par chromatographie multicolonnes d'affinité est utilisé, l'albumine n'étant pas du tout fixé au gel d'affinité utilisé.
Le plasma dépiété en IgG a été obtenu selon les étapes suivantes :
Des poches de plasma humain ayant permis de constituer un pool de plasma d'environ 30L comprenant entre 8 et 10 g/L-1 d'IgG ont été décongelées dans un bain marie à 37°C sans que le produit ne dépasse la température interne de 25°C afin d'extraire par une chromatographie multicolonnes d'affinité les immunoglobulines.
La composition des solutions tampon utilisées lors des différentes étapes du procédé de chromatographie multicolonnes d'affinité est résumée dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Solutions tampon pour la chromatographie multicolonnes d'affinité
Pour la chromatographie multicolonnes, un gel d'affinité CaptureSelect FcXL de la société Life Technologies (Réf. 1943280 IL, lot n° 200814-03) a été utilisé. Le ligand d'affinité utilisé est un ligand de la société BAC (BioAffinityCompany), qui fixe spécifiquement le domaine CH3 des 4 sous-classes des IgG humaines.
4 colonnes radiales de la société Proxcys, (MD 122 MK III - Volume de gel : 250 mL par colonne pour un volume total de gel d'affinité de 1,0 L de gel; hauteur de gel : 12 cm ; ratio diamètre d'entrée/diamètre de sortie : 2/1) ont été utilisées en combinaison avec un automate Pilote BioSc M (Novasep).
Les 4 colonnes ont été pilotées de façon séquentielle par l'automate avec une charge en plasma correspondant à 21 g d'IgG.L"1 de gel, un temps de contact de 3 à 4 minutes, àpH d'adsorption du plasma non modifié compris entre 7,1 et 7,8, l'élution étant réalisée avec une solution d'acide acétique à pH 3,0 Le gel a été régénéré après chaque chromatographie. Le débit de travail était de 76,4 mL.min"1 ce qui correspond à un temps de contact de 3,3 min lors de l'adsorption. Le déroulement des étapes de la chromatographie d'affinité multicolonnes est résumé dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Etapes de la chromato graphie d'affinité multicolonnes
VC : volume colonne
Les caractéristiques de la fraction plasmatique déplétée en IgG sont:
Albumine humaine à 16 g/L, pH=6.5, conductivité de 12 mS/cm, en tampon citrate La composition des solutions tampon utilisées lors des différentes étapes du procédé de chromatographie multicolonnes à échange d'ions pour la purification de Γ albumine est résumée dans le tableau 3 ci-dessous.
Solutions tampon pour la chromatographie multicolonnes à échange d'ions HEA-
Gels de chromatographie échangeuse d'ions pour la capture de l'albumine :
Pour la chromatographie multicolonnes de l'albumine, un gel « mixed-mode sait tolérant » de typeHEA Hypercel (gel échangeur d'anions et mode mixte) a été utilisé.
5 colonnes radiales en série de 10 mL chacune ont été utilisées en combinaison avec un automate BioSc Lab (Novasep). Six cycles de 164 minutes chacun sont réalisés, soit 17 heures environ de fonctionnement continu.
Les conditions de chromatographie multicolonnes appliquées dans cet exemple ont permis de confirmer une capture quasi complète de l'albumine, très peu d'albumine restant dans la fraction non adsorbée. Le tableau 4 ci-dessous résume les rendements dans chaque fraction collectée et la pureté minimale atteinte dans la fraction d'intérêt purifiée. Tableau 4 : rendement en albumine et estimation de la pureté par électrophorèse SDS-PAGE
Seulement 3,4% environ de l'albumine n'a pas été adsorbé. On observe une pureté électrophorétique de 80% environ. Après l'élution à pH=3.9 un rendement de 88% a été obtenu. L'éluat HEA est alors neutralisé à pH 6.5 par ajout de solution de NaOH 0,5N. Un échantillon est prélevé (référence : éluat 1 pH ajusté HEA-Hypercel).
La fraction non retenue peut ensuite être passé sur une colonne dédiée à la purification du fibrinogène.
Gels de chromatographie échangeuse d'ions et mode mixte pour la capture des contaminants de l'albumine :
Afin d'améliorer la pureté de la préparation en albumine, il est possible d'adsorber spécifiquement les protéines co-purifiées lors de la chromatographie HEA.
Un gel d'échanges d'ions classique (DEAE-Macroprep) dont on a préalablement observé l'absence de réactivité à l'albumine à pH 6,5 a d'abord été utilisé. Le passage de la fraction « Eluat 1 pH ajusté HEA-Hypercel » à travers ce gel a été récupéré en totalité avec une légère dilution due au déplacement de volume par du tampon Citrate 0.01M, NaCl 0.1M, ajusté pH=6.5. Un échantillon de la fraction non adsorbée (référence : NA+L DEAE-Macroprep ) a été Prélevé. Une concentration sur membrane d'ultrafiltration (Biomax lOkD Merck Millipore) a permis de reconcentrer l'albumine à 40 g/L avant passage sur un second gel de chromatographie capturant les contaminants de l'albumine également à pH 6,5. Le gel MEP HyperCel a été utilisé car l'albumine ne présente pas d'interaction au groupement mercapto- ethyl-pyridine très faiblement ionique à ce pH. Des adsorptions par interactions hydrophobes sont recherchées sur le noyau pyridine notamment celle ciblées contre les immunoglobulines résiduelles et/ou d'autres protéines telles que la transferrine, la ferritine et l'haptoglobine. Après passage de la solution concentrée sur le gel, une légère dilution due au déplacement de volume par du tampon Citrate 0.01M, NaCl 0.1M, ajusté pH=6.5 a été réalisée. Un échantillon de la fraction non adsorbée a été prélevée (référence : NA+L MEP HyperCel). Enfin la solution a été stabilisée par ajout de caprylate de sodium à 3 g/L et chauffée au moins 2 heures à 60°C afin de floculer les traces de protéines thermosensibles. Un dernier échantillon a été prélevé après une filtration au seuil de 0,2 μηι (référence « Final traité thermiquement »).
Tableau 5 : Rendements obtenus lors des étapes de capture des contaminants de l'albumine plasmatique
En appliquant un tel procédé, le rendement final en albumine est de 76%. Le profil SDS PAGE correspondant à ces essais montre que le produit pasteurisé présente une pureté supérieure à 90% en SDS PAGE (figure 5).
Exemple 2 : Caractérisation du concentré d'albumine obtenu à l'exemple 1
L'état d'oxydation de clivage de l'albumine a été analysé à différentes étapes du procédé de capture et de purification en continu de l'albumine à partir d'un échantillon de plasma sanguin :
Eluat 1 pH ajusté HEA (Hypercel)
NA+L DEAE (Macroprep)
NA MEP (Hypercel)
Final traité thermiquement
L'albumine est injectée sur une colonne de phase inverse C4 et analysée en ESI-MS. La spectrométrie de masse électrospray donne une mesure de masse précise suffisante pour évaluer l'hétérogénéité de l'albumine. Les masses expérimentales sont comparées aux masses théoriques.
Matériel et Méthodes
20 μg de concentré d'albumine obtenu à l'issu du procédé selon l'exemple 1 sont injectés sur une colonne de phase inverse C4 (2.1 x 150 mm, 300 A, 1.7 μιη) thermostatée à 60°C. Les phases mobiles utilisées sont : ¾0 à 0.1% TFA (A) et acétonitrile contenant 0.1% de TFA (B). L'élution est réalisée en utilisant un gradient de phase B à un débit de 200 μL/min.
L'éluat est analysé en ligne par spectrométrie de masse sur un appareil de type ESI-Q-TOF (Synapt, Waters).
Résultats
La masse expérimentale majoritaire de 66.438 Da observée pour les différentes étapes du procédé de purification de l'albumine (figures 1-4), correspond à la masse de l'albumine native (masse théorique : 66.438 Da).
Les autres formes observées sur les spectres déconvolués sont minoritaires, les deux formes les plus importantes de masses expérimentales observées de 66.558 Da et 66.601 Da correspondent respectivement à l'albumine modifiée par une cystéinylation (masse théorique : 66.559 Da) et à une glycation de l'albumine (masse théorique : 66.600 Da).
Les autres formes, de masses expérimentales 66.253 Da, 66.325 Da et 66.719 Da correspondent respectivement à la perte du N-terminal (-Asp1+Ala2), à la perte du C- terminal (-Leus8s) et à une cystéinylation + glycation de l'albumine.
Le tableau 6 ci-dessous récapitule les masses expérimentales obtenues pour les spectres de masse déconvolués de l'albumine à chaque étape de purification.
Tableau 6 : Poids moléculaire de Γ albumine aux différentes étapes du procédé de purification
: Albumine présentant une extrémité N-terminale tronquée ne comprenant pas les résidus acide aspartique et alanine N-terminaux
** : Albumine présentant une extrémité C-terminale tronquée ne comprenant pas le résidu leucine C-terminal
*** : Albumine présentant un groupement cystéine et/ou une glycation additionnelle
L'analyse de l'albumine par HPLC-MS montre que l'albumine obtenue par le procédé de purification mettant en œuvre une succession de chromatographies et aucune étape de précipitation à l'éthanol reste comparable aux différentes étapes dudit procédé.
Ccomme cela est résumé au tableau 7 ci-dessous, la forme majoritaire correspond à une albumine présentant une cystéine libre réduite (forme native, non-oxydée et non tronquée), les formes minoritaires correspondent aux formes tronquées (en N-ter et C-ter), oxydées (cysténylées et cysténylées/glyquées) et glyquées. Tableau 7 : Pourcentage des différentes formes d'albumine dans la composition d'albumine obtenue à l'issu du procédé de purification
Exemple 3 : Caractérisation des protéines contaminantes dans le concentré d'albumine Le concentré d'albumine de l'exemple 1 a été analysé, afin de déterminer les autres protéines plasmatiques présentes.
Principe
Après dénaturation, réduction, alkylation et digestion à la trypsine de l'albumine finale traitée thermiquement, le mélange de peptides obtenu est séparé et analysé par nanoLC-MS/MS. Le résultat est ensuite retraité par le logiciel Peaks studio et envoyé dans des banques de données afin d'analyser les protéines accompagnantes présentes à l'issue du procédé.
Matériel et Méthodes
200 ng du mélange trypsique est injecté sur une colonne nanoLC de phase inverse C18 thermostatée à 25°C. Les phases mobiles utilisées sont : H20 à 0.1% TFA (A) et acétonitrile contenant 0.1% de TFA (B). L'élution est réalisée en utilisant un gradient de phase B à un débit de 300nl/min.
L'éluat est analysé en ligne par spectrométrie de masse sur un appareil de type LTQ Orbitrap (Thermo).
Résultats MPT fixés : MPT fixes : carbamidométhylation
MPT variables : Déamination, oxydation
- Banque de données : HUM AN (de 04/2015)
Le tableau 8 ci-dessous présente l'ensemble des résultats obtenus après traitement du résultat. Tableau 8 : Liste des protéines présentes dans le concentré d'albumine final traité thermiquement
Le concentré d'albumine selon l'invention présente un faible taux de protéines contaminantes, le rendant avantageux pour son usage thérapeutique. Exemple 4 : Préparation de compositions d'albumine humaine à usage thérapeutique
A partir de la composition d'albumine obtenue à l'exemple 1, des formes concentrées par ultrafiltration à 40, 50, 200 et 250 g/L sont préparées, stabilisées par des sels caprylate de sodium, et pasteurisées selon les méthodes classiquement utilisées dans les préparations commerciales sans limitation de dose ou de concentration.
Exemple 5 : Comparaison de la composition d'albumine obtenue à l'exemple 1 avec une composition d'albumine de l'art antérieur
La composition d'albumine obtenue à l'exemple 1 et un produit de l'art antérieur (Albuminar® de CSL) ont été analysés par spectrométrie de masse.
Matériel et Méthodes
20 μg de concentré d'albumine obtenu à l'issu du procédé selon l'exemple 1 ont été injectés sur une colonne de phase inverse C4 (2.1 x 150 mm, 300 A, 1.7 μιη) thermostatée à 60°C.
Les phases mobiles utilisées sont : ¾0 à 0.1% TFA (A) et acétonitrile contenant 0.1% de TFA (B). L'élution a été réalisée en utilisant un gradient de phase B à un débit de 200 μL/min.
L'éluât a été analysé en ligne par spectrométrie de masse sur un appareil de type ESI-Q-TOF (Synapt, Waters).
Résultats
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 6 (spectre de la composition d'albumine Albuminar® de CSL Behring) et la figure 7 (spectre de la composition d'albumine selon l'invention, obtenue à l'exemple 1).
L'analyse des spectres montre une forte proportion des formes oxydées et cysteinylées dans le produit Albuminar®, comparé à la composition selon l'invention.
Ces résultats confirment que la composition selon l'invention comprend une quantité plus importante d'albumine non oxydée, non cysténinylée et non clivée en N/C-ter que la composition de l'art antérieur.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique, dans laquelle au moins 50% de l'albumine présente un poids moléculaire 66.438 Da, plus ou moins 5 Da, préférentiellement plus ou moins 2 Da, ladite composition comprenant en outre un sel de sodium.
2. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon la revendication 1, comprenant entre 10 et 300 mg/ml d'albumine.
3. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon la revendication 1 ou 2, comprenant entre 40 et 50 mg/ml d'albumine.
4. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon la revendication 1 ou 2, comprenant entre 200 et 250 mg/ml d'albumine.
5. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant moins de 30% d'albumine sous forme oxydée et/ou moins de 20% d'albumine présentant une extrémité C-terminale ou une extrémité N- terminale tronquée.
6. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, ladite composition comprenant entre 2.5 et 3.5 mg/ml de sel de sodium.
7. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'albumine a été obtenue par un procédé de purification dépourvu d'étape de précipitation.
8. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'albumine a été obtenue par un procédé de purification dépourvu d'étape de précipitation éthanolique.
9. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'albumine a été obtenue par un procédé de purification dépourvu d'étape de cryoprécipitation.
10. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'albumine a été obtenue par un procédé de purification comprenant une chromatographie positive suivie d'une chromatographie négative.
11. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite albumine humaine a été purifiée à partir de plasma sanguin.
12. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon la revendication 11, ladite composition comprenant en outre au moins une protéine plasmatique parmi la transferrine, les immunoglobulines G, l'haptoglobine.
13. Composition liquide d'albumine humaine à usage thérapeutique selon les revendications 1 à 12, dans laquelle ladite albumine est une albumine recombinante purifiée à partir d'un lait transgénique de mammifère non-humain.
14. Composition lyophilisée obtenue par lyophilisation d'une composition liquide d'albumine humaine selon l'une quelconque des revendications précédentes.
15. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation dans le traitement d'un déficit rénal, d'un déficit hépatique, d'une maladie neurodégénérative, d'un choc hypovolémique, d'un syndrome de détresse respiratoire chez l'adulte (ARDS), d'une maladie hémolytique du nouveau-né.
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