EP3861125A1 - Méthode et dispositif pour la détection d'au moins un microorganisme selon sa cinétique de marquage, et support de détection - Google Patents

Méthode et dispositif pour la détection d'au moins un microorganisme selon sa cinétique de marquage, et support de détection

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Publication number
EP3861125A1
EP3861125A1 EP19779504.0A EP19779504A EP3861125A1 EP 3861125 A1 EP3861125 A1 EP 3861125A1 EP 19779504 A EP19779504 A EP 19779504A EP 3861125 A1 EP3861125 A1 EP 3861125A1
Authority
EP
European Patent Office
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detection
support
sample
marker
cell marker
Prior art date
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Pending
Application number
EP19779504.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Joseph Pierquin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Redberry SAS
Original Assignee
Redberry SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Redberry SAS filed Critical Redberry SAS
Publication of EP3861125A1 publication Critical patent/EP3861125A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G06T7/0014—Biomedical image inspection using an image reference approach
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof
    • H04N23/56—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof provided with illuminating means
    • G—PHYSICS
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    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
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    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
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    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
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    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10064—Fluorescence image
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    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro
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    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30204—Marker
    • G—PHYSICS
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    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30242—Counting objects in image

Definitions

  • the present invention relates to the field of detection of microorganisms of the bacteria, yeast and mold type in the solid phase.
  • the present invention will find its application mainly in the field of industrial microbiology, for example, but not limited to, in the pharmaceutical, biotechnological, cosmetic or food industries, or even in clinical or environmental microbiology.
  • the invention relates more particularly to a device and a method allowing extremely early detection of microorganisms in solid phase, on suitable supports, and this without necessarily requiring culturing of said microorganisms with a view to their multiplication.
  • the most conventional and oldest method consists in depositing a sample, possibly after filtration, on the surface of an agar and nutritive growth medium, the latter being more or less selective of one or more types ( s) microorganisms.
  • Said medium is then incubated at the temperature suitable for the growth of the microorganism sought, for a period which can often go up to several days, before an operator proceeds to a “manual” counting of the colonies visible to the naked eye.
  • Such a method although very sensitive and allowing the detection of a single viable and cultivable contaminant in the initial sample, has the disadvantage of requiring a relatively long incubation period to allow detection with the naked eye of colonies that have formed on the agar.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) turbidimetry for example, the absorbance measured being proportional to the concentration of microorganisms present in the medium.
  • liquid phase detection techniques do not allow microbial concentrations below 10 6 or 10 7 cells / mL to be detected. Thus, the sample must again be incubated for a variable time in order to reach such a cell concentration.
  • microorganisms under the effect of stress, for example thermal stress, or else due to the presence of inhibiting agents in a sample, can take a particularly long time to multiply, further prolonging the moment. where they will be detectable by traditional cultivation techniques.
  • PCR amplification it is also known, in the prior art, to carry out a polymerase chain reaction, also called PCR amplification, to determine the presence of specific microorganisms within a sample, by amplification of a DNA sequence or RNA.
  • the flow cytometry technique is commonly used today to detect and count microorganisms present in a sample.
  • cells or particles which can be labeled with a fluorophore and suspended in a liquid, are isolated one behind the other in the form of a single cell flow. They are then routed one by one, and at high speed, through a light source, for example a light beam from a laser.
  • a light source for example a light beam from a laser.
  • the light scattered and emitted by the cells which is fluorescent in the case of labeling with a fluorophore after excitation of the latter at a given wavelength, is directed, by a system of mirrors and filters constituting the optical device from the cytometer, to a set of light detectors.
  • These detectors incorporate, in particular, photomultipliers which will make it possible to convert the light signals into electrical signals which can then be analyzed by a computer in order to generate data relating, for example, to the physical characteristics of the cells.
  • the flow cytometers currently available on the market are capable of analyzing several hundred cells, or "events" per second, in real time, and some of these devices can be configured so as to allow sorting of the cells or particles into based on their optical properties.
  • flow cytometry has a limited sensitivity, evaluated, in the best of cases, between 10 2 and 10 3 cells / ml of suspension, and dependent on the matrix.
  • a sample to be analyzed is filtered through a membrane allowing the retention of microorganisms likely to be contained in said sample.
  • microorganisms are then marked with a fluorochrome, for example acridine orange which interacts with DNA or RNA, then counted by visual analysis of several fields of the membrane using an epifluorescence microscope.
  • a fluorochrome for example acridine orange which interacts with DNA or RNA
  • the microorganisms possibly present on said membrane are subjected to a labeling step using a fluorophore.
  • the entire surface of the membrane is then scanned with a laser beam to excite the fluorophore and count any microorganisms present and viable in the initial sample to be analyzed, by measuring the fluorescence emitted.
  • ChemScan RDI registered trademark
  • the toxic effects of the reagents used, on cell metabolism are capable of preventing a subsequent culture, for the purpose of identification, of said microorganisms.
  • this solid phase cytometry method is only applicable to filterable matrices, and that the time required, from depositing the sample on a solid support until obtaining the results with the enumeration of microorganisms present on said solid support, is relatively large; the time is indeed estimated between, at least, 90 min, and can go, depending on the application, up to 4 hours.
  • inert particles for example dust
  • inert particles are also capable of emitting natural fluorescence, or even of combining with fluorochrome to emit parasitic florescence.
  • the methods implementing labeling of the cells with a fluorophore require manipulation of the sample by qualified personnel, as well as manipulation and bringing the fluorescent reagent into contact with the microorganisms to be detected, inevitably causing a risk of contamination of said sample.
  • the invention offers the possibility of overcoming, at least in part, the various drawbacks mentioned above of the state of the art by proposing a method and a device for the extremely early detection, almost instantaneous if necessary, of microorganism ( s) possibly present in a starting sample to be analyzed.
  • the method and the device of the invention are based on a detection and an analysis of the labeling kinetics of possible microorganisms by means of a cellular marker delivered in a controlled manner and without time-consuming manual operation and likely in particular to cause contamination. of the sample.
  • the present invention relates to a method of detection, on a solid detection support, of at least one microorganism, of the bacteria, yeast or mold type, present in a sample to be analyzed and revealed by at least one cell marker, said method comprising, at least, the following steps, taken in order: a) depositing said sample to be analyzed on said solid detection support;
  • At least one image I 0 is taken in a first phase P 0 of said sample on at least a portion of said detection medium by means of an optical device for taking pictures targeting an observation field of at least 10 mm long and at least 10 mm wide;
  • a controlled release of said at least one cell marker is carried out, through the detection support, for bringing said marker into contact with said microorganism;
  • a comparative analysis is carried out, by portion of the detection medium, between said image I 0 taken at P 0 and each image I ⁇ taken in at least one subsequent phase P ⁇ and we conclude as to the presence or not of at least one microorganism in said sample.
  • said detection medium is punctually illuminated via light radiation each time an image is taken at P 0 , P ⁇ .
  • the method of the invention comprises, at least, the following steps, taken in order:
  • At least one image I 0 , I'o is taken in a first phase P 0 of said sample on at least a portion of said detection medium by means of an optical device for shots aimed at a field of view at least 10 mm long by at least 10 mm wide;
  • a controlled release of said at least one cellular marker is carried out, through the detection support, for bringing said marker into contact with said microorganism;
  • step dl) of controlled release of said cell marker said detection medium is punctually illuminated via said light radiation capable of revealing said at least one cell marker
  • an image Ii is taken, by means of said optical device, I'i of each portion of the detection medium which has been the subject of an image at P 0 in at at least one subsequent phase Pi following the step of controlled release of said marker;
  • said detection medium is again punctually, at least once, via said light radiation;
  • a comparative analysis is carried out, by portion of the detection medium, between said image I 0 , I'o taken at P 0 and said images Ii, I'i; I 2 , I ' 2 taken in at least two subsequent phases Pi and P 2 and it is concluded as to the presence or not of at least one microorganism in said sample.
  • the detection support is subjected to n displacements according to distinct paths with a view to a spatial division of said detection support into n + 1 portions subject to shots in at least two phases P 0 and Pi, n being an integer less than or equal to 20;
  • an optical device is used during the image taking steps c) and e) or cl), fl) and hl) having a resolution at least equal to 20 megapixels, and preferably greater than 100 megapixels;
  • said cell marker is a fluorescent marker
  • said cell marker released in a controlled manner during step d) or dl) is enveloped in an encapsulation means in solid form, for example in the form of a powder
  • said detection support comprises a delivery solvent in solution of said marker
  • said cell marker is enveloped in an encapsulation means in liquid form
  • encapsulation means is heat-sensitive and, in step d) or dl), a controlled release of the cell marker wrapped in said heat-sensitive encapsulation means is carried out by subjecting the latter to an increase in temperature capable of making melting said heat-sensitive encapsulation means, for example by increasing the temperature from room temperature to a maximum temperature of 45 ° C;
  • the cell marker in liquid solution is conveyed in a controlled manner to said solid detection support containing the sample to be analyzed; a volume between 10 and 2000 ⁇ L of said sample to be analyzed is directly deposited on said detection support, said sample to be analyzed is filtered through a filtering membrane having a cut-off threshold of between 0.2 and 0.45 ⁇ m, preferably a cutoff threshold equal to 0.3 ⁇ m, said filter membrane being positioned directly in said detection support;
  • the present invention also relates to a method for distinguishing microorganisms from dust on the detection supports having received the samples to be analyzed, characterized by:
  • the invention also relates to a device for detecting at least one microorganism, of the bacteria, yeast or mold type, present in a sample to be analyzed, capable of implementing the detection method of the invention, and comprising at least:
  • a solid detection support intended to receive said sample to be analyzed capable of containing at least one microorganism
  • an optical device for taking pictures of at least a portion of said detection medium, said optical device with a field of view of at least 10 mm long and at least 10 mm wide;
  • the device of the invention comprises means for moving said detection support under said optical device for taking pictures.
  • Said solid detection support comprises at least one filtering membrane resting on a fiberglass support disc;
  • said cell marker storage means is included in the detection support and consists of a layer of microcapsules made up of said cell marker wrapped in an encapsulation means, said layer of microcapsules being disposed between said glass fiber support disc and said filter membrane;
  • said means for controlled release of the cell marker comprises heating means and means for controlling and regulating the temperature capable of operating a temperature increase within the device and melting said encapsulation means enveloping the cell marker;
  • - Said cell marker storage means consists of a reserve of liquid cell marker solution separate from the detection medium and said detection device comprises means for conveying said cell marker from said storage means to said detection medium; in this case, said means of controlled release of the cellular marker can comprise at least one pump with controlled flow; - Said optical device for taking pictures has a depth of field of the order of or equal to 0.5 mm;
  • said optical device for taking pictures is based on a camera with CMOS sensors
  • - Said optical device for taking pictures has a field of vision of 25 mm * 25 mm;
  • - Said optical device for taking pictures has a resolution at least equal to 20 megapixels and preferably greater than 100 megapixels.
  • the invention also relates to a detection support capable of being implemented in the detection method according to the invention or entering into the composition of the detection device according to the invention and composed, at least, of a rigid base through which at least one liquid supply duct and at least one liquid suction and discharge duct, said supply duct being extended by a chimney projecting from said base and passing through, on the one hand , a first orifice formed in a rigid and permeable support means surmounting said base and, on the other hand, a second orifice formed in a flexible support disc made of glass fibers, said disc being positioned on said rigid and permeable support means and supporting a filter membrane having a cut-off threshold of 0.2 and 0.45 ⁇ m, suitable for the retention of microorganisms, said detection support further comprising a clamping ring fixedly attached to said insert ase and holding together said base, said rigid and permeable medium support, said support disc and said filter membrane.
  • the present invention has many advantages.
  • the present method based on the evaluation of the labeling kinetics of microorganisms, makes it possible to detect almost immediately, within minutes or tens of minutes at most following the preparation of a sample, and without necessarily requiring cultivation, the presence or absence of living microorganism (s) in said sample, while discriminating, in an extremely reliable manner, these microorganisms from possible artefacts, such as dust or the like.
  • the invention requires only a few manipulations of the sample, and in any case no manipulation of the cell marker, a complex operation involving the use of qualified personnel and presenting a non-negligible risk of contamination of said sample.
  • FIG. 1 illustrates, schematically, the different steps of two particular embodiments of depositing a sample on a solid detection support, these steps can be implemented in the method of detecting at least one microorganism according to the invention
  • FIG. 2 shows, schematically, a particular embodiment of implementation of the different steps of the detection method of the invention, including in particular the deposition of a sample on a detection medium, taking a image P 0 before marking said sample and then taking several successive images Pi to P 4 after controlled release of a cellular marker, and a comparative analysis of the different images to arrive at an analysis result;
  • Figures 3 ⁇ and 3B each schematically illustrate an exploded and perspective view, respectively in full and in a median section, of two nonlimiting exemplary embodiments of a detection support that can be implemented in the method or in the device the invention;
  • Figures 4 ⁇ and 4B each schematically illustrate an exploded and perspective view, respectively in full and in a median section, of an embodiment different from those shown in Figures 3A and 3B and particularly preferred of a support detection that can be implemented in the method or in the device of the invention;
  • FIG. 5 represents a particular embodiment of the detection method of the invention in which the sample to be tested is brought into contact with an encapsulated cell marker, in the form of microcapsules, and released in a controlled manner under the action of an external stimulus to allow the detection of microorganisms possibly present in the sample;
  • FIG. 6 shows a series of shots of Bacillus subtilis microcolonies, following a culture phase, the shot on the left I 0 having been carried out before the release of a cell marker while the other shots Ii at I 5 were carried out at regular time intervals following the controlled release of said marker, allowing the evaluation of a labeling kinetics of B. subtilis colonies by these successive shots;
  • FIG. 7 illustrates a series of five successive shots, referenced I ' 0 to I' 4 , of a detection support on which are present, on the one hand, a dust and, on the other hand, cells to detect in a test sample, in this case yeasts belonging to the genus Candida and to the species albicans.
  • the present invention relates, firstly, to a method of detection, on a solid detection support 1, 21, of at least one microorganism 2, or d 'A plurality of microorganisms 2, present (s), optionally but not necessarily, in a sample 3 which should be tested.
  • the said microorganism (s) 2 whether they are present in a single-cell form or in the form of microcolonies after a prior culture phase, are brought into contact with at least one cell marker 4.
  • the term “cell marker” is intended to mean a substance capable of demonstrating by light emission, in particular fluorescence, possibly by bioluminescence, or even by coloring, the microorganisms optionally present in a starting sample to be tested.
  • this cellular marker can preferably be a fluorescent marker capable of demonstrating only viable microorganisms or of differentiating viable microorganisms from non-viable microorganisms, or even capable of only marking certain pathogenic microorganisms of interest.
  • sample 3 to be tested can come, for example but not limited to, from a pharmaceutical or food industry, or consist of a sample either of human origin in clinical or medical microbiology, or of environmental origin, and microorganisms 2 to detect in said sample 3 are of the bacteria, yeast or mold type, mainly.
  • a) of the detection method according to the invention the sample 3 to be tested is deposited on said solid detection support 1, 21 preferably comprising at least one filtering membrane 5, 25.
  • the sample 3 to be analyzed consists of a liquid matrix, with a volume which can range from 1 ml at 500 mL, filtered through a detection support 1 comprising, at least, a filter membrane 5, said support 1 being positioned on a device D suitable for filtration.
  • Said membrane 5 has an adequate cut-off threshold for retaining the microorganisms 2 possibly present in the sample 3 and mainly eliminating on the one hand, the residual liquid of said sample 3 and, possibly, on the other hand, impurities contained in the latter and smaller than the cutoff threshold.
  • said membrane 5, 25 preferably has a cutoff threshold of between 0.20 and 0.45 pm. Even more preferably, the cutoff threshold of this membrane 5, 25 is equal to, or of the order of, 0.30 ⁇ m.
  • Such a cut-off threshold makes it possible to retain, on the surface of said membrane 5, all the microorganisms 2 of the bacteria, yeast and mold type, the size of which varies between approximately 0.5 and approximately 10 ⁇ m, and which are liable to be present in sample 3.
  • the use of such a cut-off threshold promotes, in addition to the separation of microorganisms 2 from the rest of the sample 3, retention of the majority of inert particles (such as dust) which are also present at 'origin, in said sample 3.
  • the liquid sample 3, of volume between 1 and 500 ml is filtered through a filter membrane 5 on an appropriate filtration device D, said membrane 5 having a cutoff threshold of between 0.20 and 0.45 ⁇ m and preferably equal to 0.3 ⁇ m.
  • the filtering membrane 5 is extracted from the filtration device D to be deposited on the detection device 1.
  • Said detection support 1 can also be supplemented at least by a support disc 13 made of a permeable material, for example fiberglass.
  • Such a support disc 13 on which is brought to rest, possibly, the filter membrane 5 after removal of the latter from the device D to form, in this embodiment, the solid detection support 1, is illustrated in particular in the figures 3 ⁇ and 3B attached.
  • a direct inoculation of said sample 3 on the detection support 1, 21 comprising at least minus the membrane 5, 25 and the support disc 13, 23 as illustrated in the upper part of FIG. 1.
  • said detection medium 1 is inserted into a fully automated detection device 14 capable of implementing the method of the invention. Said device 14 will be described in more detail later.
  • step a) of depositing the sample 3 implements a detection support 21 configured to allow, quite preferably, either the deposition of a small volume of sample 3 between 10 and 2000 ⁇ L on a filter membrane 25, ie direct filtration of a larger volume of sample 3 and greater than 2000 ⁇ L, typically up to a volume of 100 ml, without going through a filtration device D dedicated to this operation and outside the detection device 14.
  • Filtration of the sample 3, even in the case where a small volume is deposited on the filtering membrane, can be envisaged, in an automated manner, in the detection device 14.
  • the detection support 21 will be described in detail in the following description, with reference to Figures 4 ⁇ and 4B.
  • these operations of handling and depositing the sample 3 on the support 1, 21 can preferably be carried out by an operator in a sterile atmosphere, for example by carrying out said operations under a microbiological safety station PSM , visible in Figure 1.
  • PSM microbiological safety station
  • the detection support 1, 21 containing said sample 3 is illuminated at least once by means of light radiation 6 capable to the visualization or the revelation of said cell marker 4.
  • At least one image I 0 , I'o, of the sample 3 is taken during a step c) on at least a portion of said detection support 1, 21, in a first phase P 0 , two examples of images I 0 , I'o being visible in FIGS. 6 and 7.
  • the taking of images during the process of the invention is preferably carried out by means of an optical device 7 for taking pictures having a higher optical resolution or equal to 20 megapixels, preferably greater than 100 megapixels, allowing detection of labeled microorganisms having a size at least equal to 0.5 ⁇ m on a predetermined surface.
  • said optical device 7 in fact has a relatively wide field of observation, typically at least 10 mm long by at least 10 mm wide, and, more preferably still, this field of observation is 25 * 25mm, so that you can, for example, take the entire detection medium 1, 21 in a single image.
  • said optical device 7 has a depth of field of +/- 0.5 mm in order to overcome any flatness defects of the membrane 5, 25 of said detection support 1, 21.
  • step c) a single image I 0 , I'o of the entire surface of the detection support 1, 21 is taken.
  • the size of the detection medium 1, 21 is too large for it to be viewed by means of a single image capture, and to be able to observe a wider field without invest in a non-standard optical device under economic conditions which are therefore much less favorable, than subjecting said detection medium 1, 21 to n displacements according to distinct paths, n being an integer greater than 1 and less than or equal to 20, and more preferably still less than or equal to 10.
  • a spatial division of said detection medium 1, 21 is allowed into n + 1 portions, each of said portions being the subject of at least one shot at the instants of taking pictures. , in particular at P 0 and during at least one subsequent phase P ⁇ described in more detail below, the sum of the shots of the different portions then allowing a visualization of the entire detection support 1, 21 to each of the different phases P 0 , P ⁇ .
  • I'o proceed to a step d) of controlled release of at least one cell marker 4, through said detection support 1, 21, so that said marker 4 comes into contact microorganisms possibly present in the starting sample 3 and deposited on the support 1, 21.
  • step d) of controlled release is more particularly illustrated in FIG. 5.
  • the cell marker 4 used in the method of the invention is a fluorescent marker.
  • This marker 4 can be advantageously selected by a person skilled in the art from all the cellular markers well known to him and commonly used, for example, in current cytometry techniques.
  • said cell marker can be selected, for example, from the following markers: DNA markers such as acridine orange, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole), PI (propidium iodide ), DRAQ7 * (Deep Red Anthraquinone 7), 7-AAD (7-aminoactinomycin D), TO-PRO-1 *, TO-PRO-3 *, SYTOX *, LDS 751, bromide ethidium, eosin 5'maleimide (EMA), amine reactive markers such as "Zombie Fixable *", “Fixable Viability Dye eFluor *", “LIVE / DEAD Fixable dead *", “Viobility Fixable * "," Horizon Fixable Viability * ",” ghost * ", esterase activity markers such as calcein AM (acetoxy methyl), cFDA (Carboxy-fluorescein diacetate),” CellTracker Green CMFDA * ", redox markers like
  • the light radiation 6 is selected from a laser beam and one, or more, light-emitting diode (s) (s), the latter solution being moreover particularly preferred.
  • step d it is also envisaged, during step d), to bring the possible microorganism (s) 2 into contact with at least one non-fluorescent but visible and detectable cell marker 4.
  • Said cell marker 4 may also consist of a bioluminescent marker, it being understood that in this case, the method for detecting microorganisms of the invention is implemented by eliminating the illumination step (s) of the detection support 1, 21. In other words, with the exception of the illumination of the support, all the other steps, variants and examples of embodiment of the method of the invention detailed in the present description are applicable to a method for detecting microorganisms by bioluminescence, if this proves to be suitable and conceivable, by implementing, of course, a suitable bioluminescent marker.
  • step d) of controlled release the cell marker 4 which it is desired to release in a controlled manner during the method of the invention is wrapped in an encapsulation means 8 thus advantageously forming a microcapsule, a microbead or a microsphere 9 having a diameter for example of the order of 100 ⁇ m.
  • the encapsulation means 8 is sensitive to the application of an external stimulus 10 leading to its rupture and the release of the cell marker 4.
  • the encapsulation means 8 consists of thermosensitive lipid waxes and the release of the encapsulated marker 4 is carried out by gradually applying a rise in temperature to said encapsulation means 8 so that the latter melts and releases the marker 4 on contact with potential microorganisms 2 to be detected.
  • the temperature to which said heat-sensitive encapsulation means 8 is subjected can gradually be increased from an ambient temperature to a temperature not exceeding 45 ° C., threshold beyond which destruction of certain microorganisms 2 could occur. .
  • the release of the cellular marker 4 is carried out in an automated manner, consequently making it possible to dispense with any manual operation which is a source of contamination, and is controlled so as to be done with the adequate quantity of marker 4 and good kinetics for effective labeling of microorganisms 2.
  • the cell marker 4 is encapsulated in liquid form, the microcapsule 9 then comprising, in addition to said marker 4, a solvent for dissolving the latter.
  • the cell marker 4 is encapsulated in solid form, in particular in the form of a powder. Following the release of the cell marker 4, the latter is then placed in the presence of an appropriate dissolving solvent, for example water, so that the labeling of the microorganisms 2 can be carried out.
  • an appropriate dissolving solvent for example water
  • the solvent for dissolving the solid cell marker 4 is contained in the support disc 13 made of glass fiber and the filtering membrane 5 through which the sample 3 has previously been passed is disposed above said support disc 13.
  • the support disc 13 can be imbibed with an appropriate solvent and maintained at a temperature capable of melting the encapsulation layer 8 thus releasing the cell marker 4 encapsulated in the form solid powder by simultaneously putting it in solution so that it reveals the possible presence of microorganisms 2 on the membrane 5.
  • step d) and when the step of depositing a) of the sample 3 of small volume (10 to 2000 ⁇ L) is carried out directly on the solid detection support 1, may again be composed of at least one support disc 13 and a filter membrane 5 framing a layer of microcapsules 9, said support disc 13 also has a support function for said microcapsules 9 to prevent them from s' evacuate with the filtered liquid at the time of removal.
  • the layer of microcapsules 9 is placed under the support disc 13, for example made of glass fibers, and said disc 13 ensures the diffusion by capillarity of said microcapsules 9 or of the cell marker 4 once it released in a controlled manner, as well as a homogeneous distribution of these microcapsules 9 diffused under the filtering membrane 5.
  • the cell marker 4 is conveyed directly in the form of a liquid solution, and in a controlled and automated manner, for example at a controlled rate through appropriate means, such as a controlled flow pump, for contacting with the microorganism (s) 2 present on the surface of the filter membrane 5, 25 of the detection support 1, 21.
  • said marker 4 whether it is preferably fluorescent, or else bioluminescent or not , most preferably has minimal toxicity with respect to microorganisms 2 potentially present on the membrane 5.
  • Such an identification step 12, illustrated in FIG. 2 can thus be carried out by culturing the sample 3 subsequent to detection, in particular by removing the filtering membrane 5, 25 and depositing that -this on an appropriate nutrient agar allowing the multiplication of microorganisms, then by the implementation of a conventional identification method and well known to those skilled in the art, for example by mass spectrometry.
  • a conventional identification method for example by mass spectrometry.
  • the method of detecting microorganism (s) following the step of controlled release of at least one cell marker 4, one takes, during a step e), and during at least one phase P ⁇ subsequent to phase P 0 , at least one image I ⁇ , i being an integer greater than or equal to 1.
  • FIGS. 6 and 7 a succession of images respectively I 0 to I 5 and I ' 0 to I' 4 , taken during phase P 0 and during several phases subsequent to P 0 , are illustrated.
  • Each image I ⁇ taken during at least one subsequent phase P ⁇ is, if necessary, cut into portions of said detection medium 1, 21.
  • Such a succession of image shots one (for example I 0 ) being carried out before the labeling of microorganisms 2 by controlled release of the cellular marker 4 and at least one other (I ⁇ ) after this release, makes it possible to characterize a kinetics of labeling of these microorganisms 2, in other words an evolution of the behavior, and in particular preferentially of the fluorescence, possibly of bioluminescence, of said microorganisms, corresponding to an assimilation of the marker 4 by the latter, between the first image taking I 0 without marker 4 and at least the second image taken I ⁇ after release of the latter.
  • FIGS. 6 and 7 according to a first image capture Ii, I'i during a first subsequent phase Pi, after a variable period of time, of the order of a few seconds to a few tens of seconds, for example between 10 and 30 seconds, an image I 2 , I ′ 2 is again taken of each portion of said support 1 having been taken from image during phases P 0 and Pi.
  • step e) of image taking I ⁇ after step d) of controlled release of the cell marker 4 and before l step f) of comparative analysis of the images I 0 , I'0; Ii, I'i; I 2 , I ' 2 , etc., the successive image captures Ii being spaced apart by a period of time between 10 and 30 seconds, preferably 20 seconds.
  • step e) of the present method is repeated three times successively before the comparative analysis step f), so as to generate three images Ii, I'i; I 2 , I ' 2 ; I 3 , I ' 3 , of each portion of the detection support 1, 21 having is the subject of an image at P 0 during subsequent phases of taking images respectively Pi, P 2 and P 3 .
  • five images are generated from Ii to I 5 or from I to I ' 5 (the image I' 5 not being shown in FIG. 7) of each of the portions of the detection support 1, 21 having been viewed during phase P 0 .
  • the microorganisms 2 hypothetically present in said sample 3 will be marked, preferably from the unicellular stage, in a short period of time, of the order of a few minutes, corresponding to the kinetics of the reactions of assimilation of the cellular marker 4 by the microorganism 2, thus allowing a result of rapid detection by taking images I 0 , I'o; Ii, I'i, etc., successive of the support 1, 21 after the marking during different phases P 0 , Pi, etc.
  • the biochemical reaction of assimilation thereof by a microorganism 2 can be, in particular, either an enzymatic reaction, or an oxido reaction. -reduction, or even an intercalation reaction of said marker between the bases of a nucleic acid.
  • the characterization of a labeling kinetics of the microorganisms 2 potentially present in the sample 3 to be tested also makes it possible to quickly differentiate the behavior of inert or dust particles, capable of emitting fluorescence naturally, from that of said microorganisms 2, resulting in a significant reduction in false positives in comparison with the systems proposed in the prior art.
  • a step g) of counting the microorganism (s) 2 present (s) in the sample 3 and on the detection support 1, 21 can be implemented.
  • This optional step g) can also be carried out by algorithm 11.
  • This algorithm 11 must therefore make it possible in particular to detect as accurately and quickly as possible, the presence or absence of microorganisms 2 on the images Ii , I'i; I 2, I ' 2 etc., by evaluating the evolution of the behavior of said microorganisms 2 over time, and by discriminating them from possible artefacts, in particular dust, and then counting these microorganisms 2.
  • the algorithm 11 is able to detect elements (dust, microorganisms, etc.), the dimensions of which are of the order of, or even less than, the resolution of the sensors of the optical device 7 for taking pictures. .
  • the variation in fluorescence intensity due to the labeling kinetics can be detected on a single pixel.
  • the size of the microorganism 2 is therefore not necessarily greater than the size of a pixel.
  • the intensity of light emitted by a microorganism 2 of size less than one pixel is just sufficient to illuminate said pixel. If this intensity may be insufficient to reliably detect the microorganism 2, the variation in intensity during labeling may be sufficient to detect it.
  • step e) of taking an image I ⁇ of the detection support 1, 21 according to the controlled release of the cellular marker 4 is carried out according to a time offset according to the release of said marker 4 typically comprised between 20 and 300 seconds , preferably between 80 and 160 seconds in the case of labeling with acridine orange for example.
  • the detection support 1, 21 is punctually illuminated via light radiation 6 capable of revealing the cellular marker 4, and this simultaneously, or almost simultaneously, with each of the images taken. , both the initial image capture I 0 , I'o of step b) in a first phase P 0 , and simultaneously with the image capture I ⁇ which takes place in at least one subsequent phase R ⁇ .
  • the detection support 1, 21 may not be illuminated by the light radiation 6.
  • the method of the invention has at least the following steps, taken in 1 order:
  • said detection support 1, 21 is punctually illuminated via a light radiation 6 capable of revealing said at least one cell marker 4;
  • At least one image I 0 , I'o is taken in a first phase P 0 of said sample 3 on at least a portion of said detection support 1, 21 by means of an optical device 7 for taking pictures having a resolution at least equal to 20 megapixels and a field of observation at least 10 mm long by at least 10 mm wide;
  • a controlled release of the cell marker 4, or even of a succession of cell markers 4 or reactive agents, is carried out, through the detection support 1, 21, for bringing said marker 4 into contact with said microorganism 2;
  • step dl) of controlled release of said cell marker 4 said detection medium 1, 21 is punctually illuminated via said light radiation 6 capable of revealing said at least one cell marker 4 ;
  • an image Ii, I'i is taken of each portion of the detection support 1, 21 having been the subject of an image I 0 , I'o to P 0 in at least one subsequent phase Pi following the step of controlled release of said marker 4;
  • an image I 2 , I ' 2 of each portion of the detection support 1, 21 having been the subject of an image I 0 , I' 0 to P is taken 0 and I 1 I'i to Pi in at least a second subsequent phase P 2 so as to detect said at least one microorganism 2 according to the evolution of the labeling kinetics of said microorganism 2;
  • a comparative analysis is carried out, by portion of the detection support 1, 21, between said image I 0 , I'o taken at P 0 and said images Ii, I'i; I 2 , I ' 2 taken in at least two subsequent phases Pi and P 2 and we conclude as to the presence or not of at least one microorganism 2 in said sample 3.
  • the steps gl) and hl) for taking the image I 2 , I ′ 2 are preferably implemented within a period of 20 and 300 seconds, preferably between 80 and 160 seconds, depending on step f1) during which the image Ii, I'i is taken.
  • a first category of inert particles or dust which emit, for example, a fluorescence or a bioluminescence in a natural way, and which will be displayed on the image I 0 , I 'o taken in a first phase P 0 , before the step dl) controlled release of cell marker 4;
  • microorganism (s) 2 possibly present in the initial sample 3 which should be analyzed, and which will not be visible on the image I 0 , I 'o, which can start to appear on the image Ii, I' i, with a weak light intensity, and which are then clearly visible, with a higher light intensity, on the images I 2 , I ' 2 and following optionally, it being understood that steps gl) and hl) can be repeated as many times as desired to take images during subsequent phases P 2 , P3, etc.
  • FIG. 7 illustrates a series of images taken I ' 0 to I' 4 , and relates some of the elements visible on these images, in particular on the images I'i to I ' 4 , with the profiles Pr j. , Pr 2a and Pr 2b illustrating the variation in light intensity of the elements in question as a function of time following the moment (0 on the axis of abscissa) where the cell marker 4 is released in a controlled manner and brought into contact with said elements, in this case dust and yeast Candida albicans present in the sample 3 and on the solid detection support 1, 21.
  • microorganisms On the succession of images I'i to I ' 4 after marking, other elements are also displayed, in this case microorganisms, and whose light intensity, represented on the profiles Pr 2a and Pr 2b , increases by gradually over time until a peak in intensity is reached, corresponding to a gradual assimilation of the cellular marker 4 by a microorganism 2 (Candida albicans yeasts in this case), before this light intensity also gradually decreases, which corresponds to the phenomenon of photobleaching.
  • the present invention also relates to an automated detection device 14 for at least one microorganism 2, of the type bacteria, yeast or mold, possibly present in a sample 3 to be tested, and capable of implementing the steps of the detection method described above.
  • the device 14 according to the invention comprises at least:
  • a solid detection support 1, 21 intended to receive said sample to be analyzed 3 capable of containing at least one microorganism 2.
  • This support 1, 21 is preferably constituted by at least one filtering membrane 5, 25, through which the l 'sample 3, and a support disc 13, 23 on which the membrane 5, 25 rests.
  • the detection support 1 can be completed by a protective cover 16 and by a means for holding all of the elements of the support 1 on a rigid support plate 18, said holding means which may be in the form of a hoop 17.
  • the detection support 21, comprising a filtering membrane 25 resting on a support disc 23 made of fiberglass, is completed by:
  • a rigid support means 24 in particular of plastic, and permeable, by the presence of a plurality of perforations of circular shape and / or of perforations of oblong shape, said rigid support means 24 also being referred to, in the following description drain 24; it has a shape and dimensions similar or almost similar to those of the support disc 23 and the filter membrane 25;
  • a rigid base 26 made for example of plastic material, crossed, on the one hand, by a conduit 26a for supplying a liquid, in this case the cellular marker 4, said conduit 26a being extended by a chimney 26b making projection from said base 26 and passing through a first orifice 24a formed in the drain 24 and a second orifice 23a formed in the support disc 23, for example made of glass fibers and, on the other hand, by a suction and discharge conduit 26c of a liquid; this conduit 26c is connected, through appropriate means, to a container for receiving the residual liquid discharged for subsequent treatment or destruction;
  • a clamping ring 27 holding, in an integral manner, all of the components of the detection support 21; for this purpose, preferably, said clamping ring 27 as well as the base 26 have a thread and said clamping ring 27 is capable of enclosing all of the components of the detection support 21;
  • the storage means 19 is included in the detection support 1. More precisely, such a storage means 19 is preferably positioned under the filter membrane 5, and preferably between said membrane 5 and the support disc 13 made of glass fibers. Such a storage means 19 is also shown in FIG. 5 and is advantageously in the form of a layer of microcapsules 9, each microcapsule 9 of the layer consisting of the cell marker 4 wrapped in an encapsulation means 8. It It is also conceivable that this storage means 19 is positioned under the support disc 13 made of glass fibers on which the filter membrane 5 then rests directly.
  • the cell marker storage means 4 consists of a reserve of liquid marker solution 4, this reserve being distinct from said detection medium 21 and said device 14 then comprising means for conveying the cellular marker 4 from said storage means to said detection medium 21. These means for conveying the marker cell 4 in liquid form are then in connection, through appropriate connecting means, with the liquid supply conduit 26a from the base 26 of the detection support 21.
  • the cell marker 4 in liquid form will, in this case, be routed directly on top of said support disc 23, under the filter membrane 25 capable of containing microorganisms 2 to be detected.
  • Such means may include, for example, in the embodiment where the means for storing at least one cell marker 4 is in the form of a layer of microcapsules 9, means for heating the detection support 1, associated to conventional temperature control and regulation means, in order to apply an increase in temperature to melt the encapsulation means 8 and release the marker 4.
  • the cell marker 4 preferably in liquid form, can be progressively conveyed at the appropriate time from a separate reserve to the detection support 1, 21 from below it, in particular under the support disc. 13, 23 and be diffused by capillarity by means of this disc 13, 23 for bringing the marker 4 into contact with the microorganisms 2 which can be retained on the membrane 5, 25.
  • the means 15 of controlled release illustrated very schematically in the form of an injection syringe in Figure 2, may consist of means for aspiration of the liquid marker 4 and means for regulating the delivery rate, for example a pump with controlled flow;
  • a means of illumination 6 of said detection support 1, 21 capable of revealing the cell marker 4, in particular based on a laser beam or, more preferably still, high power light-emitting diodes;
  • an optical device 7 for taking pictures of at least a portion of said detection support 1, 21 and positioned above this support 1, 21 said optical device 7 preferably having a resolution at least equal to 20 megapixels, more preferably at least equal to 100 megapixels.
  • This optical device 7 also preferably has a depth of field of the order of 0.5 mm, or equal to 0.5 mm in order to overcome the flatness of the detection support 1 which must be viewed. It advantageously consists of a camera with CMOS sensors and has a field of vision of dimensions for example at least 10 mm long by at least 10 mm wide, and, more preferably still, 25 * 25 mm .
  • the detection support 1, 21 can also cooperate with means for moving said support 1, 21 under this optical device 7 for taking pictures, in the event that the detection support 1, 21 must be divided into several portions for the shooting before and after marking and for the observation of a wider field. These displacement means are not shown in the figures.
  • Such means of analysis preferably consist of an image processing and detection algorithm 11.
  • FIGS. 4 ⁇ and 4B illustrate a particularly preferred embodiment of a solid detection support 21, intended to receive said sample to be analyzed 3 capable of containing at least one microorganism 2, and which can be used in the detection method according to the invention or be part of the detection device 14 capable of implementing the steps of this method.
  • this detection support 21 is composed of at least one filtering membrane 25 through which the sample 3 is passed and of a support disc 23 made of fiberglass on which the membrane 25 rests .
  • Such a detection device is also provided with a support means 24, or drain 24, which is rigid and permeable by means of a plurality of perforations of circular shape and / or perforations of oblong shape.
  • a support means 24, or drain 24 which is rigid and permeable by means of a plurality of perforations of circular shape and / or perforations of oblong shape.
  • On this drain 24 rests the support disc 23 made of glass fibers itself surmounted by said filter membrane 25.
  • Such a rigid and permeable support 24 makes it possible, in particular, to maintain the flatness of the flexible elements that it supports, disc 23 and membrane 25, liable to be subjected to deformations during the implementation of the method of invention, by depositing the sample 3 on the surface of said membrane 25, by suctioning the residual liquid, etc. In addition, due to the presence of numerous perforations, a discharge of liquid is possible through this support 24.
  • Said rigid support or drain 24 is itself mounted on a rigid base 26 traversed by at least one conduit 26a for supplying a liquid and by at least one suction and discharge conduit 26c for a liquid.
  • Said inlet conduit 26a has the function of conveying the cellular marker 4 at the level of the detection support 21, said conduit 26a being moreover extended by a chimney 26b projecting from said base 26 and passing through, on the one hand, a first orifice 24a formed in the drain 24 and, on the other hand, a second orifice 23a formed in the support disc 23 made of glass fibers so as to bring the liquid cellular marker 4 into immediate contact with the filtering membrane 25 and therefore microorganisms 2 which it potentially contains.
  • the base 26 is also traversed by at least one suction and discharge duct 26c of a liquid, either a surplus of cell marker 4 liquid after contacting the latter with the filter membrane 25, or any other liquid, for example the residual liquid of the sample 3 after filtration by the membrane 25 or even a washing liquid.
  • the filter membrane 5, 25 advantageously has a dark color, preferably a black color, in order to allow optimal revelation fluorescence or bioluminescence of the cell marker 4, by contrast between the light emitted and the dark shade of said filter membrane 5, 25.
  • a membrane 5, 25 made of polyester or polycarbonate will be preferred, while , for the detection of clusters of cells in the form of microcolonies, after a culture phase, a membrane 5, 25 of cellulose ester or nitrate will be preferred.
  • the elements which have been described above for the detection method can be applied to the detection device and to the detection supports 1, 21 according to the invention, and vice versa, if this proves to be suitable and conceivable.

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Abstract

L'invention concerne une méthode de détection, sur un support de détection (1, 21), d'au moins un microorganisme (2) présent dans un échantillon à analyser (3) et révélé par au moins un marqueur cellulaire (4). Cette méthode comporte une première prise d'image (I0, I'0) avant une étape de libération contrôlée dudit marqueur (4) et une mise en contact de ce marqueur avec ledit microorganisme, et au moins une prise d'image (Ιi) suivant cette étape de mise en contact, en sorte de détecter ledit microorganisme selon l'évolution de sa cinétique de marquage, au moyen d'une analyse comparative entre les différentes images qui ont été prises. L'invention est également relative à un dispositif de détection (14) automatisé apte à la mise en œuvre de la méthode et un support de détection apte à être mis en œuvre dans la méthode faisant partie du dispositif (14).

Description

MÉTHODE ET DISPOSITIF POUR LA DÉTECTION D'AU MOINS UN MICROORGANISME SELON SA CINÉTIQUE DE MARQUAGE, ET SUPPORT DE DÉTECTION
La présente invention concerne le domaine de la détection de microorganismes du type bactéries , levures et moisissures en phase solide .
La présente invention trouvera son application principalement dans le domaine de la microbiologie industrielle, par exemple, mais non limitativement, dans les industries pharmaceutiques , biotechnologiques , cosmétiques ou agroalimentaires , ou bien encore en microbiologie clinique ou environnementale .
L' invention concerne plus particulièrement un dispositif et une méthode permettant une détection de manière extrêmement précoce, des microorganismes en phase solide, sur des supports adaptés , et cela sans nécessiter obligatoirement de mise en culture desdits microorganismes en vue de leur multiplication.
De nombreuses techniques sont mises en œuvre, à l'heure actuelle , pour permettre la détection de contaminants , par exemple de bactéries, dans un échantillon qui doit être testé.
La méthode la plus classique et la plus ancienne consiste en un dépôt d'un échantillon, éventuellement après filtration, sur la surface d'un milieu de croissance gélosé et nutritif, ce dernier pouvant être plus ou moins sélectif d' un ou plusieurs type (s) de microorganismes.
Ledit milieu est ensuite incubé à la température adéquate pour la croissance du microorganisme recherché, pendant une durée pouvant souvent aller jusqu'à plusieurs jours, avant qu'un opérateur procède à une numération « manuelle » des colonies visibles à l'œil nu.
Une telle méthode, bien que très sensible et permettant la détection d' un seul contaminant viable et cultivable dans l'échantillon de départ, présente l'inconvénient de nécessiter une période d' incubation relativement longue pour permettre une détection à l'œil nu des colonies qui se sont formées sur la gélose .
En lieu et place d'une gélose solide, il est également envisageable d' inoculer un milieu liquide dans lequel une croissance microbienne sera détectée, après incubation, par
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26) turbidimétrie par exemple, l'absorbance mesurée étant proportionnelle à la concentration de microorganismes présents dans le milieu.
L'inconvénient des techniques de détection en phase liquide est qu'elles ne permettent pas de détecter des concentrations microbiennes inférieures à 106 ou 107 cellules/mL. Ainsi, l'échantillon doit à nouveau être incubé pendant un temps variable afin d' atteindre une telle concentration cellulaire .
A noter également que certains microorganismes, sous l'effet d'un stress, par exemple thermique, ou bien encore du fait de la présence d'agents inhibiteurs dans un échantillon, peuvent mettre un temps particulièrement long pour se multiplier, prolongeant encore le moment où ils seront détectables par les techniques de culture traditionnelle .
Il est encore connu, dans l'état de la technique, de réaliser une réaction de polymérisation en chaîne, également appelée amplification PCR, pour déterminer la présence de microorganismes spécifiques au sein d'un échantillon, par amplification d'une séquence d'ADN ou d'ARN.
Ces méthodes présentent toutefois l'inconvénient de nécessiter plusieurs brins d'acide nucléique c'est-à-dire plusieurs microorganismes contaminants dans un échantillon, et généralement au moins plusieurs dizaines de microorganismes . De telles méthodes sont donc moins sensibles que les techniques traditionnelles de culture basées sur la croissance microbienne .
Ainsi, depuis quelques années, dans le but d'augmenter la rapidité de détection des microorganismes tout en essayant de conserver la sensibilité des techniques classiques basées sur la croissance, de nombreuses méthodes ont été mises au point et développées .
La plupart de ces méthodes sont basées sur la détection de la fluorescence émise par des substances chimiques spécifiques et fluorescentes , les fluorophores ou fluorochromes , qui sont couplées, par différentes techniques de marquage, à des structures ou à des fonctions cellulaires (acides nucléiques, protéines, enzymes etc.) des microorganismes à détecter. Ces méthodes nécessitent la mise en œuvre de dispositifs de détection spécifiques , tels que des microscopes pour la technique dite « DEFT » (Direct Epifluorescence Filter Technique) ou bien encore des cytomètres .
Ainsi, la technique de cytométrie en flux est aujourd'hui communément utilisée pour détecter et compter des microorganismes présents dans un échantillon.
Dans cette technique, des cellules ou particules, pouvant être marquées par un fluorophore et en suspension dans un liquide, sont isolées les unes derrière les autres sous la forme d'un flux à cellule unique. Elles sont ensuite acheminées une à une, et à grande vitesse, au travers d'une source lumineuse, par exemple un faisceau lumineux d'un laser.
La lumière diffusée et émise par les cellules, qui est fluorescente dans le cas d' un marquage par fluorophore après excitation de celui-ci à une longueur d'onde donnée, est dirigée, par un système de miroir et de filtres constituant le dispositif optique du cytomètre, vers un ensemble de détecteurs lumineux. Ces détecteurs incorporent, notamment, des photomultiplicateurs qui vont permettre de convertir les signaux lumineux en signaux électriques pouvant être ensuite analysés par un ordinateur afin de générer des données relatives, par exemple, aux caractéristiques physiques des cellules .
Les cytomètres en flux actuellement disponibles sur le marché sont capables d'analyser plusieurs centaines de cellules, ou « évènements » par seconde, en temps réel, et certains de ces appareils peuvent être configurés en sorte de permettre un tri des cellules ou des particules en fonction de leurs propriétés optiques .
Toutefois , la détection d' évènements rares est souvent compliquée, que ce soit par la mise en œuvre de la cytométrie en flux, ou bien par la technique microscopique.
En effet, la cytométrie en flux présente une sensibilité limitée, évaluée, dans le meilleur des cas, entre 102 et 103 cellules/mL de suspension, et dépendante de la matrice. Dans la technique « DEFT », un échantillon à analyser est filtré au travers d'une membrane permettant la rétention des microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon .
Les microorganismes sont alors marqués par un fluorochrome, par exemple l'acridine orange qui interagit avec l'ADN ou l'ARN, puis comptés par analyse visuelle de plusieurs champs de la membrane au moyen d'un microscope à épifluorescence .
Dans le cas de la microscopie par fluorescence, on estime qu'au moins 104 cellules doivent être présentes, sur une membrane présentant un diamètre de 25 mm, pour obtenir des résultats représentatifs, sachant que le comptage est effectué uniquement sur une petite partie de la membrane (moins de 10% de la taille totale) , et qu'une distribution homogène des cellules est supposée et non certaine .
Or, dans certaines applications de la microbiologie industrielle ou clinique, il peut s'avérer particulièrement important de détecter, de manière précoce, la présence d'un contaminant unique ou de quelques contaminants dans un échantillon. En effet, les produits fabriqués et/ou transformés dans ce type d'industrie sont particulièrement sensibles, du fait notamment de leur destination (l'alimentation, la santé des consommateurs, etc.). Par conséquent, il est primordial de s'assurer, le plus rapidement possible, que leur qualité microbiologique est irréprochable, ou, si tel n'est pas le cas, de pouvoir identifier rapidement la source de la contamination.
C'est notamment pour ces raisons qu'a été développée, ces dernières années , la méthode de cytométrie en phase solide , également appelée cytométrie à balayage, s'appliquant à des échantillons filtrables, et faisant l'objet notamment du brevet européen EP 0 713 087.
Dans cette méthode, après une première étape de filtration d' un échantillon sur une membrane adéquate , les microorganismes éventuellement présents sur ladite membrane sont soumis à une étape de marquage au moyen d'un fluorophore. L'intégralité de la surface de la membrane est ensuite balayée par un faisceau laser pour exciter le fluorophore et compter les microorganismes éventuellement présents et viables dans l'échantillon de départ à analyser, par mesure de la fluorescence émise .
Le dispositif connu sous la dénomination ChemScan RDI (marque déposée) , met en œuvre cette méthode de cytométrie en phase solide .
Cependant, les dispositifs disponibles actuellement sur le marché pour mettre en œuvre la technique de cytométrie en phase solide, tout comme les réactifs nécessaires, sont particulièrement coûteux et nécessitent des investissements importants . En conséquence, cette technique n'est pas accessible à tous les laboratoires .
En outre, une fois la détection et le dénombrement des microorganismes effectués, les effets toxiques des réactifs utilisés, sur le métabolisme cellulaire, sont susceptibles d'empêcher une mise en culture subséquente, en vue d'une identification, desdits microorganismes.
A noter également que cette méthode de cytométrie en phase solide n'est applicable qu'aux matrices filtrables, et que le temps nécessaire, depuis le dépôt de l'échantillon sur un support solide jusqu'à l'obtention des résultats avec le dénombrement des microorganismes présents sur ledit support solide, est relativement important ; le délai est en effet estimé entre, au minimum, 90 min, et peut aller, selon l'application, jusqu'à 4h.
Finalement, qu'il s'agisse de la technique de cytométrie en flux ou bien de la cytométrie en phase solide, le taux de faux positifs détecté reste relativement important. En effet, des particules inertes, par exemple des poussières, autres que des microorganismes sont également susceptibles d'émettre une fluorescence naturelle, voire de se combiner au fluorochrome pour émettre une florescence parasite.
Cela constitue un véritable inconvénient des méthodes existantes, dans la mesure où, selon les domaines d'application, un échantillon s'avérant faussement positif devra nécessairement faire l'objet d'investigations plus poussées, coûteuses notamment en termes de temps et pouvant également avoir des répercussions financières importantes, en particulier si une chaîne de production (de produits biopharmaceutiques, par exemple), devait être arrêtée le temps desdites investigations .
De manière générale, les méthodes mettant en œuvre un marquage des cellules par un fluorophore nécessitent une manipulation de l'échantillon par du personnel qualifié, ainsi qu'une manipulation et une mise en contact du réactif fluorescent avec les microorganismes à détecter, entraînant inévitablement un risque de contamination dudit échantillon .
Ά noter également que l'ensemble de ces opérations, ainsi que le travail amont de préparation de l'échantillon, comprenant notamment les étapes de filtration, d'activation, de marquage, de lavage, etc. nécessitent inévitablement un temps important de manipulation par un opérateur, ce qui retarde d'autant le moment de la détection d'une éventuelle contamination.
L'invention offre la possibilité de pallier, au moins en partie, les divers inconvénients mentionnés ci-dessus de l'état de la technique en proposant une méthode et un dispositif pour la détection extrêmement précoce, quasi-instantanée si nécessaire, de microorganisme (s) présent (s) éventuellement dans un échantillon de départ à analyser.
La méthode et le dispositif de l'invention sont basés sur une détection et une analyse de la cinétique de marquage d'éventuels microorganismes au moyen d'un marqueur cellulaire délivré de manière contrôlée et sans opération manuelle chronophage et susceptible notamment d' entraîner une contamination de l'échantillon.
Ά cet effet, la présente invention concerne une méthode de détection, sur un support de détection solide, d'au moins un microorganisme, du type bactérie, levure ou moisissure, présent dans un échantillon à analyser et révélé par au moins un marqueur cellulaire, ladite méthode comportant, au moins, les étapes suivantes, prises dans l'ordre : a) On dépose ledit échantillon à analyser sur ledit support de détection solide ;
b) On illumine au moins une fois ledit support de détection via un rayonnement lumineux apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire ;
c) On prend au moins une image I0 en une première phase P0 dudit échantillon sur au moins une portion dudit support de détection au moyen d'un dispositif optique de prises de vues visant un champ d'observation d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large ;
d) On procède à une libération contrôlée dudit au moins un marqueur cellulaire, au travers du support de détection, pour une mise en contact dudit marqueur avec ledit microorganisme ;
e) On prend, au moyen dudit dispositif optique, une image I± (i³l) de chaque portion du support de détection ayant fait l'objet d'une image à P0 en au moins une phase ultérieure Pi suivant l'étape de libération contrôlée dudit marqueur en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit microorganisme ;
f) On procède à une analyse comparative, par portion du support de détection, entre ladite image I0 prise à P0 et chaque image I± prise en au moins une phase ultérieure P± et on conclut quant à la présence ou non d'au moins un microorganisme dans ledit échantillon .
De manière préférentielle, on illumine ponctuellement ledit support de détection via un rayonnement lumineux à chaque prise d' image à P0 , P± .
Dans un exemple de réalisation particulièrement avantageux, la méthode de l'invention comporte, au moins, les étapes suivantes, prises dans l'ordre :
al) On dépose ledit échantillon à analyser sur ledit support de détection solide ; bl) On illumine ponctuellement ledit support de détection via un rayonnement lumineux apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire ;
cl) Simultanément à l'étape d'illumination bl) , on prend au moins une image I0, I'o en une première phase P0 dudit échantillon sur au moins une portion dudit support de détection au moyen d'un dispositif optique de prises de vues visant un champ d'observation d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large ;
dl) On procède à une libération contrôlée dudit au moins un marqueur cellulaire, au travers du support de détection, pour une mise en contact dudit marqueur avec ledit microorganisme ;
el) Dans un laps de temps inférieur à 5 secondes après l'étape dl) de libération contrôlée dudit marqueur cellulaire, on illumine ponctuellement ledit support de détection via ledit rayonnement lumineux apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire ;
fl) Simultanément à l'étape d'illumination el) , on prend, au moyen dudit dispositif optique, une image Ii, I'i de chaque portion du support de détection ayant fait l'objet d'une image à P0 en au moins une phase ultérieure Pi suivant l'étape de libération contrôlée dudit marqueur ;
gl) On illumine à nouveau ponctuellement, au moins une fois, ledit support de détection via ledit rayonnement lumineux ;
hl) Simultanément à l'étape d'illumination gl) , on prend, au moyen dudit dispositif optique, une image I2, I'2 de chaque portion du support de détection ayant fait l'objet d'une image à P0 et à Pi en au moins une seconde phase ultérieure P2 en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit microorganisme ;
il) On procède à une analyse comparative, par portion du support de détection, entre ladite image I0, I'o prise à P0 et lesdites images Ii, I'i ; I2, I'2 prises en au moins deux phases ultérieures Pi et P2 et on conclut quant à la présence ou non d'au moins un microorganisme dans ledit échantillon.
Selon des caractéristiques particulières et non limitatives de la méthode de l'invention :
- le support de détection est soumis à n déplacements selon des trajets distincts en vue d'une division spatiale dudit support de détection en n+1 portions faisant l'objet de prises de vues en au moins deux phases P0 et Pi, n étant un nombre entier inférieur ou égal à 20 ;
- on utilise, au cours des étapes de prises d'image c) et e) ou cl) , fl) et hl) , un dispositif optique de prises de vues présentant une résolution au moins égale à 20 mégapixels, et de préférence supérieure à 100 mégapixels ;
si l'on conclut à la présence d'au moins un microorganisme dans ledit échantillon au cours de l'étape f) ou il), on effectue un dénombrement des microorganismes présents dans ledit échantillon ;
- ledit marqueur cellulaire est un marqueur fluorescent ; ledit marqueur cellulaire libéré de manière contrôlée au cours de l'étape d) ou dl) est enveloppé dans un moyen d'encapsulation sous forme solide, par exemple sous la forme d'une poudre, et ledit support de détection comprend un solvant de mise en solution dudit marqueur ;
ledit marqueur cellulaire est enveloppé dans un moyen d'encapsulation sous forme liquide ;
- ledit moyen d'encapsulation est thermosensible et, dans l'étape d) ou dl) , on procède à une libération contrôlée du marqueur cellulaire enveloppé dans ledit moyen d' encapsulation thermosensible en soumettant ce dernier à une augmentation de la température apte à faire fondre ledit moyen d'encapsulation thermosensible, par exemple en augmentant la température depuis la température ambiante jusqu'à une température maximale de 45°C ;
on achemine le marqueur cellulaire en solution liquide de manière contrôlée jusqu' audit support de détection solide contenant l'échantillon à analyser ; on dépose directement un volume compris entre 10 et 2000 pL dudit échantillon à analyser sur ledit support de détection on filtre ledit échantillon à analyser au travers d'une membrane filtrante ayant un seuil de coupure compris 0 , 2 et 0,45 pm, de préférence un seuil de coupure égal à 0,3 pm, ladite membrane filtrante étant positionnée directement dans ledit support de détection ;
La présente invention est également relative à un procédé pour distinguer les microorganismes des poussières sur les supports de détection ayant reçu les échantillons à analyser, caractérisé par :
mesure après chaque prise de vue de la luminosité des pixels ou groupes de pixels luminescents détectés ;
comparaison de la luminosité de chaque pixel ou groupe de pixels luminescents détecté sur les différentes prises de vue ; identification des pixels ou groupes de pixels dont la luminosité n'évolue pas sensiblement dans au moins deux prises de vues consécutives au cours de la cinétique de marquage ;
analyse et comptage des pixels ou groupes de pixels dont la luminosité évolue au cours de la cinétique de marquage.
L'invention concerne également un dispositif de détection d'au moins un microorganisme, du type bactérie, levure ou moisissure, présent dans un échantillon à analyser, apte à mettre en œuvre la méthode de détection de l'invention, et comprenant au moins :
un support de détection solide destiné à recevoir ledit échantillon à analyser susceptible de contenir au moins un microorganisme ;
un moyen de stockage d'au moins un marqueur cellulaire dudit microorganisme ;
un moyen de libération contrôlée dudit marqueur cellulaire pour une mise en contact dudit marqueur avec ledit échantillon à analyser ;
un moyen d' illumination dudit support de détection ;
- un dispositif optique de prises de vues d'au moins une portion dudit support de détection, ledit dispositif optique présentant un champ d'observation d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large ;
des moyens de mémorisation, de comparaison et d'analyse des prises de vue prises par le dispositif optique en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme éventuellement présent dans ledit échantillon selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit au moins un microorganisme .
Préférentiellement, le dispositif de l'invention comprend des moyens de déplacement dudit support de détection sous ledit dispositif optique de prises de vues .
Dans le dispositif de détection de l'invention, avantageusement :
- ledit support de détection solide comporte au moins une membrane filtrante reposant sur un disque support en fibre de verre ;
- ledit moyen de stockage du marqueur cellulaire est inclus dans le support de détection et consiste en une couche de microcapsules constituées dudit marqueur cellulaire enveloppé dans un moyen d'encapsulation, ladite couche de microcapsules étant disposée entre ledit disque support en fibres de verre et ladite membrane de filtre ; dans ce cas, ledit moyen de libération contrôlée du marqueur cellulaire comporte des moyens de chauffage et des moyens de contrôle et de régulation de la température aptes à opérer une augmentation de la température au sein du dispositif et faire fondre ledit moyen d'encapsulation enveloppant le marqueur cellulaire ;
- ledit moyen de stockage du marqueur cellulaire consiste en une réserve de solution liquide de marqueur cellulaire distincte du support de détection et ledit dispositif de détection comprend des moyens d' acheminement dudit marqueur cellulaire depuis ledit moyen de stockage vers ledit support de détection ; dans ce cas, ledit moyen de libération contrôlée du marqueur cellulaire peut comporter au moins une pompe à débit contrôlé ; - ledit dispositif optique de prises de vues présente une profondeur de champ de l'ordre de ou égale à 0,5 mm ;
- ledit dispositif optique de prises de vues est basé sur une caméra à capteurs CMOS ;
- ledit dispositif optique de prises de vues présente un champ de vision de 25 mm*25 mm ;
- ledit dispositif optique de prises de vues présente une résolution au moins égale à 20 mégapixels et de préférence supérieure à 100 mégapixels.
L'invention concerne encore un support de détection apte à être mis en œuvre dans la méthode de détection selon l'invention ou entrant dans la composition du dispositif de détection selon l'invention et composé, au moins, d'une embase rigide traversée par au moins un conduit d' amenée d'un liquide et au moins un conduit d'aspiration et d'évacuation d'un liquide, ledit conduit d' amenée étant prolongé par une cheminée faisant saillie de ladite embase et traversant, d'une part, un premier orifice ménagé dans un moyen support rigide et perméable surmontant ladite embase et, d'autre part, une deuxième orifice ménagé dans un disque support souple en fibres de verre, ledit disque étant positionné sur ledit moyen support rigide et perméable et supportant une membrane filtrante ayant un seuil de coupure compris 0,2 et 0,45 pm, apte à la rétention de microorganismes , ledit support de détection comprenant en outre un anneau de serrage fixé solidairement à ladite embase et maintenant ensemble ladite embase, ledit support moyen rigide et perméable, ledit disque support et ladite membrane filtrante .
La présente invention comporte de nombreux avantages. D'une part, la présente méthode, basée sur l'évaluation de la cinétique de marquage de microorganismes, permet de détecter presque immédiatement, dans les minutes ou dizaines de minutes au plus suivant la préparation d'un échantillon, et sans nécessiter obligatoirement de mise en culture, la présence ou l'absence de microorganisme (s) vivant (s) dans ledit échantillon, tout en discriminant, de manière extrêmement fiable, ces microorganismes d'éventuels artefacts, comme des poussières ou autres. D'autre part, l'invention ne nécessite que peu de manipulations de l'échantillon, et dans tous les cas aucune manipulation du marqueur cellulaire , opération complexe impliquant l'emploi de personnel qualifié et présentant un risque non négligeable de contamination dudit échantillon.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre des modes de réalisation non limitatifs de l'invention, en référence aux figures annexées dans lesquelles :
- La figure 1 illustre, de manière schématique, les différentes étapes de deux modes de réalisation particuliers de dépose d' un échantillon sur un support de détection solide, ces étapes pouvant être mises en œuvre dans la méthode de détection d'au moins un microorganisme selon 1 ' invention ;
- La figure 2 représente, de manière schématique, un mode de réalisation particulier de mise en œuvre des différentes étapes de la méthode de détection de l'invention, incluant notamment le dépôt d'un échantillon sur un support de détection, une prise d'image P0 avant un marquage dudit échantillon puis plusieurs prises d' images successives Pi à P4 après libération contrôlée d'un marqueur cellulaire, et une analyse comparative des différentes images pour aboutir à un résultat d'analyse ; Les figures 3Ά et 3B illustrent chacune schématiquement une vue éclatée et en perspective, respectivement en intégralité et selon une coupe médiane, de deux exemples de réalisation non limitatifs d'un support de détection pouvant être mis en œuvre dans la méthode ou dans le dispositif de l'invention ;
Les figures 4Ά et 4B illustrent chacune schématiquement une vue éclatée et en perspective, respectivement en intégralité et selon une coupe médiane, d'un mode de réalisation différent de ceux représentés sur les figures 3A et 3B et particulièrement préférentiel d'un support de détection pouvant être mis en œuvre dans la méthode ou dans le dispositif de l'invention ;
- La figure 5 représente un mode de réalisation particulier de la méthode de détection de l'invention dans lequel l'échantillon à tester est mis au contact d'un marqueur cellulaire encapsulé, sous forme de microcapsules, et libéré de manière contrôlée sous l'action d'un stimulus extérieur pour permettre la détection de microorganismes éventuellement présents dans l'échantillon ;
- La figure 6 montre une série de prises de vue de microcolonies de Bacillus subtilis, suivant une phase de culture, la prise de vue à gauche I0 ayant été effectuée avant la libération d' un marqueur cellulaire tandis que les autres prises de vue Ii à I5 ont été réalisées à intervalles de temps réguliers suivant la libération contrôlée dudit marqueur, permettant l'évaluation d'une cinétique de marquage des colonies de B. subtilis par ces prises de vue successives ;
La figure 7 illustre une série de cinq prises de vue successives, référencées I'0 à I'4, d'un support de détection sur lequel sont présentes, d'une part, une poussière et, d'autre part, des cellules à détecter dans un échantillon test, en l'occurrence des levures appartenant au genre Candida et à l'espèce albicans. Ledit support est photographié avant la libération d'un marqueur cellulaire (image I'0) et suivant la libération contrôlée de ce marqueur (image I'i à I'4) selon la méthode de l'invention ; ladite figure montre également trois profils Pr , Pr2a et Pr2b illustrant graphiquement, en parallèle avec les prises de vue I'0 à I'4, une variation d'intensité lumineuse (exprimée en niveaux de gris, représentant la luminosité d'un pixel et codé de 0 (noir) à 255 (blanc)), suivant le marquage, émise par une poussière absorbant du marqueur cellulaire (Pr^ et par une levure (Pr2a et Pr2b) en fonction du temps, plus particulièrement en fonction des prises de vue successives, deux prises de vue consécutives étant espacées de 20 secondes, démontrant une augmentation brutale de l'intensité lumineuse émise par la poussière après le marquage jusqu'à une intensité forte et stationnaire dans le temps, tandis que l'intensité lumineuse émise par les levures augmente progressivement, au fur et à mesure de l'assimilation du marqueur par la cellule, jusqu'à atteindre un pic d'intensité maximale avant une diminution de l'intensité lumineuse, appelée également photoblanchiment .
Telle que représentée sur les figures 1 à 7 des dessins ci- joints, la présente invention concerne, dans un premier temps, une méthode de détection, sur un support de détection solide 1, 21, d'au moins un microorganisme 2, ou d'une pluralité de microorganismes 2, présent (s), éventuellement mais non obligatoirement, dans un échantillon 3 qu'il convient de tester.
Dans la méthode de détection de l'invention, le (s) dit (s) microorganisme (s) 2, qu'ils soient présents sous une forme unicellulaire ou sous la forme de microcolonies après une phase de culture préalable, sont mis en contact avec au moins un marqueur cellulaire 4.
On entend, dans la suite de la description, par « marqueur cellulaire », une substance capable de mettre en évidence par émission de lumière, notamment fluorescence, éventuellement par bioluminescence, voire par coloration, les microorganismes présents éventuellement dans un échantillon de départ à tester, étant entendu que ce marqueur cellulaire peut, de préférence, être un marqueur fluorescent apte à mettre en évidence uniquement les microorganismes viables ou de différencier les microorganismes viables des microorganismes non viables , ou encore apte à ne marquer que certains microorganismes pathogènes d'intérêt.
A noter que l'échantillon 3 à tester peut provenir, par exemple mais non limitativement, d'une industrie pharmaceutique ou agroalimentaire , ou bien consister en un prélèvement soit d'origine humaine en microbiologie clinique ou médicale, soit d' origine environnementale , et les microorganismes 2 à détecter dans ledit échantillon 3 sont du type bactéries, levures ou moisissures , principalement .
Dans une première étape a) de la méthode de détection selon l'invention, on dépose l'échantillon 3 à tester sur ledit support de détection solide 1, 21 comprenant, de préférence, au moins une membrane filtrante 5, 25.
Dans un exemple de réalisation de l'étape a) de la méthode de l'invention, représenté sur la partie inférieure de la figure 1, l'échantillon 3 à analyser consiste en une matrice liquide, d'un volume pouvant aller de 1 mL à 500 mL, filtrée au travers d'un support de détection 1 comprenant, au moins, une membrane filtrante 5, ledit support 1 étant positionné sur un dispositif D approprié pour la filtration.
Ladite membrane 5 présente un seuil de coupure adéquat pour retenir les microorganismes 2 éventuellement présents dans l'échantillon 3 et éliminer principalement d'une part, le liquide résiduel dudit échantillon 3 et, éventuellement, d'autre part, des impuretés contenues dans ce dernier et de taille inférieure au seuil de coupure .
Ainsi, et quel que soit le mode de réalisation retenu pour la mise en œuvre de la première étape a) de la méthode de l'invention, ladite membrane 5, 25 présente préférentiellement un seuil de coupure compris entre 0,20 et 0,45 pm. Plus préférentiellement encore, le seuil de coupure de cette membrane 5, 25 est égal à, ou de l'ordre de, 0,30 pm.
Un tel seuil de coupure permet de retenir, à la surface de ladite membrane 5, 25 tous les microorganismes 2 du type bactéries , levures et moisissure dont la taille varie entre environ 0,5 et environ 10 pm, et qui sont susceptibles d'être présents dans l'échantillon 3.
A noter cependant que l'utilisation d'un tel seuil de coupure favorise, outre la séparation des microorganismes 2 du reste de l'échantillon 3, une rétention de la majorité des particules inertes (comme des poussières) qui sont également présentes, à l'origine, dans ledit échantillon 3. Dans un deuxième exemple de réalisation de l'étape a) de la méthode de l'invention, non représenté sur les figures, l'échantillon 3 liquide, de volume compris entre 1 et 500 mL, est filtré au travers d'une membrane filtrante 5 sur un dispositif D de filtration approprié, ladite membrane 5 présentant un seuil de coupure compris entre 0,20 et 0,45 pm et de préférence égal à 0,3 pm.
Une fois la filtration de l'échantillon 3 réalisée, la membrane filtrante 5 est extraite du dispositif de filtration D pour être déposée sur le dispositif de détection 1.
Ledit support de détection 1 peut également être complété au moins par un disque support 13 fabriqué en une matière perméable, par exemple en fibre de verre .
Un tel disque support 13 sur lequel est amenée à venir reposer, éventuellement, la membrane filtrante 5 après prélèvement de celle-ci du dispositif D pour former, dans cet exemple de réalisation, le support solide de détection 1, est illustré notamment sur les figures 3Ά et 3B jointes.
Dans un troisième exemple de réalisation, qui est appliqué sur un échantillon 3 d'un volume plus faible, typiquement entre 10 et 2000 pL, voire moins, on procède à une inoculation directe dudit échantillon 3 sur le support de détection 1, 21 comprenant au moins la membrane 5, 25 et le disque support 13, 23 comme illustré sur la partie haute de la figure 1.
Puis, de préférence, on insère ledit support de détection 1 dans un dispositif de détection 14 entièrement automatisé et apte à mettre en œuvre le procédé de l'invention. Ledit dispositif 14 sera décrit plus en détails ultérieurement.
Ά noter que, dans un exemple de réalisation particulièrement avantageux, l'étape a) de dépose de l'échantillon 3 met en œuvre un support de détection 21 configuré pour permettre, tout préférentiellement, soit le dépôt d'un faible volume d'échantillon 3 compris entre 10 et 2000 pL sur une membrane filtrante 25, soit une filtration directe d'un volume d'échantillon 3 plus important et supérieur à 2000 pL, typiquement jusqu'à un volume de 100 mL, sans passer par un dispositif D de filtration dédié à cette opération et extérieur au dispositif de détection 14.
Une filtration de l'échantillon 3, même dans le cas où un petit volume est déposé sur la membrane filtrante, est envisageable, de manière automatisée, dans le dispositif de détection 14.
Le support de détection 21 sera décrit de manière détaillée dans la suite de la description, en référence aux figures 4Ά et 4B .
Ά noter que, de manière classique, ces opérations de manipulation et de dépose de l'échantillon 3 sur le support 1, 21 peuvent être effectuées de préférence par un opérateur sous atmosphère stérile par exemple en effectuant lesdites opérations sous un poste de sécurité microbiologique PSM, visible sur la figure 1.
Dans une étape b) de la méthode de détection selon l'invention, illustrée sur la figure 2 jointe, on illumine, au moins une fois, le support de détection 1, 21 contenant ledit échantillon 3 au moyen d' un rayonnement lumineux 6 apte à la visualisation ou la révélation dudit marqueur cellulaire 4.
En effet, dans un exemple de réalisation particulier de la méthode de détection de l'invention, une illumination continue du support de détection 1, 21 tout au long de la mise en œuvre de ladite méthode est envisageable. Cependant, il est encore plus préférentiel de procéder à une illumination du support de détection 1, 21 ponctuelle et simultanée ou quasi-simultanée à chacune des prises d'images, ce qui sera détaillé ultérieurement dans la description .
Suivant cette étape b) d'illumination, on prend, au cours d'une étape c) , au moins une image I0, I'o, de l'échantillon 3 sur au moins une portion dudit support de détection 1, 21, en une première phase P0, deux exemples d'images I0, I'o étant visibles sur les figures 6 et 7.
La prise d'images au cours du procédé de l'invention est effectuée, de préférence, au moyen d'un dispositif optique 7 de prises de vues présentant une résolution optique supérieure ou égale à 20 mégapixels, de préférence supérieure à 100 mégapixels, permettant une détection de microorganismes marqués ayant une taille au moins égale à 0,5 pm sur une surface prédéterminée .
De manière particulièrement importante, ledit dispositif optique 7 présente en effet un champ d' observation relativement large, typiquement d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large, et, plus préférentiellement encore, ce champ d'observation est de 25*25mm, en sorte de pouvoir, par exemple, prendre en une seule image l'intégralité du support de détection 1, 21.
A noter également que, de préférence, ledit dispositif optique 7 présente une profondeur de champ de +/- 0,5 mm afin de s'affranchir d'éventuels défauts de planéité de la membrane 5, 25 dudit support de détection 1, 21.
Ainsi, tout préférentiellement, au cours de l'étape c) , on prend une seule image I0, I'o de l'intégralité de la surface du support de détection 1, 21.
Dans la présente méthode, il est également envisagé, lorsque la taille du support de détection 1, 21 est trop importante pour que celui-ci soit visualisé au moyen d'une seule prise d'image, et pour pouvoir observer un champ plus large sans investir dans un dispositif optique non standard à des conditions économiques par conséquent beaucoup moins favorables, que l'on soumette ledit support de détection 1, 21 à n déplacements selon des trajets distincts, n étant un nombre entier supérieur à 1 et inférieur ou égal à 20, et plus préférentiellement encore inférieur ou égal à 10.
Au moyen de ces n déplacements de trajets distincts, on permet une division spatiale dudit support de détection 1, 21 en n+1 portions, chacune desdites portions faisant l'objet d'au moins une prise de vue aux instants des prises d'images, notamment à P0 et lors d'au moins une phase ultérieure P± décrite plus en détail ci-dessous, la somme des prises de vue des différentes portions permettant alors une visualisation de l'entièreté du support de détection 1, 21 à chacune des différentes phases P0, P±.
En effet, il est particulièrement intéressant de pouvoir visualiser l'intégralité dudit support 1, 21, que ce soit en une seule ou en plusieurs fois, afin de s'assurer de la détection d'un petit nombre de germes, voire d'un seul germe présent au départ dans l'échantillon 3 à tester.
Suivant la prise de l'image I0, I'o on procède à une étape d) de libération contrôlée d'au moins un marqueur cellulaire 4, au travers dudit support de détection 1, 21, afin que ledit marqueur 4 vienne au contact des microorganismes éventuellement présents dans l'échantillon 3 de départ et déposés sur le support 1, 21.
Un mode de réalisation particulier de cette étape d) de libération contrôlée est plus particulièrement illustré sur la figure 5.
Préférentiellement, le marqueur cellulaire 4 mis en œuvre dans la méthode de l'invention est un marqueur fluorescent.
Ce marqueur 4 peut être avantageusement sélectionné par l'homme du métier parmi tous les marqueurs cellulaires bien connus de lui et couramment utilisés, par exemple, dans les techniques de cytométrie actuelles .
Ainsi, ledit marqueur cellulaire peut être sélectionné, par exemple, parmi les marqueurs suivants : les marqueurs de l'ADN comme l'acridine orange, le DAPI (4 ' , 6-diamidino-2-phénylindole) , le PI (iodure de propidium) , le DRAQ7* (Deep Red Anthraquinone 7), la 7-AAD (7-aminoactinomycine D) , le TO-PRO-1*, le TO-PRO-3*, SYTOX*, le LDS 751, le bromure d'éthidium, l'éosine 5'maléimide (EMA) , les marqueurs réactifs aux amines tels que le « Zombie Fixable *», le « Fixable Viability Dye eFluor*», le « LIVE/DEAD Fixable dead* », le « Viobility Fixable *» , le « Horizon Fixable Viability *», le « Ghost* », les marqueurs de l'activité estérase tels que la calcéine AM (acétoxy méthyle) , la cFDA (Carboxy- fluorescéine diacétate) , le « CellTracker Green CMFDA *», les marqueurs d' oxydoréduction comme la résazurine ou les sels de tétrazolium, ou des marqueurs cellulaire en kits comme les kits « LIVE/DEAD Viability *», les noms des réactifs cités dans le présent paragraphe et suivis d' une astérisque étant déposés à titre de marque . Il est également envisageable d'utiliser une pluralité de marqueurs cellulaires en combinaison parmi ceux cités précédemment .
Ά noter que, dans le cas de la mise en œuvre, dans la méthode de l'invention, d'un marqueur cellulaire fluorescent 4, le rayonnement lumineux 6 est sélectionné parmi un faisceau laser et une, ou plusieurs, diode (s) électroluminescente (s) , cette dernière solution étant d'ailleurs particulièrement préférée.
Dans une variante de réalisation de la présente méthode, il est également envisagé, lors de l'étape d) , de mettre en contact le ou les éventuel (s) microorganismes 2 avec au moins un marqueur cellulaire 4 non fluorescent mais visible et détectable.
Ledit marqueur cellulaire 4 peut également consister en un marqueur bioluminescent, étant entendu, que dans ce cas de figure, la méthode de détection de microorganismes de l'invention est mise en œuvre en supprimant l' (les) étape (s) d'illumination du support de détection 1, 21. En d'autres termes, à l'exception de l'illumination du support, toutes les autres étapes, variantes et exemples de réalisation de la méthode de l'invention détaillés dans la présente description sont applicables à une méthode de détection de microorganismes par bioluminescence, si cela s'avère adapté et envisageable, en mettant en œuvre, bien évidemment, un marqueur bioluminescent adapté.
Quoiqu'il en soit, de manière particulièrement avantageuse, dans un premier mode de réalisation précis et non limitatif de l'étape d) de libération contrôlée, le marqueur cellulaire 4 que l'on souhaite libérer de façon contrôlée au cours de la méthode de l'invention est enveloppé dans un moyen d'encapsulation 8 formant ainsi, avantageusement, une microcapsule, une microbille ou une microsphère 9 présentant un diamètre par exemple de l'ordre de 100 pm.
De préférence, le moyen d'encapsulation 8 est sensible à l'application d'un stimulus externe 10 entraînant sa rupture et la libération du marqueur cellulaire 4.
Ainsi, tout préférentiellement, le moyen d'encapsulation 8 est constitué de cires lipidiques thermosensibles et la libération du marqueur 4 encapsulé est effectuée en appliquant progressivement une élévation de la température audit moyen d'encapsulation 8 en sorte que ce dernier fonde et libère le marqueur 4 au contact de potentiels microorganismes 2 à détecter.
Dans ce cas, la température à laquelle est soumis ledit moyen d'encapsulation thermosensible 8 peut progressivement être augmentée depuis une température ambiante jusqu'à une température ne dépassant pas 45°C, seuil au-delà duquel une destruction de certains microorganismes 2 pourrait intervenir.
Dans l'invention, préférentiellement, la libération du marqueur cellulaire 4 est effectuée de manière automatisée, permettant par conséquent de s'affranchir de toute opération manuelle source de contamination, et est contrôlée en sorte d'être faite avec la quantité adéquate de marqueur 4 et à la bonne cinétique pour un marquage efficace des microorganismes 2.
Selon une première variante, le marqueur cellulaire 4 est encapsulé sous forme liquide, la microcapsule 9 comportant alors, outre ledit marqueur 4, un solvant de mise en solution de celui- ci .
Dans une seconde variante de réalisation, le marqueur cellulaire 4 est encapsulé sous forme solide, notamment sous la forme d' une poudre . Suivant la libération du marqueur cellulaire 4 , on met alors ce dernier en présence d' un solvant de mise en solution approprié, par exemple de l'eau, afin que le marquage des microorganismes 2 puisse se faire .
Tout préférentiellement, dans cette variante de réalisation, le solvant de mise en solution du marqueur cellulaire 4 solide est contenu dans le disque support 13 en fibre de verre et la membrane filtrante 5 au travers de laquelle a été préalablement passé l'échantillon 3 est disposée au-dessus dudit disque support 13.
Ainsi, une fois la membrane filtrante 5 déposée au-dessus du disque support 13 (après filtration extérieure de l'échantillon 3) , ou bien une fois que l'échantillon 3 a été déposé et filtré directement sur la membrane filtrante 5 dans le support de détection 1, quel que soit le volume de l'échantillon 3, une couche de microcapsules 9 contenant le marqueur cellulaire 4 étant positionnée entre ladite membrane 5 et ledit disque 13, on vient imbiber de solvant adéquat ledit disque support 13 pour permettre, une fois le marqueur cellulaire 4 libéré de sa capsule 9 (par exemple par augmentation de la température) , une mise en solution de celui-ci. Cet exemple est illustré sur la figure 3B.
Dans la configuration de la figure 3B, il est également envisageable que l'on vienne imbiber le disque support 13 avec un solvant approprié et maintenu à une température apte à faire fondre la couche d'encapsulation 8 libérant ainsi le marqueur cellulaire 4 encapsulé sous forme de poudre solide en le mettant simultanément en solution pour qu'il révèle la présence éventuelle de microorganismes 2 sur la membrane 5.
Quoiqu'il en soit, lorsqu'une couche de microcapsules 9 contenant le marqueur cellulaire 4 sous forme solide ou liquide est positionnée au-dessus du disque support 13, ce dernier a alors pour fonction principale, après rupture desdites microcapsules 9, d' homogénéiser , par diffusion, la répartition dudit marqueur 4 sous la membrane 5, elle-même placée au-dessus de la couche de microcapsules 9. Ainsi, chaque microorganisme 2 susceptible d'être présent au niveau de ladite membrane 5 sera révélé par la méthode de l' invention .
A noter également que, dans ce mode de réalisation de l'étape d) et lorsque l'étape de dépose a) de l'échantillon 3 de faible volume (10 à 2000 pL) est effectuée directement sur le support de détection solide 1, pouvant être composé, là encore, d'au moins un disque support 13 et d'une membrane filtrante 5 encadrant une couche de microcapsules 9, ledit disque support 13 présente également une fonction de soutien desdites microcapsules 9 pour éviter qu'elles ne s'évacuent avec le liquide filtré au moment de la dépose .
Sur la figure 3A, la couche de microcapsules 9 est placée sous le disque support 13 par exemple en fibres de verre, et ledit disque 13 assure la diffusion par capillarité desdites microcapsules 9 ou du marqueur cellulaire 4 une fois celui-ci libéré de manière contrôlée, ainsi qu'une répartition homogène de ces microcapsules 9 diffusées sous la membrane filtrante 5.
Une libération contrôlée d' un marqueur cellulaire 4 au moyen d' une destruction du moyen d' encapsulation 8 dans lequel ledit marqueur 4 est contenu, bien que s'avérant particulièrement intéressante, ne doit pas être considérée comme étant le seul mode de réalisation de l'étape d) de la méthode de l'invention.
En effet, dans un second mode de réalisation de cette étape d) , le marqueur cellulaire 4 est acheminé directement sous la forme d'une solution liquide, et de manière contrôlée et automatisée , par exemple selon un débit contrôlé au travers de moyens appropriés, telle une pompe à débit contrôlée, pour une mise en contact avec le (s) microorganisme (s) 2 présent (s) à la surface de la membrane filtrante 5, 25 du support de détection 1, 21.
Cela étant, quel que soit le mode de libération retenu pour une mise en contact contrôlée du marqueur cellulaire 4 avec le (s) microorganisme (s) 2, ledit marqueur 4, qu'il soit de préférence fluorescent, ou bien encore bioluminescent ou non, présente tout préférentiellement une toxicité minimale à l'égard des microorganismes 2 potentiellement présents sur la membrane 5.
En effet, dans le cas où une contamination de l'échantillon 3 est détectée au cours de la mise en œuvre de la présente méthode , et dans certaines applications , notamment dans le domaine de la pharmacie industrielle, il peut s'avérer particulièrement intéressant de pouvoir ultérieurement identifier le microorganisme 2 détecté.
Une telle étape d' identification 12 , illustrée sur la figure 2, peut ainsi être réalisée par une mise en culture de l'échantillon 3 subséquente à la détection, notamment au travers du prélèvement de la membrane filtrante 5, 25 et du dépôt de celle-ci sur une gélose nutritive appropriée permettant la multiplication des microorganismes , puis par la mise en œuvre d'une méthode d'identification classique et bien connue de l'homme du métier, par exemple par spectrométrie de masse. Dans la méthode de détection de microorganisme (s) selon l'invention, suite à l'étape de libération contrôlée d'au moins un marqueur cellulaire 4, on prend, au cours d'une étape e) , et au cours d'au moins une phase P± ultérieure à la phase P0, au moins une image I±, i étant un nombre entier supérieur ou égal à 1.
Sur les figures 6 et 7 , une succession d' images respectivement I0 à I5 et I'0 à I'4, prises lors de la phase P0 et au cours de plusieurs phases ultérieures à P0, sont illustrées.
Chaque image I± prise au cours d'au moins une phase ultérieure P± est, le cas échéant, découpée en portions dudit support de détection 1, 21.
Une telle succession de prises d'images, l'une (par exemple I0) étant effectuée avant le marquage de microorganismes 2 par libération contrôlée du marqueur cellulaire 4 et au moins une autre (I±) après cette libération, permet de caractériser une cinétique de marquage de ces microorganismes 2 , autrement dit une évolution du comportement, et notamment préférentiellement de la fluorescence, éventuellement de la bioluminescence, desdits microorganismes, correspondant à une assimilation du marqueur 4 par ces derniers, entre la première prise d'image I0 sans le marqueur 4 et au moins la seconde prise d' image I± après libération de ce dernier.
On permet ainsi de différencier le comportement de particules inertes, par exemple de poussières, susceptibles d'émettre, par exemple , une fluorescence naturelle , des microorganismes 2 effectivement marqués au cours de la mise en œuvre du procédé .
En effet, dans cette hypothèse où les microorganismes 2 éventuels sont révélés au moyen d'un marqueur cellulaire 4 fluorescent, les particules inertes ou poussières qui seraient naturellement fluorescentes et qui ont été retenues sur la membrane filtrante 5 seront visibles et détectables sur l'image I0 avant libération contrôlée dudit marqueur 4 et sur au moins une image Ii après cette libération, tandis que lesdits microorganismes 2 ne seront visibles et détectables que sur l'image ! , notamment sur l'image Ii ou I'i. L'étape ultérieure f) , au cours de laquelle on procède à une analyse comparative desdites images I0 et I±, notamment au moins Ii ou I ' i , permettra de conclure quant à la présence ou à l'absence de microorganismes 2 dans l'échantillon 3 de départ.
En reprenant à présent l'hypothèse où, au cours de la phase P0 , ledit support de détection 1, 21 a été soumis à n déplacements selon des trajets distincts, ce support 1, 21 est à nouveau soumis, au cours de la phase P±, à n déplacements identiques afin que les images I0 et Ii prises respectivement à P0 et Pi puissent être comparées dans une étape ultérieure d'analyse comparative (étape f)) ·
En outre, une logique similaire s'applique aux images ultérieures, s'il y a lieu.
En effet, dans un mode de réalisation préférentiel, illustré sur les figures 6 et 7, suivant une première prise d'image Ii, I'i au cours d' une première phase ultérieure Pi , après un laps de temps variable, de l'ordre de quelques secondes à quelques dizaines de secondes, par exemple entre 10 et 30 secondes, on procède à nouveau à une prise d'image I2, I'2 de chaque portion dudit support 1 ayant fait l'objet d'une prise d'image durant les phases P0 et Pi.
Ainsi, dans la méthode de détection de l'invention, il est envisageable et avantageux de répéter plusieurs fois l'étape e) de prise d'image I±, après l'étape d) de libération contrôlée du marqueur cellulaire 4 et avant l'étape f) d'analyse comparative des images I0, I'o ; Ii, I'i ; I2, I'2, etc, les prises d'image Ii successives étant espacées d'un laps de temps compris entre 10 et 30 secondes, de préférence 20 secondes.
Chaque image est bien entendue mémorisée par le dispositif 14, afin que les traitements ultérieurs, notamment de comparaison, puissent être mis en œuvre .
Tout préférentiellement, l'étape e) de la présente méthode est répétée trois fois successivement avant l'étape d'analyse comparative f) , en sorte de générer trois images Ii, I'i ; I2, I'2 ; I3, I ' 3 , de chaque portion du support de détection 1, 21 ayant fait l'objet d'une image à P0 au cours de phases ultérieures de prises d'images respectivement Pi, P2 et P3.
Encore plus préférentiellement, on génère cinq images de Ii à I5 ou de I'i à I'5 (l'image I'5 n'étant cependant pas reprise sur la figure 7) de chacune des portions du support de détection 1, 21 ayant été visualisée pendant la phase P0.
Ainsi, en libérant, de manière particulièrement originale, le marqueur cellulaire 4 après le dépôt de l'échantillon 3 sur le support de détection 1, 21 et suivant également une première prise de vue I0 en phase P0, les microorganismes 2 hypothétiquement présents dans ledit échantillon 3 seront marqués , de préférence dès le stade unicellulaire , dans un laps de temps court, de l'ordre de quelques minutes , correspondant à la cinétique des réactions d'assimilation du marqueur cellulaire 4 par le microorganisme 2, permettant ainsi un résultat de détection rapide par prises d'images I0, I'o ; Ii, I'i, etc., successives du support 1, 21 après le marquage au cours de différentes phases P0, Pi, etc.
En fonction de la nature du marqueur cellulaire 4 utilisé dans l'étape d) de la méthode, la réaction biochimique d'assimilation de celui-ci par un microorganisme 2 peut être, notamment, soit une réaction enzymatique, soit une réaction d' oxydo-réduction, ou bien encore une réaction d'intercalation dudit marqueur entre les bases d' un acide nucléique .
La caractérisation d' une cinétique de marquage des microorganismes 2 potentiellement présents dans l'échantillon 3 à tester permet en outre de différencier rapidement le comportement de particules inertes ou poussières, susceptibles d'émettre une fluorescence de manière naturelle, de celui desdits microorganismes 2 , entraînant une réduction significative des faux positifs en comparaison avec les systèmes proposés dans l'état de la technique.
Il ressort également de ce qui précède que la mise en œuvre de la méthode de l'invention permet la détection d'un contaminant unique correspondant à une UFC, c'est à dire une Unité Formant Colonie, selon la terminologie de l'homme du métier, qui peut être contenu dans l'échantillon 3 de départ. La conclusion quant à la contamination ou non dudit échantillon 3 est rendue suite à l'étape f) d'analyse comparative entre l'image I0 ; I'0 prise lors de la première phase P0, et au moins l'image I± (par exemple l'image Ii ; I'i), déjà évoquée précédemment dans la description et qui est mise en œuvre, avantageusement, au moyen d'un algorithme de traitement d'images et de détection 11.
A noter également que, lorsqu' est détectée, au cours de cette étape d'analyse f) , la présence d'au moins un microorganisme 2 contaminant, une étape g) de dénombrement du ou des microorganisme (s) 2 présent (s) dans l'échantillon 3 et sur le support de détection 1, 21 peut être mise en œuvre.
Cette étape g) optionnelle peut également être effectuée par l'algorithme 11.
Cet algorithme 11 doit permettre par conséquent notamment de détecter de la manière la plus précise possible et rapidement, la présence ou non de microorganismes 2 sur les images Ii, I'i ; I2, I ' 2 etc., en évaluant l'évolution du comportement desdits microorganismes 2 au cours du temps , et en les discriminant des éventuels artefacts, notamment des poussières, puis de dénombrer ces microorganismes 2.
En outre, tout préférentiellement, l'algorithme 11 est apte à détecter des éléments (poussières, microorganismes...) , dont les dimensions sont de l'ordre de, voire inférieures à la résolution des capteurs du dispositif optique 7 de prises de vues .
C'est l'un des avantages prépondérants de l'invention : l'utilisation d'une méthode basée sur la cinétique d'assimilation du marqueur cellulaire 4 par les microorganismes 2 permet de s'affranchir, dans une certaine mesure, de l'exigence de résolution optique.
En effet, la variation d'intensité de fluorescence due à la cinétique de marquage peut être détectée sur un seul pixel. La taille du microorganisme 2 n'est donc pas nécessairement supérieure à la taille d'un pixel. Dans certains cas, l'intensité de lumière émise par un microorganisme 2 de taille inférieure à un pixel est juste suffisante pour éclairer ledit pixel. Si cette intensité peut être insuffisante pour détecter de manière certaine le microorganisme 2, la variation d'intensité au cours du marquage peut être un élément suffisant pour le détecter.
Tout préférentiellement, l'étape e) de prise d'image I± du support de détection 1, 21 suivant la libération contrôlée du marqueur cellulaire 4 , est effectuée selon un décalage temporel suivant la libération dudit marqueur 4 compris typiquement entre 20 et 300 secondes, de préférence entre 80 et 160 secondes dans le cas d'un marquage à l'acridine orange par exemple.
Un tel décalage temporel, suivant la libération contrôlée du marqueur 4 , et donc suivant la mise en contact dudit marqueur 4 avec un microorganisme 2 éventuellement présent au niveau du support de détection, respecté avant la prise d'image I±, permet de s'assurer que ledit microorganisme 2 a correctement assimilé ledit marqueur 4.
Dans un exemple de réalisation tout préférentiel, on illumine ponctuellement le support de détection 1, 21 via un rayonnement lumineux 6 apte à révéler le marqueur cellulaire 4 , et ce de manière simultanée, ou quasi-simultanée, à chacune des prises d'images effectuées, aussi bien la prise d'image initiale I0, I'o de l'étape b) en une première phase P0, que simultanément à la prise d'image I± qui a lieu en au moins une phase ultérieure R±.
En d'autres termes, en dehors de phases de prises d'images P0 et Pi le support de détection 1, 21 peut ne pas être illuminé par le rayonnement lumineux 6.
A noter que, tout préférentiellement, la méthode de l'invention présente au moins les étapes suivantes, prises dans 1' ordre :
al) On dépose l'échantillon 3 à analyser sur ledit support de détection solide 1, 21 ;
bl) On illumine ponctuellement ledit support de détection 1, 21 via un rayonnement lumineux 6 apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire 4 ;
cl) Simultanément à l'étape d'illumination bl) , on prend au moins une image I0, I'o en une première phase P0 dudit échantillon 3 sur au moins une portion dudit support de détection 1, 21 au moyen d'un dispositif optique 7 de prises de vues présentant une résolution au moins égale à 20 mégapixels et un champ d' observation d' au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large ;
dl) On procède à une libération contrôlée du marqueur cellulaire 4, voire d'une succession de marqueurs cellulaires 4 ou agents réactifs, au travers du support de détection 1, 21, pour une mise en contact dudit marqueur 4 avec ledit microorganisme 2 ;
el) Dans un laps de temps inférieur à 5 secondes après l'étape dl) de libération contrôlée dudit marqueur cellulaire 4, on illumine ponctuellement ledit support de détection 1, 21 via ledit rayonnement lumineux 6 apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire 4 ;
fl) Simultanément à l'étape d'illumination el) , on prend une image Ii, I'i de chaque portion du support de détection 1, 21 ayant fait l'objet d'une image I0, I'o à P0 en au moins une phase ultérieure Pi suivant l'étape de libération contrôlée dudit marqueur 4 ;
gl) On illumine à nouveau ponctuellement, au moins une fois, ledit support de détection 1, 21 via ledit rayonnement lumineux 6 ;
hl) Simultanément à l'étape d'illumination gl) , on prend une image I2, I'2 de chaque portion du support de détection 1, 21 ayant fait l'objet d'une image I0, I'0 à P0 et I1 I'i à Pi en au moins une seconde phase ultérieure P2 en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme 2 selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit microorganisme 2 ;
il) On procède à une analyse comparative, par portion du support de détection 1, 21, entre ladite image I0, I'o prise à P0 et lesdites images Ii, I'i ; I2, I'2 prises en au moins deux phases ultérieures Pi et P2 et on conclut quant à la présence ou non d' au moins un microorganisme 2 dans ledit échantillon 3.
Les étapes gl) et hl) pour la prise de l'image I2, I'2 sont mises en œuvre préférentiellement dans un laps de temps de 20 et 300 secondes, de préférence entre 80 et 160 secondes, suivant l'étape fl) au cours de laquelle est prise l'image Ii, I'i.
Ά noter que les variantes ou modes de réalisation ou exemples préférentiels des étapes a) à f) décrits précédemment dans la description sont également applicables aux étapes correspondantes al) à il) de la méthode présentée dans le paragraphe ci-dessus.
Une telle méthode est particulièrement intéressante, car elle permet, d'une part, de discriminer de manière efficace :
- Une première catégorie de particules inertes ou poussières qui émettent, par exemple, une fluorescence ou une bioluminescence de manière naturelle, et qui seront visualisées sur l'image I0 , I ' o prise en une première phase P0 , avant l'étape dl) de libération contrôlée du marqueur cellulaire 4 ;
- Une seconde catégorie de particules inertes ou poussières, qui ne sont pas autofluorescentes (et donc non visualisables sur l'image I0 , I ' o) mais qui absorbent rapidement le marqueur cellulaire 4 après libération contrôlée de celui-ci, ces poussières seront alors visibles nettement sur l'image Ii, I'i ;
- Le (ou les) microorganisme (s) 2 éventuellement présent (s) dans l'échantillon 3 de départ qu'il convient d'analyser, et qui ne sera (seront) pas visible (s) sur l'image I0 , I ' o , qui peuvent commencer à apparaître sur l'image Ii , I ' i , avec une intensité lumineuse faible, et qui sont ensuite nettement visibles , avec une intensité lumineuse plus importante, sur les images I2 , I ' 2 et suivantes éventuellement, étant entendu que les étapes gl) et hl) peuvent être répétées autant de fois que souhaité pour prendre des images au cours de phases ultérieures P2, P3, etc .
La figure 7 illustre une série de prises d'images I'0 à I'4, et met en relation certains des éléments visibles sur ces images, notamment sur les images I'i à I'4, avec les profils Prj., Pr2a et Pr2b illustrant la variation d' intensité lumineuse des éléments en question en fonction du temps suivant le moment (0 sur l'axe des abscisses) où le marqueur cellulaire 4 est libéré de manière contrôlée et mis au contact desdits éléments, en l'occurrence poussières et levures Candida albicans présents dans l'échantillon 3 et sur le support de détection solide 1, 21.
Sur l'image I'0, prise avant l'étape de libération contrôlée du marqueur cellulaire 4, aucun élément n'est visible. Il ressort par conséquent de cette image I'0 qu'aucune poussière émettant de la lumière de manière naturelle n'est présente dans ledit échantillon 3 de départ.
Sur les images suivantes I'i à I'4, après marquage, il est visible que certains éléments présents dans ledit échantillon 3 présentent une intensité lumineuse importante et sensiblement constante au cours du temps, suivant l'étape de marquage. En l'occurrence, la comparaison des images successives I'i à I'4 permet de conclure qu'il s'agit là d'une poussière ayant absorbé le marqueur cellulaire et dont le profil Pr! est représenté graphiquement en liaison avec le point lumineux identifié.
Sur la succession d'images I'i à I'4 après marquage, d'autres éléments sont également visualisés, en l'occurrence des microorganismes, et dont l'intensité lumineuse, représentée sur les profils Pr2a et Pr2b , augmente de manière progressive au cours du temps jusqu'à atteindre un pic d'intensité, correspondant à une assimilation progressive du marqueur cellulaire 4 par un microorganisme 2 (levures Candida albicans dans ce cas) , avant que cette intensité lumineuse ne diminue également de manière progressive, ce qui correspond au phénomène de photoblanchiment.
A noter que, dans l'hypothèse où, sur le support de détection 1, 21, une particule inerte, par exemple une poussière, émettant naturellement de la lumière aurait été déposée au cours de la première étape al) de la méthode de l'invention, celle-ci aurait été visible sur l'image I'0 ainsi que sur toutes les images I'± suivantes. Une telle poussière aurait donc, également, pu être différenciée d'un microorganisme 2, par la mise en œuvre de la méthode de détection selon la présente invention.
La présente invention concerne également un dispositif de détection 14 automatisé d'au moins un microorganisme 2, de type bactérie, levure ou moisissure, éventuellement présent dans un échantillon 3 à tester, et apte à mettre en œuvre les étapes de la méthode de détection décrite ci-dessus .
Avantageusement, le dispositif 14 selon l'invention comporte au moins :
un support de détection solide 1, 21 destiné à recevoir ledit échantillon à analyser 3 susceptible de contenir au moins un microorganisme 2. Ce support 1, 21 est préférentiellement constitué par au moins une membrane filtrante 5, 25, au travers de laquelle est passé l'échantillon 3, et d'un disque support 13, 23 sur lequel repose la membrane 5, 25.
Dans mode de réalisation, illustré sur les figures 3A et 3B, le support de détection 1 peut être complété par un couvercle de protection 16 et par un moyen de maintien de l'ensemble des éléments du support 1 sur une platine support rigide 18, ledit moyen de maintien pouvant se présenter sous la forme d' un cerclage 17.
Dans un autre mode de réalisation, illustré plus précisément sur les figures 4A et 4B, le support de détection 21, comprenant une membrane filtrante 25 reposant sur un disque support 23 en fibre de verre, est complété par :
• un moyen support 24 rigide notamment en matière plastique, et perméable, par la présence d'une pluralité de perforations de forme circulaire et/ou de perforations de forme oblongue, ledit moyen support rigide 24 étant également dénommé, dans la suite de la description drain 24 ; celui-ci présente une forme et des dimensions similaires ou quasi-similaires à celles du disque support 23 et de la membrane filtrante 25 ;
• une embase 26 rigide, fabriquée par exemple en matière plastique, traversée, d'une part par un conduit d' amenée 26a d'un liquide, en l'occurrence le marqueur cellulaire 4, ledit conduit 26a étant prolongé par une cheminée 26b faisant saillie de ladite embase 26 et traversant un premier orifice 24a ménagé dans le drain 24 et un deuxième orifice 23a ménagé dans le disque support 23 par exemple en fibres de verre et, d'autre part, par un conduit d'aspiration et d'évacuation 26c d'un liquide ; ce conduit 26c est relié, au travers de moyens appropriés , à un récipient de réception du liquide résiduel évacué en vue de son traitement ultérieur ou de sa destruction ;
• un anneau de serrage 27 maintenant, de manière solidaire, l'ensemble des composants du support de détection 21 ; à cet effet, de préférence, ledit anneau de serrage 27 ainsi que l'embase 26 présentent un filetage et ledit anneau de serrage 27 est apte à enserrer l'ensemble des composants du support de détection 21 ;
• un joint d'étanchéité 28 pouvant être ajouté pour garantir l'étanchéité du support de détection 21.
un moyen de stockage d' au moins un marqueur cellulaire 4 dudit microorganisme 2.
Dans un mode de réalisation, illustré sur les figures 3Ά et 3B, le moyen de stockage 19 est inclus dans le support de détection 1. Plus précisément un tel moyen de stockage 19 est positionné préférentiellement sous la membrane filtrante 5, et de préférence entre ladite membrane 5 et le disque support 13 en fibres de verre. Un tel moyen de stockage 19 est également représenté sur la figure 5 et se présente avantageusement sous la forme d' une couche de microcapsules 9, chaque microcapsule 9 de la couche étant constituée du marqueur cellulaire 4 enveloppé dans un moyen d'encapsulation 8. Il est également envisageable que ce moyen de stockage 19 soit positionné sous le disque support 13 en fibres de verre sur lequel repose alors, directement, la membrane filtrante 5.
Dans un autre mode de réalisation, dans lequel le dispositif de détection 14 comporte le support de détection 21 illustré sur les figures 4Ά et 4B, le moyen de stockage de marqueur cellulaire 4 consiste en une réserve de solution liquide de marqueur 4 , cette réserve étant distincte dudit support de détection 21 et ledit dispositif 14 comprenant alors des moyens d' acheminement du marqueur cellulaire 4 depuis ledit moyen de stockage vers ledit support de détection 21. Ces moyens d'acheminement du marqueur cellulaire 4 sous forme liquide sont alors en connexion, au travers de moyens de liaison appropriés , avec le conduit d' amenée 26a de liquide de l'embase 26 du support de détection 21. Au travers du conduit d' amenée 26a puis de la cheminée 26b de l'embase 26 qui traverse le drain 24 par l'orifice 24a et le disque support 23 par l'orifice 23a, le marqueur cellulaire 4 sous forme liquide sera, dans ce cas de figure, acheminé directement sur le dessus dudit disque support 23, sous la membrane filtrante 25 susceptible de contenir des microorganismes 2 à détecter.
un moyen 15 de libération contrôlée dudit marqueur cellulaire 4 pour une mise en contact dudit marqueur 4 avec ledit échantillon 3 à analyser.
Un tel moyen peut comporter par exemple , dans le mode de réalisation où le moyen de stockage d' au moins un marqueur cellulaire 4 se présente sous la forme d'une couche de microcapsules 9, des moyens de chauffage du support de détection 1, associés à des moyens classiques de contrôle et de régulation de la température, afin d'appliquer une augmentation de la température pour faire fondre le moyen d' encapsulation 8 et libérer le marqueur 4.
Dans un autre exemple de réalisation, le marqueur cellulaire 4 , de préférence sous forme liquide , peut être acheminé progressivement au moment opportun depuis une réserve distincte vers le support de détection 1, 21 par le dessous de celui-ci, notamment sous le disque support 13, 23 et être diffusé par capillarité au moyen de ce disque 13, 23 pour une mise en contact du marqueur 4 avec les microorganismes 2 pouvant être retenus sur la membrane 5, 25. Dans ce cas, le moyen 15 de libération contrôlée, illustré de manière très schématique sous la forme d'une seringue d'injection sur la figure 2, peut consister en des moyens d' aspiration du marqueur 4 liquide et des moyens de régulation du débit d'acheminement, par exemple une pompe à débit contrôlée ;
un moyen d'illumination 6 dudit support de détection 1, 21 apte à la révélation du marqueur cellulaire 4 , notamment basés sur un faisceau laser ou, plus préférentiellement encore, des diodes électroluminescentes à forte puissance ;
un dispositif optique 7 de prises de vues d'au moins une portion dudit support de détection 1, 21 et positionné au-dessus de ce support 1, 21 ledit dispositif optique 7 présentant de préférence une résolution au moins égale à 20 mégapixels, plus préférentiellement au moins égale à 100 mégapixels. Ce dispositif optique 7 présente encore préférentiellement une profondeur de champ de l'ordre de 0,5 mm, ou égale à 0,5 mm pour s'affranchir des défauts de planéité du support de détection 1 qui doit être visualisé. Il consiste, de manière avantageuse, en une caméra à capteurs CMOS et présente un champ de vision de dimensions par exemple d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large, et, plus préférentiellement encore, de 25*25 mm.
Le support de détection 1, 21 peut également coopérer avec des moyens de déplacement dudit support 1, 21 sous ce dispositif optique 7 de prises de vue, dans l'hypothèse où le support de détection 1, 21 doit être divisé en plusieurs portions pour la prise de vue avant et après le marquage et pour l'observation d'un champ plus large . Ces moyens de déplacement ne sont pas représentés sur les figures .
des moyens de mémorisation, de comparaison et d'analyse des prises de vue prises par le dispositif optique 7 en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme 2 éventuellement présent dans ledit échantillon 3 selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit au moins un microorganisme 2. De tels moyens d' analyse consistent préférentiellement en un algorithme de traitement d'images et de détection 11.
Les figures 4Ά et 4B illustrent un mode de réalisation particulièrement préférentiel d'un support de détection solide 21, destiné à recevoir ledit échantillon à analyser 3 susceptible de contenir au moins un microorganisme 2 , et qui peut être mis en œuvre dans la méthode de détection selon l'invention ou bien faire partie du dispositif de détection 14 apte à mettre en œuvre les étapes de cette méthode . Comme visible sur ces figures 4A et 4B, ce support de détection 21 est composé par au moins une membrane filtrante 25 au travers de laquelle est passé l'échantillon 3 et d'un disque support 23 en fibre de verre sur lequel repose la membrane 25.
Un tel dispositif de détection est également muni d'un moyen support 24, ou drain 24, rigide et perméable au moyen d'une pluralité de perforations de forme circulaire et/ou de perforations de forme oblongue . Sur ce drain 24 vient reposer le disque support 23 en fibres de verre surmonté lui-même de ladite membrane filtrante 25. Ainsi, ces trois éléments, disque support 23, drain 24 et membrane filtrante 25 présentent, avantageusement, une forme, essentiellement circulaire, ainsi que des dimensions similaires ou quasi-similaires.
Un tel support 24 rigide et perméable permet, notamment, le maintien de la planéité des éléments souples qu'il supporte, disque 23 et membrane 25, susceptibles d'être soumis à des déformations lors de la mise en œuvre de la méthode de l'invention, par le dépôt de l'échantillon 3 à la surface de ladite membrane 25, par l'aspiration du liquide résiduel, etc. En outre, du fait de la présence de nombreuses perforations , une évacuation de liquide est possible au travers de ce support 24.
Ledit support rigide ou drain 24 est lui-même monté sur une embase 26 rigide traversée par au moins un conduit d' amenée 26a d'un liquide et par au moins un conduit d'aspiration et d'évacuation 26c d'un liquide.
Ledit conduit d' amenée 26a a pour fonction l'acheminement du marqueur cellulaire 4 au niveau du support de détection 21, ledit conduit 26a étant d'ailleurs prolongé par une cheminée 26b faisant saillie de ladite embase 26 et traversant, d'une part, un premier orifice 24a ménagé dans le drain 24 et, d'autre part, un deuxième orifice 23a ménagé dans le disque support 23 en fibres de verre en sorte d' amener le marqueur cellulaire liquide 4 au contact immédiat de la membrane filtrante 25 et donc des microorganismes 2 qu'elle contient potentiellement.
Outre le conduit d' amenée 26a, l'embase 26 est également traversée d'au moins un conduit d'aspiration et d'évacuation 26c d'un liquide, que ce soit un surplus de marqueur cellulaire 4 liquide après mise en contact de celui-ci avec la membrane filtrante 25, ou tout autre liquide, par exemple le liquide résiduel de l'échantillon 3 après filtration par la membrane 25 ou bien encore un liquide de lavage .
Un anneau de serrage 27 maintenant de manière solidaire l'ensemble des composants du support de détection 21, ainsi que, de manière optionnelle, un joint d'étanchéité 28, complètent ledit support 21.
A noter que, quel que soit le mode de réalisation retenu en ce qui concerne le support de détection 1, 21, la membrane filtrante 5, 25 présente avantageusement une couleur foncée, de préférence une couleur noire, dans le but de permettre une révélation optimale de la fluorescence ou de la bioluminescence du marqueur cellulaire 4 , par contraste entre la lumière émise et la teinte foncée de ladite membrane filtrante 5, 25.
Si la méthode de détection ou le dispositif 14 de détection de l'invention est mis en œuvre dans l'objectif de détecter des cellules ou des microorganismes 2 au stade unicellulaire , une membrane 5, 25 en polyester ou en polycarbonate sera préférée, tandis que , pour la détection d' amas de cellules sous la forme de microcolonies, après une phase de culture, une membrane 5, 25 en ester ou nitrate de cellulose sera préférée .
De manière générale, les éléments qui ont été décrits ci- dessus pour la méthode de détection peuvent être appliqués au dispositif de détection et aux supports de détection 1, 21 selon l'invention, et inversement, si cela s'avère adapté et envisageable .
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples illustrés et décrits précédemment qui peuvent présenter des variantes et modifications sans pour autant sortir du cadre de 1 ' invention .

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détection, sur un support de détection solide (1, 21), d'au moins un microorganisme (2), du type bactérie, levure ou moisissure, présent dans un échantillon à analyser (3) et révélé par au moins un marqueur cellulaire (4) , ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comporte, au moins, les étapes suivantes, prises dans l'ordre :
a) On dépose ledit échantillon (3) à analyser sur ledit support de détection solide (1, 21) ;
b) On illumine au moins une fois ledit support de détection
(1) via un rayonnement lumineux (6) apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire (4) ;
c) On prend au moins une image (I0) en une première phase P0 dudit échantillon (3) sur au moins une portion dudit support de détection (1, 21) au moyen d'un dispositif optique (7) de prises de vues visant un champ d'observation d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large ;
d) On procède à une libération contrôlée dudit au moins un marqueur cellulaire (4) , au travers du support de détection (1, 21) , pour une mise en contact dudit marqueur (4) avec ledit microorganisme (2) ;
e) On prend, au moyen dudit dispositif optique (7) , une image (Ii) (i³l) de chaque portion du support de détection (1, 21) ayant fait l'objet d'une image à P0 en au moins une phase ultérieure P± suivant l'étape de libération contrôlée dudit marqueur (4) en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme (2) selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit microorganisme (2) ; f) On procède à une analyse comparative, par portion du support de détection (1, 21) , entre ladite image (I0) prise à P0 et chaque image (Ii) prise en au moins une phase ultérieure Pi et on conclut quant à la présence ou non d'au moins un microorganisme (2) dans ledit échantillon (3) .
2. Méthode de détection selon la revendication précédente , caractérisée en ce qu'on illumine ponctuellement ledit support de détection (1, 21) via un rayonnement lumineux (6) à chaque prise d'image à P0, P±.
3. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte, au moins, les étapes suivantes, prises dans 1' ordre :
al) On dépose ledit échantillon (3) à analyser sur ledit support de détection solide (1, 21) ; bl) On illumine ponctuellement ledit support de détection (1, 21) via un rayonnement lumineux (6) apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire (4) cl) Simultanément à l'étape d'illumination bl) , on prend au moins une image (I0, I'o) en une première phase P0 dudit échantillon (3) sur au moins une portion dudit support de détection (1, 21) au moyen d'un dispositif optique (7) de prises de vues visant un champ d'observation d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large ;
dl) On procède à une libération contrôlée dudit au moins un marqueur cellulaire (4) , au travers du support de détection (1, 21) , pour une mise en contact dudit marqueur (4) avec ledit microorganisme (2) ; el) Dans un laps de temps inférieur à 5 secondes après l'étape dl) de libération contrôlée dudit marqueur cellulaire (4) , on illumine ponctuellement ledit support de détection (1, 21) via ledit rayonnement lumineux (6) apte à révéler ledit au moins un marqueur cellulaire (4) ;
fl) Simultanément à l'étape d'illumination el) , on prend, au moyen dudit dispositif optique (7) , une image (Ii, I'i) de chaque portion du support de détection (1, 21) ayant fait l'objet d'une image à P0 en au moins une phase ultérieure Pi suivant l'étape de libération contrôlée dudit marqueur (4) ;
gl) On illumine à nouveau ponctuellement, au moins une fois, ledit support de détection (1, 21) via ledit rayonnement lumineux (6) ;
hl) Simultanément à l'étape d'illumination gl) , on prend, au moyen dudit dispositif optique (7) , une image (I2 , 1·' 2) de chaque portion du support de détection (1, 21) ayant fait l'objet d'une image à P0 et à Pi en au moins une seconde phase ultérieure P2 en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme (2) selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit microorganisme (2) ;
il) On procède à une analyse comparative, par portion du support de détection (1, 21) , entre ladite image
(I0, I' 0) prise à P0 et lesdites images (Ii, I'i ; I2, I' 2) prises en au moins deux phases ultérieures Pi et P2 et on conclut quant à la présence ou non d'au moins un microorganisme (2) dans ledit échantillon (3) .
4. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisée en ce que le support de détection (1, 21) est soumis à n déplacements selon des trajets distincts en vue d'une division spatiale dudit support de détection (1, 21) en n+1 portions faisant l'objet de prises de vues en au moins deux phases P0 et Pi, n étant un nombre entier inférieur ou égal à 20.
5. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'on utilise, au cours des étapes de prises d'image c) et e) ou cl) , fl) et hl) , un dispositif optique (7) de prises de vues présentant une résolution au moins égale à 20 mégapixels, et de préférence supérieure à 100 mégapixels.
6. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que, si l'on conclut à la présence d'au moins un microorganisme (2) dans ledit échantillon (3) au cours de l'étape f) ou il), on effectue un dénombrement des microorganismes (2) présents dans ledit échantillon (3) .
7. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisée en ce que ledit marqueur cellulaire (4) est un marqueur fluorescent.
8. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes , caractérisée en ce que ledit marqueur cellulaire (4) libéré de manière contrôlée au cours de l'étape d) ou dl) est enveloppé dans un moyen d'encapsulation (8).
9. Méthode de détection selon la revendication précédente, caractérisée en ce que ledit marqueur cellulaire (4) est enveloppé dans un moyen d'encapsulation (8) sous forme solide, par exemple sous la forme d'une poudre, et en ce que ledit support de détection (1) comprend un solvant de mise en solution dudit marqueur (4) .
10. Méthode de détection selon la revendication 8 caractérisée en ce que ledit marqueur cellulaire (4) est encapsulé sous forme liquide .
11. Méthode de détection selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que ledit moyen d'encapsulation (8) est thermosensible et, dans l'étape d) ou dl) , on procède à une libération contrôlée du marqueur cellulaire (4) enveloppé dans ledit moyen d'encapsulation (8) thermosensible en soumettant ce dernier à une augmentation de la température apte à faire fondre ledit moyen d'encapsulation (8) thermosensible .
12. Méthode de détection selon la revendication précédente , caractérisée en ce que l' on augmente la température depuis la température ambiante jusqu'à une température maximale de 45°C .
13. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'on achemine le marqueur cellulaire (4) en solution liquide de manière contrôlée jusqu' audit support de détection solide (21) contenant l'échantillon (3) à analyser.
14. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'on dépose directement un volume compris entre 10 et 2000 pL dudit échantillon (3) à analyser sur ledit support de détection (1, 21).
15. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que l'on filtre ledit échantillon (3) à analyser au travers d'une membrane filtrante (5, 25) ayant un seuil de coupure compris 0,2 et 0,45 pm, de préférence un seuil de coupure égal à 0,3 pm, ladite membrane filtrante (5, 25) étant positionnée directement dans ledit support de détection (1, 21).
16. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que pour distinguer les microorganismes des poussières sur les supports de détection (1, 21) ayant reçu les échantillons à analyser, les étapes suivantes sont mises en oeuvre:
- mesure après chaque prise de vue de la luminosité des pixels ou groupes de pixels luminescents détectés;
- comparaison de la luminosité de chaque pixel ou groupe de pixels luminescents détecté sur les différentes prises de vue ;
- identification des pixels ou groupes de pixels dont la luminosité n'évolue pas sensiblement dans au moins deux prises de vues consécutives au cours de la cinétique de marquage ;
- analyse et comptage des pixels ou groupes de pixels dont la luminosité évolue au cours de la cinétique de marquage.
17. Dispositif de détection (14) d'au moins un microorganisme (2) , du type bactérie, levure ou moisissure, présent dans un échantillon à analyser (3) , apte à mettre en œuvre la méthode des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, au moins :
- un support de détection solide (1, 21) destiné à recevoir ledit échantillon à analyser (3) susceptible de contenir au moins un microorganisme (2) ;
- un moyen de stockage d' au moins un marqueur cellulaire (4) dudit microorganisme (2) ;
- un moyen (15) de libération contrôlée dudit marqueur cellulaire (4) pour une mise en contact dudit marqueur (4) avec ledit échantillon (3) à analyser ;
- un moyen d'illumination (6) dudit support de détection (1, 21) ;
- un dispositif optique (7) de prises de vues d'au moins une portion dudit support de détection (1, 21) , ledit dispositif optique (7) présentant un champ d'observation d'au moins 10 mm de long sur au moins 10 mm de large ; - des moyens de mémorisation, de comparaison et d'analyse des prises de vue prises par le dispositif optique (7) en sorte de détecter ledit au moins un microorganisme (2) éventuellement présent dans ledit échantillon (3) selon l'évolution de la cinétique de marquage dudit au moins un microorganisme (2) .
18. Dispositif de détection (14) selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de déplacement dudit support de détection (1, 21) sous ledit dispositif optique (7) de prises de vues.
19. Dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que ledit support de détection (1, 21) solide comporte au moins une membrane filtrante (5, 25) reposant sur un disque support (13, 23) en fibre de verre.
20. Dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que ledit moyen de stockage (19) du marqueur cellulaire (4) est inclus dans le support de détection (1) et consiste en une couche de microcapsules (9) constituées dudit marqueur cellulaire (4) enveloppé dans un moyen d'encapsulation (8), ladite couche de microcapsules (9) étant disposée entre ledit disque support (13) en fibres de verre et ladite membrane de filtre (5) .
21. Dispositif de détection (14) selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit moyen de libération contrôlée du marqueur cellulaire (4) comporte des moyens de chauffage et des moyens de contrôle et de régulation de la température aptes à opérer une augmentation de la température au sein du dispositif (14) et faire fondre ledit moyen d'encapsulation (8) enveloppant marqueur cellulaire (4) .
22. Dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que ledit moyen de stockage du marqueur cellulaire (4) consiste en une réserve de solution liquide de marqueur cellulaire (4) distincte du support de détection (21) et que ledit dispositif de détection (14) comprend des moyens d'acheminement dudit marqueur cellulaire (4) depuis ledit moyen de stockage vers ledit support de détection (21) .
23. Dispositif de détection (14) selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit moyen de libération contrôlée du marqueur cellulaire (4) comporte au moins une pompe à débit contrôlé .
24. Dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, caractérisé en ce que ledit dispositif optique (7) de prises de vues présente une profondeur de champ de l'ordre de ou égale à 0,5 mm.
25. Dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, caractérisé en ce que ledit dispositif optique (7) de prises de vues est basé sur une caméra à capteurs CMOS .
26. Dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 à 25, caractérisé en ce que ledit dispositif optique (7) de prises de vues présente un champ de vision de 25 mm*25 mm.
27. Dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 à 26, caractérisé en ce que ledit dispositif optique (7) de prises de vues présente une résolution au moins égale à 20 mégapixels et de préférence supérieure à 100 mégapixels.
28. Support de détection (21) apte à être mis en œuvre dans la méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 ou entrant dans la composition du dispositif de détection (14) selon l'une quelconque des revendications 17 à 27 caractérisé en ce qu'il est composé, au moins, d'une embase (26) rigide traversée par au moins un conduit d' amenée (26a) d'un liquide et au moins un conduit d'aspiration et d'évacuation (26c) d'un liquide, ledit conduit d' amenée (26a) étant prolongé par une cheminée (26b) faisant saillie de ladite embase (26) et traversant, d'une part, un premier orifice (24a) ménagé dans un moyen support (24) rigide et perméable surmontant ladite embase (26) et, d'autre part, une deuxième orifice (23a) ménagé dans un disque support (23) souple en fibres de verre, ledit disque
(23) étant positionné sur ledit moyen support rigide et perméable (24) et supportant une membrane filtrante (25) ayant un seuil de coupure compris 0,2 et 0,45 pm, apte à la rétention de microorganismes (2) , ledit support de détection
(21) comprenant en outre un anneau de serrage (27) fixé solidairement à ladite embase (26) et maintenant ensemble ladite embase (26) , ledit support moyen rigide et perméable
(24) , ledit disque support (23) et ladite membrane filtrante (25) .
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3158560A1 (fr) 2024-01-22 2025-07-25 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon
WO2025157873A1 (fr) 2024-01-22 2025-07-31 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon
WO2026022384A1 (fr) 2024-07-25 2026-01-29 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113033510B (zh) * 2021-05-21 2021-10-15 浙江大华技术股份有限公司 图像变化检测模型的训练和检测方法、设备及存储介质

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0713087A1 (fr) * 1994-11-17 1996-05-22 Chemunex Appareil et procédé de détection et de numération rapides et ultrasensibles de micro-organismes par fluorescence

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2184346T3 (en) * 2001-09-06 2017-06-26 Rapid Micro Biosystems Inc Rapid detection of replicating cells
US20060050946A1 (en) * 2002-05-10 2006-03-09 Mitchison Timothy J Computer-assisted cell analysis
US20060073470A1 (en) * 2002-05-30 2006-04-06 Naohiro Noda Method of counting microorganisms or cells
DE10259302A1 (de) * 2002-12-17 2004-07-08 Henkel Kgaa Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Keimen
US20060246535A1 (en) * 2003-01-09 2006-11-02 Burns Edward R Agglutination tests for detection of microorganisms
JP2006029793A (ja) 2004-07-12 2006-02-02 Matsushita Electric Ind Co Ltd 生菌検出方法および生菌計数装置
US8557539B2 (en) * 2006-11-10 2013-10-15 Biolumix Inc. Optical method and device for the detection and enumeration of microorganisms
EP2238432B1 (fr) * 2008-01-17 2020-02-19 Neogen Corporation Capteur optique de co2 pour détection et enumération de microorganismes
EP2513648B1 (fr) 2009-12-16 2015-05-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Détection de la décomposition d'enzymes dans un élément de test par libération contrôlée d'analyte protégé
FR2986237A1 (fr) 2012-01-27 2013-08-02 Advencis Dispositif de detection rapide de micro-organismes
AU2013302756C1 (en) 2012-08-14 2018-05-17 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US10584366B2 (en) * 2014-12-03 2020-03-10 IsoPlexis Corporation Analysis and screening of cell secretion profiles
ES2930467T3 (es) 2015-12-28 2022-12-14 Nihon Rikagaku Kaihatsu Llc Dispositivo para determinar el estado bacteriano vivo/muerto y método para determinar el estado bacteriano vivo/muerto utilizando dicho dispositivo
CN109072279B (zh) * 2016-02-26 2022-10-28 淡马锡生命科学研究院有限公司 β-溶血性病原体的检测
CA3027317A1 (fr) * 2016-06-14 2017-12-21 Cellply S.R.L. Kit et procede de criblage
JP2019527073A (ja) * 2016-07-29 2019-09-26 ノバダック テクノロジーズ ユーエルシー 機械学習を用いた、対象の組織を特徴付けるための方法およびシステム
WO2018078448A1 (fr) * 2016-10-27 2018-05-03 Scopio Labs Ltd. Procédés et systèmes destinés à une plate-forme de diagnostic
EP3553165A4 (fr) 2016-12-06 2019-12-25 Fujifilm Corporation Dispositif d'évaluation d'image de cellules et programme de commande d'évaluation d'image de cellules
US12547118B2 (en) * 2017-07-05 2026-02-10 Ast Revolution, Llc Lens-free holographic optical system for high sensitivity label-free microbial growth detection and quantification for screening, identification, and susceptibility testing
WO2019010327A1 (fr) * 2017-07-05 2019-01-10 Accelerate Diagnostics, Inc. Système optique holographique sans lentille destiné à la détection et à la quantification de la croissance microbienne sans étiquette à haute sensibilité pour criblage, identification et analyse de sensibilité
EP3785008A4 (fr) * 2018-04-25 2021-12-29 The Regents Of The University Of California Imagerie tridimensionnelle de tissu de grade histologique à l'aide d'un microscope à excitation de surface ultraviolette
EP3811287B1 (fr) * 2018-06-19 2025-09-17 MetaSystems Hard & Software GmbH Système et procédé de détection et de classification d'objets d'intérêt dans des images de microscope par apprentissage machine supervisé

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0713087A1 (fr) * 1994-11-17 1996-05-22 Chemunex Appareil et procédé de détection et de numération rapides et ultrasensibles de micro-organismes par fluorescence

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3158560A1 (fr) 2024-01-22 2025-07-25 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon
FR3158561A1 (fr) 2024-01-22 2025-07-25 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon
WO2025157873A1 (fr) 2024-01-22 2025-07-31 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon
WO2026022384A1 (fr) 2024-07-25 2026-01-29 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon
FR3165073A1 (fr) 2024-07-25 2026-01-30 Spore Biotechnologies Dispositif de détection de bactéries dans un échantillon

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US20210277440A1 (en) 2021-09-09

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