EP4545094A2 - Rekombinanter orf-virus-vektor - Google Patents

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EP4545094A2
EP4545094A2 EP25156960.4A EP25156960A EP4545094A2 EP 4545094 A2 EP4545094 A2 EP 4545094A2 EP 25156960 A EP25156960 A EP 25156960A EP 4545094 A2 EP4545094 A2 EP 4545094A2
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EP
European Patent Office
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orfv
fragment
recombinant
promoter
antigen
Prior art date
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EP25156960.4A
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English (en)
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Hans-Joachim Rziha
Ralf Amann
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Prime Vector Technologies GmbH
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Prime Vector Technologies GmbH
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant Orf virus vector, a cell containing the recombinant Orf virus vector, a composition containing the recombinant Orf virus vector according to the invention and/or the cell according to the invention, the use of the recombinant Orf virus vector according to the invention for the expression of a foreign gene and a nucleic acid molecule encoding an Orf virus vector promoter.
  • Viral vectors are used in biotechnology to deliver genetic material into target cells.
  • the introduced genetic material often encodes foreign genes used to produce a recombinant protein.
  • Viral vectors therefore represent an important platform technology, particularly for the production of recombinant vaccines, which, in addition to the traditional prevention of infectious diseases, are increasingly being used to develop new, innovative therapeutic concepts, such as therapeutic tumor immunization.
  • ORFV The Orf virus
  • ORFV belongs to the poxvirus family and possesses a variety of properties that make it attractive for the production of recombinant vaccines and preferable to other technologies. It represents the prototype of the parapoxvirus genus and belongs to the Poxviridae family.
  • ORFVs are enveloped, complex dsDNA viruses with a ball-of-wool morphology and an average size of approximately 260 x 160 nm. They possess a linear, GC-rich, approximately 130 to 150 kbp DNA genome, the central region of which is bordered on both sides by ITR regions ("inverted terminal repeats") and terminates in a hairpin structure that covalently links both single DNA strands.
  • the central region of the genome predominantly contains genes that are essential for viral replication and morphogenesis and are highly conserved within poxviruses.
  • Viral replication in poxviruses is restricted to the cytoplasm and begins with the virus binding to the surface of the host cell. After fusion, the so-called viral core, a protein core containing the viral genome, early viral mRNA, and viral transcription factors (TFs), is released into the cytoplasm. Early viral gene expression then begins, in which viral mRNA is synthesized under the control of poxvirus-specific early promoters. After the core structure is broken down, viral DNA is released into the cytoplasm. In contrast to the transcription of early genes, which occurs exclusively under the control of viral TFs, the subsequent intermediate and late gene transcription depends on the assistance of cellular TFs. Thus, the poxviral expression of early genes, unlike the expression of intermediate and late genes, requires neither the replication of viral DNA nor virus production.
  • ORFV is characterized by a very narrow natural host range, which includes sheep and goats. Infections occur via skin lesions that allow the virus to penetrate. Replication of the dermatotropic virus is subsequently limited to regenerative keratinocytes, causing contagious dermatitis or ecthyma contagiosum . This generally mild, self-limiting infection manifests as a localized skin or mucosal lesion, with pustules caused by massive infiltration of polymorphonuclear lymphocytes occurring primarily in the mouth and udder. The lesion heals after approximately 4 to 6 weeks without scarring. Despite the strong immune response, long-lasting immune protection is not developed, so reinfection is possible after just a few weeks, although clinical symptoms and virus production are significantly reduced. Systemic spread or viremia has not been observed for ORFV, even after experimental intravenous injection of high doses of infectious virus.
  • ORFV is considered a zoonotic pathogen and, in rare cases, can be transmitted to humans through broken skin. After infection, localized modular swelling occurs, usually confined to the fingers and hands, as well as occasional swelling of the lymph nodes and fever. The course is usually harmless, free of complications, and heals completely within three to eight weeks without clinical sequelae. Severe cases have also been reported in immunocompromised individuals. Infections were observed, but they completely healed after treatment with antiviral drugs such as cidofovir or imiquimod.
  • ORFV is of interest for the production of recombinant vaccines. Compared to orthopoxviruses, ORFV is characterized by a very narrow natural host tropism, encompassing sheep and goats. This virtually eliminates the possibility of inhibitory "preimmunity" against the vector caused by natural infection, as observed with the most common viral vectors of vaccinia and adenoviruses, in humans. Furthermore, the exceptionally weak and short-lived ORFV-specific vector immunity enables highly effective booster and/or booster vaccinations or immunizations with ORFV-based vaccines directed against additional pathogens.
  • ORFV ORFV-induced immunostimulatory response in both permissive and non-permissive hosts, characterized by a pronounced induction of innate immune mechanisms and the release of interferons, cytokines, and chemokines.
  • dendritic cells accumulate at the injection site and subsequently initiate a specific adaptive immune response by activating T and B cells.
  • vaccines derived from inactivated viruses or live vectors which usually induce a humoral immune response
  • the balanced induction of the cellular and humoral immune response following immunization with recombinant ORFV is a decisive advantage. At the same time, it eliminates the need for adjuvants, which can lead to undesirable side effects and inflammatory reactions. Further advantages include the possibility of standardized production of recombinant vaccines in permanent cell lines without the use of antibiotics, as well as the elimination of production in chicken eggs (increasing number of protein and antibiotic intolerances).
  • An attenuated ORFV vaccine approved for veterinary use is designated D1701, corresponding to the ORFV strain of the same name.
  • This vaccine known in inactivated form under the trade names Baypamun (Bayer) or Zylexis (Pfizer), was originally obtained by isolating a wild-type virus from sheep and subsequently adapting it through multiple passaging in bovine kidney culture cells. This was followed by further adaptation in Vero cells (African green monkey kidney cells), resulting in the ORFV vector D1701-V. D1701-V is further attenuated and causes only asymptotic infections, even in immunosuppressed sheep.
  • Previous recombinant ORFV vectors select the VEGF locus as the insertion site. According to current knowledge, this offers the perceived advantage of further attenuation of the vector by eliminating the vegf-e gene, which is under the control of a poxvirus-specific "early" promoter and is considered a virulence factor.
  • ORFV-based recombinant vaccines have now been produced and tested in animal models. Recombinant ORFV vaccines are currently being used against various infectious diseases, such as Aujeszky's disease, rabies, Borna disease, influenza, and classical swine fever.
  • one of the objects underlying the invention is to provide a new recombinant ORFV vector which reduces or avoids the disadvantages of the known ORFV vectors and vector systems.
  • an Orf virus is understood to mean all viruses and virus strains belonging to the species Parapoxvirus ovis , in particular strain D1701.
  • a recombinant ORFV vector is understood to be a vector based on the ORFV genome which is designed for the transport and/or expression of a foreign gene in biological cells.
  • a foreign gene is understood to be a gene or open reading frame (OLR) that does not originate from the ORFV genome.
  • OLR open reading frame
  • a promoter is understood to be a nucleic acid segment that enables the regulated expression of the foreign gene in the ORFV vector according to the invention. It is preferably an ORF promoter, i.e., a promoter present in the wild-type ORFV genome or a promoter derived therefrom and possibly artificial, such as a poxvirus promoter, CMV promoter, etc.
  • the position of the insertion locus IL 1, 2 and 3 according to the invention in the ORFV genome can be determined in various ways: by means of restriction fragments, the ORFV genes or open reading frames (OLR) or nucleotide positions in the ORFV genome.
  • the designation 006, 007 (dUTPase), 008 (G1L-Ank), 009 (G2L) for IL 1 means that the insertion locus extends from gene or OLR 006 to gene or OLR 009.
  • the information in parentheses refers to the coding products or encoded enzymatic activities, as far as they are currently known.
  • IL 1 lies in a range that begins at nucleotide 400 to 600 (500 ⁇ 100) and ends at nucleotide 1800 to 3000 (2,400 ⁇ 600).
  • nt nucleotide positions
  • the inventors were able to determine that foreign genes can be stably integrated into the ORFV genome at the newly identified insertion loci. This was surprising. Previously, it was assumed that the regions of the genome affected by the insertion loci were required for viral replication or unsuitable for the expression of foreign genes.
  • a particular advantage of the ORFV vector according to the invention has been found to be that gene expression can be controlled by selecting the insertion locus.
  • the expression of foreign genes in IL-2 is reduced by a factor of 2 compared to the previously used VEGF locus.
  • the strength and timing of expression of the foreign gene can be specifically influenced by selecting the promoter.
  • ORFV is one of the strain D1701.
  • This measure has the advantage of using a vector that is attenuated and causes only asymptomatic infections in a host.
  • all variants of D1701 are covered, including D1701-B and D1701-V.
  • the promoter is an ORFV promoter, more preferably an early ORFV promoter, which more preferably has a nucleotide sequence selected from: SEQ ID No. 1 (P1), SEQ ID No. 2 (P2), SEQ ID No. 3 (VEGF), SEQ ID No. 4 (optimized “early”), SEQ ID No. 5 (7.5 kDa promoter) and SEQ ID No. 6 (consensus "early”).
  • This measure has the advantage of using promoters that enable a high expression level of the foreign gene and targeted control of expression.
  • the P1 and P2 promoters were newly developed by the inventors. The remaining promoters originate from the vaccinia virus and are used in other contexts. Davidson and Moss (1989), Structure of vaccinia virus late promoters, J. Mol. Biol., Vol. 210, pages 771 to 784 , and Yang et al. (2011), Genome-wide analysis of the 5' and 3' ends of Vaccinia Virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated and anomalous transcripts, J. Virology, Vol. 85, No. 12, pp.
  • P2 results in significantly higher expression levels than P1. This was surprising, since the P1 promoter corresponds 100% to the consensus sequence from the vaccinia virus, but not P2.
  • the low expression of the "optimal" vaccinia virus promoter (Orthopox) in the ORFV (Parapox) is a contradiction and surprising. It is also surprising that the P2 promoter leads to very strong expression.
  • the promoter is arranged at a position of nt 28 ⁇ 10 to nt - 13 ⁇ 10 upstream with respect to the nucleotide sequence coding for the foreign gene.
  • This measure has the advantage that the promoter is located at a position that allows high expression strength and controlled expression of the foreign gene.
  • nucleotide sequences coding for and expressing a foreign gene are used in at least one of the IL 1, 2 or 3.
  • This measure has the advantage that multiple foreign genes can be expressed using a recombinant ORFV vector according to the invention.
  • This configuration is particularly suitable for the production of polyvalent vaccines that simultaneously target multiple antigenic structures.
  • Several foreign genes preferably 2, 3, 4, or more, can be expressed at each insertion locus.
  • the recombinant ORFV vector has a further nucleotide sequence coding for and expressing a foreign gene, which is under the control of a preferably early ORFV promoter, and which is inserted into an insertion locus located in the vegf-E gene in the ORFV genome.
  • This approach has the advantage of using a well-characterized insertion locus that has already been described in the state of the art.
  • the use of the vegf locus can be used for targeted control of gene expression.
  • the expression of the foreign gene can be increased in the vegf locus compared to one of the new expression locuses, e.g., IL-2.
  • This measure has the advantage that particularly important antigens, in particular for the production of vaccines, can be expressed via the recombinant ORFV virus according to the invention.
  • a further subject matter of the present invention relates to a biological cell, preferably a mammalian cell, more preferably a Vero cell, containing the ORFV vector according to the invention.
  • the present invention further relates to a composition, preferably a pharmaceutical composition, containing the ORFV vector according to the invention and/or the cell according to the invention.
  • the pharmaceutical composition can preferably be a vaccine, more preferably a polyvalent vaccine.
  • a further object of the present invention relates to the use of the recombinant ORFV vector according to the invention for the expression of at least one foreign gene, more preferably for the expression of at least one vaccine containing a foreign gene product (monovalent vaccine), more preferably of a vaccine containing at least two foreign gene products (polyvalent vaccine).
  • Another object of the present invention relates to a nucleic acid molecule encoding an ORFV promoter, preferably an early ORFV promoter, which has a nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences SEQ ID No. 1 (P1) and SEQ ID No. 2 (P2).
  • the nucleic acid molecule of the invention encodes novel ORFV promoters that are particularly suitable for the expression of foreign genes in the recombinant ORFV vector of the invention.
  • the promoters result in very strong, early gene expression.
  • the ORFV genome consists of linear double-stranded DNA and is approximately 138 kB long, has a GC content of approximately 64%, and contains 130–132 genes.
  • the structure of the ORFV genome is similar to that of other poxviruses. It consists of a central region with essential genes that exhibit a high degree of conservation within the Poxviridae.
  • the ORFV genome contains 88 genes that are conserved across all Chordopoxvirinae. Viral genes that are not essential for in vitro growth but are relevant for the pathogenicity and tropism of the virus are located in the terminal regions.
  • the D1701 virus which has been adapted for cell culture propagation, shows a significant increase in the number of inverted terminal repeats (ITR). These changes led not only to the loss but also to the duplication of some genes, such as the vegf-e gene.
  • ITR inverted terminal repeats
  • Adaptation of D1701-B, propagated in bovine BK-KL3A cells, to growth in Vero cells generated three additional insertion loci, IL 1, IL 2, and IL 3, in the viral genome of the virus now designated D1701-V. These are shown in the Fig. 1 illustrated.
  • the "early” promoter of VACV consists of a 16- or 15-nucleotide critical region, separated from a 7-nucleotide initiator region by an 11-nucleotide spacer region.
  • the critical region is more adenine-rich, whereas the spacer region is more thymine-rich.
  • transcription initiation always occurs at a purine.
  • Nucleotide substitutions in the critical region can have a drastically negative effect on promoter activity; even a complete loss of activity is possible.
  • the intermediate promoters consist of an AT-rich core sequence approximately 14 nucleotides long, followed by a 10-11 nucleotide spacer region, followed by a short initiator region.
  • the structure of the "late" promoters consists of an upstream AT-rich region of approximately 20 nucleotides, which is separated by a spacer region of approximately 6 nucleotides before the transcription start site, which contains the highly conserved sequence -1 TAAAT +4.
  • the inventors sought a new strategy for producing a recombinant polyvalent ORFV vector. During the adaptation of ORFV to Vero culture cells, several deletions in the viral genome occurred. It was investigated whether the deletion regions were suitable for the integration of foreign genes ( Fig. 1A ).
  • the transfer plasmid pDel2 was designed, which includes the homologous regions of the IL 2 region ( Fig. 2 ).
  • the cloning of foreign genes into the plasmid was enabled by the use of multiple MCS (multiple cloning sites).
  • the plasmid was constructed to allow the simultaneous integration of several foreign genes, each under the control of artificial early ORFV promoters and delimited by poxvirus-specific T5NT early transcription stop motifs ( Fig. 2 ).
  • Nucleotide sequences of the new artificial early ORFV promoters P1 and P2 were designed.
  • the suitability of the IL-2 locus for the stable integration of foreign genes was investigated.
  • the mCherry fluorescent marker gene was cloned into the pDel2 transfer plasmid under the control of the P2 promoter.
  • the plasmid was then transfected into D1701-VrV-infected Vero cells.
  • New recombinant viruses were visually selected after identifying red-glowing cells using fluorescence microscopy.
  • the AcGFP gene under the control of the P1 promoter was cloned into the pDel2 transfer plasmid alongside the P2-controlled mCherry gene.
  • the selection and purification of the homologous recombinants D1701-V-D1-GFP-D2-Cherry was carried out analogously to the previously described D1701-V-P2-Cherry selection.
  • PCR and Southern blot analyses demonstrated the correct integration of the two foreign genes into the IL 2 locus. Expression was detected by fluorescence microscopy and flow cytometry ( Fig. 3C ).
  • Orf virus vector D1701-V is very well suited for the production of polyvalent recombinants.
  • Several foreign genes could be stably integrated into the viral genome, for example, via the newly discovered insertion locus IL 1, 2, and 3, or the known insertion locus VEGF.
  • the strength of foreign gene expression depends on both the promoter and the insertion locus. The strongest gene expression was achieved after integration of a P2-driven foreign gene into the VEGF locus.
  • the table provides an overview of the fluorescent recombinant ORFV vectors produced during the work leading to the invention.
  • the insertion site (locus) and the promoters used to control foreign gene expression (P vegf , P1, P2) are shown for the respective recombinants in the table.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Orf-Virus-Vektor, eine Zelle, die den rekombinanten Orf-Virus-Vektor enthält, eine den erfindungsgemäßen rekombinanten Orf-Virus-Vektor und/oder die erfindungsgemäße Zelle enthaltende Zusammensetzung, die Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten Orf-Virus-Vektors zur Herstellung von einem Fremdgen sowie ein Nukleinsäuremolekül codierend für einen Orf-Virus-Vektor-Promotor.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten Orf-Virus-Vektor, eine Zelle, die den rekombinanten Orf-Virus-Vektor enthält, eine den erfindungsgemäßen rekombinanten Orf-Virus-Vektor und/oder die erfindungsgemäße Zelle enthaltende Zusammensetzung, die Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten Orf-Virus-Vektors zur Expression von einem Fremdgen sowie ein Nukleinsäuremolekül codierend für einen Orf-Virus-Vektor-Promotor.
  • Virale Vektoren werden in der Biotechnologie dafür verwendet, um genetisches Material in Zielzellen zu schleusen. Das eingeschleuste genetische Material codiert dabei häufig für Fremdgene, die der Herstellung eines rekombinanten Proteins dienen. Virale Vektoren stellen deshalb eine bedeutende Plattformtechnologie insbesondere zur Herstellung von rekombinanten Impfstoffen dar, die neben der klassischen Prävention von Infektionskrankheiten zunehmend auch zur Entwicklung von neuen, innovativen Therapiekonzepten, wie bspw. der therapeutischen Tumorimmunisierung, eingesetzt werden.
  • Das Orf-Virus (ORFV) gehört zu der Familie der Pockenviren und verfügt über eine Vielzahl von Eigenschaften, welche es zur Herstellung von rekombinanten Impfstoffen interessant macht und gegenüber anderen Technologien präferiert. Es stellt den Prototyp der Gattung der Parapockenviren dar und ist der Familie der Poxviridae zuzuordnen. ORFV sind behüllte, komplexe dsDNA-Viren von wollknäuelartiger Morphologie und einer mittleren Größe von ca. 260 x 160 nm. Sie besitzen ein lineares, GC-reiches, ca. 130 bis 150 kbp großes DNA-Genom, dessen zentraler Bereich beidseitig von ITR-Regionen ("inverted terminal repeats") abgegrenzt wird und in einer Haarnadelstruktur endet, welche beide DNA-Einzelstränge kovalent miteinander verknüpft. Im zentralen Bereich des Genoms befinden sich überwiegend Gene, die hauptsächlich für die virale Replikation und Morphogenese essentiell und innerhalb der Pockenviren hochkonserviert sind. Dagegen
  • Die virale Replikation ist bei Pockenviren auf das Zytoplasma restringiert und beginnt mit der Bindung des Virus an die Oberfläche der Wirtszelle. Nach der Fusion werden das sog. virale Core, ein Proteinkern, welches das virale Genom, frühe virale mRNA sowie virale Transkriptionsfaktoren (TF) beinhaltet, in das Zytoplasma freigesetzt. Nachfolgend beginnt die frühe virale Genexpression, in der unter Kontrolle von poxvirusspezifischen frühen ("early") Promotoren virale mRNA synthetisiert wird. Nach Auflösung der Core-Struktur wird die virale DNA im Zytoplasma freigesetzt. Im Gegensatz zu der Transkription von "early"-Genen, die ausschließlich unter Kontrolle viraler TF verläuft, ist die nachfolgende "intermediate" und "late" Gentranskription auf die Mithilfe zellulärer TF angewiesen. Somit benötigt die poxvirale Expression früher Gene, im Unterschied zur Expression von "intermediate"- und "late"-Genen, weder die Replikation viraler DNA noch eine Virusproduktion.
  • Das ORFV zeichnet sich durch einen sehr engen natürlichen Wirtsbereich aus, der Schaf und Ziege umfasst. Infektionen erfolgen über Läsionen der Haut, die das Eindringen des Virus ermöglichen. Die Vermehrung des dermatropen Virus ist anschließend auf regenerative Keratinozyten begrenzt, wodurch eine kontagiöse Dermatitis oder Ecthyma contagiosum ausgelöst wird. Diese in der Regel mild verlaufende, selbstlimitierende Infektion manifestiert sich als lokal begrenzte Haut- bzw. Schleimhautläsion, wobei die durch die massive Infiltration polymorphkerniger Lymphozyten ausgelöste Pustelbildung hauptsächlich an Maul und Euter auftritt. Die Läsion heilt nach ca. 4 bis 6 Wochen ohne Narbenbildung ab. Ein langanhaltender Immunschutz wird trotz der starken Immunantwort nicht ausgebildet, so dass eine Reinfektion bereits nach wenigen Wochen möglich ist, wenngleich klinische Symptome und Virusproduktion deutlich vermindert sind. Eine systemische Verbreitung oder Virämie wurde für ORFV nicht beobachtet; auch nicht nach experimenteller intravenöser Injektion hoher Dosen infektiöser Viren.
  • ORFV gilt als zoonotischer Erreger und ist in seltenen Fällen über die verletzte Haut auch auf den Menschen übertragbar. Nach der Infektion kommt es zu lokal begrenzten modulären Schwellungen, die sich zumeist auf Finger und Hände beschränken, sowie vereinzelt zu Schwellungen der Lymphknoten und Fieber. Für gewöhnlich ist der Verlauf harmlos, frei von Komplikationen und heilt innerhalb von drei bis acht Wochen ohne klinische Nachwirkungen vollständig ab. Bei immunsupprimierten Personen wurden auch schwerere Infektionsverläufe beobachtet, die jedoch nach Behandlung mit Virustatika, wie Cidofovir oder Imiquimod, vollständig verheilten.
  • ORFV ist für die Herstellung von rekombinanten Impfstoffen interessant. Im Vergleich zu Orthopockenviren zeichnet sich ORFV durch einen sehr engen natürlichen Wirtstropismus aus, der Schaf und Ziege umfasst. Damit kann im Menschen eine durch eine natürliche Infektion verursachte, inhibierende "Präimmunität" gegen den Vektor, wie sie bei den gängisten viralen Vektoren der Vaccinia- und Adenoviren beobachtet wird, nahezu ausgeschlossen werden. Des Weiteren ermöglicht die außergewöhnlich schwache und kurzlebige ORFV-spezifische Vektorimmunität sehr effektive Booster- und/oder Auffrischimpfungen bzw. Immunisierungen mit ORFV-basierten Impfstoffen, die sich gegen weitere Erreger richten.
  • Die Verabreichung von ORFV führt in permissiven, aber auch nicht-permissiven Wirten zu einer starken immunstimulierenden Reaktion, die sich durch eine ausgeprägte Induktion angeborener Immunmechanismen und der Freisetzung von Interferonen, Zytokinen und Chemokinen auszeichnet. Kurz nach der Immunisierung akkumulieren dendritische Zellen an der Injektionsstelle und leiten anschließend durch Aktivierung von T- und B-Zellen eine spezifische adaptive Immunantwort ein. Im Gegensatz zu Impfstoffen aus inaktivierten Viren oder Lebendvektoren, die meist eine humorallastige Immunantwort induzieren, ist die balancierte Induktion der zellulären und der humoralen Immunantwort nach Immunisierung mit rekombinanten ORFV ein entscheidender Vorteil. Zugleich macht es den Einsatz von Adjuvanzien, die zu unerwünschten Nebenwirkungen und Entzündungsreaktionen führen können, überflüssig. Als weitere Vorteile sind zudem die Möglichkeit der standardisierten Herstellung der rekombinanten Impfstoffe in permanenten Zelllinien ohne den Einsatz von Antibiotika, sowie der Verzicht auf eine Herstellung im Hühnerei (wachsende Anzahl an Eiweiß- und Antibiotika-Unverträglichkeiten) zu nennen.
  • Ein im Veterinärbereich zugelassener, attenuierter ORFV-Impfstoff trägt die Bezeichnung D1701, entsprechend dem gleichlautenden ORFV-Stamm. Dieser in inaktivierter Form unter dem Handelsnamen Baypamun (Bayer) bzw. Zylexis (Pfizer) bekannte Impfstoff wurde ursprünglich durch die Isolierung eines Wildtypvirus aus dem Schaf und anschließender Adaptierung infolge mehrfacher Passagierung in Rindernierenkulturzellen gewonnen. Es folgte eine weitere Adaptierung in Vero-Zellen (African green monkey kidney cells), was zum Erhalt des ORFV-Vektors D1701-V führte. D1701-V ist weiter attenuiert und ruft selbst in immunsupprimierten Schafen nur asymptotische Infektionen hervor.
  • Die bisherigen rekombinanten ORFV-Vektoren wählen als Insertionsort den VEGF-Lokus. Dies bietet nach derzeitigen Erkenntnissen den vermeintlichen Vorteil, dass durch die Eliminierung des unter der Kontrolle eines poxvirus-spezifischen "early"-Promotors stehenden und als Virulenzfaktor geltenden vegf-e Gens eine weitere Attenuierung des Vektors erfolgt. Inzwischen wurden mehrere ORFV-basierte, rekombinante Impfstoffe hergestellt und im Tiermodell untersucht. Derzeit werden rekombinante ORFV-Impfstoffe gegen unterschiedliche Infektionskrankheiten wie beispielsweise gegen die Aujeszky'sche Krankheit, Tollwut, Borna'sche Erkrankung, Influenza oder die klassische Schweinpest eingesetzt.
  • Die gute immunstimulierende und prophylaktische nutzbare Wirkung rekombinanter Orf-Viren konnte in den letzten Jahren durch die Etablierung einer Reihe von Impfstoffen bzw. Vakzinen gegen unterschiedliche virale Infektionskrankheiten gezeigt werden. Ein Überblick über die Verwendung von rekombinanten Pockenviren, einschließlich ORFV, zur Herstellung von rekombinanten Proteinen findet sich in Rziha et al. (2000), Generation of recombinant parapoxviruses: non-esssential genes suitable for insertion and expression of foreign genes, Journal or Biotechnology Vol. 83, Seiten 137-145, und Büttner und Rziha (2002), Parapoxviruses: From the Lesion to the Viral Genome, J. Vet. Med. B. Vol. 49, Seiten 7-16.
  • Der eingeschränkte Einsatz bisheriger rekombinanter ORFV-Vektoren erklärt sich v.a. durch die langwierige Selektionsprozedur. Insbesondere war bisher eine Herstellung von polyvalenten Impfstoffen nicht möglich. Ferner weisen die bekannten rekombinanten ORFV-Vektoren keine gezielt regulierbare Expression der Fremdgene auf.
  • Vor diesem Hintergrund ist es eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe, einen neuen rekombinanten ORFV-Vektor bereitzustellen, mit dem die Nachteile der bekannten ORFV-Vektoren und Vektorsysteme reduziert oder vermieden werden.
  • Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines rekombinanten Orf-Virus-(ORFV)-Vektors gelöst, der Folgendes aufweist:
    1. (1) zumindest eine für ein Fremdgen kodierende und dieses exprimierende Nukleotidsequenz, und
    2. (2) zumindest einen Promotor, der die Expression der Nukleotidsequenz kontrolliert,
    dadurch gekennzeichnet, dass
    die Nukleotidsequenz in zumindest einem der Insertionslokusse (IL) 1, 2 und 3 eingesetzt ist, die im ORFV-Genom in folgenden Regionen lokalisiert sind:
    IL 1 IL 2 IL 3
    Restriktionsfragment HindIII-Fragment C, HindIII-Fragment I/J, HindIII-Fragment G/D,
    KpnI-Fragment G, KpnI-Fragment B, KpnI-Fragment B,
    BamHI-Fragment C/G, BamHI-Fragment A, BamHI-Fragment A,
    EcoRI-Fragment B EcoRI-Fragment A/E EcoRI-Fragment D
    und/oder
    Gen/OLR 006, 102, 114,
    007 (dUTPase), 103 115,
    008 (G1L-Ank), 116,
    009 (G2L) 117 (GIF)
    und/oder
    Nukleotidposition nt 500 ± 100 bis nt 5.210 ± 100 bis nt 15.660 ± 100 bis
    nt 2.400 ± 600 nt 7.730 ± 100 nt 17.850 ± 100
  • Erfindungsgemäß werden unter einem Orf-Virus (ORFV) sämtliche unter die Art Parapoxvirus ovis fallenden Viren und Virenstämme verstanden, insbesondere der Stamm D1701.
  • Erfindungsgemäß wird unter einem rekombinanten ORFV-Vektor ein auf dem ORFV-Genom basierender Vektor verstanden, der zum Transport und/oder zur Expression eines Fremdgens in biologische(n) Zellen ausgebildet ist.
  • Erfindungsgemäß wird unter einem Fremdgen ein nicht dem ORFV-Genom entstammendes Gen bzw. offenes Leseraster (OLR) verstanden.
  • Unter einem Promotor wird erfindungsgemäß ein solcher Nukleinsäureabschnitt verstanden, der die regulierte Expression des Fremdgens in dem erfindungsgemäßen ORFV-Vektor ermöglicht. Vorzugsweise handelt es sich um einen ORF-Promotor, d.h. um einen im Wildtyp-ORFV-Genom vorliegenden Promotor oder einen sich hiervon ableitenden und ggf. artifiziellen Promotor, wie einen Poxvirus-Promotor, CMV-Promotor etc.
  • Bei dem rekombinanten ORFV-Vektor lässt sich die Lage der erfindungsgemäßen Insertionslokusse IL 1, 2 und 3 im ORFV-Genom erfindungsgemäß auf verschiedene Weisen festlegen: anhand von Restriktionsfragmenten, der ORFV-Gene bzw. offenen Leseraster (OLR) oder Nukleotidpositionen im ORFV-Genom.
  • Die traditionelle Beschreibung der Lokalisierung von IL 1, 2 und 3 erfolgt anhand von Restriktionskarten und der Angabe von Restriktionsfragmenten, auf denen die Insertionsbereiche liegen. Die Restriktionskarte des ORFV ist beispielhaft für den Stamm D1701 in Cottone et al. (1998), Analysis of genomic rearrangement and subsequent gene deletion of the attenuated Orf virus strain D1701, Virus Research, Vol. 56, Seiten 53-67, angegeben. Der Inhalt dieser Publikation ist Bestandteil der vorliegenden Offenbarung. Dabei bedeutet erfindungsgemäß bspw. für IL 1 die Angabe HindIII-Fragment C, KpnI Fragment G, BamHI-Fragment C/G, EcoRI-Fragment B, dass sich dieser Insertionslokus von dem HindIII-Fragment C bis hin zum EcoRI-Fragment B erstreckt. IL 2 erstreckt sich von dem HindIII-Fragment I-J bis hin zum EcoRI-Fragment A/E. IL 3 erstreckt sich von dem HindIII-Fragment G/D bis zum EcoRI-Fragment D.
  • Die Angabe 006, 007 (dUTPase), 008 (G1L-Ank), 009 (G2L) für IL 1 bedeutet, dass sich der Insertionslokus vom Gen bzw. OLR 006 bis hin zum Gen bzw. OLR 009 erstreckt. Die Angaben in den Klammern beziehen sich auf die Codierungsprodukte bzw. codierten enzymatischen Aktivitäten, soweit sie derzeit bekannt sind.
  • IL 1 liegt erfindungsgemäß in einem Bereich, der bei Nukleotid 400 bis 600 (500 ± 100) beginnt und bei Nukleotid 1800 bis 3000 (2.400 ± 600) endet.
  • Das für IL 1 Gesagte gilt für IL 2 und IL 3 entsprechend der Angaben in der vorstehenden Tabelle.
  • Die angegebenen Positionen der Nukleotide (nt) konnten die Erfinder aus einer Vielzahl von Bestimmungen an verschiedenen ORFV-Stämmen ermitteln. Dabei ergaben die Untersuchungen für den Stamm D1701 bzw. Varianten hiervon folgende Positionen, die besonders bevorzugt sind: nt 496 − nt 2.750 ; nt 496 − nt 1.912 und nt 511 − 2.750
    Figure imgb0001
     nt 5.2112 − 7.736
    Figure imgb0002
     nt 15.656 − 17.849 .
    Figure imgb0003
  • Die Erfinder konnten feststellen, dass in die angegebenen neu erkannten Insertionslokusse Fremdgene stabil in das ORFV-Genom integriert werden können. Dies war überraschend. Bislang wurde angenommen, dass die von den Insertionslokussen betroffenen Bereiche im Genom für die Virusreplikation erforderlich bzw. für die Expression von Fremdgenen ungeeignet sind.
  • Dabei hat sich als besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen ORFV-Vektors herausgestellt, dass über die Wahl des Insertionslokus die Genexpression gesteuert werden kann. So ist beispielsweise die Expression von Fremdgenen in IL 2 gegenüber dem bisher verwendeten VEGF-Lokus um den Faktor 2 erniedrigt. Ferner lässt sich über die Wahl des Promotors die Stärke und der Zeitpunkt der Expression des Fremdgens gezielt beeinflussen.
  • Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
  • Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausgestaltung des rekombinanten ORFV-Vektors handelt es sich bei ORFV um ein solches des Stammes D1701.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solcher Vektor zum Einsatz kommt, der attenuiert ist und bei einem Wirt nur asymptomatische Infektionen hervorruft. Erfindungsgemäß sind sämtliche Varianten von D1701 erfasst, einschließlich D1701-B und D1701-V.
  • Nach einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausgestaltung des rekombinanten ORFV-Vektors ist der Promotor ein ORFV-Promotor, weiter vorzugsweise ein früher ORFV-Promotor, der weiter vorzugsweise eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist: SEQ ID Nr. 1 (P1), SEQ ID Nr. 2 (P2), SEQ ID Nr. 3 (VEGF), SEQ ID Nr. 4 (optimierter "early"), SEQ ID Nr. 5 (7.5 kDa Promotor) und SEQ ID Nr. 6 (Consensus "early").
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Promotoren zum Einsatz kommen, die ein hohes Expressionsniveau des Fremdgens und gezielte Steuerung der Expression ermöglichen. Dabei handelt es sich bei den Promotoren P1 und P2 um solche, die von den Erfindern neu entwickelt wurden. Die übrigen Promotoren stammen vom Vaccinia-Virus und sind in anderen Zusammenhängen in Davidson und Moss (1989), Structure of vaccinia virus late promotors, J. Mol. Biol., Vol. 210, Seiten 771 bis 784, und Yang et al. (2011), Genome-wide analysis of the 5' and 3' ends of Vaccinia Virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated and anomalous transcripts, J. Virology, Vol. 85, Nr. 12, S. 5897-5909, Broyles (2003), Vaccinia virus transcription, J. Gen. Virol., Vol. 84, Nr. 9, S. 2293-2303, beschrieben. Nach den Erkenntnissen der Erfinder, bewirkt P2 eine deutlich höhere Expressionsstärke als P1. Dies war überraschend, da der Promotor P1 zu 100% der Consensussequenz aus dem Vaccinia Virus entspricht, nicht aber P2. Die niedrige Expression des "optimalen" Vaccinia Virus-Promotor (Orthopox) im ORFV (Parapox) ist ein Widerspruch und überraschend. Zudem überrascht, dass der P2-Promoter zu sehr starke Expression führt.
  • Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen rekombinanten ORFV-Vektors ist der Promotor an einer Position von nt 28 ± 10 bis nt - 13 ± 10 stromaufwärts in Bezug auf die für das Fremdgen codierende Nukleotidsequenz angeordnet.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der Promotor an einer solchen Position lokalisiert ist, die eine hohe Expressionsstärke und kontrollierte Expression des Fremdgens ermöglicht.
  • Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen rekombinanten ORFV-Vektors ist in zumindest einem der IL 1, 2 oder 3 mehr als eine, vorzugsweise 2, 3, 4 oder mehr, für ein Fremdgen codierende und dieses exprimierende Nukleotidsequenz eingesetzt.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit einem rekombinanten erfindungsgemäßen ORFV-Vektor mehrere Fremdgene exprimiert werden können. Diese Ausgestaltung eignet sich besonders für die Herstellung von polyvalenten Impfstoffen, die zugleich gegen mehrere antigene Strukturen gerichtet sind. Dabei können in jedem Insertionslokus mehrere Fremdgene, vorzugsweise 2, 3, 4 oder mehr, exprimiert werden.
  • Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausgestaltung weist der rekombinante ORFV-Vektor eine weitere für ein Fremdgen codierende und dieses exprimierende Nukleotidsequenz auf, die unter der Kontrolle eines vorzugsweise frühen ORFV-Promotors steht, und die einen Insertionslokus eingesetzt ist, der im ORFV-Genom im vegf-E-Gen lokalisiert ist.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein im Stand der Technik bereits beschriebener und gut charakterisierter Insertionslokus zum Einsatz kommt. Die Verwendung des vegf-Lokus kann für eine gezielte Steuerung der Genexpression genutzt werden. So kann im vegf-Lokus die Expression des Fremdgens im Vergleich zu einem der neuen Expressionslokusse, z.B. IL 2, erhöht sein.
  • Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausgestaltung ist das Fremdgen des rekombinanten ORFV-Vektors ausgewählt aus den Gruppen folgender Antigene:
    • virales Antigen, vorzugsweise
      • Rabiesvirus-Antigen, einschließlich Glykoprotein (RabG);
      • Influenza-A-Antigen, einschließlich Nukleoprotein (NP), Hämaglutinin (HA), Neuraminidase (NA);
    • Tumorantigen, vorzugsweise virales Tumorantigen, einschließlich HPV-selektives virales Tumorantigen;
    • tumorassoziiertes Antigen, einschließlich virales tumorassoziiertes Antigen, einschließlich HPV-selektives virales tumorassoziiertes Antigen;
    • parasitäres Antigen, vorzugsweise Plasmodium-Antigen;
    • Zytokin.
  • Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass über das erfindungsgemäße rekombinante ORFV-Virus besonders bedeutsame Antigene, insbesondere für die Herstellung von Impfstoffen, exprimierbar sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine biologische Zelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle, weiter vorzugsweise eine Vero-Zelle, enthaltend den erfindungsgemäßen ORFV-Vektor.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den erfindungsgemäßen ORFV-Vektor oder/und die erfindungsgemäße Zelle. Bei der pharmazeutischen Zusammensetzung kann es sich vorzugsweise um einen Impfstoff, weiter vorzugsweise um einen polyvalenten Impfstoff handeln.
  • Die Eigenschaften, Vorteile, Merkmale und Weiterbildungen des erfindungsgemäßen rekombinanten ORFV-Vektors gelten für die erfindungsgemäße Zelle und die erfindungsgemäße Zusammensetzung entsprechend.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten ORFV-Vektors zur Expression von zumindest einem Fremdgen, weiter vorzugsweise zur Expression von zumindest einem ein Fremdgenprodukt enthaltenden Impfstoff (monovalenter Impfstoff), weiter vorzugsweise von einem zumindest zwei Fremdgenprodukte enthaltenden Impfstoff (polyvalenter Impfstoff).
  • In diesem Zusammenhang bedeutet "zumindest", dass 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 etc. Fremdgene umfasst sind.
  • Die Merkmale, Vorteile, Eigenschaften und Weiterbildungen des erfindungsgemäßen rekombinanten ORFV-Vektors gelten für die erfindungsgemäße Verwendung entsprechend.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül codierend für einen ORFV-Promotor, vorzugsweise einen frühen ORFV-Promotor, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus den Nukleotidsequenzen SEQ-ID Nr. 1 (P1) und SEQ-ID Nr. 2 (P2).
  • Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül codiert für neue ORFV-Promotoren, die für die Expression von Fremdgenen in dem erfindungsgemäßen rekombinanten ORFV-Vektor besonders geeignet sind. Die Promotoren bewirken eine sehr starke, frühe Genexpression.
  • Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf beiliegende Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
    • Fig. 1
    zeigt die Karte der Hind III-Restriktionsfragmente des ORFV D1701-V DNA-Genoms. Die schraffierten Kästen stellen die Insertionsstellen IL1, IL2, IL3 und vegf dar. ITRL steht für die invertierten terminalen Repeats der Genomenden.
    Fig. 2
    zeigt eine schematische Darstellung des Transferplasmids pD1-GFP-D2Cherry. Der Vektor zeigt das AcGFP-Gen (Linienschraffur), das unter der Kontrolle des artifiziellen frühen Promotors P1 (schwarzer Pfeil, oben) steht, sowie das mCherry-Gen (Kästchenschraffur), das unter der Kontrolle des artifiziellen frühen Promotors P2 (schwarzer Pfeil, rechts) steht. Hinter beiden Fluoreszenzgenen befinden sich poxvirusspezifische frühe Transkriptionsstopp-Motive T5NT (schwarz). Die Gene sind über einen Spacer (Sp) voneinander getrennt. Mehrere multipler Klonierungsstellen (MCS 1-6) ermöglichen den Austausch der Fluoreszenzmarkergene durch gewünschte Fremdgene. Die Gene umfassenden flankierten Bereiche sind stromabwärts homolog zu dem ORFV-Genombereich ORF117/118, stromaufwärts homolog zu dem ORFV-Genombereich ORF114, und gewährleisten eine zielgerichtete Integration in den IL 2-Lokus des D1701-V-Genoms über homologe Rekombination.
    Fig. 3
    zeigt eine Expressionsanalyse unterschiedlicher Fluoreszenzrekombinanten. (A,a) Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahme einer 6-Well-Platte mit D1701-V-D2Cherry infizierten Vero-Zellen. Zur Selektion der Rekombinanten wurden Cherry-fluoreszierende Plaques gepickt und das Virus aus den Plaques angezogen. Nach vier Plaque-Reinigungen konnte die Homogenität von D1701-V-D2Cherry über PCR-Analysen sichergestellt werden. (A,b) Bestimmung der Cherry-Expression mittels Durchflußzytometrie. Die Abbildung zeigt exemplarisch die Expression D1701-V-D2Cherry infizierter Vero-Zellen (MOI = 1,0) im Durchflußzytometer. Nach 48 Stunden exprimieren ca. 45 % aller lebender Einzelzellen Cherry. Nicht-infizierte Vero-Zellen dienten als Negativkontrolle. (B) Fluoreszenzexpression der Rekombinante D1701-V-GFP-D2Cherry. Vero-Zellen wurden mit D1701-V-GFP-D2Cherry infiziert (MOI = 0,5). In der oberen Reihe ist eine Fluoreszenzaufnahme 48 Stunden nach Infektion zu sehen (Vergrößerung: 20X). Die untere Reihe zeigt die Fluoreszenzexpression nach 24 Stunden (Vergrößerung: 63X). Die Fluoreszenzmikroskopie erlaubte die Darstellung der AcGFP-(GFP), der mCherry-Expression (mCherry), sowie beider Fluoreszenzen in einer Zelle (merged). Zusätzlich wurden die Zellen im Mikroskop-Durchlicht (Durchlicht) aufgenommen. (C) Fluoreszenzexpression der Rekombinante D1701-V-D1GFP-D2Cherry. Vero-Zellen wurden mit D1701-V-D1GFP-P2Cherry infiziert (MOI = 1,0) und die Expression im Durchflußzytometer ermittelt. Nach 24 Stunden exprimierten ca. 25 % aller lebenden Einzelzellen sowohl mCherry, als auch GFP. Nicht-infizierte Vero-Zellen dienten als Negativkontrolle.
    Fig. 4
    zeigt die Bestimmung der Bestimmung der Fluoreszenzintensität unterschiedlicher Rekombinanten. (A) Vero-Zellen wurden mit GFP-exprimierenden Rekombinanten (MOI ca. 1,5) infiziert und 24 Stunden später die mittlere Fluoreszenzintensität durchflußzytometrisch bestimmt. Nicht-infizierte Vero-Zellen dienten als Negativkontrolle. M1 beschreibt den Bereich in dem 99,39 % aller nicht-infizierten Zellen (vordere erste Kurve) detektiert werden. Im Bereich M2 befinden sich dagegen GFP-positive Zellen. Die Population GFP-positiver Zellen war nach Infektion mit den GFP-exprimierenden Rekombinanten vergleichbar (38,2 % -40,0 %). Dabei war ersichtlich, dass die GFP-Intensität in D1701-V-D1GFP-infizierten Zellen (durchgezogene Linie) am geringsten, in D1701-V-D2GFP-infizierten Zellen (----) am stärksten war. (B) Vero-Zellen wurden mit mCherry-exprimierenden Rekombinanten (MOI ca. 3,0) infiziert und 24 Stunden später die mittlere Fluoreszenzintensität durchflußzytometrisch bestimmt. Nicht-infizierte Vero-Zellen dienten als Negativkontrolle. M1 beschreibt den Bereich in dem 99,47 % aller nicht-infizierten Zellen (vordere erste Kurve) detektiert werden. Im Bereich M2 befinden sich dagegen Cherrypositive Zellen. Die Population mCherry-positiver Zellen war nach Infektion mit den GFP-exprimierenden Rekombinanten vergleichbar (62,5 % - 63,3 %). Dabei war die mCherry-Intensität in D1701-V-Cherry-infizierte Zellen (- - - - -) deutlich geringer als in D1701-V-D2Cherry- (blaue Linie) bzw. in D1701-V2Cherry-infizierten Zellen (rote Linie). (C+D) Die Diagramme zeigen die prozentuale Fluoreszenzintensität unterschiedlicher Fluoreszenz-rekombinanten in Relation zu D1701-V-GFP (C) bzw. zu D1701-V-Cherry (D). Die Daten repräsentieren Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten.
    Ausführungsbeispiele 1. Das ORFV-Genom
  • Das ORFV-Genom besteht aus einer linearen Doppelstrang-DNA und hat eine Länge von etwa 138 kB, einen GC-Gehalt von etwa 64 % und besitzt 130-132 Gene. Der Aufbau des ORFV-Genoms ähnelt dem anderer Poxviren. Es besteht aus einer zentralen Region mit essentiellen Genen, die einen hohen Grad an Konservierung innerhalb der Poxviridae aufweisen. So finden sich im ORFV-Genom 88 Gene, die bei allen Chordopoxvirinae konserviert auftreten. In den terminalen Regionen sind virale Gene lokalisiert, die für das in vitro Wachstum nicht essentiell, jedoch für die Pathogenität und den Tropismus des Virus relevant sind.
  • Im Vergleich zu anderen Orf Viren zeigt das an die Vermehrung in Zellkultur angepasste D1701 Virus eine deutliche Vergrößerung der invertierten terminalen Repeats (ITR). Diese Veränderungen führten nicht nur zum Verlust, sondern auch zur Duplizierung einiger Gene, wie auch dem vegf-e-Gen. Die Adaptierung des in bovinen BK-KL3A Zellen vermehrten D1701-B an das Wachstum in Vero Zellen erzeugte drei weitere Insertionslokusse IL 1, IL 2 und IL 3 im Virusgenom des nun D1701-V bezeichneten Virus. Diese sind in der Fig. 1 veranschaulicht.
    • 2. Poxvirus-Promotoren
  • Poxviren besitzen "early", "intermediate" und "late" Promotoren. Diese unterschiedlichen Promotoren weisen einige charakteristische Sequenzeigenschaften auf, die am Beispiel des VACV im Folgenden erläutert werden. So besteht der "early" Promotor des VACV aus einer 16 bzw. 15 Nukleotide langen kritischen Region, die von einer 7 Nukleotide langen Initiatorregion durch eine 11 Nukleotide lange Abstandsregion getrennt ist. Die kritische Region ist eher adeninreich, wohingegen die Abstandsregion eher thyminreich ist. Die Initiation der Transkription erfolgt mit seltenen Ausnahmen stets an einem Purin. Nukleotid-Substitutionen in der kritischen Region können einen drastisch negativen Effekt auf die Promotoraktivität haben, selbst ein vollständiger Verlust der Aktivität ist möglich. Substitutionsanalysen des frühen VACV 7.5 kDa Promotors lieferten eine optimierte kritische Region, zudem ist es gelungen, eine Consensus-Sequenz für den "early" Poxviruspromotor abzuleiten, die in der Tabelle 1 gezeigt ist. Die "intermediate" Promotoren bestehen aus einer AT-reichen Kernsequenz, die etwa 14 Nukleotide lang ist, gefolgt von einer 10-11 Nukleotide langen Abstandsregion, woran sich eine kurze Initiatorregion anschließt. Der Aufbau der "late" Promotoren besteht aus einer vorgelagerten etwa 20 Nukleotide langen AT-reichen Region, die durch eine Abstandsregion vor der Transkriptionsstartstelle von etwa 6 Nukleotide getrennt ist, welche die hochkonservierte Sequenz -1 TAAAT +4 beinhaltet.
    Figure imgb0004
    • 3. Herstellung des rekombinanten ORFV-Vektors
  • Die Erfinder haben nach einer neuen Strategie zur Herstellung eines rekombinanten polyvalenten ORFV-Vektors gesucht. Während der Adaption des ORFV auf Vero-Kulturzellen sind mehreren Deletionen im viralen Genom aufgetreten. Es wurde untersucht, ob sich die Deletionsbereiche für die Integration von Fremdgenen eignen (Fig. 1A).
  • Daher wurde neben weiteren Plasmiden das Transferplasmid pDel2 konzipiert, welches die homologen Bereiche der IL 2-Region umfasst (Fig. 2). Die Klonierung von Fremdgenen in das Plasmid wurde durch den Einsatz mehrerer MCS (multipler Klonierungsstellen) ermöglicht. Zusätzlich wurde das Plasmid so konstruiert, dass es die gleichzeitige Integration mehrerer Fremdgene erlaubte, die jeweils unter Kontrolle artifizieller früher ORFV-Promotoren stehen und von poxvirusspezifischen T5NT frühen Transkriptions-Stopp-Motiven begrenzt sind (Fig. 2).
  • Es wurden Nukleotidsequenzen der neuen artifiziellen frühen ORFV-Promotoren P1 und P2 entworfen.
  • In einem ersten Versuch sollte untersucht werden, ob der IL 2-Lokus für die stabile Integration von Fremdgenen geeignet ist. Hierzu wurde das mCherry-Fluoreszenzmarkergen unter Kontrolle des Promoters P2 in das pDel2-Transferplasmid kloniert. Anschließend wurde das Plasmid in mit D1701-VrV-infizierte Vero-Zellen transfiziert und neue rekombinante Viren visuell nach Identifikation rot-leuchtender Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie selektioniert und die über mehrere Plaquereinigungen erhaltene homogene Rekombinante D1701-V-D2-Cherry angezogen (Fig. 3A,a).
  • Die korrekte Integration des mCherry-Gens in den IL 2-Lokus von D1701-VrV wurde über spezifische PCR-Analysen und Southern Blot-Hybridisierungen sichergestellt, die korrekte Expression ließ sich neben Fluoreszenz-und Western Blot-Analysen auch mittels Durchflußzytometrie zeigen (Fig. 3A,b).
  • Dabei konnte eine starke Expression früh nach der Infektion nachgewiesen werden. Durch mehrmaliges in vitro Passagieren der Rekombinante konnte gezeigt werden, dass die Fremdgen-Integration in das ORFV-Genom stabil war.
  • Weiterhin wurde mithilfe der hergestellten Rekombinante D1701-V-GFP-D2-Cherry, bei der das AcGFP-Gen im vegf-e- und das mCherry-Gen im IL 2-Lokus integriert ist, erfolgreich die simultane frühe Expression zweier Fluoreszenzgene in unterschiedlichen Insertionslokussen nachgewiesen (Fig. 3B).
  • Weiter sollte untersucht werden, ob gleichzeitig auch ein zweites Fremdgen stabil in den IL 2-Lokus integriert werden kann. Hierfür wurde in das pDel2-Transferplasmid neben dem P2-kontrollierten mCherry-Gen, das AcGFP-Gen unter Kontrolle des P1-Promoters kloniert. Die Selektion und Aufreinigung der homologen Rekombinanten D1701-V-D1-GFP-D2-Cherry erfolgte analog zu der vorher beschriebenen D1701-V-P2-Cherry-Selektion.
  • Auch hier wurde über PCR- und Southern Blot Analysen die korrekte Integration der beiden Fremdgene in den IL 2-Lokus gezeigt. Der Nachweis der Expression erfolgte über Fluoreszenzmikroskopie und Durchflußzytometrie (Fig. 3C).
  • Die Stärke der Promotoren P1 und P2 wurde untereinander und mit dem Promoter Pvegf in Expressionsanalysen verglichen. Dabei zeigte sich, dass der Promoter P2 die stärkste, der Promoter P1 die schwächste Genexpression induzierte (Fig. 4A + 4C). Dies war überraschend, da P1 zu 100% der Consensussequenz aus dem Vaccinia Virus entspricht, nicht aber P2.
  • Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die Integration eines zweiten, unter Kontrolle eines eigenständigen Promoters regulierten Fremdgens keine Auswirkung auf die Expressionsstärke des ersten Fremdgens hatte. Dabei war es irrelevant, ob das zweite Gen in denselben oder in einen unterschiedlichen Insertionslokus integriert wurde. Nach der Insertion eines P2-gesteuerten mCherry-Gens in den VEGF-Lokus konnte anhand des Vergleichs mit der Rekombinanten, die das P2-regulierte mCherry-Gen in den IL 2-Lokus integriert hatte, der Einfluss des Insertionsorts untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass die Genexpression im VEGF-Lokus etwa zweimal so stark war, wie im IL 2-Lokus (Fig. 4B + 4D).
  • Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der Orf-Virusvektor D1701-V für die Herstellung polyvalenter Rekombinanten sehr gut geeignet ist. Es konnten mehrere Fremdgene stabil in das virale Genom integriert werden, bspw. über die neu aufgefundenen Insertionslokusse IL 1, 2 und 3, oder aber den bekannten Insertionslokus VEGF. Die Stärke der Fremdgenexpression ist sowohl von dem Promotor als auch vom Insertionslokus abhängig. Die stärkste Genexpression wurde nach Integration eines P2-gesteuerten Fremdgens im VEGF-Lokus erreicht.
  • Von den Erfindern wurden weitere unterschiedliche Vektoren hergestellt, die sich durch die Art und Konstellation der verschiedenen Marker-Fremdgene, Insertionsorte und Promotoren voneinander unterscheiden (Tab. 2). Tab. 2: Tabellarische Übersicht der neu hergestellten fluoreszierenden ORFV-Vektoren.
    Rekombinante Lokus Fremdgenexpression
    VEGF IL2
    D1701-V-Cherry Pvegf: mCherry - - +++
    D1701-V-Cherry-D1GFP Pvegf: mCherry P1:AcGFP - +++/+
    D1701-V-Cherry-D2GFP Pvegf: mCherry - P2: AcGFP +++/++++
    D1701-V12-Cherry P2: mCherry - - ++++
    D1701-V12-Cherry-D2GFP P2: mCherry - P2: AcGFP ++++/++++
    D1701-V-GFP Pvegf: AcGFP - - +++
    D1701-V-GFP-D2Cherry Pvegf: AcGFP - P2: mCherry +++/++++
    D1701-V-GFP-D2CD4 Pvegf: AcGFP - P2: hCD4 +++/++++
    D1701-V-D1GFP Pvegf: LacZ P1: AcGFP - +++/+
    D1701-V-D1GFP-D2Cherry Pvegf: LacZ P1: AcGFP P2: mCherry +++/+/++++
    D1701-V-D2GFP Pvegf: LacZ - P2: AcGFP +++/++++
    D1701-V-D2Cherry Pvegf: LacZ - P2: mCherry +++/++++
    D1701-V-D2Orange Pvegf: LacZ - P2: mOrange +++/++++
    D1701-V-CD4-D2Cherry Pvegt: hCD4 - P2: mCherry +++/++++
  • Die Tabelle gibt einen Überblick über die während der zur Erfindung führenden Arbeiten hergestellten fluoreszierenden rekombinanten ORFV-Vektoren. Der Insertionsort (Lokus) und die für die Steuerung der Fremdgenexpression genutzten Promotoren (Pvegf, P1, P2) sind für die jeweiligen Rekombinanten in der Tabelle ersichtlich. Zudem ist die Stärke der Fremdgenexpression angegeben (sehr stark = ++++ bis schwach = +).
  • Die Erfindung eröffnet für die Entwicklung neuer rekombinanter ORFV-basierter Impfstoffe eine Vielzahl an Optionen. So können Rekombinanten hergestellt werden, die gleichzeitig mehrere Antigene exprimieren. Dies könnte etwa bei der Herstellung einer universellen Vakzine, von Kombinationsimpfstoffen oder von therapeutischen Tumorimpfstoffen, die sich gegen mehrere Tumorantigene richten, ein bedeutender Vorteil sein. Darüber hinaus könnte die Immunantwort durch eine gleichzeitige Insertion von Antigen und Zytokinen gezielt beeinflusst werden.
    • Sequence Number (ID) 1: aaaaattgaaaaatta
    • Sequence Number (ID) 2: aaaaattgaaattcta
    • Sequence Number (ID) 3: aaaaattgaaaaayta
    • Sequence Number (ID) 4: aaaagtagaaaatta
    • Sequence Number (ID) 5: caaaatgtaaattata
    • Sequence Number (ID) 6: aaaaaatgaaaaaawa

Claims (14)

  1. Rekombinanter Orf-Virus-(ORFV)-Vektor, der folgendes aufweist:
    (1) zumindest eine für ein Fremdgen codierende und dieses exprimierende Nukleotidsequenz, und
    (2) zumindest einen Promotor, der die Expression der Nukleotidsequenz kontrolliert,
    dadurch gekennzeichnet, dass
    die Nukleotidsequenz in zumindest einem der Insertionslokusse (IL) 1, 2 und 3 eingesetzt ist, die im ORFV-Genom in folgenden Regionen lokalisiert sind: IL 1 IL 2 IL 3 Restriktionsfragment HindIII-Fragment C, HindIII-Fragment I/J, HindIII-Fragment G/D, KpnI-Fragment G, KpnI-Fragment B, KpnI-Fragment B, BamHI-Fragment C/G, BamHI-Fragment A, BamHI-Fragment A, EcoRI-Fragment B EcoRI-Fragment A/E EcoRI-Fragment D und/oder Gen/OLR 006, 102, 114, 007 (dUTPase), 103 115, 008 (G1L-Ank), 116, 009 (G2L) 117 (GIF) und/oder Nukleotidposition nt 500 ± 100 bis nt 5.210 ± 100 bis nt 15.660 ± 100 bis nt 2.400 ± 600 nt 7.730 ± 100 nt 17.850 ± 100
  2. Rekombinanter ORFV-Vektor nach Anspruch 1, wobei es sich bei ORFV um ein solches des Stammes D1701 handelt.
  3. Rekombinanter ORFV-Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der ORFV-Promotor ein früher ORF-Promotor ist, der vorzugsweise eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus: SEQ ID Nr. 1 (P1), SEQ ID Nr. 2 (P2), SEQ ID Nr. 3 (VEGF), SEQ ID Nr. 4 (optimierter "early"), SEQ ID 5 (7.5 kDa Promotor) und SEQ ID Nr. 6 (Consensus "early").
  4. Rekombinanter ORFV-Vektor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor an einer Position von nt -28 ± 10 bis nt -13 ± 10 stromaufwärts in Bezug auf die für das Fremdgen codierende Nukleotidsequenz angeordnet ist.
  5. Rekombinanter ORFV-Vektor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in zumindest einem der IL 1, 2 oder 3 mehr als eine für ein Fremdgen codierende und dieses exprimierende Nukleotidsequenz eingesetzt ist, vorzugsweise 2, 3, 4 oder mehr Nukleotidsequenzen.
  6. Rekombinanter ORFV-Vektor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieser eine weitere für ein Fremdgen codierende und dieses exprimierende Nukleotidsequenz aufweist, die unter der Kontrolle eines vorzugsweise frühen ORFV-Promotor steht, und die in einen Insertionslokus eingesetzt ist, der im ORFV-Genom im vegf-E-Gen lokalisiert ist.
  7. Rekombinanter ORFV-Vektor nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fremdgen ausgewählt ist aus den Gruppen folgender Antigene:
    - virales Antigen, vorzugsweise
    Rabiesvirus-Antigen, einschließlich Glykoprotein (RabG);
    Influenza-A-Antigen, einschließlich Nukleoprotein (NP), Hämaglutinin (HA), Neuraminidase (NA);
    - Tumorantigen, vorzugsweise virales Tumorantigen, einschließlich HPV-selektives virales Tumorantigen;
    - tumorassoziiertes Antigen, einschließlich virales tumorassoziiertes Antigen, einschließlich HPV-selektives virales tumorassoziiertes Antigen;
    - parasitäres Antigen, vorzugsweise Plasmodium-Antigen;
    - Zytokin.
  8. Zelle, vorzugsweise Säugetierzelle, weiter vorzugsweise eine Vero-Zelle, enthaltend den rekombinanten ORFV-Vektor nach einem der vorherigen Ansprüche.
  9. Zusammensetzung, vorzugsweise pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den rekombinanten ORFV-Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder/und die Zelle nach Anspruch 8.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um einen Impfstoff, vorzugsweise eine polyvalenten Impfstoff handelt.
  11. Verwendung des rekombinanten ORFV-Vektors nach einem der vorherigen Ansprüche zur Expression von zumindest einem Fremdgen.
  12. Verwendung nach Anspruch 11 zur Herstellung von einem zumindest ein Fremdgenprodukt enthaltenden Impfstoff (monovalenter Impfstoff), vorzugsweise von einem zumindest zwei Fremdgenprodukte enthaltenden Impfstoff (polyvalenter Impfstoff).
  13. Nukleinsäuremolekül codierend für einen ORFV-Promotor, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID Nr. 1 (P1) und SEQ ID Nr. 2 (P2).
  14. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ORFV-Promotor um eine frühen ORFV-Promotor handelt.
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