ES2103803T5

ES2103803T5 - Metodo inmunocromatografico.

Info

Publication number: ES2103803T5
Application number: ES91904867T
Authority: ES
Inventors: Eugene Fan; Dou-Mei Wang; Fon-Chiu Mia Chen; Gregg L. Wilson; Michael W. Milner; Ching Huang
Original assignee: Pacific Biotech Inc
Current assignee: Pacific Biotech Inc
Priority date: 1990-02-08
Filing date: 1991-02-08
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2011-02-08
Also published as: CA2049919A1; KR920701471A; AU7316291A; ES2103803T3; EP0466914A1; JP3317699B2; ATE153701T1; AU649022B2; WO1991012336A1; EP0466914B2; DE69126248D1; DE69126248T2; EP0466914B1; CA2049919C; US5096837A; JPH04504764A; EP0466914A4; DE69126248T3

Abstract

LA INVENCION EXPUESTA SE REFIERE AL CAMPO DE PRUEBAS DE UN SOLO PASO Y A LAS PRUEBAS DE AGLUTINACION DE LATEX ("LAT"), Y PROPORCIONA UN METODO PERFECCIONADO DE PREPARACION Y USO DE PRUEBAS DE INMUNIDAD DE UN PASO, ASI COMO DE METODOS PERFECCIONADOS DE PREPARACION DE PARTICULAS DE LATEX CUBIERTAS PARA UTILIZAR EN PRUEBAS DE DIAGNOSTICO Y, ESPECIALMENTE, EN PRUEBAS INMUNOCROMATOGRAFICAS.

Description

Método inmunocromatográfico.

Antecedentes de la invención

Las partículas uniformes de látex ("ULPs") son, en general, esferas extremadamente uniformes de pequeño diámetro. Los diámetros típicos oscilan desde menos de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 100 \mum. Las partículas menores de 5 \mum se preparan habitualmente mediante polimerización por emulsión. El resultado de este procedimiento es una serie de partículas con distribuciones de tamaño extremadamente uniformes.

El principal empleo de las ULPs reside en el campo del diagnóstico médico, en donde las partículas se utilizan para ensayos de aglutinación del látex. Se han sugerido nuevas utilizaciones entre las que figuran aplicaciones microbiológicas, p. ej., tipificación e identificación bacteriana, y medición de los niveles de antibióticos en el suero sanguíneo (ver p. ej., Bangs, L.B., "Uniform Latex Particles" ("Partículas Uniformes de Látex") presentado en un seminario de estudios en el 41º National Meeting, American Association for Clinical Chemistry, 1989 ("41ª Asamblea Nacional, Asociación Americana de Química Clínica, 1989"), adquirible en forma impresa en Seragen Diagnostics Inc., Indianápolis, IN; o Galloway, R.J., "Development of microparticle tests and inmunoassays" ("Desarrollo de los ensayos e inmunoensayos de micropartículas"), © 1988 por Seradyn, Inc., Indianápolis, IN). Otras variedades de partículas, tal como el látex modificado con amidas ("AML") y látex modificado con carboxilos ("CML") tienen grupos amida y grupos carboxilo respectivamente en sus superficies. Estos grupos funcionales permiten la unión covalente de antígenos o anticuerpos a la superficie de las ULPs para mejorar los ensayos de aglutinación.

El uso más extendido de las ULPs reside en el campo de los inmunodiagnósticos o inmunoensayos, en especial en ensayos de aglutinación de látex, en donde se utilizan para detectar la presencia de cantidades o concentraciones muy pequeñas de antígenos o anticuerpos, en la sangre, suero, orina o fluido cefalorraquídeo. En esencia, las ULPs se utilizan para aumentar o visualizar la formación del complejo antígeno/anticuerpo; puede también utilizarse para cuantificar esta reacción.

Por ejemplo, si se está intentando medir un anticuerpo particular ("Ab"), se recubren las partículas de látex con un antígeno apropiado ("Ag"). Dado que el Ab es divalente, se puede unir a sitios idénticos de dos partículas adyacentes y así unirse a dichas partículas. Así, si el Ab presente en una muestra individual se mezcla con las partículas recubiertas de Ag tendrá lugar una aglutinación o coagulación de las partículas; estos agregados son generalmente visibles a simple vista. Este fenómeno es esencialmente la base de los ensayos de aglutinación de látex ("LAT").

Una dificultad importante con los LATs es el hecho de que las partidas recubiertas tienden a aglutinarse espontáneamente. Esto es debido en gran manera al hecho de que las suspensiones de látex son suspensiones coloidales de partículas hidrofóbicas. La estabilidad de la suspensión depende de las cargas activas de la superficie; la adición de pequeñas cantidades de proteína (aproximadamente 10 mg por mg de látex) puede causar la aglomeración mientras que la adición continuada de mayores cantidades de proteína tienden a aumentar la estabilidad de las partículas.

Este tipo de aglutinación es también un problema en los ensayos cromatográficos que utilizan partículas coloreadas o visibles, tales como el ensayo descrito en la Solicitud PCT nº W088/08534 publicada. En este ensayo, se aplica una muestra a un sustrato de un material absorbente, y el analito se une a las partículas de látex coloreadas móviles que llevan el anticuerpo o el antígeno. Las partículas a las que se une el analito se unen ellas mismas entre sí por el inmunoreactivo inmovilizado cuando la muestra atraviesa cromatográficamente a lo largo del material absorbente.

Se han sugerido varios métodos para solucionar este problema y el problema conexo de la aglutinación no específica, incluyendo el empleo de engarces y espaciadores. Algunos de los espaciadores sugeridos incluyen la proteína A, diaminoalcanos, anticuerpos desnudos, y espaciadores estreptavidinabiotina, para nombrar unos pocos. Ha sido también sugerido el empleo de engarces heterobifuncionales, ácidos carboxílicos sustituidos con halógeno, albúmina de suero bovino, surfactantes y fragmentos F(ab)_{2}. Sin embargo, pocas de estas sustancias sugeridas demuestran ser totalmente satisfactorias puesto que tienden a interferir con el ensayo, muchas de ellas haciéndolo de forma que inhiben la aglutinación. Esto es, por supuesto, completamente inaceptable para los LATs.

Otros han probado también de mejorar la exactitud de los inmunoensayos como se describe en las siguientes referencias. May y col., (U.K: Pat. Nº GB-A-2.204.398) describen dispositivos e inmunoensayos para analitos en muestras en donde una fase sólida se divide en por lo menos dos zonas, de las cuales una zona contiene un reactivo calificado como libremente móvil, específico para el analito y la segunda zona contiene un reactivo permanentemente inmovilizado para la detección visual del analito unido al reactivo móvil. Sakai y col., (U.S. Pat. Nº 4.680.274) describen que las microesferas ultrafinas ("ultramicroesferas") de un tamaño medio de 0,2 \mum o más pequeñas que contienen una sustancia que reacciona con un factor no específico en una muestra, pueden emplearse para inhibir una reacción no específica cuando están incluidas en una gran variedad de inmunoensayos. Manita (JP-A-5748658; Pat. Abstr. of Japan, vol. 6(121) (P-126) (999); la Base de Datos de WPI/Derwent, AN: 82-34252E) describe un inmunoensayo en el cual la sensibilidad está potenciada cuando la reacción se efectúa en presencia de partículas inmunológicamente inactivas.

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Por todo ello, los Solicitantes describen la presente invención en respuesta a la necesidad expresa de un procedimiento de inmunoensayo con diversa aplicabilidad, que evite los problemas de aglomeración que tienen otros ensayos y que cumpla el objetivo de una mejor exactitud y una mayor resolución, siendo también elegante en su simplicidad.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para minimizar la aglomeración de partículas marcadas en el ligando o marcadas en el antiligando, empleadas en un ensayo que implica el empleo de partículas marcadas y no marcadas, en donde dicha marca interacciona con el analito, caracterizado por los pasos de proporcionar dichas partículas marcadas, dichas partículas no marcadas, y el analito, sobre una capa soporte, en donde tanto las partículas marcadas como las partículas no marcadas tienen un tamaño de 0,8 \mum tal que dichas partículas pueden moverse por acción capilar a través de la capa soporte, y están formadas del mismo material, permitiendo la interacción de dicha marca y dicho analito, y desplazándose dichas partículas marcadas a través de dicha capa soporte desde una primera zona a una segunda zona después de dicha interacción, sin que se produzca aglomeración de partículas debido a esta interacción. Una variación propugna la inmovilización de la mezcla en una primera zona definida de una capa soporte que tiene una o más zonas definidas.

En una versión preferida, el inmunoensayo comprende además, la inmovilización de la inmunoglobulina G (IgG) anti-conejo, sobre una segunda zona definida de la capa soporte. En otra variación, la proteína unida a la segunda partícula móvil es la BSA.

En una versión preferida, las partículas móviles se colorean. Todavía, otra versión propugna la adición de un detergente a la mezcla.

De acuerdo con otra versión, las partículas a las cuales el ligando no está unido se recubren con una proteína que no participa en la unión ligando-antiligando empleada en el ensayo, tal como la BSA. Todavía en otra versión, las partículas de polímero comprenden perlas de látex o poliestireno.

Breve descripción de los dibujos

La figura I representa los resultados obtenidos al emplear un anticuerpo-látex/BSA-mezcla de látex en un ensayo Strep A, prueba nº 1.

La figura II representa los resultados obtenidos al emplear una mezcla anticuerpo-látex/BSA-látex en un ensayo Strep A, prueba nº 2.

La figura III representa los resultados obtenidos al emplear una mezcla anticuerpo-látex/BSA-látex en un ensayo Occult Blood.

Descripción detallada

Hemos descubierto que muchos inmunoensayos actualmente en uso tienen una deficiente exactitud, debido a la existencia de falsos negativos y falsos positivos. Creemos que hemos reducido significativamente, si no eliminado, tales problemas.

A. Preparación de conjugados anticuerpo-látex

El procedimiento básico para la conjugación proteína-látex bien sea vía absorción simple o bien por unión covalente, es ya conocido en la especialidad, como lo es el empleo de partículas de látex coloreadas, lo cual aumenta la resolución y la legibilidad de los inmunoensayos. Se han descrito varios procedimientos, en términos generales, en Bangs, L.B., "Uniform Latex Particles" ("Partículas uniformes de látex"), presentado en un seminario de estudios en el 41º National Meeting, Amer. Assoc. Clin. Chem., 1989 ("Asamblea Nacional de la Asociación Americana de Química Clínica, 1989"), y disponible en forma impresa, de Seragen Diagnostics Inc., Indianápolis, IN; o Galloway, R.J., "Development of microparticle tests and inmunoassays" ("Desarrollo de los ensayos de micropartículas e inmunoensayos"), Seradyn, Inc., Indianápolis, IN.

Un método para preparar ULPs revestidas es el método de absorción. En términos generales, se debería: 1) utilizar reactivos puros; 2) limpiar las partículas antes del revestimiento; y 3) determinar la cobertura cuantitativa de la superficie del ULP y la química de ligandos. Por ejemplo, los conjugados anticuerpo-látex ("Ab-látex") pueden prepararse de acuerdo con el siguiente método: en el caso más sencillo, se disuelve el ligado apropiado en una solución tampón, se añade a una suspensión de látex y se agita durante un tiempo que oscila desde unos pocos minutos hasta más de 24 horas. Una vez se ha establecido el equilibrio, se centrifuga el látex y el sobrenadante que contiene cualquier ligando sin absorben, se desecha. El látex se resuspende en tampón recién preparado y se centrífuga; el sobrenadante se desecha de nuevo. Se repiten estos pasos hasta que el látex se estima que está lavado y exento de cualquier ligando residual sin absorber. En este momento, el procedimiento de revestimiento del látex se estima que es completo y el látex está listo para ser usado en los LATs.

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El enlace covalente implica la unión permanente o covalente de un ligando u otro material a la superficie de la partícula de látex. Si el enlace covalente es el método elegido, primeramente se debe acoplar el ligando a la ULPs, a continuación mantener la estabilidad de la suspensión de partículas de látex, seguido de la prevención de que la proteína sea desnaturalizada. (Para una discusión general de las técnicas de enlace covalente, y citación a las referencias más detalladas, ver Bangs, L.B., "Uniform Latex Particles" ("Partículas uniformes de látex").

Mientras que la discusión anterior se ha efectuado en el contexto de las partículas de látex, debe entenderse que pueden utilizarse otras partículas de polímeros tales como las partículas de poliestireno, e incluso partículas metálicas tales como las partículas de un sol de oro. Estas partículas y sus métodos de preparación son ya conocidos.

B. Preparación de los conjugados BSA-látex

La preparación de los conjugados albúmina de suero bovino-látex ("BSA-látex") es similar a la preparación del Ab-látex, como se ha descrito más arriba, excepto que no se emplea ningún anticuerpo en la preparación, y que en su lugar se emplea la BSA. Alternativamente, pueden usarse otras proteínas en lugar de la BSA, tales como otras albúminas (incluyendo la lactoalbúmina), caseína, globulina, inmunoglobulina (la cual no participa en la reacción antígeno-anticuerpo), y similares, que pueden prevenir la unión no específica.

C. Mezcla de Ab-látex y BSA-látex

El Ab-látex y el BSA látex se mezclan entre sí en diferentes proporciones, en función del ensayo que va a efectuarse. Por ejemplo, en la preparación de mezclas para utilizar como se expone en los ejemplos que siguen, el Ab-látex y el BS-látex se mezclaron aproximadamente en la relación 1:1 y 1:3, volumen a volumen, para emplear en el Occult Blood Test ("Ensayo de sangre oculta")(ver el ejemplo II). En el ensayo de Strep A (ejemplo I), la relación fue de aproximadamente 1:2, Ab-látex:BSA-látex. La cantidad de látex (u otra partícula) sin ningún anticuerpo, puede ser cualquier cantidad que sea eficaz para disminuir apreciablemente la unión no específica o las reacciones falsamente positivas. Tales cantidades se determinan fácilmente por métodos obviamente empíricos.

D. Procedimiento del ensayo de un paso

La unidad de reacción del ensayo utilizada en una versión particular de la invención, está provista de una banda de membrana de nitrocelulosa con un tamaño de poro de aproximadamente 8 \mum, aunque pueden utilizarse tamaños de poro más grandes o más pequeños (es decir, de preferencia en un margen desde aproximadamente 3 \mum hasta aproximadamente 12 \mum). La banda está alojada en una cubierta de plástico. Es importante tomar buena nota de la relación entre el tamaño del poro y el tamaño de la partícula; el diámetro de las partículas empleadas debe ser más pequeño que el tamaño del poro de la membrana, de forma que las partículas puedan moverse a través de la membrana.

Aproximadamente 5 \mul de cada uno de Ab-látex o de la mezcla Ab-látex/BSA-látex ("Ab/BSA") se aplicaron a la membrana de una forma móvil, y se inmovilizaron un Ab específico (señal positiva) y una IgG anti-conejo procedente de cabra, (señal negativa) sobre la membrana previamente al ensayo, en zonas delimitadas. (La IgG anti-conejo de cabra puede obtenerse de varias fuentes, p. ej., Pel-Freez, Rogers, AR.). Estas zonas, pueden sin embargo, ser contiguas o solaparse.

En la realización del ensayo, se aplica una muestra de la membrana, la cual fluye a lo largo de la misma debido a la acción capilar. La muestra que fluye lleva la mezcla de látex a lo largo de la membrana, y el analito de la muestra se une al látex marcado con el anticuerpo. El látex que está unido al analito queda inmovilizado al Ab de "señal positiva", y el látex que solamente tienen el Ab de conejo unido al mismo queda inmovilizado al Ab de "señal negativa". Cuando el látex marcado está coloreado, se forma una señal visible en las zonas positivas y negativas.

La invención puede comprenderse mejor mediante los siguientes ejemplos que son representativos de las versiones preferidas del mismo, pero que no han sido formulados para limitar el campo de la invención.

Ejemplo I Ensayo del Strep A

Preparamos el hidrato de carbono antígeno del grupo A de streptococcus (antígeno Strep A) mediante el método de extracción con ácido nitroso (Manual of Clinical Microbiology, 4th Ed., American Society for Microbiology) ("Manual de Microbiología Clínica, 4ª edición, Sociedad Americana de Microbiología"). La solución del antígeno de Strep A (0,25 ml) se transfirió al sitio de aplicación de la muestra de un dispositivo de inmunoensayo, que comprende como mínimo, una capa de soporte o membrana que tiene una o más zonas definidas, con ligando o antiligando unidos a las mismas, en la cual la muestra se colocó sobre la capa de soporte en una región fuera de las zonas definidas, y a continuación se administró un flujo de líquido a la capa de soporte, dejando que la muestra se difundiera a través de las zonas definidas y permitiendo que las sustancias de la muestra se unieran a las mismas. Por lo menos una de las zonas definidas tiene partículas coloidales que tienen un ligando unido a las mismas, en donde el ligando y cualquier analito de la muestra son ambos complementarios al antiligando unido a la primera zona definida (a menudo también, los dispositivos para inmunoensayos rodean o soportan la membrana con una cubierta de plástico).

Se efectuaron dos ensayos idénticos, simultáneamente paso a paso. Un ensayo se terminó a los 3 minutos, el otro a los 10 minutos.

Utilizando Ab-látex solo (ver la figura 1.A), concentraciones de antígeno equivalentes entre 5 x 10^{8} y 5 x 10^{9} células de Strep A por ensayo, ocasionaron que el Ab-látex se aglutinada. Como consecuencia, solamente una pequeña cantidad de látex se movió a través de la membrana de nitrocelulosa, con lo que las señales positivas fueron muy débiles tanto a los 3 como a los 10 minutos. Por otro lado, cuando se utilizó la mezcla Ab/BSA (ver figura 1.B), el mismo número de células Strep A por ensayo que causaron aglutinación en el Ab-látex no produjeron la misma aglutinación en la mezcla Ab/BSA. Esto se evidenció por el hecho de que se observó más látex moviéndose a lo largo de la membrana cuando se utilizó la mezcla Ab/BSA. Con este mayor volumen de movimiento de látex se produjo un subsiguiente aumento de la fuerza de la señal tanto a los 3 como a los 10 minutos, cuando se la compró con el A-látex sola. Sin embargo a concentraciones más bajas de células Strep A (5 x 10^{4} células por ensayo), tanto el Ab-látex como la mezcla Ab/BSA mostraron similares resultados en cuanto a la cantidad de látex en movimiento y fuerza de la señal.

Utilizando una mezcla de Ab-látex y látex puro (figura 2.A.), 5 x 10^{9} células Strep A por ensayo causaron la aglutinación de alguna cantidad de látex y la señal positiva no fue visible pero el fondo fue oscuro y borroso cuando se le comparó con Ab/BSA (figura 2.B.). Con 5 x 10^{8} células o menos por ensayo (figura 2.B.), la mezcla Ab/BSA mostró un fondo más claro cuando se la comparó con el ensayo utilizando una mezcla de Ab-látex y látex puro (figura 2.A.). Sin embargo, incluso la combinación de Ab-látex y látex puro mostró un mejor movimiento de látex que el Ab-látex solo (figura 1.A. y figura 2.A.).

Ejemplo II Ensayo de sangre oculta

Dos bastones para muestras de un kit de ensayo de sangre oculta (tal como el descrito en la patente USA nº 5.182.191) fueron untados con una muestra fecal y se colocaron en una copa de extracción que contenía 350 ml de solución de extracción conteniendo 0,1% de TRITON® en tampón de Tris 50 mM, pH 8,0. (Tris y TRITON® obtenidos de Sigma Co., St. Louis, MO). Después de 10 segundos de rápido movimiento de la solución y la mezcla de extracción se transfirió al sitio de aplicación de las muestras de un dispositivo para inmunoensayos, tal como se describe en el ejemplo I. El ensayo se terminó después de 10 minutos sacando la membrana de su cubierta de plástico.

Nuestras observaciones fueron similares a las registradas para el ensayo del Strep A. Encontramos que en presencia de hemoglobina humana (126 ng-600 ng por ensayo) el Ab-látex tendía a aglutinarse mucho más pronto, produciéndose un movimiento de látex desigual [apareció un "streaking" ("rayas") en la ventana de la señal; ver figura 3]. Debido a la temprana aglutinación, menos cantidad de látex fue capaz de moverse a través de la ventana de la señal, y la señal apareció algo mutilada e "inacabada". Con la adición de BSA-látex, se observó un movimiento de látex más uniforme. El resultado de utilizar una mezcla de Ab/BSA fue un fondo más limpio, e igual o mejor sensibilidad que la lograda con Ab-látex solo. Comparando la mezcla de Ab-látex y BSA-látex en una proporción 1:1 frente a 1:2 ó 1:3, cuanto más alta fue la concentración de BSA-látex, mejor fue el fondo y más rápido el movimiento del látex a través de la ventana de la señal (figura 3B y 3C).

Estos resultados indican que utilizando una mezcla de Ab-látex y BSA-látex, en lugar de Ab-látex solo, mejoró la realización del ensayo sin comprometer la sensibilidad del mismo. Formulamos la hipótesis de que el ABS-látex de la mezcla Ab/BSA pudiera funcionar como un "espaciador", evitando así la inmediata aglutinación del Ab-látex en presencia del antígeno del ensayo. Posteriormente hemos observado que la utilización de la mezcla Ab/BSA tiende también a eliminar la unión no específica y los resultados falsamente positivos.

Ejemplo III Ensayo de la HCG de la orina

Hemos observado que la utilización de la mezcla Ab/BSA reduce o elimina la producción de reacciones positivas falsas en los ensayos de un solo paso de la HCG de la orina. Cuando se aplicaba el Ab-látex solo, al soporte antes de efectuar el ensayo, se había observado que podía dar como resultado una reacción positiva falsa; cuando se utilizó la mezcla de látex Ab/BSA para analizar la misma orina, no se observó ninguna reacción positiva falsa. La producción de reacciones positivas falsas en algunas muestras de orina se debe probablemente a la presencia de sustancias que causan uniones no específicas con el Ab-látex y Ab inmovilizado, dando como resultado la formación de un "sándwich". La presencia de BSA-látex puede interferir con la unión no-específica, reduciendo o eliminando así la producción de reacciones positivas falsas. Las sustancias de la orina que causan dicha unión no específica son probablemente la proteína A del Staphylococcus aureus. Es conocido que la proteína A del S. aureus se une fuertemente a la IgG, y en el caso de que el S. aureus esté casualmente presente en la orina de una mujer no embarazada, puede producirse una reacción falsamente positiva.

Aunque la invención ha sido descrita en el contexto de versiones particulares, se pretende que el ámbito de cobertura de la patente no esté limitado a las versiones particulares, sino que esté determinada por referencia a las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Un método para minimizar la aglomeración de las partículas marcadas con el ligando o marcadas con el antiligando utilizadas en un ensayo que implica el empleo de partículas marcadas y no marcadas, en el cual dicha marca interacciona con el analito, caracterizado dicho método por los pasos de provisión de dichas partículas marcadas, de dichas partículas no marcadas, y del analito sobre una capa soporte, en donde tanto las partículas marcadas como las partículas no marcadas tienen un tamaño de 0,8 \mum de forma que dichas partículas pueden moverse por acción capilar a través de la capa soporte y están formadas del mismo material, permitiendo la interacción de dicha marca y de dicho analito, y desplazándose dichas partículas marcadas a través de dicha capa soporte, desde una primera zona a una segunda zona después de dicha interacción, sin que se produzca aglutinación de partículas debido a dicha interacción.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dichas primeras partículas móviles comprenden partículas de látex a las cuales está unido el ligando o antiligando, y dichas segundas partículas móviles comprenden partículas de látex puro.

3. El método de la reivindicación 1, en donde las primeras partículas móviles están coloreadas.

4. El método de la reivindicación 1, en donde una proteína que no interacciona con dicho ligando o antiligando está unida a dichas segundas partículas móviles.