ES2112865T5

ES2112865T5 - Anticuerpos igg purificados.

Info

Publication number: ES2112865T5
Application number: ES91917891T
Authority: ES
Inventors: Paul Ian Nicholas Ramage; Geoffrey Allen
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1990-10-17
Filing date: 1991-10-17
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2011-10-17
Also published as: FR2668164B1; EP0504363B1; AU4521897A; GR3026588T3; IL99761A0; BE1004226A5; FI922380A0; MY136210A; GB9022547D0; KR960015399B1; BR1100358A; CH681455A5; NZ240247A; MY119030A; KR920703108A; IT1250064B; CA2069481C; ES2081742B1; PT100988B; GR910100425A

Abstract

Un procedimiento para obtener una preparación purificada de un anticuerpo IgG anti-CDW 52 preparado utilizando un sistema de expresión recombinante, comprendiendo dicho procedimiento: (a) aplicar una solución acuosa del anticuerpo a una columna de Proteína A o Proteína G para absorber el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución ácida de un pH desde 3,0 hasta 3,5; (b) aplicar el eluído ácido a una columna de intercambio iónico de partículas cargadas para absorber el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución ácida de iones con carga contraria; y (c) aplicar el eluído acuoso a una columna de exclusión molecular de partículas porosas para retener las moléculas no-anticuerpo en las partículas porosas y para obtener el anticuerpo deseado en fracciones seleccionadas eluídas de la columna que contienen menos del 2% de agregado de anticuerpo según se midió por cromatografía de exclusión según tamaño.

Description

Anticuerpos IgG purificados.

La presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una preparación purificada de un anticuerpo IgG anti-CD_{w}52 producido utilizando un sistema recombinante de expresión en mamíferos, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal contra el antígeno CD_{w}52.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas son moléculas bifuncionales proteicas. Una región que es altamente variable entre los diferentes anticuerpos, es responsable de la unión a un antígeno, por ejemplo muchos agentes infecciosos diferentes que el cuerpo puede encontrar, mientras que una segunda región constante es responsable de la unión a los receptores Fc de las células y también activa el complemento. De esta forma los anticuerpos representan un componente vital de la respuesta inmune de mamíferos para destruir microorganismos y virus extraños. La inmunización de un animal con un antígeno genera la producción de anticuerpos policlonales, en otras palabras, diferentes anticuerpos con diferentes especificidades y afinidades. Para aplicaciones terapéuticas es ventajosa la capacidad de producir anticuerpos a partir de un único clon de linfocitos - tales anticuerpos son llamados anticuerpos monoclonales y son específicos para un determinante particular del antígeno original. Estos pueden obtenerse por el método de Kohler y Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497).

Una única molécula de anticuerpo de la clase IgG está compuesta por dos cadenas ligeras y por dos cadenas pesadas que se mantienen unidas por puentes disulfuro intercatenarios. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un puente disulfuro y las dos cadenas pesadas se unen entre sí por puentes disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido por varios dominios constantes, cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en el otro extremo. El dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los otros dominios constantes de las cadenas pesadas se alinean unos con otros y forman el fragmento Fc, después de la ruptura limitada de la cadena polipeptídica.

Los dominios variables de cada par de cadenas pesadas y ligeras forman el sitio de unión al antígeno. Junto con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera forman, después de la ruptura limitada de la cadena polipeptídica, el fragmento Fab. Los dominios variables de cada par de cadenas pesada y ligera tienen la misma estructura general comprendiendo cada dominio una estructura de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas con tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs). Las cuatro regiones de la estructura adoptan mayormente una conformación de hoja b y las CDRs forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja b. Las CDRs se mantienen muy próximas por las regiones de estructura y, con las CDRs del otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno.

El antígeno Cd_{w}52 (G. Hale et al, Tissue Antigens 1990 35, pp 118-127) es una molécula abundante ampliamente distribuida en la mayoría, sino en todos, de los linfocitos humanos. También está presente en la superficie de la mayoría de los linfocitos malignos, pero no en las células hematopoyéticas, ni se expresa en granulocitos, plaquetas, ni en las células eritroides o mieloides de la médula ósea. Se han producido varios anticuerpos monoclonales de isótopos diferentes contra este antígeno y se han descrito en la literatura, (G. Hale et al, Tissue Antigens, 1990, 35, pp 118-127). Uno de estos anticuerpos, un anticuerpo IgG1, ha sido humanizado (Nature, 1988, 322, 323-327 y el documento EP0328404). Este anticuerpo se conoce como Campath 1H (Campath es una marca comercial de The Wellcome Foundation Ltd). Se ha utilizado una preparación de este anticuerpo para tratar pacientes que sufren del linfoma de no Hodgkin, (G. Hale et al, Lancet, 1988, pp 1394-1399).

Campath 1H se purificó originalmente en un procedimiento de una etapa única sobre una columna (EP0228404) de Proteína A Sepharosa (marca comercial). La Proteína A es un grupo de ligandos específicos que se unen a la región Fc de la inmunoglobulina; por lo tanto otras inmunoglobulinas contenidas en el suero presentes en el medio de cultivo se co-purificarán con la inmunoglobulina de interés contaminando, por lo tanto, el producto final. (P.A. Underwood et al, Meths. in Enzymol. 121 pp. 301-306 (1986), y P.A. Underwood et al, J. Immunol. Meths 60, 33, 1983). Los anticuerpos que se utilizan en terapia médica pueden necesitar ser aplicados de forma repetitiva, de manera que es importante la necesidad de eliminar inmunoglobulinas extrañas debido a que dicha administración puede producir una respuesta inmune e inducir nefrotoxicidad, enfermedad del suero y, en casos severos, choque anafiláctico. Todos los sueros animales o la albúmina sérica contendrán otras proteínas, lípidos y carbohidratos; estas moléculas pueden en sí mismas producir una respuesta inmune pero poseen un peligro mayor de albergar patógenos tales como el agente que produce la Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE). También pueden estar presentes endotoxinas que son indeseables debido a que producen potencialmente respuestas pirogénicas fatales.

Otros contaminantes en el medio de cultivo que contiene el anticuerpo expresado, incluyen células huésped y ácido nucleico viral. También las agrupaciones de anticuerpos pueden actuar como inmunógenos y producir una respuesta inmune indeseable.

La presente invención proporciona por lo tanto un procedimiento para obtener una preparación purificada de un anticuerpo IgG anti-CD_{W} 52 preparado utilizando un sistema de expresión recombinante, dicho procedimiento comprende:

(a): aplicar una solución acuosa del anticuerpo a una columna de Proteína A o Proteína G como para absorber el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución ácida de un pH de desde 3,0 hasta 3,5.

(b): aplicar el eluído ácido a una columna de intercambio iónico de partículas cargadas como para absorber el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución acuosa de iones con carga contraria; y

(c): aplicar el eluído acuoso a una columna de exclusión molecular de partículas porosas para retener las moléculas que no son anticuerpos en las partículas porosas y para obtener el anticuerpo deseado en fracciones seleccionadas eluídas de la columna que contienen menos del 2% de agregado de anticuerpo medido por cromatografía de exclusión según tamaño.

Se describe además una preparación purificada de un anticuerpo IgG anti-CD_{W} 52 preparado utilizando un sistema de expresión recombinante, siendo obtenible dicha preparación por un procedimiento según la invención. Dichas preparaciones muestran:

(i): sobre cromatografía de exclusión según tamaño:

: un pico único bajo condiciones no reductoras y dos picos principales bajo condiciones reductoras;

(ii): sobre una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS convencional:

: una banda principal utilizando una muestra no reducida y dos bandas principales utilizando una muestra reducida; y

(iii): sobre HPLC en fase inversa:

: un pico único bajo condiciones no reductoras y dos picos principales bajo condiciones reductoras.

La cromatografía de exclusión según tamaño como sugiere su nombre separa en base al tamaño de las proteínas. En general la separación se produce porque las moléculas grandes se excluyen al no poder entrar en la fase estacionaria porosa y se transportan directamente a través de la columna mientras que las moléculas progresivamente más pequeñas tienen capacidades incrementadas para entrar en la fase estacionaria y consecuentemente tienen tiempos de elución particularmente más largos. Por lo tanto es la porosidad de la fase estacionaria la que determina que se produzca la separación. Esta técnica analítica es particularmente adecuada para determinar niveles de agregado en la preparación purificada. La fase estacionaria es un gel de sílice de poro ancho que puede modificarse con grupos diol preferiblemente un gel tal como Zorbax GF450-GF250 (Marca comercial de Dupont) o gel TSK G3000 SWXL o G4000 SWXL. La fase móvil está generalmente en el intervalo de pH de 4 a 8, más preferiblemente de 6 a 7,5 y ventajosamente alrededor de pH 6,8. Esta fase es ventajosamente una mezcla de un fosfato tal como hidrógeno ortofosfato de disodio y un sulfato tal como sulfato de sodio o de potasio y agua. La molaridad de dicha mezcla es generalmente de 25 mM hasta 1 M estando más preferiblemente alrededor de 50 mM.

La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS PAGE) da información sobre el número y tipo de proteínas presentes en la mezcla, su abundancia relativa y da una medida de sus pesos moleculares. SDS es un detergente aniónico, que reacciona con las proteínas antes de la electroforesis. La mayoría de los complejos proteína SDS son solubles y migrarán a través de un gel de poliacrilamida hacia el ánodo, bajo la influencia de una carga eléctrica. La velocidad de migración generalmente está inversamente relacionada con el logaritmo del peso molecular de la proteína. Es conveniente realizar el análisis SDS en un gel gradiente que puede ser un lecho plano o bloques o barras verticales. El gradiente es ventajosamente del 10 al 22% o más preferiblemente del 8 al 18%. El gel es preferiblemente el gel Pharmacia Excel (Marca comercial).

La HPLC en fase inversa separa en base a la hidrofobicidad. Como en las otras técnicas HPLC hay una fase estacionaria polimérica, de por ejemplo poliestireno/divinilbenceno. La fase móvil es normalmente una combinación de un tampón acuoso débil o un ácido diluido y un disolvente orgánico miscible en agua. Para la separación efectiva de las proteínas la fase móvil es generalmente un sistema gradiente, requerido para conseguir la separación y es preferiblemente lineal por conveniencia.

La fase estacionaria para el análisis de la inmunoglobulina puede ser una matriz polimérica orgánica tal como Polymer Labs PLRP-S generalmente de un tamaño de partícula de alrededor de 8 \mum; el tamaño del poro es preferiblemente de 30 nm o 100 nm (300\ring{A} o 100\ring{A}). La fase móvil es ventajosamente una mezcla de un ácido tal como un ácido fórmico, acético o trifluoroacético, agua y acetonitrilo. El ácido y el agua están presentes preferiblemente en la proporción 5:3.

Un anticuerpo puede reducirse a las cadenas pesadas y ligeras que lo componen por reducción de los puentes disulfuro bajo condiciones desnaturalizantes con como por ejemplo cloruro de Guanidinium y ditiotreitol. La alquilación subsiguiente de los grupos tioles libres, por ejemplo con yodoacetamida del ácido yodoacético, ayuda a impedir que se vuelvan a formar los enlaces.

Se proporciona una medida de la pureza por la actividad específica de la preparación de anticuerpos. La actividad específica puede determinarse por el método expuesto en los ejemplos. Una preparación purificada según el procedimiento de la invención tiene preferiblemente una actividad específica mayor de 0,8 Kilo Unidades/mg, idealmente mayor de 0,9 Kilo Unidades/mg, y más preferiblemente alrededor de 1,0 Kilo Unidades/mg.

Una preparación purificada de un anticuerpo anti-CDW52 purificado según el procedimiento de la invención idealmente, está sustancialmente libre de contaminantes de células huésped tales como proteínas, ácidos nucleicos y endotoxinas de células huésped. La actividad específica proporciona información sobre los niveles de proteínas de células huésped en la preparación. Los niveles de endotoxina pueden medirse por el método LA (Limulus Amoebocyte Lysate) descrito en Parenteral Quality Control, M.J. Alles et al.; Marcel Dekker Inc., New York.

Una preparación purificada según el procedimiento de la invención está también esencialmente libre de agregados, según se ha medido por cromatografía de exclusión según tamaño. Sería deseable que estos niveles fueran menores del 2%, idealmente menores del 0,5%.

El anticuerpo se prepara utilizando un sistema de expresión recombinante. El sistema preferido es un sistema de expresión de mamíferos utilizando células del ovario de hámster (CHO) chino. Estas pueden ser dihidrofolato reductasa (dhfr) deficientes y depender por tanto de la timidina y la hipoxantina para su crecimiento (PNAS 77 1980, 4216-4220). La línea celular parental CHO dhfr- es transfectada con el gen del anticuerpo y el gen dhfr que permite la selección de los transformantes de fenotipo dhfr positivo. La selección se lleva a cabo cultivando las colonias en medio deficiente en timidina e hipoxantina, la ausencia de los cuales impide el crecimiento de las células no transformadas y las células transformadas recuperan la vía del folato y desvían por lo tanto el sistema de selección. Estos transformantes normalmente expresan niveles bajos del producto del gen en virtud de la co-integración de ambos genes transfectados. Los niveles de expresión del gen del anticuerpo pueden incrementarse por amplificación utilizando metotrexato (MTX). Este fármaco es un inhibidor directo de la enzima dhfr y permite el aislamiento de colonias resistentes que amplifican el número de copias del gen de dhfr suficientemente para sobrevivir bajo estas condiciones. Debido a que los genes de dhfr y anticuerpo están unidos más próximamente en los transformantes originales, hay normalmente una amplificación concomitante, y por lo tanto una expresión incrementada del gen del anticuerpo deseado.

Otro sistema de expresión para uso con células CHO o de mieloma es el sistema de amplificación de la glutamina sintetasa (GS) descrito en el documento WO87/04462. Este sistema incluye la transfección de una célula con un gen que codifica la enzima GS y el gen del anticuerpo deseado. Después se seleccionan las células que crecen en un medio libre de glutamina. Estos clones seleccionados se someten después a inhibición de la enzima GS utilizando metionina sulfoximina (Msx). Las células, para sobrevivir, amplificarán el gen de GS con amplificación concomitante del gen que codifica el anticuerpo.

El anticuerpo anti-CD_{W} 52 se obtiene preferiblemente en una forma en la que es secretado al medio de cultivo. El medio recogido puede filtrarse y/o concentrarse a continuación mediante una etapa de ultrafiltración para obtener una solución acuosa que se somete a un procedimiento de purificación que comprende:

(a): aplicar una solución acuosa del anticuerpo así producido a una columna de Proteína A o Proteína G para absorber así el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución ácida;

(b): aplicar el eluído ácido a una columna de intercambio iónico de partículas cargadas para absorber así el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución acuosa de iones con carga contraria; y

(c): aplicar el eluído acuoso a una columna de exclusión molecular de partículas porosas para retener así las moléculas que no son anticuerpos en las partículas porosas y para obtener el anticuerpo deseado en fracciones seleccionadas eluídas de la columna.

La proteína A es un ligando específico de grupo que se une a la región Fc de la mayoría de IgG. Es sintetizada por varias cadenas de Staphylococcus aureus y puede aislarse a partir de los sobrenadantes del cultivo y después hacerse insoluble mediante unión a perlas de agarosa o sílice. Un método alternativo es utilizar la bacteria completa de una cepa que porte grandes cantidades de proteína A sobre la superficie de la célula bacteriana. Ambos tipos de preparación de gel están disponibles comercialmente. (Proteína A - Pharmacia. Bacteria completa - Calbiochem, IgG sorb). (Alan Johnstone y Robin Thorpe Immunochemistry in practice, Blackwell Scientific Publn. Chpt. 10). Una alternativa a la Proteína A es la Proteína G (Analytical Chem. Vol. 61 (13) 1989 1317).

La columna que se utiliza más preferiblemente es la columna de proteína A Sepharosa (Marca comercial) particularmente la de Proteína A Sepharosa Fast Flow (Marca comercial). Idealmente la columna se lava con solución salina tamponada con tris o fosfato alrededor de pH 7 y el anticuerpo es eluído a un pH ácido de 3,0 a 3,5 ventajosamente pH 3,0 utilizando un ácido tal como ácido cítrico por ejemplo en una concentración de alrededor de 0,1 M.

La cromatografía de intercambio iónico explota las interacciones entre los grupos cargados en una fase estacionaria y la muestra que se encuentra en la fase móvil. La fase estacionaria de una columna de intercambio iónico puede ser un catión intercambiador cargado positivamente o un anión intercambiador cargado negativamente. Los grupos cargados son neutralizados por contraiones con carga opuesta en la fase móvil, reemplazándose los contraiones durante la cromatografía por moléculas de la muestra con mas carga. Es preferible utilizar columnas reticuladas basadas por ejemplo en agarosa, por ejemplo la columna de intercambio catiónico S-Sepharosa Fast Flow (Marca comercial) particularmente la columna de intercambio catiónico S.Sepharosa Fast Flow (Marca comercial). Alternativamente puede emplearse una columna basada en membranas. La columna se lava normalmente después de la aplicación del eluído a partir de la columna de Proteína A, con tampón HEPES 20 mM a pH 7,5 y el anticuerpo es eluído con el mismo tampón que contiene cloruro de sodio en el intervalo de 0,2 M a 0,075 M.

La cromatografía de exclusión según tamaño como su propio nombre indica separa en base al tamaño de las proteínas. En general la separación se produce porque las moléculas grandes se excluyen al no poder entrar en la fase estacionaria porosa y se transportan directamente a través de la columna mientras que las moléculas progresivamente más pequeñas tienen capacidades incrementadas para entrar en la fase estacionaria y consecuentemente tienen tiempos de elución particularmente más largos. Por lo tanto es la porosidad de la fase estacionaria la que determina que se produzca la separación. Los materiales adecuados están unidos químicamente y proporcionan resistencia a la compresión, por ejemplo, una composición de dextrano y/o agarosa tal como Superdex (Marca comercial). Una columna preferida es un medio de exclusión molecular Superdex 200. El eluído de la columna de intercambio iónico se aplica preferiblemente a una columna Superdex y se desarrolla en un tampón en el intervalo de pH 5-8 preferiblemente PBS a pH 7,2.

Preferiblemente cada columna es protegida por un filtro que puede ser un filtro esterilizador Gelman Acro de 20 \muM o en el caso de la columna de Proteína A o PALL posidyne SLK 7002 NFZP o un filtro PALL DSLK2 (disponible de Pall Process Filtration LTD. European House, Havant Street, Portsmouth 301 3PD) y para las otras dos columnas un filtro de Millipak preferiblemente Millipak 100 para la columna de intercambio iónico y Millipak 20 ó 60 para la columna de exclusión molecular (disponible de Millipore, The Boulevard, Blackmore Lane, Watford, Herts). Preferiblemente las columnas se esterilizan antes de su utilización con un esterilizador adecuado, por ejemplo NaOH 0,5 M durante 16 horas para cualquiera de las columnas, o gluconato de hibitane al 2% en etanol al 20% para la columna de Proteína A o NaOH 1 M para las otras dos columnas. Los esterilizadores se extraen por lavado con los tampones estériles apropiados antes de aplicar la solución de proteína. Todas las soluciones utilizadas en el procedimiento eran preferiblemente estériles y exentas de endotoxinas.

Pueden añadirse etapas adicionales al procedimiento de purificación descrito anteriormente. Puede utilizarse ultrafiltración para reducir adicionalmente la contaminación de ácidos nucleicos virales y de la célula huésped. Esta puede llevarse a cabo utilizando unidades de ultrafiltración disponibles comercialmente tales como membranas Viresolve/70' o Viresolve/180' adicionalmente, membrana cortada 300 k de celulosa regenerada con PLMK, todas disponibles de Millipore, The Boulevard, Blackmore Lane, Watford, Herts. Un método alternativo para reducir la contaminación por virus es la microfiltración utilizando una membrana de Nailon en forma de cartucho por ejemplo la membrana de Nailon de 66, 0,04 \mum de PALL.

Puede introducirse una etapa de purificación para eliminar el ADN contaminante, por ejemplo, un lavado de la columna de Proteína A utilizando NaCl en el intervalo 1 M-3 M en tampón a pH neutro preferiblemente PBS a pH 7,2. Puede añadirse glicina al NaCl preferiblemente a alrededor de 1,5 M en el intervalo de pH de 8,8 a 9,0.

La tecnología de ADN recombinante ha proporcionado la capacidad para desarrollar anticuerpos alterados de dos tipos básicos. El primer tipo, referido como anticuerpos quiméricos, son los que solo dominios constantes de roedores son reemplazados por dominios equivalentes de origen humano (Morrison et al, P.N.A.S., 1984, 81, 6851-6855; Boulianne et al, Nature, 1985, 314, 268-270; y Neuberger et al, Nature, 1985, 314, 268-270). El segundo tipo son los que los dominios constantes de murina y las regiones de murina que forman la estructura son todas reemplazadas por dominios y regiones equivalentes de origen humano. Este segundo tipo de anticuerpo es referido como anticuerpo humanizado o injertado con CDR (Jones et al, Nature, 1986, 321, 522-525; y Riechmann et al, Nature, 1988, 322, 323-327). Estos anticuerpos se asemejan más próximamente a los anticuerpos humanos cuando se administran a un paciente humano y de esta manera no provocan una respuesta anti-anticuerpo del mismo grado. También puede utilizarse un anticuerpo humano.

Por lo tanto el anticuerpo anti-CDw52 purificado puede ser un anticuerpo de rata, ratón o humano en el que las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras son homólogas con las secuencias del anticuerpo producido por las especies linfocitos in vivo o in vitro por hibridomas. Preferiblemente un anticuerpo anti-CDw52 es un anticuerpo alterado tal como un anticuerpo híbrido en el que las cadenas pesadas y ligeras son homólogas a un anticuerpo natural pero se combinan de una manera que no se produce naturalmente. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico que tiene regiones variables de un anticuerpo y regiones constantes de otro. De esta forma, los anticuerpos quiméricos pueden ser quimeras especies/especies o quimeras clase/clase. Tales anticuerpos quiméricos pueden tener una o más modificaciones adicionales para mejorar la capacidad de unión al antígeno o para alterar la funcionalidad del efector. Otra forma de anticuerpo alterado es un anticuerpo humanizado o injertado con CDR que incluye un anticuerpo compuesto, en donde partes de las regiones hipervariables además de las CDRs se transfieren a la estructura humana. Pueden alterarse aminoácidos adicionales en las estructuras o regiones constantes de tales anticuerpos. De esta manera se describe cualquier anticuerpo alterado anti-CDw52 en el que la secuencia de aminoácidos es una que no existe en la naturaleza. Sin embargo, los anticuerpos injertados con CDR son más preferidos entre los cuales Campath 1H (Marca comercial de The Wellcome Foundation LTD.) es un ejemplo. Las secuencias de cadena de ADN del anticuerpo que incluyen las CDRs de Campath 1H se muestran en el documento de patente EP0328404. Se describe además una preparación purificada de un anticuerpo anti-CDw52 en el que el anticuerpo comprende una o más de las secuencias de CDR mostradas en el documento EP0328404.

Los anticuerpos anti-CDw52 purificados son útiles en la terapia médica para el tratamiento de numerosos trastornos generalmente como inmunosupresores más particularmente por ejemplo en trastornos mediados por las células T incluyendo vascularitis aguda, artritis reumatoide, lupus sistémico, también trastornos autoinmunes tales como esclerosis múltiple, la enfermedad de graft vs huésped, psoriasis, diabetes juvenil, la enfermedad de Sjogrens, enfermedad de tiroides, miastemia gravis, rechazo en transplantes y asma. Estos anticuerpos son también útiles en el tratamiento de cánceres tales como el linfoma distinto al de Hodgkin y leucemias.

También se describe la utilización de una preparación purificada de un anticuerpo anti-CDw52 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualesquiera de los trastornos mencionados anteriormente. Un ser humano que tenga cualquiera de dichos trastornos puede ser tratado mediante administración a dicho individuo de una cantidad terapéutica efectiva de una preparación purificada de un anticuerpo anti-CDw52.

Las dosis de tales anticuerpos variarán con la condición a tratar y el receptor del tratamiento, pero estarán en el intervalo de desde 1 hasta alrededor de 100 mg para un paciente adulto, preferiblemente de 1 a 10 mg, normalmente administrado diariamente durante un periodo entre 1 y 30 días. Puede ser preferible un régimen de dosificación en dos partes en el que se administran de 1 a 5 mg durante 5 a 10 días seguidos de 6 a 15 mg durante otros 5 a 10 días adicionales.

También se describen formulaciones que contienen una preparación purificada de un anticuerpo anti CDw52. Tales formulaciones incluyen preferiblemente, en adición al anticuerpo, un diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable posiblemente en combinación con otros agentes tales como otros anticuerpos y antibióticos. Vehículos adecuados incluyen pero no se limitan a solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato, glucosa salina tamponada con fosfato y solución salina tamponada. Alternativamente, el anticuerpo puede estar liofilizado (secado bajo congelación) y reconstituido para su uso cuando sea necesario, mediante la adición de una solución tamponada acuosa como las descritas anteriormente. Las vías de administración son rutinariamente parenterales que incluyen inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal o envío.

Los dibujos adjuntos muestran: (figuras 2 a 6 están relacionadas con una preparación purificada de Campath 1H).

Figura 1.

a) El constructo que cotniene las casetes de expresión para el marcador de selección/amplificación dhfr "lisiado" y el ADNc de cadena ligera Campath-1H. la pequeña caja con la flecha arrojada es el promotor SV40 debilitado, la caja punteada más grande con una flecha es el promotor b-actina, poliA se refiere a las señales añadidas de poliadenilación y terminación respectivamente; la caja pequeña con ori contiene el origen de replicación de SV40;

(b) La construcción pNH316 que contiene las casetes de expresión para el marcador de selección de la neomicina y el ADNc de la cadena pesada de Campath 1H. La caja con una flecha y MT se refiere al promotor de la metalotioneina de ratón. Los sitios de restricción indicados son: - H, HindIII; Bg, Bg1II; B, BamHI; R1, EcoR1.

Figura 2.

Gel de poliacrilamida SDS de Campath 1H no reducido y reducido que muestra una banda simple única.

Figura 3.

Cromatografía de alta resolución en fase inversa de Campath 1H no reducido que muestra un pico único.

Figura 4.

Cromatografía de alta resolución en fase inversa de Campath 1H reducido y carboximetilado que muestra dos picos resueltos que corresponden a las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Figura 5.

Cromatografía de exclusión según tamaño de alta resolución de Campath 1H no reducido que muestra un pico único.

Figura 6.

Cromatografía de exclusión según tamaño de alta resolución de Campath 1H que muestra dos picos principales.

Ejemplo 1 Producción de Campath 1H a partir de células CHO

Ejemplo 1A

Clonado de los ADNcs de la cadena pesada y ligera para Campath 1H

Originalmente las regiones determinantes complementarias del monoclonal Campath-1G de rata se injertaron directamente en las estructuras genómicas humanas de cadena pesada y ligera (Winter et al, Nature, 1988, 322, 323-327). Estas construcciones se produjeron por ingeniería genética para la expresión en la línea celular YO de mieloma y produjeron rendimientos de Campath 1H de hasta 5 \mug/ml después de 10 a 14 días en cultivo (Hale et al, Tissue Antigens, 1990, 35, 118-127 y Winter et al, Nature, 1988, 322, 323-327). La línea celular de mieloma TF57 (Hale et al, ibid,) se utilizó para generar fracciones de ADNc seleccionadas por tamaño de 0,9 a 1,2 kb y 1,4 a 1,7 kb para las cadenas pesada y ligera respectivamente. Estas se utilizaron para hacer genotecas de ADNc unidas con EcoR1 en \lambdagt10. Todos los procedimientos se hicieron según describieron Huynh et al (DNA Cloning, Vol I: A Practical Approach, 1984, Glover, D (Editor), IRL Press, Oxford). Las genotecas se seleccionaron utilizando sondas marcadas por desplazamiento de mella [32P] específicas para las regiones variables para aislar clones de ADNc de cadena completa. Para el ADNc de la cadena ligera, la secuencia líder 5' no traducida se eliminó hasta la posición -32 utilizando la exonucleasa Ba1-31 y se añadió un ligando HindIII. Para el extremo 3', se hizo uso de un único sitio SacI 47pb corriente arriba del codón de parada. Se utilizó un par oligonucleótido sintético SacI-HindIII para regenerar esta secuencia y colocar el sitio HindIII inmediatamente después del codón de parada. Para el extremo 5' del ADNc de la cadena pesada, se utilizó el único sitio NcoI que solapa el codón de partida ATG para reconstruir una secuencia líder no traducida de 29 pb, idéntica a la de la cadena ligera, utilizando un par de oligonucleótido HindIII-NcoI. En el extremo 3', el único sitio NaeI de 12 pb corriente abajo del codón de parada se convirtió en un sitio HindIII utilizando engarces.

Ejemplo 1B

Construcción de Vectores

Se escindió el promotor de la \beta-actina humana a partir de pH \betaAPr-3-neo (que se corresponde con pH \betaAPr-1-neo (Gunning et al, P.N.A.S., 1987, 84, 483-35) excepto en que la señal de poliadenilación/terminación de SV40 se ha reemplazado con las respectivas señales de la \beta-actina humana) como un fragmento PvuII-HindIII de 2860 pb, en el que el sitio PvuII se convirtió subsiguientemente en un BgIII utilizando engarces. Para aislar las señales de poliadenilación y terminación de la \beta-actina humana a partir de pH \betaAPr-3-neo, un sitio SphI de 1,4 kb corriente abajo del único sitio HindIII se convirtió a un sitio BamHI utilizando engarces. El vector dhfr basal llamado p104, se construyó según se explica a continuación. El sitio SphI en la posición -128 en el promotor de SV40 en pSV2dhfr (Subramani et al, Mol. Cell. Biol., 1981, 1, 854-864) se convirtió en un sitio SalI para eliminar todos los elementos intensificadores del promotor. Después la unidad de expresión dhfr debilitada se subclonó como un fragmento SalI-BamHI en los sitios homólogos en pSVOd (Mellon et al, Cell, 1981, 27, 279-288).

Para construir pLD9, el vector p104 se digirió con BamHI, se trató con fosfatasa, y se ligó con otros tres fragmentos que constaban del promotor BgIII-HindIII de la \beta-actina, el ADNc HindIII de la cadena ligera de Campath-1H y las señales poliA/terminación de la \beta-actina HindIII-BamHI. Para construir pNH316, se digirió la construcción pdBPV-MMTneo (Law et al, Mol. Cell. Biol. 1983, 3, 2110-2115) con BamHI, se trató con fosfatasa, y se aisló el fragmento que contenía el gen de la neomicina después de separación sobre un gel de agarosa. Este se ligó a los dos fragmentos de la \beta-actina y al ADNc de la cadena pesada de Campath-1H. Las construcciones, pLD9 y pNH316 se muestran en la Figura 1.

Ejemplo 1C

Expresión de Campath-1H en células CHO

La línea celular CHO dhfr- DUK-B11 (Urlaub et al, P.N.A.S., 1980, 77, 4216-4220) se cultivó en MEM de Iscove suplementado con suero bovino fetal al 10%, y con 4 \mug/ml de hipoxantina y de timidina. 10 \mug de pLD9 y pNH316 se coprecipitaron sobre células utilizando el método del fosfato de calcio, (Gorman et al, DNA Cloning, 1985, Vol II, 143-190, Academic Press, N.Y.) y se seleccionaron para el doble fenotipo de resistencia dhfr+/neo utilizando el medio anterior excepto en que se utilizó suero dializado al 10%, se omitieron la hipoxantina/timidina, y se incluyó G418 (Gibco) a 500 \mug/ml. En algunos experimentos se incluyó MTX directamente en la primera ronda de selección para transformantes dhfr+. Se recogieron y se ensayaron varios cientos de colonias resistentes para la producción del anticuerpo Campath-1H en el medio de cultivo. El rendimiento medio fue de 0,5 \mug/ml para transformados no amplificados de la primera ronda.

Cada población de células recogida se cultivó después en la presencia de MTX 10-7M, y después de dos semanas se recogieron de nuevo las colonias resistentes y se tritiaron para la producción de Campath-1H. Había un considerable aumento en el rendimiento de hasta 80 veces (Tabla 1). Estas células se clonaron en dilución, se seleccionaron para rendimiento Campath-1H, y se aislaron dos líneas altamente productoras, llamadas A37 y 3D9 (Tabla 1). Estas se amplificaron ambas adicionalmente en la presencia de MTX 10-6M, después se clonaron en dilución y se seleccionaron según se ha descrito anteriormente. El incremento en la expresión en esta segunda y final etapa de amplificación no fue tan dramático como el observado previamente; sin embargo, cuando se realimenta en confluencia y se deja durante 4 días adicionales, las líneas celulares A39 y 3D11 fueron capaces de producir hasta 200 \mug/ml de Campath-1H.

TABLA 1 Niveles de expresión de Campath-1H utilizando amplificación por etapas

1

Se dejó que las células alcanzaran confluencia en un matraz con medio de cultivo T-175, después se realimentaron con 50 ml de medio de cultivo tisular fresco y se dejó durante 4 días adicionales. Se midió mediante ELISA el anticuerpo Campath-1H que se había acumulado en el medio durante este periodo. El recuento de las células totales al día del ensayo fue normalmente de 2,5 x 10^{7}. El rendimiento de la línea celular 3D11 refleja una productividad de 100 \mug/10^{6} células/día.

Los vectores de co-transfección pLD9 y pNH316 se emplearon además para evaluar una estrategia de amplificación alternativa a la descrita anteriormente. Las células CHO dhfr- se co-transfectaron normalmente, y dos días después se dividieron directamente en una serie de matraces que contenían G418 (para selección por neomicina) y concentraciones crecientes de MTX que variaban desde 3 X 10^{-9} hasta 10^{-7}. Pasadas dos semanas de esta selección, se contaron el número de colonias resistentes y se juntaron para cada matraz. Cuando las poblaciones celulares se habían estabilizado, se analizaron para títulos de anticuerpos Campath-1H y los resultados se muestran en la tabla 2. A medida que aumentaba el nivel de MTX, se producía un acusado descenso en el número de colonias dhfr+ supervivientes, pero proporcionalmente expresan más Campath-1H. De esta manera, en una selección directa en una única etapa a altas concentraciones de MTX, es posible aislar poblaciones celulares que producen un incremento del rendimiento de anticuerpo de hasta 60 veces comparado con las poblaciones celulares seleccionadas para niveles de dhfr basal.

TABLA 2 Niveles de expresión de Campath-1H utilizando selección directa

2

Las colonias de cada etapa de selección MTX se recogieron y se ensayaron según se describe en la leyenda de la Tabla 1.

Se repitió este procedimiento de selección después de otra co-transfección de células, y en este caso, se seleccionó toda la población en medio que contenía G418 y MTX 3 x 10^{-8} M. Esto generó un grupo mayor de colonias resistentes que fueron subsiguientemente recogidas y re-amplificadas dos veces usando concentraciones de MTX de 6 x 10^{-7} M, y después 3 x 10^{-6} M. En esta etapa, las células se clonaron en dilución y se seleccionaron para niveles de Campath-1H. Las dos líneas celulares más altamente productoras aisladas eran capaces de producir niveles de anticuerpo de hasta 100-150 \mug/ml y se designaron como líneas 4F11 y 5E10.

Las velocidades de crecimiento de estas líneas celulares, y de las líneas A39/3D11 descritas anteriormente, eran considerablemente más lentas que las células parenterales CHO dhfr- no transformadas. Normalmente esto es una característica común de estas células una vez que éstas han sido producidas por ingeniería genética para expresar grandes cantidades de un producto génico. Los rendimientos de las líneas celulares 5E10 y 4F11 mostraron ser bastante variables a lo largo del tiempo, y la última parecía tener solo un tiempo de vida limitado durando alrededor de 3 semanas antes de entrar en crisis y morir. Esta inestabilidad no era evidente en absoluto en las otras líneas celulares, aunque en general, las líneas aisladas a partir del segundo procedimiento de amplificación, incluyendo 5E10, eran normalmente más débiles en cultivo. De todas las líneas, la 3D11 tenía buen crecimiento y estabilidad con altos rendimientos de Campath-1H. Para asegurar la propagación de estas características, la línea celular 3D11 se clonó en dilución una vez más para generar la línea 3D11* y ésta produjo de manera similar rendimientos de Campath-1H de hasta 200 \mug/ml.

Ejemplo 2 Crecimiento y Producción de C1H 3D11* 44 en medio exento de suero

Las células C1H 3D11* que crecen como una monocapa en Iscoves + FBS al 10%, aminoácidos no esenciales Flow, Metotrexate 10^{-6} M y antibióticos eran confluentes al 90% aproximadamente. Estas células se retiraron del plástico con tripsina/verseno, se lavaron en medio Iscoves sin suplementos, se centrifugaron y se resuspendieron a 5 x 10^{4} /ml en medio WCM4 mostrado en la Tabla inferior + peptona al 0,25% + 10.000 polietilenglicol (PEG) al 0,1% + suero bovino fetal (FBS) al 0,5% sin metotrexate (MTX). Estos matraces de 25 cm^{2} se llenaron con 10 ml de suspensión celular + hipoxantina (H), timidina (T) o HT. Se incubaron estos matraces a 36,5ºC en un incubador de CO_{2} al 5%.

Después de seis días, se recogieron los contenidos de los matraces y se añadieron a un volumen igual de medio + MTX sin peptona o PEG, y se transfirieron a un matraz de 75 cm^{2}.

Estas células se utilizaron para sembrar una centrifugadora Techne de 500 ml, se incubaron a 36,5ºC girando a 40 rpm. Las células continuaron creciendo exentas de suero durante un periodo de unos cinco meses y aunque se vio que las células necesitaban un periodo de adaptación, la velocidad de crecimiento y la viabilidad mejoraron uniformemente. Se calculó que el tiempo necesario para duplicar la población era de 73,1 horas a las 7 semanas aproximadamente. Este descendió hasta 47,4 horas durante los 20 días subsiguientes y luego se estabilizó. La secreción de anticuerpos se mantuvo elevada a niveles en exceso de 60 \mug/ml. Se determinó que el número de copias de genes en estas células no descendió en relación a la intensidad de banda utilizando un análisis de tinción Northern.

En los fermentadores, estas células produjeron anticuerpos en exceso de 70 \mug/ml y regularmente consiguieron niveles de 100 \mug/ml o más. Esta células eran C1H 3D11* 44 donadas.

Medio WCM4 DMEM Iscoves (Iscoves N and Melcher (1978), J. Exp. Med. 1, 47, 923) modificado para excluir BSA, transferrina y lecitina

+ 5 ml/litro	L glutamina 200 mM
+ 50 mg/litro	L prolina
+ 50 mg/litro	L treonina
+ 50 mg/litro	L metionina
+ 50 mg/litro	L cisteína
+ 50 mg/litro	L tirosina
+ 25 mg/litro	ácido ascórbico
+ 0,062 mg/litro	vitamina B6
+ 1,36 mg/litro	vitamina B12
+ 0,2 mg/litro	ácido lipoíco
+ 0,088 mg/litro	linoleato de metilo
+ 1 \muM	metotrexate

(Continuación)

+ 1 mg/litro	FeSO_{4}
+ 1 mg/litro	ZnSO_{4}
+ 0,0025 mg/litro	CuSO_{4}
+ 5 mg/litro	Insulina recombinante
	(Nucellin)
+ 50.000 UI/litro	polimixina
+ 20.000 UI/litro	neomicina
+ 0,16 mg/litro	putrescina-2 HCL.

Las células C1H 3D11*44 de la etapa anterior que habían crecido exentas de suero durante 2 meses se transfirieron a un fermentador Sgi de 1 litro con paletas en ángulo de acero inoxidable girando a 70 rpm. La temperatura se mantuvo a 37ºC, dO2 al 10% y control de pH a 7-7,2. Se sembró el fermentador el día 0 con 0,22 x 10^{6} células/ml en medio WCM4 con 10.000 polietilen glicol al 10% (PEG) y peptona de soja al 25%, y se gasificó por encima con O2. Se dieron pases a las células rutinariamente utilizando medio fresco y una velocidad de división típicamente entre 1 hasta 2 y 1 hasta 4.

El día 33 el gas de superficie se reemplazó con burbujeo que se espera que produzca más daño físico a las células.

Desde el día 50 en adelante se utilizó WCM5 (ver la Tabla a continuación) junto con peptona y PEG en lugar de WCM4.

El día 53 el PEG se reemplazó con F68 plurónico al 0,1%. El crecimiento resultante y los niveles de anticuerpo conseguidos estaban en un exceso de 100 \mug/ml en los fermentadores.

Medio WCM5 DMEM Iscoves modificado para excluir BSA, transferrina y lecitina

+ 5 ml/litro	L glutamina 200 mM
+ 50 mg/litro	L prolina
+ 50 mg/litro	L treonina
+ 50 mg/litro	L metionina
+ 50 mg/litro	L cisteína
+ 50 mg/litro	L tirosina
+ 25 mg/litro	L ácido ascórbico
+ 0,062 mg/litro	Vitamina B6
+ 1,36 mg/litro	Vitamina B12
+ 2 mg/litro	citrato férrico
+ 1 mg/litro	sulfato de zinc
+ 0,0025 mg/litro	sulfato de cobre
+ 50.000 UI/litro	Polimixina
+ 20.000 UI/litro	Neomicina
+ 0,16 mg/litro	putrescina
+ 5 mg/litro	Insulina recombinante
	(Nucellin)

Todos los componentes de WCM4 y WCM5 están disponibles comercialmente.

Ejemplo 3 Purificación de Campath 1H (G Dev-95) Materiales y Métodos

El método de purificación utilizado está basado en cromatografía a través de tres columnas. Los geles utilizados fueron 7,85 ml de Proteína A Sepharose 4 Fast Flow, Pharmacia code No. 17-0974-04 (10 cm x 1 cm); 7,85 ml de intercambiador catiónico Sepharose Fast Flow, Pharmacia code No. 17-0511-01 (10 cm x 1 cm), según el fabricante, los geles de S Sepharosa y Superdex 200 son ambos estables en NaOH 1 M durante periodos de tiempo prolongados, estos geles se metieron en sus columnas (columna Pharmacia c10/20 y c16/100 respectivamente) se lavaron con NaOH 1 M y después se dejó que reposaran en esta disolución durante 24 horas para retirar la endotoxina y esterilizar los sistemas de columna.

Las soluciones para la operación y esterilización de la columna se fabricaron utilizando agua destilada libre de pirógeno y filtrada estéril hasta 0,2 \mum a través de filtros Millipore Millpack 100. Se ensayaron muestras de todas las soluciones para endotoxina por el test LAL y subsiguientemente sólo se utilizaron aquellas con valores
bajos.

Operación de columna Gel Fast Flow de proteína A Sepharosa

Se suministró el medio de cultivo tisular del Ejemplo 1 que contenía anticuerpo Campath 1H y se filtró hasta 0,2 \mum a través de un filtro estéril PALL posodyne SLK7002 NFZP en un alojamiento Sealkleen. Se retiró con agua destilada el gluconato de hibitano al 2% en etanol al 20% utilizado para esterilizar el sistema de columna de Proteína A y el sistema se equilibró con la solución salina tris tamponada a pH 7,5 (T.B.S). La columna de proteína A se cargó después con 1,75 litros de Campath 1H crudo (71,4 mg) a una velocidad de flujo de 300 cm/hora (235 ml/hora) a una temperatura de 20ºC \pm 5ºC. Se lavó el material no unido del sistema de columna con 5 volúmenes de lecho (39,25 ml) de T.B.S. a pH 7,5 a la misma velocidad de flujo. Se eluyó el gel de Proteína A a 300 cm/hora con ácido cítrico 0,1 M a pH 3,0 durante <24 horas a temperatura ambiente. Se controló el perfil de elución a A280 nm utilizando un monitor de vía única Pharmacia UV1 y se aisló la proteína del pico. El volumen de elución del pico fue de 18,9 ml y 1 ml de éste se retiró y se ensayó para Campath 1H por ELISA según se describe a
continuación.

A. gel Fast Flow de Sepharosa

Se lavó el NaOH 1 M del sistema de columna de S. Sepharosa con Hepes 20 mM a pH 7,5 hasta que los lavados de la columna tenían un pH de 7,5. Los 17,9 ml de eluído de la columna de Proteína A se cargaron en la columna a una velocidad de flujo de 300 cm/hora (235 ml/hora). Se lavó el material no unido del sistema de columna con 7 volúmenes de lecho (55 ml) de Hepes 20 mM a pH 7,5 a la misma velocidad de flujo. Se eluyó el gel de S.Sepharosa por una etapa de elución, utilizando NaCl 0,2 M en Hepes 20 mM a pH 7,5 a una velocidad de flujo de 300 cm/hora. Se recogió el pico de elución por señal utilizando un monitor UV1 a A280 nm (2 mm de longitud de paso 0,5 AUFS). La recogida del eluído se comenzó a aproximadamente el 20% de desviación y se continuó hasta que la señal había descendido hasta el 70% de desviación. El volumen de elución era de 10 ml y se muestreó 1 ml de este para ensayo para Campath 1H por ELISA según se describe a continuación.

gel Superdex 200

Se lavó el NaOH 1 M del sistema de columna Superdex con PBS a pH 7,2 hasta que los lavados de la columna tenían un pH de 7,2. Se cargaron los 9 ml remanentes del eluído de S Sepharosa en la columna Superdex con una jeringa vía un filtro GV de Millipore Millex y el filtro se lavó con 2 ml de pBS a pH 7,2. Se desarrolló la columna con PBS a 30 cm/hora (60 ml/hora). Se controlaron los picos de exclusión molecular utilizando un monitor UV1 de Pharmacia a A280 nm. Se tomaron las fracciones eluídas de los picos para separar el pico agregado del pico monómero. La fracción del pico monómero tenía un volumen de 17,6 ml.

Ensayo Inmunoabsorbente Unido a Enzima (ELISA)

Este es un Inmunoensayo de Enzima Sandwich estándar (Referencia) en el que IgG anti-humana, producida a partir de antisuero de cabra inmuno-purificado, se une a la fase sólida como una capa de captura. La detección del antígeno capturado (Campath 1H Ig) se consigue con IgG anti-humana de cabra marcada con peroxidasa. El ensayo es secuencial estando las muestras de Campath 1H diluidas en un tampón que contiene caseína y gelatina hidrolizada. Se utilizan periodos de incubación de 1 hora y 30 minutos, a temperatura de 37ºC. Se añade cromógeno 3', 3', 5, 5'-tetrametilbencidina (TBM) más sustrato peróxido de hidrógeno para revelar cualquier peroxidasa unida. Pueden determinarse las densidades ópticas a 450 nm y las concentraciones de Campath 1H leídas a partir de una curva estándar de concentraciones conocidas varían entre 3,9 ng hasta 250 ng de Campath 1H
purificado.

Ensayo de Campath 1H purificado

Se estimó el contenido de proteína del pico monómero a A280 nm utilizando un coeficiente de extinción (E^{1%} 1 cm) de 1,35 (opcionalmente 1,32) y se examinó la muestra para el contenido de agregado por columna de exclusión molecular HPLC. El material remanente se filtró estérilmente a través de un filtro GV de Millipore Millex (tamaño del poro de 0,2 \mum) y se llenó en 29 alícuotas de 0,5 ml en tubos Sarstedt estériles. La mayoría de los tubos muestra se almacenaron a 4ºC, sin embargo 6 tubos se almacenaron a -70ºC. Las muestras de almacenamiento a 4ºC se utilizaron para ensayos según se describen en los siguientes ejemplos.

Resultados y discusiones

Los resultados del ELISA Campath se muestran en la tabla que se da a continuación.

Campath 1H

3

La recuperación total a través de los tres sistemas de columna, basadas en la recuperación a través de cada columna es del 61,6%.

Contenido en endotoxina por el test LAL

Muestra	uE/ml
cruda	1,25
pico de monómero superdex	<0,625

Ejemplo 4

Se llevó a cabo una electroforesis convencional en gel de poliacrilamida SDS en un gradiente 8-18% de Pharmacia Excelgel de lecho plano. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 5 Caracterización de Campath 1H por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa

Se sometió una muestra de 50 \mul del producto del Ejemplo 3 (designado G-Dev-95) en tampón fosfato salino (PBS) a una concentración de 2,4 mg/ml a cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) bajo las siguientes condiciones:

Columna: PLRP-S 0,1 \mum (1000 \ring{A}) (tamaño del poro); 8 \mum (tamaño de partícula) 15 x 0,46 cm obtenido de Polymer Laboratories Ltd UK.

La fase móvil utilizó un sistema ácido fórmico/agua/acetonitrilo:

Componente A - ácido fórmico: agua (5:3).

B - CH_{3}CN

en el siguiente gradiente:

%	A	80	80	65	0	0	80	80
%	B	20	20	35	100	100	20	20

Tiempo (mins)	0	5	38	41	50	51	65

La columna se desarrolló a temperatura ambiente a una velocidad de flujo de 1 ml/min^{-1} y la detección de UV en un LDC Spectro Monitor D de longitud de onda variable se llevó a cabo a una longitud de onda de 280 nm con una sensibilidad de 0,1 a.u.f.s.

Resultado

Como puede verse en la Figura 3 la cromatografía de Campath 1H que utiliza el sistema anterior dio un pico agudo único. Los picos que eluyen después de 30 minutos son debidos a la fase móvil.

Ejemplo 6 Caracterización de Campath 1H reducido y carboximetilado por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RPHPLC) 6.a. Reducción y carboximetilación de Campath 1H

Campath 1H puede reducirse a las cadenas pesada y ligera que lo componen utilizando procedimientos de reducción y carboximetilación estándares, los cuales primeramente reducen los enlaces disulfuro y después les impiden que vuelvan a formarse alquilando los grupos tioles libres.

A 1 ml de Campath 1H G Dev-95 del Ejemplo 3 en tampón fosfato salino a una concentración de 2,4 mg/ml se le añadió 1 ml de cloruro de guanidinio 8 M en tampón Tris/HCl 0,5 M a pH 9,0 y 120 \mul de Ditiotreitol en el mismo tampón. La mezcla se incubó durante 2 horas a 37ºC.

Después de incubación se añadió ácido yodoacético al 9% en tampón Tris/HCl 0,5 M y se dejó la mezcla en la oscuridad durante 1 hora.

El material carboximetilado reducido resultante recibe el nombre de Campath 1H RCM.

6.b. Caracterización RP HPLC de Campath 1H RCM

Se sometieron 30 \mul del material obtenido en el ejemplo 6ª a cromatografía de líquidos de alta resolución bajo las siguientes condiciones.

Columna PLRP-S 0,1 \mum (1000 \ring{A}) (tamaño de poro); 8 \mum (tamaño de partícula) 15 x 0,46 cm de Polymer Laboratories Ltd UK.

La fase móvil utilizó un gradiente de agua, ácido fórmico y acetonitrilo tal como se describe en la siguiente tabla:

\vskip1.000000\baselineskip

A= ácido fórmico
B= agua
C = acetonitrilo
%	A	50	50	29,4	0	0	50	0
%	B	35	35	20,6	0	0	35	35
%	C	15	15	50	100	100	15	15

Tiempo (mins)	0	5	70	72	82	82,1	95

\vskip1.000000\baselineskip

La columna se desarrolló a temperatura ambiente a una velocidad de flujo de 1 ml/min y fue seguida de absorbancia UV a una longitud de onda de 280 nm a.u.f.s.

Resultado

Como puede verse en la Figura 4, el material resultante produce dos picos, que se corresponden con las cadenas pesada y ligera.

Ejemplo 7 Caracterización de Campath 1H por cromatografía de exclusión según tamaño de alta resolución para la determinación de componentes de alto peso molecular de Campath 1H

Se sometió una muestra de 50 \mul del producto del Ejemplo 3 (G-Dev-95) en tampón fosfato salino (a una concentración de 2,4 mg/ml) a cromatografía por exclusión de tamaños de alta resolución bajo las siguientes condiciones:

: Columna - gel TSK G3000 Swx1 30 cm x 0,78 cm i.d.

: Fase móvil - Na_{2}H PO_{4} 0,05 M + Na_{2} SO_{4} 0,1 M ajustado con H_{3}PO_{4} hasta pH 6,8

: Caudal - 0,75 ml/min

La columna se desarrolló durante 24 minutos a temperatura ambiente y se siguió por absorbancia UV a una longitud de onda de 280 nm.

Se analizó por el mismo método una segunda muestra de 50 \mul utilizando Campath 1H reducido según el Ejemplo 6a).

Resultados: Los resultados de la Figura 5 indican un único pico claro que indica bajos niveles de agregado. Se consiguen generalmente niveles de entre 0,5 y 2%. Los resultados de la Figura 6 muestran dos picos principales que se corresponden con las cadenas pesada y ligera en la proporción esperada. Los picos al volumen de filtración total (ca. 15-18 minutos) se deben a los reactivos.

Ensayos biológicos para Campath 1H purificado funcional Ensayo de lisis de complemento para Campath 1H

El ensayo de lisis del complemento es una medida de función de anticuerpo expresada como actividad específica, determinada por la capacidad de una preparación purificada de un anticuerpo anti-CDW52 de concentración conocida para unir un número pre-determinado de células y efectuar la lisis celular.

El ensayo se lleva a cabo sobre Campath 1H utilizando células Karpas 422 (estabilizadas a partir de la línea celular de linfoma de no-Hodgkin de células B - Dyer et al (1990) Blood, 75 704-714) que expresa el antígeno Campath sobre la superficie celular. Se cargaron 1,2 x 10^{7} células con marca radioactiva incubándolas durante 2 horas a 37ºC en un incubador de CO_{2} en la presencia de 600 \muCi de ^{51}Cr (cromato de sodio).

Se añadieron 5,3 ml de células cargadas en medio (volumen total 23,5 ml) a 12,5 ml de suero humano normal y se pipetearon 150 \mul de la mezcla en los pocillos de una placa de microtitulación.

Se mezclaron muestras de 50 \mul del eluído final de las tres purificaciones con las células y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC seguidas de 90 minutos a 37ºC. El cultivo se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y se contabilizó la radioactividad de 100 \mul de sobrenadante celular en un contador gamma. Se calculó la actividad de lisis del complemento en KiloUnidades/ml a partir de una curva estándar de una preparación de referencia (1000 Unidades/ml).

Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Se estimó la concentración de Campath 1H en las muestras de 50 \mul del eluído final utilizando muestras en PBS a pH 7,2 leídas en un espectrofotómetro a 280 nm. Los resultados se expresan en la Tabla 3 como densidad óptica en mg/ml.

A partir de estos datos se determinó la actividad específica en KiloUnidades/mg utilizando la ecuación: KU/ml/DO

TABLA 3

5

Los resultados indican que las preparaciones purificadas de Campath 1H son funcionales.

Claims

1. Un procedimiento para obtener una preparación purificada de un anticuerpo IgG anti-CD_{W} 52 preparado utilizando un sistema de expresión recombinante, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) aplicar una solución acuosa del anticuerpo a una columna de Proteína A o Proteína G para absorber el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución ácida de un pH desde 3,0 hasta 3,5;

(b) aplicar el eluído ácido a una columna de intercambio iónico de partículas cargadas para absorber el anticuerpo en la columna y después eluir el anticuerpo con una solución ácida de iones con carga contraria; y

(c) aplicar el eluído acuoso a una columna de exclusión molecular de partículas porosas para retener las moléculas no-anticuerpo en las partículas porosas y para obtener el anticuerpo deseado en fracciones seleccionadas eluídas de la columna que contienen menos del 2% de agregado de anticuerpo según se midió por cromatografía de exclusión según tamaño.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha solución acuosa de anticuerpo se ha obtenido recogiendo el anticuerpo de un medio de cultivo y sometiendo el medio recogido a filtración y/o concentración por una etapa de ultrafiltración.

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la columna de la etapa (a) se lava con solución salina tamponada con tris o fosfato a un pH alrededor de 7,0 y después se eluye el anticuerpo a un pH desde 3,0 hasta 3,5.

4. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solución acuosa del anticuerpo se aplica a una columna de Proteína A en la etapa (a).

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la columna se eluye con ácido cítrico.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la columna de intercambio iónico es una columna de intercambio catiónico en la etapa (b).

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo obtenido en la etapa (c) se somete a ultrafiltración.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo se prepara utilizando células CHO.

9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo se prepara a partir de células CHO o de mieloma utilizando el sistema de amplificación de la glutamina sintetasa.

10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

11. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo injertado con CDR.

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano.

13. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (c) se lleva a cabo para obtener el anticuerpo es un anticuerpo deseado en fracciones seleccionadas eluidas de la columna que contiene menos del 0,5% de agregado de anticuerpo medido por cromatografía de exclusión según tamaño.

14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende formular la preparación purificada con un diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que la formulación está liofilizada.