PT100988B

PT100988B - Processo para a purificacao de imunoglobulinas

Info

Publication number: PT100988B
Application number: PT100988A
Authority: PT
Inventors: Paul Ian Nicholas Ramage; Geoffrey Allen
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1990-10-17
Filing date: 1992-10-20
Publication date: 1999-08-31
Also published as: FR2668164B1; ES2112865T5; EP0504363B1; AU4521897A; GR3026588T3; IL99761A0; BE1004226A5; FI922380A0; MY136210A; GB9022547D0; KR960015399B1; BR1100358A; CH681455A5; NZ240247A; MY119030A; KR920703108A; IT1250064B; CA2069481C; ES2081742B1; GR910100425A

Description

DESCRIÇÃO presente invenção refere-se a anticorpos recombinantes à processo para a e as

uma prepauti1ização sua produOs anticorpos bi-funcionais proteicas entre os diferentes anticorpos é i uoi antigénio, por exemplo muitos agentes corpo pode encontrar, enquanto que a segunda é responsável pela ligação activa também o complementa um componente vital da na destruição de microorganismos imunização de um animal com um antigénio tem como a produção de anticorpos poli clonais ou, por outras ds diferentes anticorpos com diferentes especificidades e afinidades moláculas variável

1igação diferentes que o região constante das células e que anticorpos representam dos mamíferos nhos, A resultado p o d sí-—ss p r o d uc i r linfócito - estes tn ο π o c 1 o n a is e sã o i fiiun og 1 obul 1 nas sãs

Uma região que ê altament® responsável pela

1nfecciosos aos receptores Fc = Deste modo, os resposta imune e virus estraPara aplicações terapêuticas é vantajoso nticorpos a partir de um único clone ds anticorpos são designados por anticorpos •specíficos em relação a um determinante particular do antigénio original. Estes anticorpos monoclonais

. 'V.1 podem ser oht.idos pelo método de e Milstein (Mat urs,

Kohler

1975, Ξ56, 495-497)«

Uma molécula i solada de um anticorpo da classe IgB é constituída por duas cadeias leves e pesadas que são mantidas ligadas por meio de ligações d@ dissulfursto entre as cadeias. Cada uma das cadeias leves está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissullureto e ss duas cadeias pesadas estão ligadas uma è. outra por ligações d® di seuI vur et ο -,.

Cada uma das «cadeias pesadas possui numa das extremidades um domínio variável seguido por vários domínios constantes e variável numa cada uma das cadeias leves possui um domínio das extremidades e um domínio constante na outra extremidade» 0 domínio variável das cadeias leves está alinhado coa» o domínio variável das cadeias pesadas. Os restantes •Joiiiínius constantes das cadeias pesadas encontram-se alinhados entre si e formam o fragmento Fc, após cisão limitada da cadeia polipeptídica.

Os domínios variáveis de cada par de cadeias leves e pesadas formam locais de ligação de antigênios.. Em conjunto com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e com o domínio constante da cadeia leve aqueles domínios formam, após cisão limitada da cadeia polipeptídica, o fragmento Fab« Os domínios variáveis de cada par de cadeias pesadas e leves possuem &. mesma estrutura geral, contendo cada domínio ums estrutura de quatro regiões cujas sequências são relativaments conservadas, ligadas por três regiões determinantes complementares (RDCs)o As quatro regiões estruturais adoptam predominantemente a conformação em folha -s as RDCs formam laçadas que ligam, s em alguns casos compreendem parcialmente, a estrutura em folha )B= As RDCs são mantidas muito próximas pelas regiões estruturais e, cora as RDCs da outra domínio, contribuem para a formação do local de ligação dos antigênios.

Os anticorpos destinados a ser usados em terapia médica podem necessitar de ser administrados repetidaments, de modo que a necessidade de eliminar as imunoglobulin-ss estranhas é importante uma vez que esta administração pod^ produzir uma resposta imune e induzir nefrotoxicidade, doença

do soro e em casos graves shock anafilático, O soro integral d® animais e a albumina do soro contam outras proteínas, lípidos e hidratas de carbana? estas maléculas podem também suscitar uma resposta imune mas colocam um perigo mais importante de poder conter agentes patogénicos cqííio o agente que causa a encetai apatia espongi forme bovina (EEB) « Podem também estar presentes endotoxinas que são indesejáveis uma vez que produzem respostas pirogénicas potencialmsnte fatais.

Outros contaminantes no mel o de cultura que contém o anticorpo expresso incluem as células hospedeiras s ácidos nucleícos virais- Também podem actuar cotão imonugénios e causar uma resposta imune indesejável os agregados de anticor posA presente invenção proporcionai por conseguinte uma preparação purificada de um anticorpo recombinante que apresentas em cromatografia de exclusão por dimensãos un único pico sob condiçães não redutoras e dois picos principais sob condiçães de desnaturação e redutoras?

2) em electroforese em gel de SDS-poliacrilamidas uma banda principal usando uma amostra não reduzida e duas bandas principais usando uma amostra reduzida?

3) em HPLC da fase inversa?

um pico único e bem marcado sob condiçítes não redutoras e dois picos principais sob condições redutoras? e

4) uma actividade específica superior & 0,S quilouni dades/mg-

Por cromatografia de exclusão por dimensão, como sugere o próprio noras, separam-se as proteínas por dimensão- Em geral a separação ocorre quando as moléculas rasicrsã são excluídas à entrada da fase porosa estacionária e são transportadas directamente moléculas progressivamente através da -coluna enquanto que as mais pequenas são capazes de pene trar na íasa estacionária cada vez mais e em consequência

possuem tempos de eluição especialmente prolongados» Deste modo ê a porosidade da -Fase estacionária que determina a separação» Esta técnica analítica é especialmente boa para determinar níveis de agregação na preparação puri-ficada» A fase estacionária é um gel d® sílica de poro largo que pode ser medi-ficado com grupos dial, de preferencia um gel coso Zorbax SF430-BF250 <marca registada d® Dupond) ou gel TSK B3000 SWXL ou B4000 SWXL» A -fase móvel tem um valor de pH geral mente entre 4 @ B, d® preferencia. sntre 6 e 7,5, de modo particularmente vantajoso de cerca de pH. 6,8» Esta fase é de preferencia uma mistura de um fosfato, como hidrcgencortofosfato de dissódio, e um sulfato, como sulfato de sódio ou de potássio, s água» A molaridade d&?sta mistura ê geralmente de 25 mH a 1 H, de modo especialmente preferida de cerca de 5G mH»

A electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS FASE) dá informações sobre o número ε o tipo de proteínas presentes numa mistura, a sua abundância relativa e uma medida dos ssus pesos moleeulares. D SDS é um detergente? aniónico que reage com as proteínas antes da electroforese. A maior parte dos complexos SDS-proteínas são solúveis e migram através do gsl da electroforese em direcção ao ânodo, sob a influencia da uma carga eléctrica» A velocidade de migração está geralmente relacionada inversamente com o logaritmo do peso molecular da proteína» é conveniente efectuar as análises d® SDS num g®l com gradiente que pode ser preparado sobre uma placa horizontal ou vertical ou sobre uma vareta» ϋ gradiente é de preferencia de 10 de S a 18%» □ gel é (marca registada)»

A a 22% ou de modo de preferencia o

HrLC d® fase especialmeπte preferido gel Excel de Pharmacia invertida efectua uma separação na base da hidrofobicidade» Como cem outras técnicas d® MPLC há usna fase estacionária polimérica, dg por exemplo polisstireno/-divini1benzeno. A fase móvel é normalmente uma combinação de um tampão aquoso fraco ou um ácido diluído e um solvente orgânico miscável com a água» Para uma separação de proteínas eficaz a fase móvel é geral mente um sistema de gradiente, necessário para conseguir a separação e é de prsfe4 ré‘ncia linear,

A •fase análise de pode ser uma matriz

j. munogl obul i nas como seja o

Polymer Labs PLRP-8, geral mente de dimensão de partícula de cerca de 8 uMg a dimensão dos poros é de preferencia 3002A nu

1OOOSA. A -fase móvel é de modo um ácido, como seja o ácido -fórmico acético ou trifluoroacético, presentes numa proporção de 5:3.

Um anticorpo pode ser reduzido às suas cadeias pesadas e leves componentes por redução das ligaçães de dissulfureto sob condiç&es de desnaturação por exemplo com cloreto de guanidínio e diclorotreitol= Por alquilação subsequente dos grupas tiol livres, por exempla com iadoacetamida/ácido iodoacético, evita-se a -formação de novo das ligaçães.

constitui uma medida da pureza na específica pode ser preparação do anticorpo determinada pelo método

A actividade descrito nos exemplos. Uma preparação de acordo invenção tem de pre-fer’ê'ncia uma actividade especí-fiça superior a 0,8 Ki 1 ounidades por mg, idealmente superior a 0,9 Kilounidades por mg, de modo especialmente preferido de cerca de 1,0 Kilounxdades por mg.

Uma preparação purificada de um anticorpo de acordo com a presente invenção ideal mente é isenta substancialmente de contaminantes das células hospedeiras, como por exemplo proteínas, ácidos nucleícos e endotoxinas das células hospedeiras. A actividade específica proporciona informação acerca dos níveis das proteínas das células hospedeiras na preparação. Os níveis de enndotoxinas podem ser medidos pelo método de LAL (lisado de Limulus amoebocyte) descrito em Parenteral Qualxty Control, M.J. Alies et al. Mareei Dekker Inc., Nova Iorque.

Uma preparação de acordo com a presente invenção é também substancial mente isenta de agregados, o que pode ser determinado por cromatografia de exclusão por dimensão, é desejável que estas células sejam menos de 2%, idealmen5 te menos de 0,5%

Os anticorpos de acordo com

presente invenção podem ser preparados usando um sistema recombinante, sendo o sistema preferido um sistema de de expressão de mamífero que usa células de ovário de hamster chinês (CHO)» Estas podem ser deficientes em redutase de di-hidrofoliato (dhfr) e por connseguinte dependentes de timidina e tina para o crescimento (PMAS 77 células progenitora dhfr-CHO é anticorpo e com o gene da dhfr, transformantes de células CHO de

1980, 4216-4220)„ de de gene do o que permite uma fenótipo positivo em relação a selecção de dhfr. A selecção é feita por cultura das colónias num meio sem timidina e hipoxantina, cuja ausência evita o crescimento das células não transformadas e que as células transformadas possam a via do foliato contornando deste modo o sistema de recuperar selecção baixos do

Estes transformantes normal mente expressam níveis produto do gene em virtude da co-integração dos dois genes transfectadas. Os níveis de expressão do gene do, anticorpo podem ser aumentados por amplificação usando metotrexato (MTX). Esta substância é um inibidor directa da enzima dhfr e permite? o isolamento de colónias dificientes que amplificam o seu número de cópias do gene da dhfr de modo suficiente para a sobrevivência nestas condiçÇres. Uma vez que a dhfr e os genes dos anticorpos estão em geral ligados infimamente nos transformantes originais, há normalmente uma amplificação concomitante e por conseguinte uma expressão aumentada do gene do anticorpo pretendi do = com células CHO ou de miei orna sintetase de glutamina CGS) descrita em W087/04462. Este de uma célula com

Seleccionam-se em seguida as células que crescem em meio isento de glutamina. Estes clon.es seieccionados tidos met i onina-sulf ox i mi na (Msx).

com a amplificação concomitante do gene que codifica para o

anti corpo»

Os anticorpos são de preferencia obtidos numa forma na qual são segregados para o meio de cultura» 0 caldo de cultura pode em seguida ser filtrada e/ou concentrado por uma fase de ultrafiltração a fim de obter uma solução aquosa que é sebmetida a um procedimento de purificação que inclui a aplicação de uma solução do anticorpo as

a) uma coluna de proteína A de modo a absorver o anticorpo na coluna, e em seguida a eluição do anticorpo com uma solução ácida;

b) a aplicação do eluído acídico a uma coluna de permuta iónica de partículas carregadas de modo a absorver o anticorpo, e em seguida a eluição do anticorpo com uma solução aquosa de iães de carga contrária;

c) a aplicação do eluído aquoso a uma coluna de exclusão por dimensão de partículas porosas de modo a efectuar uma separação de acordo com a dimensão molecular e a obter o anticorpo pretendido em fracçSíes sei ecci onadas eluídas da coluna»

A proteína A é u.m ligando específico de grupo que se liga à região Fc da maioria das

IgG»

Esta proteína é sintetizada por algumas estirpes de Staphylococcus aureus s pode ser isolada a partir do sobrenadante da cultura e em seguida insolubilizada por acoplamento a pérolas de agarose ou a sílica» Um método alternativo é a utilização das bactérias inteiras de uma estirpe que possua grandes quantidades de proteínas A sobre a superfície das células bacterianas» Ambos os tipos de preparaçães de gel podem ser obtidas no comércio (Protein A - Pharmacial; Whole bactéria Calbiochem, IgG sorb)» Alan Johnstone e Robin Thorpe Immunochemistry in Practice,

Blackwell Scientific Publn. Cap. 10)» Uma alternativa à proteí na A é a proteína G (Analytical Chem» Vol» 61 (13) 1989 1317)» tipo de coluna usado de preferencia é uma coluna de Sepharose-proteína A, em especial a Protein A Sepharose Fast Flow (Marca registada). Idealmente a coluna é lavada com salina tamponizada com tris ou com fosfato de pH de cerca

de 7,0 e α anticorpo ê eluído em meio ácido com um pH de 3,0 e

3,5, de modo vantajoso a pH 3,0 usando um ácido como seja ácido cítrico por exemplo numa concentração de cerca de 0,1 M.

A cromatografia de permuta i ónica explora as interacç&es entre os grupos carregados numa fase estacionária e a amostra que se encontra na fase móvel»

A fase estacionária de uma coluna de permuta iónica pode ser um permutador catiónico carregado positivamente ou um permutador aniónico carregado negativamente. Os grupos carregados são neutralizados por contra-iães de carga oposta na fase móvel, sendo os contra-i&'es substituídos durante a cromatografia por moléculas de amostra de carga mais elevada. É preferível usar colunas com ligaçães cruzadas baseadas por exemplo em agarose, por exemplo

S-Sspharose Fast Flow (marca registada), em especial uma coluna de permutador catiónico de S.Sepharose Fast Flow (marca registada). Em alternativa pode empregar-se uma coluna com base em membranas. A coluna é normalmente lavada após aplicação do eluído de uma coluna de proteína A, com tampão HEPE5 20 mH de pH 7,5 e o anticorpo é eluído com o mesmo tampão contendo cloreto de sódio na gama de 0,2 M a 0,075 M=

A cromatografia de- exclusão por dimensão, como o nome sugere, efectua uma separação na base das proteínas. Em geral a separação ocorre quando entrada de moléculas de grande dimensão na porosa e são transportadas directamente enquanto que cada vez mais as moléculas progressivamente capazes de penetrar na fase da dimensão estaci onári a através da coluna consequência gados. For conseguinte possuem tempos de eluição parti é cularmente prolona porosidade da fase estacionária que determina o grau de separação. Ds materiais adequados possuem ligações químicas e possuem resistência à compressão por exemplo uma composição de agarose e/ou de dextrano como por exemplo Superdex (marca registada). Um meio preferido para uma coluna é o meio de exclusão Superdex de dimensão 200. O eluído da coluna de permuta iónica é de preferência aplicado a uma coluna de Superdex e é desenvolvido num tampão na gama de pH de 5 a 8, de preferência PBS de pH 7,2.

0,2 um filtra PALL posidyne SLh

7002 NFZP ou um

Ltd«

filtro PALL DSLK2

European House,

Havant para as outras duas colunas de preferênci a Millipak

100 para a coluna de permuta iónica e a coluna de exclusão por dimensão (obtenível de Millipore, The

Boulevard,

Blackmore Lane, Watford, Herts)= As colunas são de preferência desinfectadas antes da utilização com um priado, por exemplo NaDH

0,5 M durante horas para qualquer de hibitano a em etanol a

20% para a coluna de proteína A ou

NaOH 1 N para as colunas lavagem com os tampães estéreis apropriados antes da aplicação da solução proteica.·

Podem ser acrescentadas fases adicionais ao procedimento de purificação descrito anteriormsnte, Pode usarse ultrafiltração para reduzir ainda o? de ácidos nucleícos das células hospedeiras, Esta operação pode como por exemplo membranas de Viresolve/70 cu. Viresolve/IBO' ou uma membrana PLMK de celulose regenerada de limiar de corte 300 k, todas obtenível s da Millipors, The Boulevard, blackmore Lane,

Um método alternativo para reduzir a contaminaa microf1Itração usando uma membrana de Nylon sob a forma de cartuxos, por’exemplo uma membrana de Nylon 66 de 0,04 M de PALL,

Pode introduzi;—se uma fase de purificação uma lavagem da coluna de proteína A usando NaCl na gama de 1 M a um pH neutro de preferência PBS de pH 7,2= Per iii*

M em tampão gli ci na ao NaCi de preferência com uma concentração de cerca de

A tecnologia de ADN recombinante proporcio nou a capacidade de desenvolver anticorpos modificados de dois tipos básicos. No primeiro tipo, designado por anticorpos quiméricos, apenas os domínios constantes do roedor são substituídos por domínios equivalentes ds origem humana (Morrison et al „ , F.N.fl.S. 1984, 81. 6851-68555 Boulianne et al.. - Nature, 1985, 314, 268—270? e Neuberger et al., Nature. 1985, 314, 268-270). No segundo tipo os domínios constantes de murino e as regiões estruturais ds murino são integralmente substituídos por domínios e regiões equivalentes de origem humana. Este segundo tipo de anticorpos é designado por anticorpo humanizada ou enxertado por RDCs (Jones et al,, Nature, 1986, 321, 522525? e Riechmann et al. . Nature, 1988, 332. 323-327). Estes anticorpos assemelham-se mais aos anticorpos humanos quando administrados a um paciente humano e deste modo não desencadeiam uma resposta anti-anticorpo com a mesma intensidade. Também é possível usar um anticorpo humano.

De preferencia, o anticorpo é um anticorpo modificado como seja um anticorpo híbrida na qual as cadeias pesadas e leves são homólogas em relação a um anticorpo natural mas estão combinadas de modo que não ocorre naturalmente . Os anticorpo pode ser um, anticorpo quimérico que possua regiões variáveis de um anticorpo e regiões constantes de outro. Deste modo, os anticorpos quiméricos podem ser quimeras espécie/espécie ou quimeras classe/classe. Estes anticorpos quiméricas podem ter uma ou várias modificações adicionais para melhorar a f unc i o namento modificado é incluindo um ligação aos um anticorpo

Uma outra humanizado ou para modificar o forma de um anticorpo par RDCs anticorpo composta em que além das

RDCs são transferi das para a estrutura humana partes das regiões hiper variáveis. Fadem modifica?—se ácidas aminados adicionais na estrutura ou regiões constantes destes anticorpos.

□s anticorpos recombinantss purificados são úteis na terapia médica para o tratamento de numerosas afecções humanas, geralmente como imunossupresores, mais em especial por exemplo em afecções mediadas por células T incluindo a vasculite grave, a artrite reumatóide, o lupas sistémico e também as

afecções auto imunes como por exemplo a esclerose múltipla, a doença de enxerto contra hospedeiro, a psoríase, a diabetes juvenil, a doença de Sjogrens, as doenças da tiróide, a miastenia grave, as rejeições de transplantes e a asma» Estes anticorpos são também úteis no tratamento de cancros como por exemplo o linfoma não de Hodgkin e leucemias.,

A presente invenção proporciona por conseguinte a utilização de um preparado purificado de um anticorpo recombinante para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de qualquer das afecções anteriormente mencionadas. A presente invenção também proporciona um método para o tratamento de um ser humano atingido por uma das afecções referidas que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um preparado purificado de um anticorpo recombinante.

As dosagens destes anticorpos podem variar com a afecção que se pretende tratar e com o estado rnas normal mente situam-se entre 1 e cerca de 100 adulto, de preferência entre 1 e 10 mg normal mente administra dos diariamente durante um período de

Fade ser preferível um regime de dosagem em duas partes no qual seguidos de 6 a 15 mg

Também se consideram incluídas na presente invenção as composições farmacêuticas que contêm um preparado purificado ds um anticorpo recombinante. Estas composições farmacêuticas contêm de preferência para além do anticorpo um diluente ou uma substância veicular fisiologicamente aceitável em conjunto com outros agentes como por exemplo outros anticorcias veiculares adequadas salina fisiológica, salina tamponi safosfato e salina tamponizada. Em alternativa, o anticorpo pode ser por adição de uma solução tamponizada aquosa conforme descrito anteri ormente.

As vias de administração normais são a injecção ou a perfusão cular, subcutânea e tams

Figura 1.

(a) intraperitoneal.

As -Figuras apresentadas em anexo represen(b) a construção pLD9 que contém blocas integradas (cassettes) de expressão para o marcador de seiecção/amplificação de dh-Fr “mutilado e o ADNc da cadeia leve do anticorpo Campath-IH. □ pequeno sector representado com a -Flecha a tracejado é o promotor SV40 enfraquecido.? o sector maior representado a ponteado com uma -Flecha é o promotor de B-actinaj poli A refere-se respectivamente a poliadenilação original e sinais de terminação? o sector menor com ori contém origem de replicação de SV40? a construção que contém os blocos integra dos de expressão para α marcador de selecção pela neomicina e o ADNc da cadeia pesada do anticorpo Campath-1H. □ sector com uma -Flecha e MT refere-se ao promotor de metalotioneína de rato. Ds locais de restrição indicados sãos - H, HindIII? Bg, BglII? B, BamHI? Rl, EcaRl.

Figura 2.

reduzido e reduzido

Figura 3.

Fase invertida de pico.

Gel de SDS-poliacrilamida de Campath-IH não mostrando uma única banda principal.

Cromatografia líquida de alta eficiência de ampath ÍH não reduzido mostrando um único

Figura 4

Cromatografia líquida de alta eficiência de fase invertida de Campath 1H reduzido e carboximetilado apresentando dois picos resolvidos correspondentes às cadeias pesada e leve do anticorpo»

Figura 5»

	Cromatografia de	exclusão	de	al ta	eficiên-
cia de	Campath	1H não reduzido mostr<	ando um único	pi CG »
Figura	6»
		Cromatografia de	exclusão	de	alta	eficiên-

cia de Campath 1H reduzido mostrando dois picos principais»

Exemplo 1

Produção de Campath 1H a partir de Células CHD

E?ÁEj-1PLG lAs Clonagem dos ADNcs das cadeias pesadas e leves de

Campath—ÍH

Enxertaram-se original mente as regiões determinantes complementares de Campath-1B monoclonal de ratazana directamente nas estruturas das cadeias pesadas e leves do genoma humano (Winter et al» » Mature» 1988, 322., 323327)» Estas construções foram projectadas de modo a que se desse a expressão da linha de células de mieloma YQ e tiveram como resultado rendimentos de Campath-1H até 5 p.g/ml após 10 a dias de cultura (Hale et al» _a Tissue Anti geris.

1990, 35, fracções de ADNc seieccionadas por dimensão de n_r9 “ 7 ' a 1,2 Kb e

1,4 a 1,7 Kb para os ADNcs das pesadas respectivamente» Estes ADAN.cs foram usados para preparar bancos de

ADNc ligado em EcoRI em ygtlO. Todos os procedi mentos foram descritos por Huynn et al._a (DNA cloninq. Vol, Is A Praticai Approach, 1984, Blover, D (Editor), IRL Press, Oxford). Procedeu-se a buscas nos bancos usando sondas com transiacção de encaixe específicas para as regimes variáveis para isolar os clones . de ADNc de comprimento integral. Para o ADNc da cadeia leve, eliminou-se o guia 5' não traduzido até à posição -32 usando exonuclease Bal-31 e um adaptador hindIII adicionado» Para a extremidade 3' usou-se o local singular Saci 47 pb a montante do codão de paragem» Usou-se um par de oligonucleótidos sintéticos SacI-HindIII a fim de regenerar esta sequência e posicionar o local HindIII imediatamente após o codão de paragem. Para do ADNc

Ncol singular sobreposto ao codãa de início ATG a par de oligonucleótidos

Mael de 12 pb a jusante do cl codão de paragem num local HindIII usando adaptadores»

EXEMPLO IBs Construção de vectoress

Cortou-se o promotor da p—actina humana do plasmídeo pHBAPr-3-neo (que corresponde ao plasmídeo pHBAPr—1neo (Gunning et al., P» N» A» S. .., 1987, 84, 483-35) excepto em que o sinal de poliadenilação/terminação de SV40 foi substituída pelos sinais de p-actina humana respectivos) sob a forma de um fragmento PvulI-HindlII de 2860 pb, no qual o local PvuII foi subsequentemente convertido num local BglII usando adaptadores» A fim de isolar os sinais de poliadeni1 ação e de termi nação da p-actina humana do plasmídeo pHpAPi—3-neo um local Sphl 1,4 Kb a jusante do local singular

HindIII num local BamHI usando adaptadores» 0 vector de dhfr basal designa do por pl04 foi construído como se segue. Converteu-se o local Sphl na posição -128 do promotor de SV40 no plasmídeo pSV2dhfr (subramant et al.» Mol. Cell. Biol». 1981, £, 854-864) num local Sall a fim de eliminar todos os elementos de intensificapromotor» A unidade de seguida subclonada sob nos locais homólogos ção do foi em

BamHI

expressão de dhfr forma de um -Fragmento em pSVÓd (Mellon et al»

c.

enfraqueci da

SallpLD9,

A fim de construir o plasmídeo vector p!04 com BamHI, tratou-se com fosfatase e três outros fragmentos constituídos pelo promotor

da p-actina BglII-HxndIII, o ADNc da cadeia leve de Campath-1H HindIII e os sinais de poliA/terminação da jB-actina HindlIIBamHI» A fim de construir o plasmídeo pNH316, digeriu-se a construção pdBPV-MMTneo (Law et al»₃ Mol» Cell» Biol», 1983, 3, 2110-2115) com BamHI, tratou-se com fosfatase e isolou-se o fragmento que continha o gene da neomicina após separação num gel ds agarose» Ligou-se este aos dois fragmentas de JB-actina e ao ADNc da cadeia pesada de Campath-IH. As construções pLD9 e pNH31fe são apresentadas na Figura. 1»

EXEMPLO ICs Expressão de Campath-1H em células CHOs

Cultivou-se a linha de células dhfr CHO

DUK-Bll (Urlaub et al» » P » N » A » 8 »» 1980, 77, 4216-4220) em meio

HEM de Isocove suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 4

pg/ml de hipoxantxna e outro tanto de timidina» Coprecipitaramse 10 ug de pLD9 e pNH316 em células usando o método de fosfato de cálcio, (Borman et al» DNA Cloninq·, 1985, Vol » IL· 143-190» Academic Press, Nova Iorque) e seleccionou-se o fenótipo duplo de resistência a dhfr*/neo usando o meio descrito excepto em que se usou 10% de soro dialisado, omitiram-se a hipoxantina e a timidina e incluiu-se 8418 (Sibco) a 500 μς/ίηΐ» Em algumas experiências incluiu-se MTX directamente na primeira fase da selecção para transformantes dhfr*» Reuniram-se vários centos de colónias s analisaram-se para detectar a produção do anticorpo Campath-IH no meio de cultura» C rendimento médio foi de 0,5 pg/ml para os transformantes não amplificados da primeira f ase»

Cada população de células seleccionada foi em seguida cultivada na presença de MTX IO^-7 M e após duas semanas reuniram-se novamente as colónias resistentes e determinou-se a produção de Campath-IH. Houve um aumento considerável no rendimento atingindo um máximo de BO vezes (Quadro D» Estas células foram clonadas com diluição e seleccionadas em relação ao rendimento em Campath-IH tendo-se isolado duas linhas de alto grau de produção designadas A37 e 3D9 (Quadro í>. Estas foram ambas amplificadas novamente na presença de MTX ÍO⁶ M, em seguida clonadas com diluição e submetidas a nova selecção. O aumento da expressão nesta segunda e última fase de amplificação não foi tão drástico como o primeiro, no entanto, quando realimentado em confluência e deixada durante mais 4 dias, as linhas de células A39 e 3D11 foram capazes de produzir até um máximo de 200 jjg/ml de Campath-IH.

QUADRO 1

Níveis de expressão de Campath-IH usando amplificação faseada

Construção

Fase de selecção

Campath-IH acumulado (pg/ml) pLD9 + pNH316 conjunto dhfr*/neo basal0,5 conjunto amplificado com MTX 10^-7M 1B a 40 linhas de células A37 e 3D940 conjunto amplificado com MTX ÍO^_d,M 60 a 90 linha de células A39100 linha de células 3D11 150 a 200 confluência num balão de cultura de tecidos T-175 e em seguida realimentaram-se com 50 ml de meio de cultura deixaram-se sm repouso durante mais 4 dias. Mediu—se a quantidade do anticorpo Campath-IH que se tinha acumulado no meio durante este período por análise de ELISA. As contagens de células no dia da análise foram normalmente de 2,5 x IO⁷. o rendimento a partir da linha de células 3D11 reflecte uma produtividade de 100 ^tg/lO⁶ células/dia.

Empregaram-se ainda os vectores de cotransfecção pLD? e píMHSlá a fim de avaliar uma estratégia alternativa de amplificação à descrita anteriorments. Co-transfectaram-se as células dhfr CHO coma habitual mente e dois dias mais tarde distribuiram-se directamente por uma série de balões que continham, B418 (para selecção de neomicina) e concentração crescentes de MTX de 3 x IO^-9 M até 10 ⁷M. Após duas semanas desta selecção contou-se o número de colónias resistentes e reuniram-se estas para cada balão. Quando as populações celulares estabilizaram, foram analisadas para determinar os títulos de anticorpos Campath-1H, apresentando-se

MTX foi aumentado, verificou-se uma diminuição considerável no de colónias dhfr* sobreviventes, mas estas expressavam ciorialmente mais Campath-IH» Deste modo, numa selecção propordi recta de uma única fase a altas concentrações de MTX é possí vel vezes no rendimento de anticorpo em comparação com as populações celulares seleccionadas para os níveis de dhfr basais.

SUADRO 2

Níveis de expressão de Campath—1H usando selecção directa

Selecção (M de MTX)	Colónias dhfr*	Campath-IH acumulado (pg/ml)
Sem MTX	500	0,5
3 x IO⁹	40
10 ^_e	5 .	7
3 x 10^-s	5	30
10 ~⁷	—	—

Reuniram-se s analisaram-se as colónias de cada fase de selecção por MTX conforme descrito na legenda do

Quadro 1.

Este procedimento de selecção •foi repetido após uma nova co-transfseção de caso toda a população foi seleccionada num meio que contém B418 e MTX 3 x reamplificadas

ainda duas vezes usando concentrações de MTX de x IO'⁶ M„ Nesta fase as células foram, x 10“⁷ M e em seguida diluição níveis de CamAs duas linhas de células de maior produção isolada eram capazes de produzir níveis de enticorpos até um máximo de

ÍOO a 150 yg/ml e considerável mente inferiores às transformatias progenitoras.

r í st i c a normalment e c o mum projectadas para expressar de crescimento destas linhas descritas anteriormente eram das células dhfr facto constitui uma

CHO não destas células uma vez que foram génico. Verificou-se que os rendimentos das linhas de células e 4rll são muito variáveis ao longo do tempo e observou-se que tr@s dade a última tem apenas um tempo de vida limitado de cerca de semanas antes de entrar em crise e morrer. Esta instabili não se nota noutras linhas de células, se bem que em geral as linhas isoladas a partir do segundo procedimento de amplificação, incluindo a linha

5E10, sejam usual mente mais instáveis em cultura. De todas as senta simultaneamente um bom crescimento e níveis de Campath-IH elevados. A fim de assegurar a propagação destas característicélulas 3011 por diluição uma vez mais a fim d® dar origem à linha 3011« e esta produziu também máximo de 200 pg/ml

Exemplo 2

Crescimento de células C1H 3Π1ϊ·£ 44 s produção a partir destas células ea meio isento de soro

As células C1H 3D11* cultivadas em monocamada em Iscoves + ácidos aminados não essenciais a 10% em FBS Flow, metotrexato 10⁶ M e antibióticos eram aproximadamente 90% confluentes» Removeram-se estas células do plástica com tripsina/versene, lavaram-se em meio Iscoves sem suplementos centrifugado e ressuspenso a 5 x 10⁴/ml em meio WCM4 apresentado no Quadro seguinte + 0,25% de peptona + 0,1% de polipropileno-glicol (FEG) 10 000 + 0,5% de soro fetal de bovino (FBS) sem metotrexato (MTX)» Mediram-se 10 ml da suspensão celular + hipoxantina (H), timidins (T) ou HT para balães de 25² cm . Incubaram-se estes balães a 36,52C num incubador com CO a 5%»

Após seis dias, recolheram-se os conteúdos dos balães e adicionaram-se a um volume igual de meio + MTX sem peptona nem PES e tranferiram-se para um balão de 75 cm^z.

Estas células foram usadas para inocular um agitador rotativa Techne de 500 ml incubada a uma rotação de 40 rpm e a 36,520» As células continuaram o crescimento sem soro durante um período de cinco meses e, se bem que se tenha verificada que as células necessitavam de um período de adaptação, a velocidade de crescimento e a viabilidade melhoraram rapidamente» D período de duplicação da população foi calculado em 73,1 horas durante aproximadamente 7 dias? baixou para 47,4 horas nos 20 dias subsequentes e em seguida estabilizou» A secreção de anticorpo manteve-se elevada a níveis acima de 60 pg/ml» Determinou-ss que o número de cópias o gene nestas células não diminuiu de acordo com a intensidade da banda usando uma análise de mancha de Northern»

Em fermentadores, estas células produziram o anticorpo a mais de 70 ^tg/ml e regularmente atingiram níveis de 100 pg/ml ou mais» Estas células foram designadas C1H 3D1Í* 44»

Meio WCM4

DMEM Iscoves (Iscoves N e Melcher (1973), J. Exp. Med., 1, 47,

923) modificado para excluir BSA, transierrina e lecitina»

4-	5 ml/litro	de	L glutamina 200 mH
4-	50 mg/1itro	de	L prolina
I	50 mg/1itro	de	L treonina
	50 mg/1itro	de	L metionina
4-	50 mg/1itro	de	L cisteína
4*	50 mg/1 itro	de	L ti resina
4,	25 mg/1itro	de	ácido ascórbico
4	0,062 mg/1itro	de	vitamina B6
4-	1,36 mg/1itro	de	vitamina Bi2
4-	0,2 mg/1itro	de	ácido lipóico
4-	0,088 mg/1itro	de	linoleato de metilo
4.	1	metotrexato
4.	1 mg/1itro	de	FeSD*
4-	1 mg/1itro	de	ZnS0₄
4**	0,0025 mg/1itro	d®	CuSO,

insulina recombinante (Nucel1i n)

+	50 000 lu/litro	de	polimixina
+	20 000 lu/litro	de	neomi ci na
4·	0,16 mg/1itro	de	putrescina»2 HC1»

As células C1H 3011« 44 da fase anterior que tinham sido cultivadas sem soro durante mais de 2 meses foram transferidas para um fermentador SGi de 1 litro com um agitador de impulsor em ângulo de aço inoxidável girando a 70 rpm» A temperatura foi ajustada a 372C, o dO₂ a 107» e o pH entre 7 e 7,2« D fermentador foi inoculado no dia 0 com 0,22 x .1.0 célula/ml em meio WCM4 com 0,1% de pol ieti 1 eno-gl icol (PEG) 10 000 e 0,23% de peptona de soja e foi arejado na parte superior com 0» As células foram evacuadas sistematicamente usando meio fresca e uma taxa de partilha normal mente entre 1

para 2 e 1 para 4

No dia

o arejamento superior foi substi tuído por borbulhamento em profundidade, o que possa provocar mais dano físico às células.

A partir do dia 50 usou-se

Quadro seguinte) juntamente com peptoná e PES em se pensa que meio WCM5 (ver vez de WCM5.

No dia 53 o FEB foi substituído nico F68 a 0,1%. G crescimento resultante e os por pluró anticorpo alcançados foram superiores a 100 p.g/ml nos fermenta· dores.

Meio MCH5

DMEM Iscoves modificado para excluir lecitina.

BSA, transferrina e

4-	5	ml /'1 i tro	de	L glutamina 200 mM
4-	50	mg/litro	de	L prolina
4-	50	mg/litro	de	L treonina
4-	50	mg/1i tro	de	L metionina
+	50	mg/li tr o	de	L cisteína
4-	50	mg/1i tro	de	L tirosina
4-	25	mg/1itro	de	ácido L ascórbico
•Λ.	0,062 mg/litro	de	vitamina B6
+	Λ g	36 mg/litro	de	vitamina B12
4-		mg/1i tro	de	citrato férrico
+	1	mg/litro	de	sulfato de zinco
4-	0,	0025 mg/litro	de	sulfato de cobre
j.	50	000 Iu/litro	de	polimixina
4-	20	000 Iu/litro	de	neomi ci na
4-	-t-	pg/li tro	ds	etanolamina
+	0,	16 mg/litro	de	putrescina.2 HC1.
+	5	mg/1i tro	de insulina	recombinante (Nucellin)

Todos os constituintes dos meios WCM4 e

WCM5 podem ser adquiridos no comércio»

Exemplo 3

Purificação da Campath ÍH (6- Dev—95)

Materiais e Métodos □ método de purificação usado foi baseado sm cromatografia através de três colunas- Os géis usadas foram 7,85 ml de proteína A Sepharose 4 Fast Flow, Fharmacia código n£- 17-0974-04 (10 cm x í cm) p 7,85 ml de permutador iónico 5 Sepharose Fast Flow, Fharmacia código nR» 17-0511-01 (10 cm x 1 cm)e 120 ml de meio de exclusão por dimensão Superdex 200, Fharmacia código nR» 17-1046-01 (60 cm x 1,6 cm). Cada coluna foi protegida por um filtro esteri1izante Gslman Acro de 0,2 fimPreparação de equipamento e soluçães

D equipamento do sistema da coluna de proteína A foi lavado por NaOH 1 N e foi deixado nesta solução durante 24 horas a fim de remover as endotoxinas. O gel foi em seguida carregado numa coluna Fharmacia CC10/20 e desinfectado com gluconato de hibitano a 2% em etanol. a 20%. Uma vez que- de acorda com o fornecedor, as géis de S Sepharose e Superdex 200 são os dois estáveis em NaOH 1 N durante longos períodos estes géis foram carregadas nas suas colunas (uma coluna Fharmacia C10/20 e uma coluna Fharmacia C16/100 respectivamente) lavadas com NaDH 1 N e em seguida deixadas em repouso nesta solução durante 24 horas para remover as endotoxinas e desinfectar os sistemas de colunas» As soluçães para a operação das colunas s para a desinfecção foram preparadas usando água destilada isenta tis pirogénios e estéril filtrada através de filtras Millipack 100 da Millipore de 0,2 p.m» Analisaram-se amostras de todas as soluçães para detectar a presença de endotoxinas pelo ensaio de LAL e apenas se usaram em seguida as que apresentaram valores baixos»

Operação das colunas

Filtrou-se um meio de cultura de tecidos do

Exempla 1 contendo o anticorpo Campath 1H através de um filtro

PALL posidyne SLK7002 NFZP de 0,2 um para um tubo Sealkleen.

Eliminou-se a solução de gluconato de hibitano a 2% em etanol a

20¾ usada para a desinfecção do sistema

A com água sistema com a salina tamponi zada com tris a pH 7,5

CS.T = T. )

Carregou-se em segui da a coluna de

A com litros de Campath

1H não purificado (71,4 mg) caudal de

500 cm/hora C235 ml/hora) a uma temperatura de

202C +

O produto foi arrastado cio sistema de colunas com volumes de leito de

S.T.T. de pH

7,5 ao mesmo caudal de proteína A foi eluído a 300 cm/hora com pH 3,0 durante <24 horas à temperatura ambiente um monitor

UV1 e isolou-se o pico proteico. 0 volume do pico da eluição foi de 18,9 ml e removeu-se 1 ml deste e analisou-se para verificar a presença de Campath

1H por análise de ELISA conforme descrito seguidamente

Eel de S_o Sepharose Fast FIqw

Eliminou-se a NaOH 1 M do sistema de colunas de S. Sepharose por lavagem com hepes 20 mH de pH 7,5 até que o líquido de lavagem da coluna apresentá-se um pH de 7,5. Ds restantes 17,9 ml de eluído da coluna de proteína A foram carregados na coluna com um caudal de 300 cm/hora (235 ml/hora). Eliminou-se o produto não ligado por lavagem do sistema de colunas com 7 volumes de leito (55 ml) de hepes 20 mM de pH 7,5 com o mesmo caudal. Eluiu-se o gel de S. Sepharose par Lima sluição faseada usando NaCl 0,2 M em hepes 20 mM de pH 7,5 com caudal de 300 cm/hora. Reuniu-se o pico da eluiçào detectado por meio de um monitor Pharmacia UV1 a 280 nm (2 mm de percurso óptico 0,5 AUFS). Iniciou-se a recolha do eluído a aproximadamente 20% de deflecção e continuou-se até o regista se ter reduzido para 70% de deflecção. 0 volume da eluição foi de 10 ml e tomou-se uma alíquota de 1 ml deste para análise da anticorpo Campath 1H por análise de ELISA conforme se descreve seguidamente.

Sal Superdex 200

Eliminou-se a NaOH 1 do sistema de colunas de Superdex líquido de 1 avag em por lavagem com PBS de da coluna apresentá-se pH um

0>=>

restantes 9 ml ds eluido da coluna de S.Sspharose foram carregados na coluna de Superdex com uma seringa através de um filtro Millex GV da Millipore e lavou-se o filtro com 2 ml de PBS de pH 7,2. Eluiu-se a coluna com PBS de pH 7,2 a 30 cm/hora (60 ml/hora). Monitorizaram-se os picos de exclusão por dimensão usando um monitor Pharmacia UV1 a 280 nm. Recaiheram-se as fracçííes dos eluídos dos picos a fim de separar o pico do agregado da pico da monómero. D pico do monómero tinha um volume d® 17,6 ml.

Análise de Imunossorvente ligado a enzim-a (ELISA)

Usou-se uma análise imunológica enzimática de sanduíche normal na qual IgG anti-humana, feita a partir ds anti-soro de cabra imuno-purifiçado, s® encontra ligada ã fase sólida como camada de captura. A detecção do antigénio (Campath 1H Ig) capturado é efectuada com uma IgG anti-humana de cabra marcada com peroxidas®. A análise á sequencial, sendo as amostras de Campath 1H diluídas num tampão que contém caseína e gelatina hidralisada» Usam-se períodos de incubação de uma hora e 30 minutos a uma temperatura de 375C. Adiciona-se como cromogénio 3', 3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e substrato

de peróxido de hidrogénio a fim de revelar qualquer peroxidase ligada. Podem determinar-se as densidades ópticas a 450 nm e ler as concentrações cie Campath 1H a partir de uma curva padrão de concentrações conhecidas entre 3,9 ng e 250 ng e Campath 114 purificado.

Análise de Campath 1H purificado proteico do pico do monómero a 280 nm usando um coeficiente de extinção (E^1!i _lcn,·?

de 1,35 (opcionalmente de 1,32) e examinou-se uma amostra para determinar o conteúdo de agregado por HPLC numa coluna de exclusão por dimensão filtro Millex 6V da Millipore de poro 0,2 μπύ e carregou-se em aliquotas de 0,5 tubos Sarstedt estéreis. Conservou-se a maioria dos (dimensão ml em 29 amostras a 4SC mas 6 tubos foram guardadas a -702C. Enviaram-se para análise amostras das armazenadas a 4SC conforme descrito nos exemplas que se seguem.

Resultadas e discussão

Os resultados da análise ELISA são apresentadas na Quadra seguinte.

Campath 1H
Amostra Título Vol. (ml) C1H total	Pesa de C1H aplicada prox. col.	% de recuperação /coluna
par	kLISA !	do conjunto mg na conjunta
Bruta	40,8	yg/ml 1750	71,4	71,4
Eluído da
proteína A	4,2	mg/ml 18,9	79,4	75,2	111,2
Eluído da
S. Spherose	4	mg/ml 10,0	64,0	57,6	85,0
Monómero	Ο Εζ ç W	mg/ml 17,6	44,0		76,4

D rendimento global de recuperação ao longo do sistema das três colunas, com base na recuperação em cada coluna, é de 61,6%

Conteúdo ea ondotoxinas pelo ensaio de LAL

Amostra		Eu/ml
Bruta		1,25
Pico do	monómero de Superdex	<0,625
Exemplo	4
	Levou-se	a efeito	LlfRâ	electoforese em	gel
de SDS-	•poliacril amida sobre	uma placa	horizontal Exce	Igel
Pharmaci	a com um gradiente	de S a	18%.	□s resultados	são

apresentados na figura 2.

Exemplo 5

Caracterização do anticorpo Campath 1H por cromatografia líquida de alta eficiência de fase invertida»

Submeteu-se uma amostra de 50 pl do produto do Exemplo 3 (designado por G-Dev-95) em salina tamponizada por fosfato (PBS) a uma concentração de 2,4 mg/ml a cromatografia líquida de alta eficiência de fase invertida (RP-HPLC) nas condições seguintes:

Coluna: PLRP-S 10002A (dimensão do poro)? S pm (dimensão das partículas) 15 x 0,46 cm de Polymer Laboratories Ltd UK»

Para fase móvel utilizou-se um sistema ácido fórmico/água/acetonítri1 o:

Componente A - ácido fórmico? água (5:3)

B - CH_SCN» com o seguinte gradiente:

% de A	80	80	65	0	0	80	80
% de B	20	20	35	100	100	20	20
Tempo (min)	0	5	38	41	50	51	65

ambiente com

Desenvolveu-se a coluna à temperatura um caudal de 1 ml/min e detectou-se por UV num monitor LDC Spectro D de comprimento de onda variável a um comprimento de onda de 280 nm com uma sensibilidade de 0,1 a» Uaf nSn

Resultado

Conforme se pode ver na Figura 3 a cromatografia de Campath 1H usando o sistema descrito anteriormente deu um pico único pronunciado» Os picos que são eluídos após 30 minutas são derivados à fase móvel»

Exemplo &

Caracterização de Campath 1 reduzido e carboximetilado por cromatografia líquida de alta eficiência de fase invertida (RPHPLC).

6ê„ Redução e CarboximetilaçSo de Campath ÍH pesadas e redução e primeiro

Pode reduzir-se Campath 1H nas suas cadeias leves componentes utilizando procedimentos normais de de carboximetilação, por meio dos quais se reduz em lugar as ligaçÕes mação destas par alquilação ml por em salina tamponizada mg/ml adieionionou-se tampão de tris.HCl 0,5 M de pH 7¾ na mesmo tampão. Incubou-se 372C.

dos grupas ds Campath fosfata a

1H B Dev-95 do Exemplo 3 uma concentração de 2,4 cloreto de guanidínio 8 M em 9,0 e 120 pl de ditiotreitol a a mistura durante duas horas a

Após incubação adicionaram-se 120 j.tl ds

ácida iadoacético a 9% em tampão ds tris=HCl 0,5 hl e deixou-se a mistura em repousa ao abriga da luz durante uma hora. Designou-se o material reduzido e carboximeti lado resultante por Campath ÍH RCM,

6«s_D Caracterização par RP HPLC de Campath iH RCM

Submeteu-se uma amostra de 30 pl do produto do Exempla 6a a cromatografia líquida de alta eficiência de fase invertida nas condiçães seguintes:

Colunas PLRP-S 10002A (dimensão do poro): 8 pm (dimensão das partículas) 15 x 0,46 cm de Polymer Laboratories Ltd UfG

Para a fase móvel utilizou—se um gradiente de água, ácido fórmico e acetonitrilo conforme se esquematiza no quadro seguinte:

A = ácida fórmico

B = água

C = acetonitrilo

:4 de	A	50	50	29,4	0	o	50	0
% de	B		35	20,6	0	0	TC? ój·—J	•rj*
% de	C	13	15	50	100	100	15	15
Tempo	(min)	0	5	70	77	82	82,1	95

Desen vo 1 veu.-se a coluna à temperatura ambiente com um caudal de 1 ml/min^-1 e segui-se a absorvância de UV a um comprimento de onda de 280 nm a,u,f

Resultado

Conforme se pode ver na Figura 4, o produto resultante é resolvido em dois picos, correspondentes às cadeias pesadas e leves.

Exemplo 7

Caracterização de Campath

IH por cromato-

grafia de exclusão por dimensão de alta eficiência para a determinação de componentes de alto peso molecular de Campath 1H»

Submeteu-se uma amostra de 50 μ! do produto do Exemplo 3 (G-Dev-95) em salina tamponizada por fosfato (a uma concentração de 2,4 mg/ml) a cromatografia de exclusão por dimensão de alta eficiência nas condiçães seguintes.

Coluna - gel TSK 83000 SWxl 30 cm x 0,78 cm d.i.

Fase móvel - Na₂HFQ 0,05 M + Na₂S0„0,l M ajustado com H₃FO₄a pH 6,8

Caudal - 0,75 mi/min^-1

Desenvolveu-se a coluna durante vinte e quatro minutos à temperatura ambiente e segiu.-se a absorvãncia de UV a um comprimento de onda de 280 nm.

Analisou-se pelo mesmo método uma segunda amostra de 50 pl usando Campath 1H reduzido de acordo com o Ex emp 1 o 6a ) =

Resultados? Os resultados apresentados na Figura 5 mostram um pico único nítido que indica baixos níveis de agregado. Alcançam-se geral mente níveis entre 0,5 e 2,0%. Os resultados apresentados na Figura 6 mostram dois picos principais correspondentes às cadeias pesadas e leves na proporção prevista. Os picos correspondentes ao volume total de permeação (cerca de 15 a 18 minutos) são devidos aos reagentes.

Análises biológicas para Campath 1H purificado funcional

Análise por lise complementar de Campath 1H

A análise por lise complementar é uma medida da função de anticorpo expressa como actividade específica, determinada pela capacidade de um preparado purificado de um anticorpo anti-CD_w52 de concentração conhecida para se ligar a um número pré-determinado de células e para provocar a lise das células.

A análise é efectuada com Campath 1H usando

células Karpas 422 (estabelecidas a partir ds uma linha de células de 1 infama não de Hodgkin de células B - Dyer et ah (1990) Blood, 75, 704-714) que expressa um antigénia Campath sobre a superfície celular. Carregaram-se 1,2 χ 10⁷ células com uma marcação radioactiva por incubação durante duas horas a 3720 num incubador de C0₂ na presença ds 600 p.Ci de_B1Cr (cromato de scdi o)»

Adicionaram-se 5,3 ml das células carregadas num meio nutriente (volume total 23,5 ml) a 12,5 ml de soro humana normal e pipetaram-se 150 pl para os alvéolos de uma placa de microtitulação.

Misturaram-se amostras de 50 μΐ do eluído final de três fases de purificação com as células e incubaramse durante 30 minutos a 420 seguidos ds 90 minutos a 372CCsntrifugou-se a cultura a 2000 rpm durante 5 minutos s contou-se a redioactividade em 100 pl do sobrenadante celular num contador gama. Calculou-se a actividade de li se complementar em qui1o-unidades/ml a partir de uma curva padrão ds um preparado de referência (1000 unidades/ml).

Os resultados são apresentados no Quadro 3»

Estimou—se a concentração de Campath 1H nas amostras de 50 μΐ do eluído final usando amostras em PBS de pH 7,2 analisadas num espectrofotómetro a 2S0 nrn. Ds resusltados estão reunidos no Quadro 3 em densidade óptica em mg/ml.

actividade

A partir destes dad os determina-se cl específica em q u i1o-uni d ades usando a equação?

KU/ml

DO

QUADRO 3

Amostra	Lise complementar	Cone, de proteína	Actividade
	KU/ml	mq/ml	ESyfzvC. 3, T 1 Ca
			em KU
A	11,2	11,1	1,0
B	14,8	14,2	1,0
C	13,7	13,6	1,0

Os resultados indicam que os preparados purificados de Campath 1H são funcionais.

Claims

REIVINDICAÇÕES

Processo para a purificação ds um anticorpo recombinante caracterizado por se aplicar uma solução aquosa do ân*C3. CQfp w Sn

a) uma coluna de proteína A de modo a que o anticorpo seja absorvido na coluna e eluir o anticorpo com uma solução ácida.?

b) aplicar o eluído ácido a uma coluna ds permuta iónica de partículas carregadas de modo a que o anticorpo seja absorvido e em seguida eluir o anticorpo com uma solução aquosa de iães de carga contráriag

c) aplicar o eluído aquoso a uma coluna de exclusão por dimensão de partículas porosas de modo a que as moléculas que não sejam do anticorpo sejam retidas nas partículas porosas e a obter o anticorpo pretendido em fracçães seleccioriadas obtidas da coluna.

caracteri zado

3,0 a 3,5,

Processo de acordo com a reivindicação 1, por a coluna de proteína A ser eluída a um pH de cítrica dicações í₅ ou ser uma coluna de

Processa de acordo com a reivindicação 2, a coluna de proteína A ser eluída com ácido

4* proteína A Sepharose caracterizado por permuta catiónica caracterizada par permuta aniónica num meio

6ã

Processa de acordo a coluna de permuta com a i ónica com a iónica

1» sor uma coluna reivindicação ser uma coluna de

1, de com qualquer das rei vin- 8â. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado per α anticorpo ser produzido a partir de células de mieloma.

caracterizado c ar ac t er i z ad ο determinantes

Processo de acordo com a reivindicação lOã

8,

Q i rj

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo humano.

Processo para a preparação de uma formulação que contém um anticorpo recombinante purificado caracterizado por se incorporar uma preparação de anticorpo recombinante purificada obtida de acordo com qualquer das rei vindicações 1 a 7 em conjunto com um diluente ou substância veicular fisiolagicamente aceitável.

Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a formulação ser liofilizada.

- 14-ã» Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 cu 13, caracterizado por a formulação ser adequada para administração parsntsral ou subcutânea.

di cações

12 a. 14, ser utilizada para

Processo de acordo caracterizado por a com qualquer das rei vi rifo r mui aç ã o he destinar a

- láã. - dicações 12 ser utilizada c*.

4, caracterizado por a para o tratamento de com qualquer das rei vinformulação se destinar a afecções mediadas por

- 17ã. Processo ds acordo com qualquer das reivindicações 12 a 14, caracterizado por a formulação se destinar a ser utilizada para o tratamento de afecções autoimunes.

Processo de dicações 12 a 14, caracterizado ser utilizada para o tratamento acordo com qualquer das reivin— por a formulação se detsinar a de cancro.

Processo de acordo com a rei vindicação

18, caracterizado por a formulação se destinar a ser utilizada para o tratamento de 1inforna não de Hodgkin ou leucemia.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente britânico apresentado em 17 ds Outubro de 1990, sob o NS. 902 234=5=