ES2152424T5 - Complejos del mhc y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS MOLECULAS DE COMPLEJOS PRINCIPALES DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC), Y A LA UTILIZACION DE DICHOS COMPLEJOS. ESPECIALMENTE, LA INVENCION SE RELACIONA CON COMPLEJOS DE FUSION MHC, QUE CONTIENEN UNA MOLECULA DE MHC, CON UN SURCO DE UNION PEPTIDICO, Y UN PEPTIDO DE PRESENTACION UNIDO COVALENTEMENTE A LA MOLECULA DE MHC. LOS COMPLEJOS DE FUSION DE LA INVENCION, SON UTILES PARA DIVERSAS APLICACIONES, INCLUYENDO LA SELECCION IN VITRO PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE PEPTIDOS QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE CELULAS T SELECCIONADAS, INCLUYENDO PEPTIDOS QUE SON ANTAGONISTAS Y AGONISTAS PARCIALES DE RECEPTORES DE CELULAS T, METODOS DE SUPRESION DE LA RESPUESTA INMUNE DE MAMIFEROS, Y METODOS DE INDUCCION DE DICHA RESPUESTA.
Description
Complejos del MHC y usos de los mismos.
La presente solicitud es una continuación en
parte de la solicitud de EE.UU. en tramitación junto con la presente
número de serie 08/382.454, presentada el 1 de Febrero de 1995, que
es una continuación en parte de la solicitud número de serie
08/283.302, presentada el 29 de Julio de 1994, ambas aplicaciones
mencionadas incorporadas completamente aquí mediante
referencia.
La presente invención se refiere a un complejo
de fusión del MHC, un constructo de DNA, un vector, un uso y una
composición farmacéutica como los definidos en las reivindicaciones
adjuntas. Más particularmente, la invención se refiere a complejos
de fusión del MHC que contienen una molécula del MHC con una ranura
que se une a los péptidos y un péptido de presentación conectado
covalentemente a la proteína del MHC. Los complejos de fusión de la
invención son útiles para una variedad de aplicaciones incluyendo
rastreos in vivo para la identificación y el aislamiento de
péptidos que modulan la actividad de células T seleccionadas,
incluyendo péptidos que son antagonistas y agonistas parciales de
receptores de células T, métodos para suprimir una respuesta
inmunitaria de un mamífero y métodos para inducir una respuesta
inmunitaria en un mamífero.
Las respuestas de células T específicas para
antígenos están provocadas por péptidos antigénicos unidos a la
ranura o hendidura de unión de glicoproteínas del complejo principal
de histocompatibilidad (MHC) como parte del mecanismo del sistema
inmunitario para identificar y responder a antígenos extraños. Los
péptidos antigénicos unidos interactúan con receptores de células T
y de ese modo modulan una respuesta inmunitaria. Los péptidos
antigénicos se unen por medios no covalentes a "bolsas de
unión" particulares comprendidos por residuos polimórficos de la
ranura de unión de las proteínas del MHC.
Las moléculas del MHC de clase II son
glicoproteínas heterodímeras que consisten en cadenas \alpha y
\beta. Los dominios \alpha1 y \beta1 de estas moléculas se
pliegan entre sí para formar una ranura de unión a péptidos. Los
péptidos antigénicos se unen a la molécula del MHC a través de la
interacción entre aminoácidos de anclaje sobre el péptido y los
dominios \alpha1 y \beta1. La estructura cristalina del complejo
HLA-DR1 de clase II humano con un péptido de
influenzavirus indica que los extremos N- y
C-terminales del péptido unido se extienden más
allá de la ranura de unión de modo que el extremo C del péptido está
próximo al extremo N de la cadena \beta [Brown, J. H. y otros
(1993) Nature 364: 33-39; Stern, L.J. y otros (1994)
Nature 368: 215-221]. Las moléculas del MHC de
clase I tienen organizaciones de dominios diferentes que las
moléculas del MHC de clase II, pero generalmente una estructura
similar con un sitio o una ranura de unión a péptidos que es distal
a los dominios de membrana [véase, por ejemplo, Rudensky, A.Y. y
otros (1991) Nature 353:622-626]. Véanse también
las Patentes de EE.UU. 5.284.935; 5.260.422; 5.194.425; 5.130.297 y
WO 92/18150 y WO 93/10220 para los análisis de las moléculas del
MHC.
Las moléculas del MHC complejadas con péptidos
antigénicos pueden inducir la inmunosupresión selectiva mediante
varios mecanismos diferentes [véase, por ejemplo, Guery, J. y otros
(1993) Critical Reviews in Immunology 13(3/4):
195-206].
Más específicamente, se ha presentado que los
complejos de péptido-MHC sobre la superficie de
células que presentan antígenos sólo inducirán la expansión clonal
de una línea de células T específica para el péptido unido al MHC
si las células que presentan antígenos también aportan señales
co-estimulantes. Un sistema propuesto se beneficia
de este requerimiento para la activación de células T e inhibe el
desarrollo de células T mediante la interacción con el péptido
antigénico unido a la molécula del MHC en ausencia de señales
co-estimulantes. Véanse Nicolle, M. y otros, J.
Clin. Invest. (1994) 93: 1361-1369; y Sharma, S. y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:
11465-11469.
Otro sistema propuesto inhibe el desarrollo de
células T con moléculas del MHC que contienen un péptido unido que
es un antagonista o un agonista parcial de un receptor de células T
(TcR). Véase Evavold, B. y otros, Immunology Today (1993)
14(12): 602-609.
Se ha intentado la modificación de los péptidos
antigénicos unidos a receptores de células T para examinar residuos
sensibles a respuestas de células T específicas. La determinación de
tales aminoácidos "activantes" de los péptidos antigénicos
podría proporcionar una revelación de la secuencia adecuada de un
agonista parcial o un antagonista de TcR. Véase Evavold, B. y
otros, anteriormente.
También se ha especulado que podrían
desarrollarse nuevas vacunas basadas en la determinación de la
naturaleza de diversos péptidos antigénicos unidos a moléculas del
MHC. Véase Chicz, R. y otros, Immunology Today (1994) 15(4):
155-160.
Sería así deseable tener moléculas del MHC que
contuvieran un péptido antigénico para la modulación de la
actividad de un receptor de células T. También sería deseable tener
un medio para la preparación de moléculas del MHC virtualmente con
cualquier péptido deseado situado en una ranura de unión para la
interacción con un receptor de células T. Sería además deseable
tener un medio para identificar péptidos que fueran capaces de
modular la actividad de un receptor de células T.
La presente invención se refiere a un complejo
de fusión del MHC, un constructo de DNA, un vector, un uso y una
composición farmacéutica como los definidos en las reivindicaciones
adjuntas.
Los complejos de fusión del MHC pueden
comprender un péptido de presentación conectado covalentemente a la
molécula del MHC que contiene una ranura o hendidura de unión a
péptidos. Según se usa aquí, el término "péptido de
presentación" se refiere a un péptido que es capaz de modular la
actividad de un receptor de células T, para inducir la
proliferación de células T o para inhibir o inactivar el desarrollo
de células T, según se determina por los ensayos descritos
posteriormente, incluyendo el ensayo que incluye etapas secuenciales
de cultivar células T para hacer proliferar las mismas, y poner en
contacto las células T con un complejo de fusión del MHC de la
invención y a continuación evaluar si el complejo de fusión del MHC
inhibe el desarrollo adicional de las células T.
Conectar covalentemente el péptido de
presentación al péptido del MHC de acuerdo con la invención
proporciona un número de ventajas significativas. La práctica
actual requiere la purificación de moléculas del MHC que se han
cargado previamente con péptidos de células que presentan antígenos.
Los péptidos cargados están estrechamente unidos y no pueden
intercambiarse eficazmente con el péptido de interés. Pueden
producirse complejos de fusión del MHC de la invención que
contienen un solo péptido antigénico, incluyendo tal péptido de
estructura conocida. El análisis de interacciones con receptores de
células T se facilitará mediante el uso de tales moléculas del MHC.
Adicionalmente, puede presentarse una amplia variedad de péptidos
para la interacción con células T en virtud del hecho de que sólo
un pequeño número (alrededor de 4 a 6) de los aminoácidos en el
péptido de presentación es importante para unirse a una molécula
del MHC particular, esto es, una biblioteca de diferentes péptidos
limitada solamente por los residuos de anclaje del MHC puede
conectarse covalentemente a la molécula del MHC para la
presentación de células T. Además, para aplicaciones terapéuticas,
en lugar de la administración de una molécula del MHC a un sujeto,
puede administrarse un vector de expresión de DNA que codifica para
la molécula del MHC conectada al péptido de presentación, para la
expresión in vivo del complejo de fusión del MHC. Tal
sistema evita etapas de purificación costosas típicamente asociadas
con la preparación de proteínas recombinantes y evita las
complejidades de la captación y el procesamiento de antígenos
asociadas con sistemas convencionales.
La molécula del MHC de los complejos de fusión
puede ser MHC clase II. Para un complejo de fusión del MHC que
contiene una molécula del MHC de clase II, preferiblemente, el
péptido de presentación está conectado covalentemente al extremo N
de la cadena \beta de la proteína del MHC, aunque el péptido de
presentación también puede estar conectado a la cadena \alpha de
la proteína del MHC.
Los complejos de fusión del MHC pueden estar
truncados (particularmente, no incluyendo una porción de
transmembrana) o pueden ser "de longitud completa" e incluir
una porción de transmembrana y/o un dominio citoplásmico y/u otras
membranas celulares. Según se analiza posteriormente, para algunos
sistemas, puede emplearse adecuadamente un complejo de fusión del
MHC que no incluye una porción de transmembrana, mientras que para
otras aplicaciones puede emplearse un complejo de fusión del MHC
que contiene una porción de transmembrana y/o una porción
citoplásmica y/o tales otros dominios.
Los complejos de fusión del MHC también pueden
incluir preferiblemente una secuencia conectora flexible interpuesta
entre la proteína del MHC y el péptido de presentación. La
secuencia conectora debe permitir la colocación eficaz del péptido
de presentación con respecto a la ranura de unión de la molécula del
MHC de modo que el péptido de presentación pueda modular la
actividad de un receptor de células T, para inducir la proliferación
de células T o para inhibir o inactivar el desarrollo de células T,
según se determina por los ensayos descritos posteriormente,
incluyendo los ensayos in vitro que incluyen etapas
secuenciales de cultivar células T para hacer proliferar las
mismas, y poner en contacto las células T con un complejo de fusión
del MHC de la invención y a continuación evaluar si el complejo de
fusión del MHC inhibe el desarrollo adicional de las células T.
En un aspecto preferido de la invención, un
complejo de fusión del MHC sin una porción de transmembrana (es
decir, un "complejo truncado") está conectado covalentemente a
una inmunoglobulina tal como IgG, IgM o IgA o un fragmento de la
misma (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')_{2}). Adecuadamente,
el complejo de fusión del MHC está conectado a regiones constantes
de la inmunoglobulina. Tal conexión a una inmunoglobulina puede
proporcionar un número de ventajas sobre la expresión del complejo
de fusión del MHC incluyendo una estabilidad incrementada, fácil
purificación por afinidad y flexibilidad en el número de dominios de
unión presentados, por ejemplo, desde un dominio en fragmentos
similares a Fab hasta dominios multivalentes en moléculas de IgG o
similares a
IgM.
IgM.
Un complejo de fusión del MHC puede ser una
proteína de fusión monocatenaria, es decir, un complejo del MHC de
clase II, donde las subunidades de las cadenas \alpha y \beta
están conectadas como una proteína de fusión monocatenaria. El
péptido de presentación está preferiblemente conectado a la cadena
\beta de la proteína de fusión. Tal complejo monocatenario
conectado puede proporcionar un número de ventajas. En particular,
al reducir el complejo a una sola molécula, pueden mejorarse los
rendimientos y la estabilidad de las moléculas. Eso puede ser
especialmente importante para moléculas solubles que no pueden
producirse eficazmente en forma activa. Los complejos de fusión del
MHC monocatenarios de la invención son útiles para los métodos
descritos aquí, incluyendo la identificación in vitro de
péptidos reconocidos por un receptor de células T, métodos para
suprimir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, el tratamiento de
individuos con trastornos inmunitarios tales como trastornos
autoinmunitarios o alergias) y métodos para inducir una respuesta
inmunitaria deseada, y métodos de diagnóstico tales como tipaje del
HLA y obtención de imágenes de diagnóstico in vivo. También
se prefiere la administración directa de una construcción de DNA que
codifica para una molécula (complejo) de fusión del MHC
monocatenaria.
La invención también describe métodos para la
identificación in vitro de péptidos reconocidos por un
receptor de células T, incluyendo péptidos que pueden inducir el
desarrollo de células T así como péptidos que pueden antagonizar
receptores de células T, es decir antagonistas o agonistas parciales
de receptores de células T (TcR).
Además, se describen métodos para suprimir una
respuesta inmunitaria de un mamífero, particularmente un ser
humano, que comprenden administrar al mamífero una cantidad eficaz
de un complejo de fusión del MHC de la invención. Esos métodos
incluyen el tratamiento de un mamífero que sufre o es susceptible a
un trastorno autoinmunitario tal como esclerosis múltiple, diabetes
mellitus insulinodependiente o artritis reumatoide, o,
alternativamente, un mamífero que es susceptible a una respuesta o
respuestas inmunitarias no deseadas, tales como un sujeto con
alergias crónicas o un paciente que sufre cirugía de trasplante tal
como cirugía de trasplante de órganos o piel.
Una respuesta inmunitaria puede suprimirse de
acuerdo con la invención mediante una o una combinación de
estrategias alternativas. Así, un método de tratamiento para la
supresión de una respuesta inmunitaria induciendo anergia o
apoptosis de células T específicas y proporciona la administración
de una cantidad eficaz de uno o más complejos de fusión del MHC
puede estar en ausencia sustancial de señal o señales
co-estimulantes. Típicamente, se emplea un complejo
de fusión del MHC truncado, es decir un complejo de fusión del MHC
soluble que no contiene dominios de transmembrana y citoplásmico de
una molécula del MHC de longitud completa o intacta. Otro método
para la supresión de una respuesta inmunitaria proporciona la
administración de una cantidad eficaz de uno o más complejos de
fusión del MHC de la invención que contienen cada uno un péptido de
presentación conectado covalentemente que es un antagonista o un
agonista parcial de células T.
El complejo de fusión del MHC que contiene el
péptido de presentación que es un antagonista o un agonista parcial
de células T puede administrarse como un complejo de fusión del MHC
soluble que carece de señales co-estimulantes.
Alternativamente, la administración puede tomar la forma de una
cantidad eficaz de una secuencia de DNA que comprende un vector que
codifica para un complejo de fusión del MHC "de longitud
completa", es decir, un complejo que contiene proteínas del MHC
de longitud completa incluyendo la porción de transmembrana y un
péptido de presentación con actividad antagonista o agonista parcial
conectado covalentemente a la molécula del MHC.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un
mamífero, que, en general, comprenden la administración de una
cantidad eficaz de una secuencia de DNA que comprende un vector que
codifica para un complejo de fusión del MHC "de longitud
completa" de la invención, es decir un complejo que contiene
proteínas del MHC de longitud completa incluyendo la porción de
transmembrana y un péptido de presentación conectado covalentemente
a la molécula del MHC. Preferiblemente, se administra a un mamífero
DNA que codifica para un complejo de fusión del MHC de longitud
completa de la invención, junto con una secuencia de DNA que
codifica para un factor coestimulante de células T tal como un gen
que codifica para B7 o B7-2. Según se usa aquí, el
término "factor co-estimulante de células T" se
refiere a un péptido que es capaz de proporcionar una señal
co-estimulante para activar de ese modo la
proliferación de células T en presencia de uno o más complejos de
fusión del MHC de la invención. Tal activación de la proliferación
de células T puede determinarse mediante los ensayos descritos
aquí, incluyendo el ensayo que se ejemplifica en el Ejemplo 9 y se
analiza posteriormente. También se proporcionan métodos de
diagnóstico incluyendo tipaje del HLA y obtención de imágenes de
diagnóstico in vivo usando complejos de fusión del MHC de la
invención, incluyendo complejos de fusión del MHC que contienen un
marcador radiactivo (por ejemplo, ^{125}I, ^{32}P o ^{99}Tc)
u otra etiqueta detectable.
Otros aspectos de la invención se analizan
posteriormente.
Las figuras 1A y 1B representan cada una un
complejo de fusión del MHC de la invención que incluye una secuencia
conectora. La figura 1C muestra esquemáticamente un complejo de
fusión del MHC de la invención conectado o fusionado a una
inmunoglobulina.
La figura 2 muestra el esquema para aislar el
fragmento génico \alpha1-\alpha2 de
I-A^{d} y la clonación del mismo. La figura 8
especifica los cebadores oligonucleotídicos usados en el
procedimiento representado.
La figura 3 muestra el esquema para aislar el
fragmento génico \beta1-\beta2 de
I-A^{d}, enlazar la secuencia conectora e
insertar los oligonucleótidos que codifican los péptidos
antigénicos. La figura 8 especifica los cebadores
oligonucleotídicos usados en el procedimiento representado.
La figura 4 muestra el esquema de clonación para
\alpha1-\alpha2 de HLA-DR1
humano. La figura 8 especifica los cebadores oligonucleotídicos
usados en el procedimiento representado.
La figura 5 muestra el esquema de clonación para
la cadena \beta1-\beta2 de
HLA-DR1 humano. La figura 8 especifica los
cebadores oligonucleotídicos usados en el procedimiento
representado.
La figura 6 muestra el esquema para aislar el
fragmento génico \alpha1-\alpha2 de
I-A^{s} y la clonación del mismo. La figura 8
especifica los cebadores oligonucleotídicos usados en el
procedimiento representado.
La figura 7 muestra el esquema para aislar el
fragmento génico \beta1-\beta2 de
I-A^{s}, enlazar la secuencia conectora e
insertar los oligonucleótidos que codifican los péptidos
antigénicos. La figura 8 especifica los cebadores
oligonucleotídicos usados en el procedimiento representado.
La figura 8 (ID SEC Nº: 26-74)
muestra las secuencias de oligonucleótidos usadas para construir
complejos de fusión del MHC de la invención.
La figura 9 (que incluye las figuras
9A-9F) (ID SEC Nº: 75-98) muestra
secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de complejos de fusión
del MHC solubles de la invención.
Las figuras 10A y 10B muestran vectores de
expresión de células de mamífero usados en el Ejemplo 2 que
sigue.
Las figuras 11A y 11B muestran construcciones de
DNA de la invención que se describen en el Ejemplo 2 que sigue. En
las figuras 11A y 11B (y las figuras 15, 16A y 16B) la referencia
"PE"\cdot indica promotor y estimulador, la referencia
"LS" indica exón de la secuencia líder y la referencia
"HC" indica cadena pesada.
La figura 12 muestra el esquema para introducir
sitios de restricción en el inserto de 2,7 kb de la cadena kappa a
través de mutagénesis dirigida al sitio por PCR.
La figura 13 muestra el esquema para construir
un gen de fusión que codifica el MHC (clase II\alpha)/la región
constante de la cadena kappa en un vector de expresión de células de
mamífero.
La figura 14 (ID SEC Nº: 99-102)
muestra cebadores usados para someter a secuenciación el fragmento
de 2,7 kb mutado.
La figura 15 muestra el esquema para la
mutagénesis M13 y la clonación del gen variable \beta del MHC
II.
Las figuras 16A y 16B muestran vectores de la
invención para la expresión de proteínas quiméricas de MHC
II/Ig.
II/Ig.
La figura 17 muestra el esquema para la
construcción de un vector de expresión de complejo de fusión del MHC
de longitud completa de la invención.
Las figuras 18A y 18B (ID SEC Nº:
103-109) muestran secuencias de DNA y aminoácidos de
complejos de fusión del MHC de longitud completa de la
invención.
La figura 19 (total de 7 hojas) muestra el
esquema de clonación llevado a cabo en el Ejemplo 12 que sigue. La
figura 20 representa cebadores oligonucleotídicos usados en el
esquema de clonación representado.
La figura 20 (ID SEC Nº:
110-112) representa secuencias de cebadores
oligonucleotídicos usados para construir complejos de fusión del
MHC de la invención.
La figura 21 muestra gráficamente la actividad
funcional de los cuatro clones del Ejemplo 13 que sigue junto con
un control negativo (NSO) y un control positivo (A20), donde se
presenta el valor de la D.O. de las cuatro primeras diluciones del
sobrenadante de cultivo de DO11.10.
La figura 22 muestra gráficamente los resultados
del ensayo de proliferación de células T del Ejemplo 15 que
sigue.
La figura 23 muestra gráficamente los resultados
del ensayo de proliferación de células T del Ejemplo 16 que
sigue.
La figura 24 representa un complejo de fusión
del MHC monocatenario de la invención.
La figura 25 (total de 3 hojas) muestra el
esquema de clonación llevado a cabo en el Ejemplo 17 que sigue.
La figura 26 (ID SEC Nº:
113-120) representa secuencias de cebadores
oligonucleotídicos usados para construir complejos de fusión del
MHC de la invención.
La figura 27 (ID SEC Nº: 121) muestra las
secuencias de DNA y aminoácidos del gen monocatenario SSC1.
La figura 28 (ID SEC Nº: 122) muestra las
secuencias de DNA y aminoácidos del gen monocatenario SCT1.
La figura 29 (ID SEC Nº: 123) muestra las
secuencias de DNA y aminoácidos del gen monocatenario SCE1.
Se han descubierto ahora nuevos complejos de
fusión del MHC, y vectores de expresión que codifican tales
complejos, que comprenden una molécula del MHC conectada
covalentemente a un péptido de presentación, y métodos para el uso
de tales complejos de fusión y vectores de expresión, según se
define en las reivindicaciones adjuntas.
En general, la preparación de complejos de
fusión del MHC puede efectuarse mediante procedimientos descritos
aquí y mediante técnicas de DNA recombinante reconocidas, por
ejemplo preparación de DNA plasmídico, segmentación de DNA con
enzimas de restricción, ligación de DNA, transformación o
transfección de un huésped, cultivo del huésped y aislamiento y
purificación del complejo de fusión expresado. Tales procedimientos
son generalmente conocidos y se describen, por ejemplo, en Sambrook
y otros, Molecular Cloning (2ª ed. 1989).
Más específicamente, se obtiene DNA que codifica
para una proteína del MHC deseada a partir de una línea celular
adecuada según se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 1 que sigue.
Se conocen otras fuentes de DNA que codifican para la proteína del
MHC, por ejemplo, células linfoblastoides humanas. Una vez aislado,
el gen que codifica para la molécula del MHC puede amplificarse
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros
medios conocidos en la técnica. Cebadores de PCR adecuados para
amplificar el gen del péptido del MHC pueden añadir sitios de
restricción al producto de PCR. Por ejemplo, para la expresión de un
complejo de fusión truncado, específicamente un complejo de fusión
del MHC soluble que no contiene porciones de transmembrana o
citoplásmicas y está conectado a una inmunoglobulina tal como IgG,
el producto de PCR incluye preferiblemente sitios de corte y
empalme de IgG y secuencias líder necesarias para la expresión y la
secreción apropiadas del complejo de fusión de
MHC-inmunoglobulina. El producto de PCR también
incluye preferiblemente una secuencia que codifica para la
secuencia conectora, o un sitio de enzima de restricción para la
ligación de tal secuencia. Cebadores, condiciones de PCR y técnicas
de construcción de vectores de expresión adecuados se describen, por
ejemplo, en los ejemplos que siguen y en los dibujos.
La secuencia conectora es preferiblemente una
secuencia nucleotídica que codifica para un péptido que puede
situar eficazmente el péptido de presentación en la ranura de unión
de la molécula del MHC. Según se usa aquí, la expresión "el
péptido de presentación está situado eficazmente en la ranura de
unión de una molécula del MHC" o "complejo de fusión del MHC
capaz de modular la actividad de una célula T", u otra expresión
similar, pretende significar que el péptido de presentación
conectado a una proteína del MHC está situado de modo que el
péptido de presentación y el complejo de fusión son capaces de
modular la actividad de un receptor de células T, para inducir la
proliferación de células T o para inhibir o inactivar el desarrollo
de células T, según se determina por un ensayo descrito
posteriormente, incluyendo el ensayo que incluye etapas secuenciales
de cultivar células T para hacer proliferar las mismas, y poner en
contacto las células T con un complejo de fusión del MHC de la
invención y a continuación evaluar si el complejo de fusión del MHC
inhibe el desarrollo adicional de las células T.
Preferiblemente, la secuencia conectora
comprende de aproximadamente 7 a 20 aminoácidos, más preferiblemente
de aproximadamente 8 a 16 aminoácidos, aún más preferiblemente de
aproximadamente 8 a 12 aminoácidos. La secuencia conectora es
preferiblemente flexible a fin de no plegar el péptido de
presentación en una conformación simple no deseada. El conector,
preferiblemente, comprende predominantemente aminoácidos con cadenas
laterales pequeñas, tales como glicina, alanina y serina, para
proporcionar flexibilidad. Preferiblemente, aproximadamente 80 ó 90
por ciento o más de la secuencia conectora comprende residuos de
glicina, alanina o serina, particularmente residuos de glicina y
serina. Preferiblemente, la secuencia conectora no contiene ningún
residuo de prolina, que podría inhibir la flexibilidad. Para un
complejo de fusión del MHC que contiene una molécula del MHC clase
II, la secuencia conectora está adecuadamente conectada a la cadena
\beta de la molécula del MHC, aunque la secuencia conectora
también podría estar enlazada a la cadena \alpha de la molécula
del MHC. Para conectar covalentemente un péptido de presentación a
una molécula de la cadena \beta del MHC clase II, la
aminosecuencia del conector debe ser capaz de extenderse
aproximadamente 30 angstroms desde el residuo
N-terminal de la cadena \beta del MHC clase II
hasta el residuo C-terminal del péptido de
presentación. Véanse, por ejemplo, las figuras 1A y 1B de los
dibujos. Cuando tal cadena peptídica \beta+ se expresa junto con
la cadena \alpha, el péptido de presentación conectado debe
plegarse en la ranura de unión de \alpha1 y \beta1 dando como
resultado una molécula del MHC funcional como la representada
generalmente en la figura 1C. Una secuencia conectora adecuada es
ASGGGGSGGG (ID SEC Nº: 1) (es decir, Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
Gly Gly), preferiblemente conectada al primer aminoácido del
dominio \beta1 de la proteína del MHC clase II. Podrían usarse
diferentes secuencias conectoras incluyendo cualquiera de un número
de diseños de conector flexibles que se han usado
satisfactoriamente para empalmar entre sí regiones variables de
anticuerpos, véase Whitlow, M. y otros (1991) Methods: A Companion
to Methods in Enzymology 2:97-105. Las secuencias
conectoras adecuadas pueden identificarse fácilmente empíricamente.
Por ejemplo, una construcción de DNA que codifica para un complejo
de fusión del MHC que incluye una secuencia conectora puede
clonarse y expresarse, y el complejo de fusión probarse para
determinar si el complejo es capaz de modular la actividad de un
receptor de células T, para inducir la proliferación de células T o
para inhibir o inactivar el desarrollo de células T, según se
determina mediante el ensayo descrito posteriormente. El tamaño y
las secuencias adecuados de las secuencias conectoras también pueden
determinarse mediante técnicas de modelado computarizadas basadas
en el tamaño y la conformación predichos de la molécula del
MHC.
Preferiblemente, los sitios de restricción se
tratan mediante ingeniería en la construcción de DNA que comprende
las secuencias nucleotídicas fusionadas que codifican para la
secuencia conectora y la proteína del MHC, de modo que
esencialmente cualquier secuencia nucleotídica que codifique para un
péptido de presentación de interés (por ejemplo, un péptido de
presentación antigénico o antagonista) puede enlazarse a la
construcción. Por ejemplo, en un sistema preferido ejemplificado en
los ejemplos que siguen, se incluyen sitios de restricción
adecuados (por ejemplo sitios AflII y NheI) entre el
extremo de la secuencia líder y el principio del conector para
facilitar la inserción de una amplia variedad de péptidos de
presentación en el gen de la cadena \beta de la molécula del MHC.
Véase, por ejemplo, la figura 3 de los dibujos. Las secuencias
nucleotídicas y de aminoácidos de secuencias líder específicamente
preferidas se representan en las figuras 18A y 18B de los
dibujos.
El componente del péptido de presentación de un
complejo de fusión del MHC debe ser capaz de modular la actividad
de una célula T según se describe anteriormente. Para un complejo de
fusión del MHC que contiene una molécula del MHC de clase II,
preferiblemente, el péptido de presentación tiene de aproximadamente
4 a 35 aminoácidos, más preferiblemente de aproximadamente 6 a
aproximadamente 30 aminoácidos, aún más preferiblemente de
aproximadamente 8 a aproximadamente 25 aminoácidos. Las moléculas
del MHC de clase I y clase II muestran una unión preferente hacia
diferentes secuencias peptídicas. Recientemente, se han identificado
residuos de anclaje que definen motivos peptídicos específicos para
el alelo del MHC en péptidos que se unen a la clase II [Sinigaglia,
F. y otros (1994) Curr. Opin. in Immun. 6:52-56].
Por ejemplo, en moléculas de HLA-DR1 de clase II
humanas, se encuentra habitualmente un aminoácido aromático (por
ejemplo, Tyr, Phe o Trp) cerca del extremo amino del péptido
(posición 1), un residuo hidrófobo (por ejemplo, Met o Leu) en la
posición 4 y un aminoácido pequeño (por ejemplo, Ala o Gly) en la
posición 6. Otras moléculas del MHC tienen motivos diferentes, por
ejemplo, para las moléculas de la clase II, véase Sinigaglia,
anteriormente; para las moléculas de clase I, véase Parker, K.C. y
otros (1994) J. Immunol. 152:163-175. Péptidos de
presentación preferidos incluyen el motivo de unión a MHC deseado
para facilitar la unión óptima al MHC. Así, por ejemplo, en
moléculas del MHC HLA-DR1 de clase II humanas, un
aminoácido aromático (por ejemplo, Tyr, Phe o Trp) se sitúa
preferiblemente cerca del extremo amino del péptido de presentación
(posición 1), un residuo hidrófobo (por ejemplo, Met o Leu) está en
la posición 4 del péptido de presentación y un aminoácido pequeño
(por ejemplo, Ala o Gly) está en la posición 6 del péptido de
presentación. Para los métodos de inmunosupresión de la invención
(por ejemplo, para tratar enfermedades autoinmunes o alergias, o
suprimir de otra manera una respuesta de células T no deseada), el
péptido de presentación preferiblemente puede ser el mismo que u
homólogo a (por ejemplo, al menos más de aproximadamente 80 ó 90%
de secuencia compartida) un péptido que se sabe o se sospecha que es
responsable de activar células T en el trastorno elegido. Así, por
ejemplo, el péptido MPB 80-105 es reconocido por más
de 30% de células T específicas de MPB aisladas de pacientes con
esclerosis múltiple [véase E. Meinl y otros, J. Clin. Invest. 92:
2533-2643 (1993)] y debe ser adecuado como un
péptido de presentación en complejos de fusión del MHC usados para
aplicaciones de inmunosupresión según se describe aquí.
Adicionalmente, la actividad de un péptido de presentación
particular, es decir antigénica o antagonista o agonista parcial,
puede determinarse fácilmente empíricamente mediante los métodos
descritos aquí, incluyendo los ensayos in vivo
descritos
posteriormente.
posteriormente.
Para elaborar el vector que codifica para un
complejo de fusión del MHC, la secuencia que codifica para la
molécula del MHC se conecta a una secuencia que codifica para el
péptido de presentación mediante el uso de ligasas adecuadas. El
DNA que codifica para el péptido de presentación puede obtenerse
aislando DNA de fuentes naturales o mediante métodos sintéticos
conocidos, por ejemplo el método del triéster de fosfato. Véase, por
ejemplo, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M.J. Gait, ed.,
1984). Los oligonucleótidos sintéticos también pueden prepararse
usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados disponibles
comercialmente. Una secuencia nucleotídica que codifica para una
molécula del MHC puede empalmarse directamente a una secuencia de
DNA que codifica para el péptido de presentación o, más típicamente,
una secuencia de DNA que codifica para la secuencia conectora,
según se describe anteriormente, puede interponerse entre la
secuencia que codifica para la molécula del MHC y la secuencia que
codifica para el péptido de presentación y empalmarse usando ligasas
adecuadas.
También pueden incluirse otras secuencias
nucleotídicas en la construcción génica. Por ejemplo, una secuencia
promotora, que controla la expresión de la secuencia que codifica
para el péptido del MHC fusionado al péptido de presentación, o una
secuencia líder, que dirige el complejo de fusión del MHC a la
superficie celular o al medio de cultivo, pueden incluirse en la
construcción o estar presentes en el vector de expresión en el que
se inserta la construcción. Se prefiere particularmente una
inmunoglobulina o un promotor de CMV se prefiere particularmente.
Véanse los ejemplos que siguen. También puede incluirse una
secuencia de iniciación de la traducción fuerte en la construcción
para mejorar la eficacia de la iniciación de la traducción. Una
secuencia de iniciación preferida es la secuencia de consenso Kozak
(CCACCATG) (ID SEC Nº: 2). Véanse también las figuras 18A y 18B de
los
dibujos.
dibujos.
Preferiblemente, una secuencia líder incluida en
una construcción de DNA de la invención contiene un sitio de
restricción situado eficazmente de modo que un oligonucleótido que
codifica un péptido de presentación de interés puede enlazarse a la
molécula del MHC. Adecuadamente, el sitio de restricción puede
incorporarse en el extremo 3 de la secuencia líder, a veces
denominada aquí una secuencia de juntura, por ejemplo de
aproximadamente 2 a 10 codones de longitud, que está situada antes
de la región de codificación para el péptido de presentación. Un
sitio de restricción particularmente preferido es el sitio
AflII, aunque también pueden incorporarse otros sitios de
segmentación antes de la región de codificación del péptido de
presentación. Según se analiza anteriormente, el uso de tal sitio
de restricción en combinación con un segundo sitio de restricción,
típicamente situado al principio de la secuencia que codifica para
el conector, permite la inserción rápida y directa de secuencias
que codifican para una amplia variedad de péptidos de presentación
en la construcción de DNA para el complejo de fusión del MHC. Las
secuencias líder preferidas contienen un sitio de iniciación de la
traducción fuerte y un sitio de protección en el extremo 3' de su
mRNA. Preferiblemente, una secuencia líder está enlazada al dominio
\beta de una molécula del MHC de clase II. Las secuencias líder
preferidas proporcionan la expresión secretora del complejo de
fusión del MHC.
Puede emplearse un número de estrategias para
expresar complejos de fusión del MHC. Por ejemplo, la construcción
de fusión génica del MHC descrita anteriormente puede incorporarse
en un vector adecuado por medios conocidos tales como mediante el
uso de enzimas de restricción para realizar cortes en el vector para
la inserción de la construcción seguida por ligación. El vector que
contiene la construcción génica se introduce a continuación en un
huésped adecuado para la expresión del péptido o complejo de fusión
del MHC. Véase, generalmente, Sambrook y otros, anteriormente. La
selección de vectores adecuados puede realizarse empíricamente
basándose en factores que se refieren al procedimiento de
clonación. Por ejemplo, el vector debe ser compatible con, y tener
el replicón apropiado para, el huésped que se está empleando.
Además, el vector debe ser capaz de alojar la secuencia de DNA que
codifica para el complejo de fusión del MHC que ha de expresarse.
Células huésped adecuadas incluyen células ecuarióticas y
procarióticas, preferiblemente aquellas células que pueden
transformarse fácilmente y exhibir rendimiento rápido en el medio
de cultivo. Células huésped específicamente preferidas incluyen
procariotas tales como E. coli, Bacillus subtillus, etc. y
eucariotas tales como células animales y cepas de levadura, por
ejemplo, S. cerevisiae. Se prefieren generalmente células de
mamífero, particularmente J558, NSO, SP2-O o CHO.
Otros huéspedes adecuados incluyen, por ejemplo, células de insecto
tales como Sf9. Se emplean condiciones de cultivo convencionales.
Véase Sambrook, anteriormente. Pueden seleccionarse a continuación
líneas celulares transformadas o transfectadas estables. Las células
que expresan un complejo de fusión del MHC de la invención pueden
determinarse mediante procedimientos conocidos. Por ejemplo, la
expresión de un complejo de fusión del MHC conectado a una
inmunoglobulina puede determinarse mediante un ELISA específico
para la inmunoglobulina conectada y/o mediante
inmunotransferencia.
inmunotransferencia.
En un procedimiento preferido para la
preparación de complejos de fusión del MHC solubles, secuencias de
DNA que codifican el péptido de presentación y dominios
\beta1-\beta2 de la molécula del MHC (clase II)
se disponen de modo que el extremo C-terminal del
péptido de presentación está enlazado a un aminoácido inicial del
dominio \beta1, preferiblemente el primer aminoácido del dominio
\beta1, mediante una secuencia conectora flexible. Tal
construcción se representa en las figuras 1A y 1B de los dibujos.
Según se analiza anteriormente, preferiblemente, los sitios de
restricción se tratan mediante ingeniería entre el extremo de la
secuencia líder y el principio del conector de modo que
esencialmente cualquier oligonucleótido que codifica un péptido de
presentación de interés (es decir, antigénico o antagonista) puede
ligarse al gen de la cadena \beta. Para la expresión soluble, los
dominios \alpha1-\alpha2 y
\beta1-\beta2 conectado al péptido se fusionan
adecuadamente a una inmunoglobulina, preferiblemente a los dominios
constantes de las cadenas kappa y pesada de la inmunoglobulina,
respectivamente, según se representa en la figura 1.
Inmunoglobulinas preferidas para tal fusión a \alpha y \beta
para la expresión soluble incluyen, por ejemplo, los dominios
constantes de la cadena ligera y los dominios
CH2-CH3 de IgG2b.
Un complejo de fusión del MHC expresado puede
aislarse y purificarse mediante métodos conocidos. Típicamente, el
medio de cultivo se centrifuga y a continuación el sobrenadante se
purifica mediante cromatografía de afinidad o inmunoafinidad, por
ejemplo cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G o un
procedimiento de inmunoafinidad que comprende el uso de anticuerpos
monoclonales que se unen al complejo de fusión expresado tal como
un MHC conectado o una región de inmunoglobulina del mismo. Por
ejemplo, los complejos de fusión del MHC que contienen secuencias
de HLA-DR1 humano pueden purificarse mediante
cromatografía de afinidad sobre una columna de anticuerpo
monoclonal L243-Sepharose mediante procedimientos
que se conocen y se describen generalmente, por ejemplo, véase
Harlow, E. y otros, Antibodies, A Laboratory Manual (1988). El
anticuerpo monoclonal L243 es específico para un epítopo
conformacional de la molécula de HLA-DR1 plegada
apropiadamente [George, J.C. y otros (1992) J. Biol. Chem.
262:16087-16094], y por lo tanto se prepararía para
purificar el complejo de fusión del MHC biológicamente activo. El
complejo de fusión del MHC también puede contener una secuencia
para ayudar a la purificación; véase, por ejemplo, el Ejemplo 17 que
sigue, que describe el uso de una etiqueta 6xHis.
Los complejos de fusión del MHC truncados de la
invención contienen una molécula del MHC que está suficientemente
truncada para que el complejo de fusión del MHC pueda secretarse en
un medio de cultivo (por ejemplo, condiciones fisiológicas; en
ausencia sustancial o completa de detergente o similares) después de
la expresión. Así, un complejo de fusión del MHC truncado no
incluirá regiones ricas en residuos hidrófobos, típicamente los
dominios de transmembrana y citoplásmico de la molécula del MHC,
aunque al menos porciones de esos dominios pueden estar presentes
adecuadamente con tal de que la molécula del MHC pueda secretarse
como se analiza. Así, por ejemplo, para una molécula del MHC DR1
truncada preferida de la invención, preferiblemente de
aproximadamente los residuos 199 a 237 de la cadena \beta y de
aproximadamente los residuos 193 a 230 de la cadena \alpha de la
molécula del MHC no se incluyen en el complejo de fusión del MHC
truncado. Véanse los ejemplos que siguen. Además de las secuencias
descritas aquí, las secuencias de los dominios de moléculas del MHC
clase I y clase II se han descrito previamente (véanse, por
ejemplo, las publicaciones mencionadas anteriormente). Los complejos
de fusión del MHC truncados de la invención, por supuesto, también
pueden identificarse empíricamente, es decir examinando si el
complejo del MHC se secreta en medio de cultivo después de la
expresión como se analiza. Los complejos de fusión del MHC
truncados pueden prepararse mediante varios medios, por ejemplo la
expresión de una molécula del MHC soluble o la segmentación
enzimática (por ejemplo, papaína) de al menos porciones de dominios
de transmembrana y/o citoplásmico de un complejo de fusión del MHC
de longitud completa.
Las moléculas del MHC de longitud completa
incluyen una porción de transmembrana y/o un dominio citoplásmico
y/u otras membranas celulares o porciones sustanciales de las mismas
(por ejemplo, más de aproximadamente 80 ó 90 por ciento de tales
secuencias). Para una molécula del MHC clase II de longitud completa
de la invención, generalmente tanto las cadenas \alpha como
\beta están conectadas a dominios de transmembrana y
citoplásmicos, aunque sólo una de las cadenas \alpha y \beta
puede estar conectada a dominios de transmembrana y citoplásmico,
particularmente en el caso de moléculas del MHC monocatenarias de la
invención. Según se analiza anteriormente, las moléculas del MHC de
longitud completa pueden anclarse a membranas celulares a través de
dominios hidrófobos que se extienden a través de la membrana o
alternativamente a través de la unión
post-traslacional de otros dominios de anclaje
tales como una forma glicosilada conectada covalentemente de
fosfatidilinositol.
Según se analiza anteriormente, los complejos de
fusión del MHC monocatenarios son complejos de fusión que consisten
en un solo polipéptido en vez de un agregado de múltiples cadenas,
tal como el complejo de clase II heterotrímera natural/péptido en
el que las cadenas \alpha y \beta y un péptido están asociados a
través de interacciones no covalentes. En el caso de un complejo
del MHC clase II monocatenario, las subunidades de la cadena
\alpha y \beta están conectadas como una proteína de fusión
monocatenaria con el péptido de presentación preferiblemente
conectado a la cadena \beta de la proteína de fusión de cadenas.
Tal molécula del MHC monocatenaria preferida se representa en la
figura 24. Preferiblemente, se usa una secuencia conectora para
conectar las cadenas \alpha y \beta. Tal secuencia conectora
usada para conectar dominios de una molécula del MHC se denomina a
veces aquí una "secuencia conectora de cadenas sencillas" y se
distingue de ese modo de la secuencia conectora tratada
anteriormente que está interpuesta entre y conecta covalentemente
un péptido de presentación y una molécula del MHC.
Preferiblemente, un complejo del MHC clase II
monocatenario de la invención está conectado entre el extremo
carboxilo del dominio \beta2 y el extremo amino del dominio
\alpha1, aunque múltiples dominios de un complejo del MHC de la
invención pueden estar conectados a través de otras posiciones.
La secuencia conectora de cadenas sencillas debe
permitir que la molécula del MHC conectada se pliegue hasta una
forma activa, es decir, una forma en la que la molécula del MHC
pueda modular la actividad de una célula T. Tales secuencias
conectoras de cadenas sencillas eficaces pueden determinarse
fácilmente empíricamente. Así, por ejemplo, una construcción de DNA
que codifica para una molécula del MHC monocatenaria de la
invención, donde las cadenas \alpha y \beta están conectadas
por una secuencia conectora, puede clonarse y expresarse, y la
molécula del MHC monocatenaria probarse para determinar si el
complejo es capaz de modular la actividad de un receptor de células
T, para inducir la proliferación de células T o para inhibir el
desarrollo de células T, según se determina por los ensayos
descritos posteriormente.
Tanto la longitud como la composición de la
secuencia conectora de cadenas sencillas pueden variar en general.
Por ejemplo, la longitud de una secuencia conectora de cadenas
sencillas adecuada puede variar con las posiciones en las que la
secuencia conectora está conectada a cadenas polipeptídicas del
complejo del MHC; en otras palabras, la longitud de la secuencia
conectora puede variar con la geometría del "espacio" entre
polipéptidos que salva la secuencia conectora.
La secuencia conectora de cadenas sencillas
preferiblemente también debe ser flexible para permitir el pliegue
de la molécula monocatenaria hasta una forma activa. La secuencia
conectora comprende así predominantemente de forma preferible
aminoácidos con cadenas laterales pequeñas, tales como glicina,
alanina y serina, para proporcionar flexibilidad. Preferiblemente,
aproximadamente 80 ó 90 por ciento o más de la secuencia conectora
comprende residuos de glicina, alanina o serina, particularmente
residuos de glicina y serina. Preferiblemente, esta secuencia
conectora entre las cadenas \alpha y \beta no contiene ningún
residuo de prolina, que podría inhibir la flexibilidad.
Preferiblemente, una secuencia conectora situada entre el extremo
carboxilo de un dominio \beta2 y el extremo amino del dominio
\alpha1 comprenderá aproximadamente de 15 a 40 aminoácidos, más
preferiblemente aproximadamente de 15 a 30 aminoácidos. Una
secuencia conectora particularmente preferida se describe en el
Ejemplo 17 que sigue. El tamaño y la secuencia adecuados de las
secuencias conectoras de cadenas sencillas también pueden
determinarse mediante técnicas computarizadas convencionales; véase
el Ejemplo 17 que sigue.
Los complejos del MHC monocatenarios pueden
prepararse según se analiza anteriormente así como en los ejemplos
que siguen, incluyendo los Ejemplos 17-19. Por
ejemplo, DNA que codifica una proteína del MHC deseada puede
obtenerse a partir de una línea celular adecuada, y el gen aislado
puede amplificarse mediante PCR u otros medios. En el caso de una
molécula de clase II del MHC de la invención, un fragmento génico
\alpha1-\alpha2 puede clonarse en un vector,
seguido por la clonación de un fragmento génico que codifica para
los dominios \beta1-\beta2 con una secuencia
conectora de cadenas sencillas interpuesta. El vector simple se
expresa a continuación en un huésped adecuado y la molécula
monocatenaria se recoge y se purifica si se desea. Véanse los
ejemplos que siguen, incluyendo los Ejemplos 17-19.
Véase también la Patente de EE.UU. 5.260.203 de Ladner y otros, que
analiza la preparación de anticuerpos monocatenarios, métodos que
pueden emplearse generalmente para los complejos de fusión del MHC
monocatenarios de la invención.
En un método de preparación preferido, se
obtienen regiones de codificación de las cadenas \alpha y \beta
de las moléculas del MHC clase II, particularmente aislando las
regiones de codificación mediante PCR de una línea de células B u
otra fuente de moléculas del MHC. Una secuencia que codifica una
molécula de fusión del MHC de fusión de cadenas sencillas
\beta-\alpha de la invención puede construirse
reemplazando secuencias que codifican el dominio que abarca la
transmembrana del gen de la cadena \beta por una secuencia
conectora monocatenaria como la analizada anteriormente que empalma
el gen de la cadena \beta a la cadena \alpha madura
(particularmente en el primer codón del gen de la cadena \beta).
El gen de la cadena \alpha puede contener adecuadamente su región
de transmembrana para la expresión unida a la membrana del complejo
de fusión monocatenario, o el gen de la cadena \alpha puede estar
truncado en el extremo de la región extracelular para la expresión
soluble del complejo de fusión del MHC monocatenario. Un sitio de
restricción y un conector adecuados para el péptido de presentación
se incluyen preferiblemente entre el líder de la cadena \beta y
el primer codón de la cadena \beta. La región de codificación
esencialmente de cualquier péptido de presentación puede
introducirse a continuación como un oligonucleótido en el sitio de
restricción creado. La construcción resultante se coloca a
continuación adecuadamente bajo el control de promotores de mamífero
o bacteria, incluyendo los promotores específicos descritos allí.
Una de tales construcciones monocatenarias del MHC clase II de la
invención contiene secuencias nucleotídicas conectadas que codifican
en secuencia: líder de la cadena \beta/péptido de
presentación/secuencia conectora/región extracelular
\beta1-\beta2/secuencia conectora
monocatenaria/región extracelular
\alpha1-\alpha2. Las construcciones de DNA
monocatenarias del MHC de la invención se introducen adecuadamente
en sistemas de expresión de bacterias, de células de insecto
baculoviral y de mamífero, incluyendo los sistemas de expresión
específicos descritos aquí, a continuación se expresan y se
purifican si se desea.
La molécula del MHC monocatenaria puede ser de
longitud completa, es decir la molécula del MHC está asociada con
dominios celulares y contiene, por ejemplo, cantidades completas o
sustanciales (por ejemplo, mayores de 80% de la secuencia) de
porciones de transmembrana y/o citoplásmicas de una cadena \alpha
o \beta, o está truncada según se analiza anteriormente para la
expresión soluble. Tales moléculas del MHC monocatenarias truncadas
y de longitud completa puede producirse según se describe
anteriormente y en los ejemplos para complejos del MHC
polipeptídicos múltiples de la invención. Para una molécula del MHC
clase II, una molécula de longitud completa puede tener sólo una de
las cadenas \alpha y \beta conectada a dominios de transmembrana
y citoplásmicos, preferiblemente la cadena \alpha. Un complejo
del MHC clase II de fusión monocatenario, de longitud completa
comprende, conectados covalentemente en secuencia: 1) el péptido de
presentación, 2) la cadena \beta de clase II que carece de
dominios de transmembrana y citoplásmicos, 3) una secuencia
conectora monocatenaria y 4) la cadena \alpha de clase II que
contiene dominios de transmembrana y citoplásmicos o un dominio de
anclaje a la membrana. Un complejo de clase II de MHC de fusión
monocatenario soluble preferido comprende, conectados
covalentemente en secuencia: 1) el péptido de presentación, 2) la
cadena \beta de clase II que carece de dominios de transmembrana
y citoplásmicos, 3) una secuencia conectora monocatenaria y 4) la
cadena \alpha de clase II que carece de dominios de transmembrana
y citoplásmicos.
Con respecto a los complejos del MHC de longitud
completa (tanto moléculas monocatenarias como no monocatenarias),
las proteínas del MHC pueden anclarse a membranas celulares a través
de dominios hidrófobos que atraviesan la membrana (dominios de
transmembrana) así como a través de la unión
post-traslacional de la forma glicosilada conectada
covalentemente del fosfatidilinositol (anclaje a la membrana por
GPI). Típicamente, para las cadenas \alpha y \beta de la
molécula del MHC clase II, el dominio de transmembrana consiste en
aproximadamente 25 aminoácidos hidrófobos conectados al lado
carboxiterminal de los dominios \alpha2 y \beta2. Estos residuos
permiten que la proteína atraviese la membrana. La región de
transmembrana acaba con aproximadamente 10-15
residuos que comprenden la cola citoplásmica en el extremo
carboxiterminal de cada una de estas cadenas. Se ha demostrado que
estas regiones de transmembrana y citoplásmica pueden reemplazarse
por secuencias que señalan la conexión por GPI y que las moléculas
de clase II ancladas con GPI quiméricas están unidas a la membrana
(Wettstein, D.A., J.J. Boniface, P.A. Reay, H. Schild y M.M. Davis,
1991, J. Exp. Med. 174:219-228). Los dominios de
anclaje a la membrana conectados por GPI se han definido en un
número de proteínas incluyendo el factor acelerador de las caries
(DAF), CD59 y fosfatasa alcalina de placenta humana (HPAP)
(Wettstein, D.A., J.J. Boniface, P.A. Reay, H. Schild y M.M. Davis,
1991, J. Exp. Med. 174:219-228; Kooyman, D.L., G.W.
Byrne, S. McClellan, D. Nielsen, M. Tone, H. Waldmann, T.M.
Coffman, K.R. McCurry, J.L. Platt y J.S. Logan). Por ejemplo, los
38 aminoácidos carboxiterminales de la HPAP son suficientes para
actuar como una secuencia de señal para la conexión por GIP. Si la
secuencia de DNA que codifica este dominio está conectada a una
molécula secretada como la porción soluble de la cadena \alpha o
\beta del MHC clase II, se forma una molécula quimérica unida a
la membrana (Wettstein, D.A., J.J. Boniface, P.A. Reay, H. Schild y
M.M. Davis, 1991, J. Exp. Med., 174:219-228), y tal
sistema puede emplearse para anclar moléculas de MHC de clase II
monocatenarias conectadas a péptidos a una membrana celular.
Los pesos moleculares de las moléculas de fusión
del MHC variarán, particularmente dependiendo de si la molécula es
soluble o de longitud completa (unida a la membrana). Un complejo de
fusión del MHC clase II soluble generalmente tendrá un peso
molecular de más de aproximadamente 45 kDa, y las cadenas \alpha y
\beta maduras sin dominios de transmembrana y citoplásmico
tendrán cada una un peso molecular de más de aproximadamente 20 kDa,
más típicamente entre aproximadamente 21 y aproximadamente 26 kDa.
Típicamente, las moléculas del MHC clase II monocatenarias maduras
sin dominios de transmembrana y citoplásmico tendrán un peso
molecular de aproximadamente 48 a aproximadamente 50 kDa. Para
moléculas de longitud completa (unidas a la membrana), las cadenas
\alpha y \beta maduras tendrán generalmente un peso molecular
de más de aproximadamente 25 kDa, preferiblemente entre
aproximadamente 26 y aproximadamente 30 kDa. Típicamente, las
moléculas de fusión del MHC clase II monocatenarias maduras de la
invención con un solo dominio de anclaje de transmembrana o membrana
(conectado a la cadena \alpha o \beta) tendrán un peso
molecular de más de aproximadamente 49 kDa, preferiblemente entre
aproximadamente 50 y 52 kDa. Todos los pesos moleculares
mencionados anteriormente son mediante determinación por
SDS-PAGE.
Los complejos de fusión del MHC multivalentes se
prefieren para un número de aplicaciones. La valencia de un
complejo de MHC-péptido antigénico influye en el
efecto del complejo sobre el receptor o los receptores de células
T. Por ejemplo, la activación de los hibridomas de células T 3DT52.5
requiere una molécula de MHC-antigénica que se ha
hecho multivalente. Los complejos del MHC solubles monovalentes son
incapaces de estimular esta célula T [McCluskey, J. y otros (1988)
J. Immunology 141, 1451-1455]. Los complejos de
fusión del MHC multivalentes preferidos de la invención incluyen
los conectados a una inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgM o
Fab'_{2}. Los complejos de fusión del MHC reticulados
químicamente (por ejemplo, reticulados a dendrímeros) también son
especies multivalentes adecuadas. Por ejemplo, el complejo de fusión
del MHC puede modificarse genéticamente incluyendo secuencias que
codifican residuos de aminoácidos con cadenas laterales químicamente
reactivas tales como Cys o His. Tales aminoácidos con cadenas
laterales químicamente reactivas pueden situarse en una variedad de
posiciones de un complejo de fusión del MHC, preferiblemente
distales al péptido de presentación y al dominio de unión del
complejo de fusión del MHC. Por ejemplo, el extremo C de la cadena
\beta de una molécula del MHC distal del péptido de presentación
puede contener adecuadamente tales aminoácido o aminoácidos
reactivos. Pueden usase cadenas laterales adecuadas para conectar
químicamente dos o más complejos de fusión del MHC o una partícula
de dendrímero adecuada para dar un complejo de fusión del MHC
multivalente. Los dendrímeros son polímeros químicos sintéticos que
pueden tener uno cualquiera de un número de grupos funcionales
diferentes de su superficie [Tomalia, D.A. (1993) Aldrichimica Acta
26:91:101]. Dendrímeros ejemplares para usar de acuerdo con la
presente invención incluyen, por ejemplo, el dendrímero de poliamina
de crecimiento en forma de estrella E9 y el dendrímero de poliamina
de crecimiento en forma de peine E9, que pueden conectar residuos de
cisteína.
Un vector de expresión simple de acuerdo con la
invención expresa ambas cadenas de un complejo de fusión del MHC de
la invención, es decir, secuencias que codifican las cadenas tanto
\alpha como \beta de un complejo de fusión del MHC de la
molécula monocatenaria están conectadas cada una a un solo vector de
expresión. Tal vector de expresión puede proporcionar mejores
resultados que cuando se usan vectores separados para cada cadena
de un complejo de fusión del MHC, particularmente cuando la
selección es difícil para células en las que se ha introducido el
vector. También puede preferirse construir un solo vector de
expresión que codifica para ambas cadenas de un complejo de fusión
del MHC así como otros agentes, particularmente un factor
coestimulante de células T tal como B7 o B7-2, es
decir, secuencias que codifican para ambas cadenas de un complejo de
fusión del MHC y una secuencia o secuencias que codifican para un
factor coestimulante se conectan cada una a un vector de expresión
simple, para permitir un solo procedimiento de transformación. De
nuevo, este sistema evitaría la selección potencialmente difícil de
células que se han transformado o transfectado dos o más veces.
Las moléculas del MHC de los complejos de fusión
corresponden adecuadamente en secuencia de aminoácidos a moléculas
del MHC presentes en la naturaleza, por ejemplo moléculas del MHC
clase II de un ser humano, un ratón u otro roedor, u otro mamífero.
Preferiblemente, al menos aproximadamente 70 por ciento de la
secuencia de aminoácidos de una molécula del MHC del complejo de
fusión de la invención será igual que la secuencia de aminoácidos
de una molécula del MHC presente en la naturaleza tal como las
mencionadas anteriormente, más preferiblemente al menos
aproximadamente 90 por ciento de la secuencia de aminoácidos de una
molécula del MHC del complejo de fusión de la invención será igual
que la secuencia de aminoácidos de una molécula del MHC presente en
la naturaleza, y aún más preferiblemente de aproximadamente 98 por
ciento a la totalidad de la secuencia de aminoácidos de una
molécula del MHC del complejo de fusión de la invención será igual
que la secuencia de aminoácidos de una molécula del MHC presente en
la naturaleza.
La presente invención también describe la
detección y la caracterización de péptidos recombinantes. Por
ejemplo, la invención incluye un método que puede usarse para
elaborar mapas de un epítopo no caracterizado para células T como
sigue: secuencias que codifican una biblioteca de péptidos
aleatorios o péptidos seleccionados pueden clonarse en la posición
del péptido de presentación de un sistema de vector de expresión de
la invención tal como los identificados anteriormente, que contiene
una secuencia de DNA que codifica una molécula del MHC y,
opcionalmente, una secuencia de DNA que codifica para una secuencia
conectora. Adecuadamente, se usan fragmentos de restricción de una
biblioteca de cDNA o de DNA genómico apropiada (véase Sambrook y
otros, anteriormente) como la fuente de las secuencias insertadas
en el vector de expresión, o, alternativamente, se usan como las
secuencias insertadas oligonucleótidos seleccionados tales como
oligonucleótidos sintéticos de secuencia conocida. Huéspedes
adecuados, tales como células de mamífero y otras identificadas
anteriormente, son transformados o transfectados por el vector que
contiene la fusión génica, es decir la secuencia que codifica para
la molécula del MHC conectada a la secuencia que codifica para el
péptido adicional. Los transformantes se cultivan bajo condiciones
adecuadas y las células se rastrean para la expresión del complejo
de fusión de interés que reacciona con clones de células T según se
determina por los ensayos descritos posteriormente. Las colonias
reactivas pueden recogerse a continuación y los vectores aislarse.
El análisis de la secuencia del inserto de DNA revelaría que las
secuencias peptídicas clonadas correspondían al epítopo o los
epítopos reconocidos por el clon de células T.
La capacidad de un complejo de fusión del MHC
para modular la actividad de un receptor de células T (incluyendo
la inactivación de las respuestas de las células T) puede
determinarse fácilmente mediante un ensayo in vitro.
Típicamente, las células T para los ensayos eran proporcionadas por
líneas de células T transformadas tales como hibridomas de células
T o células T que se aíslan de un mamífero, por ejemplo, un ser
humano, o de un roedor tal como un ratón. Los hibridomas de células
T adecuados están disponibles públicamente o pueden prepararse
mediante métodos conocidos. Las células T pueden aislarse de un
mamífero mediante métodos conocidos. Véase, por ejemplo,
Shimonkevitz, R. y otros (1983) J. Exp. Med. 158:303 y los Ejemplos
4 y 5 que siguen.
Un ensayo adecuado para determinar si un
complejo de fusión del MHC es capaz de modular la actividad de
células T se efectúa como sigue, mediante las etapas secuenciales
1-4 siguientes. Las células T expresan adecuadamente
un marcador que puede ensayarse y que indica la activación de
células T, o la modulación de la actividad de células T después de
la activación. Así, por ejemplo, según se describe en el Ejemplo 4
posterior, puede emplearse el hibridoma de células T de múrido DO
11.10 que expresa interleuquina-2
(IL-2) durante la activación. Las concentraciones
de IL-2 pueden medirse para determinar si un péptido
de presentación particular es capaz de modular la actividad de este
hibridoma de células T. Tal ensayo adecuado se efectúa mediante las
siguientes etapas secuenciales:
- 1.
- Se obtienen células T que tienen el receptor de células T específico para el complejo de péptido/MHC, tal como de un hibridoma de células T de interés o mediante aislamiento a partir de un mamífero.
- 2.
- Las células T se cultivan bajo condiciones que permiten la proliferación.
- 3.
- Las células T que proliferan se ponen en contacto con un complejo de fusión del MHC seleccionado de la invención.
- 4.
- Las células T se ponen en contacto con las células que presentan antígeno para proporcionar la señal necesaria para la activación y se ensayan con respecto a un marcador, por ejemplo, se mide la producción de IL-2. Una disminución en la producción de IL-2, por ejemplo, una disminución de 40 por ciento o más en la producción de IL-2 después de un período de 24 horas, más típicamente una disminución de 50 por ciento o más en la producción de IL-2 después de un período de 24 horas, indica que el complejo de fusión del MHC modula la actividad de las células T y puede suprimir una respuesta inmunitaria. El Ejemplo 4 que sigue ejemplifica tal ensayo. El ensayo se emplea adecuadamente para el análisis de la actividad de complejos del MHC "truncados" solubles de la invención que no contienen una porción de transmembrana. Además, el ensayo se emplea adecuadamente para la identificación de complejos de fusión del MHC de la invención que contienen un péptido de presentación conectado covalentemente que funciona como un antagonista o un agonista parcial de receptores de células T.
Las células T empleadas en los ensayos se
incuban bajo condiciones adecuadas para la proliferación. Por
ejemplo, un hibridoma de células T DO 11.10 se incuba adecuadamente
a aproximadamente 37ºC y CO_{2} al 5% en medio de cultivo
completo (RPMI 1640 complementado con FBS al 10%,
penicilina/estreptomicina, L-glutamina y
2-mercaptoetanol 5 x 10^{5} M). Diluciones en
serie del complejo de fusión del MHC de la invención pueden añadirse
al medio de cultivo de células T. Las concentraciones adecuadas del
complejo de fusión del MHC añadidas a las células típicamente
estarán en el intervalo de 10^{-12} a 10^{-6} M. Se proporcionan
señales de activación de células T mediante células que presentan
antígeno que se han cargado con el péptido antigénico apropiado. Se
cree que el uso de una dosis de antígeno y números APC que dan una
activación de células T ligeramente submáxima se prefiere para
detectar la inhibición de respuestas de células T con complejos de
fusión del MHC de la invención. Una disminución en la producción de
IL-2 después del contacto con el complejo de fusión
del MHC indica que el complejo de fusión modula la actividad de las
células T y puede suprimir la respuesta inmunitaria.
Alternativamente, en vez de la medida de una
proteína expresada tal como IL-2, puede determinarse
adecuadamente la modulación de la activación de las células T
mediante cambios en la proliferación de células T dependiente de
antígeno según se mide mediante técnicas de radiomarcaje que son
conocidas en la industria. Por ejemplo, un nucleótido marcado (por
ejemplo, tritiado) puede introducirse en un medio de cultivo de
ensayo. La incorporación de tal nucleótido etiquetado en DNA sirve
como una medida de la proliferación de células T. Véase el Ejemplo
5 que sigue, donde tal procedimiento se describe específicamente.
Este ensayo no es adecuado para células que no requieren la
presentación de antígeno para el crecimiento, por ejemplo,
hibridomas de células T. Es adecuado para la medida de la
modulación por los complejos de fusión del MHC de la activación de
células T para células T no transformadas aisladas de mamíferos.
Una disminución en el nivel de la proliferación de células T
después del contacto con el complejo de fusión del MHC indica que el
complejo de fusión modula la actividad de las células y puede
suprimir la respuesta inmunitaria, por ejemplo, véase el Ejemplo 5
que sigue. El ensayo de proliferación de células T in vitro
se prefiere para medir los efectos de complejos de fusión del MHC
de la invención sobre cambios específicos para antígenos en la
expansión clonal de células T in vivo. Tal ensayo se
describe específicamente en el Ejemplo 7 que
sigue.
sigue.
Estos ensayos in vitro pueden emplearse
para seleccionar e identificar un péptido o péptidos, codificados
por DNA de una biblioteca aleatoria u otros oligonucleótidos, que
son capaces de modular la actividad de un receptor de células T
(incluyendo la activación o la inhibición del desarrollo de células
T). Específicamente, pueden clonarse secuencias de DNA que
codifican una biblioteca de péptidos aleatorios o péptidos
seleccionados en la posición del péptido de presentación de un
sistema de vector de expresión de la invención, tales como los
identificados anteriormente, que contiene una secuencia de DNA que
codifica una molécula del MHC y, opcionalmente, una secuencia de
DNA que codifica para una secuencia conectora. Adecuadamente, se
usan fragmentos de restricción de un cDNA apropiado de una
biblioteca de DNA genómico (véase Sambrook y otros, anteriormente)
como una fuente de las secuencias insertadas en el vector de
expresión o, alternativamente, se usan oligonucleótidos
seleccionados, tales como oligonucleótidos sintéticos de secuencia
conocida, como la secuencia insertada. Se transforman huéspedes
adecuados, tales como células de mamífero y otros identificados
anteriormente, con el vector que contiene la fusión génica, por
ejemplo, la secuencia que codifica para la molécula del MHC
conectada a una secuencia que codifica para el péptido de
presentación. Los transformantes se cultivan bajo condiciones
adecuadas y las células se rastrean con respecto a la expresión del
complejo de fusión del MHC de interés poniendo en contacto el mismo
con células T seleccionadas. Se emplean ensayos descritos
anteriormente, por ejemplo, la medida de la producción de
IL-2 o la proliferación de células T, para
determinar si el contacto con el complejo de fusión del MHC
modulaba la activación de células T. Por ejemplo, una disminución en
la producción de IL-2 de células estimuladas con
APC identifica los complejos de fusión del MHC que modulan la
actividad de las células T y suprimen las respuestas inmunitarias.
Alternativamente, los ensayos in vitro pueden emplearse para
identificar complejos de fusión del MHC multivalentes de la
invención descritos anteriormente, que contenían péptidos de
presentación que incrementan las respuestas de células T.
Los ensayos in vivo también pueden
emplearse adecuadamente para determinar la capacidad de un complejo
de fusión del MHC para modular la actividad de células T,
incluyendo la actividad para inhibir o inactivar el desarrollo de
células T. Por ejemplo, un complejo de fusión del MHC de la
invención puede ensayarse con respecto a su capacidad para inhibir
el cambio de clase de inmunoglobulina (es decir de IgM a IgG).
Véase, por ejemplo, Linsley, P.S. y otros (1992) Science
257:792-795. Tal ensayo se describe específicamente
en el Ejemplo 6 que sigue.
También se proporcionan métodos de diagnóstico
que usan moléculas de fusión del MHC, incluyendo obtención de
imágenes de diagnóstico in vivo y tipificación del HLA
[véase, por ejemplo, A.K. Abbas, Cellular and Molecular Immunology,
página 328 (W.B. Saunders Co. 1991)]. Para aplicaciones de obtención
de imágenes in vivo, una molécula de fusión del MHC de la
invención que tiene un marcador radiactivo (por ejemplo, ^{125}I,
^{32}P, ^{99}Tc) u otra etiqueta detectable puede administrarse
a un mamífero y el sujeto puede explorarse mediante procedimientos
conocidos con respecto a la unión de la molécula del MHC. Tal
análisis del mamífero podría ayudar al diagnóstico y el tratamiento
de un número de trastornos incluyendo, por ejemplo, respuestas
inmunitarias no deseadas, según se describe aquí.
También pueden emplearse ensayos para evaluar el
uso potencial de un complejo del MHC para el tratamiento de un
trastorno inmunitario. Por ejemplo, la encefalomielitis alérgica
experimental (EAE) es una enfermedad autoinmune en ratones y un
modelo reconocido para la esclerosis múltiple. Una raza de ratón
adecuada puede tratarse para desarrollar EAE y a continuación un
complejo de fusión del MHC de la invención puede administrarse y el
animal evaluarse para determinar si el desarrollo de la EAE se
inhibe o se evita después de la administración del complejo de
fusión del MHC. Tal ensayo se describe específicamente en los
Ejemplos 8 y 11 que siguen.
La capacidad de un complejo de fusión del MHC
para inducir una respuesta inmunitaria, incluyendo proporcionar
vacunación contra un trastorno elegido, puede determinarse
fácilmente mediante un ensayo in vivo. Por ejemplo, un
complejo de fusión del MHC de la invención, o DNA que codifica para
un complejo de fusión del MHC de la invención, puede administrarse
a un mamífero tal como un ratón, pueden obtenerse muestras de sangre
del mamífero en el momento de la administración inicial y varios
momentos periódicamente posteriores (por ejemplo a las 2, 5 y 8
semanas después de la administración del complejo de fusión o el
DNA). Se recoge suero de las muestras de sangre y se ensaya con
respecto a la presencia de anticuerpos originados por la
inmunización. Las concentraciones de anticuerpo pueden
determinarse. El Ejemplo 9 que sigue describe específicamente tal
ensayo.
Según se analiza anteriormente, la invención
describe la administración directa de una construcción de DNA que
codifica para un complejo de fusión del MHC de la invención para la
expresión del complejo de fusión dentro de células del sujeto.
Preferiblemente, DNA que tiene las regiones de codificación de la
fusión de MHC-péptido de presentación,
adecuadamente bajo el control de un promotor apropiado tal como el
promotor de CMV, se inyecta directamente a músculo esquelético del
sujeto. Para asegurar la presencia de las moléculas de fusión del
MHC se inducirá una respuesta inmunitaria en el sujeto, se
co-administran preferiblemente al sujeto vectores de
DNA que codifican para un factor co-estimulante con
el DNA que codifica para la fusión de MHC-péptido de
presentación. Vectores de DNA co-administrados
preferidos incluyen, por ejemplo, los que comprenden la región de
codificación de B7-1 o B7-2 bajo el
control del promotor de CMV. La proteína B7-1 y
B7-2 expresada puede proporcionar la señal
co-estimulante para ayudar a la iniciación de la
respuesta inmunitaria.
Tal sistema para la inducción de una respuesta
inmunitaria en un sujeto, tal como un mamífero, ofrece ventajas
significativas sobre sistemas anteriores. La etapa inicial en la
presentación de un antígeno proteínico extraño es la unión del
antígeno natural a una célula que presenta antígeno (APC). Después
de la unión a APCs, los antígenos entran en las células, mediante
fagocitosis, endocitosis mediada por receptores o pinocitosis. Tales
antígenos internalizados se localizan en vesículas intracelulares
unidas a las membranas llamadas endosomas. Después de la fusión de
endosoma-lisosoma, los antígenos se procesan en
péptidos pequeños mediante proteasas celulares situadas en los
lisosomas. Los péptidos se asocian con las cadenas \alpha y
\beta de moléculas del MHC clase II dentro de estos lisosomas.
Estas moléculas del MHC clase II, previamente sintetizadas en el
retículo endoplásmico rugoso, se transportan secuencialmente a los
complejos de Golgi y a continuación al compartimiento lisosómico.
El complejo de péptido-MHC se presenta sobre la
superficie de APCs para la activación de células T y B. Por lo
tanto, la accesibilidad de sitios de procesamiento proteolíticos
dentro del antígeno, la estabilidad de los péptidos resultantes en
el lisosoma y las afinidades de los péptidos para las moléculas del
MHC son factores determinantes para la inmunogenicidad de un epítopo
particular. Estos factores no pueden cambiarse mediante la
administración de adyuvantes. La expresión directa de los complejos
de fusión del MHC de la invención, (es decir, MHC conectado
covalentemente directamente al péptido de presentación), sin
embargo, debe evitar tales complicaciones e inducir una respuesta
inmunitaria contra el epítopo soportado en las moléculas de fusión
del MHC.
Además, en lugar de administrar directamente a
un sujeto DNA que codifica para un complejo de fusión del MHC de la
invención, pueden administrarse al sujeto células que presentan
antígeno compatibles con el huésped en las que se ha introducido
DNA. Esto es, DNA que codifica para uno o más complejos de fusión
del MHC de la invención puede introducirse en células que presentan
antígeno compatibles con el huésped y tales células que presentan
antígeno transformadas o transfectadas pueden administrarse al
huésped elegido, y con el sitio elegido en el que tendría lugar la
interacción más eficaz con la célula T apropiada. Véanse, por
ejemplo, los Ejemplos 13 y 14 que siguen. Al administrarlas a un
sujeto, tales células tratadas mediante ingeniería pueden expresar
a continuación in vivo sobre la superficie celular el
complejo de fusión del MHC codificado por el DNA. Tales células
tratadas mediante ingeniería pueden administrarse a un sujeto para
inducir una respuesta inmunitaria o alternativamente para suprimir
una respuesta inmunitaria, según se describe aquí, dependiendo de
la expresión de otras señales co-estimulantes de las
células. Esto es, si durante la administración las células pueden
proporcionar un complejo de fusión del MHC en ausencia de una
cantidad eficaz de una señal o señales
co-estimulantes, o proporcionar un complejo de
fusión del MHC que contiene un péptido de presentación con
actividad antagonista o agonista parcial, las células pueden
administrarse a un huésped para suprimir una respuesta inmunitaria.
Alternativamente, si las células pueden proporcionar un complejo de
fusión del MHC en presencia de una cantidad eficaz de una señal o
señales co-estimulantes, por ejemplo, si un factor
co-estimulante de células T tal como B7 o
B7-2 se expresa sobre la superficie de las células,
las células pueden administrarse a un huésped mamífero para inducir
una respuesta inmunitaria en el mamífero, según se describe aquí.
Puede preferirse construir una sola expresión que codifica para
ambas cadenas de un complejo de fusión del MHC así como para un
factor co-estimulante de células T si se emplea,
según se analiza anteriormente, e introducir ese vector en una APC
compatible con el huésped para preparar las células para la
administración. Como será apreciado por los expertos en la técnica,
el término células que presentan antígeno "compatibles con el
huésped" significa células que presentan antígeno que son del
mismo haplotipo que el sujeto o "huésped" al que se
administran las células. Preferiblemente, las células que presentan
antígeno compatibles con el huésped transformadas son las que
pueden migrar a los nódulos linfáticos del sujeto al que se han
administrado las células y, en ese sitio, expresar el complejo de
fusión del MHC.
Según se analiza anteriormente, los complejos de
fusión del MHC y las construcciones de DNA que codifican tales
complejos de fusión tienen un número de aplicaciones
terapéuticas.
Por ejemplo, los complejos de fusión del MHC que
no contienen una porción de transmembrana (véase, por ejemplo, el
complejo soluble del Ejemplo 2 que sigue) pueden administrarse para
suprimir una respuesta inmunitaria de un mamífero, por ejemplo,
para tratar a un mamífero, incluyendo un ser humano, que sufre o es
susceptible a un trastorno autoinmune tal como, por ejemplo,
esclerosis múltiple, diabetes mellitus insulinodependiente,
artritis reumatoide y similares. También son adecuados para el
tratamiento los sujetos que sufren o son propensos a sufrir una
respuesta inmunitaria no deseada, por ejemplo pacientes que han
sufrido algún tipo de cirugía de trasplante, tal como trasplante de
corazón, riñón, piel u otros órganos. En tales situaciones, un
procedimiento de tratamiento puede comenzarse adecuadamente antes
del procedimiento quirúrgico.
Preferiblemente, para suprimir una respuesta
inmunitaria, se administra un complejo de fusión del MHC que está
conectado a una inmunoglobulina, por ejemplo, fusionado a los
dominios constantes de una molécula de inmunoglobulina tal como una
inmunoglobulina IgG, IgM o IgA o un fragmento. Véase la figura 1C de
los dibujos y los ejemplos que siguen.
Puede emplearse un número de sistemas distintos
para suprimir una respuesta inmunitaria de un mamífero, de acuerdo
con la invención.
Específicamente, según se analiza anteriormente,
se ha observado que una molécula del MHC sólo inducirá la expansión
clonal de una línea de células T específica si también se aportan
una señal o señales co-estimulantes tales como de
células que presentan antígeno. En ausencia de señales
co-estimulantes, o al menos en ausencia del aporte
de una cantidad eficaz para la proliferación de células T de tal
señal o señales co-estimulantes de células T, las
células T serán inducidas a un estado de anergia o apoptosis que da
como resultado la deleción clonal.
De acuerdo con esto, un método de tratamiento
para la supresión de una respuesta inmunitaria proporciona la
administración de una cantidad eficaz de uno o más complejos de
fusión del MHC en ausencia sustancial de cualesquiera señal o
señales co-estimulantes para inducir de ese modo la
anergia para células T específicas y suprimir eficazmente una
respuesta inmunitaria no deseada. Preferiblemente, se administra un
complejo del MHC soluble "truncado", es decir el complejo del
MHC no contiene una porción de transmembrana. El péptido de
presentación del complejo de fusión del MHC soluble administrado
puede seleccionarse de loa que son específicos para células T de
una respuesta inmunitaria no deseada para inducir un estado de
anergia con respecto a esas células T. Tales péptidos de
presentación pueden identificarse y seleccionarse fácilmente
mediante los procedimientos in vitro identificados
anteriormente.
Los complejos de fusión del MHC solubles
adecuadamente pueden administrarse a un mamífero mediante inyección,
por ejemplo inyección intraperitoneal o intravenosa. También sería
posible la administración tópica, por ejemplo, gotas oculares, y la
administración a través de inhaladores nasales y pulmonares. Un
complejo de fusión del MHC de la invención, al menos los complejos
usados en aplicaciones terapéuticas, debe producirse en células de
mamífero y purificarse antes del uso de modo que esté esencialmente
o completamente libre de cualquier bacteria o pirógeno. La dosis
óptima para una aplicación terapéutica dada puede determinarse por
medios convencionales.
Los complejos de fusión del MHC pueden
administrase adecuadamente a un sujeto (particularmente un mamífero
tal como un ser humano o ganado tal como vacas) en composiciones de
tratamiento o farmacéuticas que comprenden el complejo de fusión.
Tales composiciones farmacéuticas de la invención se preparan y se
usan de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, las formulaciones que contienen una cantidad
terapéuticamente eficaz de un complejo de fusión del MHC de la
invención pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de
múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden
almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que
requiere sólo la adición del portador líquido estéril, por ejemplo
agua para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Las
formulaciones liposómicas también pueden preferirse para muchas
aplicaciones. Otras aplicaciones para la administración parenteral
también serán adecuadas e incluirán soluciones para inyección
estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes,
tampones, bacteriostatos y solutos que hacen a la formulación
isotónica con la sangre del receptor pretendido; y soluciones
estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de
suspensión y agentes espesantes.
Otro método de tratamiento para la supresión de
una respuesta inmunitaria proporciona la administración de un
complejo de fusión del MHC que contiene un péptido de presentación
conectado covalentemente que es un antagonista o un agonista
parcial de receptores de células T. Véase Sette, A. y otros (1994)
Annu. Rev. Immunol. 12: 413-431. El complejo de
fusión del MHC puede ser una forma truncada y puede administrarse
como una proteína soluble según se describe anteriormente.
Alternativamente, el complejo de fusión del MHC puede ser de
longitud completa, es decir contendrá una porción de transmembrana.
El tratamiento con estos complejos comprenderá la administración a
un mamífero de una cantidad eficaz de una secuencia de DNA que
comprende un vector de DNA que codifica el complejo de fusión del
MHC de longitud completa y un péptido de presentación que es un
antagonista o un agonista parcial de TcR. Véase, por ejemplo, el
análisis anterior y los Ejemplos 3, 10 y 11 que siguen para medios
adecuados de preparación de tales complejos de fusión del MHC y el
uso de los mismos para la terapia inmunosupresiva. Los péptidos de
presentación que son antagonistas o agonistas parciales de TcR
pueden identificarse y seleccionarse fácilmente mediante los
procedimientos in vitro identificados anteriormente. Un
complejo de fusión del MHC que contiene un péptido de presentación
que es un antagonista o un agonista parcial de receptores de células
T se prefiere particularmente para el tratamiento de alergias y
enfermedades autoinmunitarias tales como esclerosis múltiple,
diabetes mellitus insulinodependiente y artritis reumatoide.
Además, según se analiza anteriormente, las
células que presentan antígeno compatibles con el huésped en las
que se ha introducido DNA que codifica para un complejo de fusión
del MHC pueden administrarse a un sujeto para suprimir una
respuesta inmunitaria. Durante la administración las células
expresan un complejo de fusión del MHC en ausencia de una cantidad
eficaz de señal o señales co-estimulantes de células
T, es decir tal que se induce la anergia de células T, y/o las
células administradas expresan un complejo de fusión del MHC que
contiene un péptido de presentación conectado con actividad
antagonista o agonista parcial.
También pueden usarse diferentes terapias
inmunosupresoras en combinación así como con otros agentes
inmunosupresores conocidos tales como fármacos antiinflamatorios,
para proporcionar un tratamiento más eficaz de un trastorno mediado
por células T. Por ejemplo, los complejos de fusión del MHC
inmunosupresores pueden usarse en combinación con agentes
antiinflamatorios tales como corticosteroides y fármacos no
esteroideos para el tratamiento de trastornos autoinmunes y
alergias.
La invención también describe métodos para
provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como un ser
humano, incluyendo vacunar un mamífero tal como un ser humano contra
un agente infeccioso o un trastorno elegido tal como el cáncer,
particularmente un cáncer de melanoma, u otro trastorno tal como la
malaria.
Estos métodos comprenden administrar a un
mamífero una cantidad eficaz de una secuencia de DNA que comprende
un vector de DNA que codifica para un complejo de fusión del MHC que
contiene una porción de transmembrana, y/o la administración de tal
complejo de fusión del MHC que contiene una porción de transmembrana
y/o la administración de células que presentan antígeno compatibles
con el huésped que contienen tal DNA que codifica para tales
complejos de fusión del MHC. La preparación de vectores de expresión
de complejos de fusión del MHC se describe anteriormente y en los
Ejemplos 3 y 12 que siguen. Se han presentado métodos para la
administración de DNA plasmídico, la captación del DNA por células
del sujeto administrado y la expresión de la proteína. Véase Ulmer,
J.B. y otros, Science (1993) 259: 1745-1749.
Preferiblemente, el DNA que codifica para un
complejo de fusión del MHC de longitud completa se administra a un
mamífero junto con una secuencia de DNA que codifica para un factor
co-estimulante de células T tal como DNA que
codifica para B7 o B7-2. El gen B7 y la expresión
del mismo se describen en Harlan, D. y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1994) 91: 3137-3141. Durante la captación
de ese DNA por las células del sujeto, el factor
co-estimulante de células T se expresará y puede
proporcionar la señal o las señales co-estimulantes
y de ese modo ayudar a la iniciación de la respuesta inmunitaria.
Véanse los Ejemplos 12 y 13 que siguen y describen la construcción
de vectores de expresión que contienen genes B7 o
B7-2.
Aunque la administración de DNA que codifica
para un complejo de fusión del MHC de la invención a un mamífero
tal como un ser humano según se describe anteriormente es un método
preferido para provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto, los
complejos de fusión del MHC también pueden administrarse
adecuadamente mediante otras rutas. Así, según se analiza
anteriormente, pueden administrarse a un sujeto células que
presentan antígeno compatibles con el huésped en las que se ha
introducido DNA que codifica para un complejo de fusión del MHC de
la invención, para inducir una respuesta inmunitaria. Durante la
administración las células expresan un complejo de fusión del MHC
de la invención en presencia de una cantidad eficaz de una señal o
señales co-estimulantes de células T, tales como
genes B7 o B7-2, para provocar una respuesta
inmunitaria, y/o las células administradas expresan un complejo de
fusión del MHC de longitud completa que es capaz de provocar una
respuesta inmunitaria, por ejemplo según se muestra por un
incremento en la proliferación de células T tal como mediante los
procedimientos detalladas en los ejemplos que siguen. Aunque
típicamente menos preferidos que los sistemas tratados
anteriormente, los complejos de fusión del MHC de la invención que
son capaces de provocar una respuesta inmunitaria también pueden
administrarse directamente a un sujeto, por ejemplo un complejo de
fusión del MHC de longitud completa que contiene un péptido de
presentación antigénico conectado covalentemente que puede estimular
o inducir la proliferación de células
T.
T.
Los métodos para inducir una respuesta
inmunitaria, incluyendo vacunar a un sujeto contra un trastorno
elegido, pueden usarse en combinación con métodos conocidos para
inducir una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, un complejo de
fusión del MHC, o una construcción de DNA que codifica para tal
complejo de fusión del MHC, puede administrarse a un sujeto en
coordinación o combinación con la administración de una composición
de vacuna, para estimular o prolongar el efecto deseado de tal
composición de vacuna.
Los vectores de DNA que codifican complejos de
fusión del MHC se administran adecuadamente a un mamífero,
incluyendo un ser humano, preferiblemente mediante inyección
intramuscular. La administración de cDNA a músculo esquelético de
un mamífero con la captación posterior del vector de expresión
administrado por las células musculares y la expresión de proteína
codificada por el DNA ha sido descrita por Ulmer y otros y
representa un procedimiento ejemplar [Ulmer, J.B. y otros, Science
259: 1745-1749]. La dosis óptima para una aplicación
terapéutica dada puede determinarse por medios convencionales.
Adicionalmente, los complejos de fusión del MHC,
los vectores de DNA que codifican tales complejos y las células que
presentan antígenos compatibles con el huésped que contienen tales
vectores de DNA de la invención pueden administrarse cada uno
adecuadamente a un sujeto mediante una variedad de otras rutas. Por
ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria, puede ser
preferible administrar intradérmicamente a un sujeto vectores de DNA
que codifican complejos de fusión del MHC antigénicos de las
invenciones, solos o junto con DNA que codifica para un factor
co-estimulante, mediante procedimientos conocidos
por los expertos en la técnica. Tal administración puede dar como
resultado la transformación de células que presentan antígeno
intradérmicas (por ejemplo, células dendríticas) y la proliferación
de células T. Véanse los resultados del Ejemplo 16 que sigue. Los
complejos de fusión del MHC y los vectores de DNA que codifican
tales complejos de fusión también pueden administrarse a un sujeto
mediante otras rutas, por ejemplo oralmente o transdérmicamente.
Además del tratamiento de trastornos de seres
humanos, los complejos de fusión del MHC de la invención y las
construcciones de DNA que codifican tales complejos de fusión
tendrán un uso significativo para aplicaciones veterinarias, por
ejemplo, el tratamiento de trastornos de ganado tal como vacas,
ovejas, etc, y mascotas tales como perros y gatos.
Aunque los complejos de fusión del MHC descritos
en la invención o las construcciones de DNA que codifican para
tales complejos de fusión pueden administrarse solos a un sujeto,
también pueden usarse como parte de una composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden en
general uno o más complejos de fusión del MHC de la invención o
construcciones de DNA que codifican para tales complejos de fusión
junto con uno o más portadores aceptables. Los portadores deben ser
"aceptables" en el sentido de ser compatibles con otros
ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor
de la misma. Por ejemplo, para la administración parenteral, tal
como mediante una formulación para inyección, puede prepararse una
solución o suspensión estéril con agua, u otras soluciones
farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas se
preparan adecuadamente mediaste métodos conocidos en la técnica.
Se apreciará que las cantidades preferidas
reales de un complejo de fusión del MHC descrito en la invención
dado o una construcción de DNA que codifica para el mismo usados en
una terapia dada variarán con el compuesto o los compuestos activos
particulares que se utilizan, las composiciones particulares
formuladas, el modo de aplicación, el sitio particular de
administración, el peso del paciente, la salud general, el sexo,
etc., la indicación particular que se trata, etc. y otros factores
tales que son reconocidos por los expertos en la técnica,
incluyendo el médico o veterinario asistente. Los grados de
administración óptimos para un procedimiento de administración dado
pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica usando
pruebas de determinación de la dosificación convencionales
efectuadas, por ejemplo, con respecto a las pautas precedentes y los
ensayos descritos aquí.
Todos los documentos mencionados aquí se
incorporan aquí mediante referencia en su totalidad.
Los siguientes ejemplos no limitativos son
ilustrativos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
1A-1F
Se prepararon vectores de fusión del MHC clase
II-péptido para expresar moléculas del MHC clase II
solubles con péptidos de presentación conectados covalentemente,
según se describe posteriormente en los Ejemplos
IA-IF. Los genes del MHC clase II usados para
preparar las siguientes construcciones de complejos de fusión del
MHC se aislaron mediante amplificación por PCR de cDNA generado a
partir de la Célula que Presenta Antígeno (APC) apropiada, según se
muestra en las Figuras 2-8 de los dibujos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1A
Para los genes I-A^{d}, se
aisló RNA total de la línea celular A20 del linfoma de células B de
ratón. Brevemente, se homogeneizaron 1 x 10^{8} células A20 (ATCC
TIB 208) en 6 ml de tiocianato de guanidinio 4 M enfriado con
hielo, Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, usando un
homogeneizador Tissue Tearer durante 5 minutos. Después de la
homogeneización, se añadió sarcosilo hasta una concentración final
de 0,5% y la solución se mezcló a fondo. El homogenado se
centrifugó a 5000 g durante 10 minutos y el sobrenadante se llevó
hasta 10 ml con tiocianato de guanidinio 4 M,
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, tampón de sarcosilo al 0,5%.
El sobrenadante se dispuso en forma de capa suavemente en la parte
superior de un colchón de 3,5 mm de CsCl 5,7 M, EDTA 0,01 M, pH
7,5, en un tubo de ultracentrífuga transparente SW41. Las muestras
se centrifugaron en un rotor SW41 a 32.000 rpm durante 24 horas a
20ºC. Después de la centrifugación, el sobrenadante se retiró
cuidadosamente y el pelet de RNA se lavó con etanol al 70%. El RNA
se disolvió en 350 \mul de agua tratada con DEPC que contenía 40
unidades de RNasin (Promega). El RNA se precipitó con 35 \mul de
acetato sódico 3 M y 970 \mul de etanol. Este procedimiento daba
aproximadamente 370 \mug de RNA total. El RNA se suspendió hasta 5
\mug/\mul con agua tratada con DEPC y se usó para la clonación
por RT-PCR de los genes I-A^{d}.
La figura 2 de los dibujos muestra la estrategia para aislar el
fragmento génico \alpha1-\alpha2 de
I-A^{d} (que codifica de aa1 a 182) y la figura 8
de los dibujos lista los cebadores oligonucleotídicos usados. El RNA
total de A20 (5 \mug) se convirtió en cDNA usando
Superscript-MLV Reverse Transcriptase
(GIBCO-BRL) y un cebado específico para \alpha2
de acuerdo con los procedimientos del fabricante. De los 20 \mul
de cDNA generados, 2 \mul se usaron como DNA de molde para PCR.
Las reacciones de amplificación por PCR típicas (100 \mul)
contenían DNA de molde, 10 pmoles de los cebadores apropiados
(OPR100 y OPR101), 2,5 unidades de polimerasa de Taq, dNTP
100 \muM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3,
MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%. El molde se desnaturalizó
mediante una incubación inicial a 96ºC durante 5 minutos, mientras
la polimerasa de Taq se añadía para iniciar en caliente la
reacción. Los productos deseados se amplificaron mediante 10 ciclos
térmicos de 55ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 2 minutos, a
continuación 96ºC durante 1 minuto, seguidos por 25 ciclos por
etapas de 70ºC durante 1 minuto y a continuación 96ºC durante 1
minuto. El producto de PCR \alpha1-\alpha2
inicial (aproximadamente 550 pb) se diseñó para clonarse en el
vector de expresión bacteriano, pJRS139. Los productos de PCR de 5
reacciones se reunieron, se precipitaron con 2 volúmenes de
etanol/acetato sódico 0,3 M, y los productos resultantes
(aproximadamente 0,2 \mug de DNA) se resuspendieron en agua. El
fragmento génico \alpha1-\alpha2 se digirió con
NcoI y SpeI, se resolvió mediante electroforesis en
gel de agarosa y se purificó mediante elución del gel de agarosa.
Los productos de PCR digeridos purificados se ligaron a
continuación en pJRS139 digerido con NcoI/SpeI. El
fragmento génico \alpha1-\alpha2 clonado en
pJRS139 se denominaba 39AD2 y servía como el molde para que la
amplificación por PCR añadiera sitios de restricción y secuencias
de flanqueo necesarios para la clonación y la expresión en los
vectores de expresión de mamífero. En estas reacciones, se usaron
0,5 ng de 39AD2 digerido con NcoI como un molde, OPR107 y
OPR108 eran los cebadores y las condiciones de PCR eran 5 ciclos
térmicos de 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1 minuto y 96ºC
durante 1 minuto seguidos por 20 ciclos por etapas de 70ºC durante 1
minuto y 96ºC durante 1 minuto. El producto de PCR
\alpha1-\alpha2 (aproximadamente 590 pb)
contiene un sitio EcoRV 5' y un sitio EagI 3' para la
clonación entre el intrón líder y el intrón de la región J del
vector lanzadera de la cadena kappa de IgG (véase la figura 9A de
los dibujos). Además, el producto de PCR tiene los sitios de corte
y empalme y las secuencias líder de IgG necesarios para la expresión
apropiada de la proteína de fusión de MHC-IgG. Los
productos de PCR se digirieron con EcoRV y EagI y se
purificaron en gel. Los productos de PCR digeridos purificados se
ligaron a continuación en pBlueScript II SK + (Stratagene) digerido
con EcoRV/EagI dando como resultado la construcción
pA19. Este vector se digirió con EcoRV y EagI y el
fragmento génico \alpha1-\alpha2 resultante se
subclonó en el vector lanzadera de IgG pJW003 según se describe en
el Ejemplo 2 posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1B
El siguiente procedimiento se empleó para aislar
el fragmento génico \beta1-\beta2 de
I-A^{d} (que codifica de aa1 a 189), enlazando la
secuencia líder e insertando los oligonucleótidos que codifican los
péptidos antigénicos. Este sistema también se representa en la
figura 3 de los dibujos. El RNA total de A20 (10 \mug) se
convirtió en cDNA usando Superscript-MLV Reverse
Transcriptase (GIBCO-BRL) y cebado específico para
oligo dT de acuerdo con los procedimientos del fabricante. De los 20
\mul de cDNA generados, 2 \mul se usaron como DNA de molde para
PCR. Las reacciones se llevaron a cabo como se describe
anteriormente excepto que los cebadores oligonucleotídicos eran
OPR102 y OPR104 (véase la figura 8 de los dibujos) y las condiciones
de PCR eran 100 ciclos térmicos de 60ºC durante 1 minuto, 70ºC
durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto seguidos por 40 ciclos por
etapas de 70ºC durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto. El producto
de PCR \beta1-\beta2 inicial (aproximadamente
570 pb) se diseñó para clonarse en el vector de expresión
bacteriano, pJRS139. Los productos de PCR se digirieron con
NcoI y SpeI y se purificaron en gel de la misma manera
que se describe anteriormente. Los productos de PCR digeridos
purificados se ligaron a continuación en pJRS139 digerido con
NcoI/SpeI. El fragmento génico
\beta1-\beta2 clonado en pJRS139 se denominó
39BD2 y servía como el molde para que la amplificación por PCR
añadiera la secuencia conectora y los sitios de restricción y las
secuencias de flanqueo necesarios para la clonación y la expresión
en los vectores de expresión de mamífero. En estas reacciones, se
usaron 0,5 ng de 39AB2 digerido con NcoI como un molde,
OPR107 y OPR108 eran los cebadores y las condiciones de PCR eran 5
ciclos térmicos de 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1 minuto y
96ºC durante 1 minuto, seguidos por 20 ciclos por etapas de 70ºC
durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto. El producto de PCR de
conector-\beta1-\beta2
(aproximadamente 640 pb) contiene un sitio EcoRV 5' y un
sitio EagI 3' para la clonación entre el intrón líder y el
intrón de la región J del vector lanzadera de cadena pesada de IgG
(figura 9B). Además, el producto de PCR tiene los sitios de corte y
empalme y las secuencias líder de IgG necesarios para la expresión
apropiada de la proteína de fusión de MHC-IgG. Para
permitir la clonación de las secuencias de péptidos antigénicos, se
trató mediante ingeniería un sitio AflII en el extremo de la
secuencia de señal y estaba presente un sitio NheI al
principio del conector. Los productos de PCR se digirieron con
EcoRV y EagI y se purificaron en gel. Los productos de
PCR digeridos purificados se ligaron a continuación en pBlueScript
II SK + (Stratagene) digerido con EcoRV/EagI dando
como resultado la construcción pB15. La secuencia y los análisis de
restricción indicaban que esta construcción contenía una mutación
en el sitio EcoRV. Para corregir esta mutación, se
reasociaron dos oligonucleótidos (OPR119 y
OPR120-2) y se ligaron en pB15 digerido con
HindIII/NheI, dando como resultado el vector, pBC1.
Para insertar secuencias que codifican los péptidos que se unen a
I-A^{d} de clase II, los oligonucleótidos se
reasociaron y se ligaron en pBC1 digerido con
AflII/NheI. El péptido Ova 323-339
(SISQAVHAAHAEINEAGR) (ID SEC Nº: 3) estaba codificado por los
oligonucleótidos OPR110 y OPR111, Ova:H331R (SISQAVHAARAEINEAGR)
(ID SEC Nº: 4) por OPR115 y OPR116, Ova A331Y (SISQAVHAAHYEINEAGR)
(ID SEC Nº: 5) por OPR117 y OPR118, y HEL 74-86
(NLCNIPCSALLSS) (ID SEC Nº: 6) por OPR140 y OPR141. Las
construcciones respectivas en la cadena principal de pBC1 se
denominaron pB16, pB24, pB37 y pB4. Estos vectores se digirieron con
EcoRV y EagI y el
péptido-conector-fragmento génico
\beta1-\beta2 resultante se subclonó en el
vector lanzadera de IgG pJW009 según se describe en el Ejemplo 2
que sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1C
El siguiente sistema se empleó para aislar el
fragmento génico
\alpha1-\alpha2-bisagra de
HLA-DR1 humano (que codifica de
aa1-192) y se representa en la Figura 4 de los
dibujos. Se elaboró RNA celular total mediante el procedimiento
descrito anteriormente a partir de 3 x 10^{6} células
BLCL-K68 obtenidas a partir de un individuo
homocigótico HLA-DR1. El RNA total se convirtió en
cDNA (20 \mul) usando Superscript-MLV Reverse
Transcriptase (GIBCO-BRL) y cebado específico para
oligo dT de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Las
reacciones de PCR iniciales se diseñaron para añadir sitios de
restricción necesarios para la clonación del fragmento génico
\alpha1-\alpha2-bisagra de
vectores de expresión bacterianos (para un trabajo que no es
relevante para esta solicitud). Las PCRs se realizaron como se
describe anteriormente, excepto que se usaron 5 \mul del cDNA de
molde, los cebadores eran DR1A-F y
DR1A-B (figura 8) y las condiciones de PCR eran 10
ciclos térmicos de 55ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1 minuto y
96ºC durante 1 minuto seguidos por 20 ciclos por etapas de 70ºC
durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto. El producto de PCR
\alpha1-\alpha2-bisagra
(aproximadamente 570 pb) se digirió con HindIII y
BamHI, se purificó en gel y se ligó en pUC18 digerido con
HindIII/BamHI, dando como resultado el vector K68A3.
Este vector (0,5 ng) servía como un molde para amplificaciones por
PCR adicionales usando oligonucleótidos AF-N y
AB-S como cebadores. El producto de PCR
\alpha1-\alpha2-bisagra
resultante se digirió con NcoI y SpeI, se purificó en
gel y se ligó en pJRS139 digerido con NcoI/SpeI,
dando como resultado el vector 39A2. Este vector servía como un
molde para que la amplificación por PCR añadiera la secuencia
conectora y los sitios de restricción y las secuencias de flanqueo
necesarios para la clonación y la expresión en los vectores de
expresión de mamífero. Las PCRs se realizaron como se describe
anteriormente, excepto que se usaron 10 ng DNA de molde de 39A2
digerido con NcoI, los cebadores eran OPR124 y OPR125 (las
secuencias de los mismos indicadas en la figura 8 de los dibujos) y
las condiciones de PCR eran 5 ciclos térmicos de 50ºC durante 1
minuto, 70ºC durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto, seguidos por
10 ciclos por etapas de 70ºC durante 1 minuto y 96ºC durante 1
minuto. El producto de PCR
\alpha1-\alpha2-bisagra
(aproximadamente 610 pb) contiene un sitio EcoRV 5' y un
sitio EagI 3' para la clonación entre el intrón líder y el
intrón de la región J del vector lanzadera de la cadena kappa de
IgG (véase la figura 9e de los dibujos). Además, el producto de PCR
tiene los sitios de corte y empalme de IgG y las secuencias líder
necesarias para la expresión apropiada de la proteína de fusión de
MHC-IgG. Los productos de PCR se digirieron con
EcoRV y EagI y se purificaron en gel. Los productos
de PCR digeridos purificados se ligaron a continuación en A19
digerido con EcoRV/EagI dando como resultado la
construcción pBS-DR1A. Este vector se digirió con
EcoRV y EagI y el fragmento génico
\alpha1-\alpha2-bisagra de
HLA-DR1 se subclonará en el vector lanzadera de IgG
pJW003 según se describe en el Ejemplo 2 que sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1D
El siguiente sistema se empleó para aislar el
fragmento génico
\beta1-\beta2-bisagra de
HLA-DR1 humano (que codifica de
aa1-198), enlazando la secuencia conectora e
insertando los oligonucleótidos que codifican los péptidos
antigénicos. Este sistema también se representa en la figura 5 de
los dibujos. Se elaboró RNA celular total mediante el procedimiento
descrito anteriormente a partir de 3 x 10^{6} células
BLCL-K68 obtenidas de un individuo homocigótico
HLA-DR1. El RNA total se convirtió en cDNA (20
\mul) usando Superscript-MLV Reverse
Transcriptase (GIBCO-BRL) y cebado específico para
oligo dT de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Las
reacciones de PCR iniciales se diseñaron para añadir sitios de
restricción necesarios para clonar el fragmento génico
\beta1-\beta2-bisagra en
vectores de expresión bacterianos (para un trabajo que no es
relevante para esta solicitud). Las PCRs se realizaron como se
describe anteriormente, excepto que se usaron 5 \mul del cDNA de
molde, los cebadores eran DR1B-F y
DR1B-B (las secuencias de esos cebadores indicadas
en la figura 8 de los dibujos) y las condiciones de PCR eran 10
ciclos térmicos de 55ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1 minuto y
96ºC durante 1 minuto, seguidos por 25 ciclos por etapas de 70ºC
durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto. El producto de PCR
\beta1-\beta2-bisagra
(aproximadamente 610 pb) se digirió con HindIII y
BamHI, se purificó en gel y se ligó en JS143.3 digerido con
HindIII/BamHI, dando como resultado el vector pB712.
Este vector (0,5 ng) servía como un molde para amplificaciones por
PCR adicionales usando oligonucleótidos BF-NN y
BB-S como cebadores. El producto de PCR
\beta1-\beta2-bisagra
resultante se digirió con NcoI y SpeI, se purificó en
gel y se ligó en pJRS139 digerido con NcoI/SpeI,
dando como resultado el vector 39B3. Este vector servía como el
molde para que la amplificación por PCR añadiera la secuencia
conectora y los sitios de restricción y las secuencias de flanqueo
necesarios para la clonación y la expresión en los vectores de
expresión de mamífero. Se usó PCR de extensión solapada para mutar
un AflII en la región \beta1 y añadir la secuencia
conectora. El vector 39B3 se digirió con AflII y SpeI
y el fragmento génico
\beta1-\beta2-bisagra de
AflII/SpeI se purificó en gel. Dos oligonucleótidos
que codifican para el conector y el principio de la región \beta1
(OPR121 y OPR122) se reasociaron, se extendieron con DNA polimerasa
de Taq dando como resultado un fragmento de 78 pb en el que
el AflII en la región \beta1 se muta sin cambiar el
aminoácido especificado. Este fragmento (5 ng) se mezcló con el
fragmento génico
\beta1-\beta2-bisagra de
AflII/SpeI (5 ng) y se llevaron a cabo extensiones de
solapamiento durante 5 ciclos térmicos de 37ºC durante 1 minuto,
70ºC durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto. Después de la
adición de los cebadores de PCR OPR119 y OPR123, se llevaron a cabo
5 ciclos térmicos de 37ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1 minuto y
96ºC durante 1 minuto y 10 ciclos por etapas de 70ºC durante 1
minuto y 96ºC durante 1 minuto. El producto de PCR
conector-\beta1-\beta2-bisagra
resultante (aproximadamente 670 pb) contiene un sitio EcoRV
5' y un sitio EagI 3' para la clonación entre el intrón líder
y el intrón de la región J del vector lanzadera de cadena pesada de
IgG (véase la figura 9F de los dibujos). Además, el producto de PCR
tiene los sitios de corte y empalme y las secuencias líder de IgG
necesarios para la expresión apropiada de la proteína de fusión de
MHC-IgG. Para permitir la clonación de las
secuencias de péptidos antigénicos, se trató mediante ingeniería un
sitio AflII en el extremo de la secuencia de señal y estaba
presente un sitio NheI al principio del conector. Los
productos de PCR se digirieron con NheI y EagI, se
purificaron en gel y se ligaron en pB16 digerido con
NheI/EagI (véase anteriormente), para intercambiar los
fragmentos génicos de la cadena \beta. El vector resultante se
denominó pBS-DR1\beta. Para insertar secuencias
que codifican los péptidos de unión de HLA-DR1 de
clase II, los oligonucleótidos se reasocian y se ligan en
pBS-DR1\beta digerido con
AflII/NheI. El péptido NP 404-415, que
tiene la secuencia QISVQPAFSVQ (ID SEC N: 7), es
codificado por los oligonucleótidos OPR128 y OPR129, y HA
307-319, que tiene la secuencia PKYVKQNTLKLAT (ID
SEC Nº: 8), es codificado por OPR130 y OPR131. Las secuencias de
OPR128, OPR129, OPR130 y OPR131 se indican en la figura 8 de los
dibujos. Las construcciones respectivas en la cadena principal de
pBS-DR1\beta se denominan
pBS-DR1\beta/NP y
pBS-DR1\beta/HA. Estos vectores se digieren con
EcoRV y EagI y el
péptido-conector-fragmento génico
\beta1-\beta2-bisagra resultante
se subclona en el vector lanzadera de IgG pJW009 como se describe
en el Ejemplo 2 que sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1E
El siguiente sistema se emplea para aislar el
fragmento génico \alpha1-\alpha2 de
I-A^{s} (que codifica de aa1 a 182). La figura 8
lista los cebadores oligonucleotídicos usados. La figura 6 de los
dibujos también representa el procedimiento. El RNA total se preparó
a partir del bazo de un ratón SJL mediante el mismo procedimiento
usado para preparar RNA de cultivos celulares. El RNA (10 \mug) se
convirtió en cDNA (50 \mul) usando MLV Reverse Transcriptase
(GIBCO-BRL) y cebado específico para \alpha2 de
acuerdo con los procedimientos del fabricante. Se realizaron PCRs
según se describe anteriormente, excepto que se usaron 6 \mul del
cDNA de molde, los cebadores eran OPR100 y OPR101 (las secuencias de
los mismos indicadas en la figura 8 de los dibujos) y las
condiciones de PCR eran 5 ciclos térmicos de 55ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 30 segundos y 96ºC durante 1 minuto,
seguidos por 20 ciclos por etapas de 72ºC durante 1 minuto y 96ºC
durante 1 minuto. El producto de PCR
\alpha1-\alpha2 inicial (aproximadamente 550 pb)
se reamplificó usando los cebadores de PCR OPR107 y OPR108 durante
5 ciclos térmicos de 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30
segundos y 96ºC durante 1 minuto, seguidos por de 10 a 15 ciclos por
etapas de 72ºC durante 1 minuto y 96ºC durante 1 minuto. El
producto de PCR \alpha1-\alpha2 resultante
(aproximadamente 590 pb) contiene un sitio EcoRV 5' y un
sitio EagI 3' para la clonación entre el intrón líder y el
intrón de la región J del vector lanzadera de la cadena kappa de
IgG (véase la figura 9C de los dibujos). Además, el producto de PCR
tiene los sitios de corte y empalme y las secuencias líder de IgG
necesarios para la expresión apropiada de la proteína de fusión de
MHC-IgG. Los productos de PCR se digirieron con
EcoRV y EagI y se purificaron en gel. Los productos
de PCR digeridos purificados se ligarán en pA19 digerido con
EcoRV/EagI (véase anteriormente) para intercambiar
las regiones de la cadena \alpha. El vector resultante,
pBS-IAS\alpha, se digiere con EcoRV y
EagI y el fragmento génico
\alpha1-\alpha2 se subclona en el vector
lanzadera de IgG pJW003 según se describe en el Ejemplo 2 que
sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1F
Se emplea la siguiente estrategia para aislar el
fragmento génico \beta1-\beta2 de
I-A^{s} (que codifica de aa1 a 189), enlazando la
secuencia líder e insertando los oligonucleótidos que codifican los
péptidos antigénicos. Este sistema también se representa en la
figura 7 de los dibujos. El RNA total de bazo de SJL (10 \mug) se
convirtió en cDNA usando MLV Reverse Transcriptase
(GIBCO-BRL) y cebado específico para \beta2 de
acuerdo con los procedimientos del fabricante. De los 50 \mul de
cDNA generados, 6 \mul se usaron como DNA de molde para PCR. Las
reacciones se llevaron a cabo como se describe anteriormente,
excepto que los cebadores oligonucleotídicos eran VW310 y OPR106
(figura 8) y las condiciones de PCR eran 5 ciclos térmicos de 62ºC
durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos y 96ºC durante 1
minuto, seguidos por 21 ciclos por etapas de 72ºC durante 1 minuto
y 96ºC durante 1 minuto. Para añadir las secuencias conectoras, el
producto de PCR \beta1-\beta2 inicial
(aproximadamente 580 pb) se reamplificó usando los cebadores de PCR
VW309 y OPR106 durante 3 ciclos térmicos de 50ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 30 segundos y 96ºC durante 1 minuto,
seguidos por 10 ciclos por etapas de 72ºC durante 1 minuto y 96ºC
durante 1 minuto. Véase la figura 8 para las secuencias de los
cebadores VW309 y OPR106. El producto de PCR de
enlazador-\beta1-\beta2
(aproximadamente 640 pb) se digirió con NheI y EagI,
se purificó en gel y se ligó en pB16 digerido con
NheI/EagI (véase anteriormente), para intercambiar
los fragmentos génicos de la cadena \beta. El vector resultante,
denominado pBS-IAS\beta contiene el conector
EcoRV/EagI -fragmento
\beta1-\beta2 necesario para la clonación entre
el intrón líder y el intrón de la región J del vector lanzadera de
la cadena kappa de IgG (véase la figura 9D de los dibujos). Para
insertar secuencias que codifican los péptidos de unión de
I-A^{s} de clase II, los oligonucleótidos se
reasocian y se ligan en pBS-IAS\beta digerido con
AflII/NheI. El péptido MBP 91-103
(HYGSLPQKSQHGR) (ID SEC Nº: 9) es codificado por los
oligonucleótidos VW315 y VW316, PLP 139-151
(HSLGKWLGHPDKF) (ID SEC Nº: 10) por VW313 y VW314 y MBP
1-14 (MASQKRPSQRSKYL) (ID SEC Nº: 11) por VW317 y
VW318. Las secuencias de esos oligonucleótidos se indican en la
figura 8 de los dibujos. Las construcciones respectivas en la
cadena principal de pBSI-AS\beta se denominan
pBS-IAS\beta/MBP91,
pBS-IAS\beta/PLO y
pBS-IAS\beta/MBP1. Estos vectores se digieren con
EcoRV y EagI y el
péptido-conector-fragmento génico
\beta1-\beta2 resultante se subclona en el
vector lanzadera de IgG pJW009 como se describe en el Ejemplo 2 que
sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El siguiente procedimiento incluye la expresión
de moléculas solubles de MHC clase II/inmunoglobulina conectadas a
péptido, como proteína quimérica. El objetivo es construir una
molécula similar a un anticuerpo que tenga un dominio constante de
kappa más la región de la cadena \alpha de la del MHC clase II y
el dominio constante de IgG2b de múrido empalmado a la cadena
\beta del MHC clase II conectada covalentemente a péptidos de
interés. Estas construcciones se clonan a continuación en vectores
de expresión de mamíferos separados y se usan para transfectar
líneas celulares derivadas de linfomas, es decir J558.
Dos vectores de expresión de mamífero usados
comúnmente se modificaron de modo que las construcciones quiméricas
pudieran clonarse y expresarse. Los vectores originales son
descritos por Near y otros, Molecular Immunology
27:901-909 (1990). La figura 10A de los dibujos
muestra el vector de expresión de cadena ligera pSVneoKappa
26-10 de 11,7 Kb que contiene pBR322 como cadena
principal y el gen de resistencia a la neomicina. Por otra parte,
tiene un trozo de 6,7 Kb de DNA de kappa de la línea germinal, que
se clonó inicialmente como DNA genómico en lambda. Un fragmento
EcoRI-XbaI de 2,7 Kb contiene el promotor y el
estimulador de kappa de Ig, la secuencia líder y su intrón, el exón
de la región variable redispuesto con JK1, los restantes exones e
intrones de JK, y parte del intrón principal que separa la región
variable de la región constante de kappa según se muestra en la
figura 11A de los dibujos.
La cadena \beta conectada a péptido más la
región constante de inmunoglobulina IgG2b se ha clonado en pSVgptHC
26-10 denominado pJW010. Este vector celular de
mamífero fue descrito originalmente por Mulligan y otros (Science
209:1422-1427, 1980); y más tarde por Near y otros,
anteriormente. Brevemente, pSVgptHC 26-10, mostrado
en la figura 10B de los dibujos, tiene 10 Kb y contiene el gen de
xantina-guanina fosforribosiltransferasa (gpt) de
E. coli bajo el control del promotor primario de SV40. El
dominio constante de IgG2b de múrido de la línea germinal se clonó
en pSVgpt como un fragmento BglII/XbaI. Otro cambio
con respecto al vector elaborado por Near y otros, anteriormente,
era la clonación de un trozo EcoRI-XbaI de 0,7 Kb que
contiene el promotor/estimulador de la cadena pesada de Ig. Estos
cambios dejan al vector pSVptgHC 26-10 con un sitio
de clonación XbaI que era usado para clonar un fragmento
XbaI de 1,7 Kb por Near y otros. Este inserto de 1,7 Kb
contiene una secuencia líder de la cadena pesada de Ig y su intrón,
el exón variable conectado al dominio JH4, y parte del intrón
principal que reside entre la región V y la región C. Por otra
parte, el fragmento de 1,7 Kb es del DNA de secuencia diana que se
ha mutado. En resumen, para efectuar la clonación de las cadenas
\alpha y \beta tienen que completarse varias mutaciones posibles
en los fragmentos de 2,7 Kb y 1,7 Kb según se describe
posteriormente.
La estrategia para preparar el vector pJW004
para la clonación y la expresión del gen de la cadena \alpha era
elaborar dos mutaciones de sitio dentro del inserto de 2,7 kb y se
describe en la figura 11A. Una muestra de pJW004 se ha depositado
en the American Type Culture Collection (ATCC), Rockland, Maryland,
EE.UU. de A. y ha recibido el número ATCC 75832. Se creó un sitio
EcoRV en ocho nucleótidos 5' de la región variable de kappa
mientras que se añadió un sitio EagI en ocho nucleótidos 3'
del dominio JK1. Estas mutaciones permitirían la clonación
direccional del gen \alpha del MHC clase II en el vector para la
expresión de la molécula de fusión de cadena \alpha/región
constante de kappa. Se usó mutagénesis dirigida al sitio mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para añadir estos dos
sitios de restricción, y los cebadores y las etapas llevadas a cabo
para hacer estos cambios se muestran en la figura 12 de los dibujos.
El trozo de 2,7 kb de DNA se clonó desde pUC19 en M13 mp18 como un
fragmento de EcoRI-XbaI que se linealizó con
EcoRI y se usó como molde (5 ng/100 \mul de mezcla) en las
reacciones de PCR. El inserto de 2,7 Kb se dividió en tres
fragmentos de PCR diseñando cebadores que amplificarían
específicamente tres productos de PCR de diferentes longitudes, que
incluían un fragmento de EcoRI a EcoRV de 0,8 Kb, un
fragmento de EcoRV a EagI de 0,4 Kb y un fragmento de
EagI a XbaI de 1,5 Kb. Los cebadores de PCR usados
para amplificar cada fragmento se resumen y la secuencia subrayada
corresponde al sitio de la endonucleasa de restricción. Se usaron
cebadores PMC 120 [5'GCAGAAGAATTCGAGCTCGGCCCCCAG3'] (ID SEC
Nº: 12), que contiene un sitio EcoRI, y PMC 108
[5'GATGATATCAGAGAGAAATACATACTAACACAC3'] (ID SEC Nº: 13), que
contiene un sitio EcoRV, para amplificar el producto de 0,4
Kb, mientras que se usaron los cebadores PMC 100
[5'CGGAAGAAAGAGACTTCGGCCGCTACTTAC3'] (ID SEC Nº: 14), que
contiene un sitio EagI, y PMC 102
[5'GTGTGTTAGTATGTATTTCTCTCTGATATCTTCAGCTTCCAGCAGTG3'] (ID
SEC Nº: 15), que contiene un sitio EcoRV, para la PCR del
fragmento de 0,4 Kb. El trozo final que ha de amplificarse tenía
1,5 Kb de longitud y se amplificó usando los cebadores PMC 99
[5'TCTTCTAGAAGACCACGCTAC3'] (ID SEC Nº: 16), que contiene un
sitio XbaI, y PMC 107
[5'GATGATARCCGGCCGAAGTCTCTTTCTTCCGTTGTC3'] (ID SEC Nº: 17),
que contiene un sito EagI. Se realizaron dos reacciones de
PCR de solapamiento con los tres productos de PCR para construir el
inserto de 27 Kb mutado. La primera PCR de solapamiento daba como
resultado la amplificación de un producto de 1,2 Kb usando los
cebadores PMC 100 y PMC 120 y los fragmentos de 0,8 Kb y 0,4 Kb. Se
realizó una segunda reacción de PCR de solapamiento usando el DNA de
1,2 Kb purificado en gel y el trozo de 1,5 Kb y los cebadores PMC
99 y 120. A partir de esta reacción, se produjo un fragmento de 2,7
Kb que posteriormente se digirió con EcoRI y XbaI y se
clonó en pUC19. El DNA de las mezclas de reacción de ligación se
transformó en células DG101 y 36 colonias se recogieron y se
rastrearon mediante digestos dobles usando las enzimas
EcoRV-EagI.
Después de detectar varios clones positivos
mediante elaboración de mapas de restricción, se eligieron tres
clones para la secuenciación. Usando los cebadores PMC 33, 77, 111 y
114 (las secuencias de esos cebadores se indican en la figura 14 de
los dibujos), se obtuvieron 900 pb de datos de secuencia. Se
encontró que la región donde la secuencia era correcta incluía 400
pb de DNA entre los sitios EcoRV y EagI y 300 pb 5'
del sitio EcoRV y 200 pb 3' del sitio EagI. Un clon,
pJW001, tenía una buena secuencia que era diferente de la secuencia
de consenso en 5 bases. Una observación perturbadora hecha después
de elaborar el mapa de restricción y de revisar los datos de la
secuencia generados usando cebadores universales M13 era que el DNA
de inserto clonado en pUC19 y transformado en DG101 se suprimía.
Estas secuencias suprimidas planteaban un problema ya que se
suprimía mucha maquinaria de transcripción junto con el intrón
principal situado entre el sitio EagI y XbaI. Para
salvar el trozo de DNA que contenía los sitios mutados, EcoRV
y EagI, el inserto del clon Nº 12 se digirió con dos
cortadores únicos, NcoI y BsmI. El sitio NcoI está situado
aproximadamente 300 pb 5' del sitio EcoRV, y un sitio BsmI
está presente aproximadamente 200 pb 3' del sitio EagI. Por
lo tanto, como se observa en la figura 13 de los dibujos, el trozo
NcoI-BsmI de 0,9 Kb se cortó de pJW001 y se clonó
en el inserto pUC19/kappa 26-10 que no tenía los
sitios EcoRV y EagI pero sí tenía los sitios únicos
NcoI y BsmI. Para confirmar que el inserto de tamaño correcto se
había clonado en pJW002, se digirió una parte alícuota de DNA de
pJW002 con tres pares diferentes de enzimas de restricción,
EcoRI-XbaI, NcoI-BsmI y
EcoRV-EagI.
Para evitar que se produzcan de nuevo casos de
recombinación, la cepa de E. coli se cambió de DG101 a
XL1-B, un huésped negativo a recA. En esta etapa,
el DNA del inserto contenía las dos mutaciones de sitio y la
clonación del gen \alpha del MHC clase II podía proceder.
El DNA de pJW002 se digirió con EcoRV y
EagI, se desfosforiló con fosfatasa alcalina intestinal de
ternero (CIAP) y a continuación se purificó en gel. El DNA de vector
aislado se usó a continuación en ligaciones con el gen
I-A^{d} de la cadena \alpha cortado con
EcoRV-EagI de 577 pb purificado en gel. La ligación,
la transformación y el rastreo de 10 colonias daban un solo clon
positivo que se digería con dos pares de enzimas,
EcoRI-XbaI y EcoRV-EagI. El clon
positivo, pJW003 (kappa mutada con pUC19 que contiene el gen
\alpha), se hizo crecer y el DNA se purificó con
Qiagen.
Qiagen.
Se realizó un digesto triple de DNA de pJW003
usando EcoRI, XbaI y HindIII. El DNA cortado se
trató a continuación con fenol-cloroformo, se
precipitó con etanol y se lavó con etanol al 70% después de lo cual
el DNA se digirió con ScaI y se trató con CIAP. El DNA de
pUC19 migra en 2,7 Kb sobre un gel de agarosa, lo que hace difícil
separar pUC del DNA del inserto deseado. Sin embargo, pUC19 tiene un
sitio ScaI único que corta y da dos fragmentos de tamaño
inferior que pueden separarse en un gel de agarosa del DNA del
inserto de 2,9 Kb. Después de la purificación en gel, el inserto del
gen I-A^{d} de \alpha de 2,9 Kb se ligó en
vector pSVneo purificado en gel con EcoRI-XbaI para
elaborar pJW004 (figura 16A). Las ligaciones se transformaron en
DG103. Se realizaron maxi-preparaciones de Qiagen
para aislar grandes cantidades de DNA de vector de modo que el
pJW004 pudiera transfectarse en células de
mamífero.
mamífero.
La estrategia para clonar el gen variable
\beta de MHC en el vector de expresión pSVgpt era elaborar cuatro
mutaciones dentro del trozo XbaI de 1,7 Kb descrito en la
figura 11B. Las cuatro mutaciones incluían dos deleciones de sitio
EcoRV, unp situado 68 nucleótidos 5' del exón de la secuencia
líder y el otro sitio situado 27 nucleótidos 5' de la región
variable. Las otras dos mutaciones eran adiciones de sitio e
implicaban un sitio EcoRV ocho nucleótidos 5' de la región
variable y un sitio EagI ocho nucleótidos 3' del dominio
JH4. Se usó mutagénesis dirigida al sitio de M13 para elaborar las
mutaciones en el inserto de 1,7 Kb. El sistema era subclonar el
fragmento XbaI de 1,7 Kb de pSVgptHC26-10 y
clonarlo en M13. Se realizó mutagénesis dirigida al sitio usando
the BioRad Muta-Gene in vitro Mutagenesis Kit
que se basa en el método altamente eficaz y simple de Kunkel. Este
método emplea una cepa de E coli especial que es deficiente
para dUTPasa (dut) y
uracil-N-glicosilasa (ung). Estas
deficiencias permiten sustituciones aleatorias de timina por uracilo
en el ssDNA de M13. Cuando el DNA de doble hebra, o la forma
replicativa (RF), se transforma de nuevo en una cepa huésped de
tipo salvaje, la
uracil-N-glicosilasa degrada los
uracilos presentes en el molde original de modo que sólo la hebra
de DNA que tiene la mutación específica de sitio se replica
generando de ese modo una alta eficacia de clones positivos.
Las etapas empleadas para elaborar las
mutaciones se muestran en la figura 16. Brevemente, se usó el
cebador PMC 26 [5'CAGGGTGATC AACACCCTGAAAAC3'] (ID SEC Nº:
18) para suprimir el sitio EcoRV situado 68 nucleótidos 5'
del exón de la secuencia líder, y contenía un solo cambio de base,
indicado por el nucleótido subrayado, de A por T. La supresión del
segundo sitio EcoRV 27 nucleótidos 5' de la región variable
se realizó con el cebador PMC 28 [5'GTCACAGTTATCCACTCTGTC3']
(ID SEC Nº: 19) y de nuevo era un cambio de mutación puntual simple
de A por T. El cebador PMC 96
[5'CCGTCTCCTCAGGTACGGCCGGCCTCTCCAGGTCTTCG3'] (ID SEC
Nº: 20) contenía la mutación del sitio EagI, que consistía
en cuatro cambios de bases indicados por los nucleótidos subrayados.
Finalmente, el cebador PMC 97
[5'CACAGTTATCCACTCTGTCTTTGATATCACAGGTGTCCT3'] (ID SEC Nº: 21)
se usó para crear el sitio EcoRV cambiando cuatro
nucleótidos según se muestra.
El inserto de 1,7 Kb mutado se digirió a
continuación con EcoRV-EagI, se trató con CIAP, se
purificó en gel y se usó en ligaciones con el gen \beta del MHC
clase II purificado en gel, cortado con EcoRV-EagI.
Otras variantes, tales como Ova 323-339/fragmento
génico \beta1-\beta2 de
I-A^{d} descrita en el Ejemplo 1 anteriormente,
también se clonaron en el sitio EcoRV-EagI y se
hicieron crecer en M13. La figura 15 de los dibujos describe la
estrategia para clonar la variable \beta del MHC clase II y
variantes en el vector pJW009. Después de clonar en pJW009, el DNA
se digirió con XbaI para separar los fragmentos de
XbaI que contienen los diversos genes variables de \beta
conectados a péptido y se subclonó en el vector de expresión de
mamífero pJW010 según se muestra en la figura 16B. Puesto que no era
posible la clonación direccional, se realizó el rastreo de clones
positivos digiriendo con EcoRI-EcoRV. Se han aislado
clones positivos que contienen los genes \beta y otras variantes
de la cadena \beta conectadas a péptidos y el DNA se ha
purificado con Qiagen. Estos se han denominado pHB27, pHB310, pHB412
y pHB58 para la construcción de la cadena \beta de
I-A^{d} que no contiene péptido, o que contiene el
péptido Ova 323-339, el péptido Ova:H331R y el
péptido Ova:A331Y, respectivamente (véase el Ejemplo 1B). Se han
depositado muestras de pHB27, pHB310, pHB412 y pHB58 en the
American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU.
de A. y han recibido los números ATCC 75833, 75835, 75836 y 75834,
respectivamente.
La transfección de células derivadas de linfoma
tales como células J558 y NSO puede hacerse esencialmente como se
describe por Near y otros. Pueden co-transfectarse
20 \mug tanto de pJW004 como de pJW010 en células J558 o NSO
mediante electroporación usando el impulsor génico BioRad. Se
seleccionan líneas celulares estables en de 7 a 10 días. La
expresión de la molécula quimérica de MHC claseII/Ig de la invención
se determina mediante un ELISA específico para detectar la región
constante de IgG2b de múrido y/o puede realizarse un análisis por
transferencia Western. Finalmente, la proteína expresada se purifica
mediante cromatografía de afinidad de Proteína A o
G.
G.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se construyen adecuadamente vectores capaces de
co-expresar las moléculas de la cadena \alpha de
I-A^{d} de longitud completa y la cadena \beta
de I-A^{d} conectada a péptido mediante los
procedimientos esbozados en la figura 17 de los dibujos. Para
aislar la cadena \alpha de I-A^{d} de longitud
completa, se convirtió RNA total de A20 (5 \mug) en cDNA usando
Superscript-MLV Reverse Transcriptase
(GIBCO-BRL) y cebado específico para TM de la
cadena \alpha de acuerdo con los procedimientos del fabricante.
Este cDNA se usó como el molde para la amplificación por PCR usando
un cebador OPR136 específico para el líder de la cadena \alpha (la
secuencia de ese cebador se indica en la figura 8) y un cebador
OPR139 específico para TM de la cadena \alpha (la secuencia de
ese cebador se indica en la figura 8) mediante las condiciones de
PCR descritas en el Ejemplo 1 anterior. El producto de PCR
resultante tiene aproximadamente 800 pb y contiene un sitio
XmaI 5' y un sitio EcoRI 3' para la clonación entre
el promotor de CMV y sitios poli-A de SV40 del
vector de expresión de mamífero PEE13 (Celltech). Además, este
fragmento tiene una secuencia de consenso de Kozak para la
iniciación eficaz de la traducción (véase la figura 18A de los
dibujos). El producto de PCR se digirió con XmaI y
EcoRI, se purificó en gel y se ligó en PEE13 digerido con
XmaI/EcoRI, para dar el vector
PEE-IA^{d}\alpha. El fragmento de cadena
\beta conectado a péptido, de longitud completa, se construyó
insertando las secuencias líder y TM en los vectores péptido Ova
323-339 y HEL
74-86-conector-\beta1-\beta2
(pB16 y pB4, respectivamente), descritos en el Ejemplo 1
anteriormente. Se convirtió RNA total de A20 (5 \mug) en cDNA
usando Superscript-MLV Reverse Transcriptase
(GIBCO-BRL) y cebado específico para oligo dT o
específico para TM de la cadena \beta de acuerdo con los
procedimientos del fabricante. Estos cDNAs se usaron como el molde
para amplificaciones por PCR usando un par de cebadores específicos
para el líder de la cadena \beta (OPR132/OPR133) (las secuencias
de esos cebadores se indican en la figura 8 de los dibujos) o un par
de cebadores específicos para TM de la cadena \beta
(OPR134/OPR135) (las secuencias de esos cebadores se indican en la
figura 8 de los dibujos). El producto de PCR líder de \beta de
100 pb contiene sitios HindIII y XmaI 5' y un sitio
AflII 3' para clonar en los vectores péptido pBC1 y
pB16-conector-\beta1-\beta2.
La inclusión del sitio AflII cambia los dos últimos
aminoácidos del líder de la cadena \beta de
I-A^{d} por los encontrados en el líder de IgG.
El producto de PCR del líder de \beta se digirió con
HindIII y XmaI, se purificó en gel y se ligó en pB16
digerido con HindIII/AflII, para dar pDM21. El
producto de PCR de TM de \beta de 180 pb contiene un sitio
BstXI 5' y sitios XmaIII y EcoRI 3' para clonar
en pDM21. El producto de PCR de TM de \beta se digirió con
BstXI y EcoRI, se purificó en gel y se ligó en pDM21
digerido con BstXI/EcoRI, para dar el vector
pIA^{d}\beta/OVA, pVW229. El oligonucleótido del péptido Ova se
intercambió con el oligonucleótido del péptido HEL descrito en el
Ejemplo 1 anteriormente para generar el vector
pIA^{d}\beta/HEL. Estos vectores se digirieron con XmaI y
EcoRI para generar los fragmentos génicos de la cadena
\beta conectados a péptido, de longitud completa, para la
clonación entre el promotor de CMV y sitios poli-A
de SV40 del vector de expresión de mamífero PEE6 (Celltech). Estos
fragmentos también tienen la secuencia de consenso Kozak para la
iniciación eficaz de la traducción (figura 18B). Los vectores
resultantes PEE-IA^{d}\beta/OVA y
PEE-IA^{d}\beta/HEL se digirieron con
BglII y BamHI. Los fragmentos de promotor de
CKMB/péptido-cadena \beta se purificaron en gel y
se ligaron en PEE-IA^{d}\alpha digerido con
BamHI, para generar los vectores de expresión finales
PEE-IA^{d}/OVA y PEE-IA^{d}/HEL.
También se construyó y usó como control un vector sin ningún
oligonucleótido peptídico,
PEE-IA^{d}.
PEE-IA^{d}.
Para clonar los genes B7-1 y
B7-2, pueden generarse cDNAs a partir de RNA total
aislado de células de bazo de ratón activadas o de líneas de
células de linfoma de ratón. Estos cDNAs sirven como moldes para la
amplificación por PCR usando cebadores específicos para
B7-1 o B7-2. Los productos de PCR
generados tienen sitios NotI 5' y 3' para la clonación entre
el promotor de CMV y sitios poli-A de SV40 de vector
de expresión de mamífero pCMV\beta (Clonetech). Estos fragmentos
también tienen la secuencia de consenso Kozak para la iniciación
eficaz de la traducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4-11
Se emplean adecuadamente uno o más de varios
sistemas de ensayo para probar la capacidad de los complejos de
fusión del MHC solubles de la invención para modular la actividad de
células T y se ejemplifican en los ejemplos que siguen. Se sabe que
en un primer ensayo ejemplar, una molécula de fusión de
I-A^{d} del MHC clase II/Ig de ratón se conecta a
un péptido antigénico de lisozima de huevo de gallina (HEL
74-86), ovalbúmina de pollo (Ova
323-339) o uno de dos análogos de una sola
sustitución del péptido Ova-Ova H331R u Ova A332Y.
Los péptidos HEL 75-86, Ova 323-339
y Ova H331R se unen a I-A^{d} mientras que el
análogo Ova 332Y servirá como un control de ausencia de unión
[Buus, S. y otros (1987) Science 235: 1353-1358;
Sette, A. y otros (1987) Nature 328:395-399]. Se
cree que la His_{331} no es importante para la unión al MHC pero
es crítica para la estimulación de células T y el complejo Ova
H331R/I-A^{d}/Ig servirá como un antagonista de
TcR para la estimulación de células T. El hibridoma de células T DO
11.10 de ratón reconoce específicamente el complejo Ova
323-339/1-A^{d} y se estimula para
producir IL-2. El ensayo, esbozado en el Ejemplo 4
posterior, usa el Ova
323-339/I-A^{d}/Ig soluble para
suprimir la estimulación de células T por APCs cargadas con el
péptido Ova. Efectos adicionales de las moléculas solubles de MHC
conectado a péptido/Ig sobre la proliferación de células T
específicas para Ova se examinan en el Ejemplo 5. Además, los
efectos del Ova 323-339/I-A^{d}/Ig
soluble y
HEL-74-86/I-A^{d}/Ig
soluble sobre la función de células T in vivo pueden
examinarse como se describe en los Ejemplos 6 y 7. Los ratones se
inyectan con los péptidos antigénicos HEL y Ova (conectados al
portador KLH) y las moléculas Ova
323-339/I-A^{d}/Ig soluble o HEL
74-86/I-A^{d}/Ig soluble. La
inhibición de respuestas de anticuerpos dependientes de células T
in vivo y la proliferación de células T específicas para Ova
y células T específicas para HEL se caracterizarán como se describe
en los Ejemplos 6 y 7.
Un modelo adicional se ejemplifica mediante un
ensayo que implica conectar un péptido de la nucleoproteína de la
influenza (NP 404-415) a las moléculas humanas de
HLA-DR1 de clase II/Ig (véase el Ejemplo 5). Las
moléculas NP 404-415/DR1/Ig solubles se analizan con
respecto a su capacidad para inhibir la proliferación dependiente
de APC/NP 404-415 de una línea de células T humanas,
K68-36. Las moléculas de DR1/Ig solubles conectadas
a un péptido que se une a HLA-DR1 diferente (HA
307-319) se usan como un control negativo.
En un sistema modélico adicional, se examina la
capacidad de moléculas solubles del MHC conectado a péptido/Ig para
suprimir la autoinmunidad. Como un modelo animal para la esclerosis
múltiple, los ratones SJL pueden inducirse para que desarrollen
encefalomielitis alérgica experimental (EAE) después de la
inmunización con proteínas o péptidos encefalitogénicos o después
de la transferencia adoptiva de células T_{H} específicas para
estos antígenos. Según se describe posteriormente, las regiones
encefalitogénicas de la proteína básica de la mielina (MBP
91-103) y de la proteolipoproteína (PLP
139-151) están conectadas cada una a la molécula de
I-A^{s} de clase II/Ig de ratón. El péptido MBP
1-14 que no se une sirve como un control negativo.
Las moléculas solubles de I-A^{s} conectado a
péptido/Ig se administran a ratones inducidos para la EAE. La
capacidad para reducir la incidencia y la gravedad de la EAE se
determina según se describe en el Ejemplo 8 que sigue. Además, los
efectos inmunosupresores de análogos de PLP antagonistas de TcR
conectados a moléculas I-A^{s} de longitud total
en ratones inducidos hacia la EAE pueden examinarse en este sistema.
Los complejos de péptido/MHC se producirán en el músculo después de
la inyección con DNA que tiene las construcciones génicas
apropiadas, según se describe en el Ejemplo 11 que sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Un ensayo de acuerdo con la invención implica el
uso de un hibridoma de células T de múrido, DO 11.10 [Shimonkevitz,
R. y otros (1983) J. Exp. Med. 158:303] que expresa sobre su
superficie un receptor de células T específico para un fragmento
peptídico de 21 aminoácidos (aa 323-339) derivado de
ovalbúmina de huevo de pollo (Ova). Este péptido puede presentarse
a DO 11.10 sólo mediante células que presentan antígeno (APC) que
expresan la molécula de MHC clase II de múrido
I-A^{d}. Cuando el péptido es presentado por la
APC apropiada, las células DO 11.10 responden produciendo
IL-2, que puede ensayarse a continuación como una
medida de la activación de células T. La línea celular a emplear
para presentar el antígeno es A20.1-11 [Kim, K. y
otros (1979) J. Immunol. 122: 549], que expresa
I-A^{d} sólo en su superficie. Brevemente, las
células A20.1-11 se incuban en presencia del
fragmento peptídico hasta que sus moléculas de
I-A^{d} se saturan (aproximadamente 3 horas) con
péptido y a continuación se lavan para retirar el péptido no unido.
Las células DO 11.10 se incuban con o sin las moléculas solubles de
MHC conectado a péptido/Ig durante 3 horas (o más) y a continuación
se lavan intensamente para retirar la proteína no unida. Según se
describe en el Ejemplo 1 anterior, los péptidos conectados a la
cadena \beta de I-A^{d} incluyen Ova
323-339, uno de dos análogos de una sola sustitución
del péptido Ova-Ova H331R u Ova 332Y, o un péptido
de lisozima de huevo de gallina (HEL 74-86). Se sabe
que los péptidos Ova 323-339, Ova H331R, HEL
74-86 se unen a I-A^{d} mientras
que el análogo Ova A322Y servirá como un control que no se une
[Buus, S. y otros (1987) Science 235: 1353-1358;
Sette, A. y otros (1987) Nature 328:395-399]. El
péptido HEL 74-86 sirve como un control negativo no
específico. APC impulsadas por antígenos se incuban a continuación
con el hibridoma de células T DO 11.10 tratado (2 x
10^{5}/pocillo) durante 24 horas a 37ºC en una atmósfera de
CO_{2} al 5%. Los cultivos se llevan a cabo en medio de cultivo
completo (RPMI 1640 complementado con FBS al 10%,
penicilina/estreptomicina, L-glutamina y
2-mercaptoetanol 5 x 10^{5} M) en placas de
microvaloración de fondo plano de 96 pocillos. Después de 24 horas,
el sobrenadante de cultivo se ensaya con respecto a la presencia de
ELISA usando la línea de células T de múrido dependiente de
IL-2, CTLL-2.
Se preparan varias diluciones de dos veces de
cada sobrenadante de cultivo en medio completado en placas de
microvaloración de fondo plano y se añaden 1 x 10^{4} células
CTLL-2 a cada pocillo. Después de 16 a 20 horas los
pocillos de control negativos (CTLL-2 cultivadas con
medio sólo) y los pocillos de control positivos (células
CTLL-2 cultivadas con rIL-2) se
examinan microscópicamente y, en el punto en el que las células de
control negativo están muertas en un 90%, mientras las células de
control positivo todavía proliferan activamente, se añade MTT (2
mg/ml; 25 \mul/pocillo) y las placas se devuelven a la incubadora
durante 4 horas adicionales. En este momento, los cristales azules
formados por MTT en células que se metabolizan activamente se
disolverán mediante la adición de 150 \mul por pocillo de HCl 0,4
N en isopropanol por pocillo. Después de la mezcladura cuidadosa,
se determina la D.O. a 562 nm usando un lector de placas de ELISA
(Ceres-UV900HI). La concentración de
IL-2 en pocillos experimentales puede determinarse
mediante extrapolación de una curva estándar de IL-2
y a continuación puede compararse la IL-2 de
cultivos que no contienen proteína recombinante con aquéllos que
contienen las moléculas que han de probarse y puede calcularse un
índice de inhibición.
Se cree que se prefiere el uso de una dosis de
antígeno y números de APC que dan respuestas ligeramente submáximas
de antígeno peptídico y células que presentan antígeno para la
activación de DO 11.10 para detectar la inhibición del sistema por
moléculas de proteínas recombinantes. En vista de lo mismo, los
experimentos, preferiblemente, se efectúan al menos inicialmente
con condiciones de impulsos de antígeno peptídico de 100 \mug/ml y
10 \mug/ml y con concentraciones de APC de 0,5 x 10^{5}/pocillo
y 0,1 x 10^{5}/pocillo.
Moléculas solubles de MHC conectado a péptido/Ig
se prueban con respecto a su capacidad para bloquear este sistema a
lo largo de un intervalo de concentraciones de
10^{-12}-10^{-6} M. La prueba se realiza
adecuadamente con una relación molar de aproximadamente 10:1 a 1:1
entre las moléculas solubles de MHC conectado a péptido/Ig y el MHC
Clase II expresado sobre 0,5 x 10^{5} ó 0,1 x 10^{5} células
A20.1-11. Las concentraciones se ajustan según sea
necesario dependiendo de los resultados de experimentos
preliminares. Una disminución en la producción de
IL-2 de DO 11.10 después de la preincubación con las
moléculas solubles Ova
323-339/I-A^{d}/Ig u Ova
H331R/I-A^{d}/Ig en comparación con la
preincubación con moléculas de Ova
A332Y/I-A^{d}/Ig o HEL
74-86/I-A^{d} o sin preincubación
indicará que las moléculas solubles de MHC conectado a péptido
pueden suprimir las respuestas inmunitarias de una manera
específica para el péptido.
Este mismo ensayo también puede usarse para
identificar péptidos que funcionan como un antagonista o un agonista
parcial de TcR según se analiza anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Un ensayo adicional de acuerdo con la invención
examina si las moléculas solubles de MHC conectado a péptido/Ig son
capaces de suprimir respuestas inmunitarias en células T aisladas de
ratones o seres humanos (en vez del hibridoma de células T descrito
en el Ejemplo 4 anterior).
El hibridoma de células T DO 11.10 está
parcialmente activado y no requiere señales
co-estimulantes para la activación completa. Por
otra parte, las células T_{H} no transformadas aisladas de ratones
inmunizados requieren tanto una señal de péptido/MHC como señales
co-estimulantes para proliferar en cultivo. Este
sistema se usará como una medida sensible de los efectos de las
moléculas solubles de MHC conectado a péptido/Ig sobre respuestas
de células T_{H}. Se obtendrán células T cebadas con Ova a partir
de ratones BALB/c (MHC Clase II: I-A^{d})
inmunizando con 50 \mug de Ova
323-339-KLH en adyuvante completo de
Freund, subcutáneamente en la base de la cola. Se realizarán dos
inmunizaciones a intervalos de 7 días y, una semana después de la
segunda inyección, los ratones se sacrificarán y los nódulos
linfáticos inguinales y paraaóritcos se retirarán y se convertirán
en una suspensión de células simples.
La suspensión se agota de células que presentan
antígeno mediante incubación sobre lana de nailon y columnas
Spehadex G-10, y las poblaciones de células T
resultantes se incuban con medio de Click solo o con moléculas
solubles de MHC conectado a péptido/Ig disueltas en medio de Click.
Las células T se cultivan con las moléculas solubles de MHC
conectado a péptido/Ig (según se describe en el Ejemplo 4
anteriormente) durante 3 horas antes del lavado y la iniciación del
ensayo de proliferación, sin embargo este período de tiempo puede
incrementarse hasta 24 horas si es necesario.
Se usan células B activadas de ratones BALB/c
como células que presentan antígeno en el ensayo de proliferación.
Las células B se preparan cultivando células de bazo con 50
\mug/ml de LPS durante 48 y 72 horas, tiempo en el cual las
células activadas se aislarán mediante centrifugación con gradiente
de densidad sobre Lymphoprep. Las células B activadas se someten a
continuación a impulsos con péptido de ovalbúmina durante 3 horas,
se lavan intensivamente, se fijan con paraformaldehído para inhibir
la proliferación de células B, y se añaden a células T
purificadas.
\newpage
\global\parskip0.980000\baselineskip
El ensayo de proliferación se lleva a cabo en
placas de microvaloración de fondo redondo de 96 pocillos a 37ºC,
CO_{2} al 5%, durante 3-5 días. Los pocillos se
someten a impulsos con 1 \muCi de ^{3}H-timidina
durante 18 horas antes de la terminación de los cultivos y se
recogen usando un recogedor de células Skatron. La incorporación de
^{3}H-timina en DNA como una medida de la
proliferación de células T se determina usando un espectrómetro de
centelleo de líquidos LKB. Una disminución en la proliferación de
células T después de la preincubación con las moléculas solubles
Ova 323-339/I-A^{d}/Ig, en
comparación con la preincubación con moléculas Ova
A332Y/I-A^{d}/Ig o HEL
74-86/I-A^{d}/Ig o sin
preincubación, indica que las moléculas solubles de MHC conectado a
péptido/Ig pueden suprimir respuestas inmunitarias de una manera
específica para el péptido.
La medida de las concentraciones de
IL-2 en pocillos que contienen células T que
proliferan a las 24 y 48 horas puede ser una buena alternativa para
llevar a cabo el ensayo de proliferación de 3 a 5 días. Experimentos
iniciales implican la comparación de estos dos sistemas para
determinar qué sería más sensible para la detección de la
inhibición. Debido a que la detección de IL-2 mide
un caso de activación previo, puede resultar ser más útil en esta
situación.
Experimentos iniciales llevados a cabo antes de
la prueba de las moléculas solubles de MHC conectado a péptido
determinarán los parámetros óptimos para estos sistemas, es decir,
las concentraciones supramáxima, máxima y submáxima de antígeno
peptídico para someter a impulsos células que presentan antígeno,
las dosificaciones óptima y subóptima de APC/pocillo, y la duración
óptima del ensayo de proliferación (3-5 días) o el
ensayo de producción de IL-2. Según se analiza
anteriormente, se cree que el sistema será más sensible a la
inhibición con proteínas recombinantes a un nivel subóptimo de
activación de células T, de modo que se eligen preferiblemente
tales condiciones para los experimentos iniciales.
También se examinarán los efectos de moléculas
solubles de MHC de clase II humano conectado a péptido/Ig sobre la
proliferación de células T humanas estimuladas por antígeno. Pueden
producirse moléculas solubles de HLA-DR1/Ig
enlazadas covalentemente a la proteína nuclear de influenza NP
404-415 o la proteína de hemaglutinina de influenza
HA 307-318 según se describe en los Ejemplos 1 y 2
anteriormente. Se sabe que ambos péptidos se unen a las moléculas
de HLA-DR1. Un clon de células T humanas específico
para NP 404-415/DR1, K68-36, se
usará para probar los efectos de la preincubación de las moléculas
solubles de MHC conectado a péptido/Ig sobre la incorporación de
^{3}H-timidina estimulada por APCs cargadas con NP
404-415 (células BLCL-K68; células B
transformadas con EBV del mismo donante), según se describe
anteriormente. De nuevo una disminución en la proliferación de
células T después de la preincubación con las moléculas solubles de
NP 404-415/DR1/Ig, en comparación con la
preincubación con moléculas de HA 307-318/DR1/Ig o
sin preincubación, indicará que las moléculas solubles de MHC
conectado a péptido/Ig pueden suprimir respuestas inmunitarias
humanas de una manera específica del péptido.
Estos ensayos también pueden emplearse para
indicar si un péptido puede funcionar como un antagonista o un
agonista parcial de TcR según se analiza anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Según se analiza anteriormente, se ha observado
que los complejos de péptido-MHC sobre la superficie
de APCs sólo inducirán la expansión clonal de una línea de células
T reactivas específica para el péptido unido al MHC si las APCs
también aportan señales co-estimulantes. En ausencia
de señales co-estimulantes aportadas por las APCs,
estas células T_{H} reactivas particulares inducirán un estado de
anergia.
Para probar si las moléculas solubles de MHC
conectado a péptido/Ig pueden inducir anergia de células T_{H}
in vivo, pueden examinarse los efectos de tales moléculas
sobre el cambio de la clase de inmunoglobulina dependiente de
células T_{H} (es decir de IgM a IgG) y sobre la expansión clonal
de líneas de células T específicas para el péptido (Ejemplo 7 que
sigue).
Para examinar el cambio de la clase de Ig, se
establecen tres grupos de prueba como sigue:
- (a)
- 15 ratones BALB/c son inyectados intraperitonealmente (IP) con 10-100 \mug de conjugado de Ova 323-339-KLH, en adyuvante completo de Freund, para inducir una respuesta inmunitaria al péptido Ova 323-339. El día antes y el día de la inmunización con Ova-KLH, 5 de los ratones son inyectados IP con 10-100 \mug de Ova 323-339/MHC-I-A^{d} soluble, en PBS. Esta proteína de fusión soluble de Ova se une al receptor de células T (TCR) presentado sobre las células T_{H} específicas para Ova 323-339. Debido a la ausencia de la señal co-estimulante, estas células T_{H} son inducidas a un estado de anergia. Los 10 ratones restantes sirven como control. 5 de ellos reciben PBS y otros 5 reciben MHC I-A^{d}/Ig intraperitonealmente.
- (b)
- Se realizan experimentos idénticos con conjugado de HEL-KLH y HEL 74-86/MHC I-A^{d}/Ig.
- (c)
- Se inyectan 25 ratones BALB/c como se describe anteriormente con conjugados de Ova-KLH y HEL-KLH. 5 de estos ratones son inyectados intraperitonealmente con Ova 323-339/MHC I-A^{d}/Ig y 5 de ellos recibirán HEL 74-86/MHC I-A^{d}/Ig intraperitonealmente. Los otros ratones reciben PBS o MHC I-A^{d}/Ig como controles.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Diez días después de la inmunización, se recoge
sangre de cada ratón mediante sangrado de la cola. Los ratones son
anestesiados con metafano de la siguiente manera: algodón o gasa se
humedece con de 20 a 25 gotas de metafano y se coloca en un
recipiente de vidrio con una tapa de metal o vidrio. El ratón se
pone en la parte superior de una rejilla que está sobre el algodón
o la gasa humedecidos. Cuando la respiración se frena, el ratón se
retira de la cámara y los dedos se pellizcan para comprobar los
reflejos. Una vez que el ratón está suficientemente anestesiado, la
cola se mantiene bajo una lámpara térmica para incrementar el flujo
sanguíneo. Después de desinfectar la cola con alcohol isopropílico
o etílico, la punta se corta con unas tijeras afiladas. La sangre
se recoge en un tubo de Eppendorf. El sangrado puede mejorarse
"ordeñando" la cola. Después de recoger la sangre, se aplica
presión a la punta de la cola con un taco de gasa. La sangre se
centrifuga a aproximadamente 14.000 g durante 3-5
minutos y el suero se
recoge.
recoge.
Los ensayos se realizan en placas de
microvaloración de 96 pocillos (Maxisorp F8; Nunc, Inc.) revestidas
en 1-50 \mug/ml con OVA-KLH u
ovalbúmina entera usando un tampón de revestimiento de
Tris-HCl, pH 8,5. Un segundo grupo de placas se
reviste con 1-50 \mug/ml de
HEL-KLH o HEL entera. Las placas se cubren con
película piezosensible (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) y se
incuban durante la noche a 4ºC. Las placas se lavan a continuación
con solución de lavado (Imidazol/NaCl/Tween-20 al
0,4%) y se bloquean añadiendo 100 \mul/pocillo de una solución de
BSA al 3%. Después de la incubación sobre un rotador de placas a
temperatura ambiente durante 30 minutos, las placas se lavan 5
veces con solución de lavado. Los sueros de ratón se diluyen 1:500
en diluyente de muestra/conjugado (gelatina al 2% +
Tween-20 al 0,1% en PBS) y a continuación, por
duplicado, se diluyen en serie sobre la placa. Se establecen dos
placas idénticas para cada proteína de revestimiento, una para la
determinación de la concentración de IgM y la otra para IgG. Después
de la incubación sobre un rotador de placas a temperatura ambiente
durante 30 minutos, las placas se lavan 5 veces con solución de
lavado. Se añaden a las placas apropiadas conjugados de anti-(IgM
de ratón) de cabra-HRP y anti-(IgG de ratón) de
cabra-HRP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN,
dilución 1:100 en diluyente de muestra/conjugado). Después de la
incubación sobre un rotador de placas a temperatura ambiente
durante 30 minutos, las placas se lavan 5 veces con solución de
lavado y a continuación se incuban con 100 \mul/pocillo de
sustrato de desarrollo ABTS (Kirkgaard & Perry Laboratories,
Inc., Gaithersburg, MD) durante 10 minutos sobre un rotador de
placas a temperatura ambiente. Las reacciones se detienen con 100
\mul/pocillo de tampón de Quench (Kirkgaard & Perry
Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) y el valor de la absorbancia
se lee a 405 nm usando un lector de ELISA de placas de
microvaloración automatizado (Ceres UV900HI, Bioteck, Winooski,
Vermont). La concentración se determina representando la lectura de
la absorbancia frente al logaritmo de las diluciones de las muestras
y determinando la dilución del punto medio (50%) de la absorbancia.
Se comparan a continuación las valoraciones para IgM frente a IgG.
Los sueros también se controlan con respecto a la
reactividad
cruzada.
cruzada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Pueden examinarse adecuadamente los efectos de
moléculas solubles de MHC conectado a péptido/Ig sobre la expansión
clonal de líneas de células T específicas para péptido in
vivo de acuerdo con el siguiente ensayo.
Los grupos de tratamiento (4 ratones por grupo)
son idénticos a los descritos en el Ejemplo 6 anteriormente. El
procedimiento de inmunización es como sigue: Los ratones son
inyectados intraperitonealmente con 10-100 \mug
del Ova 323-339/MHC I-A^{d}/Ig
soluble, en PBS, y 24 horas más tarde son inyectados subcutáneamente
en la base de la cola con 50 \mug de Ova
323-339-KLH. Estas dos inyecciones
se repiten 6 y 7 días más tarde. Siete días después de la
terminación del segundo grupo de inyecciones, los ratones son
sacrificados. Los nódulos linfáticos inguinales y paraaórticos se
extirpan y se convierten en una suspensión de células simples.
La suspensión se agota de células que presentan
antígeno mediante incubación sobre lana de nailon y columnas
Sephadex G-10, y las poblaciones de células T
purificadas resultantes se incuban con APCs sometidas a impulsos
con el péptido Ova 323-339 o el péptido HEL
74-86.
Se usan células B activadas de ratones BALB/c en
células que presentan antígeno en el ensayo de proliferación. Las
células B se preparan cultivando células de bazo con 50 \mug/ml de
LPS durante de 48 a 72 horas, tiempo en el cual las células
activadas se aíslan mediante centrifugación con gradiente de
densidad sobre Lymphoprep. Las células B activadas se someten a
continuación a impulsos con el péptido Ova 323-339 o
el péptido HEL 74-86 durante 3 horas, se lavan
intensivamente, se fijan con paraformaldehído para inhibir la
proliferación de células B, y se añaden a células T purificadas de
cada grupo de ratones.
El ensayo de proliferación se lleva a cabo en
placas de microvaloración de fondo redondo de 96 pocillos a 37ºC,
CO_{2} al 5%, durante 3-5 días. Los pocillos se
someten a impulsos con 1 \muCi de ^{3}H-timidina
durante 18 horas antes de la terminación de los cultivos y se
recogen usando un recogedor de células Skatron. La incorporación de
^{3}H-timidina en DNA como una medida de la
proliferación de células T se determina usando un espectrómetro de
centelleo de líquidos LKB. El grado de proliferación de células T
reactivas con péptido es indicativo de las respuestas de células
T_{H} (es decir, de la expansión clonal) que tenían lugar en los
ratones después de la inmunización.
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Ejemplo
8
La encefalomielitis alérgica experimental (EAE)
es una enfermedad autoinmune en ratones y sirve como un modelo
animal para la esclerosis múltiple. Se han definido regiones
encefalitogénicas de dos proteínas, la proteína básica de mielina
(MBP 91-103) y la proteolipoproteína (PLP
139-151). En la raza de ratón SJL susceptible,
puede inducirse el desarrollo de EAE después de la inmunización con
el péptido encefalitogénico o la transferencia adoptiva de células
T reactivas con MBP. Para determinar si el tratamiento con complejos
de fusión solubles del MHC de la invención, tales como complejo MBP
91-103/MHC I-A^{s}/Ig y PLP
139-151/MHC I-A^{s}/Ig evita el
desarrollo de EAE después de la activación de células T, los ratones
SJL pueden inyectarse con el complejo de fusión del MHC examinado,
por ejemplo blastos de células T reactivas con MBP
91-103 y PLP 139-151 in
vivo.
Para inducir la EAE en ratones SJL con MBP
91-103, los ratones son inmunizados con 400 \mug
de MBP 91-103 en adyuvante completo de Freund en el
dorso. De 10 a 14 días más tarde, se recogen células de los nódulos
linfáticos de drenaje regional, según se describe anteriormente, y
se cultivan en placas de 24 pocillos a una concentración de 6 x
10^{6} células por pocillo en 1,5 ml de medio RPMI 1640/suero
bovino fetal al 10%/penicilina al 1%/estreptomicina, con la adición
de MBP en 50 \mug/ml. Después de una estimulación in vitro
de 4 días, se recogen blastos de células T reactivas con MBP
91-103 a través de un gradiente de densidad de
Ficoll/Hypaque, se lavan dos veces en PBS y se inyectan 1,3 x
10^{7} células en cada ratón. Los ratones que reciben células T
reactivas con MBP 91-103 encefalitogénicas reciben a
continuación 100 \mug de MBP
91-103/I-A^{s}/Ig, soluble, 100
\mug de MBP 1-14/I-A^{s}/Ig (el
control negativo) o solución salina normal los días 0, 3 y 7 i.v.
(dosis total 300 \mug). Se realizan evaluaciones clínicas e
histológicas para confirmar que MBP
91-103/I-A^{s}/Ig inhibía el
desarrollo de EAE en estos ratones.
Para inducir EAE en ratones SJL con péptido PLP
139-151, los ratones son inmunizados con péptido PLP
139-151 disuelto en PBS y mezclado con adyuvante
completo de Freund que contiene Mycobacterium tuberculosis
H37Ra en 4 mg/ml en una relación 1:1. Los ratones son inyectados
con 150 \mug de mezcla de adyuvante de péptido. El mismo día y 48
horas más tarde, a todos los animales se les administran 400 ng de
toxina pertussis. Se realiza a continuación la transferencia
adoptiva de EAE como se describe anteriormente. Se usa a
continuación PLP
139-151/I-A^{s}/Ig en vez de MBP
91-103/I-A^{s}/Ig para evitar el
desarrollo de EAE.
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Ejemplo
9
El siguiente ensayo (ilustrado con
PEE-IA^{d}/OVA) muestra como puede inducirse una
respuesta inmunitaria en un mamífero de acuerdo con la invención
mediante la administración (por ejemplo, IM) con uno o más vectores
de expresión del MHC conectado a un péptido de presentación, de la
invención, y que la co-administración de DNA que
codifica para un factor co-estimulante, tal como el
vector de expresión B7-1 (o B7-2),
puede emplearse para aumentar más la respuesta inmunitaria según se
analiza anteriormente. Este sistema proporcionará un método único
para inducir respuestas inmunitarias (incluyendo proporcionar una
vacunación contra un trastorno elegido) que evita las complejidades
de la captación y el procesamiento de antígenos.
Ratones BALB/c (cinco por grupo) son inyectados
intramuscularmente (IM) en ambas patas traseras con 100 \mug de:
(1) PEE-IA^{d}/OVA que tiene las regiones de
codificación de Ova
323-339/I-A^{d} bajo el control
del promotor de CMV, (b) pCMV/B7-1 o
pCMV/B7-2 que contienen las regiones de codificación
del gen B7-1 o B7-2 bajo el control
del promotor de CMV, (c) PEE-IA^{d}/OVA y
pCMV/B7-1 o pCMV/B7-2, (d)
PEE-IA^{d}/HEL que tiene la región de
codificación HEL 74-86/I-A^{d}
bajo el control del promotor de CMV, (e)
PEE-IA^{d}/HEL y pCMV/B7-1 o
pCMV/B7-2 o (f) PEE-IA^{d} que
contiene la región de codificación de I-A^{d} bajo
el control del promotor de CMV. Las inyecciones se administran a
las 0, 3 y 6 semanas.
A las 0, 2, 5 y 8 semanas después de la
inyección inicial, la sangre se recoge de cada ratón sangrando la
cola como se describe en el Ejemplo 6. La sangre se centrifuga a
aproximadamente 14.000 g durante 3-5 minutos y el
suero se recoge.
Los ensayos se realizan en placas de
microvaloración de 96 pocillos (Maxisorp F8; Nunc, Inc.) que se han
revestido en 1-50 \mug/ml con
OVA-KLH y HEL-KLH usando un tampón
de revestimiento de Tris-HCl, pH 8,5. Las placas se
cubren con película piezosensible (Falcon, Becton Dickinson,
Oxnard, CA) y se incuban durante la noche a 4ºC. Las placas se
lavan a continuación con solución de lavado
(Imidazol/NaCl/Tween-20 al 0,4%) y se bloquean
añadiendo 100 \mul/pocillo de una solución de BSA al 3%. Después
de la incubación sobre un rotador de placas a temperatura ambiente
durante 30 minutos, las placas se lavan 5 veces con solución de
lavado. Los sueros de ratón se diluyen 1:500 en diluyente de
muestra/conjugado (gelatina al 2% + Tween-20 al 0,1%
en PBS) y a continuación, por duplicado, se diluyen en serie sobre
la placa. Las muestras de suero de ratón se hacen pasar sobre las
placas revestidas tanto con OVA-KLH como
HEL-KLH para probar la reactividad cruzada. Después
de la incubación sobre un rotador de placas a temperatura ambiente
durante 30 minutos, las placas se lavan 5 veces con solución de
lavado y a continuación se añaden a las placas apropiadas 100 \mul
de los conjugados anti-(IgG de ratón) de cabra-HRP
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, dilución 1:100 en diluyente
de muestra/conjugado). Después de la incubación sobre un rotador de
placas a temperatura ambiente durante 30 minutos, las placas se
lavan 5 veces con solución de lavado y a continuación se incuban con
100 \mul/pocillo de sustrato de desarrollo ABTS (Kirkgaard &
Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) durante 10 minutos sobre
un rotador de placas a temperatura ambiente. Las reacciones se
detienen con 100 \mul/pocillo de tampón de Quench (Kirkgaard
& Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) y el valor de la
absorbancia a 405 nm se lee usando un lector de ELISA de placas de
microvaloración automatizado (Ceres UV900HI, Bioteck, Winooski,
Vermont). La concentración puede determinarse representando la
lectura de la absorbancia frente al logaritmo de las diluciones de
las muestras y determinando la dilución en el punto medio (50% de
la absorbancia).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Para determinar si la inyección intramuscular de
DNA ha inmunizado satisfactoriamente a los ratones para montar una
respuesta de células colaboradoras T a ovalbúmina, puede emplearse
un ensayo de proliferación de células T específico para ovalbúmina.
Los ratones se inmunizan mediante el procedimiento descrito en el
Ejemplo 9 y se preparan células T a partir de los nódulos
linfáticos inguinales y paraaórticos 7 días después de la segunda
inmunización.
La suspensión se agota de células que presentan
antígeno mediante incubación sobre lana de nailon y columnas
Spehadex G-10, y las poblaciones de células T
purificadas resultantes se incuban con APCs sometidas a impulsos
con el péptido Ova 323-339 o el péptido HEL
74-86. Células B activadas de ratones BALB/c se usan
como células que presentan antígeno en el ensayo de proliferación.
Las células B se preparan cultivando células de bazo con 50
\mug/ml de LPS durante de 48 a 72 horas, tiempo en el que las
células activadas se aíslan mediante centrifugación con gradiente
de densidad sobre Lymphoprep. Las células B activadas se someten a
impulsos a continuación con el péptido Ova 323-339
o el péptido HEL 74-86 durante 3 horas, se lavan
intensivamente, se fijan con paraformaldehído para inhibir la
proliferación de células B y se añaden a células T purificadas.
El ensayo de proliferación se lleva a cabo en
placas de microvaloración de fondo redondo de 96 pocillos a 37ºC,
CO_{2} al 5%, durante 3-5 días. Los pocillos se
someten a impulsos con 1 \muCi de ^{3}H-timidina
durante 18 horas antes de la terminación de los cultivos y se
recogen usando un recogedor de células Skatron. La incorporación de
^{3}H-timidina en DNA como una medida de la
proliferación de células T se determina usando un espectrómetro de
centelleo de líquidos LKB. El grado de proliferación de células T
reactivas con péptido es indicativo de las respuestas de células
T_{H} (es decir, de la expansión clonal) que tienen lugar en los
ratones después de la inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Los Ejemplos 3 y 9-10 anteriores
muestran metodologías que han de usarse para estimular respuestas
inmunitarias a través de complejos de fusión del MHC de la
invención. Según se analiza anteriormente, pueden emplearse
procedimientos similares para inhibir respuestas inmunitarias usando
péptidos antagonistas de TcR conectados a las moléculas del MHC, es
decir, el péptido de presentación conectado covalentemente al
péptido del MCH es un antagonista o un agonista parcial de TcR.
Según se describe en el Ejemplo 1, el péptido PLP
139-151 es capaz de inducir EAE en ratones SJL. Se
han caracterizado análogos de este péptido con respecto a la
actividad antagonista de TcR frente a un grupo de clones de células
T específicos para PLP 139-151, restringidos con
I-A^{s}. Se encontró que dos análogos diferentes,
PLP W144Y (HSLGKYLGHPDKF) (ID SEC Nº: 22) y
PLP-W144L (HSLGKLLGHPDKF) (ID SEC Nº: 23) eran
particularmente útiles para inhibir la proliferación de células T
in vitro en la mayoría de los clones de células T probados
[Franco, A. y otros (1994) Eur J. Immunol. 24:
940-946]. Como un sistema modélico, pueden
construirse vectores capaces de co-expresar las
moléculas de la cadena \beta de I-A^{s}
conectada a análogos del péptido PLP y de la cadena \alpha de
I-A^{s} de longitud completa. La construcción del
vector es adecuadamente similar a la esbozada en el Ejemplo 3
anteriormente. La construcción del MHC conectado a PLP
139-151 natural sirve como un control positivo
(antigénico). Estos DNAs de vector (con y sin los vectores de
expresión B7 o B7-2) se inyectan adecuadamente IM en
ratones SJL (véase el Ejemplo 9 para los procedimientos de
inyección) antes de y durante la inducción de EAE. Puede inducirse
la EAE mediante la transferencia adoptiva de células T_{H}
reactivas para PLP 139-151 mediante los
procedimientos que se describen en el Ejemplo 8 anterior. Se
realizan evaluaciones clínicas e histológicas para confirmar que la
inyección del vector de expresión de antagonista de
PLP/I-A^{s} inhibía el desarrollo de EAE en los
ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se construyeron vectores capaces de
co-expresar las moléculas de la cadena \alpha de
I-A^{d} de longitud completa y la cadena \beta
de I-A^{d} conectada a péptido, como se esboza en
la figura 19 de los dibujos y mediante procedimientos iguales o
similares a los descritos en el Ejemplo 3 anteriormente. Para los
genes de I-A^{d}, se aisló RNA total de la línea
de células A20 del linfoma de células B de ratón. Brevemente, se
homogeneizaron 1 x 10^{8} células A20 (Número de Registro de
American Type Culture Collection TIB 208) en 6 ml de tiocianato de
guanidinio 4 M enfriado con hielo, Tris-HCl 0,1 M,
pH 7,5, usando un homogeneizador Tissue Tearer durante 5 minutos.
Después de la homogeneización, se añadió sarcosilo sódico hasta una
concentración final de 0,5% y la solución se mezcló a fondo. El
homogenado se centrifugó a 5000 g durante 10 minutos y el
sobrenadante se llevó hasta 10 ml con tiocianato de guanidinio 4 M,
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, tampón de sarcosilo sódico
al 0,5%. El sobrenadante se dispuso en forma de capa suavemente
sobre un colchón de 3,5 ml de CsCl 5,7 M, EDTA 0,01 M, pH 7,5, en
un tubo de ultracentrífuga transparente SW41. Las muestras se
centrifugaron en un rotor SW41 a 32.000 rpm durante 24 horas a
20ºC. Después de la centrifugación, el sobrenadante se retiró
cuidadosamente y el pelet de RNA se lavó con etanol al 70%. El RNA
se disolvió en 350 \mul de acetato sódico 3 M y 970 \mul de
etanol. Este procedimiento daba aproximadamente 370 \mug de RNA
total. El RNA se suspendió hasta 5 \mug/\mul con agua tratada
con DEPC y se usó para la clonación por RT-PCR de
los genes
I-A^{d}.
I-A^{d}.
Para aislar la cadena \alpha de
I-A^{d} de longitud completa, RNA total de A20 (5
\mug) se convirtió en cDNA usando M-MLV Reverse
Transcriptase (GIBCO-BRL) y cebado específico para
TM de la cadena \alpha (oligonucleótido OPR139) de acuerdo con
los procedimientos recomendados por el fabricante. Este cDNA se usó
como el molde para la amplificación por PCR usando un cebador
específico para el líder de la cadena \alpha (OPR13). Véase la
figura 20 de los dibujos donde se describen las secuencias de esos
cebadores OPR136 y OPR139. Las reacciones de amplificaciones por
PCR típicas (100 \mul) contenían DNA de molde, 10 pmoles de los
cebadores apropiados, 2,5 unidades de polimerasa de Taq,
dNTP 100 \muM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3,
MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%. El molde se desnaturalizó
mediante una incubación inicial a 96ºC durante 5 minutos, durante
los cuales la polimerasa de Taq se añadió para empezar en
caliente la reacción. Los productos deseados se amplificaron
mediante 10 ciclos térmicos de 58ºC durante 30 segundos, 72ºC
durante 1 minuto, a continuación 96ºC durante 1 minuto seguidos por
20 ciclos por etapas de 70ºC durante 1,5 minutos y a continuación
96ºC durante 1 minuto. El producto de PCR resultante (\sim 800 pb)
contiene un sitio XmaI 5' y un sitio EcoRI 3' para la
clonación. Además, este fragmento tiene una secuencia de consenso de
Kozak para la iniciación eficaz de la traducción (véase la figura
18A de los dibujos donde se describe la secuencia del producto de
PCR). El producto de PCR se digirió con XmaI y EcoRI,
se purificó en gel y se ligó a pUC18 digerido con
XmaI/EcoRI, para dar el vector
pJRS163-10. Después de la verificación de la
secuencia, el fragmento XmaI/EcoRI se cortó, se
purificó y se subclonó entre el promotor de CMV y sitios
poli-A de SV40 del vector de expresión de mamífero
PEE13 (Celltech), dando como resultado el vector pJRS164.
El fragmento de la cadena \beta conectado a
péptido, de longitud completa, se construyó insertando las
secuencias líder y TM en el vector
\beta1-\beta2 conectado al péptido Ova
323-339 (SISQAVHAAHAEINEAGR) (ID SEC Nº: 24) (pB16)
según se describe en el Ejemplo 1 anteriormente. RNA total de A20 (5
\mug) se convirtió en cDNA usando Superscript-MLV
Reverse Transcriptase (GIBCO-BRL) y cebado
específico para oligo dT o TM de la cadena \beta (con OPR135, la
secuencia del mismo se muestra en la figura 20) de acuerdo con los
procedimientos recomendados por el fabricante. Estos cDNAs se
usaron como el molde para amplificaciones por PCR usando un par de
cebadores específicos para el líder de la cadena \beta
(OPR132/OPR133; las secuencias de esos cebadores se describen en la
figura 20 de los dibujos) y un par de cebadores específicos para TM
de la cadena \beta (OPR134/OPR135; las secuencias de esos
cebadores se describen en la figura 20 de los dibujos). Las
condiciones de amplificación por PCR eran similares a las descritas
anteriormente en este ejemplo. Específicamente, las condiciones de
ciclación térmica para amplificar la secuencia líder eran 10 ciclos
térmicos de 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1 minuto y 96ºC
durante 1 minuto seguidos por 30 ciclos por etapas de 70ºC durante
1 minuto y 96ºC durante 1 minuto, mientras que las condiciones para
amplificar el dominio TM eran 5 ciclos térmicos de 60ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 30 segundos y 96ºC durante 1 minuto seguidos
por 25 ciclos por etapas de 70ºC durante 1 minuto y 96ºC durante 1
minuto. El producto de PCR del líder de \beta de 110 pb contiene
sitios HindIII y XmaI 5' y un sitio AflII 3'
para clonar en el vector péptido
Ova-conector-\beta1-\beta2,
pB16. La inclusión del sitio AflII cambia los dos últimos
aminoácidos del líder de la cadena \beta de
I-A^{d} por los encontrados en el líder de IgG
(véase la figura 18B de los dibujos). El producto de PCR del líder
de \beta se digirió con HindIII y XmaI, se purificó
en gel y se ligó en pB16 digerido con HindIII/AflII,
para dar pDM21. El producto de PCR de TM de \beta de 180 pb
contiene un sitio BstXI 5' y sitios XmaIII y
EcoRI 3' para la clonación en el vector pDM21. El producto de
PCR de TM de \beta se digirió con BstXI y EcoRI, se
purificó en gel y se ligó en pDM21 digerido con
BstXI/EcoRI, para dar el vector pVW229. Este vector
se digirió con XmaI y EcoRI para generar los
fragmentos génicos de la cadena \beta conectados a péptido, de
longitud completa, para clonar entre el promotor de CMV y sitios
poli-A de SV40 del vector de expresión de mamífero
PEE6 (Celltech). Estos fragmentos también tienen la secuencia de
consenso Kozak (CCACCATG) (ID SEC Nº: 2) para la iniciación eficaz
de la traducción (véase la figura 18A de los dibujos). El pVW231
resultante se digirió con BglII y BamHI. El promotor
de CMV/péptido-fragmentos de cadena \beta se
purificó en gel y se ligó en pJRS164 digerido con BamHI, para
generar el vector de expresión pJRS165.1 final que contiene genes
de la cadena \alpha de I-A^{d} de longitud
completa y de la cadena \beta conectada a OVA.
Se construyeron plásmidos adicionales que
contenían el gen de la cadena \alpha de I-A^{d}
de longitud completa y el gen de la cadena \beta sin un péptido
conectado o con el péptido HEL 74-86 (NLCNIPSCALLSS)
(ID SEC Nº: 25), según se muestra en el esquema de la figura 19 de
los dibujos, y servían como controles en los estudios de inducción.
Los fragmentos AflII/BstXI de pBC1 y pB4 (según se
describen en el Ejemplo 1 anteriormente) que contienen la región
conector-\beta1-\beta2 y la
región péptido
HEL-conector-\beta1-\beta2,
respectivamente, se cortaron, se purificaron en gel y se ligaron en
pVW229 digerido con AflII/BstXI. Los vectores
resultantes, pFB12 y pFBH3, tienen fragmentos
XmaI/EcoRI que contienen el gen de la cadena \beta
de longitud completa no conectado a péptido o conectado al péptido
HEL, respectivamente. Estos fragmentos se cortaron, se purificaron
en gel y se ligaron entre el promotor de CMV y los sitios
poli-A de SV40 de PEE6 digerido con
XmaI/EcoRI, dando como resultado pB1 y pBH4. Estos
vectores se digirieron con BglII y BamHI y los
fragmentos de promotor de CMV/cadena \beta se purificaron en gel y
se ligaron en pJRS164 digerido con BamHI, para generar pAB5,
el vector de expresión que contiene los genes de la cadena \alpha
y \beta de I-A^{d} de longitud completa sin un
péptido conectado, y pABH1, el vector de expresión que contiene los
genes de la cadena \alpha de I-A^{d} de longitud
completa y la cadena \beta conectada a HEL. Muestras de los
plásmidos mencionados anteriormente pJRS165.1, pAB5 y pABH1 (Nº de
Registro 97301, 97032 y 97033, respectivamente) se han depositado
en the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
El gen B7-1 de múrido se
amplificó a partir de una plantilla del plásmido
MB7-PCR2 que tiene el gen B7 (proporcionado por E.
Podack, Univ. of Miami). Estas reacciones se llevaron a cabo con
polimerasa Ultima (Perkin-Elmer) de acuerdo con los
procedimientos recomendados por el fabricante usando los cebadores
específicos para B7, B7-1-2F y
B7-1-2B (las secuencias de esos
cebadores se describen en la figura 20 de los dibujos). Las
condiciones de ciclación térmica eran 20 ciclos térmicos de 60ºC
durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos y 96ºC durante 1
minuto seguido por 10 ciclos por etapas de 72ºC durante 1,5 minutos
y 96ºC durante 1 minuto. El producto de PCR generado tiene sitios
NotI 5' y 3' para la clonación. Este fragmento también tiene
la secuencia de consenso Kozak (CCACCATG) (ID SEC Nº: 2) para la
iniciación eficaz de la traducción. El producto se digirió con
NotI, se purificó en gel y se ligó entre el promotor de CMV y
sitios poli-A de SV40 de vector de expresión de
mamífero pCMV\beta digerido con NotI (Clonetech). El vector
resultante se denominó pUB719.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Según se detalla adicionalmente más adelante, un
tumor de células B de múrido (NSO; fondo de
H-2^{d}) se ha transfectado con la construcción
pJRS165.1 (I-A^{d} de múrido/OVA
323-339 descrito en el Ejemplo 12 anteriormente) y
se ha observado mediante análisis citométrico de flujo de la
superficie celular que expresa la porción del MHC del complejo de
fusión. Además, se observó que el complejo de fusión expresado sobre
estas células era capaz de modular la actividad del receptor de
células T (TcR) apropiado induciendo la producción de
IL-2 en el hibridoma de células T específico para
el péptido OVA 323-339, restringido por
I-A^{d}, DO11.10. Los resultados demuestran,
entre otras cosas, que (1) el péptido de fusión conectado
covalentemente puede cargarse en la hendidura de unión del MHC con
conservación de la conformación del MHC, (2) la fusión péptido/MHC
conserva la integridad funcional de la molécula del MHC (es decir,
es capaz de unirse al TcR y las células T específicas para el
péptido activadas) y (3) los mecanismos fisiológicos ordinarios para
la carga de péptido de las moléculas del MHC y la presentación
posterior del antígeno pueden evitarse a través de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea tumoral de células T de múrido NSO se
transfectó de acuerdo con the Celltech Glutamine Synthestase
Gene Amplification System Manual con pequeñas modificaciones. Este
método usa electroporación para transfectar células de mamífero con
un vector (PEE-13) que contiene la región de
codificación para la glutamina sintetasa. Las células transfectadas
tienen la capacidad de sintetizar glutamina, sobreviviendo de ese
modo sin un suministro exógeno. La selección de clones
transformados se efectuó aislando las células que crecen en medio
libre de glutamina. Brevemente, se lavaron 1 x 10^{7} células NSO
dos veces en PBS enfriado con hielo y se resuspendieron en 760
\mul de PBS frío. Se añadieron a las células 40 \mug (40 \mul
en 1 \mug/\mul) de DNA de plásmido pJRS165.1 digerido con SalI
(véase el Ejemplo 12 anteriormente) en una cubeta de electroporación
(0,4 cm). La mezcla de células/DNA se puso sobre hielo durante 5
minutos y las células se sometieron a electroporación a
continuación usando un Gene Pulser (Biorad) para aportar un impulso
de 250 voltios, 960 \muFd. Las células sometidas a impulsos se
pusieron sobre hielo durante 2-5 minutos, se
retiraron de la cubeta, y se añadieron 30 \mul de medio no
selectivo (IMDM, FBS al 10%, L-glutamina 2 mM,
penicilina/estreptomicina). Las células se cultivaron en placas de
microvaloración de fondo plano de 96 pocillos en 50 \mul/pocillo
(4 placas, suspensión de células en 30 ml de medio como
anteriormente; 5 placas, suspensión de células diluida 1:4; 5
placas, suspensión de células diluida 1:20) y a continuación se
incubaron con CO_{2} al 5% a 37ºC. Para el control negativo, se
siguió el mismo procedimiento de electroporación y cultivo en placa,
excepto que se omitió el DNA. Al día siguiente, se añadieron a cada
pocillo 150 \mul de medio selectivo [IMDM, FBS dializado al 10%,
penicilina/estreptomicina, nucleósidos (6 \mug/ml de A, G, C y U;
2 \mug/ml de T), 60 \mug/ml de glutamato y asparagina]. Las
placas se alimentaron con medio selectivo en una base semanal
retirando 100 \mul/pocillo de medio usado y añadiendo 100
\mul/pocillo de medio reciente, dejando que las células agotaran
gradualmente el medio de toda la glutamina residual. Sólo las
células que se han transformado sobrevivirán, haciéndose evidentes
colonias en 14-21 días. Las colonias, o los clones,
se expandieron y se rastrearon con respecto a la expresión del
complejo de fusión del MHC Clase II superficial conformacionalmente
correcto de la invención, según se detalla posteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones generados en la transfección anterior
se analizaron con respecto a la expresión de complejo de fusión del
MHC de Clase II a niveles significativamente superiores que la
célula parental, NSO. Los clones de NSO/IA^{d}/OVA (1x10^{5}) o
las células de control, NSO o A20.1-11 [Kim, K. y
otros (1979) J. Immunol. 122:549], se incubaron con anticuerpo
anti-IA^{d} conjugado con FITC (Pharmingen,
dilución 1:100) en tampón de tinción (PBS/FBS al 1%) durante 45
minutos a 4ºC en la oscuridad. Después de lavar tres veces en
tampón de tinción, se examinó la fluorescencia en un citómetro de
flujo Beckton Dickinson FACScan. Se usó un anticuerpo irrelevante
de igual isotipo (anti-IA^{k} conjugado con FITC,
Pharmingen 1:100) como control negativo. La intensidad de
fluorescencia de IA^{d} se comparó con la expresión de IA^{k}
para determinar la fluorescencia específica (véanse los resultados
indicados en la Tabla 1 posteriormente). En esta tabla, los datos
se presentan como fluorescencia verde máxima del canal que es una
medida de la intensidad de fluorescencia y por lo tanto la densidad
de las moléculas de IA^{d} expresadas sobre la superficie celular.
La línea celular de control negativo (NSO) alcanza el máximo en el
canal 67 y el control positivo (A20.1-11) en el
canal 1322. Los clones que exhiben fluorescencia máxima mayor del
canal 100 se eligieron para el análisis adicional de la
funcionalidad de la proteína de fusión. Los clones listados en la
Tabla 1 se han hecho crecer en masa, se han congelado y depositado
en un banco para el uso futuro. Puesto que el anticuerpo reconoce la
molécula del MHC conformacional, esta capacidad para detectar el
complejo de fusión del MHC sobre la superficie celular usando
anticuerpo demuestra que la conformación del MHC clase II se ha
conservado en el complejo de fusión
recombinante.
recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Para verificar la actividad biológicamente
relevante de estas moléculas de proteína recombinante, se evaluó la
capacidad de las moléculas para interactuar con el receptor de
células T apropiado in vitro de una manera específica para
el antígeno y provocar la activación de la célula T.
Se utilizó un hibridoma de células T de múrido,
DO11.10 [Shimonkevitz, R. y otros (1983) J. Exp. Med. 158:303], que
expresa sobre su superficie un receptor de células T específico para
un fragmento peptídico de 21 aminoácidos (aa
323-339) derivado de ovalbúmina de huevo de pollo
(OVA). Este péptido puede presentarse a DO11.10 sólo mediante
células que presentan antígeno (APC) que expresan la molécula
I-A^{d} del MHC de Clase II de múrido. Cuando el
péptido es presentado por la APC apropiada, las células DO11.10
responderán produciendo IL-2, que puede ensayarse a
continuación como una medida de la activación de células T. La línea
celular que servía como un control positivo era
A20.1-11, que expresa I-A^{d}
sobre su superficie. Brevemente, las células
A20.1-11 (1x10^{5}/pocillo) se incubaron junto con
péptido (1 \mug/pocillo) y células DO11.10 (2x10^{5}/pocillo),
durante 24 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Las
células NSO (como control negativo) y los clones
NSO/I-A^{d}/OVA (1x10^{5}) se incubaron con
células DO11.10 en ausencia de péptido. Los cultivos se llevaron a
cabo en medio de cultivo completo (RPMI 1640, FBS al 10%,
penicilina/estreptomicina, L-glutamina 2 mM y
2-mercaptoetanol 5x10^{-5} M) en placas de
microvaloración de fondo plano de 96 pocillos. Después de 24 horas,
los sobrenadantes de cultivo se ensayaron con respecto a la
presencia de IL-2 derivada de DO11.10 usando la
línea de células T de múrido dependiente de IL-2,
CTLL-2, según se describe posteriormente.
Brevemente, se prepararon diluciones de dos
veces en serie de cada sobrenadante de cultivo en medio completo en
placas de microvaloración de fondo plano y se añadieron 1x10^{4}
células CTLL-2 a cada pocillo. Después de
16-20 horas los pocillos de control negativo
(CTLL-2 cultivadas con medio sólo) y los pocillos de
control positivo (células CTLL-2 cultivadas con
rIL-2) se examinaron microscópicamente y, en el
punto en el que las células de control negativo estaban muertas en
aproximadamente 90%, mientras que las células de control positivo
todavía estaban proliferando activamente, se añadió MTT (2 mg/ml en
PBS; 25 \mul/pocillo) y las placas se devolvieron al incubador
durante 4 horas adicionales. En este momento, los cristales azules
de formazano formados en células que se metabolizan activamente se
disolverán mediante la adición de 150 \mul de HCl al 0,4 N en
isopropanol por pocillo. Después de la mezcladura cuidadosa, se
determinó la D.O. a 562 nm usando un lector de placas
(Ceres-UV900HI). Los datos que demuestran la
actividad funcional de los cuatro clones analizados anteriormente
junto con los controles negativos apropiados (NSO) se muestran en la
figura 21 de los dibujos y se representan en una gráfica que
muestra el valor de D.O. de las cuatro primeras diluciones del
sobrenadante de cultivo de DO11.10, como una medida de la
activación de células T.
Estos resultados establecen que el complejo de
MHC/péptido expresado sobre estas células transfectadas es
biológicamnete funcional, ya que puede acoplar el TcR sobre DO11.10
y activar la producción de IL-2. Estos resultados
indican que tales células tratadas mediante ingeniería que expresan
construcciones de MHC/péptido únicas en ausencia de señales
co-estimulantes pueden ser de importancia clínica en
estados de enfermedad en los que una respuesta inmunitaria
inapropiada a un péptido tiene consecuencias patológicas para el
huésped, tal como en una alergia o en ciertos trastornos
autoinmunes. Esta técnica también tiene el potencial, a través de
la manipulación adicional de la célula tratada por ingeniería, de
servir como un vector para aportar una señal positiva para la
inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
El siguiente ensayo puede emplearse para evaluar
la capacidad de líneas celulares del complejo de fusión del MHC de
la invención (es decir, células que tienen introducido en las mismas
DNA que codifica para un complejo de fusión del MHC de la
invención) para inducir o suprimir una respuesta inmunitaria en un
huésped al que se han administrado las células.
La siguiente ejemplificación del ensayo utiliza
un modelo animal de inmunización con péptido de ovalbúmina
323-331 y manipulación de la respuesta al péptido
usando el complejo de fusión tratado por ingeniería que expresa
células descritas en el Ejemplo 13 anterior. La metodología de este
ejemplo puede aplicarse a una amplia variedad de complejos de
fusión del MHC de la invención que contienen un péptido de
presentación que puede modular (es decir, suprimir o inducir) una
respuesta inmunitaria en mamíferos y que puede conectarse a una
molécula del MHC de la invención tal como mediante un conector
sensible según se describe anteriormente.
Las células que pueden utilizarse en este ensayo
(NSO/IA^{d}/OVA.B2, NSO/IA^{d}/OVA.B4, NSO/IA^{d}/OVA.B5 y
NSO/IA^{d}/OVA.A4) se transfectan con el DNA del complejo de
fusión MHC/OVA 323-339, pJRS165.1 (véanse los
Ejemplos 12 y 13 anteriores). Estas células expresan solo bajos
niveles de moléculas co-estimulantes (es decir, una
cantidad de proliferación de células T no eficaz) y por lo tanto no
son capaces de iniciar el caso de cebado inicial para la inducción
de inmunidad para el péptido (como se sabe en la técnica, las
células B son capaces de activar células T de memoria, pero, a
diferencia de las "APC profesionales", son incapaces de
aportar la señal requerida para la inducción de inmunidad. La
inyección de estas células en un huésped histocompatible puede dar
como resultado interacción con células T en ausencia de moléculas
co-estimulantes, y por lo tanto una inducción de
insensibilidad específica para el antígeno o tolerancia a células
T.
El ensayo puede efectuarse específicamente como
sigue. Ratones BALB/c (IA^{d}) (3-4 por grupo) son
inyectados i.v. en la cola o s.c. en la base de la cola con las
células o los reactivos listados en la Tabla 2 posterior. Las
células se lavan en PBS, se resuspenden hasta 1x10^{8}/ml en PBS y
se inyectan en la vena de la cola (0,1 ml; 1x10^{7}
células/ratón). Se mezcla péptido de ovalbúmina (2 mg/ml en PBS) con
adyuvante completo de Freund que contiene Mycobacterium
tuberculosis H37Ra en una relación de 1:1 v/v. Se inyectan 50
microlitros s.c. en cada lado de la base de la cola. Siete días
después de la última inyección, los nódulos linfáticos (inguinales,
paraaórticos, cervicales, braquiales) se extirpan y se homogeneizan
para obtener una suspensión de células simples. Los nódulos
linfáticos de ratones individuales dentro de un grupo se procesan
separadamente. Las células T se purifican de las poblaciones de
nódulos linfáticos mediante el paso de suspensiones de células
sobre G-10 y lana de nailon para retirar células
accesorias. Las células que presentan antígeno se preparan a partir
de los bazos de ratones BABL/c simples homogeneizando los bazos para
obtener una suspensión de células simples, lisis de eritrocitos
usando solución de Gey, tratamiento con mitomicina C (100 \mug/ml
en RPMI 1640/FBS al 1% durante 1 hora a 37ºC) para inhibir la
proliferación de APC, y tres lavados para retirar la mitomicina C
residual. Los ensayos para la inducción de una respuesta de células
T se llevan a cabo en placas de microvaloración de fondo redondo de
96 pocillos. Se mezclan de 2 a 4x10^{5} células T con
2-4x10^{5} APC. Cada combinación de células T/APC
se incuba, por triplicado, con y sin péptido de OVA (intervalo
10-200 ng/pocillo) durante 3-5
días. Aproximadamente 18 horas antes de la terminación del cultivo,
se añaden 0,4 \muCi de ^{3}H-timidina a cada
pocillo. Los pocillos se recogen usando un recogedor de células
Skatron y la incorporación de ^{3}H-timidina (una
medida de la síntesis de DNA y, por lo tanto de la proliferación de
células T) se determina usando un espectrómetro de centelleo de
líquido LKB.
Es evidente una respuesta positiva si los
pocillos que contienen péptido incorporan significativamente más
DNA que aquéllos sin péptido. Típicamente, los ratones se consideran
positivos cuando la proliferación (en cpm media) en respuesta al
péptido es mayor que aproximadamente 3 desviaciones estándar
superior que la proliferación de fondo sin péptido. Para cada
grupo, se calcula la proliferación específica media de péptido
promediando los valores para cada uno de los tres ratones. Se
considerará típicamente que la supresión de la inmunización ha
ocurrido cuando la media del grupo experimental es mayor que
aproximadamente 3 desviaciones estándar menor que la media del
grupo de control positivo.
En referencia a la Tabla 2 posterior, los grupos
1 (no inyectado) y 4 (inyección de NSO sola) sirven como controles
negativos y no deben responder a una estimulación in vitro
con péptido. El grupo 2 recibe 2 inyecciones de péptido, el
procedimiento de inmunización clásico, y debe responder óptimamente
a la presentación de péptido in vitro. El grupo 3 recibe una
inyección de péptido y puede esperarse que responda subóptimamente
in vitro. El grupo 5 recibe células NSO en primer lugar y a
continuación péptido una semana más tarde. La inyección de NSO no
debe interferir con el cebado por el péptido, por lo tanto los
resultados de este grupo deben ser similares al grupo 3 y servir
como un control negativo para la inducción de la tolerancia (grupo
7). El grupo 6 recibe las células que expresan el complejo de
fusión. Debido a la falta de expresión de moléculas
co-estimulantes necesarias para la estimulación de
células T normales, este grupo sirve como un control negativo para
el grupo 7. La ausencia de respuesta de este grupo podría
significar potencialmente "falta de respuesta" o "sin
respuesta específica". El grupo 7, que recibe una inyección
inicial de células NSO/IA^{d}/OVA y a continuación una inyección
de péptido, diferenciará entre estos dos resultados. Una ausencia de
respuesta a la estimulación in vitro con péptido de este
grupo demostrará la inducción de falta de respuesta específica, o la
tolerancia.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
El músculo esquelético puede jugar un papel como
un microambiente inmunológico. Un trabajo previo ha mostrado que
pueden expresarse genes extraños en células musculares (Wolff, J.A.
y otros, Science (1990) 247: 1465) y que se produce una
respuesta inmunitaria contra estos antígenos (Ulmer, J.B. y otros,
Science (1993) 259: 1745). También se ha presentado que la
estimulación de células musculares humanas cultivadas (mioblastos)
con interferón-\gamma
(IFN-\gamma) conduce a la expresión de complejos
del MHC clase II sobre estas células (Goebels N. y otros J.
Immunol. (1992) 149: 661-667).
Células musculares de ratón fueron inyectadas
con DNA que codifica para un complejo de fusión de OVA
323-339/IA^{d}MHCII de múrido específico
(pJRS165.1) y la señal co-estimulante
B7-1 (pUB719) para generar células que presentan
antígeno (APCs) locales que expresan el complejo de fusión que
contiene el péptido de ovalbúmina 323-339. Estas
APCs activarán finalmente células T. Según se detalla
posteriormente, se inyectó (i.m.) DNA que codifica para un complejo
de fusión del MHC de la invención y molécula
co-estimulante en ratones BALB/c para producir una
respuesta de proliferación de células T específica al péptido
codificado por el DNA (ilustrado con pJRS165.1 y pUB719).
Tres grupos de ratones BALB/c (3 ratones por
grupo) fueron inyectados i.m. en ambos cuádriceps de las patas
traseras con 50 \mul de PBS estéril que contiene los plásmidos 1)
pJRD165.1 que tiene la región de codificación del OVA
323-339/IA^{d}MHCII de múrido bajo el control del
promotor de CMV solo o 2) pJRS165.1 y pUB719 que contienen la
región de codificación del gen B7-1 de múrido bajo
el control del promotor de CMV o 3) pUB719 solo. Los ratones se
anestesiaron previamente en una cámara saturada con Metophane®
(Pitman-Moor, Mundelein, IL) de acuerdo con el
método descrito en el Ejemplo 6 anterior.
Dentro de cada grupo, 3 ratones fueron
inyectados con 100 \mug de DNA en 100 \mul de PBS en la semana
0 y una inyección de refuerzo con el mismo DNA se realizó en la
semana 3. Diez días después de la última inyección, se recogieron
los nódulos linfáticos inguinales y paraaórticos. Las células de los
nódulos linfáticos se aislaron y se sometieron a un ensayo de
proliferación de células T específicas para OVA como sigue. Las
células se lavaron tres veces en medio completo
(RPMI-1640, FBS al 10%, L-glutamina
2 mM, penicilina, estreptomicina, y
2-mercaptoetanol 5x10^{-5}) y se resuspendieron en
5x10^{6} células/ml. Se añadieron 100 microlitros de la
suspensión de células a pocillos de una placa de microvaloración de
fondo redondo de 96 pocillos. Se prepararon diluciones del péptido
OVA (323-339) que variaban de 0,8 \mug/ml a 10
\mug/ml y se añadieron 100 \mul/pocillo a las células por
triplicado. La proliferación de fondo se determinó omitiendo el
péptido. Las placas se incubaron con CO_{2} al 5% a 37ºC durante
3-5 días. Los pocillos se sometieron a impulsos con
0,4 \muCi de ^{3}H-timidina durante 18 horas
antes de la terminación de los cultivos y se recogieron usando un
Skatron Cell Harvester. La incorporación de
^{3}H-timidina en DNA como una medida de la
proliferación de células T se determinó usando un espectrómetro de
centelleo de líquidos LKB. El grado de proliferación de células T
reactivas con péptido era indicativo de las respuestas de células
T_{h} (es decir de la expansión clonal) que tenían lugar en los
ratones después de la inmunización.
Los resultados del ensayo de proliferación se
muestran en la Figura 22 de los dibujos. Específicamente, la
inyección de 100 \mug de DNA no mostraba proliferación de células
T específicas para OVA significativa ni en el caso de la inyección
de pJRS165.1 ni si se coinyectaba pUB719. Estos resultados indican
que en este caso administrar intramuscularmente DNA que codifica
para complejos de fusión de OVA 323-339/MCHII solos
o en combinación con DNA de molécula coestimulante no induce una
respuesta inmunitaria contra el péptido de OVA. La respuesta
proliferativa limitada observada con dosis altas de DNA de pJRS165.1
inyectado (es decir, 100 \mug) puede ser el resultado de
transformar células dendríticas intradérmicas (APCs intradérmicas)
durante la inyección (véase el Ejemplo 16
posterior).
posterior).
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Ejemplo
16
Las células dendríticas son células que
presentan antígeno (APCs) intradérmicas profesionales. La
transformación de estas células (ilustrada en este ejemplo) u otras
células (tales como las ejemplificadas en el Ejemplo 13
anteriormente) con complejos de fusión del MHC clase II específicos,
de la invención, puede inducir una respuesta de células T
específicas para el péptido. Estas APCs ya tienen las moléculas
co-estimulantes (es decir, B7-1)
que proporcionan la segunda señal de activación a las células T.
Dos grupos de ratones BALB/c (9 ratones por
grupo) fueron inyectados en el dorso afeitado con 100 \mul de PBS
que contenían 10 \mug de 1) pJRS165.1 que tiene la región de
codificación del gen de fusión de múrido OVA
323-339/MHC clase II de IA^{d} bajo el control del
promotor de CMV o 2) pABH1 que tiene la región de codificación del
complejo de fusión de múrido HEL 74-86/MHCII de
I-A^{d} bajo el control del promotor de CMV como
un grupo de control. Cuatro, 7 y 14 días después de la inyección se
recogieron los nódulos linfáticos inguinales y paraaórticos. Las
células de los nódulos linfáticos se aislaron y se sometieron a un
ensayo de proliferación de células T específicas para OVA como
sigue. Las células se lavaron tres veces en medio completo
(RPMI-1640, FBS al 10%, L-glutamina
2 mM, penicilina, estreptomicina, y 2-mercaptoetanol
5x10^{-5} M) y se resuspendieron en 5x10^{6} células/ml. Se
añadieron 100 microlitros de la suspensión de células a pocillos de
una placa de microvaloración de fondo redondo de 96 pocillos. Se
prepararon las diluciones del péptido OVA (323-339)
que variaban de 0,8 \mug/ml a 10 \mug/ml y se añadieron 100
\mul/pocillo a las células por triplicado. La proliferación de
fondo se determinó omitiendo el péptido. Las placas se incubaron con
CO_{2} al 5% a 37ºC, durante 3-5 días. Los
pocillos se sometieron a impulsos con 0,4 \muCi de
^{3}H-timidina durante 18 horas antes de la
terminación de los cultivos y se recogieron usando un Skatron Cell
Harvester. La incorporación de ^{3}H-timidina en
DNA como una medida de la proliferación de células T se determinó
usando un espectrómetro de centelleo de líquidos LKB. El grado de
proliferación de células T reactivas con péptido era indicativo de
las respuestas de células T_{H} (es decir de la expansión clonal)
que tenían lugar en los ratones después de la
inmunización.
inmunización.
Los resultados de los ensayos de proliferación
se muestran en la Figura 23 de los dibujos. No se detecta una
proliferación de células T específica significativa (aproximadamente
2.500 cpm) 4 días después de la inyección en ratones inyectados con
pJRS165.1 o pABH1. Siete días después de la inyección, las células
de los nódulos linfáticos de ratones inyectados con pJRS165.1
muestran una proliferación 12 veces superior con una concentración
de péptido estimulante de 0,31 \mug/ml en comparación con el día
4. Concentraciones de péptido superiores reducían la respuesta
proliferativa hasta aproximadamente 15.000 cpm. Sin embargo, las
células de ratones inyectados con pABH1 no mostraban un incremento
significativo en la proliferación (aproximadamente 7.000 cpm) en
los 3 puntos temporales. La respuesta proliferativa específica (OVA)
el día 14 después de la inyección es 3 veces inferior que el día 7,
indicando que ha transcurrido el período de estimulación máxima.
Estos resultados indican que las APCs intradérmicas se han
transformado con complejo de fusión de OVA
323-339/MHCII funcional y que las células T
específicas para OVA se han cebado y expandido. Debido a la ausencia
de estímulo (péptido HEL) las células T específicas para HEL
(activadas por APCs transformadas con pABH1) no proliferan en la
prueba. Se observa un período de retraso de 4 días antes de
cualquier activación de células T.
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Ejemplo
17
Los genes del MHC clase II usados para estas
construcciones se aislaron originalmente mediante amplificación por
PCR de cDNA generado a partir de las APC apropiadas según se
describe en los ejemplos anteriores (véase en particular el Ejemplo
1 anterior). Fragmentos de los genes de las cadenas \alpha y
\beta de I-A^{d} se generaron mediante
amplificación por PCR usando genes clonados como DNA de molde y se
montaron en el esquema de clonación mostrado en la figura 25 de los
dibujos dando como resultado un gen quimérico que codifica el
péptido antigénico, OVA 323-339, conectado a una
molécula de I-A^{d} monocatenaria. Brevemente, el
fragmento génico \alpha1-\alpha2 clonado en
39AD2 servía como el molde para la amplificación por PCR usando los
cebadores JLA007 y JLA010 (todos los oligonucleótidos usados en la
clonación se listan en la figura 26 de los dibujos, dando como
resultado la adición de un sitio de restricción XhoI 5' y uno
XmaI 3'. El producto de PCR de
\alpha1-\alpha2 se digirió con XhoI y
XmaI, se purificó en gel y se subclonó en el vector pLL101
dando como resultado la construcción pJA\alpha9. Este vector añade
una secuencia que codifica una etiqueta 6xHis al extremo de la
proteína \alpha1-\alpha2 para ayudar en la
purificación de la proteína.
La estrategia para aislar el fragmento génico
\beta1-\beta2 de I-A^{d} y
enlazarlo a la secuencia conectora se ha descrito en los ejemplos
anteriores. El conector de 10 aa-fragmento génico
\beta1-\beta2 en pBC1 servía como el molde para
la amplificación por PCR usando cebadores JLA005 y JLA009 para
añadir sitios de restricción NcoI y SpeI necesarios
para la clonación posterior. Los productos de PCR se digirieron con
pJA\alpha9 digerido con NcoI/SpeI dando como
resultado la construcción pJA\alpha9\beta20. Para generar una
molécula de clase II monocatenaria, se determinó mediante modelado
computarizado de la estructura cristalina de
HLA-DR1 que podía insertarse un conector flexible
entre el extremo carboxilo del dominio \beta2 y el extremo amino
del dominio \alpha1. Basándose en que la distancia entre estos
residuos era 47 angstroms, un conector de 24 aminoácidos
comprendido principalmente por el motivo (GGGGS) repetido cuatro
veces se modeló y se usó. Para insertar secuencias que codifican
este péptido flexible entre los fragmentos génicos de las cadenas
\alpha y \beta clonados, los oligonucleótidos, JA301 y JA302, se
reasociaron y se ligaron en pJA\alpha9\beta20 digerido con
SpeI/XhoI. La construcción resultante se denominó
pJALNK. pJALNK se digirió con NheI y EcoRI y el
fragmento génico monocatenario de
\beta1\beta2-\alpha1\alpha2 se purificó en
gel. Este fragmento se insertó en el vector pVW229 que tenía la
secuencia líder de la cadena \beta y las regiones que codifican
el péptido OVA 323-339 según se describe en los
ejemplos anteriores. La construcción resultante SSC1 contiene un
gen quimérico que codifica el líder de \beta/péptido OVA/conector
de 10 aa/\beta1-\beta2/conector de 20
aa/\alpha1-\alpha2/etiqueta 6xHis. La secuencia
de este gen se muestra en la figura 27 de los dibujos.
Para construir un vector para la expresión de
moléculas solubles de clase II monocatenarias (sc) en un sistema de
expresión de células de insecto, el gen quimérico se retiró de SSC1
mediante digestión con NcoI y EcoRI y se purificó en
gel. El fragmento se ligó en vector p2Bac digerido con
NcoI/EcoRI (número de serie In Vitrogen
V1980-10) para crear pMBSC1.2.
Para genera un vector capaz de expresar
moléculas de clase II sc unidas a membrana en células de mamífero,
el fragmento BclI/EcoRI de pJRS163-10
que codifica el dominio de transmembrana (TM) de la cadena \alpha
se subclonó en vector SSCI digerido con BclI-EcoRI. El
vector resultante, SCTM1, se digirió con XmaI y EcoRI
y el casete I-A^{d}-OVA
monocatenario se insertó en el vector de expresión de mamífero
PEE13, dando la construcción SCT1. La secuencia del gen quimérico
se muestra en la figura 28 de los dibujos.
Para generar un vector capaz de expresar
moléculas del MHC sc solubles en células de mamífero, el DNA de
molde de la cadena \alpha se amplificó mediante PCR a partir de
pJRS163-10 usando los cebadores JS305 y OPR142,
añadiendo de ese modo una secuencia que codifica la etiqueta del
anticuerpo EE en el extremo 3' del fragmento génico. El producto de
PCR se digirió con BclI y EcoRI y se clonó en el
vector SSC1 digerido. El vector resultante, SEE1, se digirió con
BclI-EcoRI y el casete
I-A^{d}-OVA monocatenario se
insertó en el vector de expresión de mamífero PE13, dando la
construcción SCE1. La secuencia del gen quimérico se muestra en la
figura 29 de los dibujos. Muestras de los plásmidos monocatenarios
anteriores, pMBSC1.2, SCT1 y SCE1, se han depositado en the
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
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Ejemplo
18
El plásmido pMBSC1.2 purificado se usó en una
cotransfección y el virus recombinante se enriqueció a partir de
AcMNPV de tipo salvaje limitando la dilución (véase D.R. O'Reilly y
otros, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. WH
Freeman & Co. Nueva York (1992)). Se usaron células SF9 en todas
partes.
El sobrenadante de los pocillos se probó
mediante ELISA para identificar virus que producen productos
recombinantes (sc I-A^{d}-OVA).
El ensayo de ELISA implica revestir 100 ng de
anti-IA^{d} M5/114 (ATCC TIB 120) sobre los
pocillos de placas de microvaloración de 96 pocillos en 50
microlitros de tampón de carbonato 0,1 M, pH 8,2. El bloqueo se
realizó con 200 \mul de PBS, FBS al 10% (suero bovino fetal de
Biowhittaker, número de serie 14-901F) durante al
menos 1 hora y las placas se lavaron tres veces con 200 \mul de
tampón de lavado (PBS con 0,5 ml de Tween 20/1). Las muestras se
añadieron en 100 \mul/pocillo y se incubaron 15 minutos a 37ºC.
Las placas se lavaron 4 veces con 200 \mul de tampón de lavado. Se
añadió anti-IA^{d} AMS-32.1
biotinilado (número de serie 06032D de Pharmingen) en 100
mg/pocillo en 100 \mul de PBS-FBS al 10%. Después
de la incubación durante 15 minutos a 37ºC, las placas se lavaron
cuatro veces con tampón de lavado. Se añadió peroxidasa de avidina
(Sigma) a 250 ng/pocillo en 100 \mul/pocillo de
PBS-FBS al 10% y se incubó durante 15 minutos a
37ºC. Las placas se lavaron a continuación ocho veces con 200 \mul
de tampón de lavado y se añadieron 100 \mul de sustrato ABTS
(Kirkegaard y Perry, números de serie 5060-00 ó
50-60-01) por pocillo. La
absorbancia se midió a 405 nm.
El sobrenadante de la mezcla de cotransfección
se probó con respecto a la reactividad de I-A^{d}
mediante el ensayo de ELISA anterior. La absorbancia media de
pocillos por duplicado se muestra en la Tabla 3 posterior. La
especificidad de la señal observada se debe a la secreción de sc
I-A^{d}-OVA en el sobrenadante de
cultivo por células
SF9.
SF9.
Se realizó subclonación por dilución limitativa
sobre la mezcla de cotransfección diluyendo virus en medios
completos (TNMFH, número de serie 51942 de JRH Biosciences
complementado con FBS al 10%) e incubando diluciones de virus con 2
x 10^{4} células SF9/pocillo en placas de 96 pocillos. El
sobrenadante de los pocillos que mostraba signos visibles de
infección pero no poliedros se probó en el ELISA de IA^{d}. Los
clones C6 (1,557) y F8 (1,446) son fuertemente positivos. C12 es
claramente negativo (0,124).
Se añadieron 500 microlitros de clon positivo C6
a cada uno de tres matraces de un litro que contenían células SF9
en 1x10^{6} células/ml. Se usaron aproximadamente 2.200 ml de
sobrenadante de infección en la purificación de sc
I-A^{d}-OVA según se describe en
el Ejemplo 19 posterior. El complejo de MHCII monocatenario así
purificado se ensayó con respecto a la capacidad para modular la
actividad de hibridoma de células T DO11.10 según se describe en el
Ejemplo 20 posterior.
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Los controles negativos que incluyen diluyente
de muestra (0,064) y sobrenadante de una infección realizada con un
baculovirus recombinante que contiene el gen de Enolasa Específica
de Neuronas (NSE) en células SF9 mostraban una unión insignificante
(0,098).
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Ejemplo
19
Las siguientes etapas se llevaron a cabo en la
preparación de I-A^{d}-OVA
monocatenario soluble a partir de sobrenadantes de cultivo de
células de insecto.
Fraccionación con Sulfato Amónico: A
0-4ºC, se añadió lentamente sulfato amónico sólido
(0,436 g/ml) a medio de cultivo de células de insecto (2200 ml)
mientras se agitaba la muestra. Después de la adición de sulfato
amónico, la agitación de la muestra se continuó durante 30 minutos.
La mezcla se centrifugó a continuación a 26000 g y 4ºC durante 30
minutos. El sobrenadante se descartó, y el pelet se resuspendió en
100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La muestra
resuspendida se dializó contra 4000 ml de PBS a 4ºC durante
aproximadamente 20 horas, con un cambio de PBS reciente después de
las primeras 4,5-5 horas de diálisis. El volumen de
la muestra dializada se midió y se añadió NaCl sólido y Tween 20 al
20% (v/v) a NaOH 0,5 N, seguido por filtración a través de un
filtro de 0,8 micras.
Afinidad de Quelatos Metálicos y Cromatografía
de Inmunoafinidad: Todas las etapas siguientes se realizaron a
temperatura ambiente.
Ni-IDA Sepharose: La muestra
proporcionada por la etapa de fraccionación anterior se cargó en una
columna Ni-IDA Sepharose Fast Flow (2,6 x 7,2 cm,
38,0 ml) que se había equilibrado con al menos 5 volúmenes de lecho
de PBS, NaCl 0,5 M, Tween 20 al 0,2% (v/v), pH 8. El caudal para la
muestra de carga era 3 ml/minuto. A continuación, la columna se
lavó con al menos 7-8 volúmenes de lecho del tampón
de equilibración anterior, seguido por 2,5-3
volúmenes de lecho de Na_{2}HPO_{4} 20 mM, pH 7,0, NaCl 0,2 M.
El caudal para el lavado era 5 ml/minuto. La proteína
I-A^{d} se eluyó con disminuciones de pH
escalonadas efectuadas mezclando diferentes proporciones de tampón
A (Na_{2}HPO_{4} 20 mM, pH 7,0, NaCl 0,2 M) y Tampón B
(Na_{2}HPO_{4} 20 mM, pH 3,0, NaCl 0,2 M) programadas en un
controlador FPLC. Un ensayo de ELISA que usaba anticuerpo monoclonal
anti-I-A^{d} (que reconoce
epítopos conformacionales de moléculas de I-A^{d})
indicaba que I-A^{d} está presente en fracciones
eluidas por Tampón B a 90% y 100%. Los picos de A_{280\ nm}
eluidos por Tampón B al 90% y 100% se reunieron, ajustando
inmediatamente hasta pH 7,0 con Tris 1 M. La muestra se concentró y
se intercambió el tampón por Tris-HCl 20 mM, pH
8,0, mediante ultrafiltración.
Cromatografía de Inmunoafinidad: La muestra de
la etapa anterior se hizo pasar en primer lugar a través de una
columna Protein A Sepharose Fas Flow (1,6 x 5 cm, 10 ml) y a
continuación se aplicó a una columna (1,6 x 3,4 cm, 6,8 ml) de
Protein A Sepharose Fas Flow reticulada con MKD 6, un anticuerpo
monoclonal anti-I-A^{d}. Las dos
columnas se habían equilibrado previamente con
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Después de la aplicación de
la muestra, la columna de inmunoafinidad se lavó con
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, hasta que se alcanzaba una
línea base de A_{280\ nm}. La columna de anticuerpo se lavó a
continuación con el mismo tampón que contiene NaCl 1 M que
anteriormente para retirar proteínas unidas no específicas. La
proteína I-A^{d} se eluyó a continuación con
glicina 50 mM-NaOH, pH 11,0. El pico de proteína
eluido (verificado mediante A_{280nm}) de la columna de
anticuerpo se ajustó inmediatamente hasta pH 8,0 con glicina 2 M, pH
2,0, se concentró y se intercambió el tampón por
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, mediante ultrafiltración. La
muestra purificada se almacenó a 4-8ºC. La pureza y
la funcionalidad de la muestra de I-A^{d} se
probaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de dodecilsulfato sódico y un ensayo de activación de
células T (véase posteriormente), respectivamente. El
I-A^{d}-OVA monocatenario
purificado de esta preparación no mostraba bandas contaminantes en
un gel de poliacrilamida teñido con Coommassie y la proteína total
era 125 \mug/ml mediante el ensayo de proteína total.
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Ejemplo
20
Se determinó si los complejos de
I-A^{d}/OVA-MHC monocatenarios
purificados de la invención podían activar el hibridoma de células
T DO11.10 específico para OVA según se medía mediante producción de
IL-2 e IL-4. Este método implica
revestir I-A^{d}/OVA monocatenario en placas
IMMULON II (Dynatech) en PBS durante la noche a 4ºC. Los pocillos
se vaciaron, se lavaron una vez con PBS y se añadieron 1 x 10^{5}
células DO11.10 por pocillo en 220 \mul de
RPMI-FBS al 10%. Después de la incubación durante la
noche a 37ºC en un incubador húmedo con CO_{2} al 10%, se
recogieron los sobrenadantes de cultivo, las células se retiraron
mediante centrifugación y se determinaron los niveles de
IL-2 e IL-4 mediante ELISA como
sigue.
El anticuerpo de captura de ELISA de
anti-(IL-2 de ratón) de rata (Pharmingen, número de
serie 18161D) se revistió a 100 ng/pocillo en 50 \mul de
carbonato 0,1 M, pH 8,2. El bloqueo se realizó con 200 \mul de
PBS-FBS al 10% durante al menos 1 hora y las placas
se lavaron 3 veces con 200 \mul de tampón de lavado (PBS con 0,5
ml de Tween 20 por l). Las muestras se añadieron en 100
\mul/pocilllo y se incubaron durante 4 horas a temperatura
ambiente o durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron 4 veces con
200 \mul de tampón de lavado y se añadió
anti-(IL-2 de ratón) de rata biotinilado
(Pharmingen) a 100 ng/pocillo en 100 \mul de
PBS-FBS al 10%. Después de la incubación durante 45
minutos a temperatura ambiente, las placas se lavaron cuatro veces
con tampón de lavado. Se añadió peroxidasa de avidina (Sigma, número
de serie A-3151) a 250 ng/pocillo en 100
\mul/pocillo de PBS-FBS al 10% y se incubó durante
30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron a
continuación ocho veces con 200 \mul de tampón de lavado y se
añadieron 100 \mul de sustrato ABTS (Kirkegaard y Perry,
número de serie 5060-00 ó
50-66-01) por pocillo. La
absorbancia se midió a 405 nm. El procedimiento de ELISA de
IL-4 era idéntico excepto por el uso de anticuerpos
de captura y sonda específicos para IL-4
(Pharmingen). Los resultados de un ensayo de activación se muestran
en la Tabla 4 posteriormente. Ni las células DI11.10 solas ni las
células DO11.10 + A20 (positivas a I-A^{d})
secretaban IL-2 o IL-4. El sc
I-A^{d}-OVA daba como resultado la
secreción de IL-2 e IL-4 por el
hibridoma de células T DO11.10. Una segunda activación se realizó
con dosis inferiores de sc
I-A^{d}-OVA inmovilizado. Los
niveles de secreción de IL-2 e IL-4
se valoraban ambos hasta cero, como se muestra en la Tabla 5
posteriormente. En ambos experimentos, eran secretadas
IL-2 e IL-4 por células DO11.10 de
una manera dependiente de la dosis con respecto a la exposición a
sc I-A^{d}-OVA inmovilizado.
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
La transfección y la selección de líneas
celulares de mamífero se llevaron a cabo como sigue: 1x10^{7}
células NSO se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo. Se
resuspendieron en 760 \mul de PBS frío y se mezclaron con 40
\mug (1 \mug/ml) de DNA de plásmido SC1 o SCT1 linealizado con
SalI. Después de 5 minutos de incubación sobre hielo, las
células se sometieron a electroporación usando un Gene Pulser
(Biorad) para aportar un impulso de 250 voltios, 960 \muFd. Las
células sometidas a impulsos se pusieron sobre hielo durante
2-5 minutos y se añadieron 30 ml de medio no
selectivo (IMDM, FBS al 10%, glutamina 2 mM, 5000 unidades/ml de
penicilina, 500 \mug/ml de estreptomicina). Las células se
cultivaron en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96
pocillos y, 24 horas más tarde, se añadieron a cada pocillo 150
\mul de medio selectivo (IMDM, FBS dializado al 10%, 5000
unidades/ml de penicilina, 5000 \mug/ml de estreptomicina, 1 x
nucleósidos, 1 x glutamato + asparagina). Las placas se alimentaron
con medio selectivo en una base semanal retirando 100
\mul/pocillo de medio usado y añadiendo 100 \mul/pocillo de
medio selectivo reciente, dejando que las células agotaran
gradualmente el medio de toda la glutamina residual. El gen de
glutamina sintetasa contenido en los plásmidos SCE1 y SCT1 permite
el crecimiento selectivo de las células transfectadas en medios
libres de glutamina. Las colonias de las células transfectadas con
el plásmido se hacían evidentes después de 14-21
días. Los transfectantes que tenían el vector SCT1 (es decir la
forma unida a la membrana de las moléculas de sc
I-A^{d}-OVA) se expandieron y se
rastrearon con relación a la expresión de las moléculas del MHC
mediante citometría de flujo según se describe anteriormente.
Los clones generados a partir del procedimiento
de transfección/selección se analizaron con respecto a la expresión
superficial de moléculas del MHC de clase II a niveles
significativamente superiores que la línea de células parentales.
Las células se incubaron con anticuerpo
anti-I-A^{d} conjugado con FITC,
AMS 32.1 (PharMingen, dilución 1:100) en tampón de tinción frío
(PBS, FCS al 1%) durante 45 minutos en la oscuridad. Después de
lavar tres veces en tampón de tinción, se examinó la fluorescencia
de un citómetro de flujo FACSan (Beckton Dickinson). Un anticuerpo
anti-I-A^{k} conjugado a FITC de
igual isotipo, 10-3.6 (PharMingen, dilución 1:100),
se usó como un control negativo. Los resultados de tal ensayo,
mostrados posteriormente en la Tabla 6 para tres líneas celulares
transfectadas con SCT1 independientes, indican que las células
transfectadas expresan el sc
I-A^{d}-OVA sobre su superficie
celular.
Los transfectantes que tienen el vector SCE1 (es
decir, forma soluble de las moléculas sc
I-A^{d}-OVA) se expandieron y se
rastrearon con relación a la expresión y la secreción de las
moléculas del MHC mediante los ensayos de ELISA específicos para
I-A^{d} descritos en el Ejemplo 18 anteriormente.
Los resultados de tal ensayo del sobrenadante de cultivo de dos
líneas celulares transfectadas SCE1 se muestran en la Tabla 7
posteriormente. Estos resultados indican que las células
transfectadas producen y secretan la molécula de sc
I-A^{d}-OVA. Este sistema podría
usarse para generar grandes cantidades de moléculas solubles del MHC
monocatenarias conectada a péptido.
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Ejemplo
22
La estimulación de la liberación de
IL-2 a partir del hibridoma de células T DO11.10
restringido por I-A^{d} específico para OVA
323-339 se llevó a cabo como se describe en el
Ejemplo 29 anteriormente. Brevemente, 1x10^{5} células
transfectantes SCT1 o A20.11 se incubaron junto con (cantidades
variables de) péptido OVA y 2x10^{5}/pocillo células DO11.10 a
37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Los cultivos se llevaron a
cabo en medio completo (RPMI 1640 complementado con FBS al 10%, FBS
al 10%, penicilina/estreptomicina, L-glutamina y
2-mercaptoetanol 50 \muM) en placas de
microvaloración de fondo plano de 96 pocillos. Después de 24 horas,
los sobrenadantes de cultivo se ensayaron con respecto a la
presencia de IL-2 derivada de DO11.10 usando el
ensayo de ELISA de IL-2 descrito en el Ejemplo 20
anteriormente o midiendo el crecimiento de la línea de células T de
múrido dependiente de IL-2, CTLL-2.
En la última prueba, se prepararon diluciones de dos veces en serie
de cada sobrenadante de cultivo en medio completo en placas de
microvaloración de fondo plano y se añadieron 1x10^{4} células
CTLL-2 a cada pocillo. Una curva estándar de
(cantidades de) rIL-2 se trazó en paralelo. Después
de 16 a 20 horas, se añadió MTT (2 mg/ml, 27 \mul/pocillo) y las
placas se incubaron durante 4 horas. En este momento, los cristales
azules formados por MTT en células que se metabolizan activamente se
disolvieron mediante la adición de 150 \mul de HCl 0,4 N en
isopropanol. Después de mezclar, la D.O. a 562 nm se determinó
usando un lector de placas Ceres-UV900HI. La
absorbancia corresponde al nivel de crecimiento de células CTLL
apoyado por la IL-2 en los medios de cultivo.
Los resultados de dos de tales ensayos de
activación se muestran en las Tablas 8 y 9 posteriores. Se
obtuvieron resultados similares usando el ensayo de CTLL.
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Ejemplo
23
Para probar si las moléculas solubles de clase
II monocatenarias conectadas a péptidos pueden inducir anergia de
células T_{H} en un sistema modélico animal, pueden examinarse los
efectos de las moléculas sobre el cambio de la clase de
inmunoglobulina (es decir, de IgM a IgG) dependiente de células
T_{H} y sobre la expansión clonal de líneas de células T
específicas para el péptido.
Para examinar el cambio de clase de Ig, se
establecen dos grupos de prueba como sigue: (a) 10 ratones BALB/c
son inyectados con 100 \mug de OVA 323-339 en
adyuvante completo de Freund H37Ra en la base de la cola y
reforzados de nuevo 7 días más tarde, para inducir una respuesta
inmunitaria al péptido OVA 323-339. El día antes
del día de cada inmunización con OVA, 5 de los ratones son
inyectados IV con 10-100 \mug del
I-A^{d} OVA monocatenario soluble en PBS. Esta
proteína de fusión soluble se unirá al receptor de células T (TcR)
presentado sobre las células THE específicas para OVA
323-339. Debido a la ausencia de la señal
co-estimulante, estas células T_{H} son inducidas
a un estado de anergia. Puesto que el cambio de la clase de
inmunoglobulina es un procedimiento dependiente de células T_{H},
se espera que la inducción de anticuerpo anti-IgG de
OVA 323-339 se reduzca en los ratones tratados con
I-A^{d}-OVA monocatenario. Los 5
ratones restantes sirven como control y reciben PBS.
Diez días después de la segunda inmunización, se
recoge sangre de cada ratón mediante sangrado de la cola. La sangre
se centrifuga a aproximadamente 14.000 G durante 3-5
minutos y el suero se recoge. Los ensayo se realizan en placas de
microvaloración de 96 pocillos (Maxisorp F8; Nunc, Inc.) revestidas
en 1-50 \mug/ml con ovalbúmina usando un tampón
de revestimiento de Tris-HCl, pH 8,5. Las placas se
cubren con película piezosensible (Falcon, Becton Dickinson,
Oxnard, CA) y se incuban durante la noche a 4ºC. Las placas se lavan
a continuación con solución de lavado
(Imidazol/NaCl/Tween-20 al 0,4%) y se bloquean
añadiendo 100 \mul/pocillo de una solución de BSA al 3%. Después
de la incubación sobre un rotador de placas a temperatura ambiente
durante 30 minutos, las placas se lavan 5 veces con solución de
lavado. Los sueros de los ratones se diluyen 1:500 en diluyente de
muestra/conjugado (gelatina al 2% + Tween-20 al 0,1%
en PBS) y a continuación, por duplicado, se diluyen en serie sobre
la placa. Se establecen dos placas idénticas para cada proteína de
revestimiento, una para la determinación de la concentración de IgM
y la otra para IgG. Después de la incubación a temperatura ambiente
durante 30 minutos, las placas se lavan 5 veces con solución de
lavado. Se añaden a las placas apropiadas conjugados anti-(IgM de
ratón) de cabra-HRP y anti-(IgG de ratón) de
cabra-HRP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN,
dilución 1:100 en diluyente de muestra/conjugado). Después de la
incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, las placas se
lavan 5 veces con solución de lavado y a continuación se incuban con
100 \mul/pocillo de sustrato de desarrollo ABTS (Kirkgaard &
Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Las reacciones se detienen con 100
\mul/pocillo de tampón de Quench (Kirkgaard & Perry
Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) y los valores de la
absorbancia se leen a 405 nm usando un lector de ELISA de placas de
microvaloración automatizado (Ceres UV900HI, Bioteck, Winooski,
Vermont). La concentración se determina representando la lectura de
la absorbancia frente al logaritmo de las diluciones de las
muestras. Las concentraciones para IgM se comparan a continuación.
Según se detalla anteriormente, se espera que las moléculas
solubles de MHC clase II monocatenario ligado a péptido inhiban el
cambio de clase de IgG de una manera específica para el péptido
debido a la anergia inducida en las células T_{H} reactivas con
péptido correspondientes.
Los efectos de las moléculas solubles de MHC
monocatenario conectado a péptido sobre la expansión clonal de
líneas de células T específicas para el péptido in vivo
pueden examinarse como sigue. Los grupos de tratamiento (4 ratones
por grupo) son adecuadamente los mismos que los descritos
anteriormente. El procedimiento de inmunización es adecuadamente
como sigue: los ratones se inyectan IV con 10-100
\mug de la proteína de fusión soluble de
I-A^{d}-OVA monocatenaria en PBS y
24 horas más tarde son inyectados subcutáneamente en la base de la
cola con 50 \mug de OVA 323-339 en adyuvante
completo de Freund H37Ra. Estas dos inyecciones se repiten 6 y 7
días más tarde. Siete días después de la terminación del segundo
grupo de inyecciones, los ratones son sacrificados. Los nódulos
linfáticos inguinales y paraaórticos se extirpan y se convierten en
una suspensión de células simples.
La suspensión se agota de células que presentan
antígeno mediante incubación sobre lana de nailon y columnas
Spehadex G-10, y las poblaciones de células T
purificadas resultantes se incuban con APCs sometidas a impulsos
con el péptido OVA 323-339. Células B esplénicas
sirven como células que presentan antígeno. Estas células se fijan
con mitomicina C (de 50 a 100 \mug/ml en una suspensión de 4 x
10^{6} esplenocitos/ml) para inhibir la proliferación de las
células B, se lavan intensivamente y se añaden a células T
purificadas con diversas concentraciones del péptido OVA
323-339. El ensayo de proliferación se lleva a cabo
en placas de microvaloración de fondo redondo de 96 pocillos a
37ºC, CO_{2} al 5%, durante 3-5 días. Los pocillos
se someten a impulsos con 1 \muCi de
^{3}H-timidina 18 horas antes de la terminación de
los cultivos y se recogen usando un recogedor de células Skatron.
La incorporación de ^{3}H-timidina en DNA como una
medida de la proliferación de células T se determina usando un
espectrómetro de centelleo de líquidos LKB. El grado de
proliferación de células T reactivas con péptido es indicativo de
las respuestas de células T_{H} (es decir de la expansión clonal)
que tienen lugar en los ratones después de la inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
Un ejemplo de un sistema modélico para probar
los efectos del sistema de inoculación de DNA (particularmente
intramuscular o intradérmico) se esboza como sigue. Tres grupos de
ratones BLB/c son inyectados intramuscularmente (IM) en ambas patas
traseras con 100 \mug de: (1) SCE1, (b) SCT1 o (c) solución
salina. Las inyecciones se administrarán a las 0, 2 y 4 semanas. A
las 4 y 5 semanas después de la inyección de DNA inicial, el péptido
OVA 323-330 (100 \mug/ratón en adyuvante completo
de Freund H37Ra) se inyecta subcutáneamente en la base de la cola.
Dos semanas más tarde (semana 8), se recoge sangre de cada ratón
mediante sangrado de la cola y se obtiene suero después de la
centrifugación a aproximadamente 14.000 G durante
3-5 minutos. Las valoraciones de anticuerpos de IgG
e IgM específicos de OVA se determinan como se describe
anteriormente. El grado de anticuerpo de IgG específico para OVA es
indicativo del cambio de la clase de inmunoglobulina dirigido a
células T_{H} que tiene lugar en los ratones después de la
inmunización con el péptido. Por lo tanto, la inoculación de DNA
con los vectores de expresión del MHC monocatenarios conectados a
péptido puede provocar una reducción en el nivel de anticuerpos de
IgG específicos para el péptido sin afectar a los niveles de
anticuerpo de IgM.
Un ensayo alternativo es medir la expansión o
proliferación clonal de células T_{H} específicas para OVA.
Brevemente, se preparará una suspensión de células a partir de los
nódulos linfáticos inguinales y paraaórticos 7 días después de la
segunda inmunización con OVA. La suspensión se agota de células que
presentan antígeno mediante incubación sobre lana de nailon y
columnas Sephadex G-10, y las poblaciones de células
T purificadas resultantes se incuban con APCs sometidas a impulsos
con el péptido OVA 323-339. Las células B esplénicas
sirven como células que presentan antígeno. Estas células se fijan
con mitomicina C (de 50 a 100 \mug/ml en una suspensión de 4 x
10^{6} esplenocitos/ml) para inhibir la proliferación de las
células B, se lavan intensivamente y se añaden a células T
purificadas con diversas concentraciones del péptido OVA
323-339. El ensayo de proliferación de células T
específicas para OVA se lleva a cabo como se describe anteriormente.
El grado de proliferación de células T reactivas frene al péptido
es indicativo de las respuestas de células T_{H} (es decir de la
expansión clonal) que tienen lugar en los ratones después de la
inmunización con el péptido. Por lo tanto, la inoculación de DNA
con los vectores de expresión del MHC monocatenarios conectados a
péptido puede provocar una reducción en el nivel de proliferación de
células T_{H} específicas para el péptido.
La invención se ha descrito con referencia a
modalidades preferidas de la misma. Sin embargo, se apreciará que
los expertos en la técnica, al considerar esta descripción, pueden
hacer modificaciones y mejoras dentro del espíritu y el alcance de
la invención.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sunol Molecular Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2810 North Commerce Parkway
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Miramar
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Florida
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU. de A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 33025
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPLEJOS DE MHC Y USOS DE LOS MISMOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 123
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: PC Compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/09816
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 31 de JULIO de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/382.454
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01 de FEBRERO de 1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/283.302
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 de JULIO de 1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACCATG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip2,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 58 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip3,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 99:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 99:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 100:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 100:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip6.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 101:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 101:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 102:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 103:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 95 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 103:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 104:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 105:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 106:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 106:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 107:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 194 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 107:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 108:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 108:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 109:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 109:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 110:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 110:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 111:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 111:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 112:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 113:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 114:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 115:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 116:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 118:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 119:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1385 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 6..1382
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1508 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 6..1505
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 122:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1382 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 6..1382
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 123:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Un complejo de fusión del MHC que comprende
una molécula de MHC clase II que contiene una ranura que se une a
péptido, y un péptido de presentación conectado covalentemente a la
molécula del MHC,
en el que las subunidades de cadena \alpha y
\beta están conectadas como una proteína de fusión monocatenaria
con el péptido de presentación,
en el que el péptido de presentación y el
complejo de fusión son capaces de modular la actividad de un
receptor de células T para inducir la proliferación de células
T,
en el que una secuencia conectora se interpone
entre la molécula del MHC y el péptido de presentación,
en el que una segunda secuencia conectora
("secuencia conectora monocatenaria") se usa para conectar las
cadenas \alpha y \beta y
en el que ambas secuencias conectoras son
flexibles para permitir el plegamiento de la molécula monocatenaria
hasta una forma activa.
2. Una construcción de DNA que codifica para el
complejo de fusión del MHC de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Un método para la identificación de un
péptido que puede modular la actividad de células T para inducir la
proliferación de células T, que comprende:
introducir en células huésped vectores de
clonación que contienen cada uno construcciones de DNA que codifican
para un complejo de fusión del MHC de acuerdo con la reivindicación
1;
cultivar las células huésped bajo condiciones
adecuadas para la expresión del complejo de fusión del MHC; y
seleccionar células huésped que expresan el
complejo de fusión del MHC que modula la actividad de células
T.
4. Un vector de expresión recombinante simple
que comprende DNA que codifica para las cadenas \alpha y \beta
del complejo de fusión del MHC de acuerdo con la reivindicación
1,
y opcionalmente también codifica para un factor
coestimulante de células T.
5. El uso de 1) una secuencia de DNA que
comprende la construcción de acuerdo con la reivindicación 2, ó 2)
una secuencia de DNA que codifica para una molécula monocatenaria de
acuerdo con la reivindicación 1,
para la preparación de un agente para inducir
una respuesta inmunitaria que comprende proliferación de células T
en un mamífero, preferiblemente para vacunar a un mamífero contra un
trastorno elegido.
6. El uso de un complejo de fusión del MHC de
acuerdo con la reivindicación 1, para la preparación de una
composición farmacéutica para inducir una respuesta inmunitaria que
comprende proliferación de células T.
7. Composición farmacéutica que comprende al
menos un complejo de fusión del MHC de acuerdo con la reivindicación
1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
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