ES2153808T3 - Tira de ensayo con biosensor electroquimico mejorada. - Google Patents

Abstract

Una tira de ensayo, que comprende: un primer sustrato aislante que tiene una primera y una segunda superficies, una indentación a lo largo de un borde y un orificio de ventilación; al menos dos pistas eléctricamente conductoras fijadas a la primera superficie del primer sustrato aislante; un segundo sustrato aislante que tiene una primera y una segunda superficies, una indentación similar a la indentación del primer sustrato aislante, y una primera y una segunda aberturas, estando la segunda superficie fijada a las pistas conductoras y a la primera superficie del primer sustrato aislante, y orientada de modo que la indentación del segundo sustrato aislante se encuentre sobre la indentación del primer sustrato aislante, dejando la primera abertura al descubierto parte de las pistas conductoras para conexión eléctrica a un medidor capaz de medir una propiedad eléctrica, dejando al descubierto la segunda abertura una parte diferente de las pistas conductoras y el orificio de ventilación; un reactivo de ensayo que se encuentra sobre, al menos, parte de las pistas conductoras dejadas al descubierto por la segunda abertura; y un techo que tiene superficies primera y segunda y una indentación que es similar a las indentaciones del primero y del segundo sustratos aislantes, estando fijada la segunda superficie del techo a la primera superficie del segundo sustrato aislante y posicionada de manera que 1) la segunda superficie del techo y la superficie del primer sustrato aislante formen paredes opuestas de una cámara de llenado por apilaridad, y 2) la indentación del techo se encuentre sobre las indentaciones del primero y del segundo sustratos aislantes.

Description

Tira de ensayo con biosensor electroquímico mejorada.

Ámbito de la presente invención

La presente invención se refiere a un biosensor y a su uso para detectar o medir analitos en fluidos.

Antecedentes la presente invención

El estado técnico previo engloba tiras de ensayo, incluyendo las tiras de ensayo con biosensor electroquímico, para medir la cantidad de un analito en un fluido.

Este tipo de tiras de ensayo se ha empleado especialmente para medir glucosa en sangre humana. Dichas tiras han sido usadas por diabéticos y profesionales sanitarios para medir sus niveles de glucosa en sangre. Las tiras de ensayo suelen emplearse en combinación con un medidor, que mide luz reflejada, si la tira está diseñada para la detección fotométrica de un colorante, o bien alguna propiedad eléctrica, p.ej. una corriente, si la tira está diseñada para la detección de un compuesto electroactivo.

Sin embargo las tiras de ensayo fabricadas hasta la fecha presentan ciertos problemas a los usuarios. Por ejemplo, son relativamente pequeñas y por tanto un diabético con la vista disminuida puede tener gran dificultad en depositar bien una muestra de sangre en la zona de la tira prevista para ello. Sería útil que la tira de ensayo estuviera hecha de tal modo, que las personas con visión reducida pudiesen aplicar fácilmente la muestra.

Cuando la tira de ensayo es un modelo de llenado capilar, es decir, cuando la cámara de reacción química de la tira de ensayo es un espacio capilar, puede resultar difícil llenarla de modo suficiente con la muestra líquida objeto de análisis. Debido a la pequeñez del espacio capilar y a la composición de los materiales empleados en la elaboración de la tira, la muestra ensayada puede fluctuar al penetrar en la cámara de reacción capilar. También es posible que la cámara de reacción capilar absorba una cantidad insuficiente de muestra y que, por tanto, el resultado de la prueba sea inexacto. Sería muy conveniente que pudieran minimizarse dichos problemas.

En definitiva, las tiras de ensayo se producen en masa, sobre todo las que emplean los diabéticos para medir glucosa en sangre. Procesos como el troquelado mecánico - usado para fabricar estas tiras de ensayo - pueden provocar el cuarteamiento o la rotura del reactivo secado sobre la superficie de la zona de ensayo de la tira, con lo cual hay una pérdida de reactivo o una colocación incorrecta del mismo en la tira. También sería útil diseñar un reactivo de ensayo que pudiera resistir etapas de proceso tales como el troquelado mecánico.

La tira de ensayo con biosensor electroquímico de la presente invención ofrece soluciones a dichos problemas encontrados en las tiras de ensayo del estado técnico previo.

Resumen de la presente invención

La presente invención es una tira de ensayo con biosensor electroquímico mejorada con cuatro nuevas características muy ventajosas.

La primera característica nueva es una escotadura a lo largo de uno de los bordes de la tira de ensayo, para que las personas con visión disminuida identifiquen fácilmente el punto de aplicación de la muestra o para usar con nula o poca iluminación.

La tira tiene una cámara de ensayo capilar y el techo de la cámara de ensayo incluye la segunda característica nueva de la tira de ensayo biosensora. La segunda característica nueva es una ventana transparente o translúcida que funciona como un límite tipo "llenar hasta aquí", indicando así cuando se ha añadido suficiente cantidad de muestra (de una muestra líquida, como la sangre) a la cámara de ensayo para efectuar la prueba de manera exacta. La ventana determina la cantidad mínima de muestra, o dosis, necesaria para realizar correctamente un ensayo y, por tanto, supone un sistema visual infalible que disminuye la probabilidad de resultados de ensayo erróneos.

La longitud y la anchura de la ventana son más cortas que la longitud y la anchura de la cámara de ensayo capilar. La ventana está dimensionada y situada de manera que cubra toda la anchura del electrodo de trabajo y al menos un 10% de la anchura del contraelectrodo o electrodo de referencia de la tira de ensayo biosensora. Preferiblemente, el área del techo que rodea la ventana está coloreada de modo que haya un buen contraste entre la muestra observada a través de la ventana y el área del techo que rodea la ventana, a fin de poder apreciar fácilmente si la dosificación de la tira es suficiente.

La tercera característica nueva de la tira de ensayo es la inclusión de una o varias muescas situadas en el punto de aplicación de la muestra. Se practica una muesca tanto en el primer substrato aislante como en el techo de la tira. Estas muescas están dimensionadas y situadas de modo que se superponen en la tira de ensayo. Estas muescas reducen el fenómeno llamado "fluctuación de dosis". Cuando se añade una muestra en el punto de aplicación de una tira sin muescas, la muestra puede fluctuar a la entrada de la cámara de ensayo capilar. Esta "fluctuación de dosis" incrementa el tiempo de ensayo. Si la tira tiene una muesca la fluctuación disminuye. Además la inclusión de la muesca en el primer substrato aislante y en el techo facilita la aproximación de la muestra al punto de aplicación desde una amplia variedad de ángulos. El ángulo de aproximación de la muestra sería más limitado si solamente hubiera muescas en el techo.

Por último, la cuarta característica nueva de la tira de ensayo es un reactivo que lleva poli(óxido de etileno) con un peso molecular medio de aproximadamente 100 kilodaltons hasta 900 kilodaltons, en concentraciones de aproximadamente 0,2% (peso:peso) hasta 2% (peso:peso), con lo cual el reactivo secado resulta más hidrófilo y resistente. Con la inclusión de poli(óxido de etileno) el reactivo de ensayo puede resistir fácilmente el troquelado mecánico durante la fabricación de las tiras y la manipulación mecánica por parte del usuario. Asimismo el reactivo secado, que suele llevar aproximadamente desde 1,75% (peso:peso) hasta 17,5% (peso:peso) de poli(óxido de etileno), se puede redisolver o resuspender con facilidad al añadir una muestra acuosa a la tira de ensayo.

Descripción sucinta de los dibujos

La fig. 1 es un plano de despiece de una forma de ejecución preferida de la presente invención.

La fig. 2 muestra una tira de ensayo preferida totalmente montada.

Las figs. 3a-3i representan un método preferido de elaborar la tira de ensayo de la presente invención.

La fig. 4 es un corte de la tira de ensayo de la fig. 2 a través de la línea 28-28.

La fig. 5 es un corte de la tira de ensayo de la fig. 2 a través de la línea 29-29.

La fig. 6 ilustra curvas de calibración hipotéticas para distintos lotes de tiras de ensayo.

Descripción de la presente invención

En las figuras 1, 2, 4 y 5 se representan los componentes de una forma de ejecución preferida del biosensor de la presente invención. El biosensor comprende un primer substrato aislante (1), que tiene una primera superficie (22) y una segunda superficie (23). El substrato aislante (1) puede ser de cualquier material aislante útil. Normalmente plásticos tales como los polímeros vinílicos, las poliimidas, los poliésteres y los estirénicos proporcionan las propiedades eléctricas y estructurales deseadas. El primer substrato aislante (1) lleva además la escotadura (2), la muesca (3) y el orificio de ventilación (4). Como el biosensor representado en la fig. 1 está pensado para ser producido en serie a partir de rollos de un material que sea suficientemente flexible para procesar bobinas, pero a la vez suficientemente fuerte para conferir una rigidez adecuada al biosensor acabado, un primer substrato aislante (1) particularmente preferido es el plástico MELINEX 329, de 0,18 mm de grosor (7 milésimas de pulgada), un poliéster de la firma ICI Films (3411 Silverside Road, PO Box 15391, Wilmington, Delaware 19850).

Tal como está representado en la fig. 1, las pistas eléctricamente conductoras (5) y (6) están montadas sobre la primera superficie (22) del primer substrato aislante (1). La pista (5) puede ser un electrodo de trabajo hecho de materiales eléctricamente conductores como paladio, platino, oro, carbono y titanio. La pista (6) puede ser un contraelectrodo formado por materiales eléctricamente conductores como paladio, platino, oro, plata, aleaciones de plata, aleaciones de níquel-cromo, carbono, titanio y cobre. Se prefieren los metales nobles porque proporcionan una superficie de electrodo más constante y reproducible. Se prefiere especialmente el paladio porque es uno de los metales nobles más difíciles de oxidar y porque es un metal noble relativamente económico.

Las pistas eléctricamente conductoras (5) y (6) se depositan preferiblemente sobre un soporte aislante, tal como poliimida o poliéster, a fin de disminuir la posibilidad de rotura del material del electrodo durante el manejo y la elaboración de la tira de ensayo. Un ejemplo de tales pistas conductoras es una capa de paladio con una resistencia superficial inferior a 5 ohmios por metro cuadrado sobre un soporte de poliimida UPILEX, que vende la firma Courtalds-Andus Performance Films de Canoga Park, California.

Las pistas eléctricamente conductoras (5) y (6) representan los electrodos de la tira de ensayo biosensora. Estos electrodos deben estar suficientemente separados, de modo que los procesos electroquímicos en un electrodo no interfieran con los procesos electroquímicos en el otro electrodo. La distancia preferida entre los electrodos (5) y (6) es aproximadamentede 1,2 milímetros (mm).

En la tira de ensayo representada en la fig. 1 la pista eléctricamente conductora (5) sería el electrodo de trabajo y la pista eléctricamente conductora (6) sería un contraelectrodo o electrodo de referencia. La pista (6) sería un electrodo de referencia si estuviera hecha de materiales típicos de electrodos de referencia, tales como plata/cloruro de plata. En una forma de ejecución preferida la pista (5) es un electrodo de trabajo hecho de paladio y la pista (6) un contraelectrodo también hecho de paladio, cuyo tamaño es básicamente igual al del electrodo de trabajo.

También son posibles aquellas combinaciones de tres electrodos en que la tira incluye otra pista eléctricamente conductora situada entre la pista conductora (6) y el orificio de ventilación (4). En una combinación de tres electrodos la pista conductora (5) sería un electrodo de trabajo, la pista (6) un contraelectrodo y el tercer electrodo entre la pista (6) y el orificio de ventilación (4) un electrodo de referencia.

Cubriendo las pistas conductoras (5) y (6) hay un segundo substrato aislante (7) hecho de un material similar o preferiblemente igual al del primer substrato aislante (1). El substrato (7) tiene una primera superficie (8) y una segunda superficie (9). La segunda superficie (9) está fijada a la superficie del substrato (1) y a las pistas conductoras (5) y (6) mediante un adhesivo tal como un pegamento termofusible. Un ejemplo de un adhesivo de este tipo es el DYNAPOL S-1358, de la firma Hüls America, Inc., 220 Davidson Street, PO Box 6821, Somerset, NJ 08873. El substrato (7) también incluye una primera abertura (10) y una segunda abertura (11). La primera abertura (10) deja al descubierto una parte de las pistas conductoras (5) y (6), para la conexión eléctrica a un medidor que mide alguna propiedad eléctrica de una muestra examinada, una vez mezclada con el reactivo de la tira de ensayo. La segunda abertura (11) expone otra parte de las pistas conductoras (5) y (6), para la aplicación del reactivo de ensayo (12) sobre estas superficies abiertas de las pistas (5) y (6). (En la fig. 1 toda la anchura de las pistas conductoras (5) y (6) queda expuesta por la abertura (11). No obstante, también cabe la posibilidad de exponer solo una porción de la anchura de la pista conductora (6), que es un contraelectrodo o un electrodo de referencia, siempre que la abertura (11) deje al menos descubierta un 10% de la anchura). Además el segundo substrato aislante (7) comprende una escotadura (19), que coincide con la escotadura (2), tal como se indica en la fig. 1.

El reactivo de ensayo (12) es específico para la prueba que se realiza con la tira de ensayo. El reactivo de ensayo (12) se puede aplicar sobre toda la superficie expuesta de las pistas conductoras (5) y (6) en el área determinada por la segunda abertura (11). La manera de aplicar el reactivo (12) en dicha zona también puede ser diferente. Por ejemplo, si en esta zona de la tira la pista conductora (6) está formada como electrodo de referencia, del tipo plata/cloruro de plata, el reactivo (12) solo es necesario que cubra la superficie expuesta del electrodo de trabajo (5) en dicha zona. Asimismo no hace falta que toda la superficie expuesta de un electrodo quede cubierta con el reactivo de ensayo, con tal que lo esté una superficie bien definida y reproducible del electrodo.

Recubriendo una parte de la primera superficie (8) y de la segunda abertura (11) está el techo (13). El techo (13) incluye la escotadura (14) y la muesca (15). Por su forma y su colocación la escotadura (14) y la muesca (15) coinciden con las escotaduras (2) y (19) y con la muesca (3). El techo (13) puede ser de un material plástico - como una lámina de poliéster transparente o translúcida, de aproximadamente 0,05 mm (2 milésimas de pulgada) hasta 0,15 mm (6 milésimas de pulgada). El techo (13) tiene una primera superficie (16) y una segunda superficie (17). La segunda superficie (17) del techo (13) está fijada a la primera superficie (8) del segundo substrato aislante (7) mediante un adhesivo adecuado, tal como el pegamento acrílico 3 M 9458 de la firma 3M, Identification and Converter Systems Division, 3M Center, Building 220-7W-03, St. Paul, MN 55144.

Preferiblemente el techo (13) incluye una ventana (18) transparente o translúcida. La ventana (18) está dimensionada y situada de tal modo que, al fijar el techo (13) sobre el segundo substrato aislante (7), cubre toda la anchura de la pista conductora (5) y al menos un diez por ciento de la anchura de la pista conductora (6).

La segunda superficie (17) del techo (13), los bordes de la abertura (11) y la primera superficie 22 del substrato aislante (1) (así como las pistas conductoras (5) y (6) fijadas a la primera superficie (22) del substrato (1)) definen una cámara de ensayo capilar. La longitud y la anchura de esta cámara están delimitadas por la longitud y la anchura de la abertura (11) y su altura por el grosor del segundo substrato aislante (7).

Una tira de ensayo preferida se puede elaborar mediante el proceso ilustrado por las figs. 3a-3i. Una lámina de material substrato aislante (21) (MELINEX 329, de 0,18 mm de grosor (7 milésimas de pulgada), de ICI) se recubre por una cara con un adhesivo termofusible (DYNAPOL S-1358 de Hüls) (fig. 3a). La lámina (21) se corta a lo largo de la línea (24), formando el primer substrato aislante (1) recubierto con adhesivo sobre la primera superficie (22) y el segundo substrato aislante (7) recubierto con adhesivo sobre la segunda superficie (9) (figs. 3b y 3c). En el substrato (7) se troquela la primera abertura (10) y la segunda abertura (11) (fig. 3d). Luego las pistas eléctricamente conductoras (5) y (6) - de paladio sobre soporte Upilex (de Courtalds-Andus Performance Films) - se desenrollan de unos rollos cortados previamente a unos 1,5 milímetros de anchura y se depositan sobre la superficie (22) del substrato (1), con lo cual el soporte de Upilex es adyacente a la superficie (22). La superficie (9) del substrato (7) se deposita sobre la superficie (22) del substrato (1) y las pistas conductoras (5) y (6), formando la estructura sandwich mostrada en la fig. 3e. Dicha estructura sandwich está termosellada.

Después se introduce un reactivo (12) por la abertura (11) y se seca (fig. 3f). Una vez seco el reactivo (12) se troquela el orificio de ventilación (4) (fig. 3g). Luego el techo (13) - que comprende el recubrimiento hidrófilo (25) y la ventana (18) - se deposita sobre la abertura (11) de modo que la ventana (18) cubre toda la anchura de la pista conductora (5) y aproximadamente una mitad de la anchura de la pista conductora (6). El techo (13) se desprende de un soporte antiadherente y se adhiere a la superficie (8), tal como está representado en la fig. 3h.

Por último se troquelan las tiras de ensayo individuales, tal como indica la fig. 3i. El troquel puede recortar tiras de ensayo con o sin la muesca (15). Si se incluye la muesca (15), el ángulo preferido del vértice es de 105º. La muesca (15) también puede tener otros ángulos, por ejemplo desde 45º hasta 105°. Asimismo puede haber una sola muesca (15) o varias.

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Tal como se ha dicho antes, el reactivo de ensayo (12) se introduce por la zona de la tira de ensayo definida por el recorte (11). En el proceso de elaboración descrito anteriormente es preferible llevar a cabo un tratamiento de corona de la abertura (11) antes de aplicar el reactivo de ensayo (12). La aplicación del tratamiento de corona sirve para incrementar la energía superficial de la porción de la superficie (22) y de las pistas conductoras (5) y (6) expuestas por la abertura (11) - lo cual favorece la extensión uniforme del reactivo (12) - y como limpieza previa de la porción de las pistas conductoras (5) y (6) expuestas por la abertura (11). Se ha demostrado que la limpieza previa de las pistas conductoras (5) y (6) mejora notablemente el funcionamiento de la tira de ensayo. El tratamiento de corona puede aplicarse a densidades en vatios desde aproximadamente 20 hasta 90 vatios por centímetro por segundo (W/cm/s) con una distancia de arco de aproximadamente 1 mm (0,040 pulgadas).

En el método preferido el tratamiento corona se aplica de modo global sobre las superficies representadas en la fig. 3e con las densidades en vatios descritas. El tratamiento tiene la máxima efectividad si se efectúa dentro de los 5 minutos previos a la aplicación del reactivo (12) y suele practicarse en los 45 segundos previos a la aplicación del reactivo (12).

Conviene reducir los efectos del tratamiento corona sobre la superficie (8), para asegurar que el reactivo (12) se concentre plenamente en la abertura (11) y no tenga más afinidad por la superficie (8) que por la porción de la superficie (22) y de las pistas conductoras (5) y (6) expuestas por la abertura (11). Se agrega un proceso de disipación de corona que permite reducir selectivamente los efectos de un proceso global de tratamiento corona, para rebajar los efectos del tratamiento en áreas del tejido (la lámina de tiras de ensayo en proceso) fuera de la abertura (11). Este proceso de disipación de corona consiste en aplicar un film delgado de agua desionizada, de manera que el agua esté en contacto con la superficie (8), pero no con las aberturas (10) y (11). El film delgado de agua, preferiblemente de unas 1,5 hasta 3,0 micras de espesor (aproximadamente 9,1 gramos de agua por metro cuadrado), puede aplicarse mediante una almohadilla empapada, por impresión flexográfica u otros métodos de recubrimiento comercialmente disponibles. Después el film delgado de agua se puede secar utilizando métodos de convección o de infrarrojos, justo antes de aplicar el reactivo (12). El efecto neto de este tratamiento es que la energía superficial de la superficie (8) se reduce eficazmente a menos de 62 dinas antes de aplicar el reactivo (12), mientras que la superficie de la abertura (11) mantiene la energía superficial que tenía tras el tratamiento de corona.

En la forma de ejecución preferida el reactivo de ensayo (12) está formulado para medir glucosa en una muestra de sangre humana. Seguidamente se indica un plan para preparar un litro de un reactivo de glucosa preferido, usando el enzima quino-proteína (que lleva pirroloquinolina quinona (PQQ)) glucosa deshidrogenasa y el mediador redox ferricianuro. (La quino-proteína glucosa deshidrogenasa tiene el n2 1.1.99.17 de la comisión de enzimas).

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Etapa 1

Se prepara una disolución de NATROSOL en agua desionizada, añadiendo 0,45 gramos (g) de NATROSOL-250M (una hidroxietilcelulosa microcristalina de la firma Aqualon) a 414 g de agua desionizada, mientras se agita a una velocidad no inferior a 250 revoluciones por minuto (rpm) durante un periodo no inferior a 30 minutos. La mezcla se consigue mejor mediante un agitador eléctrico giratorio de hélice con tres o cuatro palas o álabes. La elección del tamaño y de la forma del agitador depende mucho del radio del depósito de mezcla utilizado. La hélice escogida suele tener un radio superior al 75% del radio del depósito de mezcla.

Etapa 2

En la solución de la etapa 1 se dispersan 1,56 g de AVICEL RC-591F (una celulosa microcristalina de la firma FMC Corp.) agregándolo gradualmente a la solución mientras se agita a una velocidad no inferior a 750 rpm durante no menos de 60 minutos.

Etapa 3

A la mezcla de la etapa 2 se le añaden gradualmente 8,4 g de poli(óxido de etileno) (de 300 kilodalton de peso molecular medio), mientras se agita a una velocidad no inferior a 690 rpm durante un periodo no inferior a 45 minutos.

Etapa 4

Se prepara una solución tampón añadiendo 12,1 g de fosfato potásico monobásico (anhidro) y 21,3 g de fosfato potásico dibásico (anhidro) a 450 g de agua desionizada.

Etapa 5

Se extrae un alícuota de 50 g de la solución tampón preparada en la etapa 4. A este alícuota de 50 g se le añaden 12,5 mg de coenzima PQQ (que vende Fluka). Esta solución se agita hasta que el coenzima está totalmente disuelto. (Para la preparación del enzima se prefiere un agitador constituido por una barra y una placa magnéticas).

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Etapa 6

A la solución de la etapa 5 se le añaden gradualmente 1,21 millones de unidades del apoenzima de quinoproteína glucosa deshidrogenasa, agitando a baja velocidad (menos de 400 rpm sobre una placa magnética de agitación), a fin de evitar que se forme espuma. La solución resultante se mezcla durante un tiempo no inferior a 2 horas, para permitir que se estabilice la asociación de enzima y coenzima, dando lugar a una solución de quinoproteína glucosa deshidrogenasa.

Etapa 7

Se agregan 59,1 g de ferricianuro potásico a la solución tampón de la etapa 4. Luego se añaden 6,2 g de succinato sódico. La solución obtenida se mezcla hasta que todos los solutos están completamente disueltos. Tras la disolución se evalúa el pH de la solución, que debe ser aproximadamente de 6,76 más menos 0,05.

Etapa 8

La solución de la etapa 7 se incorpora gradualmente a la mezcla de la etapa 3, agitando a una velocidad no inferior a 190 rpm.

Etapa 9

Se agregan 20 g de trehalosa a la mezcla de la etapa 8, agitando a una velocidad no inferior a 190 rpm por un periodo no inferior a 10 minutos.

Etapa 10

Se añaden 0,35 g del tensioactivo TRITON X-100, de Boehringer Mannheim Biochemicals, a la mezcla obtenida en la etapa 9, agitando a una velocidad no inferior a 190 rpm. Esta mezcla debe seguir en agitación durante no menos de 5 minutos.

Etapa 11

La solución enzimática de la etapa 6 se añade a la mezcla de la etapa 10 y el reactivo ya completo se mezcla a una velocidad no inferior a 190 rpm durante un periodo no inferior a 30 minutos.

Etapa 12

Ahora el reactivo se puede filtrar, tal como lo requiere el equipo de fabricación, pasándolo a través de una bolsa tamiz de 100 micras o bien a través de un filtro de 100 micras integrado en un sistema de bombeo.

El apoenzima de la quinoproteína glucosa deshidrogenara especificado arriba se obtiene de la Boehringer Mannheim GmbH en Alemania (número de identificación 1464221 de Boehringer Mannheim GmbH). Como alternativa, este apoenzima puede obtenerse partiendo de Acinetobacter Calcoaceticus, según el protocolo siguiente, expuesto en Duine y otros, FEBS Letters, vol. 108, n° 2, págs. 443-46.

Se cultiva Acinetobacter Calcoaceticus en un medio salino mineral suplementado con succinato sódico 0,02 molar (M) o con metanol 0,10 M, a 22ºC y con buena aireación. Se recogen las células al final de la fase logarítmica y puede obtenerse un rendimiento de células húmedas de \sim4 g/l.

Se descongelan células congeladas (10 g) y se mezclan con 15 mililitros (ml) de tampón Tris/39 mM glicina 36 milimolar (mM). Tras añadir 6 miligramos (mg) de lisozima, la suspensión se agita a temperatura ambiente durante 15 min. y se centrifuga durante 10 min. a 48.000 xg. Se descarta el sobrenadante y el precipitado se extrae dos veces con un tampón de Tris/39 mM glicina 36 mM que lleva 1% del tensioactivo TRITON X-100. Los sobrenadantes de las etapas de centrifugación se combinan y se usan inmediatamente.

El extracto libre de células se añade a una columna DEAE-Sephacel (13 x 2,2 centímetros (cm)) equilibrada con tampón Tris/39 mM glicina 36 mM que lleva 1% de tensioactivo TRITON X-100 y la columna se lava con el mismo tampón. El enzima no se adhiere al material de la columna y las fracciones activas reunidas se valoran con ácido acético 2 M hasta pH 6,0. Esta solución se añade inmediatamente a una columna de CM-sefarosa CL-6 B (5 x 1 cm) equilibrada con fosfato potásico 5 mM (pH 6,0). Después de lavar la columna con el mismo tampón hasta que no aparece tensioactivo en el eluato, el enzima se eluye con fosfato potásico 0,1 M (pH 7,0).

Luego el enzima se dializa contra acetato sódico 0,1 M (pH 4,5), que contiene bromuro potásico 3 M, a 42 durante 72 horas. Después el enzima se dializa contra fosfato potásico 0,02 M (pH 7,0) durante 12 horas, obteniéndose el apoenzima.

En la tira de ensayo preferida, la abertura (11) es aproximadamente de 3,2 milímetros por 6,7 milímetros. En la forma de ejecución preferida de una tira de ensayo para glucosa se introducen por la abertura (11) 4,5 microlitros del reactivo de ensayo preparado según el protocolo anterior. (Ver fig. 3f). Esta cantidad de reactivo cubre esencialmente las superficies expuestas de las pistas conductoras (5) y (6) en la abertura (11). Luego el reactivo de ensayo (12) se seca a aproximadamente 70ºC durante 1 a 2 minutos.

El film seco resultante del reactivo preferido de glucosa contiene aproximadamente 2.000 hasta 9.000 unidades de actividad enzimática por gramo de reactivo. El reactivo preferido contiene los siguientes componentes adicionales por gramo de reactivo:

100

Es importante que la inclusión de aproximadamente 0,2% en peso hasta 2% en peso de poli(óxido de etileno) con un peso molecular medio de aproximadamente 100 kilodaltons hasta 900 kilodaltons - preferiblemente de un 0,71% en peso de poli(óxido de etileno) con un peso molecular medio de 300 kilodaltons - en el reactivo húmedo arriba citado proporciona un reactivo de ensayo que, una vez seco, tiene más resistencia a las etapas de procesado de la tira, tales como el troquelado mecánico, y a la manipulación mecánica de la tira de ensayo por el usuario, y que se redisuelve o resuspende al añadirle una muestra acuosa, como de sangre humana. Después de secar, el porcentaje de poli(óxido de etileno) varía aproximadamente desde 1,75% (peso:peso) hasta 17,5% (peso:peso). En el reactivo preferido seco, el porcentaje de poli(óxido de etileno) es aproximadamente del 6,2% (peso:peso).

El espesor preferido del film seco de reactivo de glucosa es el que, en combinación con las características inherentes a la química del ensayo, mitiga la sensibilidad del ensayo a la interferencia por causa de la variación del hematocrito. En esta forma de ejecución preferida de la presente invención el espesor del film (calibrado por la razón entre el volumen de reactivo húmedo dispensado y la superficie expuesta por la abertura (11)) corresponde a la dosificación de 4,5 microlitros de reactivo sobre un área de aproximadamente 22,5 milímetros cuadrados (el área preferente de la abertura (11)). La inclusión de poli(óxido de etileno) de aproximadamente 100 kilodaltons hasta 900 kilodaltons de peso molecular medio en un film de dicho espesor da como resultado un sensor que tiene menos sensibilidad a la variación del hematocrito, cuando se mide glucosa de una muestra de sangre humana.

Después de secar el reactivo de ensayo (12) en la abertura (11) el techo (13) se deposita sobre la abertura (11) y se adhiere a la superficie (8) del modo anteriormente descrito. El propio techo (13) está elaborado en un proceso aparte, de acuerdo con los procedimientos abajo descritos.

Preferentemente el techo (13) está elaborado con una lámina de poliéster MELINEX 561, que tiene un grosor de 5 milésimas de pulgada. Sobre la primera superficie (16) de la plantilla (27) se imprime una tinta básicamente opaca, de tal manera que la ventana (18) queda transparente o translúcida. La ventana está situada y dimensionada de manera que, al fijar el techo a la superficie (8), queda alineado con la abertura (11), tal como se representa en la fig. 3h.

Sobre la segunda superficie (17) se lamina un sistema adhesivo, para que el techo quede finalmente unido a la superficie (8). Este sistema adhesivo puede ser ventajosamente de tipo acrílico, como los que hay comercialmente disponibles de varios proveedores, aunque se prefiere el número de catálogo 9458 de 3M Inc.

Además, antes de poner el techo sobre la superficie (8), se coloca contra el sistema adhesivo de la segunda superficie (17) una pieza de plástico con recubrimiento transparente o translúcido, preferiblemente de un poli(etilentereftalato) (PET) como el Melinex S, de aproximadamente 0,025 mm (0,001 pulgadas) hasta 0,1 mm (0,004 (0,001 pulgadas) de grosor, alineada con la ventana (18) y sobrepasando sus dimensiones. Este plástico recubierto es el recubrimiento hidrófilo (25), el cual se escoge específicamente para impartir carácter hidrófilo a la superficie interna de la cámara de ensayo capilar, con el fin de favorecer el flujo de una muestra acuosa, tal como sangre, hacia el interior de la cámara de ensayo. El recubrimiento (25) puede escogerse entre diversos recubrimientos diseñados para presentar una superficie hidrófila, pero se prefiere el producto ARCARE número 8586 de Adhesives Research Inc. El recubrimiento (25) también evita el contacto directo del adhesivo del techo con el reactivo (12).

Por último, el techo (13) se coloca sobre la superficie (8) (véase fig. 3h). Es en este momento cuando la ventana transparente o translúcida (18), definida por la ausencia de tinta impresa sobre el techo (13), debe alinearse con la abertura (11), tal como indica la fig. 3h. Las medidas de la ventana transparente o translúcida (18) deberían elegirse de manera que una porción sustancial de la anchura (mayor que un 75%) del canal capilar subyacente sea visible a través de la ventana (18). La dimensión ortogonal de la ventana (18) debería exponer toda la anchura del electrodo de trabajo (5). Por lo tanto, cuando una muestra, por ejemplo de sangre, se introduce en la cámara de ensayo capilar por el punto de aplicación (20), un usuario con agudeza visual razonable podrá comprobar si la ventana está totalmente llena de muestra. Si las dimensiones de la ventana se eligen del modo indicado, el usuario de la tira de ensayo podrá ver si la tira ha recibido suficiente dosis de muestra. La confirmación visual del llenado total de la ventana garantiza que hay suficiente superficie del electrodo de trabajo cubierta de muestra y que una parte suficiente del electrodo de referencia (6) también está cubierta. Esta cobertura de los electrodos por la muestra analizada es importante para llevar a cabo una prueba correcta en un biosensor electroquímico de llenado capilar. Dicha confirmación visual de la dosificación suficiente de la tira de ensayo supone una seguridad contra los resultados erróneos provocados por una infradosificación no detectada de la tira de ensayo.

Las tiras de ensayo completas (26) se usan con un medidor capaz de medir alguna propiedad eléctrica de la muestra analizada, una vez añadida en el punto de aplicación (20) (véase fig. 2). La propiedad eléctrica medida puede ser por ejemplo una corriente eléctrica, un potencial eléctrico, una carga eléctrica o una impedancia. En la patente U.S. nº 5,413,690 hay un ejemplo de cómo medir cambios de potencial eléctrico para realizar un ensayo analítico.

En las patentes U.S. n° 5,288,636 y 5,508,171 figura un ejemplo de cómo medir una corriente eléctrica para realizar un ensayo analítico.

En la forma de ejecución preferida la tira de ensayo (26) se conecta a un medidor que lleva una fuente de alimentación (una batería). En las patentes U.S. n° 4,999,632; 5,243,516; 5,366,609; 5,352,351; 5,405,511; 5,438,271 pueden encontrarse mejoras en dichos medidores y en un sistema biosensor.

Mediante la tira de ensayo electroquímica de la presente invención pueden analizarse muchos fluidos que contienen analitos. Por ejemplo pueden medirse analitos en fluidos corporales humanos como sangre entera, suero sanguíneo, orina y líquido cerebroespinal. Además pueden medirse analitos encontrados en productos de fermentación y en muestras ambientales que puedan contener contaminantes.

Para determinar la concentración de glucosa en una muestra de sangre humana con la tira de ensayo preferida anteriormente descrita, cuyas pistas (5) y (6) son de paladio y básicamente del mismo tamaño y donde el reactivo de glucosa es el especificado arriba, se deposita una muestra de sangre en el punto de aplicación (20). La muestra será aspirada por acción capilar hacia el interior de la cámara de ensayo y, una vez dentro de ella, la muestra de sangre se mezclará con el reactivo de ensayo (12). Después un periodo de incubación según un tiempo deseado, por ejemplo 30 segundos, la fuente de alimentación del medidor aplicará una diferencia de potencial entre las pistas (5) y (6). En la forma de ejecución preferida la diferencia de potencial aplicada es de 300 milivoltios. Se puede medir la corriente en cualquier momento comprendido entre 0,5 segundos y aproximadamente 30 segundos tras la aplicación de la diferencia de potencial de 300 milivoltios. La corriente medida puede correlacionarse con la concentración de glucosa en la muestra de sangre.

La corriente medida durante el ensayo de un analito de una muestra líquida se puede relacionar con la concentración del analito en la muestra, aplicando un algoritmo mediante el medidor de corriente. El algoritmo puede ser tan simple como el del siguiente ejemplo:

[Analito] = Ci_{7,5} + d

donde [Analito] representa la concentración de analito en la muestra (ver fig. 6), i_{7,5} es la corriente (en microamperios) medida 7,5 segundos después de la aplicación de la diferencia de potencial entre los electrodos, C es la pendiente de la línea (30) (fig. 6) y d es la intersección con el eje (fig. 6).

La curva de calibración (30) (fig. 6) se puede construir haciendo mediciones con concentraciones conocidas de analito. Dicha calibración se almacena en la tecla de memoria ROM del medidor y es aplicable a un lote concreto de tiras de ensayo. En la fig. 6 las líneas (31) y (32) representan otras curvas de calibración hipotéticas para dos lotes distintos de tiras de ensayo. La calibración de estos lotes de biosensor puede producir valores ligeramente diferentes de C y d en el algoritmo arriba indicado.

Según un método preferido para análisis de glucosa en una muestra de sangre humana entera, las mediciones de corriente se hacen a intervalos de 0,5 segundos, una vez transcurridos desde 3 hasta 9 segundos tras la aplicación de la diferencia de potencial entre los electrodos. Estas mediciones de corriente se relacionan con la concentración de glucosa en la muestra de sangre.

En este ejemplo de medición de glucosa en una muestra de sangre, las mediciones de corriente se efectúan a distintos intervalos de tiempo (entre 3 y 9 segundos tras la aplicación de la diferencia de potencial), más que en un único momento determinado (como se describe arriba), y el algoritmo resultante es más complejo y se puede representar por la siguiente ecuación:

[Glucosa] = C_{1}i_{1} + C_{2}i_{2} + C_{3}i_{3} + ... C_{n}i_{n} + d,

donde i_{1} es la corriente medida en el primer momento (3 segundos después de aplicar la diferencia de potencial de 300 milivoltios), i_{2} es la corriente medida en el segundo momento (3,5 segundos después de aplicar la diferencia de potencial de 300 milivoltios), 13 es la corriente medida en el tercer momento (4 segundos después de aplicar la diferencia de potencial de 300 milivoltios), i_{n} es la corriente medida en el enésimo momento (en este ejemplo en el 13° momento o 9 segundos después de aplicar la diferencia de potencial de 300 milivoltios); C_{1}, C_{2}, C_{3} y C_{n} son los coeficientes derivados de una técnica analítica de regresión multivariable, tal como el análisis de componentes principales o de los mínimos cuadrados parciales, y d es la intersección de la línea de regresión (en unidades de concentración de glucosa).

Como alternativa la concentración de glucosa analizada en la muestra se puede determinar integrando la curva generada al representar la corriente i frente al tiempo de medición a lo largo de cierto periodo (por ejemplo de 3 hasta 9 segundos tras la aplicación de la diferencia de potencial de 300 milivoltios), con lo cual se obtiene la carga total transferida durante el periodo de medición. La carga total transferida es directamente proporcional a la concentración de glucosa en la muestra analizada.

Asimismo, la medición de la concentración de glucosa se puede corregir con respecto a las diferencias entre la temperatura ambiente en el momento de la medición real y la temperatura ambiente de cuando se realizó la calibración. Así, por ejemplo, si la curva de calibración de la medición de glucosa se construyó a una temperatura ambiente de 23°C, la medición de glucosa se corrige mediante la siguiente ecuación:

[Glucosa]_{corregida} = [Glucosa]_{medida} x (1-K(T-23ºC)),

donde T es la temperatura ambiente (en ºC) en el momento de medir la muestra y K es una constante derivada de la siguiente ecuación de regresión:

Y = K(T-23),

donde

Y = \frac{[Glucosa]_{medida \ a \ 23^{o}C} - [Glucosa]_{medida \ a \ T^{o}C}}{[Glucosa]_{medida \ a \ T^{o}C}}

Para calcular el valor de K, cada una de las múltiples concentraciones de glucosa se mide con el medidor a diversas temperaturas T y a 23°C (el caso básico). Luego se efectúa una regresión lineal de Y frente a T-23. El valor de K es la pendiente de esta regresión.

Varias características de la presente invención se pueden incorporar a otras tiras de ensayo electroquímicas, como las que se revelan en las patentes U.S. n° 5,120,420; 5,141,868; 5,437,999; 5,192,415; 5,264,103; y 5,575,895.

Claims (15)

1. Una tira de ensayo que comprende:

un primer substrato aislante (1) que tiene una primera (22) y una segunda (23) superficie, una escotadura (2) a lo largo de un borde y un orificio de ventilación (4);

como mínimo dos pistas eléctricamente conductoras (5, 6) fijadas sobre la primera superficie (22) del primer substrato aislante (1);

un segundo substrato aislante (7) que tiene una primera (8) y una segunda (9) superficie, una escotadura (19) similar a la escotadura (2) del primer substrato aislante (1) y una primera (10) y una segunda (11) abertura, de modo que la segunda superficie (9) va fijada sobre las pistas conductoras (5, 6) y la primera superficie (22) del primer substrato aislante (1) y está orientada de forma que la escotadura del segundo substrato aislante cubre la escotadura del primer substrato aislante, de modo que la primera abertura (10) deja al descubierto una porción de las pistas conductoras (5, 6) para la conexión a un medidor capaz de medir una propiedad eléctrica y la segunda abertura (11) deja al descubierto una porción diferente de las pistas conductoras (5, 6) y el orificio de ventilación (4); de modo que un reactivo de ensayo (12) cubre al menos una porción de las pistas conductoras (5, 6) descubiertas por la segunda abertura (11), y

un techo (13) que tiene una primera (16) y una segunda (17) superficie y una escotadura (14) similar a las del primer (1) y segundo (7) substratos aislantes, de modo que la segunda superficie (17) del techo (13) está fijada sobre la primera superficie (8) del segundo substrato aislante (7) y situada de manera que (1) la segunda superficie (17) del techo (13) y la primera superficie (22) del primer substrato aislante (1) forman las paredes opuestas de una cámara de llenado capilar y 2) la escotadura (14) del techo (13) cubre las escotaduras (2, 19) del primer (1) y segundo (7) substratos aislantes.

2. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la cual la escotadura lleva además una muesca (3) para reducir la fluctuación de la dosis.

3. La tira de ensayo de la reivindicación 1 o 2, que lleva al menos dos pistas conductoras a través de dicha cámara de ensayo capilar.

4. La tira de ensayo de la reivindicación 1, en la cual el primer y segundo substratos aislantes son flexibles.

5. La tira de ensayo de la reivindicación 1, que tiene una ventana transparente o translúcida (18) para proporcionar una confirmación visual de la dosificación suficiente de la tira de ensayo.

6. La tira de ensayo de la reivindicación 1, que tiene una ventana transparente o translúcida (18) a través de la cual se puede ver una fracción sustancial de la anchura del canal capilar subyacente.

7. La tira de ensayo de la reivindicación 5 o 6, en la cual la dimensión ortogonal de la ventana (18) deja expuesta toda la anchura de un electrodo de trabajo (5).

8. La tira de ensayo de la reivindicación 5 o 6, en la cual la superficie de la ventana es menor que el área de la cámara de ensayo capilar.

9. La tira de ensayo de la reivindicación 8, en la cual la longitud y la anchura de la ventana son más cortas que la longitud y la anchura de la cámara de ensayo capilar.

10. La tira de ensayo de la reivindicación 5 o 6, en la cual dicha ventana va incluida en el techo (13).

11. La tira de ensayo de la reivindicación 5 o 6, en la cual dicha ventana proporciona la confirmación visual de que la tira ha recibido suficiente dosis de muestra para analizar.

12. La tira de ensayo de la reivindicación 2, en la cual la muesca mencionada para disminuir la fluctuación de la dosis se practica tanto en el primer substrato aislante como en el techo de la tira.

13. La tira de ensayo de la reivindicación 12, en la cual dichas muescas para reducir la fluctuación de la dosis están dimensionadas y situadas de tal modo que se sobreponen en la tira de ensayo.

14. La tira de ensayo de la reivindicación 1, la cual lleva un techo (13) que incluye un recubrimiento hidrófilo (25).

15. La tira de ensayo de la reivindicación 12, en la cual el techo (13) incluye un recubrimiento hidrófilo (25).