ES2156851T5

ES2156851T5 - Amplificacion del adn de genomas multiples para la deteccion de supresiones.

Info

Publication number: ES2156851T5
Application number: ES89310424T
Authority: ES
Inventors: Charles T. Caskey; Jeffrey S. Chamberlain; Richard A.L. Gibbs; Joel E. Rainer; Phi Nga Nguyen
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1988-10-12
Filing date: 1989-10-11
Publication date: 2009-06-23
Anticipated expiration: 2009-10-11
Also published as: EP0364255A2; EP0364255A3; EP0364255B2; ATE201451T1; CA1339731C; AU4260589A; JPH07136000A; US5582989A; DE68929299D1; DE68929299T3; ES2156851T3; DE68929299T2; KR900006520A; EP0364255B1; AU634175B2; AU3862193A

Abstract

EL INVENTO SE REFIERE A UN METODO PARA DETECTAR SIMULTANEAMENTE MULTIPLES SECUENCIAS DE DNA. EL METODO COMPRENDE LA AMPLIFICACION DE FRECUENCIAS MULTIPLES SIMULTANEAMENTE DESCOMPONIENDO UNA PLURALIDAD DE OLEGONUCLEOITIDOS PRIMARIOS PAREADOS EN DNA DE RAMAL SIMPLE. UN MIEMBRO DE CADA PAR ES COMPLEMENTARIO EN EL SENTIDO DEL RAMAL DE UNA SECUENCIAS Y EL OTRO MIEMBRO ES COMPLEMENTARIO A UN SEGMENTO DIFERENTE DEL RAMAL CONTRARIO DE LA MISMA SECUENCIA. LA AMPLIFICACION SE PRODUCE ALTERNATIVAMENTE DESCOMPONIENDO Y EXTENDIENDO LOS PRIMARIOS. EL INVENTO TAMBIEN INCLUYE SECUENCIAS PRIMARIAS DE OLIGONUCLEOTIDOS UTILES EN LA DETECCION DE ENFERMEDADES GENETICAS Y / O SECUENCIAS DE DNA EXOGENAS.

Description

Amplificación del ADN de genomas múltiples para la detección de supresiones.

Esta invención se relaciona con el campo de la detección simultanea de supresiones en secuencias de ADN genómico por medio de proceso de amplificación de secuencia múltiples dentro del genoma homocigoto o hemicigoto. Las secuencias de ácido nucleico se amplifican por medio del proceso de reacciones repetitivas múltiples simultáneas. Este método de detección de supresiones es útil en una variedad de áreas incluyendo la detección de enfermedades genéticas, y la cría de animales. La amplificación de ADN múltiple se puede aplicar también al análisis simultaneo de múltiples secuencias genómicas y es útil en medicina forense, detección d enfermedades, y en el desarrollo de organismos recombinantes o transgénicos.

Esta invención es una mejora en los procedimientos actualmente establecidos para la detección de enfermedades genéticas resultantes de mutaciones y supresiones en secuencias de ADN genómico. El diagnóstico prenatal y la detección de portadores de muchas enfermedades ligadas con X están disponibles a través de análisis Southern utilizando clones de ADNc de longitud completa. Infortunadamente, existen varias limitaciones importantes que evitan el uso rutinario y generalizado del análisis Southern para el diagnóstico de enfermedades genéticas. En muchas de las enfermedades ligadas con X, las secuencias defectuosas son desconocidas y no hay sondas disponibles. En otras enfermedades, tales como distrofia muscular ligada con X, existen múltiples exones, al menos 60, dispersos en una gran área de ADN genómico, aproximadamente 2,4 millones de bases. Los intrones tienen un promedio de 35 Kb de longitud. En el caso de distrofia muscular, al menos 7 - 9 subclones separados de ADNc son necesarios para el análisis de transferencia de Southern para resolver cada fragmento de restricción que contiene un exón para la asignación de un hiplotipo o el diagnóstico de alteraciones genómicas. Además, el análisis Southern es una técnica costosa, tediosa y que consume mucho tiempo que requiere del uso de radioisótopos, haciéndolo inadecuado para el uso rutinario en laboratorios clínicos.

Una alternativa al análisis Southern para detección de mutaciones y de supresiones es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita por Mullis y colaboradores en la patente estadounidense No. 4.683.195 publicada el 28 de julio de 1987 y por Mullis en la patente estadounidense No. 4.683.202 publicada el 28 de julio de 1987. Con PCR, se pueden amplificar regiones específicas de un gen hasta un millón de veces a partir de cantidades en nanogramos de ADN genómico. Después de la amplificación se pueden analizar las secuencias de ácido nucleico por la presencia de alelos mutantes ya sea por medio de secuenciación directa de ADN o por hibridación con sondas de oligonucleótido específico del alelo. La técnica de PCR ha probado ser útil en el diagnóstico de diferentes enfermedades incluyendo \beta-talasemia, hemofilia A, anemia de células falciformes y fenilcetonuria. La detección de rutina de enfermedades genéticas y de secuencias exógenas de ADN, tales como virus, con PCR, ha estado limitada por la habilidad para llevar a cabo análisis únicamente para una sola secuencia a la vez. La detección de una pluralidad de posibles secuencias de ADN requiere de un gran número de engorrosos ensayos separados, incrementando así el tiempo, el costo, y el tedio en la realización de tales ensayos. Por ejemplo, en algunas enfermedades, tales como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), el diagnóstico por PCR se ha visto limitado ya que no se han identificado mutaciones puntuales conducentes a la DMD. Aproximadamente 60% de los casos de DMD son debidos a supresiones. El otro 40% son desconocidos hasta el presente, pero probablemente involucran mutaciones de los sitios de empalme intrón-exón o la creación de codones de detención prematura. Por lo tanto, un gen grande como el gen para la DMD debe ser detectado con múltiples ensayos.

En ambas patentes estadounidenses, la No. 4.683.195 como la No. 4.683.202, se describen procedimientos para la amplificación de secuencias específicas. Ambas patentes describen procedimientos para detectar la presencia o la ausencia de al menos una secuencia específica de ácido nucleico en una muestra que contiene una mezcla de secuencias. Aunque las patentes reivindican al menos una secuencia y establecen que se pueden detectar múltiples secuencias, ellas no proporcionan un procedimiento efectivo para amplificar múltiple secuencias al mismo tiempo. En los ejemplos, se amplifican secuencias individuales o se amplifican secuencialmente múltiples secuencias. La adición de iniciadores para una segunda secuencia es usualmente posible, pero cuando se añaden iniciadores para más de dos secuencias, el procedimiento se derrumba. La presente solicitud es una mejora de un método de PCR y resuelve los problemas encontrados cuando reaccionan simultáneamente iniciadores para múltiples secuencias. La presente invención describe un procedimiento para amplificación simultánea de múltiples secuencias, y para la aplicación de este procedimiento de amplificación múltiple con el propósito de detectar una pluralidad de supresiones dentro del mismo gen o dentro de múltiples genes.

Los procedimientos de la presente solicitud proveen métodos mejorados para la detección de supresiones en genes hemicigotos sobre los cromosomas X y Y. Los procedimientos son efectivos en la detección de enfermedades genéticas provocadas por supresiones sobre el cromosoma X o el cromosoma Y, por ejemplo, DMD. También son efectivos en la detección de supresiones en homocigotos y pueden ser utilizados para detección simultánea de muchas supresiones posibles en homocigotos o hemicigotos con tal de que se conozcan partes de las secuencias genéticas apropiadas. El procedimiento para amplificación múltiple también permite análisis simultáneos de múltiples loci genéticos independientemente de la presencia o la ausencia de supresiones.

La presente invención está dirigida a un método para la detección simultánea de más de dos secuencias de ADN utilizando más de dos pares de iniciadores.

Aunque EP-A-0.237.362 pueda sugerir una PCR múltiple (2 juegos de iniciadores), un examen adicional de las especificaciones muestra que no existen ejemplos de trabajo de ninguna PCR múltiple. Además, el único ejemplo hipotético dado en la página 14, línea 29 utiliza únicamente dos juegos diferentes de iniciadores. El resto de la descripción de esta solicitud se relaciona con condiciones PCR estándar.

Nature, Vol. 329, 24 de septiembre de 1987, páginas 293 - 294 (Chehab y colaboradores), en el mejor de los casos muestra el uso de dos juegos de iniciadores. Buscando en la Figura 1, en el control normal, se puede ver una banda nítida para la hebra beta. Sin embargo, existe una respuesta muy débil para la hebra alfa. Esto indica que, aún si se obtuvo una amplificación, fue una amplificación muy débil cuando se utilizaron dos juegos de iniciadores. Nuevamente, no existe evidencia de que se hubieran utilizado dos juegos de iniciadores.

American Journal of Human Genetics, Vol. 43, Suplemento No. 3, Septiembre de 1988, resumen No. (0711) 3.2; (Chamberlain y colaboradores) es un resumen que sugiere que se puede hacer un proceso múltiple pero que no brinda ninguna de las condiciones y tampoco enseña como puede hacerse.

Science, Vol. 239, 29 de enero de 1988, páginas 491 - 494 (Stoflet y colaboradores) muestra nuevamente la amplificación de al menos dos juegos de iniciadores. Tiene además el problema de que es un procedimiento mucho más complicado que el de la presente invención. Existe la necesidad de la adición de T7 ARN polimerasa seguido por una secuencia y una transcriptasa inversa para identificar los productos de amplificación. Este es un procedimiento mucho más costoso que el de la presente invención para detectar múltiples secuencias. No existe evidencia en este artículo de la posibilidad de amplificar más de dos juegos de secuencias al mismo tiempo.

EP-A-0.256.630 únicamente describe el uso de múltiples análisis en los cuales cada uno tendría su propia secuencia separada de amplificación. Incluso si el ejemplo fuera descrito como relacionado con múltiples aplicaciones de PCR, no existe descripción de cómo se lograría esto. No existen ejemplos de ninguna amplificación múltiple en esta descripción.

Nucleic Acid Research, vol. 15, no. 22, 1987, páginas 9129 - 9142 (Heilig y colaboradores) se refiere al estudio de secuencias de los límites intrón - exón. Sin embargo, al momento de presentar esta solicitud, habían sido publicadas únicamente secuencias de intrón para los exones 8 y 19. Muchas de las otras secuencias de intrón no eran conocidas al momento de la presentación de la solicitud. Aunque había sido publicada la secuencia completa del ADNc para el gen de la distrofina, pocos límites exón/intrón estaban disponibles al momento de presentar esta solicitud. De los pocos límites intrón/exón que eran conocidos, varios eran incorrectos.

El artículo en Cell, Vol. 53, 22 de abril de 1988, páginas 219 - 228, Cell Press (Koenig y colaboradores) describe principalmente límites intrón/exón que fueron inferidos a partir de la homología de secuencia. Se debe observar, sin embargo, que los datos de secuencia de la presente solicitud probaron que varios de los límites intrón/exón inferidos en este artículo eran erróneos.

Chamberlain y colaboradores, Am. J. Human Genetics, 43(3), A17, 1988 especulan sobre la posibilidad de utilizar PCR para amplificar múltiples secuencias utilizando diferentes juegos de iniciadores pero carecen de los detalles técnicos necesarios que permitan llevar a cabo PCR múltiple.

La presente invención busca proveer un método para detectar simultáneamente secuencias objetivo de ADN en una muestra, preferiblemente supresiones a partir de una pluralidad de secuencias de ADN genómico. La presente invención detecta preferiblemente enfermedades genéticas ligadas con X, tales como DMD.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para detectar simultáneamente en una muestra secuencias objetivo de ADN, que comprende las etapas de:

: proveer en un recipiente de reacción común la muestra en forma de una sola cadena y pares de iniciadores oligonucleótidos, cada par específico para una secuencia diferente, un iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte de la secuencia en la secuencia sentido y el otro iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte diferente de la misma secuencia en la cadena complementaria antisentido;

: el apareamiento de los pares de iniciadores con sus secuencias complementarias;

: extender simultáneamente dichos pares de iniciadores apareados a partir de cada terminal 3' del iniciador para sintetizar un producto de extensión complementario con las cadenas apareadas a cada iniciador, dichos productos de extensión, después de la separación de su complemento, sirviendo como moldes para la síntesis de un producto de extensión del otro iniciador de cada par;

: separar dichos productos de extensión de dichos moldes para producir moléculas de una sola cadena de las secuencias objetivo;

: amplificar dichas secuencias objetivo monocatenarias por repetición, al menos una vez, dicho apareamiento, extendiendo y separando etapas; e

: identificar si dichos productos de extensión amplificados han sido sintetizados a partir de cada secuencia diferente, como una medida de la presencia o de la ausencia de cada secuencia objetivo, caracterizado porque:

: el método se adapta para detectar simultáneamente más de dos secuencias objetivo por medio de la utilización de más de dos pares de iniciadores oligonucleótidos.

Modalidades adicionales incluyen la detección de supresiones en una pluralidad de secuencias de ADN genómico de los cromosomas X y Y o sobre cromosomas autosomales cuando las supresiones son homocigotos. Se pueden detectar una variedad de enfermedades ligadas con X incluida la deficiencia de ornitina transcarbamilasa, la deficiencia de hipoxantina fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide sulfatasa y la distrofia muscular ligada con X.

En otra modalidad, se detecta la distrofia muscular ligada con X utilizando más de dos iniciadores apareados que son complementarios con secuencias diferentes dentro del gen que codifica para la proteína distrofina. Otras modalidades incluyen múltiples iniciadores oligonucleótidos útiles en la detección de una enfermedad genética ligada con X.

Otros objetivos y objetivos adicionales, características y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades actualmente preferidas de la invención dados con el propósito de divulgación cuando se los toma junto con los dibujos acompañantes.

La invención será más fácilmente entendida a partir de una lectura de la siguiente descripción y por referencias a los dibujos acompañantes, que forman parte de la misma:

La Figura 1 es una representación esquemática del gen que codifica para la DMD que ilustra el tamaño aproximado del locus, la posición de los fragmentos amplificados y la ubicación de las regiones genómicas que han sido clonadas y secuenciadas.

La Figura 2 es un ejemplo de una reacción PCR utilizada para detectar una supresión en ADN fetal para diagnóstico prenatal.

La Figura 3 representa la amplificación múltiple del ADN de ADN de linfoblasto de pacientes machos con DMD no tratada. A y B muestran dos juegos de diez muestras. Cada # del DRL se refiere al número familiar del R. J. Kleberg Center for Human Genetics Diagnostic Research Laboratory. MW: ADN de \varphiX174 digerido con Hae III. (-): no se añadió molde de ADN a la reacción. La relación entre la región amplificada y la región sobre el gen está indicada a la derecha de A. las letras corresponden a aquellas sobre la Figura 1.

La Figura 4 representa la amplificación múltiple de ADN para diagnóstico prenatal de DMD. Se muestran los resultados de la amplificación utilizando ADN de un macho afectado (AM; ADN de linfoblasto) y un feto macho (MF; ADN celular de fluido amniótico cultivado) de seis familias diferentes. Tanto los ADN fetales como los del macho afectado #s 521 y 531 del DRL muestran una supresión de la región f (Fig. 1); diagnosticando estos fetos como afectados. En el # 43C del DRL se suprimen todas las regiones excepto la f del macho afectado, mientras que el feto no está afectado. Se suprime la región a del macho afectado # 483 del DRL, mientras que el feto macho no está afectado. Ninguna de las muestras #s 485 ó 469 del DRL mostró una supresión con esta técnica.

La Figura 5 representa amplificación múltiple de ADN del ADN de un espécimen de vellosidad coriónica (CVS). Tanto el macho afectado (AM; ADN de linfoblasto) como el feto macho (MF, ADN de CVS) # 92 del DRL muestran una supresión de las regiones e y f (Fig. 1), diagnosticando el feto como afectado. El ADN del CVS # 120 del DRL no mostró una supresión con esta técnica.

La Figura 6 muestra la amplificación de siete regiones de exón del locus de DMD.

Los dibujos no están necesariamente a escala y ciertas características de la invención pueden estar exageradas en escala o mostradas en forma esquemática en el interés de la claridad y de la concisión.

Descripción detallada

El término "iniciadores oligonucleótidos" como se lo utiliza aquí define una molécula que consiste de más de tres desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Su longitud exacta dependerá de muchos factores relacionados con la función última y el uso del iniciador oligonucleótido, incluida la temperatura, la fuente del iniciador y el uso del método. El iniciador oligonucleótido puede ser de origen natural, como en una digestión purificada de restricción, o puede ser producido sintéticamente. El iniciador oligonucleótido es capaz de actuar como un punto de inicio para la síntesis cuando es colocado bajo condiciones que inducen la síntesis de un producto de extensión del iniciador complementario a una cadena de ácido nucleico. Las condiciones pueden incluir la presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como una ADN polimerasa a una temperatura y pH adecuados. En la modalidad preferida, el iniciador es un oligodesoxirribonucleótido monocatenario de longitud suficiente para cebar la síntesis de un producto de extensión de una secuencia específica en presencia de un agente de inducción. En el procedimiento de detección de la supresión, los oligonucleótidos son usualmente al menos mayores a 12 mers de longitud. En la modalidad preferida, los iniciadores oligonucleótidos son aproximadamente de 18 a 29 mers de longitud. La sensibilidad y la especificidad de los iniciadores oligonucleótidos están determinadas por la longitud del iniciador y por la singularidad de la secuencia dentro de una muestra dada de ADN molde. Los iniciadores que son muy cortos, por ejemplo aproximadamente menores de 12 mers, pueden mostrar un enlazamiento no específico con una amplia variedad de secuencias en el ADN genómico y por lo tanto no son muy útiles. En la modalidad preferida, se selecciona usualmente al iniciador oligonucleótido por su habilidad para aparearse con secuencias de intrón en la proximidad del extremo 5' ó 3'del exón o para aparearse con una secuencia en la unión intrón - exón. Ya que los defectos de supresión conocidos que resultan en enfermedades genéticas son el resultado de supresiones que incluyen a los exones o a las regiones del sitio de empalme del intrón, es preferible tener iniciadores complementarios a las secuencias del intrón.

Cada par iniciador fue seleccionado aquí por ser sustancialmente complementario con las diferentes cadenas de cada secuencia específica que es amplificada. Por lo tanto, un iniciador de cada par es suficientemente complementario para hibridar con una parte de la secuencia en la cadena sentido y el otro iniciador de cada par es suficientemente complementario para hibridar con una parte diferente de la misma secuencia en la cadena antisentido. De este modo, aunque la secuencia del iniciador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde, entre más cercanamente refleje la secuencia exacta, mejor el enlazamiento durante la etapa de apareamiento.

Dentro de un par de iniciadores, cada iniciador se enlaza preferiblemente en un sitio sobre la secuencia de interés distante del otro iniciador. En la modalidad preferida, la distancia entre los iniciadores debe ser suficiente para permitir la síntesis de un producto de extensión entre los dos sitios de enlazamiento, aún lo suficientemente cerca para que el producto de extensión de cada iniciador, cuando está separado de su molde, pueda servir como molde para el otro iniciador. Los productos de extensión de los dos iniciadores apareados son complementarios entre sí y pueden servir como moldes para síntesis adicionales. Entre más separados los sitios de enlazamiento, hay más ADN genómico que puede ser que puede ser detectado. Sin embargo, si la distancia es tan grande que los productos de extensión no se superpondrán eficientemente con los iniciadores y en consecuencia no se presentará la amplifica-
ción.

Como se lo utiliza aquí, el término "producto de extensión" se refiere a la secuencia de nucleótidos que se sintetiza a partir del extremo 3' del iniciador oligonucleótido y que es complementaria a la cadena a la cual está enlazado el iniciador oligonucleótido.

Como se lo utiliza aquí, el término "marcado diferencialmente" indica que cada producto de extensión puede ser diferenciado de todos los otros debido a que tiene una marca diferente unida o es de un tamaño diferente o se enlaza a un oligonucleótido específicamente marcado. Alguien capacitado en el arte reconocerá que están disponibles una variedad de marcadores. Por ejemplo, estos pueden incluir radioisótopos, compuestos fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. Diferentes factores afectan la escogencia del marcador. Estos incluyen el efecto del marcador sobre el índice de hibridación y de enlazamiento del iniciador con el ADN, la sensibilidad del marcador, la facilidad de elaboración del iniciador marcado, la sonda o los productos de extensión, la capacidad de automatización, la instrumentación disponible, la conveniencia y similares. Por ejemplo, se podría utilizar un radioisótopo diferente tal como ^{32}P, ^{3}H, o ^{14}C; un compuesto fluorescente diferente tal como fluoresceína, tetrametilrodamina, Rojo Tejas ó 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1-diazol (NBD), o una mezcla de diferentes marcadores tales como radioisótopos, compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes. Alternativamente, se pueden seleccionar los iniciadores de tal manera que los productos amplificados de extensión para cada secuencia son de diferentes longitudes y por lo tanto pueden ser separados por medio de una variedad de métodos conocidos en el arte. En forma similar, los productos de extensión podrían incluir un polimorfismo de longitud del fragmento de restricción que podría ser utilizado para distinguir diferentes productos de extensión. En estos ejemplos, cada iniciador o su producto de extensión se pueden diferenciar de todos los otros iniciadores cuando están en una mezcla. Alternativamente, las sondas que se enlazan a los productos de extensión amplificados podrían ser marcadas y se podrían utilizar juegos de sondas que distinguen alelos de una secuencia única en una reacción de amplificación múltiple de ADN, estén marcadas o no.

Cada secuencia específica diferente de ADN, que va a ser detectada allí, puede derivarse de ADN genómico del organismo o de ADN exógeno tal como de virus, bacterias o parásitos. La fuente de ADN genómico del organismo que va a ser analizado puede ser sangre, pelo o tejido (incluyendo vellosidad coriónica, células amnióticas, fibroblastos y biopsias). La fuente de ADN puede ser obtenida en forma fresca o haber sido adecuadamente almacenada durante largos períodos de tiempo. El ADN debe ser de calidad suficiente para permitir la amplificación. El ADN genómico se puede preparar por medio de una variedad de técnicas conocidas por alguien capacitado en al arte.

Como se lo utiliza aquí, el término "supresión" se refiere a aquellas secuencias de ADN genómico en las cuales una o más bases de ácido nucleico han sido suprimidas de la secuencia y por lo tanto ya no están presentes en el gen. El tamaño de la supresión puede afectar la sensibilidad del procedimiento de amplificación. Generalmente, entre mayor la supresión mayor la sensibilidad.

Cualquier secuencia específica conocida de ácido nucleico puede ser detectada por medio del presente método. Preferiblemente, al menos parte de la secuencia es suprimida del genoma. Solamente es necesario que un número suficiente de bases de ambos extremos de la secuencia sea conocida con suficiente detalle para preparar iniciadores oligonucleótidos que hibridarán con las diferentes cadenas de la secuencia deseada en posiciones relativas a lo largo de la secuencia.

Los iniciadores oligonucleótidos se pueden preparar utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, métodos de fosfotriéster y de fosfodiéster o modalidades automatizadas de los mismos, la síntesis de oligonucleótidos sobre un soporte sólido modificado, el aislamiento de una fuente biológica (digestión con una endonucleasa de restricción), y la generación de copias dirigida enzimáticamente de un molde de ADN o de ARN.

Una modalidad de la presente invención es un método para detectar simultáneamente supresiones en una pluralidad de secuencias de ADN, que comprende las etapas de: tratar dicho ADN para formar cadenas monocatenarias complementarias; añadir una pluralidad de iniciadores oligonucleótidos apareados, cada par específico para una secuencia diferente, un iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte de la secuencia en la cadena sentido y el otro iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte diferente de la misma secuencia en la cadena complementaria antisentido; aparear la pluralidad de iniciadores con sus secuencia complementarias; extender simultáneamente dicha pluralidad de iniciadores apareados de cada terminal 3' del iniciador para sintetizar un producto de extensión complementario con las cadenas aperadas a cada iniciador, sirviendo dichos productos de extensión, después de la separación del complemento, como moldes para la síntesis de un producto de extensión del otro iniciador de cada par; separar dichos productos de extensión de dichos moldes para producir moléculas monocatenarias; amplificar dichas moléculas monocatenarias repitiendo, al menos una vez, dicho apareamiento, extendiendo y separando etapas; e identificar dicho producto amplificado de extensión de cada secuencia diferente.

Una modalidad preferida de la presente invención es un método para detectar supresiones en una pluralidad de secuencias de ADN genómico, en donde dichas secuencias se seleccionan del grupo de secuencias sobre los cromosomas X y Y. Es preferible detectar genes homocigotos sobre los cromosomas X y Y, ya que esto incrementa el nivel de sensibilidad. Cuando se utiliza el procedimiento para detectar el estado homocigoto, se requiere de medición cuantitativa, y por lo tanto es mucho menos eficiente que la detección de la presencia o la ausencia de secuencias como se hace para los genes hemicigotos. Por ejemplo, si se ha suprimido parte de un exón, el método de amplificación múltiple de la presente invención detectará esto ya sea fallando en la producción de una secuencia de oligonucleótidos o por medio de la producción de una secuencia de oligonucleótidos de un tamaño diferente. Además, se pueden detectar múltiples exones al mismo tiempo. De este modo, es fácil detectar la presencia de una supresión. Sin embargo, mirando estados heterocigotos, donde los cromosomas tienen un gen normal y un gen suprimido, el gen normal producirá un producto normal, y por lo tanto existe la necesidad de medir la diferencia cuantitativa en la producción de productos de extensión.

Una segunda modalidad de la presente invención es permitir la amplificación simultánea de múltiples secuencias, posiblemente no relacionadas con el propósito de su análisis simultáneo. Tales análisis pueden involucrar simplemente la determinación de si están presentes secuencias exógenas (virus, bacterias u otros parásitos) dentro de una muestra de ADN, o podría involucrar la detección de polimorfismos o mutaciones dentro de una pluralidad de secuencias. Los polimorfismos o mutaciones se pueden detectar por medio de una variedad de métodos bien conocidos por aquellos capacitados en el arte. Los métodos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación directa de ADN, hibridación de oligonucleótidos específica del alelo, e imprimación competitiva de oligonucleótidos.

El método de amplificación múltiple de ADN genómico se utiliza preferiblemente para detectar enfermedades ligadas con X resultantes de las supresiones en la secuencia de ADN genómico. Las enfermedades genéticas pueden ser causadas por una variedad de mecanismos incluidas mutaciones y supresiones. El procedimiento descrito aquí fue desarrollado para la detección de enfermedades genéticas que resultan de supresiones dentro del genoma. Los ejemplos de algunas enfermedades ligadas con X que son candidatas para el uso de amplificaciones múltiples de ADN gnómico son la deficiencia de ornitina transcarbamilasa, la deficiencia de hipoxantina fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide sulfatasa y la distrofia muscular ligada con X. Otros desórdenes sobre el cromosoma X o de los genes sobre el cromosoma Y pueden ser detectados también fácilmente. El procedimiento es también aplicable a la detección de cualquier conjunto de mutaciones puntuales conocidas dentro de un conjunto de secuencias genómicas. El procedimiento es también aplicable a la detección simultánea de cualquier conjunto de secuencias exógenas de ADN en una muestra dada de ADN. El procedimiento es también aplicable a la detección simultanea de cualquier conjunto de secuencias repetitivas polimórficas o variables en tándem dentro de un genoma.

Las ventajas del sistema de amplificación múltiple son aquellas numerosas enfermedades o aquellas alteraciones específicas de la secuencia de ADN que pueden ser detectadas en el mismo ensayo. Por ejemplo, los iniciadores para la deficiencia de hipoxantina fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide sulfatasa, la distrofia muscular ligada con X, la deficiencia de ornitina transcarbamilasa y otras enfermedades ligadas con X pueden ser corridas todas simultáneamente sobre la misma muestra. Además, el procedimiento de amplificación múltiple es útil para genes muy grandes con exones múltiples, tal como el gen para la distrofina. Debido al gran tamaño del locus de distrofina, la amplificación por PCR del tipo Mullis no es capaz de escudriñar el gen completo en un ensayo. Por lo tanto, es necesario para la amplificación en múltiples sitios dentro del gen, detectar todas las posibles supresiones que podrían resultar en enfermedades. Las supresiones en el locus de la DMD pueden abarcar a cualquiera de los aproximadamente 60 exones más que están distribuidos sobre más de 2 millones de bases de ADN. Virtualmente todos estos exones están separados por interferones grandes y así se podrían requerir hasta de 60 reacciones separadas para completar el análisis de las supresiones de la DMD. Para simplificar esta tarea, se puede emplear la presente invención de una amplificación múltiple de ADN genómico para la detección de la supresión para realizar el examen simultáneo de múltiples exones. Por ejemplo, se pueden sintetizar y combinar los iniciadores oligonucleótidos que flanquean a los exones separados del gen para la DND, y usarlos para aplicaciones múltiples de ADN. Hasta el momento, se han examinado simultáneamente al menos hasta 7 secuencias diferentes del gen para la DMD. El procedimiento completo para la amplificación múltiple desde la puesta en marcha hasta la fotografía de los resultados toma menos de 5 horas. Las ubicaciones relativas de las regiones amplificadas no afectan los resultados y se han amplificado exones que han estado separados al menos al menos por 1000 kb. La técnica de amplificación por PCR de Mullis es adecuada para uno y posiblemente dos pares de iniciadores, pero cuando se utilizan más de dos pares de iniciadores, el proceso no amplifica adecuadamente todas las secuencias apropiadas.

Alguien capacitado en el arte apreciará fácilmente que entre más secuencias génicas del exón estén disponibles, se expandirá la aplicabilidad de este ensayo para examinar las supresiones en múltiples genes al mismo tiempo o examinar sitios múltiples dentro del mismo gen al mismo tiempo. Este último ejemplo es importante para genes tales como los de la distrofina que son tan grandes que los iniciadores apareados a los extremos del gen no atravesarán la secuencia completa del gen. Por eso la necesidad de hacer múltiples análisis para detectar supresiones en diferentes regiones del gen. Además, como las mutaciones específicas dentro de genes múltiples no relacionados se hacen conocidas, se puede aplicar amplificación múltiple de ADN para analizar simultáneamente la presencia de cualquiera de estas mutaciones.

Además, como llegan a conocerse polimorfismos específicos o altamente variables de secuencias de ADN en diferentes Loci genéticos, se pueden utilizar amplificaciones múltiples de ADN para analizar simultáneamente estos polimorfismos para determinar el haplotipo o para determinar la identidad o la fuente del ADN (huella genética).

El número de análisis que pueden correrse simultáneamente es ilimitado, sin embargo, el límite superior es probablemente aproximadamente de 20 y depende de las diferencias de tamaño requeridas para la resolución y/o del número de marcadores o de métodos que están disponibles para resolver los productos de extensión. La habilidad para amplificar simultáneamente únicamente 9 exones permitiría la detección de más del 90% de todas las supresiones conocidas de la DMD en una única reacción. La habilidad para amplificar simultáneamente incluso solamente 10 exones permite el diagnóstico rápido y simple de supresiones de la DMD utilizando únicamente unas pocas reacciones separadas. Asumiendo que hubiera aproximadamente 60 exones en el gen para la DMD y que los exones estén ampliamente separados de tal manera que se necesiten iniciadores para cada exón, se requieren un máximo de 6 ensayos separados para detectar todas las supresiones en este gen. Bajo los mismos supuestos, el método por PCR de Mullis requeriría de 60 reacciones separadas para detectar las supresiones en este gen. Por lo tanto, en la medida en que se incrementa el tamaño del gen y el número de exones que no puede ser detectado al mismo tiempo, se incrementan grandemente las ventajas de este método. Además, el uso de un aparato automático para PCR (tal como aquel producido por Perkin-Elmer/Cetus) y de las máquinas secuenciadoras de ADN facilitará la resolución y la detección de los fragmentos amplificados de ADN, ayudará a automatizar el análisis y permitirá que el método sea aplicado rutinariamente en laboratorios clínicos sin la necesidad de personal de investigación altamente entrenado.

A continuación se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y no se pretende que limiten la invención de ninguna manera. En los ejemplos, todos los porcentajes son en peso, si es para sólidos y en volumen si es para líquidos, y todas las temperaturas se dan en grados Celsius a menos que se indique otra cosa.

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Ejemplo 1

Las siguientes condiciones están actualmente en uso para llevar a cabo la amplificación simultánea de una pluralidad de regiones genómicas dentro del gen para la DMD humana. Pude necesitarse modificar ligeramente estas condiciones dependiendo de las regiones particulares que van a ser amplificadas, del número y longitud de las secuencias que van a ser amplificadas, y de la escogencia de los iniciadores oligonucleótidos. El tiempo de reacción depende grandemente de la longitud total de la secuencia. Por lo tanto, en la medida en que se incrementa el número de secuencias amplificadas y/o se incrementa la longitud de las secuencias amplificadas, se debe incrementar el tiempo. La temperatura depende de la longitud, de la singularidad de la secuencia del iniciador y del porcentaje relativo de bases GC. Entre más largos los iniciadores, más alta la temperatura requerida. Entre más única la secuencia, menor la temperatura requerida para la amplificación. Los iniciadores ricos en GC necesitan temperaturas más altas para evitar la hibridación cruzada y para permitir una amplificación única. Sin embargo, en la medida en que se incrementa el porcentaje de AT, temperaturas más altas provocan que estos iniciadores se fundan. Por lo tanto, estos iniciadores deben ser alargados para que la reacción funcione.

Se preparó un molde de ADN a partir del tejido escogido para análisis utilizando una variedad de métodos bien establecidos conocidos por aquellos capacitados en el arte. Típicamente, se utilizaron volúmenes de reacción de 100 \mul. Se añadieron aproximadamente 500 ng de ADN a una solución que constaba de lo siguiente: Tris - HCl 67 mM [pH 8,8 a 25ºC]; cloruro de magnesio 6,7 mM; sulfato de amonio 16,6 mM; \beta-mercaptoetanol 10 mM; ácido etilen diamino tetraacético (EDTA) 6,7 \muM, y 170 \mug/mL de albúmina de suero bobino. Esta solución se pude preparar de antemano y parece ser estable durante períodos de tiempo muy largos de almacenamiento a -70º. Se añadió la enzima, Taq polimerasa, para lograr una concentración final de 100 unidades/mL. Se mezcló suavemente la mezcla de reacción. Se cubrió la mezcla de reacción con una capa de aproximadamente 50 \muL de aceite de parafina, y se centrifugó el vaso de reacción (preferiblemente en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml) a 14.000 x g durante 10 segundos. Se llevó a cabo la amplificación ya sea transfiriendo manualmente los vasos de reacción entre bloques de calentamiento rellenos con glicerol a las temperaturas apropiadas, o transfiriendo automáticamente los vasos de reacción con un termociclador Perkin-Elmer/Cetus utilizando las funciones "etapa - ciclo". La reacción fue controlada por medio de cambios de temperatura repetidos y regulados de diferente duración. Inicialmente se calentó la reacción hasta 94º durante 7 minutos. Posteriormente se aplicaron 25 ciclos con las siguientes duraciones de temperatura: 94º durante 1 minuto, luego 55º durante 45 segundos, luego 65º durante 3 ½ minutos. Después de completar el ciclo final se incubó la reacción a 65º durante 7 minutos adicionales. Las reacciones fueron luego almacenadas a 4º hasta el análisis.

Se determinaron las supresiones del ADN genómico y/o las secuencias exógenas de ADN examinando los productos de amplificación. Por ejemplo, la carencia de un producto de amplificación esperado indica una supresión. Se conocen muchos métodos para esta determinación por parte de aquellos capacitados en el arte. El método preferido involucra electroforesis de aproximadamente una vigésima parte de la reacción sobre un gel de agarosa al 1,4% (peso/volumen) en el siguiente amortiguador: tris - HCl 40 mM; acetato de sodio 20 mM, EDTA 1 mM (ajustado hasta un pH de 7,2 con ácido acético glacial), y 0,5 \mug/\mul de bromuro de etidio. Se llevó a cabo la electroforesis a 3,7 voltios/cM durante 10 minutos por 14 cM de longitud del gel de agarosa. Se completó el análisis examinando los productos de reacción sometidos a electroforesis sobre un transiluminador de radiación ultravioleta, y se fotografiaron los resultados para registros permanentes.

Cuando los análisis requieren la determinación de los polimorfismos de la secuencia de ADN o de las mutaciones dentro de productos de amplificación individuales, se transfiere el gel de agarosa hasta un medio apropiado de enlazamiento de ADN tal como nitrocelulosa utilizando procedimientos bien establecidos, por ejemplo, transferencias de Southern. Las secuencias individuales de ADN dentro de los fragmentos amplificados de ADN se pueden determinar por medio de una variedad de técnicas que incluyen hibridación del oligonucleótido específico del alelo. Alternativamente, se pueden analizar adicionalmente los productos de reacción antes de la electroforesis sobre gel de agarosa por medio de amplificación competitiva del iniciador oligonucleótido, utilizando iniciadores separados específicos del alelo para cada secuencia amplificada de ADN de los productos de reacción de amplificación múltiple.

Un tercer método para determinar las diferencias en la secuencia de ADN dentro de los productos de amplificación individuales no requiere de electroforesis. En este método, se aplican secuencialmente alícuotas de la reacción de amplificación múltiple a una membrana apropiada para enlazamiento del ADN tal como nitrocelulosa, y luego se analiza cada alícuota a través de hibridación con membranas individuales de juegos de sondas de oligonucleótidos específicas del alelo (ASO), siendo hibridada cada alícuota separada con un miembro de un par de sondas ASO específicas para un miembro de las secuencias de ADN amplificado en forma múltiple.

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Ejemplo 2

La Figura 1 es una representación esquemática del locus de la DMD. Se ilustra la ubicación relativa de los exones utilizados en los ejemplos de amplificación del gen para la DMD.

Para la detección de DMD, se puede utilizar una variedad de sondas ya sea en reacciones PCR individuales o en combinaciones en reacciones PCR múltiples. Estas sondas son mostradas en la Tabla 1.

TABLA 1 Resumen de los juegos de iniciadores de amplificación múltiple del gen para DMD

1

En la Tabla 1 cada exón está designado por a, b, c, d, f, ó g y corresponde a la misma letra en la Fig. 1. Cuando se conoce el número del exón se lo enlista. También se muestra el tamaño del exón en pares de bases (pb). Las secuencias del iniciador de la PCR se muestran en orientación 5' - 3'. El iniciador hacia adelante (F), hibrida 5' del exón, y el iniciador inverso (R), hibrida 3' del exón. También se muestra el tamaño del fragmento amplificado obtenido con cada juego de iniciadores.

El porcentaje de pacientes analizados con DMD que son suprimidos por cada exón indicado se muestra en la columna cuatro. Este número total es menor que la suma de las frecuencias individuales de supresión del exón debido a que muchas supresiones abarcan múltiples exones.

En la Tabla 2 están las secuencias del exón y del intrón flaqueo para el Exón 17. El exón es de 227 hasta 402. Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta secuencia son de 7 hasta 33 y de 396 hasta 421.

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TABLA 2

3

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En la Tabla 3 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón d de la tabla 1 [o, el exón localizado sobre un fragmento de Hind III de 4,1 Kb]. El exón es de 295 hasta 422. Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta secuencia son de 269 hasta 293 y de 512 hasta 536.

TABLA 3

5

En la Tabla 4 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón e de la Tabla 1 [exón del fragmento de Hind III de 0,5 Kb]. El exón es de 396 hasta 571. Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta secuencia son de 51 hasta 75 y de 572 hasta 597.

TABLA 4

6

En la Tabla 5 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón f de la Tabla 1 [se superpone al fragmento de Hind III de 1,2 Kb y 3,8 Kb]. El exón es de 221 hasta 406. Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta secuencia son de 26 hasta 53 y de 516 hasta 541.

TABLA 5

7

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En la Tabla 6 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón 12. El exón es de 180 hasta 329. Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta secuencia son de 27 hasta 52 y de 332 hasta 357.

TABLA 6

9

10

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En la Tabla 7 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de Hind III de 10 Kb. El exón es de 1 hasta 150.

TABLA 7

11

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En la Tabla 8 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de Hind III de 1,6 Kb de 512 hasta 622.

TABLA 8

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En la Tabla 9 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de Hind III de 3,1 Kb. El exón es de 519 hasta 751.

TABLA 9

14

15

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En la Tabla 10 está el exón y las secuencias del intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de Hind III de 1,5 Kb. El exón es de 190 hasta 337.

TABLA 10

16

Ejemplo 3

Diagnóstico Prenatal y Detección de DMD Utilizando PCR

Un ejemplo de diagnóstico prenatal con detección de la supresión por PCR es demostrado por medio de la utilización de iniciadores oligonucleótidos sintetizados (juego b, Tabla 1). Este grupo iniciador corresponde a las secuencias del intrón que flanquean al Exón 17 del gen para la DMD humana, una región que ha sido aislada y secuenciada (Tabla 2).

Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 2. Los productos PCR (un veinteavo de la reacción total) fueron obtenidos con ADN molde aislado a partir de un macho de control \boxempty, siendo diagnosticado el feto macho como A, la madre portadora de la DMD (\medcirc) y un hermano macho afectado del feto \blacksquare. También se muestra un estándar de peso molecular de ADN (MW; ADN de \varphiX174 digerido con Hae III). Los resultados demuestran que el macho afectado porta una supresión del Exón 17, que no fue amplificado, pero que el feto no porta la supresión y por lo tanto no está afectado. Estos resultados indican que la PCR es útil en el diagnóstico de casos de DMD que contienen una supresión que involucra a este exón.

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Ejemplo 4

Detección Múltiple

Un ejemplo de detección múltiple es mostrado en las Figuras 3A y 3B.

Este análisis fue hecho utilizando seis pares de iniciadores (juegos a - f, Tabla 1) y las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo una amplificación automática en vez de una manual. Estos iniciadores oligonucleótidos representan las regiones de flanqueo de seis exones separados del gen para DMD. Se los combinó dentro de un vial de reacción y se los utilizó para amplificaciones múltiples de ADN genómico. Se aisló el ADN molde a partir de linfoblastos (de una muestra de sangre). El análisis se hizo por medio de electroforesis en gel de agarosa.

Cuando se utilizó ADN sin supresiones como molde, las seis regiones dispersas del gen para la DMD fueron simultanea y específicamente amplificadas (Figura 3A, Muestra # 534). Las supresiones discretas, que fueron detectadas con este método, son mostradas en las Figuras 3A y 3B. Se muestran varias muestras de ADN que contenían supresiones normales, parciales o totales en el gen para la DMD. Las Figuras 3A y 3B también muestran un estándar de peso molecular de ADN (MW; ADN de \varphiX174 digerido con Hae III), y un control negativo (-) donde no se añadió ADN molde a las reacciones. La Figura 3A también indica que fragmento amplificado de ADN corresponde a que exón (a - f) de la Figura 1.

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Ejemplo 5

Diagnóstico Prenatal

Se ha utilizado exitosamente PCR múltiple en varios diagnósticos prenatales. Las condiciones son como las descritas anteriormente en el Ejemplo 1. La Figura 4 muestra una amplificación múltiple de ADN para diagnóstico prenatal de la DMD. Se muestran los resultados de la amplificación utilizando ADN de machos afectados (AM; ADN de linfoblasto) y fetos machos (MF; ADN de células de fluido amniótico) de seis familias diferentes. El análisis fue como el descrito en el Ejemplo 1. Tanto el ADN del macho afectado como el ADN fetal #s 521 y 531 del DRL muestran una supresión de la región f (Figura 1). Por lo tanto, estos fetos fueron diagnosticados como afectados. En el # 43C del DRL se suprimieron todas las regiones del macho afectado excepto la f, mientras que el feto no fue afectado. En el macho afectado # 483 del DRL se suprimió la región a, mientras que el feto macho no es afectado. Ninguna de las muestras #s 485 ó 469 del DRL mostró una supresión con esta técnica. Por lo tanto, si un defecto en una supresión causa DMD en estas familias, esto ocurrió en un exón no analizado.

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Ejemplo 6

Diagnóstico prenatal utilizando amplificación múltiple del ADN del ADN de un espécimen de vellosidad coriónica (CVS)

La Figura 5 demuestra la amplificación múltiple del ADN del ADN de un CVS. Tanto el macho afectado (AM; ADN de linfoblasto) como el feto macho (MF; ADN de un CVS) de # 92 del DRL muestran una supresión de las regiones e y f (Fig. 1). Por lo tanto, el feto fue diagnosticado como afectado. El ADN de un CVS de # 120 del DRL no mostró una supresión con esta técnica. Las muestras fueron analizadas como se describe en el Ejemplo 1. Estos resultados demuestran que la técnica de amplificación múltiple trabaja bien para diagnóstico prenatal cuando el ADN de un CVS es utilizado como el molde para la amplificación.

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Ejemplo 7

Amplificación múltiple de siete exones separados del gen para DMD

Este ejemplo demuestra que siete secuencias separadas de ADN pueden ser amplificadas simultáneamente utilizando la técnica de amplificación múltiple. Las condiciones fueron como las descritas en el Ejemplo 1. Se añadieron los juegos de iniciadores a - g (Tabla 1) a la reacción. De este modo, se amplificaron (Figura 6) siete regiones del exón del gen para DMD (Figura 1).

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 4683195 A [0003] [0004]: \bullet EP 0237362 A [0007]

\bullet US 4683202 A [0003] [0004]: \bullet EP 0256630 A [0011]

Literatura citada en la descripción que no es de patente

\bulletCHEHAB. Nature, 24 de septiembre de 1987, vol. 329, 293 - 294 [0008]

\bulletCHAMBERLAIN. American Journal of Human Genetics, Septiembre de 1988, vol. 43 (3 [0009]

\bulletSTOFLET. Science, 29 de enero de 1988, vol. 239, 491 - 494 [0010]

\bulletHEILIG. Nucleic Acid Research, 1987, vol. 15 (22), 9129 - 9142 [0012]

\bulletKOENIG. Cell Press. Cell, 22 de abril de 1988, vol. 53, 219 - 228 [0013]

\bulletCHAMBERLAIN y colaboradores, Am. J. Human Genetics, 1988, vol. 43 (3), A17 [0014]

Claims

1. Un método para detectar simultáneamente en una muestra secuencias objetivo de ADN, que comprende las etapas de:

: identificar si dichos productos de extensión amplificados han sido sintetizados a partir de cada secuencia diferente, como una medida de la presencia o de la ausencia de cada secuencia objetivo, caracterizado porque:

2. El método de la Reivindicación 1 para detectar supresiones de secuencias de ADN genómico, en donde dichas secuencias se seleccionan entre el grupo de secuencias sobre los cromosomas X y Y.

3. El método de la Reivindicación 2 para la detección de una enfermedad ligada con X, en donde dichas secuencias de ADN genómico contienen una supresión que provoca una enfermedad genética.

4. El método de la Reivindicación 3 para la detección de dichas enfermedades genéticas ligadas con X seleccionadas del grupo que consiste de la deficiencia de ornitina transcarbamilasa, la deficiencia de hipoxantina fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide sulfatasa y la distrofia muscular ligada con X.

5. El método de la Reivindicación 4 para la detección de distrofia muscular ligada con X, en donde cada par de dichos iniciadores es complementario con diferentes secuencias dentro del gen que codifica para la proteína distrofina.

6. El método de la Reivindicación 5, en donde los pares de iniciadores se seleccionan del grupo que consiste de:

(1) 5'-GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC-3'

(2) 5'-AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC-3',

(1) 5 '-GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG-3'

(2) 5'-GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTAG-3',

(1) 5'-AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC-3'

(2) 5'-CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3',

(1) 5'-GATAGTGGGCTTTACTTACATCCTTC-3'

(2) 5'-GAAAGCACGCAACATAAGATACACCT-3',

(1) 5'-CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA-3'

(2) 5'-TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT-3',

(1) 5'-TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG-3'

(2) 5'-CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC-3',

y

(1) 5'-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3'

(2) 5'-GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC-3'.

7. El método de la Reivindicación 3, en donde dicho ADN genómico es de tejido fetal.