JPH07136000A

JPH07136000A - 欠失を検出するための複数染色体ｄｎａ増幅法

Info

Publication number: JPH07136000A
Application number: JP1266102A
Authority: JP
Inventors: Charles T Caskey; トーマスカスケイチャールズ; Jeffrey S Chamberlain; エス．チャンバレンジェフリィ; Richard A L Gibbs; エイ．エル．ギブスリチャード; Joel E Ranier; イー．レイナージョエル; Phi N Nguyen; ヌガヌグェンプヒ
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1988-10-12
Filing date: 1989-10-12
Publication date: 1995-05-30
Also published as: EP0364255A2; EP0364255A3; EP0364255B2; ATE201451T1; CA1339731C; AU4260589A; US5582989A; DE68929299D1; DE68929299T3; ES2156851T3; DE68929299T2; KR900006520A; EP0364255B1; AU634175B2; AU3862193A; ES2156851T5

Abstract

(57)【要約】電子出願以前の出願であるので要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野この発明は、ヘミザイゴートまたはホモザイゴートの染色体の中で複数の配列の増幅過程によって染色体のＤＮＡ配列にある欠失を一度に検出するという分野に関する。核酸配列が複数の反復反応を同時に行う過程で増幅される。この欠失を検出する方法は、遺伝病のスクリーニングや畜産等を含むいろいろな領域に有用である。複数のＤＮＡ増幅法はまた複数の染色体配列の同時解析に応用でき、法医学、疾病の診断、組換え生物体、すなわち形質転換体の開発に有用である。

従来の技術及び発明が解決しようとする課題この発明は染色体ＤＮＡ配列における変異や欠損から生じる遺伝病のために現在確立されている方法を改良するものである。多くのＸ染色体に関係する病気を生前診断したり、キャリヤーの検出には完全の長さをもったｃＤＮＡクローンを用いたサザン解析によって用いられる。

残念ながら遺伝病の診断にサザン解析を広範に、そしてルーチンに使うことのできないいくつかの限界がある。Ｘ染色体関連の疾病の多くには、防御的な配列が未知であり、プローブを使うことができない。他の病気、例えばＸ染色体関係の筋ジストロフィー等では、少くとも60の複数のエクソンが約2.4百万ベースをもった染色体ＤＮＡの大きな領域に分散している。イントロンは長さで平均35kbである。筋ジストロフィーの場合には、染色体の変化の場所を決め診断するための各エクソンを含んだ制限酵素断片を解析するために、少くとも７〜９の別々のｃＤＮＡサブクローンがサザンブロット解析に必要とされる。さらにサザン法による解析は高価で面倒で時間がかかり、病院の研究室でルーチンに使うのには適さないラジオアイソトープの使用が必要とされる技法である。

変異と欠失の検出にサザン解析にかわるものは、Mullisらによる1987年７月28日公告されたアメリカ合衆国特許No.4,683,195及び1987年７月28日公告のMullisによるアメリカ合衆国特許No.4,683,202に記載されたポリメラーゼ鎖反応(PCR)である。

ＰＣＲによれば、遺伝子の特定の領域がナノグラム量の染色体ＤＮＡから百万倍にまで増幅される。増幅後、核酸の配列は直接ＤＮＡ配列決定、あるいは対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることによって変異した対立遺伝子の存在を解析できる。

ＰＣＲ法はβ−サラセミア、ヘモフィリスＡ、鎌状赤血球性貧血、フェニールケトン尿症等を含むいくつかの病気の診断に有用であることが認められている。遺伝病やウイルスのような体外ＤＮＡ配列を日常的に検査をすることはＰＣＲをもってしては一度に一つの配列しか試験をするために限界がある。複数の可能性のあるＤＮＡ配列を検査するには非常に多数の別の検査が必要で、従ってその方法をするには時間がかかり、高く、そしてやっかいである。

例えば、Duchenne筋ジストロフィー(DMD)のようなある種の病気では、ＤＭＤをもたらす点変異部が同定されていないので、ＰＣＲ診断には限界がある。ＤＭＤの場合の約60％が欠損によっている。他の40％は、現在未知であるが、多分、イントロン−エクソン開裂部位の変異が未完成な停止コドンの創出に関係していよう。

かくして、ＤＭＤ遺伝子のような多くの遺伝子が反覆検査法でスクリーニングされねばならない。

アメリカ特許No.4,683,195及び4,683,202では特定の配列の増幅のための方法が述べられている。両特許ともいくつか混じった配列を含む検体中の少くとも１つの特定の核酸配列があるかないかを検出する方法を述べている。その特許は少くとも１つの配列を請求しており、複数の配列を検出できると言っているが、同時に複数の配列を増幅する効果的な方法について提供していない。実施例では、単一の配列が増幅されるか、または複数の配列が次々に増幅されている。第二の配列についてプライマーを添加することは通常可能であるが、２つ以上の配列についてプライマーを加える場合、この方法はそうはいかない。本発明はＰＣＲ法の改良であり、複数の配列に対するプライマーが同時に反応するとき起こる問題を解決している。本発明は複数の配列の同時増幅法についてのべており、ここ複数増幅法を同じ遺伝子の中にある、あるいは複数の遺伝子の中にある複数の欠損を検出するために適用することを述べている。

本発明の方法はＸ及びＹ染色体上のヘミザイゴート遺伝子にある欠損を検出するために改良された方法を提供する。この方法はＸまたはＹ染色体上の欠損によって起こる例えばＤＭＤのような遺伝病を検出するのに効果的である。また、ホモザイゴートでの欠損にも有効で、適当な遺伝子配列が分っている限りにおいて、多くの起こりうるホモまたはヘミザイゴートでの欠損を同時に検査するのに使われよう。複数増幅法はまた欠損の有無に拘らず複数の遺伝子座を同時に解析することを可能にしている。

課題を解決するための手段本発明の目的は、複数の染色体ＤＮＡ配列における欠損を同時に検出するための方法である。

本発明のもう一つの目的は、Ｘ染色体に関連した遺伝病を検出することである。

さらにもう一つの本発明の目的は、ＤＭＤの診断である。

本発明の別の目的は、多形性（ポリモルフィズム）や非欠損型の変異に対する複数の遺伝子座を同時に解析することである。

すなわち、前述の目的にくわえて、本発明の一見地によって (1)その染色体を処理して一本鎖の相補鎖を作り、 (2)複数の対をなしたオリゴヌクレオチド・プライマーで各対が異なる配列に特異的であり、各対の１つのプライマーはセンスＤＮＡ鎖にある配列の一部に本質的に相補的で、他のプライマーはその相補的なアンチセンス鎖にある同じ配列の異なる部分に本質的に相補的なプライマーを添加し、 (3)夫々の相補的な配列にその複数のプライマーを接合させ、 (4)その複数の接合したプライマーを各々のプライマーに接合した鎖に相補的な伸長産物を合成するために３′末端から夫々同時に伸長させ、その伸長産物はその相補体から分離した後、各々の対のもう一つのプライマーからの伸長産物を合成するための鋳型として使用し、 (5) その伸長産物をその鋳型から分離して一本鎖分子とし、 (6) その一本鎖分子を少くとも１回、その接合、伸長、分離のステップを反復することによって増幅し、 (7) 夫々別の配列からの増幅された伸長産物を同定するステップを含む複数の染色体ＤＮＡ配列で欠損を同時に検出する方法を提供している。

それに加えての内容はＸ及びＹ染色体上の、あるいは欠損がホモザイゴートのときは常染色体クロモソーム上の複数の染色体ＤＮＡ配列での欠損の検出を含んでいる。オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損症、ステロイドスルファターゼ欠損症、Ｘ染色体関連筋ジストロフィー等を含むいろいろなＸ染色体関連の疾病を検出できる。

もう一つの内容は、Ｘ関連筋ジストロフィーが複数の対をなしたプライマーで、蛋白質ジストロフィンをコードしている遺伝子の中にある異なる配列に相補的なプライマーを使って検出されることである。他の内容はＸ関連の遺伝病を検出するのに有用な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいる。

その他の目的、特徴及び利点などは添付の図面とともにみれば、この発明の目的に対してここに与えられた実施例の記載から明らかであろう。

この分野技術に通じた者にとって、ここに明らかにされた発明について、この発明の目的と精神からはなれずにいろいろな変更や修正ができることはすでに明らかである。

ここに用いられる「オリゴヌクレオチドプライマー」の言葉は３つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子を定義している。その正確な長さは究極の機能や温度やプライマーの起源及びその方法の使い方などを含むオリゴヌクレオチドプライマーの使い方などに関する多くの要因によって左右される。オリゴヌクレオチドプライマーは精製された制限分解物の中のような自然の状態で、あるいは合成的に作られることができる。

オリゴヌクレオチドプライマーは核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下におかれると合成の始点として働くことができる。その条件には、適当な温度、pHでヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤があることが含まれる。ここにあげた実施例では、プライマーは誘発剤の存在で特定の配列から伸長産物の合成をはじめるのに十分な長さの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。

欠損検出法においては、このオリゴヌクレオチドは通常少くとも１２塩基以上の長さがある。この実施例ではオリゴヌクレオチドプライマーは大よそ18から29塩基の長さである。オリゴヌクレオチドプライマーの感度と特異性にプライマーの長さと与えられる鋳型ＤＮＡ試料にある配列の独特性によってきめられる。例えば12 塩基以下の短かずぎるプライマーは染色体ＤＮＡの広範囲の配列に非特異的な結合を示すだろうし、従って有効でない。実施例ではオリゴヌクレオチドプライマーは通常エクソンの５′または３′末端の近傍にあるイントロン配列に接合するか、またはイントロン・エクソン結合点の配列に接合する能力で選択される。遺伝病をおこす既知の欠損による欠陥はエクソンまたはイントロンのはずれる部位を含む欠損によって生じるから、イントロン配列に相補的なプライマーをもつことが望ましい。

ここにおけるプライマー対の夫々は増幅されるべき特異配列、夫々に異なる鎖に相補的であるよう選ばれた。かくして夫々のプライマー対の一方のプライマーはセンス鎖の配列の一部とハイブリダイズするよう十分に相補的で、もう一方のプライマーはアンチセンス鎖にある同じ配列の異なる部分とハイブリダイズするのに十分相補的である。かくしてプライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はないけれども、それが正確な配列を反映すればする程、接合段階の間よく結合している。

プライマー対の中では各プライマーは他のプライマーからはなれた当該の配列の場所に好んで結合する。実施例においては、プライマー同志間の距離は２つの結合部位の間に伸長産物を合成させるに十分であるべきで、また各プライマーの伸長産物が鋳型から分離したとき、他のプライマーの鋳型として利用できるほどに十分近くにあるべきである。二つの対をなすプライマーからできた伸長産物は互いに相補的で、さらに次の合成に鋳型として利用される。結合部位がはなれていればいる程検索できる染色体ＤＮＡは多くなる。しかしながら、もしその距離が大きすぎると伸長産物はプライマーと効率よくはオーバーラップせず、増幅が起らないだろう。

ここに用いられている「伸長産物」という用語はオリゴヌクレオチドプライマーの３′末端から合成され、オリゴヌクレオチドプライマーが結合される鎖に相補的なヌクレオチド配列を示している。

ここに用いられる「区別して標識された」という用語は各伸長産物が異なる標識をつけられるか、或いは異なるサイズをもつか、特別に標識されたオリゴヌクレオチドに結合することで他のものから区別ができるということを示している。この技術に通じた者は多くの標識が利用できる。例えば、それらにはラジオアイソトープ、蛍光、化学発光、酵素、抗体などが含まれる。標識の選択には多くの要因が影響する。これらには、ＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションと結合の割合に及ぼす標識の影響、標識の感度、標識されたプライマーやプローブ、伸長産物の作りやすさ、自動化のしやすさ、装置化、便利さ、などが含まれる。例えば、³²Ｐ，^３Ｈ，あるいは¹⁴Ｃのような異なるラジオアイソトープ、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッドあるいは、4-クロロ-7 -ニトロベンゾ-2-オキサ-1-ジアゾール(NBD)のようないろいろな蛍光剤あるいはラジオアイソトープ、蛍光剤及び化学発光剤のような異なる標識の混合が使われよう。また一方、プライマーは夫々の配列について増幅された伸長産物の長さをかえて、それでこの分野で知られたいろいろな方法で分離できるように選択できる。同様に伸長産物は異なる伸長産物を区別するのに使われる制限断片長のポリモルフィズムをもたせられる。これらの例では夫々のプライマーまたはその伸長産物が混合物であっても他のプライマー全てと区別される。一方、増幅された伸長産物に結合するプローブが標識されて、複数ＤＮＡ増幅反応の中で単一の配列をもった対立形質を区別する一連のプローブが標識の有無によらず使用できる。

ここにおいて検出されるべき特異的な異なるＤＮＡ配列の夫々は生物体の染色体ＤＮＡやウイルス、バクテリアあるいは寄生生物のような外来のＤＮＡからもたらされる。検査すべき生物からの染色体ＤＮＡのもとは血液、毛髪、あるいは組織（絨毛、羊水細胞、繊維芽細胞、生検試料を含む）などである。ＤＮＡの起源は新鮮に得られたものでも、永年適切に貯えられたものでよい。ＤＮＡは増幅できるに十分な品質であるべきである。染色体ＤＮＡはこの分野に通じたものにとっては既知の手法で調整できる。

ここで用いられている「欠損（欠失）」の用語は染色体ＤＮＡ配列から１つまたはそれ以上の核酸塩基が欠失し、それで遺伝子にはなくなっているようなＤＮＡ配列を表わしている。欠損の大きさは増幅法の感度に影響する。

本法によって特定の既知核酸配列が検出できる。望ましくは、少くとも配列のごく一部が染色体から欠損している。唯一必要なことは、配列の両末端で十分な数の塩基は配列にそった相当な位置で望んでいる配列と異なる鎖とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作るのに十分よくわかっているべきである。

オリゴヌクレオチドプライマーは適当な方法で調製される。例えば、フォスフォトリエステル及びフォスフィルジエステル法や自動化された方法でオリゴヌクレオチドの合成が修飾された固体の担体上で行われたり、生物体から分離されたり（制限酵素消化）、またＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型を酵素的に向けられたコピーをすることによって生成することなどによる。

本発明の実施例は、ＤＮＡを一本鎖の相補的ＤＮＡ鎖を作るよう処理し、複数の対をなしたオリゴヌクレオチドプライマーを加え、その対は夫々異なる配列に特異的で、その一つのプライマーは本質的にセンス鎖にある配列の一部に相補的で、他のプライマーは相補的なアンチセンス鎖にある同一の配列の異なる部分に本質的に相補的としてあり、それらの相補的配列にその複数のプライマーを接合させ、その接合した複数のプライマーをその３′末端から同時に伸長させて夫々のプライマーに接合した鎖に相補的な伸長産物を合成させる。その伸長産物は相補体から分離した後、夫々の対の他のプライマーから伸長産物の合成をするための鋳型として用い、その伸長産物を一本鎖分子を作るためにその鋳型から分離して、その一本鎖分子を少くとも１回その接合、伸長、分離のステップを反復することによって増幅し、そして夫々異なる配列からのその増幅された伸長産物を同定するというステップを含む複数のＤＮＡ配列における欠損を同時に検出する方法である。

本発明の実施例は、複数の染色体ＤＮＡ配列で、その配列がＸ及びＹ染色体上の一群の配列から選ばれている配列での欠損を検出する方法である。ＸとＹ染色体上のヘミザイゴート遺伝子を検出することは、これが感度の程度を上げるので望ましい。この方法が、ヘテロザイゴートの状態を検出するのに用いられるときは定量的な測定が必要であり、ヘミザイゴート遺伝子でやられるような配列の有無を検出するよりずっと効率がよくない。例えば、エクソンの一部が欠損していると、本発明の複数増幅法はオリゴヌクレオチド配列を作れないか、または異なるサイズのオリゴヌクレオチド配列を作るかのいずれかによってこれを検出する。さらに、複数のエクソンは同時に調べられる。かくして一つの欠損があることをみつけるのは容易である。

しかしながら、ヘテロザイゴートの状態をみるに染色体は一つの正常遺伝子と一つの欠損遺伝子をもち、正常遺伝子は正常な産物を産し、従って、伸長産物の生産に定量的な差を測る必要がある。

本発明の第二の実施例は、同時解析の目的で複数の、おそらく無関係の配列を同時に増幅させるものである。そのような解析は、外来の配列（ウイルス、バクテリア、或いは他の寄生生物）がＤＮＡ試料の中に存在するかどうかを決めるか、または複数の配列の中にある多形性または変異を検出することができよう。多形性または変異はこの技術に通じた者にとってよく知られたいろいろな方法で検出できる。その方法には、直接ＤＮＡ配列決定、対立形質に特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、競合オリゴヌクレオチドプライミング法等があるが、これらに限定するものではない。

複数染色体ＤＮＡ増幅法は染色体ＤＮＡ配列にある欠損によって起こるＸ染色体関連の疾病を検出するのによく使われる。遺伝病は変異、欠損等を含むいろいろなメカニズムによっておこされる。ここに記された方法は、染色体の中にある欠損から起こる遺伝病の検出のために開発された。複数染色体ＤＮＡ増幅法の使えそうないくつかのＸ染色体関連の例はオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ヒポキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼ欠損症、ステロイドサルファターゼ欠損症、Ｘ染色体関連筋ジストロフィー等がある。その他のＸ染色体またはＹ染色体上の遺伝子上の異常も容易に検出される。その方法もまた、一セットの染色体配列の中にあるいくつかのセットになった既知の点変異の検出に適用できる。この方法はまた当該のＤＮＡ試料にあるどのセットの外来ＤＮＡ配列を同時に検出するのにも適用できる。この方法はまた染色体の中にあるどのセットの多形性的な、あるいはいろいろな縦列した反復配列を同時に検出することにも応用できる。

複数増幅系の利点は、多くの病気や特定のＤＮＡ配列の変性を同じ検査で検出できることである。例えば、ヒポキサンチンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ欠損症、ステロイドスルファターゼ欠損症、Ｘ染色体関連筋ジストロフィー、オルニチン、トランスカルバミラーゼ欠損症に対するプライマーを全て同時に同じ試料に流せる。さらに複数増幅法は、ジストロフィン遺伝子のような複数のエクソンをもった非常に大きな遺伝子について用いられる。ジストロフィン座は大きなサイズであるためにMu llisタイプのＰＣＲ増幅法は一回の検査で全遺伝子を調べあげることはできない。かくして疾病をもたらす可能性のある全ゆる欠損を検出するには遺伝子の中で複数の部分増幅が必要とされる。ＤＭＤ遺伝子座での欠損はＤＮＡの200 万以上の塩基に分布している約60をこえるエクソンの座にわたっている。特に、これらのエクソンは全て大きなイントロンによって分離されているために、60にまでの別々の反応がＤＭＤ欠損を完全に解析するのに必要とされよう。この作業を単純化するために、欠損を検出するための複数染色体ＤＮＡ増幅法に関する本発明が複数のエクソンを同時に検査するために用いられる。例えば、分けられたＤＭＤ遺伝子のエクソンの脇にあるオリゴヌクレオチドプライマーが合成され、結合され、そして複数ＤＮＡ法に用いられる。現在、少くとも７つの異なるＤＭＤ遺伝子配列が同時に調べられている。複数増幅法のはじめから結果の写真撮影までの全体の方法は５時間足らずである。増幅された領域の相対位置は結果に影響せず、少くとも1000kb で分離されたエクソンが増幅されている。Mull isのＰＣＲ増幅法は、１つあるいは多分２対までのプライマーにとっては十分であるが、２対以上のプライマーが用いられると、この方法は適切な配列の全てを十分には増幅しない。

この技術に通じた者は、より多くのエクソン遺伝子配列が用いられるようになるので、この検査法の適用が複数の遺伝子の欠損に対して同時に検査する、あるいは同じ遺伝子内の複数の部位を同時に検査するためにも広げられよう。

後の方の例は遺伝子の末端に接着したプライマーが遺伝子配列の全体にゆきわたらないほど大きいジストロフィンのような遺伝子には重要である。かくして、遺伝子の異なる領域にある欠損を検出するために複数の解析をする必要がある。加えて、複数の無関係遺伝子内での特定の変異が知られてきているので、複数ＤＮＡ増幅法はこれらの変異のいずれかが存在する際には、同時に検査を適用できる。

さらに特定の、あるいは特に変わりやすいＤＮＡ配列の多形性がいろいろな遺伝子座で知られてきているので、複数ＤＮＡ増幅法がハプロタイプを決めたり、あるいはＤＮＡの同定や起源をきめる（遺伝足跡）ためにこれらの多形性を同時に解析するのに使われる。

同時に流せる解析の数は無限であるが、上限はおそらく大凡20であり、分離されるために必要な大きさのちがいや伸長産物の分離に利用される標識やその方法の数等に左右されている。

たった９個のエクソンを同時に増幅する能力が一回の反応で既知のＤＭＤ欠損の全ての中90％以上を検出させられる。10個程度しかないエクソンでさえも同時に増幅する能力が２，３回の反応でＤＭＤの欠損の迅速で簡単な診断をすることができる。ＤＭＤ遺伝子には約60のエクソンがあり、そのエクソンが夫々についてプライマーを必要とするようにバラバラであることを考えれば、最大６回の別々の検査がこの遺伝子の全欠損を検出するのに必要とされる。同じ仮定では、MullisのＰＣＲ法はこの遺伝子の欠損を検出するのに60回の別々の反応を必要とするだろう。かくして、遺伝子のサイズが増し、検出できないエクソンの数が増すにつれて、この方法の利点は大いに高まる。さらに、自動化されたＰＣＲ装置（パーキン・エルマー／シータスで製作されたような）やＤＮＡ配列決定機を使えば増幅されたＤＮＡ断片の分離と検出を容易にし、分析の自動化を助け、そして高度に訓練された研究者を必要とせずに臨床研究室で日常的に適用される方法になるであろう。

以下に記す例は説明のために提供するもので、この発明をいかなる方法をもってしても制限しようとするものでない。実施例において、全ての百分率は固体の場合、重量比であり、液体の場合は容量比である。また全ての温度は特に示さなければ摂氏である。

実施例１この場合ヒトのＤＭＤ遺伝子の中の複数の別々の染色体領域を同時に増幅させるために次の条件が使われている。これらの条件は、増幅される特定の領域、増幅される配列の長さと数、オリゴヌクレオチドプライマーの選択等に左右されて若干修正される必要があろう。反応時間は全体にわたる配列の長さに大いに左右される。かくして、増幅される配列の数が増し、また増幅される配列の長さが増すと時間も増すことになる。温度はプライマー配列の長さと特性及びＧＣ塩基の相対含量によっている。プライマーが長いほど高温を必要とされる。配列が独特であればある程、増幅の温度は低くてよい。

ＧＣに富んだプライマーは、クロスハイブリダイゼーションを妨げ、独特の増幅ができるために高温を必要とする。しかしながら、ＡＴ含量が増すと高温はこれらプライマーの融解を起こす。すなわち、これらのプライマーは作用させる反応を長びかせねばならない。

鋳型のＤＮＡはいろいろなこの技術に通じた者にとっては知られた、よく確立された方法を使って解析のために選ばれた組織から調製された。典型的には100μｌの反応容量が用いられた。大凡500ngのＤＮＡを次の組成の溶液に添加した。すなわち67mＭのトリス塩酸（pH8.8 25℃で）、6.7mＭの塩化マグネシウム、16.6mＭの硫酸アンモニウム、10mＭのβ−メルカプトエタノール、6.7μＭのエチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、170μg/mlの牛血清アルブミン。この溶液は予め調製されて−70°で保存すれば長期間安定のようである。酵素Ｔaqポリメラーゼを終濃度で100単位/mlになるよう加えた。この反応混液を穏やかに混合した。反応混液に約50μｌのパラフィン油を重層し、反応容器（好ましくは0.5mlのマイクロ遠心管がよい）を10秒間14,0 00×ｇで遠沈した。適切な温度でグリセロールを満たした加熱ブロックの間に反応容器を手動で移すか、またはパーキン・エルマー／シータス社のサーモサイクラーで「ステップ−サイクル」機能を用いて反応容器を自動的に移すかして増幅を行わせた。反応はいろいろな時間、制御された、そしてくり返さえる温度変化によってコントロールされた。はじめは、反応は94° で７分間加熱された。次いで次の温度と時間での25サイクルで行われた；すなわち、94°１分、それから55°45秒、65°3.5分である。最後のサイクルが終えたら65°でさらに７分間反応を続けた。それから解析するまで４°に保存された。

染色体ＤＮＡの欠損や外来のＤＮＡ配列を増幅産物を検査することで調べた。例えば、期待される増幅産物がない場合は欠損を示している。

この決定には多くの方法が、この技術に通じた者にとっては知られている。好ましくは、この方法は以下の緩衝液を用いて1.4%（重量／容量）のアガロースゲルで反応液の約1/20を電気泳動にかけることである；緩衝液は40mＭのトリス塩酸、20mＭの酢酸ソーダ、１ｍＭ EDTA（氷酢酸でpH7.2に調整）及び0.5μg/μｌのエチジウムブロミドである。14cmのアガロースゲルの長さのある当り、100分間3.7Ｖ／cmで電気泳動を行った。解析は紫外線照射のトランスイルミルネータで泳動された反応産物を検査することで完結するが、その結果は永久記録のために写真にとっておかれた。

解析に個々の増幅産物にあるＤＮＡ配列の多形性または変異を決めることを必要がある場合は、アガロースゲルを既によく確立された方法、例えばサザンブロッティング法を使ってニトロセルロースのような適当なＤＮＡ結合体に移す。

増幅されたＤＮＡ断片にある個々のＤＮＡ配列は対立形質特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含むいろいろな技術によって決定される。一方、反応産物は複数増幅反応産物の増幅された各々のＤＮＡ配列に対して別々の対立形質特異的なプライマーを用いて競合的オリゴヌクレオチドプライマー増幅によってアガロースゲル電気泳動の前に分析することができる。

個々の増幅産物にあるＤＮＡ配列のちがいを決める第三の方法は電気泳動を要しない。この方法では、複数増幅反応液の一部をとってニトロセルロースのような適当なＤＮＡ結合体に順次アプライし、そして夫々の試料を対立形質特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブとハイブリダイズさせることによって分析する。

夫々別々の試料はその複数増幅されたＤＮＡ配列の一つに特異的なＡＳＯプローブの対の一つとハイブリダイズすることによる。

実施例２第１図はＤＭＤ遺伝子座の模式的な表示である。ＤＭＤ遺伝子の増幅の例に使われたエクソンの相対的位置が説明されている。

ＤＭＤの検出にはいろいろなプローブが個々のＰＣＲ反応、あるいは複数ＰＣＲ反応を組み合わせるのに用いられる。これらのプローブは表１に示されている。

表１では夫々のエクソンはa,b,c,d,e, f,gと示され、第１図の同一の文字に対応している。エクソン番号がわかっているものはそれが掲げられている。エクソン番号がわかっていないときは、そのエクソンを含む染色体のHi ndIII断片の大きさが示されている。またエクソンの大きさは塩基対(bp)で示されている。ＰＣＲプライマー配列は５′−３′の方向に示されている。前向のプライマー(F)はエクソンの５′ をハイブリダイズし、また逆のプライマー(R) はエクソンの３′をハイブリダイズする。夫々のプライマーセットで得られる増幅された断片の大きさも示されている。

個々の示されたエクソンについて欠失しているＤＭＤ患者の分析した中での百分率は第４欄に示されている。この全体の数は多くの欠損が複数のエクソンに含まれるので、個々のエクソン欠損の頻度の合計よりも少ない。

表２には、エクソン17に対するエクソンとそれに隣り合うイントロンの配列がある。エクソンは227から402までである。この配列を増幅するのに用いられたプライマー配列は７から33までと396から421までのものである。

表２表３には表１のエクソンｄ〔すなわち、4.1k bのHindIII断片にあるエクソン〕に対するエクソンと隣りのイントロンが示されている。エクソンは295から442までである。この配列を増幅するのに使われたプライマー配列は269から293 までと、512から536までである。

表３表４には表１のエクソンｅ〔0.5kbのHindIII 断片のエクソン〕に対するエクソンと隣りのイントロン配列がある。このエクソンは396から5 71までである。この配列を増幅するのに用いられたプライマー配列は51から75までと、572から597までである。

表４表５には表１のエクソンｆ〔1.2kbと3.8kbの HindIII断片にオーバーラップしている〕のエクソンと隣りのイントロンがある。エクソンは22 1から406までである。この配列を増幅するのに用いられたプライマー配列は26から53までと、 516から541までである。

表５表６はエクソン12に対するエクソンと隣りのイントロンである。このエクソンは180から329 である。この配列を増幅するのに用いられたプライマー配列は27から52までと、332から357までである。

表６表７は10kb Hind III断片にあるエクソンのエクソンと隣りのイントロン配列である。エクソンは１から150までである。

表７表８は1.6kb HindIII断片にあるエクソンに対するエクソンと隣りのイントロンの配列である。

エクソンは512から622までである。

表８表９には3.1kb HindIII断片にあるエクソンのエクソンと隣りのイントロンの配列である。エクソンは519から751までである。

表９表10は1.5kb HindIII断片にあるエクソンに対するエクソンと隣りのイントロンの配列である。

エクソンは190から337までである。

表10 実施例３ＲＣＲを用いたＤＭＤの胎児診断と検出ＰＣＲ欠損検出による胎児診断の例が合成されたオリゴヌクレオチドプライマー（表１のセットｂ）を用いたものが示されている。このプライマーセットは、ヒトのＤＭＤ遺伝子のイントロン配列に隣り合うエクソン17のすでに分離され、配列が決められている領域に対応している（表２）。

この分析の結果は第３図に示されている。ＰＣＲ産物（全反応の1/20）がコントロールの男性口、診断される男性胎児Λ、ＤＮＤのキャリヤーの母親（○）、及び胎児の兄弟で罹患している男性からとった鋳型ＤＮＡによって得られた。ＤＮＡの分子量スタンダード（ＭＷ；HaeIII で消化されたφ×174ＤＮＡ）も示されている。

その結果は、罹患した男性はエクソン17の欠損をもっており、それは増幅はされておらず、また胎児は欠損がなく、従って罹患していないことを示している。これらの結果はＰＣＲはこのエクソンに関する欠損を含むＤＭＤの場合を診断するのに有効である。

実施例４複数検出複数検出の例が第３Ａ図と第３Ｂ図に示されている。

この解析は６つのプライマーセット（表１のａ〜ｆ）と実施例１に記された条件を用いて行われた。用手法によるよりも自動化された増幅で行われた。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは６つの異なるＤＭＤ遺伝子のエクソンに隣り合う領域を示している。それらを反応バイヤルに混ぜ、複数染色体ＤＮＡ増幅法のために使った。鋳型ＤＮＡは、リンパ芽球（血液試料からとった）から単離された。解析はアガロースゲル電気泳動によった。

欠損していないＤＮＡが鋳型として用いられた場合、ＤＭＤ遺伝子の６つの分散した領域が動じに、かつ特異的に増幅された（第３Ａ図試料＃534）。この方法で検出された別々の欠損が第３Ａ図と第３Ｂ図に示されている。正常、部分、または全体のＤＭＤ遺伝子の欠損を含むいくつかのＤＮＡ試料が示されている。第３Ａ図、第３Ｂ図は、またＤＮＡの分子量スタンダード（ＭＷ；HaeIIIで消化されたφ×174ＤＮＡ）と反応に鋳型ＤＮＡが加えられなかったネガティブコントロール（−）も示している。第３Ａ図はまた増幅されたＤＮＡ断片は第１図のエクソン（ａ〜ｆ）に相当することも示している。

実施例５胎児診断いくつかの胎児診断で複数ＰＣＲがうまく使われている。その条件は実施例１に記したものである。第４図はＤＭＤの胎児診断のための複数ＤＮＡ増幅法を示している。６つの異なる家系から罹患した男性（ＡＭ；リンパ芽球ＤＮＡ）と男性の胎児（ＭＦ；培養羊漿細胞ＤＮＡ）からとったＤＮＡを使った増幅の結果を示している。解析は実施例１に記したとおりであった。

ＤＲＬ＃521と＃531の罹患男性と胎児のＤＮＡが領域ｆ（第１図）の欠損を示している。すなわち、この胎児は罹患していると診断された。

ＤＲＬ＃43Ｃでは罹患した男性はｆを除く全ての領域で欠損している。一方、胎児は罹患していない。ＤＲＬ＃483での罹患した男性は領域ａで欠損しているが、一方男の胎児は罹患されていない。ＤＲＬ＃485と469からの試料はいずれもこの技術では欠損は示さなかった。かくして、もし欠損による欠陥がこれらの家系でＤＭＤを起こすとすれば検査していないエクソンに起こっているだろう。

実施例６絨毛膜繊毛標本(CVS)のDNAの複数DNA 増幅法による胎児診断第５図はＣＶＳＤＮＡからの複数ＤＮＡ増幅法を示している。ＤＲＬ＃92からの罹患男性（ＡＭ；リンパ芽球のＤＮＡ）と男性胎児（ＭＦ；ＣＶＳＤＮＡ）とも領域ｅとｆ（第１図）での欠損を示している。すなわち、胎児は罹患していると診断された。ＤＲＬ＃120からとったＣＶＳＤＮＡは、この方法では欠損を示さなかった。実施例１に示したようにして試料を分析した。この結果は複数増幅法が胎児診断に対してＣＶＳＤＮＡが増幅の鋳型として使われればよく作動することを示している。

実施例７ DMD遺伝子の７つの別個のエクソンの複数増幅法この例は７種の別個のＤＮＡ配列が複数増幅法を用いて同時に増幅されることを示している。

条件は実施例１に記されたとおりである。ａ〜ｇのプライマーセット（表１）が反応に加えられた。かくして、ＤＭＤ遺伝子の７つのエクソン領域（第１図）が増幅された（第６図）。

実施例８複数の一般的遺伝病をもたらす変異の同時検出のための複数ＤＮＡ増幅法この例は複数増幅法がＤＭＤ、鎌型赤血球性貧血、α₁-アンチトリプシン欠損症等をもたらす最も一般的な変異のいずれに対して新生児について同時に検診するのに用いることができる。

この検査では、表１に掲げたプライマーセットのどれか、またはその全てがＤＭＤ遺伝子欠損の大多数を診断するために複数ＤＮＡ増幅に用いられる。加えるに、プライマーセットはその他の遺伝病をもたらす変異を同定するために増幅反応に添加することができる。その他のプライマーセットはＡ．５′-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTT-3′ ５′-ACACAACTGTGTTCACTAG-3′ がある。このオリゴヌクレオチドはβ^Ｓ（鎌型細胞）血球素病において変異を受けるＤＮＡ塩基を含むヒトのβ−グロビン遺伝子の167bp断片を増幅する。変異したβ^Ｓ配列の有無は正常配列またはβ^Ｓ配列の特異的な２つの標識をつけた対立形質特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブの夫々を用いた複数増幅反応のサザンブロットハイブリダイゼーションまたは個別のドットブロットのいずれかによって測定される。

これら２つのＡＳＯプローブの配列は、１） Normal：５′-CTCCTGAGGAGA-3′ ２） β^Ｓ：５′-CTCCTGTGGAGA-3′ である。もしドットブロットハイブリダイゼーションが使われるときはニトロセルロースのようなＤＮＡ膜に複数増幅反応からのＤＮＡを別々に適用することが、ハイブリダイゼーションで使われる個々のプローブについて必要とされる。

個々の標識されたプローブのハイブリダイゼーションは、そのプローブが当該の遺伝子の個々の対立形質に相補的であるか、或いは別の遺伝子のそれに相補的であるかによらず別個に行わねばならない。

もう一つの、そして好ましいものとして増幅反応液の一部を２つとって別々にアガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースまたは同様の膜にサザン法で転写する。この２つのサザンブロットの各々について特定のＡＳＯプライマーの夫々に標識したセットの一つとハイブリダイズする。かくして、複数反応で増幅されたＤＮＡ断片の夫々の正常対立形質または変異のわかっている対立形質の夫々について分析される。

上に述べられたプライマーセットに加えて、次のようなオリゴヌクレオチドプライマーはまた増幅法に添加することができる。

Ｂ．５′-ACGTGGAGTGACGATGCTCTTCCC-3′ ５′-GTGGGATTCACCACTTTTCCC-3′ これらのプライマーはα₁-アンチトリプシン遺伝子のＺ対立形質を作り、α₁-アンチトリプシン欠損症をもたらすＤＮＡ塩基の変化を含む 450bpのＤＮＡ断片を生産する。Ｚ対立形質と正常のＭ対立形質は、次のようなＡＳＯプローブとハイブリダイゼーションすることによって複数増幅反応における他の対立形質と区別される。

1)Normal(M)allele:5′-ATCGACGAGAAA-3′ 2)Mutant(Z)allele:5′-ATCGACAAGAAA-3′ ハイブリダイゼーション分析は上述のように β−グロビンプローブと並行して行われる。

加えてオリゴヌクレオチドＣ．５′-GAAGTCAAGGACACCGAGGAA-3′ ５′-AGCCCTCTGGCCAGTCCTAGTG-3′ もまた複数反応に加えることができ、Ｓ対立形質を生み、α₁-アンチトリプシン欠損症をもたらすＤＮＡの塩基変化を含むα₁-アンチトリプシン遺伝子の340bpのＤＮＡ領域を生産する。

Ｓ対立形質はＭとＳの対立形質に特異的な２つのＡＳＯプローブ Normal(M)allele ５′-ACCTGGAAAATG-3′ Mutant(S)allele ５′-ACCTGGTAAATG-3′ を使うことによってβ^ＳとＺ対立形質に対しての上に述べたような複数増幅にある他の対立形質と区別される。

表１とこの例のＡ，Ｂ，Ｃにあるようなプライマーを使ってＤＭＤ、鎌型細胞性貧血、α₁-アンチトリプシン欠損症等をもたらす共通の変異を同時に決めることができる。

この技術に通じた者は本発明が、その目的とするところを実施し、ここで表示された目的と利点と同時に、そこに内在しているそれらを得るためによく適用されることを容易に評価するだろう。ここに述べられた方法や技術は、実施例として代表的なものであり、その目的とするところに制限を加えるつもりはない。

この技術に通じるものにとって発明の精神の中にあり、付記する請求範囲の目的とするところで規定されるものの変更や他の用途は可能であろう。

【図面の簡単な説明】

この発明は、以下の明細を読むこと及び添付の図面を参照することで、もっと容易に理解されよう。第１図は遺伝子座の大凡の大きさ、増幅された断片の位置及びクローン化され、配列が決められた染色体領域の位置を説明しているＤＭＤ遺伝子の模式的代表例である。第２図は生前診断に対する胎児のＤＮＡにおける欠損の検出に用いられたＰＣＲ反応の例である。第３図は関係のない男性のＤＭＤ患者からのリンパ芽細胞のＤＮＡの複数ＤＮＡ増幅を示している。Ａ．とＢ．は２セットの10種の試料を示している。ＤＲＬ＃の夫々は、Human Geneti cs Diagnostic Research LaboratoryのＲ．Ｊ．Klebergセンターの家系番号を表わしている。ＭＷ：HaeIIIで分解されたφ×174ＤＮＡ。（−）：反応に加えられた鋳型なしＤＮＡ。増幅された領域と遺伝子上の領域の間の関係は、Ａの右に示されている。英文字は第１図のそれに対応している。第４図はＤＭＤの生前診断に対してとられた複数ＤＮＡ増幅を示している。６つの異なる家系からの罹患した男性（ＡＭ；リンパ芽ＤＮＡ）と男の胎児（ＭＦ；羊水の培養細胞ＤＮＡ）からとったＤＮＡを用いた増幅の結果を示している。ＤＲＬ＃521と531の罹患した男性や胎児のＤＮＡとも、この胎児は罹患していると診断をうけている領域ｆの欠失を示している（第１図）。ＤＲＬ＃43cにおいては、罹患した男性はｆ以外の全ての領域で欠失しているが、一方、胎児は罹患していない。ＤＲＬ＃483における罹患男子は領域ａで欠損しているが、男の胎児では罹患していない。ＤＲＬ＃485と469の試料はいずれも、この技法によっては欠失を示さなかった。第５図は絨毛繊毛の標本（ＣＶＳ）のＤＮＡからの複数ＤＮＡ増幅を示している。ＤＲＬ＃92 から得た罹患した男性（ＡＭ；リンパ芽のＤＮＡ）と男の胎児（ＭＦ；ＣＶＳのＤＮＡ）はいずれも領域ｅとｆの欠損を示しており（第１図）、胎児は罹患していると診断される。ＤＲＬ＃12 0からのＣＶＳＤＮＡは、この方法では欠損を示していない。第６図はＤＭＤ座の７つのエクソン領域の増幅を示している。これらの図面は必ずしも目盛がついていないし、この発明の特色がスケールにおいて強調されているか、または明瞭さと簡明のために模式的に示されている。

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【手続補正書】

【提出日】平２．３．１ (1) 特許出願人会社の代表者名を記載した願書を提出
する。 (2) 委任状及び同訳文を提出する。 (3) 1) 明細書70頁第８〜９行目「例である。」を
「例を示す電気泳動写真である。」と訂正。 2) 明細書70頁第11〜12行目「示している。」を「示す
電気泳動写真であり、」と訂正。 3) 明細書71頁第２行目「示している。」を「示す電気
泳動写真であり、」と訂正。 4) 明細書71頁第17行目「示している。」を「示す電気
泳動写真である。」と訂正。 5) 明細書72頁第５行目「示している。」を「示す電気
泳動写真である。」と訂正。 (4) 図面（全図）については内容に変更なし。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リチャードエイ．エル．ギブスアメリカ合衆国，77025 テキサス，ヒューストン，グラメリィ 3602番地 (72)発明者ジョエルイー．レイナーアメリカ合衆国，77006 テキサス，ヒューストン，コモンウェルスアール，2100 番地 (72)発明者プヒヌガヌグェンアメリカ合衆国，77054 テキサス，ヒューストン，アプト．1032，オールドスパニッシュトレイル 2300番地

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡを一本鎖の相補的な鎖になるよう
処理し；対をなしたオリゴヌクレオチドプライマーが夫々異なる配列に特異的で、その中の１つのプライマーはセンス鎖の配列の一部分に本質的に相補的で、もう１つのプライマーがその相補的なアンチセンス鎖の同じ配列の異なる部分に本質的に相補的であるような複数の対をなしたオリゴヌクレオチドプライマーを添加し；その複数のプライマーをそれらの相補的な配列に接合させ；その複数の接合したプライマーを夫々のプライマーの３′末端から同時に伸長させて各プライマーに接合した鎖に相補的な伸長産物を合成し、その伸長産物はこの相補的から分離した後に夫々の対の他のプライマーから伸長産物の合成のための鋳型として使用し；その伸長産物をその鋳型から分離して一本鎖分子を作り；その一本鎖分子を少くとも一回上の接合、伸長、分離のステップをくり返すことによって増幅し；その増幅した伸長産物を夫々の異なる配列と比べて同定する。というステップを含む複数のＤＮＡ配列にある欠損を同時に検出する方法。
【請求項２】染色体ＤＮＡ配列がＸ及びＹ染色体上の
配列の群から選ばれる複数の染色体ＤＮＡ配列での欠損を検出する請求項１の方法。
【請求項３】遺伝病をおこす欠損を染色体ＤＮＡ配列
が含むＸ染色体関連の疾病の検出のための請求項２の方法。
【請求項４】オルニチントランスカルバミラーゼ欠損
症、ヒポキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼ欠損症、ステロイドスルファターゼ欠損症、及びＸ染色体関係の筋ジストロフィーから成る群の中から選ばれたＸ染色体関連遺伝病の検出のための請求項３の方法。
【請求項５】複数の対を成すプライマーがジストロフ
ィン蛋白をコードしている遺伝子の中にある異なる配列に相補的であるＸ染色体関連筋ジストロフィーの検出のための請求項４の方法。
【請求項６】 (1) 5′-GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC-3′ (2) 5′-AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC-3′， (1) 5′-GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG-3′ (2) 5′-GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTAG-3′， (1) 5′-AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC-3′ (2) 5′-CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3′， (1) 5′-GATAGTGGGCTTTACTTACATCCTTC-3′ (2) 5′-GAAAGCACGCAACATAAGATACACCT-3′， (1) 5′-CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA-3′ (2) 5′-TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT-3′， (1) 5′-GAATACATTGGTTAAATCCCAACATG-3′ (2) 5′-CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC-3′，及び (1) 5′-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3′ (2) 5′-GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC-3′，から成る群から複数の対をなしたプライマーが選ばれる請求項５の方法。
【請求項７】染色体ＤＮＡが胎児の組織からとられる請
求項３の方法。
【請求項８】 (1) 5′-GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC-3′ (2) 5′-AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC-3′， (1) 5′-GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG-3′ (2) 5′-GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTAG-3′， (1) 5′-AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC-3′ (2) 5′-CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3′， (1) 5′-GATAGTGGGCTTTACTTACATCCTTC-3′ (2) 5′-GAAAGCACGCAACATAAGATACACCT-3′， (1) 5′-CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA-3′ (2) 5′-TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT-3′， (1) 5′-GAATACATTGGTTAAATCCCAACATG-3′ (2) 5′-CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC-3′， (1) 5′-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3′ (2) 5′-GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC-3′， (1) 5′-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTT-3′ (2) 5′-ACACAACTGTGTTCACTAG-3′， (1) 5′-ACGTGGAGTGACGATGCTCTTCCC-3′ (2) 5′-GTGGGATTCACCACTTTTCCC-3′，及び (1) 5′-GAAGTCAAGGACACCGAGGAA-3′ (2) 5′-AGCCCTCTGGCCAGTCCTAGTG-3′，から成る群から複数の対をなしたプライマーが選ばれる複数の染色体ＤＮＡ配列における欠損を検出するための請求項１の方法。
【請求項９】のＤＮＡ配列及びそれからの断片と誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的でジストロフィン遺伝子の鎖と接合し、ジストロフィン配列を増幅することができるようなＤＮＡ配列。
【請求項１０】の配列のＤＮＡとそれからとれる断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的でジストロフィン遺伝子に接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるようなＤＮＡ配列。
【請求項１１】をもつ配列とそれからの断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的でジストロフィン遺伝子の鎖と接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるようなＤＮＡ配列。
【請求項１２】をもつ配列とそれからの断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的で、ジストロフィン遺伝子の鎖と接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるようなＤＮＡ配列。
【請求項１３】をもつ配列とそれからの断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的で、ジストロフィン遺伝子の鎖に接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるＤＮＡ配列。
【請求項１４】をもつ配列とそれからの断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的で、ジストロフィン遺伝子の鎖に接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるＤＮＡ配列。
【請求項１５】をもつＤＮＡ配列と、それからの断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的でジストロフィン遺伝子の鎖に接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるＤＮＡ配列。
【請求項１６】をもつＤＮＡ配列とそれからの断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的でジストロフィン遺伝子の鎖に接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるＤＮＡ配列。
【請求項１７】をもつＤＮＡ配列とそれからの断片及び誘導体で、その断片と誘導体がジストロフィンをコードしている遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖に相補的でジストロフィン遺伝子の鎖に接合し、ジストロフィン配列を増幅することのできるＤＮＡ配列。