ES2177967T5 - Procedimientos para inhibir una respuesta inmune mediante bloqueo de las rutas gp39/cd40 y ctla4/cd28/b7 y composiciones para su uso. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA INHIBIR UNA RESPUESTA INMUNE, ASI COMO PARA INHIBIR EL RECHAZO DE TEJIDOS TRASPLANTADOS. EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE PREVENIR QUE UNA MOLECULA ENDOGENA DE UNA CELULA SELECCIONADA ENTRE EL GRUPO FORMADO POR LOS ANTIGENOS GP39 Y CD40 FIJE SU LIGANDO ENDOGENO, E IMPEDIR QUE UNA MOLECULA ENDOGENA DE UNA CELULA SELECCIONADA DEL GRUPO FORMADO POR LOS ANTIGENOS CTLA4, CD28 Y B7 FIJEN SU LIGANDO ENDOGENO. LA PREVENCION DE TALES MOLECULAS DE LA FIJACION DE SU LIGANDO BLOQUEA DE ESE MODO DOS VIAS INDEPENDIENTES DE SEÑALIZACION E INHIBE LA RESPUESTA INMUNE QUE PROVOCA EL RECHAZO DEL TEJIDO TRASPLANTADO.
Description
Procedimientos para inhibir una respuesta inmune
mediante bloqueo de las rutas gp39/CD40 y CTLA4/CD28/B7 y
composiciones para su uso.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La CD28 se expresa en la mayoría de las líneas
celulares T y células plasmáticas (June C.H. et al., Immunol.
Today 11, 211-216 (1990); Damle et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5096-6001
(1981)). El ligando para CD28 es B7, que se expresa en células B
activadas (Linsley P.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 5031-5035 (1990); Linsley P.S. et al.,
J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991).
La CD40 es un miembro de la familia de
receptores del factor de la necrosis tumoral (TNFR) de receptores de
señalización unidos a membrana de tipo I. Aunque identificada
originalmente como un antígeno de célula B, la CD40 se expresa por
todas las células que presentan antígeno (APC), incluyendo células
dendríticas, monocitos y células B.
El ligando de CD40 es gp39, que se une a CD40 y
puede activar así las células B. El gp39 es también conocido como
CD40L, TRAP y T-BAM. El gp39 es una proteína de
superficie celular de tipo II con una homología significativa con
TNF, y se expresa transitoriamente por células T activadas. Además
de las células T, el gp39 se expresa por basófilos, mastocitos y
eosinófilos.
Las rutas de CD28 y CD40 desempeñan papeles
esenciales en la iniciación y la amplificación de respuestas inmunes
dependientes de T (Bluestone J.A. Immunity 2,
555-559 (1995); Banchereau J., et al., Own. Rev.
Immunol. 12, 881-922 (1994); Durie F.H. et
al., Science 261, 1328-1330 (1993); Foy T.M.,
et al., J. Exp. Med. 178, 1567-1575 (1993);
Van den Eertwegh A.J.M., et al., J. Exp. Med. 178,
1555-1565 (1993)).
Las interacciones CD28/B7 proporcionan
"segundas señales" críticas necesarias para la activación
óptima de células T y la producción de IL-2
(Jenkins M.K, et al., J. Immunol. 147,
2461-2466 (1991); Schwartz R.H., Cell 71,
1065-1068 (1992); Boussiotis V.A., et al., J.
Exp. Med. 178, 1735-1763 (1993)), proporcionando
las señales CD40/gp39 la coestimulación para la activación de
células B, macrófagos, células endoteliales y células T (Grewal
I.S., et al., Nature 378, 617-620 (1995); van
Essen D., et al., Nature 378, 620-623
(1995); Hollenbaugh D., et al., J. Exp. Med. 182,
33-40 (1995); Armitage R.J., et al., Nature
357, 80-82 (1992); Cayabyab M., et al., J.
Immunol. 152, 1523-1531 (1994); Noelle R., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89. 6550-6554
(1992); Alderson M., et al., J. Exp. Med. 178,
669-674 (1993); Kennedy M.K., et al., Eur. J.
Immunol., 24, 116-123 (1994)).
Se ha descrito que anticuerpos que se unen a la
proteína CD40 son útiles para prevenir el crecimiento o
diferenciación de células B (documento WO94/01547). En el documento
WO95/06481 se describen la producción y la caracterización de una
serie de anticuerpos dirigidos contra gp39 humana y gp39 de ratón.
Un ejemplo ilustrativo es el anticuerpo monoclonal MR1
anti-gp39 de ratón, que se ha depositado en la
Colección de Cultivos Tipo Americanos (American Type Culture
Collection) y asignado el número de acceso HB 11048. Estos
anticuerpos y otras moléculas solubles que se unen a la proteína
gp39, por ejemplo la proteína de fusión CD40Ig, se dice que son
útiles para inducir la tolerancia en casos de transplante de médula
ósea y otros transplantes de órganos, y para inhibir la enfermedad
de injerto frente a hospedador. Según el documento WO 95/28957, el
citado procedimiento puede utilizarse para inducir la tolerancia de
células T ante transplantes tales como de hígado, riñón, corazón,
pulmón, piel, músculo, tejido neuronal, estómago e intestino. Se
propone además un procedimiento de tratamiento de diabetes.
También el documento WO 94/01547 propone
utilizar moléculas que se unen al antígeno B7 para causar la anergia
de células T, tratar el rechazo de transplante de aloinjertos,
tratar la enfermedad de injerto frente a hospedador y prevenir o
tratar la artritis reumatoide.
En Griggs et al., Journal of Cellular
Biochemistry, vol. supl. 0, nº 21, parte A, página 141, resumen
nº C2-427 (1995), se observa que la administración
de anticuerpo anti-gp39 y CTLA4Ig administrados
conjuntamente en un modelo animal daba como resultado el bloqueo
variable de la activación de células T específicas de ZP3, como se
determina mediante el análisis de la proliferación de células T y
células T específicas de ZP3.
Según el documento WO 96/39514, se efectúa la
potenciación de la expresión génica administrando a un sujeto una
cantidad de CTLA4 soluble de modo que inhiba una respuesta inmune,
consiguiendo así una expresión génica viral persistente sin
inmunosupresión a largo plazo. Además, la combinación de una
molécula de CTLA4 soluble y un anti-ligando CD40
(MR1) prolonga la expresión génica y permite la transferencia génica
secundaria. Un anti-ligando CD40 es cualquier
molécula que reconoce y se une al ligando CD40, por ejemplo un
anticuerpo (anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal,
anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o fragmentos de los
mismos) o una proteína de unión recombinante, por ejemplo una
proteína de fusión.
Las respuestas inmunes en hospedadores causan a
menudo el rechazo de tejidos y órganos transplantados. Así, la
inhibición de esas respuestas inmunes es crítica en el éxito del
transplante de tejidos. Ha habido estudios dirigidos a bloquear las
rutas CD28 o CD40, sin embargo, el bloqueo de ninguna de estas rutas
por sí solo ha sido suficiente para permitir el injerto de
aloinjertos altamente inmunogénicos (Turka L.A., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89, 11102-11105 (1992);
Parker D.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
9560-9564 (1995); Larssen C.P., et al.,
Transplantation 61, 4-9 (1996)). Las
monoterapias que bloquean las rutas CD28 o CD40 dieron sólo como
resultado en el mejor caso periodos temporales, y a veces más
largos, de supervivencia de tejidos transplantados. Ningún bloqueo
solo potenció uniformemente la supervivencia del injerto.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La vigorosa respuesta inmune a los transplantes
de órganos xenogénicos ha servido como una poderosa barrera para la
aplicación de esta técnica a los transplantes clínicos (Platt, J.L.,
Curr. Opin. Imm. 8, 721-728 (1996).
Los intentos experimentales previos de prolongar la supervivencia de
injertos dérmicos xenogénicos han requerido o bien la irradiación
total del cuerpo seguida de reconstitución xeno/singénica mixta
(Ildstad S.T., Sachs D.H., Nature, 307:
168-170 (1984)), o un riguroso preacondicionamiento
con timectomía combinada con el empobrecimiento de los anticuerpos
anti-células T (Pierson III R.N., Winn H.J., Russell
P.S., Auchincloss Jr., H., J. Exp. Med.,
170:991-996 (1989); y Sharabi Y., Aksentijevich I.,
Sundt III T.M., Sachs D.H, Sykes M., J. Exp. Med., 172:
195-202 (1990). Estas estrategias se han utilizado
recientemente para potenciar la aceptación de injertos dérmicos a
través de una barrera xenogénica discordante (Zhao Y., Swenson K.,
Sergio J., Arn J.S., Sachs D.H, Sykes M., Nat. Med.,
2(11):1211-1216 (1996)). Sin embargo, la
morbilidad potencial asociada con los regímenes de tratamiento
citoablativo presenta un obstáculo significativo para la
introducción del uso de estas estrategias en el transplante clínico
de órganos sólidos. Así, el desarrollo de estrategias no
citoablativas para prolongar la supervivencia del xenoinjerto
facilitaría en gran medida la aplicación clínica de estas
técnicas.
Actualmente existe la necesidad de proporcionar
modos de afectar la tolerancia a largo plazo de tejidos
transplantados por el hospedador, aumentando así la tasa de
supervivencia del transplante. Para ello, es necesario asegurar una
falta de respuesta inmunológica suficiente en el receptor del
transplante.
Los inventores han encontrado que la inhibición
de las respuestas inmunes dependientes de T como resultado del
bloqueo de las señales CD28 o CD40 es potente pero incompleta. Los
datos de la presente memoria demuestran que el bloqueo simultáneo
de estas rutas inhibe inesperadamente el rechazo agudo y crónico de
tejido transplantado in vivo. El bloqueo independiente de
estas rutas utilizando una molécula de CTLA4 soluble o anticuerpos
que reconocen y se unen a gp39 no consiguió prolongar siquiera
mínimamente la supervivencia de tejido transplantado dérmico
primario.
La invención de la presente memoria implica el
descubrimiento de que el bloqueo simultáneo de las señales CD28 y
CD40 potenciaba la supervivencia a largo plazo de injertos dérmicos
totalmente alogénicos así como xenogénicos. La prolongación de la
supervivencia del aloinjerto dérmico se eliminó por la ciclosporina
A (CyA), sugiriendo que es un proceso activo que requiere la
señalización intacta mediante el complejo TcR/CD3 y/o otras rutas
sensibles a CyA. Además, CTLA4Ig/MR1 potenció la aceptación a largo
plazo de tejido de injerto cardiaco vascularizado primariamente, e
inhibió el desarrollo de rechazo vascular crónico.
El efecto demostrado en los dos modelos de
transplante en la presente memoria indica que CD28 y CD40
proporcionan rutas de señalización interrelacionadas, aunque
independientes, necesarias para la generación de respuestas de
células T eficaces. Este descubrimiento proporciona procedimientos
que son estrategias nuevas y más eficaces para manipular las
respuestas inmunes, incluyendo la supresión del rechazo de
injerto.
La presente invención se refiere a inhibir el
rechazo de un trasplante vascularizado primariamente. Esto comprende
prevenir que una molécula endógena (por ejemplo un antígeno) en una
célula seleccionada del grupo constituido por gp39 y CD40 se una a
su ligando endógeno y prevenir que una molécula endógena en una
célula seleccionada del grupo constituido por CTLA4, CD28 y B7 se
una a su ligando endógeno. La prevención de que dichas moléculas se
unan a sus ligandos bloquea así dos rutas de señales independientes,
e inhibe la respuesta inmune responsable de dicho rechazo.
Además, la invención se refiere a inhibir una
respuesta inmune implicada con dicho rechazo que comprende poner en
contacto una célula positiva para B7 con un primer ligando soluble
que reconoce y se une al antígeno B7, y poner en contacto una
célula positiva para gp39 con un segundo ligando soluble que
reconoce y se une al antígeno gp39. La unión de la célula positiva
para B7 con el primer ligando soluble bloquea la reacción del
antígeno B7 con CTLA4 o CD28 endógenas. Además, la unión del
antígeno gp39 al segundo ligando bloquea la reacción del antígeno
gp39 con la CD40 endógena. Este bloqueo de ambas rutas gp39 y B7
inhibe el rechazo de trasplante.
El descubrimiento de la solicitante incluye un
procedimiento para inhibir el rechazo de trasplante mediado por las
rutas gp39 y B7 en un sujeto. Este procedimiento comprende la
administración al sujeto de un primer ligando soluble que reconoce
y se une al antígeno B7 y un segundo ligando soluble que reconoce y
se une al antígeno gp39.
La unión de tanto el primer como el segundo
ligandos solubles a sus receptores inhibe el rechazo de trasplante
mediado por las rutas gp39 y B7 al prevenir que una molécula
endógena en una célula seleccionada del grupo constituido por
antígenos gp39 y CD40 se una a su ligando endógeno, y al prevenir
que una molécula endógena en una célula seleccionada del grupo
constituido por CTLA4, CD28 o B7 se una a su ligando.
La presente invención se refiere a inhibir el
rechazo de transplante vascularizado primariamente en un sujeto.
Esto comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una
combinación de un primer ligando soluble que reconoce y se une al
antígeno B7 en células positivas para B7, y un segundo ligando
soluble que reconoce y se une al antígeno gp39 en células positivas
para gp39.
La unión de células positivas para B7 con el
primer ligando soluble y células positivas para gp39 con el segundo
ligando soluble desestabiliza las interacciones de las células
positivas para CTLA4, CD28 y gp39 con las células positivas para B7
y células positivas para gp39 de modo que se inhibe el rechazo de
dicho transplante.
La presente invención se refiere a inhibir el
rechazo de un trasplante vascularizado primariamente que
comprende:
- a)
- prevenir que un antígeno endógeno en una célula seleccionada del grupo constituido por gp39 y CD40 se una a su ligando endógeno; y
- b)
- prevenir que un antígeno endógeno en una célula seleccionada del grupo constituido por CTLA4, CD38 y B7 se una a su ligando endógeno,
bloqueando la prevención de dichos antígenos de
unirse a su ligando dos señales celulares independientes, e
inhibiendo el rechazo de trasplante.
La figura 1 es un gráfico de barras que muestra
que el bloqueo simultáneo de las señales CD28 y CD40 anula las
respuestas aloinmunes in vivo del nódulo linfático
poplíteo.
La figura 2A es un gráfico de líneas que muestra
que el tratamiento con CTLA4Ig/MR1 prolonga la supervivencia de
aloinjertos cardiacos en comparación con CTLA4Ig sola o MR1
solo.
La figura 2B es una fotografía de una sección
histológica que muestra un aloinjerto cardiaco tratado con CTLA4Ig
el día 62 con una extensa infiltración linfocítica, fibrosis
intersticial y grave engrosamiento de la capa íntima arterial
coronaria y fibrosis, consistente con rechazo crónico (panel
izquierdo 100 aumentos, panel derecho 400 aumentos).
La figura 2C es una fotografía de una sección
histológica que muestra un aloinjerto cardiaco tratado con MR1 el
día 62 con menos infiltración linfocítica y fibrosis intersticial,
pero con grave vasculopatía coronaria característica del rechazo
crónico (panel izquierdo a 100 aumentos, panel derecho a 400
aumentos).
La figura 2D es una fotografía de una sección
histológica que muestra un aloinjerto cardiaco tratado con
CTLA4IgMR1 el día 58 exento de infiltración linfocítica, fibrosis y
lesiones de la capa íntima arterial coronaria (panel izquierdo a 100
aumentos, panel derecho a 400 aumentos).
La figura 2E es una fotografía de una sección
histológica que muestra corazones de BALB/c normales no
transplantados (panel izquierdo 100 aumentos, panel derecho 400
aumentos).
La figura 3A es una fotografía de tiras de gel
teñido con bromuro de etidio que muestra la expresión intrainjerto
de transcriptos mediadores inmunes utilizando RT-PCR
en aloinjertos cardiacos no tratados, tratados con MR1, tratados con
CTLA4Ig y tratados con MR1/CTLA4Ig.
La figura 3B es una serie de gráficas de barras
que muestran las intensidades medias de banda del producto de PCR
\pm la desviación estándar.
La figura 4A es una gráfica de líneas que
muestra los datos de ratones tratados con MR1 solo, CTLA4Ig sola y
con una combinación de MR1 y CTLA4Ig.
La figura 4B es una gráfica de líneas que
muestra los datos de ratones tratados con CyA, CyA y CTLA4Ig, y CyA
y MR1.
La figura 4C es una gráfica de líneas que
muestra los efectos del tratamiento perioperatorio con YTS191 y MR1
solos, MR1 y CTLA4Ig e YTS191 y CTLA4Ig sobre aloinjertos dérmicos
primarios.
La figura 4D es una fotografía que muestra la
apariencia sana de un injerto dérmico de BALB/c en un receptor
tratado con CTLA4Ig/MR1.
La figura 4E es una fotografía que muestra un
aloinjerto de control que experimenta rechazo.
La figura 4F es una fotografía de una sección
histológica de un injerto dérmico que presenta la apariencia sana de
un injerto aceptado a los 100 días después del transplante,
mostrando folículos pilosos epidérmicos y estructuras anexas bien
conservadas.
La figura 4G es una fotografía que muestra un
injerto dérmico BALB/c en un receptor no tratado 8 días después del
transplante. El injerto muestra una extensa infiltración
linfocítica.
La figura 5A es una serie de gráficas de barras
que muestran los efectos in vitro de utilizar MR1 solo,
CTLA4Ig sola y una combinación de MR1/CTLA4Ig en tres diferentes
poblaciones celulares.
La figura 5B es una serie de gráficos de barras
que muestran los efectos in vivo de utilizar MR1 solo,
CTLA4Ig sola y una combinación de MR1/CTLA4Ig.
La figura 6A es una gráfica de barras que
muestra el peso del nódulo linfático poplíteo inmunizado respecto
del nódulo contralateral en ratones C3H en respuesta a la
inmunización en almohadilla de la pata con esplenocitos de ratas
(Sprague-Dawley) irradiadas (2000 RADS). Nódulo
inmunizado con IgG humana (punteado), CTLA-4Ig
(rayado normal), MR1 (blanco), CTLA-4Ig/MR1 (negro)
y normal no inmunizado (rayado inverso).
La figura 6B es una gráfica de barras que
muestra la proliferación in vitro de células de nódulo
linfático después de recoger la linfa poplítea 5 días después de la
inmunización. Nódulo inmunizado con IgG humana (punteado),
CTLA-4Ig (rayado normal), MR1 (blanco),
CTLA-4Ig/MR1 (negro) y normal no inmunizado (rayado
inverso).
La figura 6C es una gráfica de barras que
muestra que el bloqueo simultáneo de las rutas CD40 y CD28 inhibe
notablemente la producción de citoquina IL-2. Nódulo
inmunizado con IgG humana (punteado), CTLA-4Ig
(rayado normal), MR1 (blanco), CTLA-4Ig/MR1 (negro)
y normal no inmunizado (rayado inverso).
La figura 6D es una gráfica de barras que
muestra que el bloque simultáneo de las rutas CD40 y CD28 inhibe
notablemente la producción de citoquina INFg. Nódulo inmunizado con
IgG humana (punteado), CTLA-4Ig (rayado normal), MR1
(blanco), CTLA-4Ig/MR1 (negro) y normal no
inmunizado (rayado inverso).
La figura 7A es una gráfica de líneas que
muestra que los receptores C3H tratados con CTLA4-Ig
(500 \mug) los días 0, 2, 4 y 6 combinado con MR1 (500 \mug) los
días 0, 2, 4 y 6 tenían una supervivencia prolongada de aloinjertos
cardiacos de ratas Sprague-Dawley.
La figura 7B es una fotografía de un xenoinjerto
cardiaco no tratado el día 6, mostrando la destrucción extendida del
tejido (400 aumentos).
La figura 7C es una fotografía de un xenoinjerto
cardiaco tratado con CTLA4-Ig el día 20, mostrando
infiltración linfocítica, destrucción de miocitos y vasculopatía
coronaria (400 aumentos).
La figura 7D es una fotografía de un xenoinjerto
cardiaco tratado con MR1 el día 20, mostrando infiltración
linfocítica, destrucción de miocitos y vasculopatía coronaria (400
aumentos).
La figura 7E es una fotografía de un corazón de
rata normal no transplantado Sprague-Dawley (400
aumentos).
La figura 7F es una fotografía de un xenoinjerto
cardiaco tratado con CTLA4-Ig/MR1 el día 20,
esencialmente exento de infiltración linfocítica y fibrosis (400
aumentos).
La figura 7G es una fotografía de un xenoinjerto
cardiaco tratado con CTLA4-Ig/MR1 el día 122,
demostrando una excelente conservación tanto de los miocitos como de
las estructuras vasculares (400 aumentos).
La figura 8A es una serie de gráficas de líneas
que muestran la prolongación de la supervivencia de xenoinjertos
dérmicos de rata Sprague-Dawley en ratones C3H
tratados con MR1 y CTLA4-Ig administrados
conjuntamente en el periodo perioperatorio, en comparación con
receptores de xenoinjertos tratados con MR1 solo o
CTLA4-Ig sola y controles no tratados.
La figura 8B es una serie de gráficas de líneas
que no muestran ningún cambio significativo en la supervivencia de
xenoinjertos después de tratamiento crónico (empezando después del
régimen estándar de 4 dosis) con combinación de
CTLA4-Ig/MR1 o MR1.
La figura 8C es una fotografía que muestra la
apariencia sana de un injerto dérmico de rata
Sprague-Dawley en un receptor C3H tratado con
CTLA4-Ig/MR1 a los 100 días después del
transplante.
La figura 8D es una fotografía que muestra un
xenoinjerto dérmico de control que experimenta rechazo a los 10 días
después del transplante.
La figura 8E es una fotografía de una sección
histológica teñida con hematoxilina-eosina de un
injerto aceptado tratado con CTLA4-Ig/MR1 a los 50
días después del transplante, mostrando una arquitectura histológica
bien conservada (400 aumentos).
La figura 8F es una fotografía de una sección
histológica teñida con hematoxilina-eosina de un
injerto dérmico de rata Sprague-Dawley en un
receptor C3H no tratado 8 días después del transplante, mostrando
una extensa infiltración linfocítica (400 aumentos).
La figura 9A es una gráfica de dispersión que
muestra la anulacióncción de la respuesta de xenoanticuerpo
provocada en suero recogida en receptores C3H 55 días después de
xenoinjertos dérmicos de donantes Sprague-Dawley.
Los ratones de control que no habían recibido tratamiento tenían
xenoanticuerpo de Ig fácilmente detectable. CTLA4-Ig
o MR1 solos bloqueaban parcialmente la repuesta de xenoanticuerpo.
La combinación de CTLA4-Ig y MR1 anulaba
esencialmente la respuesta de xenoanticuerpo provocada. Cada punto
de datos representa el análisis de un receptor individual.
La figura 9B es una gráfica de dispersión que
muestra la anulación de la respuesta de xenoanticuerpo provocada en
suero recogida de receptores C3H 20 días después de xenoinjertos
cardiacos de donantes Sprague-Dawley.
Todos los términos científicos y técnicos
utilizados en esta solicitud tienen los significados utilizados
habitualmente en la técnica a menos que se especifique otra cosa.
Como se utilizan en esta solicitud, las siguientes palabras o frases
tienen los significados especificados.
Como se utiliza en la presente memoria,
"anticuerpos monoclonales dirigidos contra gp39" o
"anti-gp39" incluye MR1.
Anti-gp39 es conocido también en la bibliografía
como un ligando anti-CD40. Los ejemplos de MR1
incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales dirigidos
contra gp39 de ratón; estando incluidos los anticuerpos dirigidos
contra gp39 de otras especies tales como mono, oveja o humano.
Además, "anticuerpos monoclonales dirigidos contra gp39" o
"anti-gp39" incluye cualquier molécula de
anticuerpo, fragmento del mismo o proteína de unión recombinante que
reconozca y se una a gp39.
Como se utiliza en la presente memoria,
"administrar" significa la administración oral, administración
como supositorio, contacto tópico, administración intravenosa,
intraperitoneal, intramuscular o subcutánea, o el implante de un
dispositivo de liberación lenta tal como una minibomba osmótica al
sujeto.
Como se utiliza en la presente memoria,
"vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier
material que cuando se combina con el anticuerpo retiene la
inmunogenicidad del anticuerpo y no es reactivo con el sistema
inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación,
cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar tales como
solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como
emulsión de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes.
Otros vehículos pueden incluir también soluciones estériles y
comprimidos, incluyendo comprimidos recubiertos y cápsulas.
Típicamente, dichos vehículos contienen
excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de
arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, estearato de
calcio o magnesio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas,
glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos pueden
incluir también aditivos aromatizantes y colorantes u otros
ingredientes. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se
formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos.
Como se utiliza en la presente memoria,
"tejido transplantado" incluye autoinjertos, isoinjertos,
aloinjertos y xenoinjertos. Los ejemplos de tejido transplantado
incluyen, pero sin limitación, transplantes de órganos sólidos tales
como corazón, hígado o riñón.
Como se utiliza en la presente memoria,
"B7" incluye B7-1 (también llamado CD80),
B7-2 (también llamado CD86), B7-3 y
la familia de B7, por ejemplo una combinación de
B7-1, B7-2 y/o
B7-3.
Para que la invención descrita en la presente
memoria pueda comprenderse con más detalle, se incluye la siguiente
descripción.
El descubrimiento de la presente memoria se
refiere a un procedimiento para inhibir el rechazo de un trasplante
vascularizado primariamente. En una realización, el procedimiento
comprende prevenir que una molécula endógena en una célula
seleccionada del grupo constituido por gp39 y CD40 se una a su
ligando endógeno. El procedimiento proporciona la prevención de que
una molécula endógena en una célula seleccionada del grupo
constituido por CTLA4, CD28 y B7 se una a su ligando endógeno. La
prevención de que estas moléculas se unan a sus ligandos endógenos
bloquea dos rutas de señales independientes. El bloqueo de estas dos
rutas de señales independientes inhibe las respuestas inmunes que
causan dicho rechazo.
En un ejemplo de la invención, se previene que
el antígeno gp39 endógeno se una a su ligando endógeno. Este
ejemplo comprende la etapa de poner en contacto una célula positiva
para gp39 con un ligando soluble que reconoce y se une al antígeno
gp39 (por ejemplo utilizando ligandos solubles tales como MR1 u
otros anticuerpos que se unen a gp39, y moléculas CD40
solubles).
Este ejemplo comprende la etapa adicional de
prevenir que el antígeno endógeno CTLA4 se una a su ligando
endógeno. Esto comprende la etapa de poner en contacto una célula
positiva para B7 con un ligando soluble que reconoce y se une al
antígeno B7 tal como CTLA4Ig (patente de EE.UU. nº 5.434.131,
concedida el 18 de julio de 1995). el anticuerpo monoclonal
BB-1 u otros anticuerpos dirigidos contra B7.
La unión de la célula positiva para gp39 a su
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno gp39 endógeno con
CD40 endógeno. La unión de la célula positiva para B7 con su ligando
soluble bloquea la reacción del antígeno B7 endógeno con CTLA4 o
CD28 endógenas. Este bloqueo combinado inhibe el rechazo de
trasplante.
En otro ejemplo, se previene que el antígeno
CD40 se una a su ligando endógeno. Este ejemplo comprende la etapa
de poner en contacto una célula positiva para CD40 con un ligando
soluble que reconoce y se une al antígeno CD40. Los ligandos
adecuados incluyen anticuerpos dirigidos contra CD40 o gp39 soluble
(sgp39).
Este ejemplo comprende la etapa adicional de
prevenir que el antígeno CTLA4 endógeno se una a su ligando
endógeno. Esta etapa comprende poner en contacto una célula
positiva para B7 con un ligando soluble que reconoce y se une al
antígeno B7. Los ejemplos de este ligando soluble incluyen CTLA4Ig,
moléculas de CD28 soluble y anticuerpos dirigidos contra B7.
La unión de la célula positiva para
CD-40 a su ligando soluble bloquea la reacción del
antígeno CD40 endógeno con gp39 endógeno. La unión de la célula
positiva para B7 a su ligando soluble bloquea la reacción del
antígeno B7 con CTLA4 endógena. El bloqueo combinado inhibe el
rechazo de trasplante.
En otro ejemplo más, se previene que el antígeno
gp39 endógeno se una a su ligando endógeno como se ha descrito
anteriormente. El ejemplo comprende la etapa adicional de prevenir
que el antígeno CD28 endógeno se una con su ligando endógeno. Esta
etapa comprende poner en contacto una célula positiva para B7 con un
ligando soluble que reconoce y se une al antígeno B7. Los ejemplos
incluyen CTLA4Ig, moléculas de CD28 soluble y anticuerpos dirigidos
contra B7 tales como BB-1.
La unión de la célula positiva para gp39 a su
ligando insoluble bloquea la reacción del antígeno gp39 con CD40
endógena. La unión de la célula positiva para B7 a su ligando
soluble bloquea la reacción del antígeno B7 con CD28 endógena. Este
bloqueo combinado inhibe el rechazo de trasplante.
En otro ejemplo, se previene que el antígeno
CD40 endógeno se una a su ligando endógeno como se ha descrito
anteriormente. El ejemplo proporciona la etapa adicional de prevenir
que el antígeno B7 endógeno se una a su ligando endógeno. Esto
comprende poner en contacto una célula positiva para CD28 con un
ligando soluble que reconoce y se une al antígeno CD28. Los
ejemplos de dichos ligandos solubles incluyen moléculas de B7
soluble y anticuerpos dirigidos contra CD28.
La unión de la célula positiva para CD40 al
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno CD40 con gp39
endógeno. La unión de la célula positiva para CD28 al ligando
soluble bloquea la reacción del antígeno B7 con CD28 endógena. Este
bloqueo combinado inhibe el rechazo de trasplante.
En otro ejemplo más, se previene que el antígeno
CD40 endógeno se una a su ligando como se ha descrito anteriormente.
Este ejemplo proporciona la etapa adicional de prevenir que el
antígeno B7 endógeno se una a su ligando endógeno, que comprende
poner en contacto una célula positiva para CTLA4 como un ligando
soluble que reconoce y se une al antígeno CTLA4. Los ejemplos de
dichos ligandos solubles incluyen moléculas de B7 soluble y
anticuerpos dirigidos contra CTLA4.
La unión de la célula positiva para CD40 al
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno CD40 con gp39
endógeno. Además, la unión de la célula positiva para CTLA4 o CD28
al ligando soluble bloquea la reacción del antígeno CTLA4 con B7
endógeno. Este bloqueo combinado inhibe el rechazo de
trasplante.
En un ejemplo adicional, se previene que el
antígeno CD40 endógeno se una a su ligando como se ha descrito
anteriormente. Este ejemplo proporciona la etapa adicional de
prevenir que el antígeno B7 endógeno se una a su ligando endógeno,
que comprende poner en contacto una célula positiva para CD28 con un
ligando soluble que reconoce y se une al antígeno CD28. Los
ejemplos de dichos ligandos solubles incluyen moléculas de B7
soluble y anticuerpos dirigidos contra CD28.
La unión de la célula positiva para CD40 al
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno gp30 con CD40
endógeno. Además, la unión de la célula positiva para CD28 con el
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno CD28 con B7
endógeno. Este bloqueo combinado inhibe el rechazo de
trasplante.
Además, en otro ejemplo, se previene que el
antígeno CD40 endógeno se una a su ligando como se ha descrito
anteriormente. Este ejemplo proporciona la etapa adicional de
prevenir que el antígeno B7 endógeno se una a su ligando endógeno,
que comprende poner en contacto una célula positiva para CTLA4 con
un ligando soluble que reconoce y se une al antígeno CTLA4.
La unión de la célula positiva para CD40 al
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno gp39 con CD40
endógeno. Además, la unión de la célula positiva para CTLA4 con el
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno CTLA4 con B7
endógeno. Este bloqueo combinado inhibe el rechazo de
trasplante.
Además, la presente invención proporciona otra
realización para inhibir el rechazo de trasplante. Esta realización
comprende poner en contacto una célula positiva para B7 con un
primer ligando soluble que reconoce y se une al antígeno B7, y
poner en contacto una célula positiva para gp39 con un segundo
ligando soluble que reconoce y se une al antígeno gp39.
La unión de la célula positiva para B7 al primer
ligando soluble bloquea la reacción del antígeno B7 con CTLA4 o CD28
endógenas. Además, la unión del antígeno gp39 al segundo ligando
soluble bloquea la reacción del antígeno gp39 con CD40 endógeno. La
combinación de este bloqueo inhibe el rechazo de trasplante.
\newpage
Además, la invención proporciona la inhibición
del rechazo de un trasplante vascularizado primariamente mediado
por las rutas CTLA4/CD28/B7 y gp39/CD40 en un sujeto. Según la
práctica de la invención, el sujeto puede ser un sujeto animal tal
como un humano, un perro, un gato, una oveja, un caballo, un ratón,
un cerdo o una vaca.
El procedimiento comprende administrar al sujeto
un primer ligando soluble que reconoce y se une al antígeno B7 (por
ejemplo moléculas CTLA4 o CD28 solubles) y un segundo ligando
soluble que reconoce y se une al antígeno gp39 (por ejemplo
anticuerpos monoclonales dirigidos contra gp39 (MR1) o moléculas
CD40 solubles). La unión del primer y segundo ligandos a su
receptor inhibe el rechazo de trasplante mediado por las
interacciones de células positivas para de CTLA4, CD28 y gp39 con
células positivas para B7 y CD40.
La invención proporciona la inhibición del
rechazo de transplantes en un sujeto en el que el trasplante es un
trasplante vascularizado primariamente. Este procedimiento comprende
administrar al sujeto una cantidad eficaz de una combinación de un
primer ligando soluble que reconoce y se une al antígeno B7 en
células positivas para B7, y un segundo ligando soluble que
reconoce y se une al antígeno gp39 en células positivas para gp39.
La unión de células positivas para B7 con el primer ligando soluble
y de células positivas para gp39 con el segundo ligando soluble
desestabiliza las interacciones de células positivas para CTLA4,
CD28 y gp39 endógenos con células positivas para B7 y células
positivas para gp39 de modo que se inhibe el rechazo de
transplante.
Según la práctica de la invención, el primer
ligando soluble puede ser una molécula de unión recombinante con al
menos una porción del dominio extracelular de CTLA4. Según la
práctica de la invención, la porción extracelular de CTLA4 se une a
una secuencia proteica no CTLA4. La secuencia proteica no CTLA4
puede ser al menos una porción de una molécula de
inmunoglobulina.
En un ejemplo específico de la invención, el
ligando es una proteína de fusión CTLA4Ig, por ejemplo la proteína
de fusión CTLA4Ig depositada en la Colección de Cultivos Tipo
Americanos (ATCC) en Rockville, Maryland, según las cláusulas del
Tratado de Budapest el 31 de mayo de 1991, y con un número de acceso
ATCC asignado: 68629. Como alternativa, el ligando puede ser un
híbrido de proteína de fusión CD28Ig/CTLA4Ig (patente de Estados
Unidos nº 5.434.131, concedida el 18 de julio de 1995).
En una realización alternativa, el primer
ligando soluble puede ser un anticuerpo monoclonal reactivo con el
antígeno B7, por ejemplo el anticuerpo puede ser un anticuerpo
monoclonal anti-BB1 (Clark et al., Human
Immunol., 16:100-113 (1986); Yokochi et al.,
J. Immunol. 128:823 (1981)); Freeman et al. (J. Immunol.
143(8): 2714-2722 (1989); y Freedman et
al., J. Immunol. 139:3260 (1987)).
En otra realización, el ligando puede ser un
híbrido de proteína de fusión CD28Ig/CTLA4Ig con una primera
secuencia de aminoácidos correspondiente a una porción del dominio
extracelular del receptor CD28 fusionada con una segunda secuencia
de aminoácidos correspondiente a una porción del dominio
extracelular del receptor CTLA4 y una tercera secuencia de
aminoácidos correspondiente a la bisagra, las regiones CH2 y CH3 de
la inmunoglobulina Cg1
En una realización de la invención, el segundo
ligando para el antígeno gp39 puede ser un anticuerpo monoclonal
reactivo con el antígeno gp39, por ejemplo el anticuerpo monoclonal
antimurina MR1 o el anticuerpo anti-gp39 humano
(patente de Estados Unidos nº 5.474.771, concedida el 12 de
diciembre de 1995).
En otra realización de la invención, el
procedimiento comprende administrar al sujeto una proteína de fusión
soluble, comprendiendo la proteína de fusión soluble un primer
dominio de unión y un segundo dominio de unión.
En un ejemplo, el primer dominio de unión es un
ligando que reconoce y se une al antígeno gp39. Los ejemplos
incluyen CD40 y anticuerpos monoclonales dirigidos contra gp39. En
otro ejemplo, el primer dominio de unión es un ligando que reconoce
y se une al antígeno CD40. Los ejemplos incluyen gp39 y anticuerpos
monoclonales dirigidos contra CD40.
En un ejemplo, el segundo dominio de unión es un
ligando que reconoce y se une a CTLA4. Los ejemplos incluyen B7 y
anticuerpos monoclonales dirigidos contra CTLA4. En otro ejemplo, el
segundo dominio de unión es un ligando que reconoce y se une al
antígeno CD28. Los ejemplos incluyen B7 y anticuerpos monoclonales
dirigidos contra CD28. En otro ejemplo, el segundo dominio de unión
es un ligando que reconoce y se une al antígeno B7. Los ejemplos
incluyen CTLA4, CD28 y anticuerpos monoclonales dirigidos contra
B7.
Los ligandos solubles pueden administrarse
durante el transplante, antes del transplante o después del
transplante. Los ligandos solubles pueden administrarse por vía
oral, vía transdérmica, vía intravenosa, vía intramuscular,
intraperitoneal o por administración subcutánea.
El modo de administración y el régimen de
dosificación más eficaces para las moléculas de la presente
invención depende de la localización del tejido que se esté
tratando, de la gravedad y del desarrollo del trastorno médico, de
la salud del sujeto, de la respuesta al tratamiento y del juicio del
médico a cargo. Como consecuencia, las dosificaciones de las
moléculas deben titularse para el sujeto individual.
\newpage
A modo de ejemplo, se describe la interrelación
de dosificaciones para animales de diversos tamaños y especies y
humanos basada en los mg/m^{2} de área superficial en Freireich,
E.J. et al., Cancer Chemother., Rep. 50(4):
219-244 (1966). Pueden hacerse ajustes en el régimen
de dosificación para optimizar la supresión de la respuesta inmune
resultado del rechazo de injerto, por ejemplo las dosis pueden
dividirse y administrarse diariamente, o la dosis puede reducirse
proporcionalmente dependiendo de la situación (por ejemplo pueden
administrarse diariamente varias dosis divididas o reducirse
proporcionalmente dependiendo de la situación terapéutica
específica).
Resultará evidente que la dosis de la
composición de la invención necesaria para alcanzar un resultado
clínico apropiado puede reducirse adicionalmente por una
optimización del programa.
La presente invención proporciona también
composiciones farmacéuticas útiles para inhibir el rechazo de
transplantes. En una realización, estas composiciones comprenden
una cantidad eficaz de una combinación de (a) ligandos solubles que
reconocen y se unen a cualquiera de los antígenos CTLA4, CD28 y B7,
junto con (b) ligandos solubles que reconocen y se unen a
cualquiera de los antígenos gp39 y CD40, y un vehículo aceptable. En
otra realización, estas composiciones comprenden una cantidad
eficaz de una proteína de fusión soluble que comprende un primer
dominio de unión y un segundo dominio de unión, siendo el primer
dominio de unión un ligando que reconoce y se une a cualquiera de
los antígenos gp39 o CD40 y siendo el segundo dominio de unión un
ligando que reconoce y se une a cualquiera de los antígenos CTLA4,
CD28 y B7.
Las composiciones farmacéuticas útiles para
inhibir el rechazo de tarsplante incluyen composiciones
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de un ligando soluble que reconoce y se une a un antígeno B7
y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de un ligando soluble que reconoce y se une a un antígeno
CD28 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de un ligando soluble que reconoce y se une a un antígeno
CTLA4 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de un ligando soluble que reconoce y se une a un antígeno
gp39 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de una combinación de un ligando soluble que reconoce y se
une a un antígeno B7, un ligando soluble que reconoce y se une a un
antígeno gp39 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de una combinación de un ligando soluble que reconoce y se
une a un antígeno CD28, un ligando soluble que reconoce y se une a
un antígeno CD40 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de una combinación de un ligando soluble que reconoce y se
une a un antígeno CTLA4, un ligando soluble que reconoce y se une a
un antígeno CD40 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de una combinación de un ligando soluble que reconoce y se
une a un antígeno gp39, un ligando soluble que reconoce y se une a
un antígeno CD28 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de una combinación de un ligando soluble que reconoce y se
une a un antígeno gp39, un liganfo soluble que reconoce y se une a
un antígeno CTLA4 y un vehículo aceptable;
que comprenden una cantidad farmacéuticamente
eficaz de una combinación de un ligando soluble que reconoce y se
une a un antígeno B7, un ligando soluble que reconoce y se une a un
antígeno CD40 y un vehículo aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
A pesar de los muchos avances en la
inmunosupresión clínica, el rechazo vascular crónico continúa siendo
la fuente principal de fallos de transplante para la que sigue sin
haber una terapia eficaz. Los experimentos descritos en la presente
memoria muestran que el bloqueo de las rutas CD28/CTLA4/B7 y
gp39/CD40 inhibe el desarrollo de vasculopatía crónica de
transplante en tejidos transplantados. Estos datos muestran que las
respuestas inmunes a los injertos alogénicos y xenogénicos pueden
inhibirse sin citoablación. Cuando se compara con el uso de
moléculas de CTLA4 soluble solas, el uso de moléculas de CTLA4
soluble junto con un ligando soluble que reconoce y se une a gp39
proporciona una inmunosupresión drásticamente prolongada.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar la presente invención, y para ayudar al conocedor de la
técnica a preparar y utilizar la misma. Los ejemplos no se pretende
en modo alguno que limiten de ninguna manera la invención.
\newpage
Ejemplo de referencia
1
Los datos en este ejemplo muestran que el
bloqueo simultáneo de las señales CD28 y CD40 anula las respuestas
aloinmunes in vivo del nódulo linfático poplíteo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron por vía subcutánea ratones
C3H/HeJ (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) con 2 x 10^{6}
esplenocitos de BALC/c en 50 ml de solución salina normal estéril
en la almohadilla de la pata izquierda y 50 ml de solución salina
normal estéril en la almohadilla de la pata derecha el día 0, y
después se trataron por vía intraperitoneal con MR1 (250 mg),
CTLA4Ig (250 mg) o ambos reactivos los días 0, 2 y 4.
Se sacrificaron los ratones el día 5, se
recogieron los nódulos linfáticos poplíteos utilizando un
microscopio de operación (de 20 aumentos), y se determinó el peso
fresco de cada nódulo con una precisión de 0,1 mg con una balanza
analítica (modelo A-160, Denver Instrument Company,
Arvada, CO).
\vskip1.000000\baselineskip
Cinco días después de la inmunización subcutánea
con esplenocitos alogénicos, los nódulos linfáticos poplíteos de
drenaje del lado de la aplicación del antígeno experimentaron un
aumento de >5 veces en peso respecto del nódulo contralateral en
ratones de control no tratados. El tratamiento con CTLA4Ig o MR1 dio
como resultado una inhibición del 50-60% de la
respuesta, mientras que la administración concomitante de CTLA4Ig y
MR1 anuló la expansión del nódulo linfático en respuesta a la
aplicación del antígeno. Los resultados representan la media \pm
desviación estándar para 3 ratones individuales de cada grupo. Se
obtuvieron resultados similares en tres experimentos
independientes.
Los ratones de control demostraron un aumento de
4-6 veces en el peso del nódulo de drenaje de la
pata inmunizada respecto del nódulo de drenaje de la pata
contralateral inyectada con solución salina estéril (figura 1).
Este aumento del peso estuvo acompañado por una drástica expansión
de las regiones paracortical (células T) y cortical (células B)
ricas en linfocitos. Cuando se administraron por separado, CTLA4Ig y
MR1 produjeron cada uno la inhibición parcial de esta respuesta
(56% y 57% de inhibición, respectivamente). La combinación de
CTLA4Ig/MR1 anuló la expansión del nódulo linfático (98% de
inhibición, figura 1) y previno la expansión de los folículos
paracortical y linfoide.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra la prolongación de la
supervivencia de aloinjerto cardiaco y la inhibición de la
vasculopatía asociada con el rechazo crónico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transplantaron ratones C3H/HeJ macho con
aloinjertos cardiacos de BALB/c vascularizados primariamente de
8-12 semanas de edad utilizando técnicas de
microcirugía (Corry, R.J., Winn, H.J. & Ruseell, P.S.
Transplantation 16, 343-350 (1973)).
Se definió el rechazo como la pérdida de
contracciones cardiacas palpables con la confirmación de laparotomía
por visualización directa. En momentos especificados después del
transplante, se extirparon los corazones transplantados, se fijaron
con formalina y se embebieron en parafina. Se tiñeron secciones de
tejido (5 mm) con Trichrome de Masson o
hematoxilina-eosina. Se revisó cada espécimen
histológico por un patólogo de transplantes cardiacos (KJW)
ignorante de la modalidad de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 2A, los receptores C3H/HeJ se
trataron con CTLA4Ig (200 mg/dosis) los días 0, 2, 4 y 6 combinado
con MR1 (250 mg/dosis) los días 0, 2 y 4, y tuvieron una
supervivencia a largo plazo de aloinjertos cardiacos de BALB/c
(tiempo de supervivencia mediano (MST) > 70 días, n= 7). Los
grupos de control incluyeron receptores tratados con: CTLA4Ig sola
(MST= 50 días, n= 12), MR1 solo (MST= 70 días, n= 12) y sin
tratamiento (MST= 12 días, n= 7).
Se controlaron todos los receptores durante 70
días, con la excepción de tres ratones con transplantes
supervivientes en cada grupo experimental que se sacrificaron para
análisis histológico a los 58-63 días después del
transplante.
En la figura 2B, el aloinjerto cardiaco tratado
con CTLA4Ig muestra el día 62 una extensa infiltración linfocítica,
fibrosis intersticial y grave engrosamiento de la capa íntima
arterial coronaria y fibrosis, consistente con rechazo crónico.
En la figura 2C, el aloinjerto cardiaco tratado
con MR1 demuestra el día 62 menos infiltración linfocítica y
fibrosis intersticial, pero una grave vasculopatía coronaria
característica del rechazo crónico.
En la figura 2D, los aloinjertos cardiacos
tratados con CTLA4Ig/MR1 estaban el día 58, en fuerte contraste,
notablemente exentos de infiltración linfocítica, fibrosis y, lo más
significativamente, lesiones de la capa íntima arterial coronaria.
El parénquima y los vasos sanguíneos de estos injertos eran
virtualmente indistinguibles de los corazones de BALB/c normales no
transplantados.
En la figura 2E, se muestran corazones BALB/c
normales no transplantados.
Se obtuvieron resultados histológicos similares
de tres aloinjertos en cada grupo experimental. Los receptores
C3H/HeJ (H-2k) tratados con CTLA4Ig sola, MR1 solo o
CTLA4Ig/MR1 mostraron todos una prolongada supervivencia de
aloinjertos cardiacos de BALB/c (H-2d) en
comparación con los controles no tratados (figura 2A). Sin embargo,
cuando se examinaron histológicamente a los 58-62
días después del transplante, resultaron evidentes diferencias
notables.
Los aloinjertos de receptores tratados con
CTLA4Ig mostraron una extensa infiltración linfocítica, fibrosis
intersticial y grave engrosamiento de la capa íntima arterial
coronaria y fibrosis, consistente con rechazo crónico (figura 2B).
Aunque el aloinjerto tratado con MR1 demostró menos infiltración
linfocítica y fibrosis intersticial, estos injertos tenían también
una grave vasculopatía coronaria característica de rechazo crónico
(figura 2C).
En marcado contraste, el aloinjerto de
receptores tratados con CTLA4Ig/MR1 estaba notablemente exento de
infiltración linfocítica, fibrosis, y lo más significativamente,
lesiones de la capa íntima arterial coronaria (figura 2D). De
hecho, el parénquima y los vasos sanguíneos de estos injertos eran
virtualmente indistinguibles de los encontrados en corazones BALB/c
normales (figura 2E).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
2
Este ejemplo muestra el bloqueo de citoquina de
células T y de la expresión de transcriptos moleculares
coestimulantes.
\vskip1.000000\baselineskip
A los 8 días después del transplante, se
extirparon los injertos cardiacos y se preparó el ARN total de los
tejidos utilizando el reactivo TRIzol (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).
Se sintetizó el ADNc utilizando 5 mg de molde de ARN total con un
Superscript Preamplification System (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) en
un volumen final de 20 ml. Se llevaron a cabo reacciones de PCR. Se
visualizaron los productos de PCR en geles de agarosa al 1% teñida
con bromuro de etidio (BIO-RAD, Hercules, CA), y
agarosa NuSieve GTG al 2% (FMC Products, Rockland, ME). Se
almacenaron las imágenes del gel utilizando un UVP Gel Documentation
System 5000. Se cuantificó la intensidad de banda utilizando
software de análisis Gelreader (National Center for Supercomputing
Applications, Urbana, IL).
En la figura 3A, se evaluó la expresión
intrainjerto de los transcriptos mediadores inmunes utilizando
RT-PCR en aloinjertos cardiacos no tratados,
tratados con MR1, tratados con CTLA4Ig y tratados con
MR1/CTLA4Ig.
Se analizaron tres aloinjertos de cada grupo de
tratamiento y el grupo de control a los 8 días después del
transplante. Se incluyeron tejido cardiaco normal (N) y un injerto
cardiaco singénico (S) a los 8 días después del transplante para
comparación.
En la figura 3B, se muestra la representación
gráfica de las intensidades medias \pm desviación estándar de la
banda de productos PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
No fueron detectables diferencias consistentes
en la expresión de los transcriptos de citoquina de células T para
IL-2, IL-4, IL-10 ni
IFNg, ni de los transcriptos moleculares coestimulantes
(B7-1 y B7-2) entre los aloinjertos
de control (figura 3A, no tratados) y los aloinjertos tratados con
MR1 (figura 3A), mientras que CTLA4Ig inhibió parcialmente la
expresión de los transcriptos de IL-4.
Los aloinjertos de receptores tratados con
CTLA4Ig/MR1 mostraron una fuerte reducción de la expresión tanto de
transcriptos de citoquina Th1 (IL-2 e IFNg) como de
citoquina Th2 (IL-4 e IL-10). Sin
embargo, los transcriptos moleculares coestimulantes intrainjerto
B7-1 y B7-2 se redujeron sólo un
poco en receptores tratados con CTLA4Ig/MR1.
Las reacciones de PCR que utilizaban molde
preparado sin transcriptasa inversa no proporcionaron productos,
siquiera para el gen GADPH sin intrón (figura 3A, GADPH, sin RT),
confirmando la ausencia de ADN genómico contaminante.
Los transcriptos moleculares coestimulantes
intrainjerto B7-1 y B7-2 se
redujeron sólo un poco en receptores tratados con CTLA4Ig/MR1
(figura 3), sugiriendo que factores independientes de CF28/B7 o
independientes de CD40/gp39 tales como GMSCF (Larsen C.P., et
al., J. Immunol. 152, 5208-5219 (1994)), pueden
ser reguladores importantes de la expresión de B7 intrainjerto.
Así, el bloqueo de la ruta CD40 mediado por MR1 no sólo inhibe los
auxiliares semejantes a células T para APC efectoras, sino que
potencia la capacidad de CTLA4Ig de inhibir la expresión de
transcriptos de activación de células T dentro de los aloinjertos.
Estos datos son consistentes con aquellos de los estudios in
vitro de los investigadores que indican que aunque MR1 solo
tiene sólo un pequeño efecto negativo sobre la proliferación
celular en reacciones de leucocitos mixtos alogénicos, potencia los
efectos inhibidores de concentraciones subóptimas de CTLA4Ig.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
3
Este ejemplo demuestra la prolongación de la
supervivencia de aloinjertos dérmicos de murina utilizando ratones
C3H/HeJ que recibieron aloinjertos dérmicos de espesor completo de
ratones BALB/c.
\vskip1.000000\baselineskip
Se injertaron segmentos de espesor completo de
piel de la cola o de la oreja de aproximadamente 1 cm^{2} en la
pared torácica lateral posterior de ratones receptores y se
aseguraron en su lugar con Bandaid® circunferencial. Se controlaron
después los injertos por inspección visual diaria. Se definió el
rechazo como la pérdida completa de tejido de injerto epidérmico
visible. Los protocolos de tratamiento para MR1 y CTLA4Ig eran como
se han detallado para los receptores de transplante cardiaco de la
figura 1. Se administró CyA (Sandoz, East Hanover, NJ) a una
concentración de 50 mg/ml a una velocidad de 0,5 ml/h
(aproximadamente 20 mg/kg/día) durante 14 días mediante una bomba
osmótica (Alzet modelo nº 2002, Alza, Palo Alto, CA), que se
implantó subcutáneamente en la región dorsal del receptor en el
momento del injerto dérmico, y se extirpó a los 21 días después del
transplante (Pereira G.M., Miller J.F. & Shevach E.M., J.
Immunol. 144, 2109-2116 (1990)). Después del
sacrificio, se extirpó el injerto dérmico, se fijó con formalina y
se embebió en parafina. Se tiñeron las secciones de tejido (5 mm)
con hematoxilina-eosina.
En la figura 4A, los receptores C3H/HeJ tratados
con MR1 solo (MST= 13 días, n= 5) o CTLA4Ig sola (MST= 12 días, n=
7) rechazaron injertos dérmicos de BALB/c de MHC totalmente dispar a
la misma velocidad que el grupo de control no tratado (MST= 13
días, n= 5). En contraposición, cuando se administraron MR1 y
CTLA4Ig conjuntamente en el periodo perioperatorio, los aloinjertos
disfrutaron de una supervivencia notablemente prolongada (MST >
50, n= 15).
En la figura 4B, los ratones tratados con CyA
sola (MST= 30 días, n= 4), CyA más CTLA4Ig (MST= 30 días, n= 5) o
CyA y MR1 (MST= 32 días, n= 4) mostraron todos una supervivencia del
injerto dérmico débilmente prolongada similar. Sorprendentemente,
el efecto saludable de CTLA4Ig/MR1 sobre la supervivencia del
injerto dérmico se anuló por la administración concomitante de
ciclosporina (MST= 34 días, n= 4).
En la figura 4C, los receptores C3H de injertos
dérmicos de BALB/C no se trataron (MST= 10 días, n= 3) o se
trataron con MR1 (MST= 13 días, n= 3), YTS191.1 (MST= 14 días, n=
6), YTS191.1 y MR1 (MST= 16 días, n= 6), YTS191.1 y CTLA4Ig (MST=
19 días, n= 5) o CTLA4Ig y MR1 (MST > 50 días, n= 22). Hasta
aquí, >53 ratones se han tratado con CTLA4Ig/MR1. De estos, 2
murieron los días 13 y 21. Todos los demás han permanecido sanos a
lo largo de los experimentos sin síntomas de pérdida de peso,
infección o malignidad.
La apariencia sana de un injerto dérmico de
BALB/c en un receptor C3H/HeJ tratado con CTLA4Ig/MR1 a los 50 días
después del transplante (figura 4D), contrasta vivamente con un
aloinjerto de control que experimenta rechazo (figura 4E). En las
secciones teñidas con hematoxilina-eosina, el
injerto aceptado demostró a los 100 días después del transplante
una epidermis, folículos pilosos y estructuras anexas bien
conservadas (figura 4F), lo que está en contraposición con un
injerto dérmico de BALB/c en un receptor C3H/HeJ no tratado 8 días
después del transplante, que muestra una extensa infiltración
linfocítica (figura 4G).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron los efectos de CTLA4Ig y MR1, solos
y en combinación, sobre la supervivencia de aloinjertos dérmicos
primarios en ratones (figura 4). Para comparación, se trataron
también los receptores con CyA sola y CyA combinada con CTLA4Ig o
MR1. Los receptores C3H/HeJ tratados con MR1 solo o CTLA4Ig sola
rechazaron injertos dérmicos de BALB/c de MHC totalmente dispar a
la misma velocidad que los controles no tratados (figura 4A).
Los ratones tratados con CyA sola, CyA más
CTLA4Ig o CyA y MR1 mostraron todos una supervivencia del injerto
dérmico débilmente prolongada (figura 4B). Sin embargo, todos estos
aloinjertos se rechazaron en última instancia sin efectos aparentes
entre el fármaco y CyA.
Como ensayo riguroso de la capacidad del bloqueo
de CD40/CD28 de interrumpir las respuestas aloinmunes, los
inventores estudiaron los efectos del tratamiento perioperatorio con
CTLA4Ig y MR1, solos y en combinación, sobre la supervivencia de
aloinjertos dérmicos primarios en ratones. Para comparación, se
trataron los receptores también con CyA, un mAb YTS191.1
anti-CD4 o con cualquiera de estos agentes
combinados con CTLA4Ig o MR1 (figuras 4B y 4C). Los receptores
C3H/HeJ tratados con MR1, CLTA4Ig o YTS191.1 solos rechazaron
injertos dérmicos de BALB/c de MHC totalmente dispar esencialmente
a la misma velocidad que los controles no tratados (figuras 4B y
4C). Los ratones tratados con YTS191.1 y MR1, YTS191.1 y CTLA4Ig,
CyA sola, CyA más CTLA4Ig o CyA y MR1 mostraron una supervivencia
débilmente prolongada del injerto dérmico (figuras 4B y 4C). Sin
embargo, todos estos aloinjertos se rechazaron en última
instancia.
En contraposición, en receptores tratados tanto
con MR1 como con CTL4Ig en el periodo perioperatorio, los
aloinjertos dérmicos demostraron una supervivencia notablemente
prolongada. El examen visual de estos aloinjertos a los 50 días
después del transplante mostró que los injertos tenían una
apariencia sana, bien vascularizados, flexibles y con pelo corto
blanco (figura 4D). Histológicamente, los injertos aceptados
demostraron una epidermis, folículos pilosos y estructuras anexas
bien conservadas (figura 4F). Sorprendentemente, el efecto saludable
de CTLA4Ig/MR1 sobre la supervivencia del injerto dérmico se anuló
por la administración concomitante de ciclosporina (figura 4B).
La notable potencia de este efecto se hizo más
claramente evidente en el modelo de aloinjerto dérmico. Ni CTLA4Ig
ni MR1 solos o con CyA prolongaron significativamente la
supervivencia del aloinjerto dérmico. Sólo la combinación de
CLTA4Ig y MR1 produjo una supervivencia > 50 días de aloinjertos
dérmicos de MHC totalmente diferente. Sólo se había observado
previamente una prolongación similar en este ensayo estricto de
inhibición de la respuesta aloinmune utilizando estrategias
citoablativas vigorosas y/o basadas en quimerismo hematopoyético
(Mayumi H & Good R.A., J. Exp. Med. 169,
213-238 (1990); Ildstadt S.T. & Sachs D.H.,
Nature 307, 168-170 (1984); Ilstad S.T.
et al., J. Exp. Med. 162, 231-244 (1985);
Cobbold S.P., Martin G., et al., Nature 323,
164-166 (1986); Qin S., et al., Science 259,
974-977 (1993)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
4
Para explorar el efecto del bloqueo de las rutas
CD28 y CD40 sobre la proliferación de células T, los investigadores
estudiaron la reacción de leucocitos mixtos alogénicos primarios
utilizando células T tanto de ratones transgénicos con receptores
de células T restringidos con Iek reactivos con citocromo c de
paloma (pcc-TCRTg) como alorreactivos con Ld (2C)
(REF HED y LOH). La CTLA4Ig, una proteína de fusión que se une a los
ligandos CD28, y su homóloga CTLA4 inhibieron eficazmente la
proliferación de los tres tipos de poblaciones de células T (figura
5A).
En contraposición, el bloqueo de la ruta CD40
con el mAb anti-gp39 de hámster, MR1, inhibió
débilmente (aproximadamente un 50%) la proliferación de células T
de C3H/HeJ que responden a células dendríticas de BALB/c, inhibió
drásticamente (85%) que las células T de pcc-TCRTg
reaccionaran con el citocromo c, pero tuvo efectos despreciables
sobre la proliferación de células T 2C que responden a células
dendríticas de BALB/c portadoras de Ld (figura 5A).
Además, el bloqueo simultáneo con estos agentes
inhibió cooperativamente la proliferación de células T en
reacciones de leucocitos mixtos alogénicos y células
pcc-TCRTg, mientras que MR-1 no
tenía efecto o aumentaba ligeramente la proliferación de células T
2C cuando se combinaba con CTLA4Ig (figura 5A). Estos resultados
indican que no todas las células T dependen de las señales CD40 para
la expansión clonal, y pueden explicar la incapacidad del bloqueo de
CD40 de inhibir completamente el rechazo de aloinjerto.
Se evaluó el efecto del bloqueo de CD28 y CD40
sobre las respuestas de células T in vivo en C3H/HeJ
(H-2k, MMTV-7+) inmunizados con
esplenocitos DBA/2(H-2d,
MMTV-7+) en las almohadillas de sus patas. Cinco
días después de la inmunización, los nódulos linfáticos poplíteos
de drenaje en los ratones de control tratados con IgG humana
mostraron un aumento de 4-6 veces en el peso (figura
5B). Éste estuvo acompañado por una expansión de 30 veces el número
de células T Vb+CD+4 reactivas con el superantigeno
MMTV-7 y un aumento de >90 veces el número de
blastos de células T+Vb+CD en el nódulo linfático poplíteo. Solos,
CTLA4Ig o MR1 inhibieron parcialmente estas respuestas. En
contraposición, la combinación de CTLA4Ig/MR1 redujo esencialmente
el aumento del tamaño del nódulo linfático y la expansión y
blastogénesis de las células T+Vb+CD4 (figura 5B).
Estos datos muestran que el bloqueo simultáneo
de las rutas CD28 y CD40 inhibe las respuestas inmunes dependientes
del complejo T in vitro y in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
5
(Pero en el ejemplo de la invención
en la medida posible se refiere a injertos
cardíacos)
Este ejemplo muestra que el bloqueo simultáneo
de las rutas CD28 y CD40 produce una notable inhibición tanto de la
respuesta celular y de anticuerpos ante el xenoantígeno como de la
aceptación a largo plazo de injertos cardiacos y dérmicos
xenogénicos (de rata a ratón) sin la necesidad de terapia de
acondicionamiento citoablativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron ratones C3H macho (Jackson
Laboratory, Bar Harbor, ME) con 2 x 10^{6} esplenocitos de rata
Sprague-Dawley (Harlan, Indianápolis, IN) irradiados
(2000 RADS) en 50 \mul de solución salina normal estéril en la
almohadilla de la pata izquierda y 50 \mul de solución salina
normal estéril en la almohadilla de la pata derecha, y después se
trataron por vía intraperitoneal (i.p.) con MR1 (500 \mug),
CTLA4Ig (500 \mug) o ambos reactivos (500 \mug cada uno) los
días 0, 2 y 4. El día 5, se extirparon los nódulos linfáticos
poplíteos, se pesaron, después se desmenuzaron y se lavaron antes de
la resuspensión en 600 \mul de RPMI 1640 con FBS al 10%
(Mediatech, Herndon, VA). Se dividió después cada nódulo
resuspendido en cuatro alícuotas iguales (150 \mul cada una). Se
sembraron tres de las alícuotas en una placa de 96 pocillos. Se
midió la incorporación de 3H-timidina (1
\muCi/pocillo) (Amersham, Arlington Heights, IL) después de 24
horas de incubación a 37ºC. Los resultados de cada animal
individual representan por tanto la media de los 3 pocillos por
nódulo. Se incubó la cuarta alícuota durante 24 horas a 37ºC, y
sirvió como fuente de sobrenadante para el análisis de citoquina
con ELISA. Cada punto de todas las gráficas representa la media
\pm desviación estándar de 5 ratones por grupo. Se repitió el
experimento con resultados similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un ELISA de sándwich utilizando
anticuerpos apareados (anti-IL-2),
anti-IFN-gamma,
anti-IL-2 biotina,
anti-IFN-gamma biotina, (Pharmingen,
San Diego, CA); anti-IL4 (amable obsequio de Peter
Jansen)) y estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford,
IL). Se ensayó la detección colorimétrica utilizando sustrato TMB
(Pierce). Se recogieron los datos utilizando un lector de placas
SpectraMax y se representaron como absorbancia (370 nm) \pm SEM.
Se generaron las curvas estándares para cada citoquina utilizando
citoquina recombinante (rIL2, Boehringer Mannheim, Indianápolis,
IN; rIL4, R&D Systems, Minneapolis, MN; y
rIFN-gamma, Biosource International, Camarillo,
CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se adquirieron ratones C3H/HeJ
(H-2k) y DBA/2 (H-2d) macho y ratas
Sprague-Dawley en Jackson Laboratory (Bar Harbor,
ME) y se utilizaron a las 8-12 semanas de edad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transplantaron ratones C3H/HeJ o DBA con
xenoinjertos cardiacos de rata Sprague-Dawley
vascularizados primariamente y se controló el rechazo como se
describe en Larsen C.P., Alexander D.Z., Hollenbaugh, D., et al.,
Transplantation, 61(1):4-9 (1996) y
Corry R.J., Winn, H.J., Russell, P.S., Transplantation,
16(4):343-350 (1973). Se trataron los
receptores con 500 mg de CTLA4Ig combinada con 500 mg de MR1 los
días 0, 2, 4 y 6. Los grupos de control incluyeron receptores
tratados con CTLA4Ig sola, MR1 solo o Ig humana. Se tiñeron las
secciones de tejido embebidas en parafina (5 \mum) con Trichrome
de Masson o hematoxilina-eosina. Se revisaron los
especímenes histológicos por un patólogo de transplantes cardiacos
(KJW) ignorante de la modalidad de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transplantaron injertos dérmicos de espesor
completo (aproximadamente 1 cm^{2}) de ratas
Sprague-Dawley en el tórax dorsal de ratones
receptores C3H, y se controló la supervivencia por inspección visual
diaria. Se definió el rechazo como la pérdida completa de tejido de
injerto epidérmico visible. Los grupos de control incluyeron
receptores tratados con: CTLA4-Ig sola, MR1 solo, y
Ig humana. Se sacrificaron dos ratones adicionales en cada grupo
experimental a los 20 días después del transplante para análisis
histológico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogió el suero mediante extracción de
sangre de la cola de animales anestesiados. Se utilizaron
suspensiones de células individuales de nódulos linfáticos de una
rata Sprague-Dawley como células diana, y se
incubaron con suero de ratón receptor durante 20 minutos a 4ºC. Se
lavaron las células y se detectaron los xenoanticuerpos IgG con IgG
biotina anti-ratón de asno (Jackson ImmunoResearch,
West Grove, PA), seguida de estreptavidina-PE
(Southern Biotech, Birmingham, AL). Se analizaron las células en un
FACscan de Becton-Dickinson utilizando software
Cellquest.
\vskip1.000000\baselineskip
Como enfoque inicial para determinar los efectos
del bloqueo de CD28 y CD40 sobre las respuestas a la aplicación de
xenoantígeno in vivo, los investigadores utilizaron el ensayo
de nódulo linfático poplíteo como se describe en Larsen C.P.,
Elwood E.T., Alexander D.Z., et al., Nature
381:434-438 (1996). Se inyectaron a ratones C3H/HeJ
(H-2k) esplenocitos de rata
Sprague-Dawley (SD) irradiados. Cinco días después
de la inmunización por la almohadilla de la pata, los nódulos
linfáticos poplíteos de drenaje en los ratones de control tratados
con IgG humana mostraron un aumento de 5,2 veces en el peso relativo
del nódulo contralateral que se inoculó con solución salina estéril
(figura 6A). La CTLA4Ig inhibió parcialmente la expansión del
nódulo. De forma similar, MR1 inhibió parcialmente esta respuesta.
En contraposición, la combinación de CTLA4Ig/MR1 redujo
esencialmente la expansión del nódulo linfático inducida por
xenoantígeno (figura 6A).
Después, los investigadores compararon la
proliferación ex vivo de células de nódulo linfático de los
diferentes grupos de ratones cebados con xenoantígeno. Aunque cada
tratamiento solo bloqueó sólo parcialmente la proliferación (figura
6B), la combinación de CTLA4Ig/MR1 anuló esencialmente la respuesta
proliferativa (302 \pm 235 cpm para la combinación frente a 143
\pm 145 para un nódulo normal no estimulado). Además, la terapia
de combinación suprimió notablemente las citoquinas Th1
(IL-2 e IFNg) al nivel de células normales no
estimuladas (figuras 6C y 6D). Los niveles de la citoquina Th2
IL-4 estaban por debajo del nivel de detección en
todas las muestras.
Resulta importante observar que esta potente
modulación inmune no es el resultado de deleción celular. El
análisis citométrico de flujo de la sangre periférica de los ratones
tratados no mostró empobrecimiento de células T CD4+ o CD8+,
células B o células NK. Estos datos son el resultado de un análisis
individual de 3 ratones por grupo tratado con CTLA4Ig o MR1 solo o
la combinación de estos agentes los días 0, 2, 4 y 6, como se ha
descrito en la sección de procedimientos. La sangre periférica se
recogió por extracción de sangre de la cola los días 6 y 20.
Los resultados de los ensayos de nódulos
linfáticos sugirieron que el bloqueo simultáneo de las rutas B7/CD28
y CD40/gp39 inhibiría el rechazo de xenoinjertos. Para explorar
esta hipótesis, los investigadores estudiaron un modelo de
xenoinjerto cardiaco vascularizado utilizando ratas
Sprague-Dawley como donantes y ratones C3H/HeJ como
receptores. El tratamiento con CTLA4Ig (MST= 33 días) o MR1 (MST= 51
días) solos prolongó la supervivencia del xenoinjerto en
comparación con los controles no tratados (MST= 6 días) (figura 7A).
Sin embargo, CTLA4-Ig/MR1 en combinación prolongaron
notablemente la supervivencia (MST= 104,5 días).
Cuando se examinaron histológicamente a los 20
días después del transplante los xenoinjertos tratados con CTLA4Ig
sola (figura 7C) o MR1 solo (figura 7D), mostraron una fuerte
infiltración linfocítica con evidencias de destrucción de miocitos
y vasculopatía, consistente con un rechazo celular moderado a grave.
En fuerte contraste, los xenoinjertos de receptores tratados con
CTLA4-Ig/MR1 estaban esencialmente exentos de
infiltración linfocítica, fibrosis intersticial y lesiones de la
capa íntima arterial coronaria (figura 7F). Los xenoinjertos
cardiacos tratados con CTLA4Ig/MR1 demostraron una excelente
conservación tanto de los miocitos como de las estructuras
vasculares el día 122 (figura 7G). Los xenoinjertos no tratados
mostraron una destrucción de tejido ampliamente extendida el día 6
(figura 7B). Se muestra un corazón de rata
Sprague-Dawley normal no transplantado en la figura
7E.
Como ensayo más estricto de la capacidad del
bloqueo de CD40/CD28 de inhibir las respuestas inmunes xenogénicas,
los investigadores han estudiado los efectos del bloqueo a corto
plazo de CD28 y/o CD40 sobre la supervivencia de xenoinjerto dérmico
primario en ratones.
Los receptores C3H tratados con MR1 (MST= 11,5
días, n= 4) o CTLA4-Ig (MST= 12 días, n= 4) solos
rechazaron los injertos dérmicos de espesor completo de ratas
Sprague-Dawley a la misma velocidad que los
controles no tratados (MST de controles no tratados= 11,5 días, n=
8) (figura 8A). En contraposición, los xenoinjertos dérmicos en
receptores tratados simultáneamente con MR1 y CTLA4Ig en el periodo
perioperatorio demostraron una supervivencia notablemente
prolongada (MST= 53 días, n= 25) (figura 8A). Un total de 25 ratones
recibieron xenoinjertos y tratamiento con CTLA4Ig/MR1. Con la
excepción de un ratón que murió el día 4, todos los demás han
permanecido sanos durante todo el experimento sin síntomas de
pérdida de peso, infección o malignidad.
El tratamiento crónico (empezando después del
régimen de 4 dosis estándar) con la combinación CTLA4Ig/MR1 (500
\mug de ambos agentes semanalmente hasta el día 100 o rechazo, lo
que suceda primero) o con MR1 (500 \mug de MR1 semanalmente hasta
el día 100 o rechazo) no dieron como resultado un cambio
significativo en la supervivencia del xenoinjerto (figura 8B).
La supervivencia del xenoinjerto después de la
terapia simultánea con MR1/CTLA4Ig fue del 52% y del 21% a 50 y 100
días, respectivamente. Los xenoinjertos supervivientes a 50 (figura
8E) y 100 días (figura 8C) después del transplante tenían una
apariencia sana, y demostraron una arquitectura histológica bien
conservada. En los controles no tratados sin la terapia de
combinación el rechazo fue inmediato, y estos xenoinjertos mostraron
notables infiltrados inflamatorios (figuras 8D y 8F).
Se observó también una prolongación similar de
los xenoinjertos dérmicos de Sprague-Dawley en
receptores DBA[H-2d] (MST de controles no
tratados= 14 días, (n= 5) frente a MST de CTLA4Ig/MR1= 86 días, n=
5), sugiriendo que el potente efecto del tratamiento de combinación
no está limitado a una sola cepa de ratón receptor.
La progresiva pérdida de xenoinjertos dérmicos
entre 25 y 75 días después del transplante sugería que el fallo
tardío del transplante podría ser debido a concentraciones
subterapéuticas de CTLA4Ig y/o MR1. Para enfrentarse a esta
posibilidad, después del régimen de combinación de 4 dosis estándar,
se trataron los ratones semanalmente con la combinación CTLA4Ig/MR1
o MR1 solo durante 100 días o hasta que apareció pérdida de injerto.
Ninguna de estas estrategias de terapia crónicas mejoraron
apreciablemente la supervivencia del xenoinjerto dérmico,
sugiriendo que el fallo del injerto en ratones tratados con
CTLA4Ig/MR1 es el resultado de factores distintos de titulaciones
inadecuadas del fármaco, y que pueden ser importantes rutas
alternativas no completamente inhibidas por CTLA4Ig/MR1 en la
pérdida subaguda de xenoinjerto.
Además de los mecanismos efectores mediados por
células, las respuestas de xenoanticuerpos provocadas pueden
desempeñar un papel importante en el rechazo vascular acelerado de
xenoinjertos concordantes, Aksentijevich I., Sachs D.H., Sykes M.,
Transplantation, 53(5): 1108-1114
(1992). Para ensayar el efecto del bloqueo simultáneo sobre las
respuestas de xenoanticuerpos provocadas, se analizaron en muestras
de suero de ratones C3H/HeJ los anticuerpos
anti-rata a los 55 días después de recibir un
injerto dérmico de rata Sprague-Dawley (figura 9A)
y a los 20 días después de recibir un injerto cardiaco de rata
Sprague-Dawley (figura 9B). El tratamiento con
CTLA4Ig o MR1 solos redujo la respuesta de anticuerpos Ig, mientras
que el bloqueo de la combinación simultánea de CD28/CD40 eliminó
esencialmente la respuesta de anticuerpos provocada ante los
xenoantígenos de rata. Así, la inhibición tanto la activación de
células T como de la producción de anticuerpos podría ser
funcionalmente importante en la supervivencia del xenoinjerto
después del bloqueo simultáneo de las rutas B7/CD28 y CD40/gp39.
\vskip1.000000\baselineskip
El bloqueo combinado de las rutas CD28 y CD40
inhibe notablemente la respuesta inmune ante xenoantígeno. La
potencia de esta terapia de combinación se demostró particularmente
en el modelo de xenoinjerto dérmico primario. Ningún agente solo
prolongó la supervivencia de xenoinjerto dérmico, mientras que en
contraposición, la combinación simultánea de CTLA4Ig y MR1 inhibió
cooperativamente el rechazo de xenoinjerto. La singularidad de los
descubrimientos reside en lo estricto del modelo de injerto
dérmico, ya que se ha mostrado anteriormente que CTLA4Ig sola
prolonga la supervivencia de islotes pancreáticos xenogénicos en un
modelo de ratón, Lenschow D., Zeng, Y., Thistlewaite J., et al.,
Science, 257: 789-792 (1992). La supervivencia a
largo plazo de injertos dérmicos xenogénicos se ha observado
anteriormente sólo utilizando vigorosas estrategias citoablativas
y/o basadas en quimerismo hematopoyético, Ildstadt S.T., Sachs,
D.H., Nature 307, 168-170 (1984); Zhao Y.,
Swenson K., Sergio J., Arn J.S., Sachs D.H., Sykes M., Nat
Med., 2(11): 1211-1216 (1996), Mayumi H.,
Good R.A., J. Exp. Med., 169(1):
213-238 (1990), Cobbold S.P., Martin G., Zin S.,
Waldman H., Nature, 323:164-166 (1986), Qin
S., Cobbold S., Benjamin R., Waldmann H., J. Exp. Med.,
169:779-794 (1989).
La observación de que el bloqueo simultáneo
CD28/CD40 puede prolongar drásticamente la supervivencia de
xenoinjerto sugiere que tanto los mecanismos mediados por
anticuerpo como mediados por célula para la destrucción del
xenoinjerto pueden inhibirse eficazmente por esta estrategia.
Mientras que la etiología del rechazo vascular agudo de xenoinjerto
continúa sin estar completamente definida, existen evidencias de que
está causado, al menos en parte, por el desarrollo de anticuerpos
xenorreactivos (Cotterell A.H., Collins B.H., Parker W., Harland
R.C., Platt J.L., Transplantation, 60(8):
861-868 (1995)). La rápida destrucción de los
xenoinjertos cardiacos de control no tratados en el modelo de los
investigadores, en ausencia de un infiltrado celular, sugiere un
papel para el rechazo mediado por anticuerpo. Esta observación y
aquellas de otros (Aksentijevich I., Sachs D.H., Sykes M.,
Transplantation, 53(5):1108-1114
(1992)), combinadas con la drástica inhibición documentada de la
respuesta de xenoanticuerpo provocada después del bloqueo de las
rutas CD28 y CD40 (figuras 9A y 9B), apoya la hipótesis de que las
xenorrespuestas pueden estar suficientemente controladas por la
inhibición de estas rutas para permitir el desarrollo de
estrategias no ablativas para xenotransplantes en combinaciones de
especies discordantes.
Aunque el bloqueo combinado de las rutas CD28 y
CD40 inhibía notablemente la respuesta de rechazo de xenoinjerto,
este bloqueo no conseguía una supervivencia indefinida uniforme del
injerto cardiaco o dérmico en el sistema experimental de los
investigadores. La observación de que el tratamiento prolongado no
mejoraba la supervivencia del injerto era sorprendente. Esto
sugiere que el bloqueo inadecuado de estas rutas no es la causa del
fallo "tardío" de injerto, y aumenta la posibilidad de que
rutas alternativas tales como células NHK u otras células, que no
requieren la coestimulación con CD28/CD40, puedan potenciar el
rechazo tardío de xenoinjerto. Evidencias sugerentes de la
contribución de células NK al rechazo de injerto apoyan esta
posibilidad, Zhao Y., Swenson K., Sergio J., Arn J.S., Sachs D.H.,
Sykes M., Nat. Med., 2(11):1211-1216
(1996), Malyguine A.M., Saadi S., Platt J.L., Dawson J.R.,
Transplantation, 61(1):161-164 (1996).
Además, los investigadores han mostrado que la inhibición del
rechazo de xenoinjertos cardiacos y dérmicos concordantes por el
bloqueo simultáneo de las rutas CD40 y CD28 está asociada con la
prevención del desarrollo "tardío" de respuestas de anticuerpo
xenorreactivo provocadas (figuras 9A y 9B), aunque no han excluido
la posibilidad de que el desarrollo de una respuesta de anticuerpos
pueda estar asociado a una pérdida de injerto retrasada.
La capacidad del tratamiento combinado de
CTLA4Ig/MR1 de bloquear el desarrollo de la vasculopatía de
transplante en xenoinjertos cardiacos y prolongar los xenoinjertos
dérmicos es de relevancia clínica significativa. El refinamiento de
las técnicas para inhibir el efecto de los anticuerpos
xenorreactivos preformados naturales combinada con el estudio
adicional del bloqueo de la ruta CD28 y CD40 promete la posibilidad
de nuevas estrategias eficaces para facilitar el transplante clínico
de xenoinjertos.
Claims (20)
1. El uso de una cantidad eficaz de una
combinación de un primer ligando soluble que previene que un
antígeno CTLA4 en una célula positiva para CTLA4 y/o un antígeno
CD28 en una células positiva para CD28 se una a un antígeno B7, y un
segundo ligando soluble que previene que un antígeno gp39 en una
célula positiva para gp39 se una a un antígeno CD40 para preparar
una composición farmacéutica para inhibir el rechazo de trasplante
mediado por interacciones de células positivas para CTLA4, positivas
para CD28 y positivas para gp39 con células positivas para B7 y
positivas para CD40, en el que el trasplante es un trasplante
vascularizado primariamente.
2. El uso de una cantidad eficaz de una
combinación de un primer ligando soluble que previene que un
antígeno CTLA4 en una célula positiva para CTLA4 y/o un antígeno
CD28 en una célula positiva para CD28 se una a un antígeno B7, y un
segundo ligando soluble que previene que un antígeno CD40 en una
célula positiva para CD40 se una a un antígeno gp39 para preparar
una composición farmacéutica para inhibir el rechazo de trasplante
mediado por interacciones de células positivas para CTLA4, positivas
para CD28 y positivas para gp39 con células positivas para B7 y
positivas para CD40, en el que el trasplante es un trasplante
vascularizado primariamente.
3. El uso de una cantidad eficaz de una
combinación de un primer ligando soluble que previene que un
antígeno B7 en una célula positiva para B7 se una a un antígeno
CTLA4 en una célula positiva para CTLA4 y/o un antígeno CD28 en una
célula positiva para CD28, y un segundo ligando soluble que previene
que un antígeno gp39 en una célula positiva para gp39 se una a un
antígeno CD40 para preparar una composición farmacéutica para
inhibir el rechazo de trasplante mediado por interacciones de
células positivas para CTLA4, positivas para CD28 y positivas para
gp39 con células positivas para B7 y positivas para CD40, en el que
el trasplante es un trasplante vascularizado primariamente.
4. El uso de una cantidad eficaz de una
combinación de un primer ligando soluble que previene que un
antígeno B7 en una célula positiva para B7 se una a un antígeno
CTLA4 en una célula positiva para CTLA4 y/o un antígeno CD28 en una
célula positiva para CD28, y un segundo ligando soluble que previene
que un antígeno gp39 en una célula positiva para gp39 se una a un
antígeno CD40 para preparar una composición farmacéutica para
inhibir el rechazo de trasplante mediado por la interacción de
células positivas para CTLA-4, positivas para CD28 y
positivas para gp39 con células positivas para B7 y positivas para
CD40, en el que el trasplante es un trasplante vascularizado
primariamente.
5. El uso de la reivindicación 1 ó 2 en el que
el primer ligando soluble que previene que el antígeno CTLA4 en la
célula positiva CTLA4 y/o el antígeno CD28 en la célula positiva
para CD28 se una al antígeno B7 es un anticuerpo reactivo con CTLA4,
un anticuerpo reactivo con CD28 o un B7 soluble.
6. El uso de la reivindicación 3 ó 4, en el que
el primer ligando soluble que previene que el antígeno B7 en la
célula positiva para B7 se una al antígeno CD28 en la célula
positiva para CD28 y/o el antígeno CTLA4 en la célula positiva para
CTLA4 es un anticuerpo reactivo con B7, CTLA4 soluble o CD28
soluble.
7. El uso de la reivindicación 6, en el que
CTLA4 soluble es una molécula de unión recombinante con al menos una
porción del dominio extracelular de CTLA4.
8. El uso de la reivindicación 7, en el que el
dominio extracelular de CTLA4 está unido a una secuencia proteica no
CTLA4.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que la
secuencia proteica no CTLA4 es al menos una porción de una molécula
de inmunoglobulina.
10. El uso de la reivindicación 6, en el que
CTLA4 soluble es una proteína de fusión CTLA4Ig.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que la
proteína de fusión CTLA4Ig es la CTLA4Ig designada como ATCC
68629.
12. El uso de la reivindicación 6, en el que la
CTLA4 soluble es un híbrido de proteína de fusión
CD28Ig/CTLA4Ig.
13. El uso de la reivindicación 12, en el que el
híbrido de proteína de fusión CD28Ig/CTLA4Ig comprende una primera
secuencia de aminoácidos correspondiente a una porción del dominio
extracelular del receptor CD28 condensado con una segunda secuencia
de aminoácidos correspondiente a una porción del dominio
extracelular del receptor CTLA4 y una tercera secuencia de
aminoácidos correspondiente a la bisagra, las regiones CH2 y CH3 de
la inmunoglobulina C humana (gamma)1.
14. El uso de la reivindicación 6, en el que
CD28 soluble es una molécula de unión recombinante con al menos una
porción del dominio extracelular de CD28.
15. El uso de la reivindicación 6, en el que
CD28 soluble es un híbrido de proteína de fusión CD28Ig/CTLA4Ig.
16. El uso de la reivindicación 1 ó 3, en el que
el segundo ligando soluble que previene que el antígeno gp39 en la
célula positiva para gp39 se una al antígeno CD40 es un anticuerpo
reactivo con gp39 o un CD40 soluble.
17. El uso de la reivindicación 2 ó 4, en el que
el segundo ligando soluble que previene que el antígeno CD40 en la
célula positiva para CD40 se una al antígeno gp39 es un anticuerpo
reactivo con CD40 o un gp39 soluble.
18. El uso de la reivindicación 16, en el que el
anticuerpo reactivo con gp39 es un anticuerpo monoclonal MR1.
19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 18, para inhibir el rechazo de autoinjertos, isoinjertos,
aloinjertos y xenoinjertos.
20. El uso de la reivindicación 19 para inhibir
la vasculopatía crónica de transplante.
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