ES2181227T5 - Procedimiento para el desenriquecimiento de patógenos víricos y moleculares en uin material biológico. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para reducir la concentración de virus y moléculas patógenas en un material biológico que contiene una o varias sustancias biológicas para ser extraídas. El material biológico se mezcla con un disolvente orgánico, el material biológico orgánico mezclado con el disolvente se pone en contacto con un intercambiador de iones, los agentes patógenos se absorben en el material intercambiador de iones y al menos una de las sustancias biológicas para ser extraídas interactúan de forma reducida o no completa con el intercambiador de iones, entonces el intercambiador de iones con los agentes patógenos absorbidos se separan del material biológico. Se obtiene así una preparación de la sustancia biológica con una concentración reducida de virus.

Description

La invención se refiere a un procedimiento para el desenriquecimiento de patógenos víricos y moleculares en un material biológico que contiene uno o varias de las substancias biológicas a obtener.

La preparación de proteínas terapéuticas y preparados, especialmente de inmunoglobulina, mediante la extracción de tejidos o líquidos humanos o animales como son la sangre o el plasma, así como de células de mamíferos transformadas, de crecimiento continuo, con frecuencia conllevan el riesgo de la contaminación potencial por patógenos como son los virus, partículas similares a los virus o priones. Por esta razón es necesario tomar medidas para no transmitir al hombre los patógenos eventualmente existentes.

La sangre o bien el plasma humano pueden contener, por ejemplo, virus que transmiten enfermedades como el SIDA, la hepatitis B u otras formas de hepatitis. En cuanto a las proteínas de plasma o plasmas mixtos el riesgo de transmitir agentes infecciosos como son los virus, es muy reducido debido a la selección de donaciones de sangre o de plasma y el procedimiento de preparación. Aunque, las medidas apropiadas como es la exclusión de donantes de sangre con un mayor riesgo, de la donación de sangre así como los análisis de la sangre y del plasma donados mediante los cuales se pueden detectar las donaciones infectadas y que permiten excluirlas de la siguiente distribución, permiten la eliminación de la mayoría de las donaciones infectadas, sin embargo, en la mayoría de los casos no pueden abarcar a todas. Los sistemas de ensayo existentes para demostrar la existencia de virus infecciosos en los materiales biológicos no siempre permiten excluir la duda de la transmisión potencial de patógenos ya que es imposible con el amplio abanico de patógenos infecciosos ensayar el material de partida en cuanto a todos los virus o patógenos moleculares. Además, la mayoría de los ensayos no registran el virus en si, sino los anticuerpos desarrollados contra el virus de manera que en el período de la así llamada "ventana de diagnóstico" no se puede demostrar contaminación.

Para algunos grupos de virus no existe, además, ningún método de prueba fiable o con la suficiente sensibilidad. Aunque los procedimientos de ensayo de reciente desarrollo, especialmente el procedimiento de amplificación del ácido nucléico, como, por ejemplo, el PCR, son muy sensibles y específicos, solamente pueden aplicarse para patógenos cuya secuencia de ácido nucléico es conocida. En los casos en los que se conocen los patógenos humanos, sin embargo no existen procedimiento sensibles para la prueba, sigue existiendo la inseguridad de que un resultado negativo solamente se obtiene debido a un contenido vírico demasiado reducido situado por debajo del límite de sensibilidad del sistema de ensayo.

Por esta razón se desarrollaron procedimientos específicos de eliminación y/o inactivación para el desenriquecimiento de virus para la preparación de productos farmacéuticos y terapéuticos de manera que en el producto final ya no se espera encontrar partículas infecciosas.

Diferentes procedimientos de inactivación se basan en un tratamiento físico-químico mediante calor y/o productos químicos. Como procedimientos se aplican, especialmente el tratamiento térmico, la pasteurización, el tratamiento de la solución de proteínas con ß-propiolactona y luz UV, tratamiento con una combinación de disolventes y un detergente (el así llamado procedimiento S/D) o la exposición de la solución de proteína a la luz después de añadir al preparado una substancia fotodinámica. Con este procedimiento se consiguió una inactivación de los virus hasta en un factor de 10-6. La eficacia del procedimiento de inactivación, sin embargo, puede variar en función del tipo de virus. Aunque los productos de sangre tratados con S/D se consideran seguros en lo que se refiere a la transmisión de HCV, HBV ó HIV, los virus sin envolvente como el HAV o el parvovirus no se inactivan con este procedimiento (Prowse C., Vox Sang. 67 (1994), 191-196).

Los procedimientos de tratamiento térmico se realizan en el caso de productos biológicos, de preferencia bien en solución (EP-0 124 506), bien en estado seco (EP-0 212 040 ó WO 82/03871) o en estado húmedo (EP-0 324 729). Con frecuencia se pueden producir aquí pérdidas debido a la termoinestabilidad de muchas substancias biológicas.

El tipo del procedimiento de inactivación también puede tener influencia sobre los productos por lo que con frecuencia es necesaria una estabilización con el fin de minimizar la pérdida de proteínas. Además, algunos procedimientos de inactivación deben seguir pasos de purificación con en fin de eliminar los productos químicos añadidos.

Los procedimientos para el desenriquecimiento de virus comprende, especialmente, procedimientos cromatográficos, filtración de soluciones de proteína a través de un filtro de membrana o la adsorción de virus en una fase sólida y la subsecuente eliminación de la fase sólida, como se ha descrito en la EP-0 679 405. Sin embargo, se ha observado que aunque el tratamiento con una fase sólida, como, por ejemplo, con Aerosil®, permite la eliminación de HIV hasta un factor de 10-4 de una solución con contenido de inmunoglobulina, la pérdida de IgG, sin embargo, puede llegar a alcanzar hasta un 42 % (Gao et al., Vox Sang 64 (1993), 204-209). Para la preparación técnica a nivel industrial, por lo tanto, un procedimiento de este tipo se considera más bien no apropiado debido a estos altos coeficientes de pérdidas.

Un procedimiento cromatográfico de amplia difusión para el aislamiento de substancias biológicas es la cromatografía de intercambio de aniones. También se ha descrito en la literatura la posibilidad del desenriquecimiento de virus mediante este procedimiento de separación. Por ejemplo, se ha investigado el desenriquecimiento de virus en la cromatografía de intercambio de aniones para la purificación de vWF bajo condiciones bajo las cuales el vWF queda ligado con el intercambiador de aniones sin embargo no el virus (Burnouf-Radosevich, Vox San 62 (1992), 1-11). Mediante un cuidadoso lavado de la columna antes de la elución fue posible obtener vWF - dependiendo del virus - con un desenriquecimiento de virus de 1,5 a 5 potencias de diez.

Zolton et al. (Vox Sang 49 (1985), 381-389) investigaron el coeficiente de desenriquecimiento de virus en la cromatografía de intercambiador de aniones para purificar gamma-globulinas bajo condiciones bajo las cuales la gammaglobulina no se une a un intercambiador de aniones. En este procedimiento se utilizó la sefarosa DEAE como intercambiador de aniones con un índice pH de 7,5. Aquí fue posible eliminar la posibilidad de infección de una solución de partida infectada con el virus de la hepatitis B mediante esta cromatografía de intercambiador de aniones. Con este experimento se consiguió un desenriquecimiento del virus de hepatitis B en un factor de 3000. Sin embargo, no fue posible decir nada sobre el coeficiente de desenriquecimiento de otros virus con un pH de 7,5. Muy interesante era que con un índice pH inferior a 7,2 se presentaron virus en el paso del intercambiador de aniones, de manera que este procedimiento es considerado generalmente como no aplicable en el rango de un pH neutro o débilmente ácido.

En la US-PS 4 590 002 se describe un procedimiento para la eliminación de la inefectividad de hepatitis B de líquidos corporales con contenido de gammaglobulina, mediante una cromatografía de columnas múltiples.

La EP 506 651 describe un procedimiento de varios pasos para obtener un preparado que contiene IgA, IgG y transferrina, donde se consiguió en cada paso del procedimiento una reducción del título de virus. Durante el paso de extracción y precipitación con 12 % etanol se alcanzó una reducción de virus en un factor de

105. En el paso de adsorción se ligaron las proteínas con un intercambiador de iones, se lavaron y se eluyeron de nuevo. En este paso, la reducción de virus se situaba en un factor de 103.

Burnouf (Dev. Biol. Stand. 81 (1993), 199-209) informa que mediante un paso de intercambiador de aniones en la purificación del factor VIII se pueden desenriquecer los virus de parainfluenza y HIV-1 en 4 o bien 3 potencias de diez. En la purificación de vWF a través de la cromatografía de intercambiador de aniones, se informa sobre un coeficiente de desenriquecimiento del PRV (Porcine pseudorabies virus) hasta un factor de 10-5 .

Mitra et al. (Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus. 56 (1989), 34-43) muestran que al purificar IgG de plasma según el esquema de fraccionamiento de plasma de Cohn-Oncley mediante una secuencia de pasos de precipitación en presencia de determinadas concentraciones de etanol y con índices de pH definidos en frío (-5º C) se puede alcanzar una reducción de virus en un factor menor de 10-5 o bien de 10-8 del virus C de ratón o bien HIV. En este trabajo también se informa que una solución de etanol al 25 % con un índice pH fisiológico puede tener un efecto fuertemente viricida. Una combinación del tratamiento con etanol y con una cromatografía de intercambiador de iones, sin embargo, según Mitra et al. ni se muestra ni se sugiere.

Hamman et al. (Vox Sang 67 (1994), 72-77) muestran que, por medio de la cromatografía de intercambiador de iones, en el proceso de preparación de un concentrado del factor VIII, se puede alcanzar una reducción de la actividad de virus o bien concentración de virus de solamente en un factor de 10-1 a 10-2 .

Existe, por lo tanto, la necesidad de métodos que se pueden aplicar a nivel industrial para separar virus de soluciones de proteínas, para reducir los riesgos de infección para los pacientes, que son tratados con preparados farmacéuticos o terapéuticos de origen animal, humano o producidos por medio de procedimientos de técnica genética mediante cultivos de células.

También existe la necesidad de productos biológicos libres de patógenos y seguros desde el punto de vista vírico, en los que ya se garantiza mediante el procedimiento de preparación que no se transmiten patógenos y que el procedimiento es lo suficientemente cuidadoso para que la actividad biológica de los productos se mantenga en gran medida.

El objetivo de la presente invención consiste por lo tanto en proporcionar un mejor procedimiento para el desenriquecimiento de patógenos víricos y moleculares en un material biológico.

Este objetivo se alcanza según la invención por medio de un procedimiento del tipo arriba descrito caracterizado porque en un procedimiento de adsorción de un solo paso sin elución adicional, el material biológico se mezcla con un disolvente orgánico, porque el material biológico mezclado con el disolvente orgánico se pone en contacto con un intercambiador de iones, donde los patógenos son adsorbidos en el material intercambiador de iones y, como mínimo, una de las substancias biológicas que se quiere obtener no entra en ninguna interacción o una interacción muy reducida con el material intercambiador de iones, y porque el intercambiador de iones con los patógenos adsorbidos se separa del material biológico obteniéndose un preparado desenriquecido de virus de la substancia biológica.

Sorprendentemente, se ha descubierto que en presencia del disolvente orgánico el factor de reducción del paso de intercambio de iones era considerablemente mayor si se compara con el factor descrito según la técnica actual. Así, Hamman et al. (supra) encontraron únicamente un factor de reducción en un factor de 10-1 en el paso de intercambio de iones.

Por lo tanto, era inesperado que en un procedimiento de un solo paso, es decir un procedimiento de adsorción sin más elución, se pudiera alcanzar un alto factor de reducción. También era sorprendente que por la presencia del disolvente se modifica esencialmente la especificidad de adsorción del intercambiador de iones debido a lo cual se fijan patógenos, mientras que las substancias biológicas, especialmente proteínas, esencialmente no se fijan. Así con el procedimiento según invención es posible alcanzar, por ejemplo para HAV, un factor de reducción en un factor menor de 10-5,95 lo que corresponde a una reducción completa, mientras que Hamman et al. por el contrario consiguieron únicamente un factor de reducción en un factor de 10-1 para HAV mediante el paso de intercambiador de iones.

Aunque se sabe que un tratamiento de desenriquecimiento con etanol al 12 % puede contribuir a la reducción de virus, sin embargo era muy sorprendente que un disolvente orgánico también es adecuado para ser aplicado al mismo tiempo con un tratamiento de intercambiador de iones para la reducción de virus.

Dentro del marco de la presente invención se ha mostrado que, especialmente, con la cromatografía de intercambiador de aniones o bien la adsorción en un intercambiador de aniones, se pueden conseguir coeficientes de desenriquecimiento especiales, de preferencia en conexión con materiales sobre la base de hidratos de carbono o polímeros sintéticos, como por ejemplo DEAE-Sephacel®, DEAE-Sephadex®, DEAE-Sepharose CL 6B®, DEAE-Sepharose Fast Flow®, QAE-Sephadex®, Q-Sepharose Fast Flow®, Q-Sepharose High Performance®, Q-Sepharose Big Beads® (todos de la firma Pharmacia); DEAE-TrisAcryl®, DEAE-Spherodex®, Q-Hyper-D® (todos de la firma Sepracor); Macroprep DEAE®, Macroprep Q® (todos de la firma BioRad); DEAE-Toyopearl®, QAE-Toyopearl®, Toyopearl Super-Q® (todos de la firma Tosohaas); Protein PAK DEAE® (Waters); Fractogel EMD-TMAE®, Fractogel EMD-DEAE®, Fractogel EMD-DMAE®, Licrospher 1000 TMAE®, Licrospher 1000 DEAE® y Licrospher 4000 DMAE® (todos de la firma MERCK).

De especial preferencia (sobre todo en la preparación de inmunoglobulina) se utiliza un intercambiador de aniones del tipo DEAE, especialmente del tipo DEAE-Sephadex.

Los patógenos adsorbidos en los intercambiadores de iones se eliminan a continuación del material biológico por separación del completo de intercambiador de iones/patógeno. Así el adsorbato es separado de forma sencilla e inmediata del material biológico sin tratamiento con una substancia tampón de elución. El complejo se separa, de preferencia por la penetración del material biológico a través de un filtro, especialmente un filtro de profundidad. La separación del complejo también puede realizarse por sedimentación, especialmente centrifugado. De preferencia, la separación del intercambiador de iones se realiza también en presencia del disolvente.

Con substancias biológicas dentro del marco de esta invención se quiere decir substancias de origen biológico, que se pueden obtener, por ejemplo, de líquidos corporales como son la sangre o el plasma, o también de sobrantes de cultivos de células recombinantes, donde estas substancias biológicas, que se quieren obtener dentro del marco de la presente invención o bien cuya contaminación por virus se quiere reducir, pueden utilizarse especialmente para fines terapéuticos, profilácticos o diagnósticos o bien como preparados farmacéuticos. Estas substancias biológicas pueden ser, por ejemplo una proteína / un péptido, hidratos de carbono o lípidos, especialmente substancias biológicamente activas, como, por ejemplo, la inmunoglobulina o factores sanguíneos. Sin embargo, también pueden incluirse bajo el término de "substancias biológicas" otras substancias que pueden formarse de células procariónticas o eucariónticas.

La obtención de preparados reducidos en virus de substancias biológicas del sobrante del adsorbato o bien del filtrado se realiza, normalmente, por otro tratamiento o purificación de las substancias biológicas o bien fracciones del material biológico, utilizándose entre otros precipitaciones, procedimientos de purificación cromatográficos, una filtración, una diafiltración, formulación.

El material biológico puede ser aquí, dentro del marco de la presente, invención, una fracción de plasma, una fracción de plasma con contenido de inmunoglobulina, de preferencia una fracción COHN II+III, una fracción con contenido de proteína de plasma que contiene factores sanguíneos como por ejemplo el factor II, Factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, proteína C, proteína S, vWF, un concentrado que contiene uno de los factores sanguíneos, un sobrante de una línea de células de hibridoma, un sobrante de cultivo de células de células de mamíferos transformadas o infectadas o un extracto de un tejido animal o humano. Los parámetros para la realización del procedimiento se ajustan aquí en cada caso al tipo y las características del material biológico y los patógenos posiblemente presentes. Los parámetros óptimos, como por ejemplo el pH, la temperatura, la duración en tiempo de la incubación para la realización el tipo del disolvente orgánicos del procedimiento según invención dependiendo del tipo de patógeno, la especificidad del intercambiador de iones y la naturaleza del material biológico (pureza de la solución, concentración de proteínas en la solución), pueden averiguarse por cualquier técnico en la material en base a sus conocimientos generales.

El procedimiento según la invención es especialmente adecuado para desenriquecer un material biológico de patógenos moleculares y/o virales, donde se eliminan con efectividad los patógenos víricos tanto del grupo de los virus envueltos en lípidos, como también del grupo de los virus no envueltos en lípidos. Entre ellos cuentan, especialmente, los virus como son HAV, HBV, HCV, HGV, HEV, HDV, HIV, CMV o parvovirus.

Los disolventes orgánicos dentro del marco de la presente invención son, especialmente, los disolventes que no provocan bajo las condiciones seleccionadas durante la mezcla con los materiales biológicos ningún proceso de desnaturalización esencial. Entre estos se cuentan, especialmente, disolventes como el metanol, etanol u otros alcoholes biológicamente compatibles.

La concentración óptima del correspondiente disolvente puede averiguarse fácilmente por cada técnico mediante sencillos experimentos - lo mismo que desviaciones despreciables en las condiciones óptimas de cromatografía, que pueden ser debido, en caso dado, por la presencia del disolvente. En general, el disolvente se utiliza en una concentración de 5 al 20 % en volumen, de preferencia en una concentración del 10 al 15 % en volumen, especialmente en una concentración de aproximadamente un 12 a un 14 % en volumen.

De preferencia se utiliza como disolvente orgánico un alcohol mono o polivalente, dándose especial preferencia al etanol. Las concentraciones de etanol especialmente preferidas se sitúan según invención entre un 12 y un 14 % en volumen, especialmente entre un 13 y un 14 % en volumen. El tratamiento con intercambiadores de iones se realiza, de preferencia a temperaturas bajas, dándose preferencia a temperaturas inferiores a 10 ºC ó inferiores a 5 ºC. Como se ha demostrado, son especialmente adecuados para el procedimiento según invención los tratamientos con intercambiadores de iones con una temperatura entre 0 y -10 ºC.

También se ha demostrado que el procedimiento según invención en contra de los informes de la técnica actual, especialmente en contra de los resultados de Zolton et al. (1985), puede aplicarse con éxito incluso con índices de pH inferiores a 7,5 o bien 7,2, es decir en el rango neutro o bien ácido.

Una variante preferida del procedimiento según invención consiste en realizar el tratamiento del material biológico con el intercambiador de iones, especialmente con el intercambiador de aniones, con un índice pH de 5,6 a 7,2, de preferencia entre 6,0 y 6,4, especialmente con pH 6,2.

El tratamiento de la solución acuosa del material biológico con el intercambiador de aniones se realiza, de preferencia, durante un tiempo de 1 minutos a 20 horas, especialmente durante 4 a 8 horas, pudiendo llevarse a cabo la incubación bien según el procedimiento por cargas o según un sistema continuo.

Con el procedimiento según la invención se puede obtener un material biológico que es seguro, libre de patógenos moleculares y/o víricos, pudiendo eliminarse los patógenos esencialmente por completo. Así se observó, en función de la concentración de etanol añadida, una eliminación del virus esencialmente completa. Mediante el procedimiento de un solo paso según invención se consigue un factor de reducción de patógenos de, preferentemente, en un factor de 10-5,5, especialmente preferido de 10-7 .

Las condiciones óptimas de adsorción en la cromatografía de intercambiador de iones pueden optimizarse fácilmente por cualquier técnico, según la substancia biológica a obtener o bien según el virus a adsorber, en función del correspondiente disolvente orgánico, haciendo uso de las enseñanzas de la presente invención.

El presente procedimiento también es adecuado de forma excelente para una combinación con otros pasos de desactivación o reducción de patógenos, como son el tratamiento con calor y/o detergente, tratamiento por irradiación o filtración, donde la nanofiltración según la AT 403 477 B puede combinarse, de especial preferencia con el procedimiento según invención.

El presente procedimiento es especialmente adecuado para la realización de preparados de inmunoglobulina, sin embargo también puede aplicarse específicamente para obtener preparados farmacéuticos, factores sanguíneos, como por ejemplo el factor II, factor IIa, factor VII, factor IX, factor X, la proteína S, proteína C o vWF.

Con ayuda de los siguientes ejemplos se explica más en detalle la presente invención sin, sin embargo, quedar limitada a éstos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1:Desenriquecimiento de virus de soluciones con contenido de IgG (actualmente según el solicitante el mejor método para la realización de la invención)

Se ajustó una fracción COHN II+III con contenido de inmunoglobulina con etanol hasta alcanzar una concentración final de 10 % al 14 % respectivamente, y la solución se templó hasta -3º a -1º. A continuación se mezcló la solución con los virus de ensayo indicados en la Tabla 1. Por cada gramo de proteína se añadieron

0,5 g de DEAE-Sephadex A-50, el pH se ajustó a 6,2 + 0,1 y se incubó agitando durante 6 horas manteniendo una temperatura y un índice pH constantes. La suspensión del intercambiador se separó a continuación por filtración en profundidad y se determinó el título de virus en el filtrado. El coeficiente de 5 desenriquecimiento de virus, expresado como reducción de la partícula infecciosa del virus en potencia de diez, se encuentra recopilado en la Tabla 1 y se determinó mediante titulación de virus o PCR. Como se puede ver de la tabla, este procedimiento conduce a un desenriquecimiento en una potencia de diez de 2 a más de 6 - dependiendo del virus de ensayo utilizado. El rendimiento de IgG en el

10 sobrante era de >70 %. En ensayos de control, en los que la incubación del virus de ensayo se realizó de forma análoga sin adición del intercambiador de aniones, no se pudo observar ningún efecto viricida del etanol bajo estas condiciones.

IgG en el procedimiento OAl a.m. DEAE-Sephadex y Filtración

etanol

10 % 11 % 12 % 13 % 14 %

rendim.

100 % 100 % 100 % 100 % 97 %

IRF [log]

PRV

n.d. n.d. 2,95 >5,44 >5,40

MVM

2,76 3,73 >6,76 n.d. >6,27

FSME

n.d. n.d. 5,00 5,96 n.d.

BVDV

n.d. n.d. 1,80 2,61 >4,35

HCV

n.d. >3,94 >5,32 n.d. n.d.

HAV

n.d. 3,91 >5,95 n.d. n.d.

HGV

n.d. n.d. 4,03 n.d. n.d.

HIV

n.d. n.d. >4,30 n.d. n.d.

ERV

n.d. n.d. >5,10 n.d. n.d.

15

PRV = MVM = FSME = BVDV = virus pseudorabies minute virus de ratón / parvovirus virus de meningo-encefalitis de principios de verano virus de diarrea bovina

20

HCV = HAV = HGV = HIV-1= virus de hepatitis C virus de hepatitis A virus de hepatitis G virus-1 de inmunodeficiencia humana

ERV n.d.

= = virus de rinoneumonitis equina no realizado

Ejemplo 2:Desenriquecimiento de parvovirus de soluciones con contenido de IgG

Se mezcló una fracción COHN III con contenido de inmunoglobulina con un contenido de etanol del 12 % de forma análoga que en la descrita en el ejemplo 1, 5 con parvovirus B19. La carga total en el material de partida mezclado con B19 era de 1011,3 DNA-copias/ml. El paso de adsorción con DEAE-Sephadex con la subsecuente filtración se realizó según se describe en el Ejemplo 1. Por medio de PCR, según se describe en la AT 403 477 B, se determinaron las DNA copias/ml en el filtrado. No se pudo demostrar la presencia de DNA específicos de parvovirus

10 en el filtrado. Teniendo en cuenta el límite de comprobación se alcanzó con el procedimiento según invención un factor de reducción del virus en un factor menor de 10-7,4.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para el desenriquecimiento de patógenos víricos y moleculares en un material biológico que contiene una o varias substancias biológicas a obtener, caracterizado porque en un procedimiento de adsorción de un solo paso sin elución adicional

    el material biológico se mezcla con un disolvente orgánico,

    el material biológico mezclado con el disolvente se pone en contacto con un intercambiador de iones, donde los patógenos son adsorbidos en el material de intercambiador de iones y donde, como mínimo, una de las substancias biológicas a obtener no entra en ninguna interacción o solamente en una interacción reducida con el intercambiador de iones, y

    el intercambiador de iones con los patógenos adsorbidos se separa del material biológico, obteniéndose un preparado de la substancia biológica desenriquecido de virus.

2. 2.

   Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como material de intercambio de iones se utiliza un intercambiador de aniones, de preferencia un intercambiador de aniones del tipo DEAE, especialmente DEAE-Sephadex.

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el disolvente orgánico se utiliza en una concentración del 5 al 20 % (v/v), de preferencia en una concentración del 10 al 15 % (v/v), especialmente en una concentración del 12 al 14 % (v/v).

4. 4.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como disolvente orgánico se utiliza un alcohol mono o polivalente, especialmente etanol.

5. 5.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la incubación con el intercambiador de iones se realiza a una temperatura inferior a 10 ºC, de preferencia inferior a 5ºC, especialmente entre 0 y -10 ºC.

6. 6.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la incubación con el intercambiador de iones se realiza con un índice pH entre 5,2 y 7,2, de preferencia entre 6,0 y 6,4, especialmente de aproximadamente 6,2.

   5 7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la incubación con el intercambiador de iones se realiza durante 1 a 20 horas, de preferencia 4 a 8 horas, donde la incubación se lleva a cabo, bien según el procedimiento por cargas bien según el sistema continuo.
7. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado 10 porque como substancias biológicas se obtienen factores sanguíneos.
8. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la separación del complejo de intercambiador de iones / patógenos se realiza mediante penetración del material biológico a través de un filtro.