ES2197165T3 - Mutantes de pro-uroquinasa. - Google Patents
Mutantes de pro-uroquinasa.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A MUTANTES DE LA PRO-UROQUINASA TROMBOLITICAMENTE ACTIVOS (PRO-UK) QUE COMPRENDEN LA SECUENCIA DE AMINOACIDO DE PRO-UK NATIVA, PERO QUE INCLUYEN UNA MUTACION QUE PROVOCAN QUE LOS MUTANTES DE LA PRO-UK INDUZCAN MENOS FIBRINOGENOLISIS Y ACTIVACION PLASMINOGENICA NO ESPECIFICA QUE LA PRO-UK NATIVA, Y TIENEN AL MENOS UNA ACTIVIDAD INTRINSECA MENOR DEL PLIEGUE 10 QUE LA PRO-UK NATIVA, Y TIENEN SUBSTANCIALMENTE LA MISMA PROMOCION DE FIBRINA Y ACTIVIDAD TROMBOLITICA DESPUES DE LA ACTIVACION DE LA PLASMINA COMPARADA CON LA PRO-UK NATIVA CUANDO SE ADMINISTRA A UN PACIENTE. LA FIGURA DESCRIBE EL PLIEGUE FLEXIBLE (AMINOACIDOS 297-313), EN EL CUAL SE PRODUCE LA SUSTITUCION.
Description
Mutantes de pro-uroquinasa.
La invención se refiere a nuevas formas de
pro-uroquinasa útiles para la terapia
trombolítica.
La pro-uroquinasa
(pro-UK) es una forma de una sola cadena de un
precursor de serin-proteasa, que se activa por
plasmina para formar uroquinasa de cadena doble (UK). Tanto la
pro-UK como la UK activan, o convierten, al
plasminógeno zimógeno a la enzima activa plasmina, que degrada una
serie de proteínas plasmáticas incluidas en coágulos de fibrina. En
consecuencia, tanto la pro-UK como la UK se han
usado para el tratamiento de la tromboembolia.
Existen ciertos efectos secundarios indeseables
que pueden estar provocados por tal tratamiento. Tanto la
pro-UK como la UK pueden provocar activación no
específica del plasminógeno, lo que conduce a la degradación de
fibrina, fibrinógeno (fibrinogenolisis), y de ciertas partes de las
plaquetas y de las paredes de los vasos sanguíneos, y diatesis
hemorrágica. La pro-UK es más selectiva, es decir,
específica, en su activación del plasminógeno a dosis más bajas que
la UK, debido a que activa sólo el plasminógeno unido a fibrina,
mientras que la UK activa cualquier plasminógeno. Sin embargo, la
especificidad de la pro-UK a bajas dosis se puede
perder cuando se administra a las dosis elevadas requeridas para la
eficacia trombolítica.
La pro-UK tiene ciertas
propiedades que hacen que se parezca tanto a un zimógeno
``inactivo'' como a una enzima ``activa''. Por un lado, las
propiedades zimogénicas de la pro-UK incluyen su
comportamiento inerte en plasma, su fracaso para formar complejos
inhibidores estables en dodecilsulfato de sodio, y su resistencia
relativa a la inhibición por fluorofosfato de diisopropilo (DFP) o
Glu-Gly-Arg clorometilcetona, que
son inhibidores químicos potentes de UK. La pro-UK
también tiene una actividad activadora de plasminógeno 200 veces
menor que la UK.
Por otro lado, las propiedades enzimáticas de la
pro-UK incluyen su actividad intrínseca medible
tanto frente a sustratos sintéticos como frente a plasminógeno, que
es 10^{4,0-4,3} veces mayor que otros zimógenos
de serin-proteasa, tales como tripsinógeno o
quimiotripsina. La pro-UK también tiene una
constante de Michaelis (K_{M}) menor que la UK frente a
plasminógeno, y, en presencia de fragmento E_{2} de fibrina, la
pro-UK ha demostrado que es completamente activa
frente a plasminógeno sin que sea activada a la forma de UK.
A pesar de su uso potencial como agente
trombolítico, cuando se administra en dosis terapéuticas, la
actividad enzimática intrínseca elevada de la pro-UK
inicia la activación indeseable no específica sistémica del
plasminógeno como se ha señalado anteriormente. Como resultado, la
terapia trombolítica con pro-UK aún se puede asociar
con efectos secundarios perniciosos.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que se pueden diseñar formas mutantes de
pro-UK que muestran una atenuación de la actividad
enzimática intrínseca, no específica, indeseable, de la
pro-UK de origen natural, nativa, pero que son al
menos tan efectivas como la pro-UK nativa en su
capacidad para ser promovidas (activadas) por fibrina (fragmento Y
ó E_{2}), para convertir plasminógeno en plasmina, y para
permanecer activas trombóticamente tras la conversión en UK de dos
cadenas. Como resultado, estos mutantes de pro-UK
provocan una menor activación no específica de plasminógeno y unas
menores complicaciones hemorrágicas que la pro-UK
nativa cuando se administran a un paciente.
Estos mutantes de pro-UK son
agentes trombolíticos superiores comparados con
pro-UK nativa, debido a que son promovidos por
fibrina en el mismo grado que la pro-UK nativa, y
por lo tanto tienen la misma eficiencia fibrinolítica, pero tienen
una especificidad muchísimo mayor por el plasminógeno unido a
fibrina que la pro-UK nativa, debido a que son
verdaderamente inertes en el plasma. Como resultado de este
comportamiento inerte, estos mutantes de pro-UK se
pueden administrar a un paciente a dosis más eficaces y mayores que
la pro-UK nativa.
En consecuencia, la invención proporciona un
mutante de pro-UK trombolíticamente activo que
tiene la secuencia de aminoácidos de la pro-UK
nativa, en el que la secuencia incluye una mutación que provoca que
el mutante de pro-UK induzca menos fibrinogenolisis
y menos activación no específica de plasminógeno que la
pro-UK nativa, cuando se administra a un paciente.
La mutación es preferiblemente una sustitución de un aminoácido
nativo, normalmente en la secuencia de aminoácidos de la
pro-UK nativa, por un nuevo aminoácido, lo que
provoca que el mutante de pro-UK tenga al menos una
actividad intrínseca 10 veces menor que la pro-UK
nativa, y que tenga sustancialmente la misma promoción por fibrina
y actividad trombolítica tras la activación por plasmina, comparadas
con la pro-UK nativa, cuando se administra a un
paciente.
Tal como se usa en la presente memoria, el
término ``nativo'' significa una forma de origen natural, o de tipo
salvaje, de una proteína, o un aminoácido en una proteína de origen
natural. Un ``nuevo'' aminoácido es aquel que no está localizado
normalmente en una localización dada dentro de una proteína nativa.
Como se usa en este documento, el término ``mutación'' incluye la
sustitución de un aminoácido nativo por un solo nuevo aminoácido, o
la sustitución de dos o más aminoácidos nativos por dos o más nuevos
aminoácidos.
En particular, la mutación puede ser una
sustitución de un aminoácido nativo por un nuevo aminoácido,
normalmente en el bucle flexible (aminoácidos 297 a 313) de la
pro-UK nativa. Por ejemplo, se puede sustituir
Lys^{300}, Gly^{299} y/o Glu^{301} por el nuevo aminoácido,
por ejemplo, con alanina o histidina. Además, se puede sustituir
Lys^{313} por el nuevo aminoácido, por ejemplo, con alanina o
histidina, o Tyr^{306}, por ejemplo, con glicina.
Además, la mutación puede ser una sustitución de
Ala^{175} por el nuevo aminoácido, y Tyr^{187} por un segundo
nuevo aminoácido, para formar una tríada zimogénica en el mutante
de pro-UK. Por ejemplo, el nuevo aminoácido puede
ser serina, y el segundo nuevo aminoácido puede ser histidina. La
invención también ofrece mutaciones en combinación, tal como la
introducción de dos mutaciones para formar la tríada zimógena, y que
incluye adicionalmente una sustitución de Lys^{300} por un tercer
nuevo aminoácido, y de Glu^{301} por un cuarto nuevo aminoácido.
Tal mutante tendría, por ejemplo, serina como el nuevo aminoácido,
histidina como el segundo nuevo aminoácido, alanina o histidina como
el tercer nuevo aminoácido, y alanina como el cuarto nuevo
aminoácido.
La invención proporciona además una molécula de
ADN, por ejemplo, una molécula de ADN recombinante, que codifica
cualquiera de los mutantes de pro-UK descritos en
este documento. Tales mutantes pueden incluir sustituciones únicas,
dobles o múltiples. La invención también incluye una célula, por
ejemplo, una célula de mamífero, bacteriana o de levadura,
transformada con tal molécula de ADN. La invención también ofrece un
procedimiento para obtener los mutantes de pro-UK
descritos en este documento transformando una célula con una
molécula de ADN que codifica un mutante de pro-UK,
cultivando las células para expresar el mutante, y aislando al
mutante.
Además, la invención proporciona un procedimiento
para tratar la tromboembolia en un paciente, que comprende
administrar al paciente una cantidad trombolítica de cualquiera de
los mutantes de pro-UK descritos en este documento.
Como se usa aquí, la expresión ``cantidad trombolítica'' es aquella
cantidad de un mutante de pro-UK que lisará
coágulos de fibrina en el paciente sin inducir hemorragia
sistémica.
Otras características y ventajas de la invención
serán manifiestas a partir de la siguiente descripción detallada, y
a partir de las reivindicaciones.
En primer lugar se describirán brevemente los
dibujos.
Dibujos
La Fig. 1 es una vista esquemática de la
estructura de aminoácidos de pro-UK, que muestra el
bucle flexible y diversos aminoácidos específicos.
La Fig. 2a es un modelo tridimensional
(3-D) generado por ordenador de
pro-UK en la conformación ``inactiva'', que muestra
el sitio activo (Ser^{356}, His^{204} y Asp^{255}, en rojo
\xxv), y la Lys^{300} y Lys^{313} (amarillo
\xxc) del denominado ``bucle flexible'' (en azul
\xxh) que no interactúa con Asp^{355} (verde
\xxd).
La Fig. 2b es un modelo en 3-D
generado por ordenador de pro-UK en la conformación
``activa'', que muestra el sitio activo (Ser^{356}, His^{204}, y
Asp^{255}, en rojo
\xxv), y la Lys^{300} y Lys^{313} (amarillo
\xxc) del denominado ``bucle flexible'' (en azul
\xxh) que interactúa con Asp^{355} (verde
\xxd).
La Fig. 2c es un modelo en 3-D
generado por ordenador de UK de cadena doble, que muestra el sitio
activo (Ser^{356}, His^{204}, y Asp^{255}, en rojo
\xxv), Asp^{355} (verde
\xxd) y el residuo terminal neoamínico roto Ile^{159} (violeta
\xxm).
La Fig. 3 es una vista esquemática que muestra el
denominado ``sistema de transferencia de carga'' que incluye
Ser^{356}, His^{204}, y Asp^{255}, y un ``puente salino''
entre Asp^{355} e Ile^{159}.
La Fig. 4 es una representación esquemática de
una forma de mutagénesis dirigida a oligonucleótidos adecuada para
crear los mutantes de pro-UK de la invención.
La Fig. 5 es un mapa esquemático del vector de
expresión pED de ARNm dicistrónico, que es adecuado para la
expresión de los mutantes de pro-UK en células de
mamíferos.
Aún no se han determinado las estructuras
tridimensionales (``3-D'') de UK y
pro-UK. Sin embargo, se sabe que la cadena B de
pro-UK/UK (que es el dominio de proteasa) es
significativamente homóloga con tripsina y quimiotripsina, y sus
precursores tripsinógeno y quimiotripsinógeno, respectivamente,
cuyas estructuras 3-D son bien conocidas a partir
de cristalografía de rayos X. Puesto que estas homologías son
mayores que 30%, el alineamiento de la cadena principal de
pro-UK/UK con estas moléculas está dentro de
alrededor de 1,0 \ring{A} o menos para los residuos del núcleo.
Por lo tanto, la estructura predicha de pro-UK/UK
es digna de confianza.
``Homología'' para secuencias de aminoácidos se
refiere a la igualdad o porcentaje de identidad entre dos o más
secuencias de aminoácidos. La homología de dos proteínas dadas se
puede determinar, por ejemplo, usando un software de análisis de
secuencias (por ejemplo, el Sequence Analysis Software Package of
the Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI).
Los valores del porcentaje de homología se asignan a emparejamientos
exactos así como a secuencias con sustituciones conservativas de
aminoácidos, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido por otro
aminoácido, similar, que da como resultado muy poco cambio o
ninguno en las propiedades y actividad de la proteína
resultante.
Los mutantes de pro-UK se
diseñaron basándose en la homología estructural de
pro-UK/UK con tripsina (tripsinógeno) y
quimiotripsina (quimiotripsinógeno), y en el descubrimiento de que
la especificidad por la fibrina de la pro-UK está
mediada por su promoción selectiva mediante el fragmento E_{2} de
fibrina, Liu & Gurewich, Biochemistry,
31:6311-6317 (1992), que induce un cambio
conformacional particular en Glu-plasminógeno. Para
diseñar los mutantes de pro-UK, se ha desarrollado
un modelo por ordenador de la estructura en 3-D del
dominio de proteasa (la cadena B) de pro-UK/UK
basándose en las coordenadas espaciales para la cadena principal
polipeptídica de quimiotripsinógeno y quimiotripsina,
respectivamente, suplementado con las estructuras de elastasa y
tripsina (tripsinógeno). También se han usado dos programas de
modelos moleculares: CHARMM, un programa para la minimización de la
energía macromolecular y cálculos dinámicos, que fue desarrollado
por el departamento de química de la Universidad de Harvard, y se
describe en Brooks et al., J. Comp. Chem., 4:187-217
(1983), y QUANTA® , que fue desarrollado por Silicon Graphics, Inc.
(San Francisco, CA, USA).
Como se muestra en las Figuras 1, 2a y 2b, este
modelo muestra claramente la estructura tridimensional de la cadena
B (dominio de proteasa) de la pro-UK. El modelo está
construido por dos subdominios que son estructuras de
\beta-barril similares a la estructura de
quimiotripsina (quimiotripsinógeno), y tiene las siguientes
características. La coordenada espacial de cada átomo en esta
cadena B está bien definida. El Ile^{159}, que está en la
superficie de la molécula, está enlazado covalentemente al péptido
130-158 de la cadena A. El ``dominio de
activación'' de pro-UK comprende tres secuencias
(localizaciones 297-313, 344-353, y
376-383 de aminoácidos). La secuencia
297-313 forma el ``bucle flexible'' (azul
\xxhen las Figuras 2a y 2b) que es menos flexible que un bucle similar de quimiotripsinógeno o tripsinógeno, pero aún es ``bamboleante''. Cuando el bucle flexible está en una cierta conformación, el grupo amino cargado positivamente en \varepsilon de la Lys^{300} (amarillo
\xxc) en el bucle interacciona con el grupo carboxilo, cargado negativamente, de Asp^{355} (verde
\xxd). Esta interacción lleva al sitio activo Ser^{356} casi a la posición ideal en la que el hidroxilo de Ser^{356} está en la posición más favorable para la interacción con el sistema de transferencia de carga que incluye los otros dos residuos principales del sitio activo: una histidina y un ácido aspártico (rojo en las Figuras 2a y 2b). La Lys^{313} (amarillo
\xxc) también interacciona con Asp^{355} desde la otra dirección. Por lo tanto, el sitio activo y la cavidad de unión del sustrato del dominio de proteasa de pro-UK se forman predominantemente, por un momento, sin conversión a la forma de cadena doble. Sin embargo, puesto que la probabilidad de esta ``conformación activa'' es sólo 0,5%, la pro-UK de una sola cadena, sin romper, tiene sólo alrededor de 0,5% de la actividad de la forma activa de cadena doble.
Como se muestra en las Figuras 2c y 3, en la
forma de cadena doble, el grupo neoamínico de Ile^{159} roto
(violeta
\xxmen la Figura 2c) forma un ``puente salino'' estable con Asp^{355} (verde
\xxden la Figura 2c), lo que estabiliza el domino de activación y hace a la molécula completamente activa. Como alternativa, si una fuerza externa, tal como una interacción procedente de plasminógeno unido al fragmento E_{2}, estabiliza la conformación activa del bucle ``flexible'' (amarillo
\xxcen la Figura 2c), la forma sin romper de una sola cadena de pro-UK también será completamente activa.
Adicionalmente, el modelo de
pro-UK no incluye la denominada ``tríada
zimogénica'' de quimiotripsinógeno (una red de enlace de hidrógeno
formada por Asp^{194}, His^{40}, y Ser^{32}), debido a que
esta tríada no está presente en la pro-UK nativa. La
His^{40} y Ser^{32} de la tríada quimiotripsinogénica son
sustituidas en pro-UK por Tyr^{187} y Ala^{175},
respectivamente. La ``tríada zimogénica'' es importante para
estabilizar la conformación inactiva de una región del sitio activo
(el oxianión completo) de quimiotripsinógeno.
Usando este modelo, se seleccionaron y se
hicieron modelos de sustituciones específicas de aminoácidos en el
dominio de proteasa de pro-UK y de UK para diseñar
mutantes específicos de pro-UK, y luego se hicieron
constructos, se expresaron y se caracterizaron algunos de estos
mutantes. A continuación se describen cuatro clases de mutaciones
que cumplen los objetivos deseados de una activación disminuida no
específica de plasminógeno y una actividad trombolítica
completamente retenida.
Mutaciones de Lys^{300} de
Pro-UK dirigidas al
sitio
Los estudios que usan cristalografía de rayos X
han ayudado a explicar porqué la forma zimógena de una sola cadena
de la mayoría de las proteasas ``no tiene'' actividad, y cómo la
ruptura de un enlace sencillo induce la formación de una enzima
totalmente activa. Sin embargo, la pro-UK tiene más
activad intrínseca que la mayoría de otros zimógenos, pero menor
que el activador de plasminógeno tisular de una sola cadena
(SC-t-PA). En particular, el
tripsinógeno y quimiotripsinógeno sólo tienen alrededor de
10^{-6} de la actividad de sus respectivas formas enzimáticas de
cadena doble activadas. El SC-t-PA
tiene alrededor de 10^{-1,5} de la actividad de
t-PA de cadena doble. La pro-UK
tiene alrededor de 10^{-2,3} de la actividad de su derivado de
cadena doble, la UK.
Un aspecto principal de la activación de un
zimógeno de serin-proteasa a la enzima activa es el
movimiento del grupo \alpha-amino
neo-amino terminal del zimógeno en una cavidad
superficial del zimógeno en la que puede formar un denominado
``puente salino'' con un ácido aspártico adyacente en la secuencia
de aminoácidos a una serina en el sitio activo de la proteína. Esta
secuencia de acontecimientos se muestra esquemáticamente en la
Figura 3. El puente salino es un enlace iónico o una interacción
electrostática formada entre el grupo
\alpha-amino positivamente cargado del
neo-amino terminal de UK de cadena doble
(Ile^{159}), o un sustituto en pro-UK, y el grupo
carboxilo negativamente cargado de la cadena lateral del residuo de
ácido aspártico (Asp^{355}).
Esta formación del puente salino da como
resultado la torsión del hidroxilo de serina en una nueva posición
más favorable para la interacción dentro del sistema de
transferencia de carga, o de transferencia de protón, que es la
clave de la catálisis, y está formado por tres residuos principales
del sitio activo: His, Asp, y Ser (Figuras 2a-2c
(rojo
\xxv), y 3). La formación del puente salino también estabiliza lo que se ha denominado el ``dominio de activación'' de pro-UK que comprende tres secuencias (297-313, 344-353, y 376-383).
En los zimógenos inactivos tripsinógeno y
quimiotripsinógeno, estos dominios de activación no se representan
en cristalogramas de rayos X, lo que se ha atribuido a que no están
fijos en el espacio, sino más bien que están en un movimiento de
bamboleo. Estos dominios rodean la cavidad de unión al sustrato, lo
cual puede explicar la falta de unión de los zimógenos a los
sustratos. En las enzimas activadas tripsina y quimiotripsina, estos
dominios están fijos y se visualizan claramente en los
cristalogramas de rayos X, comoo se describe en Huber et al.
Acct. Chem. Res., 11:114-122
(1978).
En SC-t-PA, la
carga positiva del \varepsilon-amino de
Lys^{416} (numeración t-PA) parece proporcionar
un efecto de puente salino sustituto a través de Asp^{477}
(numeración t-PA) para mover el sitio activo
Ser^{478} (numeración t-PA) casi a la posición
ideal, como se describe en Heckel et al., J. Comp. Aided Mol.
Des., 2:7-14 (1988) y Peterson et al.,
Biochem., 29:3451-57 (1990). En
pro-UK, hay una Lys^{300} (numeración
pro-UK) en la misma posición que la Lys^{416} en
SC-t-PA. Se postula que el grupo
\varepsilon-amino positivamente cargado de la
Lys^{300} de pro-UK es un sustituto del grupo
\alpha-amino neo-terminal de
Ile^{159} de UK. Sin embargo, hay un Glu^{301} adyacente que
parece que atenúa su influencia. También hay un sitio de
glicosilación en el residuo Asn^{302}, así como un sitio de
fosforilación en el residuo cercano Ser^{303}. Esta disposición
puede explicar la provisión parcial (con relación a
SC-t-PA) de una actividad
intrínseca elevada (con relación a quimiotripsinógeno) de
pro-UK.
Basándose en estas consideraciones, se ha
clasificado un grupo de mutantes en el que el residuo Lys^{300}
y/o sus residuos circundantes están mutados a varios tipos
diferentes de residuos de aminoácidos para ajustar la interacción
electrónica entre esta posición y Asp^{355} (numeración
pro-UK), lo que reduce la actividad intrínseca tanto
como sea posible, pero retiene la capacidad de promover la fibrina
y la actividad de forma de cadena doble de pro-UK
nativa. Este grupo de mutantes se ilustra mediante los siguientes
mutantes de pro-UK numerados del 1 al 5. Estos
mutantes se crearon mediante las técnicas de mutagénesis dirigida
al sitio y expresión génica, que se describen a continuación.
Mutante
1
Se sustituyó la Lys^{300} en
pro-UK por alanina (Ala), un aminoácido neutro, que
no afecta al plegamiento de la molécula pero que se diseñó para
eliminar el puente salino entre la posición 300 y Asp^{355} para
reducir la actividad intrínseca. Una vez diseñado en el modelo por
ordenador, este mutante se creó y se analizó como se describe a
continuación. Los resultados mostraron que este mutante no tuvo
casi ninguna actividad intrínseca medible, y en consecuencia fue
extremadamente estable en el plasma, sin inducir la degradación del
fibrinógeno a una concentración mayor que 10 mg/ml incubado durante
alrededor de 24 horas. Esta estabilidad es al menos 10 veces mayor
que una concentración a la que la pro-UK nativa
indujo una degradación del 50% de fibrinógeno plasmático in
vitro. Esta actividad de la forma de cadena doble del mutante
(tras activación de la plasmina) fue atenuada (33% la de UK), así
como lo fue su promoción por el fragmento E_{2} de fibrina (40% la
de pro-UK).
Mutante
2
Como una segunda alternativa, se sustituyó la
Lys^{300} por histidina (His) en el modelo de
pro-UK. La histidina es capaz de adquirir un ion
hidrógeno para cargarse positivamente a un pH menor que 6,5, pero
no es tan fuerte como la carga \varepsilon-amino
en la lisina. En el modelo de pro-UK, el grupo
imidazol de His^{300} está empaquetado en el interior de la
molécula en un estado de energía menor que fuera de la molécula,
debido a que el grupo imidazol es más bien hidrófobo. Esto permite
que el grupo imidazol tenga una carga positiva puesto que mira
hacia Asp^{355}, lo que hace al medio ambiente local ácido. Por lo
tanto, existe un débil puente salino entre Asp^{355} e
His^{300} para hacer que el His^{300} se comporte como una
Lys^{300} débil. Puesto que la carga electrostática de His depende
del medio ambiente local, y la His^{300} está localizada en la
región del bucle flexible (297-313), como se
describe a continuación, el modulador (fragmento E_{2}) aún
regula la actividad intrínseca de pro-UK. Basándose
en los datos de Lys^{300 } \rightarrow Ala y en las
características de His comparadas con Lys, la actividad intrínseca
del Mutante 2 también debería ser 10 veces menor que la de la
pro-UK nativa, pero mayor que la del Mutante 1. Sin
embargo, tanto la actividad de la forma de cadena doble como la
capacidad para promover la fibrina se deben retener, y deben ser
mayores que las del Mutante 1, pero menores que las de
pro-UK nativa.
\newpage
Mutante
3
En el modelo de pro-UK, el
oxígeno del grupo carbonilo de Gly^{299}, en la cadena principal
de pro-UK, forma un enlace de hidrógeno con
Asp^{355}. Tal formación de enlace también existe en
quimiotripsinógeno y tripsinógeno. Cuando se sustituye el
Gly^{299} por His en el modelo, se forma un fuerte puente salino
entre His^{299} y Asp^{355}, que es más fuerte que el puente
formado entre His^{300} y Asp^{355}, y por lo tanto evita que se
forme este puente salino. También, el medio ambiente local de
His^{299} se ve menos afectado por cualesquiera cambios
conformacionales del bucle flexible de pro-UK que
por cambios del sitio activo, cavidad de unión al sustrato, u otras
áreas interiores. Por contra, el mutante de His^{300} (Mutante 2)
debería tener el comportamiento opuesto, es decir, debería estar más
regulado por cambios conformacionales del área del bucle. Basándose
en las características de His comparadas con Gly, la actividad
intrínseca y la actividad de la forma de cadena doble del Mutante 3
debería ser 2 veces mayor que las del mutante 2. Sin embargo, su
capacidad para promover la fibrina debería ser más de un 20% menor
que la del Mutante 2, pero más que la del Mutante 1.
Mutante
4
Cuando se sustituye Lys^{300} positivamente
cargado por una alanina neutra, la carga negativa de Glu^{301} se
hace demasiado fuerte para atraer el grupo
\alpha-amino de Ile^{159} desde su interacción
con Asp^{355}. Esto da como resultado una reducción de la
actividad trombolítica en la forma de cadena doble activada (UK) del
Mutante 1. Por lo tanto, se diseñó un mutante doble para resolver
este problema sustituyendo tanto a Lys^{300} como Glu^{301} por
alanina neutra. Basándose en este modelo, y en las características
de Ala neutra comparadas con Lys y Glu, el Mutante 4 debe tener
características casi idénticas a las del Mutante 1, pero debe tener
una actividad de la forma de cadena doble 2 veces mayor que la del
Mutante 1.
Mutante
5
Este mutante es una combinación de los Mutantes 2
y 4. Basándose en las características del Mutante 1 de
pro-UK con Ala^{300}, el residuo (300)
positivamente cargado es importante para promover tanto la
actividad intrínseca de la forma de una sola cadena como la
actividad de la forma de cadena doble. Por lo tanto, este mutante
doble, el Mutante 5, debe ser similar al Mutante 2 en la actividad
intrínseca y en la capacidad para promover la fibrina, pero debe
tener una mayor actividad de la forma de cadena doble.
Los Mutantes 1 a 5 muestran cómo la actividad
intrínseca, la actividad de la forma de cadena doble, y la
capacidad para promover la fibrina, se pueden ajustar comparado con
la pro-UK nativa. Estos ajustes se logran en los
presentes mutantes de pro-UK mediante las técnicas
combinadas de mutagénesis dirigida al sitio y diseño de modelos
estructurales. Estos mutantes logran esencialmente los tres
objetivos de (1) una degradación reducida del fibrinógeno (baja
actividad intrínseca), (2) una promoción inalterada de la fibrina
(capacidad retenida para promover la fibrina), y (3) una actividad
igual tras la activación por plasmina comparada con la
pro-UK nativa (actividad de la forma de cadena
doble). Por lo tanto, estos mutantes tendrán una elevada utilidad
terapéutica.
Otra estructura de pro-UK que es
crítica para la actividad intrínseca es el denominado ``bucle
flexible'' formado por los aminoácidos 297-313
(Figura 1, Figuras 2a y 2b (azul
\xxh)), que es el área más desordenada, o bamboleante, en todas las serin-proteasas y sus zimógenos. Esta región puede proporcionar un mecanismo para ciertas modulaciones de la función enzima/zimógeno.
Este bucle está roto en quimiotripsina, pero en
t-PA y pro-UK está implicado un
mutante de Lys^{416/300} en las actividades intrínsecas. Basándose
en el modelo de pro-UK/UK, se identificó una
conformación ``activa'' distinta de este bucle (azul
\xxhen la Figura 2b), que, en la pro-UK nativa, está en un equilibrio dinámico con otras diversas conformaciones ``inactivas''. En la conformación ``activa'', el único residuo positivamente cargado del bucle, Lys^{300}, está colocado de forma que encara al interior de la molécula para formar un puente salino con Asp^{355} (verde
\xxd), dando como resultado un sitio catalítico completamente activo. Por contra, en las conformaciones ``inactivas'', el bucle (azul
\xxhen Fig. 2a) se suelta para colocar la carga positiva de Lys^{300} enfrentada fuera del alineamiento con Asp^{355} (verde
\xxd), lo que hace inactivo al zimógeno.
La actividad observada de pro-UK
indica que el equilibrio favorece a las conformaciones inactivas,
con sólo un 0,5% en la conformación activa, que corresponde al
porcentaje de actividad intrínseca de pro-UK con
relación a su forma de cadena doble (UK), activa.
Estudios iniciales mostraron que, en el bucle
flexible, las cadenas laterales de tres residuos negativamente
cargados (Glu^{301}, Asp^{305}, y Glu^{310}) están siempre
localizados en el lado del bucle opuesto a Lys^{300}. Cuando las
cadenas laterales de los residuos negativamente cargados se
mantienen fuera de la molécula, el grupo
\varepsilon-amino de Lys^{300} tendrá una
elevada probabilidad para formar un puente salino con Asp^{355}.
En otras palabras, la conformación activa está favorecida cuando se
mantienen fuera de la molécula a tres residuos cargados
negativamente.
Cuando la pro-UK interacciona con
Glu-plasminógeno unido al fragmento E_{2}, las
fuerzas electrostáticas externas del complejo fragmento E_{2}/Glu-
plasminógeno estabilizan la conformación activa atrayendo estas tres
cadenas laterales cargadas negativamente (Glu^{301}, Asp^{305}
y Glu^{310}) fuera de la molécula. Por lo tanto, la Lys^{300} se
coloca enfrentándose al interior de la molécula, y forma un puente
salino con Asp^{355}. Como resultado, la pro-UK
se hace completamente activa sin convertirse a la forma de cadena
doble.
Una mutación del bucle flexible dirigida al sitio
que puede aumentar adicionalmente la flexibilidad del bucle,
reducirá la probabilidad de la conformación ``activa'' a menos de
0,5%. Si este mutante retiene una actividad similar a la forma de
cadena doble tras la conversión a la forma de cadena doble, y
retiene una capacidad similar para promover la fibrina comparada
con la pro-UK nativa, será un activador superior que
logre los tres objetivos propuestos. Tal mutante tendría una menor
actividad intrínseca en el plasma, pero sería completamente activa
en presencia de fibrina (fragmento E_{2}) y en la forma de cadena
doble.
Basándose en estas consideraciones, se ha
clasificado un segundo grupo de mutantes que reducen la
probabilidad de la conformación ``activa'', pero que retienen la
capacidad de inducción de la conformación ``activa'' por el complejo
del fragmento E_{2}/Glu-plasminógeno, así como la
actividad de la forma de cadena doble. Este grupo de mutantes se
ilustra mediante el siguiente mutante de pro-UK
numerado como 6.
Mutante
6
Basándose en el concepto de que la actividad
intrínseca de pro-UK es una función del equilibrio
entre las conformaciones ``activa'' e ``inactiva'', un aumento en
la flexibilidad del bucle debería disminuir la actividad intrínseca.
Por lo tanto, se diseñó un mutante Tyr^{306} \rightarrow Gly en
el que la estructura de espiral en \beta del bucle se rompe para
aumentar su flexibilidad. Como resultado, este mutante debe tener
una actividad intrínseca reducida, pero se debe conservar la
promoción por el fragmento E_{2}, la actividad de cadena doble, y
la activación por plasmina. Por lo tanto, el Mutante 6 debe tener
una buena utilidad terapéutica.
La Lys^{313} de pro-UK es otro
sustituto del grupo \alpha-amino neo- terminal de
UK. Como se muestra en las Figs. 1 y 2b, la Lys^{313} (amarillo
\xxc) se puede comportar como Lys^{300} para formar un puente salino con Asp^{355} (verde
\xxd) lo que también debería dar como resultado un aumento de la actividad intrínseca de la pro-UK. La interacción de Lys^{313} con Asp^{355} está regulada por el movimiento del bucle flexible. Por lo tanto, la eliminación de esta interacción reducirá adicionalmente la actividad intrínseca de pro-UK. Basándose en estas consideraciones, se han diseñado los siguientes mutantes 7 y 8.
Mutante
7
Como se muestra en las Figs. 1 y 2b, la
Lys^{313} (amarillo
\xxcen Fig. 2b) está localizada en el extremo del bucle flexible (297-313 en la Fig. 1, azul
\xxhen la Fig. 2b) y próxima a Asp^{355} (verde
\xxd). Similar a la Lys^{300}, su carga positiva \varepsilon- amino actúa como un sustituto del grupo \alpha-amino neo-terminal en UK para formar un puente salino con Asp^{355} desde una dirección opuesta a la de Lys^{300}. De forma ventajosa, este mutante no afecta a la actividad de la UK de cadena doble, puesto que el puente salino se rompe cuando el grupo amino neo- terminal (Ile^{159}) se ha generado para formar competitivamente otro puente salino con Asp^{355} en la UK de cadena doble.
Por contra, la Lys^{300} sí afecta a la
actividad de la forma de cadena doble, puesto que la interacción de
cargas entre Lys^{300} y Asp^{355} existe en la forma de cadena
doble y contribuye a la actividad de la forma de cadena doble. De
forma similar, también hay un residuo Lys en la posición del
aminoácido comparable de SC-t-PA,
que se ha demostrado está implicado en su elevada actividad
intrínseca.
Mutante
8
En este mutante, se usa His, que tiene una carga
positiva menor que la de Lys, para sustituir a Lys^{313}. Este
mutante se diseña como un ajuste del Mutante 7, basándose en una
razón fundamental similar a la descrita con respecto al Mutante 2
anterior.
Tanto el Mutante 7 como el Mutante 8 deben tener
una actividad intrínseca menor que la de pro-UK
nativa, debido a que evitan la formación del puente salino con la
Lys^{313}, pero mayor que la de los Mutantes 1 ó 2. Sus
actividades de la forma de cadena doble deben ser esencialmente las
mismas que las de UK nativa (forma de cadena doble). También se
debe retener su capacidad para promover la fibrina, y debe ser
próxima a la de pro-UK nativa. Por lo tanto, estos
mutantes también serían clínicamente útiles.
Las estructuras de rayos X de quimiotripsina y
quimiotripsinógeno muestran que la formación de una red de enlace
de hidrógeno por una ``tríada zimogénica'' (que consta de
Asp^{194}, His^{40} y Ser^{32}, numeración de quimiotripsina)
es importante para estabilizar una conformación inactiva de una
región del sitio activo (la cavidad oxianiónica) de
quimiotripsinógeno. Sin embargo, se ha encontrado que esta tríada
zimogénica no aparece ni en pro-UK ni en
t-PA. La His^{40} y Ser^{32} de la tríada
quimiotripsinogénica están representadas por Tyr^{187} y
Ala^{175} en pro-UK, respectivamente. Esta tríada
perdida también puede contribuir a una mayor actividad intrínseca
de pro-UK o de t-PA.
Como un enfoque alternativo para diseñar un
mutante de pro-UK con las características deseadas,
se puede crear una ``tríada zimogénica'' en pro-UK
nativa para reducir su actividad intrínseca sin afectar las otras
funciones necesarias para la actividad fibrinolítica.
Mutante
9
Este mutante doble se diseñó para introducir una
``tríada zimogénica'' similar a la encontrada en quimiotripsinógeno
en la pro-UK. Esta mutación debería reducir la
actividad intrínseca de pro-UK, pero no debería
afectar la promoción por el fragmento E_{2}, y la actividad de la
forma de cadena doble. Por lo tanto, este mutante también debería
lograr los tres objetivos mencionados anteriormente, y debería ser
útil como un agente trombolítico.
Se ha descubierto que la actividad intrínseca de
pro-UK depende de varias interacciones
intramoleculares diferentes, que incluyen 1) Lys^{300} o
Lys^{313} como un sustituto del grupo
\alpha-amino neo-terminal de UK en
la forma de una sola cadena; 2) la falta de una ``tríada
zimogénica''; y 3) la menor flexibilidad y la mayor probabilidad de
la conformación activa del bucle flexible (297-313).
En consecuencia, una mutación basada en sólo un aspecto no
eliminaría de forma máxima la actividad intrínseca, que es dañina,
sin disminuir la actividad de la forma de cadena doble y la
actividad promotora de la fibrina, que se requieren para la
actividad trombolítica. Sin embargo, una mutación múltiple que
afecte a dos o más de estas interacciones moleculares puede lograr
un mutante óptimo de pro-UK. Basándose en estas
consideraciones, se ha diseñado un grupo de mutantes en combinación
que se ilustra mediante los siguientes Mutantes 10 a 17.
Todos los Mutantes 10 a 17 tienen una tríada
zimogénica artificial, que disminuye la actividad intrínseca, y la
mayoría tiene la Lys^{313} neutralizada o que se ha hecho menos
positiva para evitar la formación, o debilitar la formación, del
puente salino, lo que disminuye también la actividad intrínseca. De
forma similar, varios de estos mutantes en combinación tienen la
Lys^{300} neutralizada o se ha hecho menos positiva. Las
mutaciones Tyr^{306} \rightarrow Gly reducen la probabilidad de
la conformación activa del bucle flexible proporcionando más
flexibilidad, y las mutaciones Glu^{301} \rightarrow Ala
interrumpen la interacción entre Ile^{159} y Asp^{355}, y por
tanto retienen la actividad de la forma de cadena doble.
Mutante 10: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Lys^{313} \rightarrow
Ala
Mutante 11: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Tyr^{306} \rightarrow Gly
Mutante 12: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Lys^{313} \rightarrow His
Mutante 13: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Tyr^{306} \rightarrow
Gly/Lys^{313} \rightarrow Ala
Mutante 14: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Lys^{300} \rightarrow
Ala/Glu^{301} \rightarrow Ala/Lys^{313} \rightarrow Ala
Mutante 15: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Lys^{300} \rightarrow
His/Glu^{301} \rightarrow Ala/Lys^{313} \rightarrow Ala
Mutante 16: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Lys^{300} \rightarrow
Ala/Glu^{301} \rightarrow Ala/Lys^{313} \rightarrow His
Mutante 17: Ala^{175} \rightarrow
Ser/Tyr^{187} \rightarrow His/Lys^{300} \rightarrow
His/Glu^{301} \rightarrow Ala/Lys^{313} \rightarrow His
Todos estos mutantes deben lograr de forma óptima
los tres objetivos propuestos de: (1) una baja actividad intrínseca
y alta estabilidad en plasma, (2) una capacidad inalterada para
promover la fibrina y una especificidad notablemente elevada por la
fibrina, y (3) la misma actividad de la forma de cadena doble tras
la activación por plasmina comparada con la pro-UK
nativa. Por lo tanto, estos mutantes deberían disolver
eficientemente los coágulos trombóticos a una dosis mayor que la
pro-UK nativa sin inducir complicaciones
hemorrágicas. Además, deberían ser útiles como medicamentos para
prevenir la formación de trombos de fibrina oclusivos, debido a que
son muy inertes en el plasma sin fibrina, y por tanto deberían ser
extremadamente seguros. En consecuencia, estos mutantes tienen una
elevada utilidad terapéutica.
Un tipo de mutagénesis dirigida al sitio que es
adecuada para producir los mutantes de pro-UK
descritos en este documento es la mutagénesis dirigida a
oligonucleótido, que permite la alteración específica de una
secuencia de ADN existente, por ejemplo, pro-UK
nativa. El gen que codifica la pro-UK nativa está
bien caracterizado y está disponible, por ejemplo, de Dr. David
Dichek (NIH) y Dr. Paolo Sarmientos (Primm, Milán, Italia). El
número ATCC es DNA 57329 o Bact/fago 57328. La secuencia también
está disponible de la base de datos por ordenador de NIH Protein
Identity Resource con el nombre UKHU. En la Fig. 1 se muestra la
secuencia de aminoácidos de pro-UK.
La mutagénesis dirigida a oligonucleótido se
logra sintetizando un cebador de oligonucleótido cuya secuencia
contiene la mutación de interés, hibridando el cebador a un molde
que contiene la secuencia nativa, y extendiéndolo con T4
ADN-polimerasa. El producto resultante es una
molécula heterodúplex que contiene un desemparejamiento debido a la
mutación en el oligonucleótido. La mutación se ``arregla'' con la
reparación del desemparejamiento en, por ejemplo, células de E.
coli. Los detalles de este procedimiento se describen, por
ejemplo, en Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular
Biology Capítulo 8.1 (Greene Publishing Associates 1989 Sup.
13), que se incorpora aquí como referencia.
La base de este procedimiento de mutagénesis
dirigida al sitio es el uso de un molde de ADN que contiene un
pequeño número de residuos uracílicos en lugar de timina (Fig. 4).
El ADN que contiene uracilo se produce en una cepa dut^{-}
ung^{-} de E. coli. En este mutante dut^{-}
ung^{-} combinado, la desoxiuridina se incorpora en el ADN en
lugar de timidina, y no se elimina. De este modo, se pueden hacer
crecer vectores que contienen la secuencia a cambiar en un
hospedante dut^{-} ung^{-} para preparar moldes de ADN
que contiene uracilo para la mutagénesis dirigida al sitio. Como se
muestra en la Fig. 4, el cebador de oligonucleótido mutado se
híbrida al molde de ADN y se trata con T4
ADN-polimerasa y T4 ADN-ligasa para
producir una molécula circular de dos hebras.
El cebador de oligonucleótido debe ser de calidad
elevada, es decir, se debe purificar de contaminantes de menor peso
molecular que surgen de la síntesis incompleta de ADN. En algunos
casos, especialmente para oligonucleótidos de más de 40
nucleótidos, puede ser necesaria la purificación mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida.
Para las reacciones in vitro típicas de
los protocolos de mutagénesis dirigida al sitio, los moldes de ADN
que contiene uracilo son indistinguibles de los moldes normales.
Puesto que dUMP en el molde tiene el mismo potencial codificante que
TMP, el uracilo no es mutagénico. Además, la presencia de uracilo
en el molde no es inhibidora para la síntesis in vitro de
ADN. De este modo, este ADN se puede usar como un molde para la
producción de una hebra complementaria que contiene la alteración
deseada de la secuencia de ADN, pero que contiene sólo TMP y no
residuos de dUMP.
Tras completar las reacciones in vitro, el
uracilo se elimina de la hebra del molde por la acción de uracil
N-glicosilasa, por ejemplo, o introduciendo los
productos no fraccionados de la reacción in vitro en células
de E. coli de tipo salvaje (dut}^{+} ung^{+}). El
tratamiento con la glicosilasa libera uracilo, produciendo sitios
apirimidínicos (AP) letales en la hebra del molde. De este modo, la
hebra del molde se hace biológicamente inactiva, y la mayoría de la
progenie proviene de la hebra complementaria ineficaz que contiene
la alteración deseada. Esto da como resultado la producción
altamente eficiente de ADN mutante (típicamente 50%), y permite que
se puedan seleccionar ADN mutantes mediante análisis de secuencia de
ADN.
Se han desarrollado varias variaciones de
mutagénesis in vitro mediante extensión del cebador que
producen mutantes con elevada eficiencia, según se describe en
Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-463
(1986). El procedimiento descrito aquí es un protocolo simple de
mutagénesis dirigida al sitio aplicado a un molde especial que
contiene uracilo que permite la recuperación rápida y eficiente de
ADN mutantes según se describió originalmente en Kunkel, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:488-492
(1985), y en Kunkel et al., Meth. Enzymol.,
154:367-382 (1987), que se incorporan todos
aquí como referencia. En principio, este mismo molde se puede
aplicar a la mayoría de los otros protocolos.
El Mutante 1 se creó ligando el gen de
pro-UK en el emplazamiento HindIII/XbaI del
plásmido M13mp18, transformando este plásmido en E. coli,
aislando ADNss, y llevando a cabo la mutagénesis dirigida a
oligonucleótido como se describió anteriormente.
Una vez se ha obtenido el ADN de
pro-UK con la mutación deseada, se debe clonar en
un vector de expresión adecuado. Este vector se debe introducir
entonces en una estirpe celular, por ejemplo, bacteriana, de
mamífero, o de levadura, para expresar el mutante de
pro-UK, que se cosecha del medio de cultivo, o de
las células de levadura, y entonces se purifica. Estas técnicas son
bien conocidas por los expertos normales en el campo de la biología
molecular, y se describen en detalle, por ejemplo, en Ausubel et al.
(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Capítulos 9
y 16, supra; y Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular
Cloning (2ª ed.), Capítulo 16 (Cold Spring Harbor, Laboratory
Press, 1989, que se incorporan aquí como referencia.
Hay varias maneras en las que se puede introducir
el gen de pro-UK mutante en una estirpe celular de
mamífero. Un procedimiento implica la transfección de un vector en
células de ovario de hámster chino (``CHO''). En este procedimiento,
el gen de pro-UK mutante se cotransfecta con un
marcador seleccionable, se integra establemente en cromosomas de la
célula hospedante, y subsiguientemente se amplifica. El sistema
celular de CHO se prefiere debido a que permite la producción de
grandes cantidades de pro-UK mutante durante largos
períodos de tiempo. Las estirpes celulares tales como la CHO DXB11 o
CHO DG44 están disponibles de Lawrence Chasim., Universidad de
Columbia. La estirpe celular CHO GRA está disponible de Randall
Koufman, Genetics Institute.
Otro procedimiento de expresión implica la
transfección del vector que incluye el ADN mutante en un sistema de
expresión de E. coli PET-19B (Novagen,
Madison, WI). Por ejemplo, tras la mutagénesis dirigida al sitio,
se secuenció el ADN que codifica al Mutante 1 (Lys^{300}
\rightarrow Ala) para asegurarse de que había ocurrido la
mutación, y entonces se ligó en el emplazamiento
NdeI/XhaI de PET-19B, un sistema de
expresión génica de E. coli altamente eficiente (Novagen,
Madison, WI), y se transformó en E. coli. La E. coli
transformada se cultivó y se indujo a que expresara el mutante de
pro-UK mediante adición del inductor IPTG al log de
la fase.
Una vez se introdujo un vector en una estirpe
celular de mamífero, también es deseable aumentar la expresión de
la proteína deseada, por ejemplo, la pro-UK mutante,
seleccionando mayores números de copias del ADN transfectado
dentro del cromosoma del hospedante. La coamplificación del ADN
transfectado da como resultado un aumento de 100 a 1000 veces de la
expresión en la proteína codificada por el ADN transfectado. Hay más
de 20 genes seleccionables y amplificables que se han descrito en
la bibliografía, pero el más experimentado y el de mayor éxito ha
sido con la selección con metotrexato y amplificación de genes de
dihidrofolato-reductasa transfectados. Por ejemplo,
se pueden usar células de CHO deficientes en
dihidrofolato-reductasa para obtener un nivel
elevado de expresión de genes de pro-UK mutantes a
través de la coamplificación mediante selección de la resistencia a
metotrexato.
La serie pED de vectores dicistrónicos se puede
usar para obtener un nivel elevado de expresión de un gen diana en
células establemente transfectadas (Fig. 5). Estos vectores llevan
una secuencia de clonación para la inserción de un gen diana, por
ejemplo, el gen de pro-UK mutante, seguido del gen
marcador seleccionable y amplificable,
dihidrofolato-reductasa (``DHFR''). Se seleccionan
células de CHO deficientes en DHFR transformadas con el vector
apropiado, por su capacidad para crecer en un medio libre de
nucleósidos. La ciclación selectiva subsiguiente en presencia de
concentraciones crecientes de metotrexato, que es un potente
inhibidor de la función de DHFR, da como resultado la amplificación
del ADN integrado y la expresión aumentada del producto génico
deseado. Los vectores pED mostrados en la Fig. 5 se describen en
Kaufman, et al., Nucl. Acids. Res.,
19:4485-4490 (1991), que se incorpora aquí
como referencia.
Las células de CHO se pueden transfectar con los
genes de pro-UK mutante y de DHFR en un vector
adecuado, por ejemplo, pED, usando electroporación, fosfato de
calcio, o técnicas mediadas por liposomas, que se describen con
detalle en Current Protocols in Molecular Biology. Se
prefiere el tratamiento con fosfato de calcio seguido de choque con
glicerol para las células CHO DXB11. Las células transfectadas se
colocan entonces en un medio selectivo, y tras varios días de
crecimiento, se recoge un gran número de colonias sanas con
aproximadamente 500 células para amplificación. Las colonias
seleccionadas se hacen crecer en placas separadas antes de la
amplificación.
Antes de amplificar los transfectantes estables,
se debe analizar el ADN celular mediante análisis Southern, o se
debe analizar el ARN usando un ensayo funcional para la
pro-UK mutante, a fin de asegurar que las células
han integrado el gen deseado de pro- UK mutante. Las células
seleccionadas se colocan entonces en una disolución de metotrexato,
que aumenta el nivel de selección, debido a que el metotrexato es
un potente inhibidor de DHFR. Repartiendo las células en este
medio, se están seleccionando células que producen niveles elevados
de DHFR. Esto se logra generalmente aumentando el número de copias
del gen de DHFR transfectado. Al mismo tiempo, también se aumenta en
el número de copias el gen de pro-UK mutante, que
fue cotransfectado con el gen de DHFR. Se usan niveles cada vez más
altos de metotrexato para seleccionar las células que tienen el
mayor número de copias del gen de DHFR, y por tanto del gen deseado
de pro-UK mutante. Cuando las células crecen en 20
a 80 \muM de metotrexato, las células deben contener 500 a 2000
copias del gen de pro-UK mutante transfectado.
Después de que la pro-UK mutante
es expresada mediante, por ejemplo, una estirpe celular de mamífero
o bacteriana, se debe extraer del medio de cultivo, y se debe
purificar. En el caso de un cultivo de células de levadura, las
células de levadura se deben primero disgregar, por ejemplo
mediante disgregación mecánica con perlas de vidrio para producir un
extracto celular que contiene la pro-UK mutante. La
purificación de la pro-UK mutante activa procedente
del medio de cultivo o de los extractos celulares generalmente
implica las etapas de 1) extracción en fase líquida/líquida o una
etapa de filtración inicial, 2) cromatografía de afinidad
hidrófoba, 3) cromatografía de afinidad por anticuerpo, y 4)
cromatografía de filtración en gel. Estas etapas son bien conocidas
por aquellos expertos normales en el campo de la biología
molecular, y se describen con detalle en Current Protocols in
Molecular Biology, Capítulo 10.
Las células de E. coli que contienen al
Mutante 1 de pro-UK se lisaron mediante
ultrasonidos, y el lisado se aplicó a una columna de cromatografía
de afinidad de níquel, puesto que la poli-His se
inserta antes del N-terminal de
pro-UK con un sitio de ruptura de enteroquinasa
(DDDDK). El mutante de pro-UK purificado se incubó
con enteroquinasa inmovilizada para eliminar la
poli-His N-terminal con una
recromatografía en una columna de afinidad de níquel. La muestra se
purificó adicionalmente mediante cromatografías a través de
columnas de S-Sepharose, de hidroxiapatito, de
Sephacryl S-200, y de benzamidina, tras
replegamiento, según se describe en Winkler y Blaber,
Biochemistry, 25:4041-4045 (1986), y
Orsini et al., Eur. J. Biochem.,
195:691-697 (1991). Se eliminó cualquier
cantidad pequeña de UK contaminante mediante tratamiento con
fluorofosfato de diisopropilo (DFP).
Las propiedades de los mutantes de
pro-UK se pueden comparar con
rec-pro-UK producida por E. coli, como
se hizo para el Mutante 1. Se analiza la actividad intrínseca, la
promoción por el fragmento E_{2} de la activación de
Glu-plasminógeno en puntos de tiempo tempranos, y
la sensibilidad a la activación por plasmina y lisis de coágulos en
un ambiente de plasma, para determinar un perfil de ensayo que se
puede obtener con pequeñas cantidades de los mutantes de
pro-UK, y que predice cómo el mutante se comportará
como agente trombolítico in vivo.
Estos ensayos se basan en un análisis cinético de
la hidrólisis de S2444, un sustrato sintético para UK, y la
activación de Glu-plasminógeno.
Hidrólisis de S2444: se incubaron 4,0 nM
de UK o 1,0 \muM de un Mutante 1 de pro-UK con un
intervalo de concentraciones (0,03, 0,06, 0,12, 0,18, 0,24, 0,3,
0,6, 1,2, 1,8 y 2,4 mM) de S2444 en fosfato de sodio 0,05 M, NaCl
0,15 M, BSA al 0,2% y Tween 80 al 0,01% (pH 7,8), a temperatura
ambiente. La velocidad de reacción se midió mediante el incremento
lineal de la densidad óptica (OD) con el tiempo, a 410 nm, frente a
una longitud de onda de referencia de 490 nm (410/490 nm) en un
lector de placas de microtitulación. El Mutante 1 casi no mostró
ninguna actividad de hidrólisis de S2444.
Activación de
Glu-plasminógeno: se obtuvieron curvas de tiempo
frente a la absorbancia de la activación de
Glu-plasminógeno midiendo el aumento de OD de una
mezcla de reacción con el tiempo a la longitud de onda seleccionada
de 410 nm y la longitud de onda de referencia de 490 nm (410/490
nm) en un lector de placas de microtitulación (Dynatech MR 5000).
La mezcla de reacción contenía S2251 (1,5 mM),
Glu-plasminógeno (1,0, 1,5, 2,5, 3,5, 4,5, 5,5, 7,5
y 10,0 \muM) y UK (0,2 nM) o Mutante 1 de pro-UK
(5,0 nM). Los agentes reaccionantes se completaron en fosfato de
sodio 0,05 M, NaCl 0,15 M, BSA al 0,2%, Tween-80 al
0,01%, pH 7,8, y se incubaron a temperatura ambiente. El Mutante 1
mostró una actividad de activación de plasminógeno de alrededor de 4
IU/mg, que es sólo un uno por ciento de la de
pro-UK nativa, que tiene una actividad de alrededor
de 400 IU/mg.
Se determinó la activación de
Glu-plasminógeno por el Mutante 1 de
pro-UK en presencia del fragmento
E-2 midiendo el aumento de la OD con el tiempo en
una mezcla de reacción a 410 nm frente a una longitud de onda de
referencia de 490 nm (410/490 nm) en un lector de placas de
microvaloración. La mezcla de reacción contenía 1,5 mM de S2251, un
sustrato sintético para plasmina, Glu-plasminógeno
(1,0, 2,0, 4,0 y 8,0 \muM), 5,0 \muM de fragmento
E-2, y 1,0 nM de Mutante 1 de pro-UK
en fosfato de sodio 0,05 M, NaCl 0,15 M, BSA al 0,2%,
Tween-80 al 0,01%, pH 7,8, a temperatura ambiente.
La activación de plasminógeno por el Mutante 1 en presencia del
fragmento E-2 de fibrina fue sólo de alrededor de
40% la de pro-UK nativa. La activación de
plasminógeno de pro-UK nativa es unas 250 veces
mayor, en presencia del fragmento E_{2} de fibrina, que en
ausencia de la promoción por fibrina.
El ensayo de sensibilidad a plasmina es un
estudio cinético de la activación del mutante de
pro-UK por Lys-plasmina. Se incubó
un intervalo de concentraciones de Mutante 1 de
pro-UK (0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4,
2,5, 3,5 y 5,0 \muM) con Lys-plasmina (0,1 nM) en
presencia de S2444 1,2 mM en Tris-HCl 0,05 M, NaCl
0,15 M, CaCl_{2} 0,01 M y Tween 80 al 0,01%, pH 7,4, a
temperatura ambiente a lo largo del tiempo. Se incubó el mismo
intervalo de concentraciones del mutante de pro-UK
sin plasmina, con S2444 como control. La plasmina 0,1 nM no tuvo
efecto directo sobre la hidrólisis de S2444 en la condición del
control. La cantidad de UK generada a partir del Mutante 1 de
pro-UK se midió mediante el aumento de la OD con el
tiempo a 410 nm frente a una longitud de onda de referencia de 490
nm (410/490 nm) en un lector de placas de microtitulación (MR 5000;
Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA). Se encontró que el
Mutante 1 tuvo una sensibilidad a plasmina similar a la de la
pro-UK nativa, que tiene una K_{M} de 2,44 \muM,
y una k_{cat} de 3,04 nanoM/min.
Se incubaron el Mutante 1 de
pro-UK (0-100 \mug/ml) o
pro-UK (10 \mug/ml) en 1,0 ml de plasma reunido
de banco, a 37ºC durante 6, 16 ó 24 horas, tras las cuales se
añadieron 0,2 ml de aprotinina (10.000 KIU/ml), y se midió el
fibrinógeno plasmático que quedaba tras un tiempo dado mediante el
procedimiento de coagulación con trombina. El Mutante 1 tuvo una
actividad fibrinogenolítica en plasma que fue alrededor de unas 100
veces menor que la de pro-UK nativa, es decir,
mientras que 1,0 \mug/ml de pro-UK nativa lisará
el 50% de 9,0 \mug/ml de fibrinógeno en 6 horas, se necesitaron
100 \mug/ml de Mutante 1 para lograr el mismo efecto.
Se prepararon coágulos marcados isotópicamente
con ^{125}I preparados a partir de 0,25 ml de plasma como se
describe en Gurewich et al., Clin. Invest., 73:1731
(1980). Los experimentos de la lisis de los coágulos se realizaron
en 3 ml de plasma con un intervalo de concentraciones de Mutante 1
de pro-UK (10, 20, 30, 40, 70 y 80 \mug/ml) o
t-PA (5, 10, 30, 50, 75, 100 y 150 ng/ml), y
ciertas combinaciones de t-PA y mutante de
pro-UK. La lisis se cuantificó a partir de la
liberación de la radioactividad, y se expresó como un porcentaje
del valor a la lisis completa frente al tiempo. La actividad de la
lisis de coágulos de fibrina por el Mutante 1 fue 50% la de
pro-UK nativa, es decir, mientras que 200 U/ml de
pro-UK nativa lisará un coágulo (1 cm^{3}) en 6
horas, fueron necesarias 12 horas de la misma cantidad de Mutante 1
para lograr el mismo efecto.
Los mutantes de pro-UK se usaron
y administraron como agentes trombolíticos de la misma manera que
pro-UK y UK. Las pro-UK mutantes se
mezclaron con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo,
disolución salina, y se administraron mediante inyección
intravascular, por ejemplo, intravenosa o intraarterial, o
subcutánea. Los mutantes de pro-UK se inyectan como
un bolo de aproximadamente 20 a 60 mg, o se pueden infundir
intravenosamente a una velocidad de 40-80 mg/hora.
Puesto que los mutantes de pro-UK tienen una
estabilidad en plasma muchísimo mayor, y son muchísimo menos
propensos a inducir la activación no específica de plasminógeno,
que la pro-UK nativa, también se pueden usar
mayores dosis, por ejemplo, infusiones de hasta 200
mg/hora.
Otras realizaciones también están comprendidas
dentro de las siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Liu, Jian-Ning Gurewich, Victor
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MUTANTES DE PRO-UROQUINASA
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fish & Richardson
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 225 Franklin Street
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: U.S.A.
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02110-2804
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA MEDIANTE ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5'', 1,44 Mb
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2 modelo 50Z o 55SX
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-2 (Versión 5.0)
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect (Versión 5.1)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/087.163
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 2 de Julio de 1993
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Fasse, J. Peter
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.983
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: 04353/003WO1
\vskip0.666000\baselineskip
- (IX)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (617) 542-5070
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 542-8906
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 200154
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN
DE LA SECUENCIA: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 411
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
Claims (17)
1. Mutante de pro-uroquinasa
(pro-UK) trombóticamente activo que consta
esencialmente de la secuencia de aminoácidos de
pro-UK nativa, en el que la secuencia de
aminoácidos de pro-UK nativa incluye un bucle
flexible (aminoácidos 297 a 313), y en el que dicho mutante
comprende una sustitución de un aminoácido que se encuentra
normalmente en dicho bucle flexible por un nuevo aminoácido, en el
que dicha mutación provoca que dicho mutante de
pro-UK induzca menos fibrinogenolisis y menos
activación no específica de plasminógeno, y que presente por lo
menos una actividad intrínseca 10 veces menor que la de
pro-UK nativa, y que presente sustancialmente la
misma promoción de fibrina y actividad trombolítica tras la
activación por plasmina comparadas con la pro-UK
nativa, cuando se administra a un paciente.
2. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 1, en el que se sustituye Lys^{300} por dicho
nuevo aminoácido.
3. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 2, en el que dicho nuevo aminoácido es alanina o
histidina.
4. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 2, en el que la Gly^{299} se sustituye por un
segundo nuevo aminoácido.
5. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 4, en el que dicho nuevo aminoácido es alanina o
histidina, y dicho segundo nuevo aminoácido es histidina.
6. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 2, en el que se sustituye Glu^{301} por un segundo
nuevo aminoácido.
7. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 6, en el que dicho nuevo aminoácido es alanina o
histidina, y dicho segundo nuevo aminoácido es alanina.
8. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 1, en el que se sustituye Lys^{313} por dicho
nuevo aminoácido.
9. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 8, en el que dicho nuevo aminoácido es alanina o
histidina.
10. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 1, en el que se sustituye Tyr^{306} por dicho
nuevo aminoácido.
11. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 10, en el que dicho nuevo aminoácido es glicina.
12. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 1, en el que dicha mutación es una sustitución de
Ala^{175} por un nuevo aminoácido, y Tyr^{187} por un segundo
nuevo aminoácido, para formar una tríada zimogénica en dicho mutante
de pro-UK.
13. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 12, en el que dicho nuevo aminoácido es serina, y
dicho segundo nuevo aminoácido es histidina.
14. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 12, en el que dicha mutación comprende además una
sustitución de Lys^{300} por un tercer nuevo aminoácido, y una
sustitución de Glu^{301} por un cuarto nuevo aminoácido.
15. Mutante de pro-UK según la
reivindicación 14, en el que dicho nuevo aminoácido es serina, dicho
segundo nuevo aminoácido es histidina, dicho tercer nuevo
aminoácido es alanina o histidina, y dicho cuarto nuevo aminoácido
es alanina.
16. Molécula de ADN que codifica el mutante de
pro-UK según la reivindicación 1.
17. Célula transformada con la molécula de ADN
recombinante según la reivindicación 16.
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