JP2004337172A

JP2004337172A - プロ−ウロキナーゼ変異種

Info

Publication number: JP2004337172A
Application number: JP2004200871A
Authority: JP
Inventors: Jian-Ning Liu; チアン−ニン・リュウ; Victor Gurewich; ビクター・ギュアウィッチ
Original assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Current assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2004-12-02
Also published as: EP0714435A4; NZ269061A; DE69432592D1; US5472692A; CN1115412C; ES2197165T3; PT714435E; EP0714435A1; EP0714435B1; ATE239084T1; JPH08511953A; EP1361276A1; DE69432592T2; CA2165977A1; WO1995001427A1; CN1130402A

Abstract

【課題】治療的用量で投与された場合に、望ましくない上記の非特異的かつ全身的なプラスミノーゲン活性化を開始させにくい、あるいはさせない、ｐｒｏ−ＵＫ変異種を開発する。
【解決手段】ネイティブなプロ−ウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）のアミノ酸配列を必須としてなる血栓融解活性のあるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、位置３００のリジンがヒスチジンになっており、患者に投与された場合にネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりもフィブリノーゲン溶解および非特異的プラスミノーゲン活性化を誘導しないものであるｐｒｏ−ＵＫ変異種
【選択図】なし

Description

本発明は、血栓融解治療に有用な新たな形態のプロウロキナーゼに関する。

プロ−ウロキナーゼ（pro-UK）は１本鎖形態のセリンプロテアーゼ前駆体であり、プラスミンにより活性化されて２本鎖ウロキナーゼ（ＵＫ）を形成する。ｐｒｏ−ＵＫおよびＵＫはともにチモーゲンであるプラスミノーゲンを活性化し、あるいは、フィブリンのクロットに包含される一連の血漿蛋白を分解する活性酵素であるプラスミンに変換する。したがって、ｐｒｏ−ＵＫおよびＵＫはともに血栓閉栓症の治療に使用されている。

かかる治療により引き起こされうるある種の望ましくない副作用が存在する。ｐｒｏ−ＵＫおよびＵＫはともにフィブリン分解、フィブリノーゲン溶解（フィブリノーゲノリシス）および血漿板ならびに血管壁のある部分の分解を導く非特異的プラスミノーゲン活性化、そして出血性素質を引き起こしうる。ｐｒｏ−ＵＫはより選択的、すなわち、ＵＫよりも低用量でもプラスミノゲン活性化に特異的である。なぜなら、ｐｒｏ−ＵＫはフィブリン結合プラスミノゲンのみを活性化し、一方、ＵＫはすべてのプラスミノーゲンを活性化するからである。しかしながら、低用量におけるｐｒｏ−ＵＫの特異性は、血栓融解効果に必要とされる高用量で投与されている場合には失われる可能性がある。

ｐｒｏ−ＵＫは、「不活性」なチモーゲンおよび「活性のある」酵素の双方に似たある種の特性を有する。一方、ｐｒｏ−ＵＫのチモーゲン特性は、血漿中での不活性な挙動、ドデシル硫酸ナトリウムに対して安定な阻害剤複合体を形成しないこと、およびジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）またはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、あるいはＵＫに対する有効な化学阻害剤クロロメチルケトンによる阻害に対する抵抗性を包含する。ｐｒｏ−ＵＫはまた、ＵＫよりも２００倍低いプラスミノーゲン活性化活性を有する。

他方、ｐｒｏ−ＵＫの酵素特性は、合成基質およびプラスミノーゲンに対する測定可能な本来的活性であり、それは、トリプシノーゲンまたはキモトリプシンのごとき他のセリンプロテアーゼチモーゲンよりも１０^{４．０〜４．３}倍高い。ｐｒｏ−ＵＫはまた、プラスミノーゲンに対してＵＫよりも低いミカエリス定数（Ｋ_Ｍ）を有し、フィブリンフラグメントＥ_２の存在下においては、ｐｒｏ−ＵＫは、ＵＫ形態へと活性化されなくても、プラスミノーゲンに対して十分な活性があることが示されている。

血栓融解剤として使用可能であるにもかかわらず、治療的用量で投与された場合には、ｐｒｏ−ＵＫの高い本来的な酵素活性は、望ましくない上記の非特異的かつ全身的なプラスミノーゲン活性化を開始させる。結果として、ｐｒｏ−ＵＫでの血栓融解治療は、やはり有害な副作用に関連しているといえる。

治療的用量で投与された場合に、望ましくない上記の非特異的かつ全身的なプラスミノーゲン活性化を開始させにくい、あるいはさせない、ｐｒｏ−ＵＫ変異種を開発することが本発明の解決課題であった。

本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ネイティブなプロ−ウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）のアミノ酸配列を必須としてなるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、位置３００のリジンがヒスチジンになっているｐｒｏ−ＵＫ変異種が上記課題を解決するものであることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
（１）ネイティブなプロ−ウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）のアミノ酸配列を必須としてなる血栓融解活性のあるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、位置３００のリジンがヒスチジンになっており、患者に投与された場合にネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりもフィブリノーゲン溶解および非特異的プラスミノーゲン活性化を誘導しないものであるｐｒｏ−ＵＫ変異種；
（２）（１）記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種をコードしているＤＮＡ分子；
（３）（２）記載の組み換え型ＤＮＡ分子で形質転換された細胞；
（４）ネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりも出血性合併症を引き起こさないものである（１）記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種；
（５）ネイティブなｐｒｏ−ＵＫのアミノ酸配列からなるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、位置３００のリジンがヒスチジンになっている（１）記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種；
（６）（５）記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種をコードしているＤＮＡ分子；
（７）（６）記載の組み換え型ＤＮＡ分子で形質転換された細胞
を提供するものである。

治療的用量で投与された場合に、ｐｒｏ−ＵＫの高い本来的な酵素活性を保持しつつも、望ましくない非特異的かつ全身的なプラスミノーゲン活性化を開始させにくい、あるいはさせないｐｒｏ−ＵＫ変異種が提供される。

本発明は、天然に存在するネイティブなｐｒｏ−ＵＫの望ましくない本来的かつ非特異的な酵素活性の低下を示すが、フィブリン（フラグメントＹまたはＥ_２）により促進される（活性化される）能力においてネイティブなｐｒｏ−ＵＫと少なくとも同程度に有効で、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、２本鎖ＵＫへの変換後も血栓融解活性を保持する変異種形態のｐｒｏ−ＵＫを設計できることを見いだしたことに基づく。結果として、これらのｐｒｏ−ＵＫ変異種は、患者に投与した場合、非特異的プラスミノーゲン活性化および出血性合併症がネイテイブなｐｒｏ−ＵＫよりも抑えられる。

これらのｐｒｏ−ＵＫ変異種は、フィブリンによってネイティブなｐｒｏ−ＵＫと同程度に促進されるため、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫと比較すると血栓融解剤として優れており、それゆえ、同じフィブリン溶解効率を有するが、それらは血漿中では真に不活性であるためネイテイブなｐｒｏ−ＵＫよりもずっと高いフィブリン結合プラスミノーゲンに対する特異性を有する。この不活性な挙動の結果、これらのｐｒｏ−ＵＫ変異種を、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫより多量、より有効な用量で患者に投与することができる。

したがって、本発明は、ｐｒｏ−ＵＫ変異種がネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりもフィブリノーゲン溶解および非特異的プラスミノーゲン活性化を誘導しないようにする変異を包含するネイティブなｐｒｏ−ＵＫのアミノ酸配列を有する血栓融解活性のあるｐｒｏ−ＵＫ変異種を特徴とする。好ましくは、変異は、通常には、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫのアミノ酸配列におけるネイティブなアミノ酸の新しいアミノ酸への置換であり、その変異により、ｐｒｏ−ＵＫ変異種は、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりも少なくとも１０倍低い本来の活性を有し、患者に投与した場合、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫと比較して、プラスミン活性化後に実質的に同じフィブリンでの促進活性および血栓融解活性を有するのである。

本明細書の用語「ネイティブ」は、天然に存在する形態もしくは野生型の蛋白、あるいは天然に存在する蛋白におけるアミノ酸を意味する。「新しい」アミノ酸は、ネィテイブな蛋白中においてはその位置に通常は存在しないアミノ酸である。本明細書の用語「変異」は、１個のネイティブなアミノ酸のただ１個の新しいアミノ酸への置換、または２個またはそれ以上のネイティブなアミノ酸の２個またはそれ以上の新しいアミノ酸への置換を包含する。

詳細には、変異は、通常には、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫの柔軟性のあるループ（アミノ酸２９７〜３１３）における１個のネイティブなアミノ酸の１個の新しいアミノ酸への置換であってもよい。例えば、新しいアミノ酸は、Ｌｙｓ^３００、Ｇｌｙ^２９９、および／またはＧｌｕ^３０１の、例えばアラニンまたはヒスチジンへの置換であってもよい。さらに、新しいアミノ酸は、Ｌｙｓ^３１３の、例えばアラニンまたはヒスチジンへの置換、あるいはＴｙｒ^３０６の、例えばグリシンへの置換であってもよい。

さらに、変異は、Ａｌａ^１７５の新しいアミノ酸への置換、およびＴｙｒ^１８７の第２の新しいアミノ酸への置換であって、ｐｒｏ−ＵＫ変異種においてチモーゲン３回転軸（zymogen triad）を形成するものであってもよい。例えば、新しいアミノ酸はセリンであってもよく、第２の新しいアミノ酸はヒスチジンであってもよい。本発明はさらに、チモーゲン３回転軸を形成する２つの変異の誘導のごとき変異の組み合わせを特徴とし、さらにＬｙｓ^３００の第３の新しいアミノ酸への置換およびＧｌｕ^３０１の第４の新しいアミノ酸への置換を包含する。かかつ変異種は、例えば、新しいアミノ酸としてセリン、第２の新しいアミノ酸としてヒスチジン、第３の新しいアミノ酸としてアラニンまたはヒスチジン、そして第４の新しいアミノ酸としてアラニンを有するであろう。

さらに本発明は、ＤＮＡ分子、例えば、本明細書記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種のいずれかをコードする組み換えＤＮＡ分子を特徴とする。かかる変異種は、単一、２個、または多数の置換を含むことができる。また本発明は、かかるＤＮＡ分子で形質転換された細胞、例えば、哺乳動物、細菌または酵母細胞を包含する。また本発明は、ｐｒｏ−ＵＫ変異種をコードしているＤＮＡ分子で細胞を形質転換し、その細胞を培養して変異種を発現させ、次いで、その変異種を単離することによる、本明細書記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種の製造方法を特徴とする。

さらに、本発明は、血栓融解量の本明細書記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種のいずれかを患者に投与することを特徴とする患者における血栓閉栓症の治療方法を特徴とする。本明細書の用語「血栓融解量」は、全身的な出血を誘導することなく、患者におけるフィブリンクロットを溶解するｐｒｏ−ＵＫ変異種の量である。

ｐｒｏ−ＵＫ変異体の開発
ＵＫおよびｐｒｏ−ＵＫの３次元（「３−Ｄ」）構造はまだ決定されていない。しかしながら、ｐｒｏ−ＵＫ／ＵＫのＢ−鎖（プロテアーゼのドメインである）は、Ｘ線結晶回折により３−Ｄ構造がよく知られているトリプシンならびにキモトリプシン、およびそれらの各前駆体であるトリプシノーゲンならびにキモトリプシノーゲンと有意に相同的である。これらの相同性は３０％より高いので、これらの分子と並べた場合のｐｒｏ−ＵＫ／ＵＫの骨格は、コア残基に関して約１.０Åまたはそれより小さい。それゆえ、ｐｒｏ−ＵＫ／ＵＫの予想構造は信頼できる。

アミノ酸配列に関する「相同性」は、２個またはそれ以上のアミノ酸配列間の類似性または同一性のパーセントをいう。ある２個の蛋白の相同性を、例えば、配列分析ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン州マディソン（Madison）のウィスコンシン大学のザ・シークエンス・アナリシス・ソフトウェア・パッケージ・オブ・ザ・ジェネティクス・コンピューター・グループ（the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group））により決定することができる。相同性のパーセント値は、正確な合致ならびに保存的アミノ酸置換を伴う配列に割り当てられる。ここに、保存的アミノ酸置換とは、例えば、１のアミノ酸の別の同様なアミノ酸での置換であり、得られる蛋白の特性および活性にわずかしか変化を与えないかまたは変化を与えない。

トリプシン（トリプシノーゲン）およびキモトリプシン（キモトリプシノーゲン）に対するｐｒｏ−ＵＫ／ＵＫの構造上の相同性に基づいてｐｒｏ−ＵＫ変異種が設計され、ｐｒｏ−ＵＫのフィブリン特異性が、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンにおける特別なコンホーメーション変化を誘導するフィブリンフラグメントＥ_２による選択的促進によるものであることが見いだされた（リウ（Liu）およびグレビッチ（Gurewich）,バイオケミストリー（Biochemistry）,第３１巻：６３１１〜６３１７頁（１９９２年））。ｐｒｏ−ＵＫ変異種を設計するために、出願人は、キモトリプシノーゲンおよびキモトリプシンそれぞれのポリペプチド骨格に関する空間座標に基づいて、さらにエラスターゼおよびトリプシン（トリプシノーゲン）の構造を加味して、ｐｒｏ−ＵＫ／ＵＫのプロテアーゼドメイン（Ｂ鎖）の３−Ｄ構造のコンピューターモデルを開発した。さらに出願人は、２種の分子モデリングプログラム、ＣＨＡＲＭＭ（高分子のエネルギーの最小化および力学の計算用のプログラムであり、ハーバード大学化学科により開発され、ブルックス（Brooks）ら,ジャーナル・オブ・コンピュ・ケミ（J.Comp.Chem.）,第４巻：１８７〜２１７頁（１９８３年）に記載されている）、ならびに米国カリフォルニア州サンフランシスコのシリコン・グラフィックス・インコーポレイテッド（Sillicon Graphics,Inc.）により開発されたＱＵＡＮＴＡ^Ｒを使用した。

図１、２ａ、および２ｂに示すように、このモデルは、ｐｒｏ−ＵＫのＢ鎖（プロテアーゼドメイン）の３次元構造を明確に示す。当該モデルは、キモトリプシン（キモトリプシノーゲン）の構造と類似のβ−バーレル構造（β-barrel structure）である２個のサブドメインにより構築されており、以下の特徴を有する。このＢ鎖における各原子の空間座標が十分に決定されている。分子表面上のＩｌｅ^１５９は、Ａ鎖のペプチド１３０〜１５８と共有結合している。ｐｒｏ−ＵＫの「活性化ドメイン」は、３つの配列（位置２９７〜３１３、３４４〜３５３、および３７６〜３８３のアミノ酸）からなる。配列２９７〜３１３は、キモトリプシノーゲンまたはトリプシノーゲンの同様のループよりも柔軟性が小さいがやはり「ぐらついて」いる「柔軟性のあるループ」（図２ａおよび２ｂの青い部分）を形成する。柔軟性のあるループがあるコンホーメーションに存在する場合、ループ中のＬｙｓ^３００のε−位の正に荷電したアミノ基がＡｓｐ^３５５の負に荷電したカルボキシル基と相互作用する。この相互作用は、活性部位であるＳｅｒ^３５６を、他の２つの主要活性部位の残基を含んでいる電荷中継システム内での相互作用にとり最も好ましい位置にＳｅｒ^３５６のヒドロキシル基が存在するという理想的な位置のごく近傍に引き付ける。すなわち、Ｌｙｓ^３１３も別方向からＡｓｐ^３５５と相互作用するのである。それゆえ、この間にｐｒｏ−ＵＫドメインの活性部位および基質結合ポケットが、２本鎖形態への変換を伴わずに優先的に形成される。しかしながら、この「活性コンホーメーション」になる確率はわずか０.５％であるため、開裂されていない１本鎖のｐｒｏ−ＵＫは、活性のある２本鎖形態の活性のうちの約０.５％しか有していない。

図２ｃおよび３に示すように、２本鎖形態においては、開裂されたＩｌｅ^１５９の新しいアミノ基はＡｓｐ^３５５とともに安定な「塩ブリッジ」を形成し、これにより活性化ドメインが安定化され、分子が十分に活性化される。これとは別に、フラグメントＥ_２結合プラスミノーゲンからの相互作用のごとき外力が「柔軟性のあるループ」（図２ｃの黄）の活性コンホーメーションを安定化させる場合には、開裂されていない１本鎖形態のｐｒｏ−ＵＫも十分に活性となるであろう。

さらに、ｐｒｏ−ＵＫのモデルは、キモトリプシノーゲンのいわゆる「チモーゲン３回転軸」（"zymogen triad"）（Ａｓｐ^１９４、Ｈｉｓ^４０およびＳｅｒ^３２により形成される水素結合ネットワーク）を含んでいない。なぜなら、この３回転軸はネイティブなｐｒｏ−ＵＫには存在しないからである。キモトリプシン３回転軸のＨｉｓ^４０およびＳｅｒ^３２は、ｐｒｏ−ＵＫにおいてはそれぞれＴｙｒ^１８７およびＡｌａ^１７５に置換されている。「チモーゲン３回転軸」は、キモトリプシノーゲンの活性部位（酸素ホール）の領域の不活性コンホーメーションを安定化するのに重要である。

このモデルを用いて、出願人は、ｐｒｏ−ＵＫおよびＵＫのプロテアーゼドメインにおける特異的アミノ酸置換を選択、モデリングして特別なｐｒｏ−ＵＫ変異種を設計し、次いで、これらの変異種のうちのあるものを構築し、発現させ、特徴づけた。非特異的プラスミノーゲン活性化の低下および十分に保持された血栓融解活性という所望の目的を実現する変異種の４つのクラスを以下に記載する。

ｐｒｏ−ＵＫのＬｙｓ^３００の部位特異的突然変異
Ｘ線結晶回折を用いる研究は、なぜ大部分のプロテアーゼの１本鎖チモーゲン形態が「活性なし」であるのか、そして、いかにしてただ１つの結合の開裂により十分な活性のある酵素の形成が誘導されるのかについての説明の助けとなった。しかしながら、ｐｒｏ−ＵＫは、他の大部分のチモーゲンよりも大きい本来的活性を有しているが、１本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＳＣ−ｔ−ＰＡ）よりは活性が小さい。とりわけ、トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンはそれぞれの活性化された２本鎖酵素形態の活性のわずか約１０^−６倍の活性しか有していない。ＳＣ−ｔ−ＰＡは２本鎖ｔ−ＰＡの活性の約１０^−１．５倍の活性を有する。ｐｒｏ−ＵＫはその２本鎖誘導体、すなわちＵＫの活性の約１０^−２．３倍の活性を有する。

セリンプロテアーゼチモーゲンの活性酵素への活性化の主要な態様は、チモーゲンの新しいアミノ末端α−アミノ基のチモーゲンの表面ポケット中への移動であり、そこで当該アミノ基が、蛋白の活性部位のセリンに配列において隣接しているアスパラギン酸とともにいわゆる「塩ブリッジ」を形成しうる。この場合の配列を図式的に図３に示す。塩ブリッジは、２本鎖ＵＫの新しいアミノ末端（Ｉｌｅ^１５９）またはｐｒｏ−ＵＫにおける代用物とアスパラギン酸残基（Ａｓｐ^３５５）の側鎖の負に荷電したカルボキシル基との間に形成されるイオン結合または静電気的相互作用である。

この塩ブリッジ形成により、触媒の鍵となるものであり、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＳｅｒ（図式２ａ〜２ｃ（赤）、および図３）の３つの主要な活性部位残基により形成される荷電遅延またはプロトン輸送システム内での相互作用にとり最も好ましい新たな位置へのセリンのヒドロキシル基の回転を生じる。さらに塩ブリッジの形成は、３つの配列（２９７〜３１３、３４４〜３５３、および３７６〜３８３）からなる、ｐｒｏ−ＵＫのいわゆる「活性化ドメイン」を安定化する。

不活性チモーゲンであるトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンにおいては、これらの活性化ドメインはＸ線結晶回折ではイメージ化されず、そのことはそれらが空間内に固定されていないのではなく、むしろぐらついていることが原因であるとされている。これらのドメインは基質結合ポケットを取り囲んであり、そのことは、基質に対してチモーゲンが結合しないことの説明となりうる。活性化された酵素であるトリプシンおよびキモトリプシンにおいては、これらのドメインは、ヒューバー（Huber）ら,アカウント・オブ・ケミカル・リサーチ（Acct.Chem.Res.）,第１１巻：１１４〜１２２頁（９７８年）に記載のごとくＸ線結晶回折において明らかに可視化される。

ヘッケル（Heckel）ら,ジャーナル・コンピュ・エイディド・モレ・デス（J.Comp.Aided.Mol.Des.）,第２巻：７〜１４頁（１９８８年）およびペーターソン（Peterson）ら,バイオケミストリー（Biochem.）,第２９巻：３４５１〜４３５７頁（１９９０年）に記載されているように、ＳＣ−ｔ−ＰＡにおいては、Ｌｙｓ^４１６（ｔ−ＰＡにおける番号づけによる）のε−アミノ基の正電荷がＡｓｐ^４７７（ｔ−ＰＡの番号づけによる）との代用塩ブリッジ効果を提供して、活性部位のＳｅｒ^４７８（ｔ−ＰＡにおける番号づけによる）を理想的な位置のごく近傍へと引き付けると思われる。ｐｒｏ−ＵＫにおいては、ＳＣ−ｔ−ＰＡにおけるＬｙｓ^４１６と同じ位置にＬｙｓ^３００（ｐｒｏ−ＵＫにおける番号づけによる）が存在する。ｐｒｏ−ＵＫのＬｙｓ^３００の正に荷電したε−アミノ基は、ＵＫの新しい末端α−アミノ基（Ｉｌｅ^１５９の）の代用物となることが要求される。しかしながら、その影響を弱めると思われる隣接したＧｌｕ^３０１が存在する。さらにＡｓｎ^３０２残基におけるグリコシレーション部位ならびに近傍のＳｅｒ^３０３残基におけるリン酸化部位も存在する。この配置は、ｐｒｏ−ＵＫの高い本質的活性（キモトリプシノーゲンと比べて）の部分的な提供（ＳＣ−ｔ−ＰＡと比べて）の説明となりうる。

これらの考慮に基づいて、出願人は、Ｌｙｓ^３００および／またはその周囲の残基がいくつかの異なるタイプのアミノ酸に変異して、この位置とＡｓｐ^３５５（ｐｒｏ−ＵＫにおける番号づけ）との間の電気的相互作用を調節している変異種であって、本来的活性ができるかぎり低下しているがフィブリンでの促進能およびネイティブなＵＫの２本鎖形態の活性を保持している一群の変異種を分類した。この変異株のグループを、以下の１から５までの番号を付したｐｒｏ−ＵＫ変異種により説明する。部位特異的突然変異法および下記の遺伝子発現によりこれらの変異種を作り出した。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解すべきではない。

変異種１：Ｌｙｓ^３００→Ａｌａ
中性アミノ酸であるアラニン（Ａｌａ）をｐｒｏ−ＵＫのＬｙｓ^３００と置換したが、その置換は、分子の折り畳みには影響しないが位置３００とＡｓｐ^３５５との間の塩ブリッジを除去して本来的活性を減少させるように設計された。コンピューターモデル上で設計されるとすぐに、この変異種を作成し、下記のごとく試験した。結果は、この変異種は測定可能な本来的活性をほとんど有しておらず、それゆえ、血漿中においてきわめて安定であり、１０ｍｇ／ｍｌよりも高濃度で２４時間にわたりインキュベーションしてもフィブリノーゲン分解を誘導しなかった。この安定性は、ネイテイブなｐｒｏ−ＵＫがインビトロにおいて血漿フィブリノーゲンの５０％の分解を誘導した濃度よりも少なくとも１０倍高かった。この変異種の２本鎖形態の活性（プラスミン活性化後）は、フィブリンフラグメントＥ_２によるその促進（ｐｒｏ−ＵＫの促進の４０％）と同様に低下した（ＵＫの活性の３３％）。

変異種２：Ｌｙｓ^３００→Ｈｉｓ
第２の変更として、ｐｒｏ−ＵＫモデルのＬｙｓ^３００をヒスチジン（Ｈｉｓ）に置換した。ヒスチジンは水素イオンを獲得することができ、６.５より低いｐＨにおいては正に荷電するが、リジンのε−アミノ基の電荷ほど強くない。ｐｒｏ−ＵＫモデルにおいて、Ｈｉｓ^３００のイミダゾール基は、外部よりも低いエネルギー状態において、分子内部に包み込まれる。なぜなら、イミダゾール基はやや疎水的であるからである。このことにより、イミダゾール基はＡｓｐ^３５５に向いているために正電荷を有することができ、局部的に環境が酸性となる。それゆえ、弱い塩ブリッジがＡｓｐ^３５５とＨｉｓ^３００との間に存在し、Ｈｉｓ^３００は弱いＬｙｓ^３００のように挙動することとなる。Ｈｉｓの静電気的荷電状況は局部的環境に依存し、さらに上記のごとくＨｉｓ^３００が柔軟性のあるループ領域（２９７〜３１３）中に存在するので、モジュレーター（フラグメントＥ_２）はやはりｐｒｏ−ＵＫの本来的活性を調節する。Ｌｙｓ^３００→ＡｌａのデータおよびＬｙｓと比較した場合のＨｉｓの特性に基づくと、変異種２の本来的活性もまた、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫの本来的活性よりも１０倍低いはずであるが、変異種１の本来的活性よりは高いはずである。しかしながら、２本鎖形態の活性およびフィブリンでの促進能はともに保持されるはずであり、それらは変異種１よりは高いはずであるが、ネイテイブなｐｒｏ−ＵＫよりは低いはずである。

変異種３：Ｇｌｙ^２９９→Ｈｉｓ／Ｌｙｓ^３００→Ａｌａ
ｐｒｏ−ＵＫモデルにおいて、ｐｒｏ−ＵＫ主鎖のＧｌｙ^２９９のカルボニル基の酸素がＡｓｐ^３５５と水素結合を形成する。かかる結合の形成はキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンにも存在する。モデルにおいてＧｌｙ^２９９をＨｉｓに置換した場合、Ｈｉｓ^２９９とＡｓｐ^３５５との間に強い塩ブリッジが形成され、それはＨｉｓ^３００とＡｓｐ^３５５との間のブリッジよりも強力であり、それゆえ、このブリッジの形成が防止される。さらに、Ｈｉｓ^２９９の局部的環境は、活性部位、基質結合ポケット、または他の内部領域の変化によってよりも、ｐｒｏ−ＵＫの柔軟性のあるループによって影響を受けにくい。対照的に、Ｈｉｓ^３００変異種（変異種２）は逆の挙動をするはずであり、すなわち、ループ領域のコンホーメーション変化によって、より影響を受けるはずである。Ｇｌｙと比較した場合のＨｉｓの特性に基づくと、変異種３の本来的活性および２本鎖形態の活性は変異種２の２倍よりも高いはずである。しかしながら、そのフィブリンでの促進能は変異種２よりも２０％以上低いはずであり、変異種１よりも高いはずである。

変異種４：Ｌｙｓ^３００→Ａｌａ／Ｇｌｕ^３０１→Ａｌａ
正に荷電したＬｙｓ^３００を中性のアラニンに置換した場合、Ｇｌｕ^３０１の負電荷は強くなり過ぎてＩｌｅ^１５９のα−アミノ基をそのＡｓｐ^３５５との相互作用から引き離してしまう。このことは、変異種１の活性化された２本鎖形態（ＵＫ）の血栓融解活性の低下を引き起こす。それゆえ、この問題を解決するために、Ｌｙｓ^３００およびＧｌｕ^３０１を中性のアラニンに置換することにより二重変異種を設計した。当該モデルおよびＬｙｓおよびＧｌｕと比較した場合の中性のＡｌａの特性に基づくと、変異種４は変異種１とほとんど同じ特性を有するはずであるが、変異種１の２本鎖形態の活性よりも２倍高い２本鎖形態の活性を有するはずである。

変異種５：Ｌｙｓ^３００→Ｈｉｓ／Ｇｌｕ^３０１→Ａｌａ
この変異種は変異種２と変異種４の組み合わせである。ｐｒｏ−ＵＫの変異種１のＡｌａ^３００の特性に基づくと、正に荷電した残基（３００）は１本鎖の本来的活性および２本鎖形態の活性の双方を促進するのに重要である。それゆえ、この二重変異種である変異種５は、本来的活性およびフィブリンでの促進能においては変異種２と同様であるはずであるが、より高い２本鎖形態の活性を有するはずである。

変異種１から５までは、いかにしてネイティブなｐｒｏ−ＵＫと比較した場合の本来的活性、２本鎖形態の活性およびフィブリンでの促進能を調節するかを示すものである。これらの調節は、部位特異的突然変異法および構造モデリングを組み合わせることにより、実際のｐｒｏ−ＵＫ変異種において遂行される。本質的にはこれらの変異種は、（１）フィブリノーゲン分解の減少(低い本来的活性)、（２）フィブリンでの促進が不変（フィブリンでの促進能が保持される）、（３）ネイティブなｐｒｏ−ＵＫと比較した場合のプラスミン活性化後の活性（２本鎖形態の活性）が同じ、からなる３つの目的を達成するものである。それゆえ、これらの変異種は治療上非常に有用であろう。

ｐｒｏ−ＵＫの柔軟性のあるループの部位特異的突然変異
本来的活性に対して重要なｐｒｏ−ＵＫの別の構造は、アミノ酸２９７〜３１３により形成されるいわゆる「柔軟性のあるループ」であり（図１、図２ａおよび２ｂ（青））、それは、すべてのセリンプロテアーゼならびにそれらのチモーゲンにおける、最も歪んでいるかまたはぐらついている領域である。この領域は、酵素／チモーゲン機能に対するある種の変調に関する機構を提供しうる。

このループはキモトリプシンにおいては開裂されるが、ｔ−ＰＡおよびｐｒｏ−ＵＫにおいてはＬｙｓ^{４１６／３００}変異種は本来的活性を有していた。ｐｒｏ−ＵＫ／ＵＫモデルに基づいて、このループの明らかな「活性」コンホーメーションを同定した（図２ｂの青）。それは、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫにおいて、他の種々の「不活性」コンホーメーションと動的平衡にある。「活性」コンホーメーションにおいては、ループの唯一の正に荷電した残基であるＬｙｓ^３００は分子内部に対面する位置にあってＡｓｐ^３５５と塩ブリッジを形成し、十分に活性のある触媒部位を生じる。対照的に、「不活性」コンホーメーションにおいては、ループ（図２ａ中、青）は、Ｌｙｓ^３００の正電荷がＡｓｐ^３５５との一直線からはずれるように移動させられており、そのことによりチモーゲンが不活性となる。

ｐｒｏ−ＵＫについて観察された活性は、平衡は不活性コンホーメーション寄りであり、活性コンホーメーションはわずか０.５％であることを示す。該０.５％は、その活性のある２本鎖形態（ＵＫ）に対するｐｒｏ−ＵＫの本来的活性のパーセントに対応する。

初めの研究は、柔軟性のあるループにおいて、３つの負に荷電した残基（Ｇｌｕ^３０１、Ａｓｐ^３０５、およびＧｌｕ^３１０）の側鎖はいつもＬｙｓ^３００とは反対側のループの面に存在することを示した。不活性に荷電した残基の側鎖が分子の外側に保持される場合、Ｌｙｓ^３００のε−アミノ基は高い確率でＡｓｐ^３５５と塩ブリッジを形成するであろう。換言すれば、活性コンホーメーションは、３つの負に荷電した残基が分子の外側に保持される場合に好ましいものである。

ｐｒｏ−ＵＫがフラグメントＥ_２結合Ｇｌｕ−プラスミノーゲンと相互作用する場合に、フラグメントＥ_２−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン複合体からの外的な静電気力は、これら３つの負に荷電した側鎖（Ｇｌｕ^３０１、Ａｓｐ^３０５、およびＧｌｕ^３１０）を分子から引きつけることにより、活性コンホーメーションを安定化させる。それゆえ、Ｌｙｓ^３００は分子の内側に対面するように配置され、Ａｓｐ^３５５と塩ブリッジを形成する。結果として、２本鎖形態へ変換されなくてもｐｒｏ−ＵＫは十分に活性となる。

ループの柔軟性をさらに増加させうる柔軟性のあるループの部位特異的突然変異は、「活性」コンホーメーションとなる確率を０.５％よりも低下させるであろう。ネイテイブなｐｒｏ−ＵＫと比較した場合に、この変異種が２本鎖形態への変換後に同様の２本鎖形態の活性を保持し、同様のフィブリンでの促進能を保持するならば、この変異種は、前記の３つの目的を達成する優れた活性剤であろう。かかる変異種は血漿において低い本来的活性を有するが、フィブリン（フラグメントＥ_２）存在下および２本鎖形態においては十分に活性があるであろう。

これらの考えに基づき、出願人は、「活性」コンホーメーションの確率は低いが、フラグメントＥ_２−Ｇｌｕ−プラスミノーゲン複合体による「活性」コンホーメーションへの誘導可能性ならびに２本鎖形態の活性を保持している第２のグループの変異種を分類した。このグループの変異種を、下記の６番のｐｒｏ−ＵＫ変異種により説明する。

変異種６：Ｔｙｒ^３０６→Ｇｌｙ
ｐｒｏ−ＵＫの本来的活性は、「活性」および［不活性」コンホーメーション間の平衡の機能であるという考えに基づけば、ループの柔軟性の増加は本来的活性を低下させるはずである。それゆえ、ループのβ−ターン構造が破壊されてその柔軟性が増加したＴｙｒ^３０６→Ｇｌｙ変異種を設計した。結果として、この変異種は本来的活性が低下しているはずであるが、フラグメントＥ_２による促進、２本鎖形態の活性、およびプラスミン活性化は保存されるはずである。それゆえ、変異種６は良好な治療上の有用性を有するであろう。

ｐｒｏ−ＵＫのＬｙｓ^３１３の部位特異的突然変異
ｐｒｏ−ＵＫのＬｙｓ^３１３はＵＫの新しい末端α−アミノ基のもう１つの代用物である。図１および２ｂに示すように、Ｌｙｓ^３１３はＬｙｓ^３００と同様に挙動して、さらにｐｒｏ−ＵＫの本来的活性の増加を引き起こすはずであるＡｓｐ^３５５との塩ブリッジを形成しうる。Ｌｙｓ^３１３とＡｓｐ^３５５との相互作用は、柔軟性のあるループの動きにより調節される。それゆえ、この相互作用の除去は、さらにｐｒｏ−ＵＫの本来的活性を低下させるであろう。これらの考えに基づき、出願人は、以下の変異種７および８を設計した。

変異種７：Ｌｙｓ^３１３→Ａｌａ
図１および２ｂに示すように、Ｌｙｓ３１３（図２ｂ中、黄）は柔軟性のあるループ（図１の２９７〜３１３、図２ｂにおいて青）の末端に存在し、Ａｓｐ^３５５に近接している。Ｌｙｓ^３００と同様に、そのε−アミノ基の正電荷は、ＵＫの新しいα−アミノ基の代用物として作用してＬｙｓ^３００とは反対の方向からＡｓｐ^３５５と塩ブリッジを形成する。有利なことに、新しい末端アミノ基（Ｉｌｅ^１５９）が生成して２本鎖ＵＫにおいてＡｓｐ^３５５とのもう１つの塩ブリッジを競争的に形成する際にこの塩ブリッジは破壊されるので、この変異種は２本鎖ＵＫの活性に影響しない。

対照的に、Ｌｙｓ^３００とＡｓｐ^３５５との間の電荷の相互作用は２本鎖形態において存在し、２本鎖形態の活性に貢献するので、Ｌｙｓ^３００は２本鎖形態の活性に影響する。同様に、さらにＳＣ−ｔ−ＰＡの同等のアミノ酸位置にＬｙｓ残基が存在し、その高い本来的活性に関与していることが示されている。

変異種８：Ｌｙｓ^３１３→Ｈｉｓ
この変異種においては、Ｌｙｓよりも弱い正電荷を有するＨｉｓを用いてＬｙｓ^３１３を置換した。上記変異種２に関して記載したのと同様の理論に基づき、この変異種を変異種７の調節体として設計した。

変異種７および８はＬｙｓ^３１３との塩ブリッジの形成を妨げるので、それらは両方とも、ネイテイブなｐｒｏ−ＵＫよりも低い本来的活性を有するが、変異種１または２よりも本来的活性は高いはずである。それらの２本鎖形態の活性は、本質的にネイティブなＵＫ（２本鎖形態）と同じはずである。それらのフィブリンでの促進能も保持されるはずであり、ネイティブなＵＫとほぼ同じはずである。それゆえ、これらの変異種も、臨床的に有用であろう。

ｐｒｏ−ＵＫにおいて「チモーゲン３回転軸」を形成するための部位特異的突然変異
キモトリプシンおよびトリプシンのＸ線構造は、「チモーゲン３回転軸」（"zymogen triad"）（Ａｓｐ^１９４、Ｈｉｓ^４０およびＳｅｒ^３２からなる）による水素結合のネットワークの形成は、キモトリプシノーゲンの活性部位（酸素ホール（oxygen hole））の領域の不活性コンホーメーションの安定化にとり重要であることを示す。しかしながら、出願人は、ｐｒｏ−ＵＫまたはｔ−ＰＡにおいてはこのチモーゲン３回転軸が生じないことを見いだした。キモトリプシノーゲン３回転軸のＨｉｓ^４０およびＳｅｒ^３２は、ｐｒｏ−ＵＫにおいてはそれぞれＴｙｒ^１８７およびＡｌａ^１７５により表される。この失われた３回転軸も、ｐｒｏ−ＵＫまたはｔ−ＰＡの高い本来的活性に貢献しているかもしれない。所望の特性を有するｐｒｏ−ＵＫ変異種を設計するためのもう１つのアプローチとして、「チモーゲン３回転軸」をネイティブなｐｒｏ−ＵＫ中に構築して、フィブリン分解活性に必要な他の機能に影響することなく、その本来的活性を低下させることができる。

変異種９：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ
キモトリプシノーゲンにおいて見られるのと同様の「チモーゲン３回転軸」をｐｒｏ−ＵＫ中に導入するために、この二重変異種を設計した。この変異はｐｒｏ−ＵＫの本来的活性を低下させるはすであるが、フラグメントＥ_２による促進および２本鎖形態の活性には影響しないはずである。それゆえ、この変異種もまた、上記３つの目的を達成するはずであり、血栓融解剤として有用であるはずである。

混合変異
出願人は、ｐｒｏ−ＵＫの本来的活性が、いくつかの異なる分子内相互作用に依存することを見いだした。該相互作用は、１）１本鎖形態におけるＵＫの新たな末端α−アミノ基の代用物としてのＬｙｓ^３００またはＬｙｓ^３１３；２）「チモーゲン３回転軸」の欠如；および３）柔軟性のあるループ（２９７〜３１３）の低い柔軟性ならびに活性コンホーメーションの高い確率を包含する。したがって、ただ１つの態様に基づく変異によっては、本来的活性は最大限に除去されないであろうし、かかる変異は損傷を与えるものであり、血栓融解活性に必要な２本鎖形態の活性およびフィブリンでの促進活性の低下を伴うであろう。しかしながら、これらの分子内相互作用のうち２つまたはそれ以上に影響する多重変異により、最適なｐｒｏ−ＵＫ変異種を作ることができる。これらの考えに基づき、出願人は、以下の変異種１０から１７までにより説明される一群の組み合わせ変異種を設計した。

変異種１０から１７のすべてが、本来的活性を低下させる人工的なチモーゲン３回転軸を有しており、大部分は、中和されているかまたは正電荷をより少なくされているＬｙｓ^３１３を有しており、塩ブリッジの形成を防止、または塩ブリッジを弱体化するようになっていて、さらに本来的活性を低下させるようになっている。同様に、これらの組み合わせ変異種のうちのいくつかは、中和されているかまたは正電荷をより少なくされているＬｙｓ^３００を有している。Ｔｙｒ^３０６→Ｇｌｙ変異は、さらに柔軟性を提供することにより、柔軟性のあるループが活性コンホーメーションとなる確率を減じ、Ｇｌｕ^３０１→Ａｌａ変異は、Ｉｌｅ^１５９とＡｓｐ^３５５との間の相互作用を妨げ、それゆえ、２本鎖形態の活性を保持する。

変異種１０：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｌｙｓ^３１３→Ａｌａ
変異種１１：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｔｙｒ^３０６→Ｇｌｙ
変異種１２：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｌｙｓ^３１３→Ｈｉｓ
変異種１３：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｔｙｒ^３０６→Ｇｌｙ／Ｌｙｓ^３１３→Ａｌａ
変異種１４：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｌｙｓ^３００→Ａｌａ／Ｇｌｕ^３０１→Ａｌａ／Ｌｙｓ^３１３→Ａｌａ
変異種１５：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｌｙｓ^３００→Ｈｉｓ／Ｇｌｕ^３０１→Ａｌａ／Ｌｙｓ^３１３→Ａｌａ
変異種１６：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｌｙｓ^３００→Ａｌａ／Ｇｌｕ^３０１→Ａｌａ／Ｌｙｓ^３１３→Ｈｉｓ
変異種１７：Ａｌａ^１７５→Ｓｅｒ／Ｔｙｒ^１８７→Ｈｉｓ／Ｌｙｓ^３００→Ｈｉｓ／Ｇｌｕ^３０１→Ａｌａ／Ｌｙｓ^３１３→Ｈｉｓ

これらすべての変異種は、提案された３つの目的：（１）低い本来的活性および血漿中での高い安定性、（２）フィブリンでの促進能が不変であることおよび著しく高いフィブリン特異性、および（３）ネイティブなｐｒｏ−ＵＫと比較した場合の、プラスミン活性化後の同等な２本鎖形態の活性、を最適に達成するはずである。それゆえ、これらの変異種は、出血性合併症を誘発することなく、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりも高用量で効率的に血栓クロットを溶解するはずである。そのうえ、それらは、フィブリンがないと血漿中において非常に不活性であり、それゆえ、極めて安全であるため、それらは、閉塞性フィブリン血栓の形成を予防する薬物として有用なはずである。したがって、これらの変異種は高い治療上の有用性を有する。

ｐｒｏ−ＵＫ変異種の製造
オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異
本明細書記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種の製造に適した１のタイプの部位特異的突然変異は、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異であり、これは存在するＤＮＡ配列、例えば、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫのＤＮＡ配列の特異的変化を可能にする。ネイティブなｐｒｏ−ＵＫをコードしている遺伝子は十分に特徴づけられており、例えば、デイビッド・ディチェク（David Dichek）博士（ＮＩＨ）またはパオロ・サルミエントス（Paolo Sarmientos）博士（イタリアのミラノのプリム（Primm））から入手することができる。ＡＴＣＣ番号はＤＮＡ５７３２９または細菌／ファージ５７２３８である。また、配列は、ＵＫＨＵなる名称のプロテイン・アイデンテイティー・リソース（Protein Identity Resource）なるＮＩＨコンピューターデータベースから利用できる。ｐｒｏ−ＵＫのアミノ酸配列を図１に示す。

配列が対象の変異を含んでいるオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、プライマーをネイティブな配列を含んでいる鋳型とハイブリダイズさせ、次いで、それをＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させることにより、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異を行う。得られた生成物は、オリゴヌクレオチドにおける変異によるミスマッチを含むヘテロ２本鎖分子である。例えば、イー・コリ（E.coli）細胞中で、ミスマッチの修復の際に当該変異を「固定」する。この方法の詳細は、例えば、アウスベル（Ausbel）ら（編）,カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology),第８.１章（グリーン・パブリッシング・アソシエーツ（Greene Publishing Associates）１９８９年,Supp.１３）に記載されており、参照により本明細書に取り入れる。

この部位特異的突然変異法は、チミジンのかわりに少量のウラシル残基を含むＤＮＡ鋳型の使用に基づく（図４）。ウラシル含有ＤＮＡは、イー・コリｄｕｔ⁻ｕｎｇ⁻株において生産される。このｄｕｔ⁻ｕｎｇ⁻を組み合わせた変異株において、チミジンのかわりにデオキシウリジンがＤＮＡに取り込まれ、それは除去されない。かくして、変更されるべき配列を含むベクターをｄｕｔ⁻ｕｎｇ⁻宿主中で増殖させて部位特異的突然変異用のウラシル含有ＤＮＡ鋳型調製することができる。図４に示すように、変異したオリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡ鋳型にアニーリングし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼで処理して２本鎖環状分子を得る。

オリゴヌクレオチドプライマーは高品質、すなわち、不完全なＤＮＡ合成を引き起こす低分子混入物質がないように精製されているべきである。いくつかの場合、特に４０ヌクレオチドより大きいオリゴヌクレオチドに関しては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製が必要であるかもしれない。

部位特異的突然変異プロトコールの典型的なインビトロ反応において、ウラシル含有ＤＮＡ鋳型は通常の鋳型と区別できない。鋳型中のｄＵＭＰはＴＭＰと同じコーディング能力を有するので、ウラシルは変異原性ではない。そのうえ、鋳型におけるウラシルの存在はインビトロＤＮＡ合成に対して阻害的でない。かくして、所望のＤＮＡ配列の変化を有するが、ＴＭＰ残基のみを含みｄＵＭＰ残基を含まない相補鎖の生成のために、このＤＮＡを鋳型として使用できる。

インビトロ反応を完了した後、例えば、ウラシルＮ−グリコシラーゼの作用により、あるいはインビトロ反応の分画されていない生成物を野生型（ｄｕｔ^＋ｕｎｇ^＋）イー・コリ細胞に導入することにより、ウラシルを鋳型鎖から除去する。グリコシラーゼでの処理はウラシルを遊離させ、鋳型鎖に致命的なアピリミジニック部位（ＡＰ部位）（apyrimidinic site）を生じさせる。かくして、鋳型鎖は生物学的に不活性にされ、大部分の子孫は、所望の変化を有する伝染性の相補鎖から生じる。このことは非常に効率的な変異ＤＮＡの生成（典型的には５０％）を引き起こし、ＤＮＡ配列分析による変異ＤＮＡのスクリーニングを可能にする。

スミス（Smith）,アニュ・レビュ・ジェネティ(Ann.Rev.Genet.),第１９巻：４２３〜４６３頁（１９８６年）に記載のごとく、高い効率で変異種が得られるプライマー伸長によるインビトロ突然変異のいくつかの変法が開発されている。本明細書記載の方法は、迅速かつ効率的に変異ＤＮＡを回収する、特別なウラシル含有鋳型に適用される単純な部位特異的突然変異プロトコールであり、もともと、クンケル（Kunkel）,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）,第８２巻：４８８〜４９２頁（１９８５年）、およびクンケルら,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth.Enzymol.）,第１５４巻：３６７〜３８２頁（１９８７年）に記載されているものであり、これらを参照により本明細書に取り入れる。原理的には、この同じ鋳型を大部分の他のプロトコールに適用することができる。

ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子をプラスミドＭ１３ｍｐ１８のＨｉｎｄIII／ＸｂａI部位中に連結し、このプラスミドをイー・コリ中に形質転換し、ｓｓＤＮＡを単離し、次いで、上記のごとくオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異を行うことにより、変異種１を作り出した。

ｐｒｏ−ＵＫ変異種ＤＮＡの発現
所望の変異を有するｐｒｏ−ＵＫＤＮＡが得られたならば、それを適当な発現ベクター中に組み込まなければならない。次いで、このベクターをｐｒｏ−ＵＫ変異種を発現する細胞系、例えば、細菌、哺乳動物、または酵母に導入し、該変異種を培地から集め、あるいは酵母細胞から集め、次いで、精製しなければならない。これらの方法は分子生物学の分野の当業者によく知られており、例えば、上記アウスベル（Ausbel）ら（編）,カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）,第９章および第１６章；サムブルック（Sambrook）、フリッチュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）,モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）（第２版）,第１６章（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）,１９８９年）に詳細に記載されており、これらを参照により本明細書に取り入れる。

変異ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子を哺乳動物細胞系に導入できるいくつかの方法がある。１の方法は、チャイニーズ・ハムスターの卵巣（「ＣＨＯ」）細胞中へのベクターのトランスフェクションを包含する。この方法において、変異ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子は選択可能なマーカーとともに同時トランスフェクションされ、安定に宿主細胞染色体中に組み込まれ、次いで、増幅される。ＣＨＯ細胞系は長時間にわたり大量の変異ｐｒｏ−ＵＫを産生するという理由で、ＣＨＯ細胞系が好ましい。ＣＨＯＤＸＢ１１またはＣＨＯＤＧ４４のごとき細胞系がコロンビア大学のローレンス・チェイシン（Lawrence Chasin,Columbia University）から入手できる。細胞系ＣＨＯＧＲＡはジェネティクス・インステイチュートのランドール・コウフマン（Randall Koufman,Genetics Institute）から入手できる。

別の発現方法は、変異ＤＮＡを含むベクターをＰＥＴ−１９Ｂイー・コリ発現系（ウィスコンシン州マジソンのノバーゲン（Novagen））中に導入することを包含する。例えば、部位特異的突然変異を行った後、変異種１（Ｌｙｓ^３００→Ａｌａ）をコードしているＤＮＡを配列分析して変異が起こったことを確認し、次いで、これを非常に効率的なイー・コリ遺伝子発現系であるＰＥＴ−１９Ｂ（ウィスコンシン州マジソンのノバーゲン（Novagen）社製）のＮｄｅI／ＸｈａI部位中に連結し、イー・コリ中に形質転換した。形質転換されたイー・コリを培養し、インデューサーＩＰＴＧを対数増殖期に添加することによりｐｒｏ−ＵＫ変異種の発現を誘導した。

ベクターを哺乳動物細胞系に導入したならば、宿主染色体内のトランスフェクションされたＤＮＡの増加したコピー数に関して選択することにより、所望蛋白、例えば、変異ｐｒｏ−ＵＫの発現を増加させることが望ましい。トランスフェクションされたＤＮＡ同時増幅することは、トランスフェクションされたＤＮＡによりコードされる蛋白の発現の１００ないし１０００倍の増加をもたらす。文献に記載された２０種上の選択可能で増幅可能な遺伝子があるが、大部分の実験例および成功例は、メトトレキサート選択およびトランスフェクションされたジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を用いるものであった。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞を用いて、メトトレキサート耐性に関する選択による同時増幅によって高レベルの変異ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子の発現を行うことができる。

ＣＨＯ細胞発現ベクターを用いる増幅
ｐＥＤシリーズのジシストロニックベクター（dicistronic vectors）用いて、安定にトランスフェクションされた細胞において標的遺伝子の高レベル発現を行うことができる（図５）。これらのベクターは、標的遺伝子、例えば、変異ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子の挿入用に、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ＤＨＦＲ」）遺伝子に続くクローニング配列を有している。適当なベクターで形質転換されたジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損ＣＨＯ細胞を、ヌクレオシド不含培地で増殖する能力により選択する。有効なＤＨＦＲ機能の阻害剤であるメトトレキサートの存在濃度を順次増加させていく選択サイクルにより、組み込まれたＤＮＡの増幅および所望遺伝子産物の増加した発現を行う。図５に示すｐＥＤベクターは、カウフマン（Kaufman）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids.Res.）,第１９巻：４４８５〜４４９０頁（１９９１年）に記載されており、これを参照により本明細書に取り入れる。

エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム、またはリポソームにより媒介される方法のいずれかを用いて、適当なベクター、例えば、ｐＥＤ中の変異ｐｒｏ−ＵＫおよびＤＨＦＲ遺伝子でＣＨＯ細胞をトランスフェクションしてもよく、そのことは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）に詳細に記載されている。リン酸カルシウム処理、次いで、グリセロールによるショックを与えることは、ＣＨＯＤＸＢ１１細胞について好ましい。次いで、トランスフェクションされた細胞を選択培地に置き、数日間増殖させた後、約５００個の細胞を含む大型の健康的なコロニーを増幅に使用する。増幅の前に、選択されたコロニーを別々のプレート上で増殖させる。

安定なトランスフェクション体を増幅する前に、細胞ＤＮＡをサザン分析により分析するか、あるいは変異ｐｒｏ−ＵＫに関する機能的アッセイを用いることによりＲＮＡを分析して、細胞に所望ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子が組み込まれたことを確認すべきである。次いで、選択された細胞を、メトトレキサート溶液中に入れ、その選択レベルを増加させていく。なぜなら、メトトレキサートはＤＨＦＲの有効な阻害剤であるからである。細胞をこの培地中に分配することにより、ＤＨＦＲレベルを上昇させている細胞について選択する。一般的には、このことは、トランスフェクションされた遺伝子のコピー数を増加させることにより行われる。同時に、ＤＨＦＲ遺伝子とともに同時トランスフェクションされた変異ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子もコピー数を増加させる。用いるメトトレキサートのレベルが高くなればなるほど、ＤＨＦＲ遺伝子のコピー数が最も大きい細胞が選び出され、それゆえ、所望の変異ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子が得られる。細胞が２０ないし８０μＭのメトトレキサート中で増殖する場合、細胞は５００ないし２０００コピーのトランスフェクションされた変異ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子を有する。

ｐｒｏ−ＵＫ変異種の抽出および精製
例えば、哺乳動物または細菌細胞系により変異ｐｒｏ−ＵＫが発現された後、それを培地から抽出し、精製しなければならない。酵母細胞の培養の場合には、まず、例えば、ガラスビーズを用いる機械的破砕により酵母細胞を破砕して、変異ｐｒｏ−ＵＫを含有する細胞抽出液を得なければならない。培地または細胞抽出液からの活性のある変異ｐｒｏ−ＵＫの精製は、一般的には、１）液相／液相抽出または最初の濾過工程、２）疎水的親和性クロマトグラフィー、３）抗体親和性クロマトグラフィー、そして４）ゲル濾過クロマトグラフィーからなる工程を包含する。これらの段階は分子生物学の分野の当業者によく知られており、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）第１０章に詳細に記載されている。

ｐｒｏ−ＵＫ変異種１を含んでいるイー・コリ細胞を超音波処理により溶解し、エンテロキナーゼ開裂部位（ＤＤＤＤＫ）を伴うｐｒｏ−ＵＫのＮ末端の前にポリ−Ｈｉｓを挿入してあるため、溶解物をニッケル親和性クロマトグラフィーカラムに適用した。精製されたｐｒｏ−ＵＫ変異種を固定化エンテロキナーゼとともにインキュベーションして、ニッケル親和性カラムでの再クロマトグラフィーを用いてＮ−末端ポリ−Ｈｉｓを除去した。Ｓ−セファロース、ヒドロキシアパタイト、セファクリルＳ−２００、次いで、ウィンクラー（Winkler）およびブレイダー（Blader）,バイオケミストリー（Biochemistry）,第２５巻：４０４１〜４０４５頁（１９８６年）、およびオルシニ（Orsini）ら,ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）,第１９５巻：６９１〜６９７頁（１９９１年）に記載のごとく、再生させた後ベンズアミジンカラムによるクロマトグラフィーにより、さらに試料を精製した。ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）処理によりすべての少量の混入ＵＫを除去した。

ｐｒｏ−ＵＫ変異種の分析
変異種１について行ったように、ｐｒｏ−ＵＫ変異種の特性を、イー・コリにより産生された組み換え型ｐｒｏ−ＵＫと比較することができる。本来的活性、早い時点におけるＧｌｕ−プラスミノーゲンのフラグメントＥ_２による促進、および血漿環境におけるプラスミン活性化ならびにクロット溶解に対する感受性を試験して少量のｐｒｏ−ＵＫ変異種について得られ、いかにして変異種がインビトロにおいて血栓融解剤として作用するのかを予想するアッセイプロフィールを決定した。

本来的活性のアッセイ
これらのアッセイは、ＵＫの合成基質であるＳ２４４４の加水分解の動的分析およびＧｌｕ−プラスミノーゲンの活性化に基づく。

Ｓ２４４４の加水分解：４.０ｎＭのＵＫまたは１.０μＭのｐｒｏ−ＵＫ変異種１を、０.０５Ｍリン酸ナトリウム、０.１５ＭＮａＣｌ、０.２％ＢＳＡおよび０.０１％ツイン８０（ｐＨ７.８）中の０.０３、０.０６、０.１２、０.１８、０.２４、０.３、０.６、１.２、１.８および２.４ｍＭの濃度範囲のＳ２４４４とともに室温でインキュベーションした。マイクロタイタープレートリーダー上で、対照波長４９０ｎｍに対する４１０ｎｍにおけるＯＤの直線的増加（４１０／４９０ｎｍ）により反応速度を測定した。変異種１はＳ２４４４加水分解活性をほとんど示さなかった。

Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの活性化：マイクロタイタープレートリーダー（ダイナテック（Dynatech）ＭＲ５０００）上で、対照波長４９０ｎｍおよび選択波長４１０ｎｍ（４１０／４９０ｎｍ）における経時的な反応混合物のＯＤ増加を測定することにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン活性化の時間−吸光度曲線を得た。反応混合物は、Ｓ２２５１（１.５ｍＭ）、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（１.０、１.５、２.５、３.５、４.５、５.５、７.５、１０.０μＭ）およびＵＫ（０.２ｎＭ）またはｐｒｏ−ＵＫ変異種１（５.０ｎＭ）を含んでいた。０.０５Ｍリン酸ナトリウム、０.１５ＭＮａＣｌ、０.２％ＢＳＡおよび０.０１％ツイン８０（ｐＨ７.８）中に反応物質を調製し、室温でインキュベーションした。変異種１は、約４ＩＵ／ｍｇのプラスミノーゲン活性化活性を示し、これは、約４００ＩＵ／ｍｇの活性を有するネイティブなｐｒｏ−ＵＫのわずか１％の活性であった。

フィブリンフラグメントＥ−２によるプラスミノーゲン活性化に関するアッセイ
フラグメントＥ−２存在下でのｐｒｏ−ＵＫ変異種１によるＧｌｕ−プラスミノーゲン活性化を、マイクロタイタープレートリーダー上で、対照波長４９０ｎｍおよび選択波長４１０ｎｍ（４１０／４９０ｎｍ）における経時的な反応混合物のＯＤ増加を測定することにより測定した。反応混合物は、０.０５Ｍリン酸ナトリウム、０.１５ＭＮａＣｌ、０.２％ＢＳＡおよび０.０１％ツイン８０（室温でｐＨ７.８）中、１.５ｍＭＳ２２５１（プラスミンに対する合成基質）、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（１.０、２.０、４.０および８.０μＭ）、５.０μＭのフラグメントＥ−２、および１.０ｎＭのｐｒｏ−ＵＫ変異種１を含有していた。フィブリンフラグメントＥ２存在下での変異種１によるプラスミノーゲン活性化は、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫのわずか約４０％であった。ネイティブなｐｒｏ−ＵＫのプラスミノーゲン活性化は、フィブリン促進のない場合と比べてフィブリンフラグメントＥ−２存在下では２５０倍であった。

プラスミン感受性のアッセイ
プラスミン感受性のアッセイはＬｙｓ−プラスミンによるｐｒｏ−ＵＫ変異種の活性化の動的研究である。０、０.１、０.２、０.４、０.６、０.８、１.０、１.２、１.４、２.５、３.５および５.０μＭの濃度範囲のｐｒｏ−ＵＫ変異種１を、０.０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１５ＭＮａＣｌ,０.０１ＭＣａＣｌ_２および０.０１％ツイン８０,ｐＨ７.４中、１.２ｍＭのＳ２４４４の存在下で、室温において一定時間インキュベーションした。プラスミンが存在しない場合の同じ濃度範囲のｐｒｏ−ＵＫ変異種を、対照としてＳ２４４４とともにインキュベーションした。０.１ｎＭのプラスミンは、対照条件下においてはＳ２４４４の加水分解に対して直接的な影響を及ぼさなかった。ｐｒｏ−ＵＫ変異種１から生じたＵＫの量を、マイクロタイタープレートリーダー（ＭＲ５０００型；バージニア州アレクサンドリアのダイナテック・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Dynatech Laboratories Inc.））上で、対照波長４９０ｎｍおよび選択波長４１０ｎｍ（４１０／４９０ｎｍ）における経時的な反応混合物のＯＤ増加により測定した。変異種１は、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫと同様のプラスミン感受性を有し、Ｋ_Ｍ２.４４μＭ、ｋ_ｃａｔ３.０４ｎＭ／分であった。

血漿フィブリノーゲン分解活性のアッセイ
ｐｒｏ−ＵＫ変異種１（０〜１００μｇ／ｍｌ）またはｐｒｏ−ＵＫ（０〜１０μｇ／ｍｌ）を、１.０ｍｌの貯留しておいた血漿中で、６、１６、または２４時間インキュベーションし、次いで、０.２ｍｌのアプロチニン（１００００ＫＩＵ／ｍｌ）を添加し、一定時間後に残存する血漿フィブリノーゲンを、スロンビンクロット法により測定した。変異種１は、ネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりも約１００倍低い血漿フィブリノーゲン分解活性を有していた。すなわち、１.０μｇ／ｍｌのネイティブなｐｒｏ−ＵＫは９.０μｇ／ｍｌのフィブリノーゲンの５０％を６時間以内に分解するが、同じ効果を得るには１００μｇ／ｍｌの変異種１が必要である。

フィブリンクロット溶解アッセイ
０.２５ｍｌの血漿から調製された^１２５Ｉ−標識クロットを、グレビッチ（Gurewich）ら,クリニカル・インベスティゲーションズ（Clin.Invest.）,第７３巻：１７３１ページ（１９８０年）に記載のごとく調製した。クロット溶解実験を、１０、２０、３０、４０、７０、および８０μｇ／ｍｌの濃度範囲のｐｒｏ−ＵＫ変異種１または５、１０、３０、５０、７５、１００および１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡ、およびｔ−ＰＡとｐｒｏ−ＵＫの一定の組み合わせととのみ、３ｍｌの血漿中で行った。放射活性の遊離から溶解を定量化し、時間に対する完全な溶解における値のパーセントとして表現した。変異種１のフィブリンクロット溶解活性はネイティブなｐｒｏ−ＵＫの５０％あった。すなわち、２００Ｕ／ｍｌのネイティブなｐｒｏ−ＵＫはクロット（１ｃｍ^３）を６時間以内に溶解するが、同じ効果を得るためには、同量の変異種１の場合１２時間かかる。

ｐｒｏ−ＵＫ変異種の治療的使用
ｐｒｏ−ＵＫおよびＵＫと同様に、血栓融解剤としてｐｒｏ−ＵＫ変異種を使用し投与する。ｐｒｏ−ＵＫ変異種を医薬上許容される担体、例えば、セイラインと混合し、血管内投与、例えば、静脈内もしくは動脈内投与、または皮下注射により投与する。ｐｒｏ−ＵＫ変異種を、２０ないし６０ｍｇの丸薬として注入するか、または４０〜８０ｍｇ／時の割合で静脈から輸液してもよい。ｐｒｏ−ＵＫ変異種は、ネイティブないしｐｒｏ−ＵＫよりもずっと高い血漿での安定性を有し、非特異的プラスミノーゲン活性化を誘導する可能性がずっと低いので、高用量、例えば、２００ｍｇ／時までの輸液を使用することもできる。

本発明は、治療的用量で投与された場合に、ｐｒｏ−ＵＫの高い本来的な酵素活性を保持しつつも、望ましくない非特異的かつ全身的なプラスミノーゲン活性化を開始させにくい、あるいはさせないｐｒｏ−ＵＫ変異種を提供するものなので、製薬産業等において利用可能である。

図１は、ｐｒｏ−ＵＫのアミノ酸構成の図式であり、柔軟性のあるループおよび種々の特別なアミノ酸を示す。図２ａは、「不活性」コンホーメーションにおけるｐｒｏ−ＵＫのコンピューターによる３次元（３−Ｄ）モデルであり、活性部位（Ｓｅｒ^３５６、Ｈｉｓ^２０４、ならびにＡｓｐ^２５５）、およびＡｓｐ^３５５と相互作用しない、いわゆる「柔軟性のあるループ」（"flexible loop"）のＬｙｓ^３００ならびにＬｙｓ^３１３を示す。図２ｂは、「活性」コンホーメーションにおけるｐｒｏ−ＵＫのコンピューターによる３次元（３−Ｄ）モデルであり、活性部位（Ｓｅｒ^３５６、Ｈｉｓ^２０４、ならびにＡｓｐ^２５５）、およびＡｓｐ^３５５と相互作用する、いわゆる「柔軟性のあるループ」のＬｙｓ^３００ならびにＬｙｓ^３１３を示す。図２ｃは、２本鎖ＵＫのコンピューターによる３次元（３−Ｄ）モデルであり、活性部位（Ｓｅｒ^３５６、Ｈｉｓ^２０４、ならびにＡｓｐ^２５５)、Ａｓｐ^３５５、および開裂された新アミノ末端残基Ｉｌｅ^１５９を示す。図３は、Ｓｅｒ^３５６、Ｈｉｓ^２０４、ならびにＡｓｐ^２５５を包含するいわゆる「電荷中継システム」（"charge relay system"）、およびＡｓｐ^３５５ならびにＩｌｅ^１５９間の「塩ブリッジ」（"salt bridge"）の図式を示す。図４は、本発明ｐｒｏ−ＵＫ変異体の作成に適当なオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異の形態を示す図式である。図５は、哺乳動物細胞におけるｐｒｏ−ＵＫ変異体の発現に適当な、ジシストロニックｍＲＮＡ発現ベクターｐＥＤの図式的な地図である。

配列表

Claims

ネイティブなプロ−ウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）のアミノ酸配列（配列番号：１）を必須としてなる血栓融解活性のあるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、位置３００のリジンがヒスチジンになっており、患者に投与された場合にネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりもフィブリノーゲン溶解および非特異的プラスミノーゲン活性化を誘導しないものであるｐｒｏ−ＵＫ変異種。
請求項１記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種をコードしているＤＮＡ分子。
請求項２記載の組み換え型ＤＮＡ分子で形質転換された細胞。
ネイティブなｐｒｏ−ＵＫよりも出血性合併症を引き起こさないものである請求項１記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種。
ネイティブなｐｒｏ−ＵＫのアミノ酸配列（配列番号：１）からなるｐｒｏ−ＵＫ変異種であって、位置３００のリジンがヒスチジンになっている請求項１記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種。
請求項５記載のｐｒｏ−ＵＫ変異種をコードしているＤＮＡ分子。
請求項６記載の組み換え型ＤＮＡ分子で形質転換された細胞。