ES2197214T3 - Agentes entrecruzants, conjugantes y reductores activados por fosfatasa; procedimientos de utilizacion de estos agentes y reactivos que comprenden estos agentes. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA AGENTES DE RETICULACION, CONJUGACION Y REDUCCION QUE SON FUNCIONALES CON AL MENOS UN GRUPO MONOESTER FOSFOROTIOATO (- SPO{SUB,3}{SUP,-2}). TAMBIEN SE FACILITAN METODOS DE RETICULACION Y CONJUGACION ASI COMO REACTIVOS Y CONJUGADOS DE FASE SOLIDA QUE SON UTILES EN INMUNOENSAYOS. LOS AGENTES DE RETICULADO Y CONJUGACION DE LA INVENCION GENERALMENTE INCLUYEN UN COMPUESTO CORRESPONDIENTE A LA FORMULA (I): Q - (S - PO{SUB,3}{SUP,-2}){SUB,N}, DONDE N ES AL MENOS 1 Y Q ES UN MONOMERO, POLIMERO U OLIGOMERO LINEAL O RAMIFICADO, CON UN PESO MOLECULAR PROMEDIO ENTRE 200 Y 1.000.000. POR OTRA PARTE, CUANDO N ES 1, Q INCLUYE AL MENOS 1 GRUPO FUNCIONAL REACTIVO ADICIONAL. LOS AGENTES REDUCTORES PROPORCIONADOS SON COMPUESTOS DE FORMULA (Y) DONDE (A) Y (Z) PUEDEN SER UN ALQUILO C{SUB,1} - C{SUB,5} O CONH(CH{SUB,2}){SUB,P) DONDE P ES UN NUMERO ENTERO ENTRE 1 Y 5.

Description

Agentes entrecruzantes, conjugantes y reductores activados por fosfatasa; procedimientos de utilización de estos agentes y reactivos que comprenden estos agentes.

La presente invención se relaciona con agentes entrecruzantes, conjugantes y reductores y, en particular, se relaciona con agentes entrecruzantes, conjugantes y reductores con funcionalidad de monoéster de fosforotioato.

Los inmunoensayos se han convertido en una útil herramienta de diagnóstico para detectar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra de ensayo. Se conocen en la técnica varias formas de inmunoensayos, así como los reactivos y procedimientos necesarios para realizar dichos ensayos.

Una forma de inmunoensayo convencional en fase sólida es un ``ensayo en emparedado'', que conlleva el contacto de una muestra de ensayo sospechosa de contener un analito con un plástico, látex o perla de vidrio inertes substancialmente sólidos u otro material de soporte que haya sido revestido con una proteína u otra substancia capaz de unir el analito a la superficie del soporte. Se hace comúnmente referencia al analito y a la proteína o substancia capaz de unir el analito como ``par de unión'' o individualmente como ``miembros de unión'' y se hace referencia a un material de soporte revestido con un miembro de unión de forma variable como ``reactivo de fase sólida''. Después de unirse el analito al material de soporte, se retira el resto de la muestra de ensayo del soporte y se trata el material de soporte con el analito unido con un segundo miembro de unión. El segundo miembro de unión puede conjugarse a un grupo generador de señal, tal como una enzima, un fluoróforo o un marcaje quimioluminiscente y se hace referencia de forma variable colectivamente al complejo miembro de unión/grupo generador de señal como ``conjugado'' o ``reactivo indicador''. El conjugado se une al analito que está unido sobre el soporte y el soporte sólido, que tiene el primer miembro de unión, el analito y el conjugado unidos al mismo, se separa de cualquier conjugado no unido, típicamente con una o más etapas de lavado. En el caso de un enzimoinmunoensayo, se añade una substancia indicadora, por ejemplo un substrato cromogénico, que reacciona con la enzima para producir un cambio de color. El cambio de color puede ser observado visualmente, o más preferiblemente mediante un instrumento, para indicar la presencia o la cantidad de un analito en la muestra de ensayo. Para los inmunoensayos de florescencia o de quimioluminiscencia en fase sólida, los miembros de unión marcados fluorescentemente pueden ser monitorizados usando excitación a una longitud de onda apropiada, mientras que los miembros de unión marcados con quimioluminiscencia pueden ser monitorizados después de una reacción que active químicamente el marcaje quimioluminiscente y genere luz que pueda ser detectada por medios fotométricos.

Los reactivos de inmunoensayo, tales como un reactivo o conjugado de fase sólida, son típicamente fabricados en grandes cantidades y se usan pequeñas cantidades de los reactivos a granel para realizar ensayos individuales. El resto de los reactivos a granel son entonces guardados para posteriores ensayos. La estabilidad de estos reactivos es primordial para disponer de métodos analíticos que exhiban precisión y uniformidad entre ensayos individuales. La inestabilidad de tales reactivos proporciona resultados de ensayo irreproducibles, así como un aumento en los costes de los servicios médicos debido a que se han de desechar los reactivos a granel inestables.

Se han utilizado varios métodos para aumentar la estabilidad de los reactivos de inmunoensayo conservando la integridad y/o actividad de los compuestos que constituyen los reactivos. Algunos métodos de conservación de reactivos de inmunoensayo conllevan poner los aditivos, tales como proteínas o carbohidratos, en soluciones que contienen los reactivos. Otro método de conservación de reactivos de ensayo incluye la adición de agentes reductores (a los que se hace diversamente referencia como ``antioxidantes'') a los reactivos de ensayo liofilizados. Desgraciadamente, a lo largo del tiempo, los agentes reductores se autooxidan y, en consecuencia, permiten sólo una protección de los reactivos a corto plazo. El entrecruzamiento químico ha sido también aceptado como método de estabilización de macromoléculas y por ello de conservación de su integridad y actividad.

El entrecruzamiento químico puede ser realizado de manera efectiva por entrecruzamiento intermolecular o entrecruzamiento intramolecular, donde las moléculas que tienen un grado mayor de entrecruzamiento son generalmente más estables que las moléculas que tienen un grado menor de entrecruzamiento. El entrecruzamiento intramolecular se refiere a enlaces covalentes o entrecruzamientos que se forman dentro de una sola entidad química multimérica o monomérica. Por ello, los enlaces disulfuro que se producen en un anticuerpo son un ejemplo de entrecruzamiento intramolecular. Por otra parte, el entrecruzamiento intermolecular se refiere a enlaces covalentes o entrecruzamientos que se forman entre más de una entidad química distinta, tales como los enlaces que se forman cuando un compuesto se conjuga a otro. En consecuencia, un reactivo indicador de inmunoensayo que consista, por ejemplo, en un anticuerpo unido o conjugado a una enzima, es un ejemplo de entrecruzamiento intermolecular. Adicionalmente, un reactivo de fase sólida de inmunoensayo o un gel de cromatografía de afinidad que contiene un anticuerpo unido a un gel cromatográfico son otros ejemplos más de entrecruzamiento intermolecular. Mientras que el entrecruzamiento intermolecular, como se ha ejemplificado antes, es un medio efectivo de conjugar una entidad química a otra, en general, el grado de entrecruzamiento es mínimo y la estabilidad de los compuestos así conjugados apenas aumenta.

El entrecruzamiento de una entidad química por entrecruzamiento intermolecular de múltiples puntos, sin embargo, puede aumentar mucho la estabilidad del compuesto. El entrecruzamiento intermolecular de múltiples puntos da típicamente lugar a la formación de una pluralidad de enlaces entre un agente entrecruzante y el compuesto entrecruzado. Dicho entrecruzamiento está más comúnmente asociado a los enlaces formados entre una entidad soluble, tal como, por ejemplo, un polímero y una proteína, tal como, por ejemplo, una enzima.

Se han descrito previamente ejemplos de entrecruzamiento intramolecular e intermolecular. Por ejemplo, Wong y col., Enzyme Microb. Technol., Vol. 14, pp. 866-874 (1992) presentan de forma general técnicas y reactivos para entrecruzar intramolecular e intermolecularmente compuestos.

Adicionalmente, la Patente EE.UU. Nº 4.652.524 y la Patente EE.UU. Nº 4.657.853 describen el entrecruzamiento de múltiples enzimas a un polímero y también el entrecruzamiento de la enzima polimérica a un miembro de unión. La Solicitud de Patente Europea Nº 0.049.475 describe un método para el entrecruzamiento intermolecular de múltiples puntos de una enzima con un polímero soluble. Desgraciadamente, sin embargo, los métodos antes mencionados requieren condiciones severas para efectuar el entrecruzamiento, carecen de control sobre el proceso de entrecruzamiento y/o dan lugar a agregados proteicos polimerizados aleatoriamente que con frecuencia no son solubles. Más aún, el rendimiento biológico de la entidad entrecruzada resulta con frecuencia afectado de forma negativa, según se manifiesta, por ejemplo, por menores afinidades de unión, renovación enzimática disminuida, alteración del reconocimiento por ligandos específicos y similares.

Bieniarz C. y col., en Bioconjugate Chem., Vol. 5, Nº 1, pp. 31-39 (1994), describen fluoresceínas funcionalizadas con tiolato y fosforotiolato y su uso como marcajes fluorescentes.

La presente invención proporciona agentes entrecruzantes, conjugantes y reductores que están funcionalizados con al menos dos grupos monoéster de fosforotioato (-SPO_{3}^{-2}). Los agentes de la invención pueden activarse por desprotección o hidrólisis del(de los) grupo(s) fosfato que constituyen el(los) monoéster(es) de fosforotioato. Tras la activación, los agentes aquí presentados exhiben un grupo nucleofílico tiol que puede ser usado en capacidades de entrecruzamiento, reducción y/o conjugación. Los agentes entrecruzantes, conjugantes y reductores aquí presentados pueden, por ejemplo, ser activados en un ambiente de pH adecuado, pero el(los) grupo(s) fosfato también pueden hidrolizarse con una enzima hidrolizadora de fosfatos. Ventajosamente, por activación enzimática, los iones fosfatos inocuos y el agente activado son los productos mayores de la reacción de activación.

Los agentes entrecruzantes y conjugantes de la invención consistente generalmente en un compuesto correspondiente a la fórmula (I), mostrada a continuación, donde n es al menos 2 y Q es monómero, oligómero o polímero lineal o ramificado que tiene un peso molecular medio de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1.000.000. adicionalmente, cuando n es 2, Q contiene al menos una funcionalidad reactiva adicional. Q-(S-PO_{3}^{-2})_{n}\eqnum{(I)}

Un método para entrecruzar y conjugar compuestos aquí facilitado consiste en activar un compuesto correspondiente a la fórmula (I) para formar un agente activado y en poner en contacto el agente activado con al menos un compuesto que es funcional con un grupo electrofílico. Preferiblemente, el compuesto de fórmula (I) se activa con un pH de entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,5, o con una enzima fosfatasa.

También se ofrecen aquí conjugados y reactivos de fase sólida. Un conjugado tal como el que se muestra aquí consistirá, en general, en al menos un miembro de unión y al menos un resto detectable unido al residuo de un compuesto correspondiente a la fórmula (I). Por otra parte, un reactivo de fase sólida consistirá, en general, en al menos un miembro de unión y una fase sólida unida al residuo de un compuesto que tiene la fórmula (I).

También se presentan agentes reductores que se conforman, en general, a un compuesto de la fórmula (Y), mostrada a continuación, donde (A) y (Z) pueden ser independientemente seleccionados entre alquileno C_{1}-C_{5} y CONH(CH_{2})_{p}, donde p es un número entero de 1 y 5.

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Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1(a)-(f) ilustran agentes entrecruzantes y conjugantes.

Las Figuras 2(a)-(e) ilustran un método de estabilización de un compuesto.

Las Figuras 3(a)-(f) ilustran agentes conjugantes heterobifuncionales comparativos.

Las Figuras 4(a)-(d) ilustran un método de conjugación de dos entidades químicas distintas.

Las Figuras 5(a)-(d) ilustran un método de conjugación de un compuesto estabilizado y un segundo compuesto.

Las Figuras 6(a)-(d) ilustran la conjugación específica de sitio de un compuesto estabilizado con la región Fc de un anticuerpo.

Las Figuras 7(a)-(b) ilustran agentes reductores estables.

Las Figuras 8-13 ilustran de forma gráfica los diversos perfeccionamientos de propiedades exhibidos por los compuestos estabilizados.

Las Figuras 14(a)-(e) ilustran un ejemplo comparativo de la conjugación de dos entidades químicas usando un agente de conjugación heterobifuncional.

La Figura 15 ilustra el efecto que tiene la manipulación estequiométrica sobre el tamaño de los productos producidos en la reacción de entrecruzamiento.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Las siguientes definiciones son aplicables a la invención.

El término ``analito'', tal como se usa aquí, se refiere al compuesto o a la composición que ha de ser detectada o medida y que tiene al menos un epitopo o sitio de unión. El analito puede ser cualquier substancia para la que exista un miembro de unión natural o para la que se pueda preparar un miembro de unión. Los analitos incluyen, aunque sin limitación, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluyendo los administrados para fines terapéuticos, así como los administrados para fines ilícitos), partículas víricas y metabolitos o anticuerpos para cualquiera de las substancias anteriores. Por ejemplo, dichos analitos incluyen, aunque sin limitación, ferritina, creatinina kinasa MB (CK-MB), digoxina, fenitoína, fenobarbitol, carbamazepina, vancomicina, gentamicina, teofilina, ácido valproico, quinidina, hormona luteinizante (LH), hormona estimulante del folículo (FSH), estradiol, progesterona, anticuerpos IgE, vitamina B2 microglobulina, hemoglobina glicada (Gly.Hb), cortisol, digitoxina, N-acetilprocainamida (NAPA), procainamida, anticuerpos para la rubéola, tales como rubéola-IgG y rubéola-IgM, anticuerpos para la toxoplasmosis, tales como la toxoplasmosis-IgG (Toxo-IgG) y la toxoplasmosis-IgM (Toxo-IgM), testosterona, salicilatos, acetaminofeno, antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg), anticuerpos para el antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B, tal como la IgG y la IgM anti-antígeno del núcleo de la hepatitis B (Anti-HBC), virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2 (HTLV), antígeno e de la hepatitis B (HBeAg), anticuerpos para el antígeno e de la hepatitis B (anti-HBe), hormona estimulante del tiroides (TSH), tiroxina (T4), triyodotironina total (T3 total), triyodotironina libre (T3 libre), antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteína alfa-fetal (AFP), y fármacos de abuso y substancias controladas, incluyendo, aunque sin limitación, anfetamina, metanfetamina; barbituratos, tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital y barbital; benzodiazepinas, tales como Librium y Valium; cannabinoides, tales como el hashish y la marihuana; cocaína; fentanilo; LSD; metapualona; opiáceos tales como la heroína, la morfina, la codeína, la hidromorfona, la hidrocodona, la metadona, la oxicodona, la oximorfona y el opio; feniciclina, y propoxifeno, así como metabolitos de los anteriores fármacos de abuso y substancias controladas. El término ``analito'' incluye cualquier substancia antigénica, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y combinaciones de éstos.

``Miembro de unión'', tal como se usa aquí, significa un miembro de un par de unión, es decir, dos moléculas diferentes donde una de las moléculas se une, por medios químicos o físicos, a la otra molécula. Además de pares de unión específicos de antígenos y anticuerpos, otros pares de unión específica incluyen, aunque sin pretender su limitación, avidina y biotina, carbohidratos y lectinas, secuencias nucleotídicas complementarias, secuencias peptídicas complementarias, moléculas efectoras y receptoras, un cofactor enzimático o substrato y una enzima, un inhibidor enzimático y una enzima, una secuencia peptídica y un anticuerpo específico para la secuencia o proteína completa, ácidos y bases poliméricas, tintes y ligantes proteicos, péptidos y ligantes de proteínas específicos (por ejemplo, ribonucleasa S- péptido y ribonucleasa S-proteína) y similares. Más aún, los pares de unión pueden incluir miembros que son análogos del miembro de unión original, por ejemplo, un analito-análogo o un miembro de unión preparado por técnicas recombinantes o por ingeniería molecular. Si el miembro de unión es un inmunorreactivo, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, una mezcla(s) o fragmento(s) de los anteriores, así como una preparación de dichos anticuerpos, péptidos y nucleótidos cuya adecuación para uso como miembros de unión es conocida para los expertos en la técnica.

El término ``resto detectable'', tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier compuesto o grupo químico detectable convencional que tenga una propiedad física o química detectable y que pueda ser usado para marcar un miembro de unión con objeto de formar un conjugado con el mismo. Dicho grupo químico detectable pueden ser, aunque sin pretender su limitación, grupos enzimáticamente activos tales como enzimas, substratos enzimáticos, grupos prostéticos o coenzimas; marcajes de espín; moléculas fluorescentes, tales como fluoróforos y fluorógenos; cromóforos y cromógenos; moléculas luminiscentes, tales como luminóforos, quimioluminóforos y bioluminóforos; moléculas fosforescentes; ligandos específicamente unibles, como biotina y avidina; especies electroactivas; radioisótopos; toxinas; fármacos; haptenos; ADN; ARN; polisacáridos; polipéptidos; liposomas; partículas coloreadas y micropartículas coloreadas, y similares.

Una ``fase sólida'', tal como se usa aquí, se refiere a cualquier material que sea substancialmente insoluble. La fase sólida puede ser seleccionada en cuanto a su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar un miembro de unión y formar un reactivo de captura. Alternativamente, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tenga capacidad de atraer e inmovilizar un miembro de unión para formar un reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una substancia cargada que tenga una carga opuesta con respecto a un miembro de unión o a una substancia cargada conjugada a un miembro de unión. Como otra alternativa más, la molécula receptora puede ser cualquier miembro de unión específica que está unido a la fase sólida y que tenga capacidad de inmovilizar otro miembro de unión por medio de una reacción de unión específica. La molécula receptora permite la unión indirecta de un miembro de unión a un material de fase sólida antes de la realización del ensayo o durante la realización del ensayo. La fase sólida puede ser, por lo tanto, una superficie de látex, plástico, plástico derivatizado, metal magnético o no magnético, vidrio o silicio, o las superficies de tubos de ensayo, pocillos de microtitulación, láminas, perlas, micropartículas, chips y otras configuraciones conocidas para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica.

Se contempla, y está dentro del alcance de la invención, que la fase sólida pueda incluir también cualquier material poroso adecuado con suficiente porosidad para permitir el acceso por reactivos indicadores. En general, se prefieren estructures microporosas, pero se pueden usar también materiales con estructura de gel en estado hidratado. Dichos soportes sólidos útiles incluyen; carbohidratos poliméricos naturales y sus derivados sintéticamente modificados, entrecruzados o substituidos, tales como agar, agarosa, ácido algínico entrecruzado, gomas guar substituidas y entrecruzadas, ésteres de celulosa, especialmente con ácido nítrico y ácidos carboxílicos, ésteres mixtos de celulosa y éteres de celulosa; polímeros naturales que contienen nitrógeno, tales como proteínas y derivados, incluyendo las gelatinas entrecruzadas o modificadas; polímeros hidrocarbonados naturales, tales como látex y caucho; polímeros sintéticos que pueden ser preparados con estructuras adecuadamente porosas, tales como polímeros de vinilo, incluyendo polietileno, polipropileno, poliestireno, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo y sus derivados parcialmente hidrolizados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros y terpolímeros de los anteriores policondensados, tales como poliésteres, poliamidas y otros polímeros, tales como poliuretanos o poliepóxidos; materiales inorgánicos porosos, tales como sulfatos o carbonatos de metales alcalinotérreos y magnesio, incluyendo sulfato de bario, sulfato de calcio, carbonato de calcio, silicatos de metales alcalinos y alcalinotérreos, aluminio y magnesio, y óxidos o hidratos de aluminio o de silicio, tales como arcillas, alúmina, talco, caolín, zeolita, gel de sílice o vidrio (estos materiales pueden ser usados como filtros con los anteriores materiales poliméricos), y mezclas o copolímeros de las clases anteriores, tales como copolímeros de injerto obtenidos por inicialización de la polimerización de polímeros sintéticos sobre un polímero natural preexistente. Todos estos materiales pueden ser usados en formas adecuadas, tales como películas, láminas o placas, o pueden ser depositados sobre, o unirse o ser laminados a vehículos inertes apropiados, tales como papel, vidrio, películas de plástico o tejidos.

La estructura porosa de la nitrocelulosa tiene excelentes cualidades de absorción y adsorción para una amplia variedad de reactivos, incluyendo los anticuerpos monoclonales. El nilón posee también características similares y es también adecuado.

El término ``reactivo de fase sólida'', tal como se usa aquí, significa una fase sólida en la cual se ha inmovilizado un miembro de unión. Los expertos en la técnica reconocerán que un miembro de unión puede inmovilizarse en una fase sólida por numerosos métodos conocidos, incluyendo, por ejemplo, cualquier medio químico y/o físico que no destruya las propiedades de unión específica del miembro de unión específica.

Tal como se utiliza aquí, el término ``estable'', así como sus formas, significa que una entidad química tal como, por ejemplo, un miembro de unión es eficaz en su ambiente de uso y, por lo tanto, tiene o conserva al menos los atributos químicos y/o biológicos o la actividad relevantes para su uso pretendido. Así, por ejemplo, si un compuesto estabilizado es un miembro de unión usado en un inmunoensayo, tendrá la capacidad de unirse a su miembro de unión complementario para formar un par de unión; si un compuesto estabilizado es una enzima, tendrá su actividad enzimática; si el compuesto estabilizado es un resto detectable, tendrá su propiedad detectable. Se entenderá, por supuesto, que no es necesario que un compuesto estabilizado tenga o conserve cada atributo químico en la medida en que el atributo químico que no se conserva no sea relevante para su uso pretendido. Adicionalmente, un compuesto estabilizado, comparado con un compuesto no estabilizado, resiste generalmente la pérdida de sus atributos químicos relevantes cuando se expone a un estrés ambiental, tal como, por ejemplo, temperaturas extremas, pH extremos y solventes orgánicos. Por ello, un compuesto estabilizado, en comparación con un compuesto no estabilizado, conserva generalmente sus atributos químicos relevantes durante períodos de tiempo más largos.

El término ``muestra de ensayo'', tal como se usa aquí, se refiere a un material sospechoso de contener un analito. La muestra de ensayo puede ser usada directamente según se obtiene de la fuente o después de un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra de ensayo puede derivar de cualquier fuente biológica, tal como un fluido fisiológico, incluyendo sangre, saliva, fluido de las lentes oculares, fluido cerebroespinal, sudor, orina, leche, fluido ascítico, mucus, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico y similares. La muestra de ensayo puede ser pretratada antes de su uso, tal como por preparación de plasma a partir de sangre, dilución de fluidos viscosos y similares. Los métodos de tratamiento pueden incluir filtración, destilación, extracción, concentración, inactivación de componentes que interfieren y adición de reactivos. Además de fluidos biológicos o fisiológicos, se pueden usar otras muestras líquidas, tales como agua, productos alimenticios y similares para la realización de ensayos ambientales o de producción de alimentos. Además, se puede usar como muestra de ensayo un material sólido sospechoso de contener el analito. En algunos casos, puede ser beneficioso modificar una muestra de ensayo sólida para formar un medio líquido o para liberar el analito.

II. Agentes monoéster de fosforotioato activables con fosfatasa

La presente invención proporciona nuevos compuestos que exhiben al menos dos grupos monoéster de fosforotioato (-S-PO_{3}^{-2}). Se ha descubierto que estos compuestos tienen utilidad como (i) agentes entrecruzantes, (ii) agentes de conjugación y (iii) agentes reductores. Con anterioridad a la presente invención, los compuestos eran típicamente entrecruzados o conjugados en condiciones químicas severas. Desafortunadamente, dichas condiciones pueden dañar las propiedades químicas y/o biológicas asociadas a los compuestos entrecruzados o conjugados. Los agentes aquí presentados pueden ser activados y a continuación empleados para reducir, entrecruzar y/o conjugar compuestos en condiciones suaves. Más aún, los subproductos de tales reacciones son relativamente inocuos. En consecuencia, un compuesto entrecruzado, por ejemplo, no requiere purificación de los subproductos de una reacción de entrecruzamiento. En consecuencia, los compuestos que son entrecruzados, conjugados o reducidos según se muestra aquí no tienen el riesgo de resultar perjudicados por las condiciones químicas severas.

A. Agentes entrecruzantes y conjugantes

Los agentes entrecruzantes y conjugantes de la presente invención consisten generalmente en un esqueleto monomérico, polimérico u oligomérico que es funcional con al menos tres restos reactivos y al menos dos de los tres restos reactivos consisten en un monoéster de fosforotioato. Los agentes entrecruzantes aquí presentados tienen la fórmula (I) mostrada a continuación, donde Q es un monómero, polímero u oligómero lineal o ramificado y n es al menos dos.

Q-(S-PO_{3}^{-2})_{n}\eqnum{(I)}

Como se ha indicado antes, los agentes entrecruzantes y conjugantes de la presente invención tendrán al menos tres restos reactivos. En consecuencia, cuando n es dos, el esqueleto monomérico, polimérico u oligomérico tendrá al menos otro resto reactivo además del monoéster de fosforotioato. Dichos restos reactivos pueden incluir grupos electrofílicos y nucleofílicos, tales como, por ejemplo, haloalquilos, epóxidos, hidrazidas, hidrazinas, tiolatos, hidroxilos y similares, preferiblemente ésteres activos, aminas y ácidos carboxílicos.

Aunque los agentes entrecruzantes y conjugantes contendrán al menos dos grupos monoéster de fosforotioato, se prefiere que dichos agentes tengan entre aproximadamente 2 y aproximadamente 50 grupos monoéster de fosforotioato, más preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 grupos monoéster de fosforotioato y más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 grupos monoéster de fosforotioato.

Los agentes entrecruzantes y conjugantes aquí ofrecidos son preferiblemente hidrofílicos y exhiben una carga neta negativa que permite una adecuada solubilización de dichos agentes. En consecuencia, se prefiere que el esqueleto de un agente entrecruzante y conjugante sea neutro o que tenga una carga neta negativa. Adicionalmente, es preferible que la solubilidad de dichos agentes sea de al menos 1x10^{-8}M a 25ºC, más preferiblemente de al menos 1x10^{-7}M a 25ºC y más preferiblemente de al menos 1x10^{-6}M a 25ºC.

El tamaño del monómero, polímero u oligómero del esqueleto que contiene un agente entrecruzante y conjugante es en gran parte una cuestión de elección en base al compuesto o compuestos que hayan de ser entrecruzados o conjugados. El esqueleto tendrá un peso molecular medio de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1.000.000, preferiblemente de entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 850.000 y más preferiblemente de entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 750.000. Como se entenderá, por supuesto, el esqueleto tendrá al menos un monómero adecuado para derivatización con al menos un grupo monoéster de fosforotioato. El esqueleto puede ser directamente funcional con el monoéster de fosforotioato, o el esqueleto puede tener un monoéster de fosforotioato pendiente de una cadena lateral o cadenas laterales poliméricas. Cuando están presentes, las cadenas laterales que pueden estar pendientes del esqueleto polímero consisten preferiblemente en cadenas alifáticas de 1 a 40 átomos de carbono eventualmente substituidas con heteroátomos tales como, por ejemplo, nitrógeno (N), oxígeno (O) y azufre (S).

Se ha visto que diversos esqueletos monoméricos, poliméricos u oligoméricos son especialmente adecuados para formar los agentes entrecruzantes y conjugantes aquí presentados. Por ejemplo, como esqueletos adecuados se incluyen, aunque sin pretender limitarlos, polipéptidos lineales o ramificados consistentes en residuos de aminoácidos naturales o sintéticos tales como, por ejemplo, polilisina, poliamidas, ácido poliglutámico y ácido poliaspártico; oligonucleótidos tales como, por ejemplo, ADN y ARN; policarbohidratos o polisacáridos tales como, por ejemplo, poliamilosa, polifuranósidos, polipiranósidos, carboximetilamilosa y dextranos; poliestirenos tales como, por ejemplo, poliestireno clorometilado y poliestireno bromometilado; poliacrilamidas tales como, por ejemplo, poliacrilamida hidrazida; poliácidos tales como, por ejemplo, ácido poliacrílico; polioles tales como, por ejemplo, alcohol polivinílico; polivinilos tales como, por ejemplo, cloruro de polivinilo y bromuro de polivinilo; poliésteres; poliuretanos; poliolefinas; poliéteres; cadenas de alquilo lineales o ramificadas, monoméricas o poliméricas, C_{5-}C_{100.000} que pueden contener eventualmente, en dichas cadenas, heteroátomos que pueden constituir grupos tales como, por ejemplo, aminas, disulfuros, tio-éteres, ésteres activos, carbamatos y similares; cadenas de cicloalquilo C_{10-}C_{750.000}, y similares, así como otros materiales monoméricos, poliméricos u oligoméricos que contienen grupos funcionales reactivos a lo largo de la toda la longitud de su cadena que pueden estar substituidos con un grupo monoéster de fosforotioato.

La síntesis de los agentes entrecruzantes y conjugantes puede ser generalmente realizada funcionalizando un monómero, polímero u oligómero con una funcionalidad monoéster de fosforotioato usando metodologías bien conocidas para los expertos en la técnica. Se pueden funcionalizar esqueletos que tienen, por ejemplo, funcionalidades carboxilato o funcionalidades hidroxilo, tales como, por ejemplo, ácido poliglutámico, ácidos poliacrílicos, carboximetilamilosa y similares, con monoéster de fosforotioato (i) activando funcionalidades carboxilato o hidroxilo con un activador electrofílico adecuado, tal como, por ejemplo, (1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbo-diimida (EDAC) o ácido bromoacético, seguido de EDAD, y (ii) haciendo reaccionar los ésteres activados así formados con cisteamina-S-fosfato. Se pueden funcionalizar esqueletos poliméricos que tienen residuos de haloalquilestireno con un monoéster de fosforotioato por reacción de un haluro de para- u ortofenilalquilo con tiofosfato de sodio (Na_{3}SPO_{3}), según se muestra en el Esquema I. Como se entenderá, por supuesto, se puede activar cualquier monómero, polímero u oligómero que contenga, o al que se haya modificado para obtener, un haluro por reacción de dicho polímero con Na_{3}SPO_{3} en dimetilformamida acuosa según el Esquema I.

Esquema I

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 R \quad \+ - \quad X \quad + \quad  Na _{3} SPO _{3}  \quad
 \rightarrow   \quad R \quad \+ - \quad SPO _{3} \cr  \+ 1 \+
2\cr}

El Esquema I representa de forma general un método descrito por Bieniarz C., Cornwell M.J., Tetrahedron Lett., 34, 939-942 (1993), para convertir un haluro primario o secundario en un monoéster de fosforotioato. Según el Esquema I, el compuesto de fórmula 1, que representa un haluro primario o secundario, donde X es un haluro, es convertido en el correspondiente monoéster de fosforotioato de fórmula 2 usando tiofosfato de sodio tribásico dodecahidrato o tiofosfato de sodio anhidro en un solvente adecuado.

B. Entrecruzamiento químico

Los agentes entrecruzantes y conjugantes de la presente invención (a los que se hará referencia como agentes entrecruzantes en esta sección) pueden ser usados para entrecruzar compuestos activando el agente entrecruzante y poniendo en contacto el agente activado con al menos un compuesto que exhibe grupos electrofílicos y/o nucleofílicos. Según las realizaciones de entrecruzamiento, se forman preferiblemente múltiples enlaces covalentes entre el agente entrecruzante y el compuesto que se entrecruza. Como resultado, se estabiliza un compuesto entrecruzado.

Son ejemplos de agentes entrecruzantes útiles poli(fosforotioato) de carboximetilamilosa, poli(acrilamida) poli[acriloil(2-(2- fosforotioetil)aminoetil]hidrazida, poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico), poli(fosforotioato) de poli(estireno), poli(fosforotioato) de poli(acrilamida) y poli(fosforotioato) de dextrano.

En la Figura 1, se muestra un grupo de agentes entrecruzantes particularmente preferidos. La Figura 1(a) representa poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico), donde m es un número entero de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 50 y n es un número entero de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500; la Figura 1(b) representa poli(fosforotioato) de carboximetilamilosa, donde m es un número entero de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 y n es un número entero de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 500; la Figura 1(c) representa poli(ácido acrílico) poli(hidrazida) poli(fosforotioato), donde k es un número entero de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500, l es un número entero de entre aproximadamente 0 y aproximadamente 500, m es un número entero de entre aproximadamente 0 y aproximadamente 500 y n es un número entero de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 500; la Figura 1(d) representa poli(fosforotioato) de poli(estireno) bromometilado, donde m es un número entero de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 y n es un número entero de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100; la Figura 1(e) representa poli(fosforotioato) de poli(acrilamida) donde m es un número entero de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 500 y n es un número entero de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500, y la Figura 1(f) representa poli(fosforotioato) de dextrano, donde n es un número entero de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 500.

Los agentes entrecruzantes de la presente invención pueden ser activados desprotegiendo el grupo tiol que constituye el monoéster de fosforotioato. La desprotección conlleva generalmente la hidrólisis del grupo fosfato del monoéster de fosforotioato para exponer el grupo tiol nucleofílico. Por ejemplo, se puede desproteger el grupo tiol del monoéster de fosforotioato en condiciones de pH bajo. Preferiblemente la desprotección realizada de este modo tiene lugar a un pH en el rango de entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,5, más preferiblemente en el rango de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,0.

En una realización particularmente preferida, se emplea una enzima hidrolizadora de fosfato (o enzima fosfatasa) para hidrolizar el grupo protector de fosfato del monoéster de fosforotioato. Como las enzimas tienen una actividad catalítica muy específica, típicamente una enzima fosfatasa sólo hidrolizará los grupos fosfato y, por lo tanto, sólo reaccionará con el agente entrecruzante. Por ello, los compuestos que están siendo entrecruzados no son expuestos a condiciones químicas perjudiciales. La activación enzimática de un agente entrecruzante es típicamente realizada con una cantidad catalítica de enzima fosfatasa, preferiblemente en una cantidad de entre aproximadamente 1x10^{-4}M y aproximadamente 1x10^{-14}M, más preferiblemente de entre aproximadamente 1x10^{-6}M y aproximadamente 1x10^{-12}M y más preferiblemente de entre aproximadamente 1x10^{-8}M y aproximadamente 1x10^{-10}M. Como ejemplos de enzimas fosfatasas se incluyen, pero sin pretender limitarlas, las formas nativas y recombinantes de la fosfatasa alcalina, la fosfatasa ácida y similares.

Tras la activación del agente entrecruzante, los grupos tiolato altamente nucleofílicos pueden reaccionar con los grupos electrofílicos exhibidos por los compuestos que serán entrecruzados. Se ha descubierto que, controlando la estequiometría del agente entrecruzante y los compuestos que van a ser entrecruzados, se puede conseguir un entrecruzamiento eficiente. Sorprendentemente, se pueden ajustar las condiciones de reacción de tal forma que se generen compuestos entrecruzados monoméricos, diméricos o triméricos y que se mitigue substancialmente la polimerización no controlada. La razón de agente entrecruzante a compuesto que va a ser entrecruzado es generalmente de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 8:1 y más preferiblemente de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 4:1.

En general, se pueden funcionalizar proteínas (que serán usadas en adelante como representativas de compuestos a entrecruzar o conjugar) con grupos electrofílicos por reacción química con grupos reactivos que se encuentran de forma natural en las proteínas, tales como, por ejemplo, -NH_{2}, -SH y similares. Means, G.E. y Feeny, R.E., Bioconjugate Chemistry, 1: 2-12 (1990), proporcionan un resumen de metodologías para la adición electrofílica. Los grupos electrofílicos que pueden ser usados para funcionalizar proteínas incluyen, aunque sin pretender limitarlos, ligantes heterobifuncionales tales como éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (S-SMPB), éster de m-maleimidobenzoilsulfosuccinimida (S-MBS) y éster de N-\gamma-maleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS), 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) y 4-[(N-maleimidometil)tricaproamido]ciclohexano-1-carboxilato (STCM, descrito en la Patente EE.UU. Nº 4.994.385); grupos haloacetilo tales como yodoacetilo, bromoacetilo y cloroacetilo; grupos acrilato, tales como metacrilatos, grupos quinona y grupos epóxido; grupos tiopiridilo; así como otros disulfuros protegidos, tales como, por ejemplo, cistamina; complejos de metales de transición o metales de transición en diversos estados de oxidación o en formas coloidales que se sabe forman enlaces coordinados estables con tioles, tales como, por ejemplo, hierro, cobalto, níquel, cobre, rutenio, rodio, paladio, plata, osmio, iridio, platino, oro, cadmio y mercurio; y similares. Preferiblemente, se usan grupos maleimida para funcionalizar electrofílicamente una proteína y, más preferiblemente maleimidas de ésteres activos de ácidos alquil(C_{1}-C_{3})carboxílicos y maleimidas de ésteres activos de ácidos arilcarboxílicos que tienen entre aproximadamente 6 y aproximadamente 30 átomos entre los dos grupos funcionales. Se entenderá, por supuesto, que una proteína puede tener funcionalidades adecuadas para la reacción con funcionalidades distintas del monoéster de fosforotioato presentes en el agente entrecruzante.

Preferiblemente, una proteína entrecruzada está ``envuelta'' o ``cosida'' por el agente entrecruzante como resultado de múltiples entrecruzamientos que se forman entre el agente entrecruzante y la proteína. Una vez envuelta por el polímero, una proteína tiene menos libertad conformacional y tiene, por lo tanto, menos probabilidad de sufrir distorsión estructural y, en algunos casos, desnaturalización. En consecuencia, una proteína entrecruzada queda estabilizada. Adicionalmente, una reacción entre un grupo nucleofílico del agente entrecruzante y un grupo electrofílico de una proteína da lugar a la formación de un ``brazo de unión'' que cubre la distancia entre el esqueleto del agente entrecruzante y la proteína. Preferiblemente, esta distancia se mantiene en un mínimo para limitar la libertad conformacional de un compuesto entrecruzado.

Merece la pena observar que la activación enzimática de un agente entrecruzante puede ser empleada en una ``reacción de autocatálisis''. Concretamente, la enzima que cataliza la activación del agente entrecruzante puede ser el compuesto que ha de ser entrecruzado. Según este mecanismo, la enzima puede desproteger un grupo tiol o grupos tiol del agente entrecruzante, el(los) cual(es) a su vez reacciona(n) con la enzima que desenmascaró el grupo tiol o los grupos tioles. Preferiblemente, la cantidad de enzima empleada en una reacción de autocatálisis es de entre aproximadamente 10^{-2}M y aproximadamente 10^{-6}M.

La Figura 2 ilustra, en general, el entrecruzamiento de una proteína según la presente invención. Tal como se ejemplifica en la Figura 2, la proteína de la Figura 2(a), que es funcional con una pluralidad de grupos amina, puede ser derivatizada con ligantes heterobifuncionales, tales como SMCC, para dar la proteína de la Figura 2(b). El agente entrecruzante de la presente invención, representado por la Figura 2(c), puede ser activado, por ejemplo, con enzima fosfatasa alcalina para dar el agente entrecruzante activado representado por la Figura 2(d). Una vez activado, el agente entrecruzante reacciona fácilmente con los grupos electrofílicos de la proteína de la Figura 2(b) para dar la proteína cosida de la Figura 2(e).

Después de haberse completado suficientemente una reacción de entrecruzamiento, la reacción puede finalizar inherentemente porque ya no hay más grupos capaces de reacción, o la reacción puede quedar detenida. Una reacción de entrecruzamiento puede ser detenida rematando los grupos tiol expuestos por adición de cualquiera de los conocidos grupos rematantes de tiol, tales como, por ejemplo, N-etilmaleimida (NEM), yodoacetamida, ácido yodoacético y similares. Alternativamente, uno de los reactivos puede ser eliminado, por ejemplo, pasando la mezcla de reacción sobre una columna de clasificación por tamaños. Después de separar una proteína estabilizada de una mezcla de reacción, los grupos tiol no reaccionados, de haberlos, pueden ser rematados. Como se entenderá, por supuesto, una proteína estabilizada como la representada en la Figura 2(e) puede ser conjugada a otras proteínas usando tiolatos no reaccionados.

Las proteínas entrecruzadas como se muestra aquí exhiben una mayor estabilidad, que puede manifestarse, por ejemplo, por una actividad residual que dura más que la actividad asociada a una proteína no estabilizada, y/o una capacidad para soportar un estrés ambiental mejor que una proteína no estabilizada. Por ejemplo, una enzima estabilizada puede mantener su actividad cuando sufre estrés de temperatura, tal como, por ejemplo, cuando se guarda la enzima durante 7 días a 45ºC o se guarda a 25ºC durante 30 días. Una enzima estabilizada puede conservar su actividad a pH's en los que la enzima no estabilizada no tiene actividad. Otros efectos potenciales de la estabilización pueden incluir la estabilidad de una proteína en un solvente orgánico que habitualmente desnaturalizaría una proteína no estabilizada y el aumento de la capacidad de un miembro de unión para unirse específicamente y así formar un par de unión.

C. Compuestos conjugantes

Los agentes entrecruzantes y conjugantes de la presente invención pueden ser también empleados para conjugar compuestos. En esta sección, se hará referencia a tales agentes como agentes conjugantes. Según las realizaciones de conjugación, al menos se unen dos entidades químicas distintas o se inmovilizan de algún otro modo a un agente conjugante. Por ejemplo, usando un agente conjugante se pueden inmovilizar restos detectables a un miembro de unión para formar un reactivo indicador, se pueden inmovilizar miembros de unión a un gel cromatográfico para formar geles cromatográficos de afinidad y se pueden inmovilizar miembros de unión a una fase sólida para así formar un reactivo de fase sólida.

Mientras que los compuestos ilustrados en la Figura 1 pueden ser empleados como agentes conjugantes, las fórmulas de agentes conjugantes heterobifuncionales según la presente invención no incluyen los encontrados en la Figura 3. La Figura 3(a) representa cisteamidofosforotioato 4,5-ditioheptil-1-carboxilato de N-hidroxisuccinimidilo; la Figura 3(b) representa cisteamidofosforotioato 3-oxibutil-1-carboxilato de N-hidroxisuccinimidilo; la Figura 3(c) representa cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinimidilo 1-carboxilato de heptanoílo; laFigura 3(d) representa cisteamidofosforotioato heptanoil-1-hidrazida; la Figura 3(e) representa cisteamidofosforotioato heptanoil-1-(aminoetil)carboxamida, y la Figura 3(f) representa cisteamidofosforotioato de p-nitrofenilo 1-carboxilato de heptanoílo.

Se pueden conjugar dos o más proteínas entre sí con el agente conjugante aquí facilitado usando el mismo mecanismo de reacción previamente señalado para compuestos entrecruzantes. Concretamente, se puede activar un agente conjugante en condiciones de pH adecuadas o preferiblemente con una enzima fosfatasa. El agente conjugante activado puede contactar entonces con las proteínas que van a ser entrecruzadas. Los grupos tiol nucleofílicos de un agente conjugante activado reaccionan con los grupos electrofílicos presentes en los compuestos que van a ser conjugados para así conjugar los compuestos. Se entenderá, por supuesto, que se puede sacar ventaja de otras funcionalidades reactivas distintas del fosforotioato exhibidas por un agente conjugante para conjugar proteínas. También se entenderá que los compuestos pueden ser modificados con grupos electrofílicos, como antes, para permitir que éstos reaccionen con el agente conjugante.

La razón de reactivos en una reacción de conjugación es dependiente en gran medida del producto final deseado. Así, por ejemplo, si se deseara un reactivo indicador que tiene múltiples restos detectables, la cantidad de restos detectables empleados en una reacción de conjugación sería mayor que la cantidad del miembro de unión o del agente de conjugación empleados. Típicamente, sin embargo, la razón molar del agente conjugante en una reacción de conjugación diseñada para inmovilizar dos compuestos es 1:1:1.

El agente conjugante puede ser también empleado en una reacción de autocatálisis. Por ejemplo, en casos en los que se está conjugando una enzima hidrolizadora de fosfatos, dicha enzima podría servir como agente activante para su propia conjugación. Concretamente, dicha enzima podría hidrolizar el grupo protector de fosfato del monoéster de fosforotioato del agente de conjugación y así permitir una reacción entre el agente conjugante y una enzima electrofílicamente derivatizada, así como cualquier otro compuesto con grupos electrofílicos funcionales que esté siendo conjugado.

La Figura 4 ilustra de forma general la conjugación de múltiples compuestos usando el agente conjugante como plantilla. Tal como se muestra mediante la Figura 4, dos proteínas que han sido funcionalizadas con un grupo de unión maleimida están representadas mediante las Figuras 4(a) y 4(b). El agente de conjugación está representado por la Figura 4(c). Tras la activación con, por ejemplo, una enzima fosfatasa, los grupos tiol del agente de conjugación reaccionan con las maleimidas para formar una estructura de la Figura 4(d). De este modo, se conjugan las proteínas representadas por las Figuras 4(a) y 4(b).

Como conjugación alternativa, una proteína que ha sido entrecruzada puede conjugarse con otras proteínas usando el agente entrecruzante también como agente conjugante. Por ejemplo, la Figura 5 muestra la conjugación de una proteína estabilizada a un anticuerpo. Tal como muestra la Figura 5, un anticuerpo representado por la Figura 5(a) puede ser modificado para exhibir una región reactiva, por ejemplo, por (i) tratamiento con peryodato y (ii) tratamiento con cistamina y cianoborohidruro de sodio, para obtener un anticuerpo que exhibe puentes disulfuro en la región Fc, según se representa en la Figura 5(b). El anticuerpo nucleofílico puede entonces conjugarse a una proteína entrecruzada, como la representada en la Figura 5(c), para dar el conjugado de anticuerpo/proteína estabilizada mostrado en la Figura 5(d).

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De forma similar, la conjugación específica de sitio de un anticuerpo y una proteína estabilizada puede ser realizada según la Figura 6, donde n es menor que el número de funcionalidades carbohidrato presentes en la región Fc de un anticuerpo. Por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo representado por la Figura 6(a) puede ser oxidada con peryodato y expuesta a 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilhidrazida (M_{2}C_{2}H), para obtener el anticuerpo representado por la Figura 6(b). Una proteína estabilizada representada por la Figura 6(c) puede entonces reaccionar con el anticuerpo derivatizado para añadir con especificidad de sitio la proteína estabilizada a la región Fc del anticuerpo y dar el conjugado de la Figura 6(d).

Como ejemplos comparativos que no entran dentro del alcance de la invención, se pueden emplear también agentes conjugantes heterobifuncionales tales como los representados en las Figuras 3(a) a 3(f) para conjugar compuestos. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 14, reacciona cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinimidilo 1-carboxilato de heptanoílo, representado en la Figura 14(a), en condiciones conocidas para los expertos en la técnica con una proteína amino- funcional representada en la Figura 14(b) para dar la proteína de la Figura 14(c). Una proteína maleimido-funcional mostrada en la Figura 14(d) reacciona entonces con la proteína de la Figura 14(c) en presencia de, por ejemplo, una cantidad catalítica de fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina hidroliza los grupos fosfato del ligante heterobifuncional, lo que permite una reacción entre el grupo tiol nucleofílico y la región rica en electrones de la maleimida, para dar las proteínas conjugadas de la Figura 14(e).

D. Agentes reductores

La invención también proporciona un agente reductor estabilizado representado, en general, mediante el compuesto de la fórmula (Y) mostrada a continuación, donde (A) y (Z) pueden ser independientemente seleccionados entre alquileno C_{1}-C_{5} y CONH(CH_{2})_{p}, donde p es un número entero de entre 1 y 5.

1

En la Figura 7 se muestran agentes reductores estables particularmente preferidos, donde el compuesto designado como 7(a) representa disfosfato de ditiotreitol y el compuesto designado como 7(b) representa 1,4-bisfosforo- tioiletiltartramida.

Los agentes reductores protegidos aquí presentados pueden ser generalmente sintetizados usando metodologías previamente descritas. Por ejemplo, según el Esquema I, mostrado anteriormente, se puede convertir cualquier haluro primario o secundario, tal como, por ejemplo, 1,4-dibromo-2,3-butanodiol, en un agente reductor estabilizado. Como otro ejemplo más, los compuestos carboxi-funcionales pueden ser convertidos en agentes reductores estables como se ha indicado con anterioridad. Por ejemplo, se puede convertir el ácido tartárico en un agente reductor estable por (i) activación de los carboxilatos con un activador electrofílico adecuado y (ii) reacción de los ésteres activados así formados con cisteamina-S-fosfato para obtener el agente reductor estabilizado.

De forma similar a los agentes entrecruzantes y conjugantes, los grupos tiol exhibidos por los agentes reductores son protegidos y pueden ser activados tras la hidrólisis del grupo fosfato. Así, los agentes reductores son útiles en, por ejemplo, recipientes de reactivos de inmunoensayo líquidos o liofilizados que requieren condiciones reductoras en el momento de su uso. Cuando se necesita dicho ambiente reductor, los agentes reductores pueden ser activados, por ejemplo, con una enzima hidrolizadora de fosfatos o un ambiente de pH apropiado. Después de hidrolizar los grupos fosfato de las funcionalidades monoéster de fosforotioato, se produce un ambiente reductor, ya que los grupos tiol ya no están protegidos.

III. Ejemplos

Se facilitan los siguientes ejemplos para mayor ilustración de las realizaciones de la invención y no han de ser considerados como limitación del alcance de la invención. Los materiales empleados en los ejemplos están comercializados o pueden ser fácilmente sintetizados. Se puede encontrar una compilación general de materiales y su fuente en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|l|}\hline 
Fuente  \+ Localización de  \+ Material obtenido de la fuente \\  
\+ la fuente \+ \\\hline  Amicon  \+   Beverly, MD  \+
Centriprep-30-Concentrator, \\   \+ 
\+ Centricon-30-Concentrator
\\\hline  Bio-Rad  \+ Hercules, CA  \+ Columna
Econo, columna Bio-Sil \\   \+  \+
SEC-400, resina BIO-REX \\   \+  \+
MSZ 501(D) \\\hline  Pharmacia LKB  \+ Piscataway,  \+
Sistema Phastgel de Pharmacia \\   \+ NJ \+ \\\hline  Spectrum  \+
Houston, TX  \+ Todos los tubos de diálisis \\\hline  Hitachi  \+
Naperville,  \+ Espectrofotómetro de florescencia \\   \+ IL  \+
Hitachi F-4010 \\\hline  Abbott Laboratories  \+
Abbott Park,  \+ Analizador Biocromático \\   \+ IL  \+ Abbott VP,
peroxidasa de \\   \+  \+ rábano picante (HRPO), sal \\   \+  \+
sódica del ácido 3,5-dicloro-2- \\  
\+  \+ -hidroxibencenosulfónico \\   \+  \+ (HDCBS),
4-aminoantipirina \\   \+  \+
(4-AAP) \\\hline  Boehringer  \+ Indianapolis,  \+
Fosfatasa alcalina (ALP) \\  Mannheim  \+ IN  \+ bovina, glucosa
oxidasa \\   \+  \+ (GOD) \\\hline  Yamasa Shoyo  \+ Tokio, Japón 
\+ Glutamato oxidasa (GlOX) \\\hline  Molecular  \+ Eugene, OR  \+
R-ficoeritrina (R-PE), aminodextrano
\\  Probes \+ \+ \\\hline  Pierce  \+ Rockford, IL  \+ Éster
bis-activo del ácido \\   \+  \+
3,3'-ditiopropiónico, ligante \\   \+  \+ SMCC,
ligante M _{2} C _{2} H, \\   \+  \+ éster
bis-activo del ácido \\   \+  \+ diglicólico, éster
bis- \\   \+  \+ activo del ácido subérico \\\hline  Sigma  \+ St.
Louis, MO  \+ Sephadex G-25,
N-etilmaleimida \\   \+  \+ (NEM), bromoacetato de
\\   \+  \+ succinimidilo, tiofosfato \\   \+  \+ de sodio, ácido
poli-L-glutámico, \\   \+  \+
cisteamina-S-fosfato, EDAC, \\   \+ 
\+ carboximetilamilosa, m-peryodato \\   \+  \+ de
sodio, cianoborohidruro de \\   \+  \+ sodio, glucosa,
poliacrilamida \\   \+  \+ hidrazida, fosfato de \\   \+  \+
p-nitrofenilo (PNPP), \\   \+  \+ seroalbúmina
bovina, ácido \\   \+  \+ etilendiaminatetraacético \\   \+  \+
(EDTA) \\\hline  Seradyne  \+ Indianapolis,  \+ Micropartículas
aminadas \\   \+ IN \+ \\\hline  Aldrich  \+ Milwaukee, WI  \+
Monohidrato de hidrazina, \\   \+  \+ etilendiamina,
po-li(acrilamida- co -ácido \\   \+  \+
acrílico), 5,5'-ditiobis(ácido \\   \+  \+
2-nitrobenzoico) (DTNB), \\   \+  \+ gliceraldehído,
kathon, \\   \+  \+
1,4-dibromo-2,3-butanodiol,
\\   \+  \+ nitrato de plata, paranitro-fenol, \\  
\+  \+ ditiotreitol (DTT)
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 1 Síntesis de polímeros funcionalizados con poli(fosforotioato) (a) Poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)

Se disolvieron ácido poli-L-glutámico PM \sim70.000 (1,0 g, 14 \mumol) y cisteamina-S-fosfato (0,26 g, 1,4 mmol) en 40 ml de agua desionizada. Se añadió EDAC (1,00 g, 5,2 mmol) en lotes de 100 mg cada 30 minutos durante 5 horas. Se purificó el producto polimérico con un Centriprep-30-Concentrator frente a agua desionizada y se liofilizó después.

(b) Análisis de fosforotioato

A 1,0 ml de una solución 5,0 \muM de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) en tampón Tris 0,1 M, MgCl_{2}

\hbox{1,0 mM}

, ZnCl_{2} 0,1 mM, pH 7,5 (Tampón A), se añadieron 30 \mul de DTNB (10 mM en Tampón A). Se incubó la solución durante 5 minutos y se registró la absorbancia a 412 nm. No se detectó tiol libre. Se añadió ALP (10 \mul de una solución de 10 mg/ml) y se incubó al solución hasta que no se detectó más aumento en la absorbancia a 412 nm (\sim30 minutos). Se calculó la concentración de tiol libre (0,12 mM) por la absorbancia final a 412 nm (1,54 UA) y el coeficiente de extinción del ácido 2-nitro-5-tiobenzoico (13.000 M-1 cm-1 a pH 7,5). Se encontraron 24 moles de fosforotioato por mol de polímero. (c) Polifosforotioato de carboximetilamilosa

Se disolvieron carboximetilamilosa PM \sim60.000 (0,15 g, 2,5 \mumol) y cisteamina-S-fosfato en 10 ml de agua desionizada. Se añadió EDAC (0,125 g, 0,65 mmol) en lotes de 25 mg cada hora durante 5 horas. Se purificó el producto carbohidratado en un Centriprep-30-Concentrator frente a agua desionizada y se liofilizó después. El análisis de fosforotioato (realizado como se ha descrito antes) reveló 1 fosforotioato por cadena polimérica de carboximetilamilosa.

(d) Poli(acrilamida) poli[acriloil(2-(2-fosforo- tioetil)aminoetil]hidrazida

Se disolvió poliacrilamida hidrazida PM \sim180.000 (0,050 g, 0,28 \mumol) en 20 ml de tampón acetato de sodio

\hbox{0,05 M}

pH 4,5 (Tampón B). Se añadieron gliceraldehído (0,080 g, 0,89 mmol) y cianoborohidruro de sodio (0,056 g,

\hbox{0,89 mmol}

) y se agitó la solución durante 20 horas. Se purificó el producto polidiólico en un Centriprep-30-Concentrator frente a Tampón B. Se añadió peryodato de sodio (0,095 g, 4,4 mmol) en 10 ml de Tampón B al polidiol y se agitó la mezcla durante 1 hora en un baño de hielo, se dejó que se calentara hasta la temperatura ambiente y se agitó de nuevo durante otra hora. Se purificó el producto polialdehídico en un Centriprep-30-Concentrator frente a tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 5,5.

Se añadieron al polialdehído cisteamina-S-fosfato (0,079 g, 0,44 mmol) y cianoborohidruro de sodio (0,028 g, 0,44 mmol) y se agitó la mezcla durante la noche. Se purificó el polifosforotioato producto en un Centriprep-30-Concentrator frente a agua desionizada y se liofilizó después. El análisis de fosforotioato (realizado como se ha descrito antes) reveló 66 fosforotioatos por polímero.

(e) Poli(fosforotioato) de poli(amino)dextrano

Se disuelve aminodextrano (PM \sim70.000, aproximadamente 30 aminas/polímero) en agua desionizada, se disuelven 20 equivalentes de bromoacetato de succinimidilo en dimetilformamida (DMF) y se añade un volumen de esta solución mayor del 10% de la solución de aminodextrano a la solución de aminodextrano para formar una mezcla de reacción. Se agita la mezcla de reacción durante 3 horas a temperatura ambiente y se purifica el polímero bromoacetilado resultante frente a agua desionizada con un Centriprep-30-Concentrator. Se añaden entonces 50 equivalentes de tiofosfato de sodio en agua desionizada al polímero purificado y se agita la mezcla resultante durante 2 horas a temperatura ambiente. Se purifica el aminodextrano fosforotioado resultante como antes con un Centriprep-30-Concentrator y se liofiliza.

(f) Poli(fosforotioato) de poli(acrilamida-co-ácido acrílico)

Se disuelven poli(acrilamida-co-ácido acrílico) PM \sim200.000 (1,0 g, 5 \mumol) y cisteamina-S-fosfato (0,09 g,

\hbox{0,5 mol}

) en 40 ml de agua desionizada. Se añade EDAC (0,5 g, 2,6 mmol) en lotes de 50 mg cada 30 minutos durante

\hbox{5 horas}

. Se purifica entonces el producto polimérico en un Centriprep-30-Concentrator frente a agua desionizada y se liofiliza después. Ejemplo 2 Entrecruzamiento con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de fosfatasa alcalina (ALP) bovina (a) Entrecruzamiento de fosfatasa alcalina

A 0,75 ml de 10 mg/ml (50 nmol) de ALP se añadieron 1,25 ml de fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl_{2}

\hbox{1,0 mM}

, ZnCl_{2} 0,1 mM, pH 7,0 (Tampón C). Se concentró la enzima a aproximadamente 0,2 ml usando un Centricon-30-Concentrator. Se rediluyó el concentrado a 2,0 ml con tampón C y se reconcentró después a 0,2 ml. Se repitió este procedimiento de concentración/dilución tres veces. Se llevó el volumen de la solución de enzima a 1,5 ml con tampón C y se puso en un vial. A 75 \mul de DMF se añadieron 0,62 mg (1,87 \mumol) de SMCC. Se añadió esta solución a 1,46 ml de 4,8 mg/ml (46,7 nmol) de fosfatasa alcalina lavada y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Se vertió Sephadex G-25 grosero, que había sido previamente rehidratado con fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,1 M, azida al 0,05%, pH 7,0 (Tampón D) hasta una altura de lecho de 45 cm en una columna Econo de 1 x 50 cm. Se equilibró la columna con tres volúmenes de columna de tampón c. Siguiendo la incubación, se aplicó la fosfatasa alcalina derivatizada con SMCC a la columna G-25 para eliminar el SMCC no reaccionado. Se eluyó la columna con tampón C y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con A_{280} mayor de 0,5 UA y se usó la A_{280} del pool para calcular la concentración de enzima de la fosfatasa alcalina derivatizada con SMCC. A 300 \mul de Tampón C, se añadieron 2,43 mg (34,7 nmol) de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de PM 70.000 (26 SPO3/PGA). Se añadió esta solución a 1,86 ml de 1,40 mg/ml (17,4 nmol) de fosfatasa alcalina derivatizada con SMCC y se dejó reaccionar durante la noche a 5ºC rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. (b) Caracterización de la ALP entrecruzada

Se evaluó ALP entrecruzada con poli(fosfo-rotioato) de poli(ácido glutámico) por cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna Bio-Sil SEC-400. Se hizo la detección a 280 nm. La fase móvil era fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 7,0 (Tampón E), que recorría a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los resultados de esta evaluación mostraron que la población primaria generada tenía un tiempo de retención correspondiente a enzima entrecruzada singlete con muy poca polimerización. También se evaluó la fosfatasa alcalina entrecruzada por SDS-PAGE usando un sistema Phastgel. Se operaron geles en gradiente del 7%-10% de poliacrilamida en condiciones no reductoras y reductoras. Los resultados de las condiciones no reductoras mostraron que la población primaria generada era enzima entrecruzada singlete con muy poca polimerización. Los resultados de las condiciones reductoras mostraron que la ALP entrecruzada no se reducía en condiciones que eran suficientes para reducir la ALP nativa en monómeros. Se evaluó la actividad enzimática residual de la ALP entrecruzada y se la comparó con la actividad de la ALP nativa a la misma concentración. A 1,0 ml de PNPP 7 mM en tampón de dietanolamina 0,5 M, MgCl_{2} 1,0 mM. ZnCl_{2} 0,1 mM, pH 10,2 (Tampón F), se añadieron 20 \mul de 10 \mug/ml de ALP. Se calculó la velocidad (UA/segundo) de cambio en la absorbancia a 412 nm a lo largo de un intervalo de 14 segundos. La velocidad generada por las preparaciones de ALP entrecruzada fue dividida por la velocidad generada por la ALP nativa para calcular el porcentaje de actividad enzimática residual para las preparaciones entrecruzadas. Los resultados de esta evaluación mostraron que la ALP entrecruzada había retenido el 80% de la actividad enzimática inicial.

(c) Evaluación de la estabilidad térmica de la ALP entrecruzada

Se evaluó la estabilidad térmica de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 45ºC y se comparó con la ALP nativa en las mismas condiciones. Se diluyeron tanto la enzima nativa como la enzima entrecruzada a 10 \mug/ml con tampón A. Estas diluciones fueron guardadas en una incubadora a 45ºC durante la duración del estudio. El día 0 y en varios puntos de tiempo en el transcurso del estudio, se evaluó la actividad de las diluciones. Se añadieron a volúmenes separados de 1,0 ml de PNPP 7 mM en tampón F 20 \mul de las diluciones de ALP de 10 \mug/ml. Se calculó la velocidad de cambio en la absorbancia a 412 nm a lo largo de un intervalo de 14 segundos. Se dividió la velocidad generada por las preparaciones enzimáticas en los diversos puntos temporales por la velocidad generada por la misma preparación enzimática el día 0 para calcular el porcentaje de actividad enzimática residual para las preparaciones estresadas. En la Figura 8 se muestran los resultados de esta evaluación.

Ejemplo 3 Entrecruzamiento con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de la glucosa oxidasa (GOD) (Aspergillus niger) (a) Entrecruzamiento de la GOD

A 200 mg (1,25 \mumol) de GOD se añadieron 20 ml de tampón E. Se concentró la enzima a aproximadamente

\hbox{2 ml}

usando un Centriprep-30-Concentrator con un corte de PM de 30.000. Se rediluyó el concentrado a 20 ml usando tampón E y se reconcentró luego a 2 ml. Este procedimiento de concentración/dilución fue repetido tres veces. El volumen de la solución enzimática fue llevado a 6 ml con tampón E y colocado en un vial. A 500 \mul de DMF se añadieron

\hbox{9,39 mg}

(28,1 \mumol) de SMCC. Se añadió esta solución a una alícuota de 977 \mul de GOD lavada a

\hbox{30,7 mg/ml}

(

\hbox{187 nmol}

) y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Se preparó una Sephadex G-25 como antes con tampón E y, después de la incubación, se aplicó la GOD derivatizada con SMCC a la columna G-25 para eliminar el SMCC no reaccionado. Se eluyó la columna con tampón E y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Las fracciones con una A_{280} mayor de 0,5 UA fueron reunidas y la A_{280} del pool fue usada para calcular la concentración enzimática de la GOD derivatizada con SMCC. A 1,5 ml de tampón C, se añadieron 56,3 mg (938 nmol) de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de PM 60.000 (19 SPO3/PGA). Se añadieron a esta solución 50 \mul de ALP a 10 mg/ml (3,33 nmol) para desproteger el fosforotioato. Se dejó que esta desprotección procediera durante tres horas a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Después de la incubación, se añadió una alícuota de 300 \mul (188 nmol) de esta solución a 1,26 ml de GOD derivatizada con SMCC a 7,95 mg/ml (62,6 nmol) y se dejó reaccionar durante la noche a 5ºC mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio. (b) Caracterización de la GOD entrecruzada

Se evaluó la GOD entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) por cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna Bio-Sil SEC-400. Se hizo la detección a 280 nm. La fase móvil era tampón E, que recorría a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto. Los resultados de esta evaluación mostraron que la población primaria generada tenía un tiempo de retención correspondiente a enzima entrecruzada singlete con muy poca polimerización. La actividad enzimática residual de la GOD entrecruzada fue también evaluada y comparada con la actividad de la GOD nativa a la misma concentración. A 260 \mul de 4-aminoantipirina(4-AAP) 2 mM, ácido 2-hidroxi-3,5-diclorobenceno (HDCBS) 8 mM, 1 U/ml de peroxidasa de rábano picante (HRPO) y glucosa 100 mM en tampón E, se añadieron 100 \mul de GOD a 2 \mug/ml en tampón E. Se calculó la velocidad (UA/minuto) de cambio en la absorbancia a 550 nm a lo largo de un intervalo de 2 minutos. Se dividió la velocidad generada por las preparaciones de GOD entrecruzada por la velocidad generada por la GOD nativa para calcular el porcentaje de actividad enzimática residual para las preparaciones entrecruzadas. Los resultados de esta evaluación mostraron que la GOD entrecruzada había retenido un 85% de la actividad enzimática inicial.

(c) Evaluación de la estabilidad térmica de la GOD entrecruzada a pH 7,4

Se evaluó la estabilidad térmica de GOD entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 37ºC y se comparó con la GOD nativa en las mismas condiciones. Se diluyeron tanto la enzima nativa como la enzima entrecruzada a 500 \mug/ml con tampón de fosfato de sodio 0,1 M, EDTA 1,0 mM, NaCl 0,1 M, Kathon 0,05%, pH 7,4 (Tampón G). Se guardaron estas diluciones en una incubadora a 37ºC durante la duración del estudio. El día 0 y en varios puntos de tiempo en el transcurso del estudio, se evaluó la actividad de ambas preparaciones. Antes de la evaluación, se diluyeron las preparaciones de enzimas estresadas a 2 \mug/ml usando tampón E. A 260 \mul de 4-AAP

\hbox{2 mM}

, HDCBS 8 mM, 1 U/ml de HRPO, glucosa 100 mM en tampón E, se añadieron 10 \mul de cada una de las diluciones de 2 \mug/ml de glucosa oxidasa en tampón E. Se calculó la velocidad (UA/minuto) de cambio en la absorbancia a

\hbox{550 nm}

a lo largo de un intervalo de 2 minutos. Se dividió la velocidad generada por las preparaciones enzimáticas en los diversos puntos temporales por la velocidad generada por la misma preparación enzimática el día 0 para calcular el porcentaje de actividad enzimática residual para las preparaciones estresadas. Los resultados de esta evaluación son mostrados en la Figura 9. (d) Evaluación de la estabilidad térmica de la GOD entrecruzada a pH 9,0

Se evaluó la estabilidad térmica de la GOD entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 37ºC y se la comparó con la GOD nativa en las mismas condiciones. Se diluyeron tanto la enzima nativa como la enzima entrecruzada a 500 \mug/ml con tampón de fosfato de sodio 0,1 M, EDTA 1,0 mM, NaCl 0,1 M, Kathon 0,05%, pH 9,0 (Tampón H). Se guardaron estas diluciones en una incubadora a 37ºC durante la duración del estudio. El día 0 y en varios puntos de tiempo en el transcurso del estudio, se evaluó la actividad de ambas preparaciones. Antes de la evaluación, se diluyeron las preparaciones de enzimas estresadas a 2 \mug/ml usando tampón E. A 260 \mul de 4-AAP 2 mM, HDCBS 8 mM, 1 U/ml de HRPO, glucosa 100 mM en tampón E, se añadieron 10 \mul de cada una de las diluciones de 2 \mug/ml de GOD. Se calculó la velocidad (UA/minuto) de cambio en la absorbancia a 550 nm a lo largo de un intervalo de 2 minutos. Se dividió la velocidad generada por las preparaciones enzimáticas en los diversos puntos temporales por la velocidad generada por la misma preparación enzimática el día 0 para calcular el porcentaje de actividad enzimática residual para las preparaciones estresadas. Los resultados de esta evaluación son mostrados en la Figura 10.

Ejemplo 4 Entrecruzamiento con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de la glutamato oxidasa (GlOX) (Streptomyces sp. X119-6) (a) Entrecruzamiento de la GlOX

A 100 mg (714 nmol) de GlOX se añadieron 20 ml de tampón E. Se concentró esta solución a aproximadamente

\hbox{2
ml}

usando un Centriprep-30-Concentrator con un corte de PM de 30.000. Se rediluyó el concentrado a 20 ml usando tampón E y se reconcentró luego a 2 ml. Este procedimiento de concentración/dilución fue repetido tres veces. El volumen de la solución enzimática fue llevado a 3 ml con tampón E y colocado en un vial. A 800 \mul de DMF se añadieron 4,18 mg (12,5 \mumol) de SMCC. Se añadió esta solución a una alícuota de 1,25 ml de GlOX lavada a

\hbox{28,0 mg/ml}

(250 nmol) y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Se preparó una columna Sephadex G-25 como antes con tampón E y, después de la incubación, se aplicó la GlOX derivatizada con SMCC a la columna G-25 para eliminar el SMCC no reaccionado. Se eluyó la columna con tampón E y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Las fracciones con una A_{410} mayor de 1,0 UA fueron reunidas y la A_{410} del pool fue usada para calcular la concentración enzimática de la GlOX derivatizada con SMCC. A 2,5 ml de tampón C, se añadieron 100 mg (1,67 \mumol) de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de PM 60.000 (18 SPO3/PGA). Se añadieron a esta solución 50 \mul de ALP a 10 mg/ml (3,33 nmol) para desproteger el fosforotioato. Se dejó que esta desprotección procediera durante tres horas a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Después de la incubación, se añadió una alícuota de 524 \mul (343 nmol) de esta solución a 1,74 ml de GlOX derivatizada con SMCC a 6,88 mg/ml (85,5 nmol) y se dejó reaccionar durante la noche a 5ºC mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio. (b) Caracterización de la GlOX entrecruzada

Se evaluó la GlOX entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) por cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna Bio-Sil SEC-400. Se hizo la detección a 410 nm. La fase móvil era tampón E, que recorría a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto. Los resultados de esta evaluación mostraron que la población primaria generada tenía un tiempo de retención correspondiente a enzima entrecruzada doblete y triplete con muy poca polimerización. La actividad enzimática residual de la GlOX entrecruzada fue también evaluada y comparada con la actividad de la GlOX nativa a la misma concentración. Se realizaron las mediciones de actividad usando un analizador bicromático VP. Se dividió la actividad generada por las preparaciones de GlOX entrecruzada por la actividad generada por la GlOX nativa para calcular el porcentaje de actividad enzimática residual para las preparaciones entrecruzadas. Los resultados de esta evaluación mostraron que la GlOX entrecruzada había retenido un 81% de la actividad enzimática inicial.

(c) Evaluación de la estabilidad térmica de la GlOX entrecruzada

Se evaluó la estabilidad térmica de GlOX entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 37ºC y se comparó con la GlOX nativa en las mismas condiciones. Se diluyeron tanto la enzima nativa como la enzima entrecruzada a 500 \mug/ml con tampón G. Se guardaron estas diluciones en una incubadora a 37ºC durante la duración del estudio. El día 0 y en varios puntos de tiempo en el transcurso del estudio, se evaluó la actividad de ambas preparaciones. Antes de la evaluación, se diluyeron las preparaciones de enzimas estresadas a 6 \mug/ml usando tampón E. Se realizaron las mediciones de actividad usando un analizador bicromático VP. Se dividió la actividad generada por las preparaciones enzimáticas en los diversos puntos temporales por la actividad generada por la misma preparación enzimática el día 0 para calcular el porcentaje de actividad enzimática residual para las preparaciones estresadas. Los resultados de esta evaluación son mostrados en la Figura 11.

Ejemplo 5 Entrecruzamiento con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de R-ficoeritrina (R-PE) (Porphyra tenera) (a) Entrecruzamiento de la R-PE

A 2,5 ml de R-PE a 10 mg/ml se añadieron 2 ml de tampón E. Se transfirió esta solución a tubos de diálisis Spectrapore-2 con un corte de PM de 12.000-14.000 y se dializó durante 24 horas cada vez frente a tres cambios de 4 litros de tampón E. A 200 \mul de DMF se añadieron 0,49 mg (1,47 \mumol) de SMCC. Se añadió esta solución a una alícuota de 1,21 ml de R-PE dializada a 5,80 mg/ml (29,2 nmol) y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Se preparó una columna Sephadex G-25 como antes con tampón E y, después de la incubación, se aplicó la R-PE derivatizada con SMCC a la columna G-25 para eliminar el SMCC no reaccionado. Se eluyó la columna con tampón E y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Las fracciones con una A_{566} mayor de 1,0 UA fueron reunidas y la A_{566} del pool fue usada para calcular la concentración enzimática de la R-PE derivatizada con SMCC. A 1 ml de tampón C, se añadieron 10 mg (167 nmol) de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) de PM 60.000 (18 SPO3/PGA). Se añadieron a esta solución 25 \mul de ALP a 10 mg/ml (1,67 nmol) para desproteger el fosforotioato. Se dejó que esta desprotección procediera durante tres horas a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Después de la incubación, se añadió una alícuota de 71 \mul (11,5 nmol) de esta solución a 1,91 ml de R-PE derivatizada con SMCC a 1,44 mg/ml (11,5 nmol) y se dejó reaccionar durante la noche a 5ºC mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio.

(b) Caracterización de la R-PE entrecruzada

Se evaluó la R-PE entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) por cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna Bio-Sil SEC-400. Se hizo la detección a 280 nm. La fase móvil era tampón E, que recorría a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto. Los resultados de esta evaluación mostraron que la población primaria generada tenía un tiempo de retención correspondiente a enzima entrecruzada singlete y doblete con muy poca polimerización. La actividad de fluorescencia residual de la R-PE entrecruzada fue también evaluada y comparada con la fluorescencia de la R-PE nativa a la misma concentración. Se realizaron las mediciones de fluorescencia usando un espectrofotómetro de fluorescencia F-4010. Se dividió la fluorescencia generada por las preparaciones de R-PE entrecruzada por la fluorescencia de la R-PE nativa para calcular el porcentaje de fluorescencia residual para las preparaciones entrecruzadas. Los resultados de esta evaluación mostraron que la R-PE entrecruzada había retenido un 92% de la intensidad de florescencia inicial.

(c) Evaluación de la estabilidad térmica de la fluorescencia de la R-PE entrecruzada

Se evaluó la estabilidad térmica de R-PE entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 45ºC y se comparó con la R-PE nativa en las mismas condiciones. Se diluyeron tanto la enzima nativa como la enzima entrecruzada a 100 \mug/ml con tampón E. Se guardaron estas diluciones en una incubadora a 45ºC durante la duración del estudio. El día 0 y en varios puntos de tiempo en el transcurso del estudio, se evaluó la intensidad de la fluorescencia de ambas preparaciones. Antes de la evaluación, se diluyeron las preparaciones de proteínas estresadas a 1 \mug/ml usando tampón E. Se realizaron las mediciones de la intensidad de fluorescencia usando un espectrofotómetro de fluorescencia F-4010. Se dividió la fluorescencia de las preparaciones de R-PE a los diversos puntos temporales por la fluorescencia de la misma preparación el día 0 para calcular el porcentaje de intensidad de fluorescencia residual para las preparaciones estresadas. Los resultados de esta evaluación son mostrados en la Figura 12.

(d) Evaluación de la estabilidad térmica de la R-PE entrecruzada por tamaños

Se evaluó la estabilidad térmica de la R-PE entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 45ºC y se comparó con la R-PE nativa en las mismas condiciones. Se usó una columna Bio-Sil SEC-400 para seguir la descomposición de la R-PE estresada en componentes subunitarios menores. Se hizo la detección a 280 nm. La fase móvil era tampón E, que recorría a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto. Tanto la proteína nativa como la proteína entrecruzada fueron diluidas a 100 \mug/ml con tampón E. Estas diluciones fueron guardadas en un incubador a 45ºC durante la duración del estudio. El día 0 y en diversos puntos de tiempo en el transcurso del estudio, se evaluó el porcentaje de la absorbancia total a 280 nm que se debía a los componentes pequeños. Los resultados de esta evaluación están mostrados en la Figura 13.

Ejemplo 6 Conjugado de fosfatasa alcalina (ALP) bovina entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)/IgG anti-TSH (a) Derivatización del anticuerpo anti-TSH

A 1 ml de IgG anti-TSH a 6,6 mg/ml se añadió 1 ml de tampón C. Se concentró el anticuerpo a aproximadamente 0,2 ml usando un Centricon-30-Concentrator con un corte de PM de 30.000. Se rediluyó el concentrado a 2 ml usando tampón C y se reconcentró después a 0,2 ml. Se repitió este procedimiento de concentración/dilución tres veces. Se llevó el volumen de la solución de anticuerpo a 1 ml con tampón C y se puso en un vial. A 50 \mul de DMF se añadieron 0,56 mg (831 nmol) de ligante succinimidil(tricaproamidociclohexilmetil)-N-maleimida (STCM). Se preparó el ligante como se describe en la Patente Estadounidense Nº 4.994.385, la cual es aquí incorporada como referencia. Se añadió esta solución a 0,47 ml de anticuerpo lavado a 5,30 mg/ml (16,6 nmol) y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Se preparó una Sephadex G-25 como antes con tampón C y se aplicó después de la incubación el anticuerpo derivatizado a la columna G-25 para eliminar el ligante no reaccionado. Se eluyó la columna con tampón C y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de 0,5 UA y se usó la A_{280} del pool para calcular la concentración del anticuerpo derivatizado con el ligante. Se guardó el pool de anticuerpo en hielo hasta su conjugación.

(b) Conjugación de la IgG anti-TSH derivatizada con ligante a ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)

A una alícuota de 0,72 ml de IgG anti-TSH derivatizada con ligante a 0,83 mg/ml (4 nmol) se añadieron

\hbox{0,69 ml}

de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 1,30 mg/ml (6 nmol) (preparada según el Ejemplo 2). Se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante la noche a 5ºC mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio. Ejemplo 7 Conjugado de R-ficoeritrina (R-PE) entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)/IgG anti-CD8 (a) Derivatización del anticuerpo anti-CD8

A 1 ml de IgG anti-CD8 a 4,1 mg/ml se añadió 1 ml de tampón E. Se concentró el anticuerpo a aproximadamente 0,2 ml usando un Centricon-30- Concentrator con un corte de PM de 30.000. Se rediluyó el concentrado a 2 ml usando tampón E y se reconcentró después a 0,2 ml. Se repitió este procedimiento de concentración/dilución tres veces. Se llevó el volumen de la solución de anticuerpo a 1 ml con tampón E y se puso en un vial. A 150 \mul de DMF se añadieron 0,15 mg (223 nmol) de ligante STCM (preparado como en el ejemplo 6). Se añadió esta solución a 0,50 ml de anticuerpo lavado a 4,39 mg/ml (14,6 nmol) y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Se preparó una columna Sephadex G-25 como antes con tampón E y después de la incubación se aplicó el anticuerpo derivatizado a la columna G-25 para eliminar el ligante no reaccionado. Se eluyó la columna con tampón E y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de

\hbox{0,5 UA}

y se usó la A_{280} del pool para calcular la concentración del anticuerpo derivatizado con el ligante. Se guardó el pool de anticuerpo en hielo hasta su conjugación. (b) Conjugación de la IgG anti-CD8 derivatizada con ligante a ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)

A una alícuota de 0,53 ml de IgG anti-CD8 derivatizada con ligante a 1,71 mg/ml (6 nmol) se añadieron 0,68 ml de R-PE entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a 2,11 mg/ml (6 nmol) (preparada según el Ejemplo 5). Se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante la noche a 5ºC mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio.

Ejemplo 8 Preparación de conjugado de anticuerpo anti-alfa hCG de cabra/fosfatasa alcalina (ALP) bovina usando poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) como plantilla (a) Derivatización del anticuerpo de cabra anti-alfa hCG

Se diluyó una alícuota de 1 ml de IgG de cabra anti-alfa HCG que contenía 2,8 mg (18,7 nmol) con 1 ml de tampón E. Se concentró el anticuerpo a aproximadamente 0,2 ml por centrifugación a 5000 x g usando un Centricon-30-Concentrator que contiene una membrana con un tamaño adecuado para pasar el material que tiene un peso molecular medio numérico de hasta aproximadamente 30.000. Se diluyó el concentrado a 2 ml con tampón E y se reconcentró después a aproximadamente 0,2 ml. Se repitió este procedimiento de concentración y dilución dos veces más. A continuación, se llevó el volumen a 1 ml con tampón E y se puso la solución de anticuerpo en un vial. A la solución de anticuerpo se añadieron 0,19 mg (280 nmol) de ligante STCM (preparado como en el ejemplo 6) disueltos en 100 \mul de DMF. Se agitó suavemente la mezcla de reacción resultante en un agitador rotatorio durante una hora a temperatura ambiente. Se purificó el anticuerpo derivatizado por cromatografía de exclusión por tamaños con una columna Sephadex G-25 de 1 x 45 cm. Se equilibró la columna y se eluyó con tampón E. Se recogieron fracciones de alrededor de 1 ml cada una durante la elución y se determinó la absorbancia a 280 nm. Se juntaron las fracciones pico y se calculó la concentración del anticuerpo en el pool por su absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción (E1cm1%) de 13,9. Se guardó el pool de anticuerpo en hielo hasta su conjugación.

(b) Derivatización de ALP

Se diluyó una alícuota de 0,7 ml que contenía 7 mg (46,6 nmol) de ALP a 2 ml con tampón C y se concentró a aproximadamente 0,2 ml centrifugando a 5000 x g usando un Centricon-30-Concentrator. Se diluyó la enzima concentrada de nuevo a 2 ml con tampón C y se reconcentró a aproximadamente 0,2 ml. Se llevó el volumen a 1 ml con tampón C y se puso la solución de enzima en un vial. Se añadieron a la solución de enzima 0,63 mg (935 nmol) de STCM (preparado como en el Ejemplo 6) disuelto en 200 \mul de DMF. Se agitó suavemente la mezcla de reacción resultante en un agitador rotatorio durante 30 minutos a temperatura ambiente y se purificó la enzima derivatizada por cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna de 1 x 45 cm de Sephadex G-25. Se equilibró la columna y se eluyó con tampón C. se recogieron fracciones de aproximadamente 1 ml cada una durante la elución y se determinó la absorbancia a 280 nm. Se juntaron las fracciones pico y se calculó la concentración de la enzima en el pool por su absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción (E1cm1%) de 10.

(c) Conjugación de la enzima derivatizada y del anticuerpo con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) como plantilla

Se prepararon tres conjugados, con razones molares variables de anticuerpo:enzima:poli-(fosforotioato) de poli(ácido glutámico), como sigue:

Conjugado 1

Anticuerpo:enzima:poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (1:1:1)

Se mezcló una alícuota de 1,0 ml (0,7 mg ó 4,6 nmol) del anticuerpo anti-alfa hCG derivatizado con 0,45 ml (

\hbox{0,7 mg}

ó 4,7 nmol) de la ALP derivatizada y 0,32 ml (0,32 mg ó 4,6 nmol) de una solución acuosa de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico). Se agitó suavemente la mezcla resultante en un agitador rotatorio durante la noche a 2-8ºC.

Conjugado 2

Anticuerpo:enzima:poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (1:3:1)

Se mezclaron 0,68 ml (0,5 mg ó 3,3 nmol) de la solución de anticuerpo anti-alfa hCG derivatizado con 0,96 ml (

\hbox{1,5 mg}

ó 10 nmol) de la ALP derivatizada y 0,23 ml (0,23 mg ó 3,3 nmol) de una solución acuosa de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico). Se agitó suavemente la mezcla resultante en un agitador rotatorio durante la noche a 2-8ºC.

Conjugado 3

Anticuerpo:enzima:poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (1:1:0,5)

Se mezcló 1 ml (0,7 mg ó 4,6 nmol) de la solución de anticuerpo anti-alfa hCG derivatizado con 0,45 ml (0,7 mg ó 4,6 nmol) de la ALP derivatizada y 0,17 ml (0,17 mg ó 2,4 nmol) de una solución acuosa de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico). Se agitó suavemente la mezcla resultante en un agitador rotatorio durante la noche a 2-8ºC.

Se evaluaron los tres conjugados por HPLC de exclusión por tamaños. No se detectó anticuerpo o enzima residual en los conjugados 1 y 3. El conjugado 2, sin embargo, contenía aproximadamente un 20% de material de partida residual, presumiblemente enzima.

Los grupos tiol no reaccionados del poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) conjugado o libre fueron rematados por tratamiento con N- etilmaleimida (NEM) durante un período de 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron alícuotas de una solución 5 mM al conjugado, de tal forma que la concentración final de NEM en el conjugado fuera de aproximadamente 0,3 mM.

Ejemplo 9 Preparación de conjugado de anticuerpo anti-proteína filamentosa pancreática/fosfatasa alcalina (ALP) bovina usando poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) como plantilla (a) Derivatización del anticuerpo anti-proteína filamentosa pancreática

Se concentraron 4,0 ml de una solución de 1 mg/ml de anticuerpo anti-proteína filamentosa pancreática a aproximadamente 0,2 ml centrifugando a 5000 x g usando un Centricon-30-Concentrator y se diluyó el concentrado a 2 ml con tampón E y se reconcentró a aproximadamente 0,2 ml. Se repitió este procedimiento de concentración y dilución dos veces más, después de lo cual el volumen fue llevado a 1 ml con tampón E. Se puso la solución de anticuerpo en un vial y se añadieron 0,27 mg de ligante STCM (preparado como en el ejemplo 6) disueltos en 100 \mul de DMF. Se agitó suavemente la mezcla de reacción resultante en un agitador rotatorio durante una hora a temperatura ambiente. Se purificó el anticuerpo derivatizado por cromatografía en una columna de 1 x 45 cm de Sephadex G-25. Se equilibró la columna y se eluyó con tampón E. Se recogieron fracciones de aproximadamente 1 ml cada una durante la elución y se determinó la absorbancia a 280 nm. Se juntaron las fracciones pico y se calculó la concentración del anticuerpo en el pool por su absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción (E1cm1%) de 13,9. Se guardó el pool de anticuerpo en hielo hasta su uso en la reacción de conjugación.

(b) Derivatización de ALP

Se diluyó una alícuota de 0,7 ml que contenía 7 mg (46,6 nmol) de ALP a 2 ml con tampón C y se concentró a aproximadamente 0,2 ml centrifugando a 5000 x g usando un Centricon-30-Concentrator. Se diluyó la enzima concentrada de nuevo a 2 ml con tampón C y se reconcentró a aproximadamente 0,2 ml. Se llevó el volumen a 1 ml con tampón C y se puso la solución de enzima en un vial. Se añadieron a la solución de enzima 0,63 mg (935 nmol) de STCM (preparado como en el Ejemplo 6) disuelto en 200 \mul de DMF. Se agitó suavemente la mezcla de reacción resultante en un agitador rotatorio durante 30 minutos a temperatura ambiente y se purificó la enzima derivatizada por cromatografía en una columna de 1 x 45 cm de Sephadex G- 25. Se equilibró la columna y se eluyó con tampón C. Se recogieron fracciones de aproximadamente 1 ml cada una durante la elución y se determinó la absorbancia a

\hbox{280 nm}

. Se juntaron las fracciones pico y se calculó la concentración de la enzima en el pool por su absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción (E1cm1%) de 10. (c) Conjugación de la enzima derivatizada y del anticuerpo con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) como plantilla

Se prepararon dos conjugados, con razones molares variables de anticuerpo:enzima:poli-(fosforotioato) de poli(ácido glutámico), como sigue:

Conjugado 1

Anticuerpo:enzima:poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (1:1:1)

Se mezcló una alícuota de 1,25 ml (0,7 mg ó 4,7 nmol) del anticuerpo anti-proteína filamentosa pancreática derivatizado con 0,45 ml (0,7 mg ó 4,7 nmol) de la ALP derivatizada y 0,32 ml (0,32 mg ó 4,6 nmol) de una solución acuosa de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico). Se agitó suavemente la mezcla resultante en un agitador rotatorio durante la noche a 2-8ºC.

Conjugado 2

Anticuerpo:enzima:poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (1:3:1)

Se mezclaron 0,89 ml (0,5 mg ó 3,3 nmol) de la solución de anticuerpo anti-proteína filamentosa pancreática derivatizado con 0,96 ml (1,5 mg ó 10 nmol) de la ALP derivatizada y 0,23 ml (0,23 mg ó 3,3 nmol) de una solución acuosa de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico). Se agitó suavemente la mezcla resultante en un agitador rotatorio durante la noche a 2-8ºC.

Se evaluaron los dos conjugados por HPLC de exclusión por tamaños. No se detectó anticuerpo o enzima residual en los conjugados 1 y 3. El conjugado 2, sin embargo, contenía aproximadamente un 20% de material de partida residual, presumiblemente enzima.

Los grupos tiol no reaccionados del poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) conjugado o libre fueron rematados por tratamiento con NEM durante un período de 1 hora a temperatura ambiente según se menciona en el Ejemplo 8c.

Ejemplo 10 Desprotección ácida de cisteamina-S-fosfato

Se pusieron tres alícuotas de 5 \mul de una solución acuosa 8,2 mM de cisteamina-S-fosfato en tres viales independientes. Se diluyeron las tres muestras a 1 ml con tampón acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0. El pH final de las muestras resultó ser de 4,0. Se dejaron las muestras a temperatura ambiente y se neutralizaron a 1, 3 ó 19 horas por adición de 50 \mul de hidróxido de sodio aproximadamente 5 M y 2 ml de fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,5. Se cuantificaron colorimétricamente los grupos tiol generados tras la adición de 20 \mul de una solución 10 mM de DTNB. Se leyó la absorbancia en los 5 minutos siguientes a la adición del DTNB a 412 nm frente a un blanco reactivo sin cisteamina-S-fosfato. Se usó el coeficiente de extinción molar determinado experimentalmente de 13.000 en la cuantificación del tiol. En la siguiente Tabla 2, se resumen los resultados.

Se repitió el experimento exactamente como se ha descrito antes, pero con una concentración tres veces mayor de cisteamina-S-fosfato. Para los controles, se recogieron las mismas cantidades de cisteamina-S-fosfato en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0, y se sometieron a cuantificación de tiol después de los intervalos apropiados. En la siguiente Tabla 3, se resumen los resultados.

TABLA 2

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline
  \+\multicolumn{3}{|c|}{Exposición a
cisteamina-S-}\\   \+\multicolumn{3}{|c|}{fosfato pH
4,0}\\\dddcline{2}{4}   \+ 1 hora  \+ 3 horas  \+ 19 horas \\\hline 
Tioles generados (nmol)  \+ 8,2  \+ 19,2  \+ 29,3 \\  %
Desprotección de tiol  \+ 20  \+ 46,8  \+ 71,5
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

TABLA 3

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|}\hline
  \+\multicolumn{3}{|c|}{Exposición a
cisteamina-S-}\\   \+\multicolumn{3}{|c|}{fosfato pH
4,0}\\\dddcline{2}{4}   \+ 1 hora  \+ 3 horas  \+ 19 horas \\\hline 
Tioles generados (nmol)  \+ 32,8  \+ 51,6  \+ 77,5 \\  %
Desprotección de tiol  \+ 26,7  \+ 42,0  \+ 63,0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Se vio que el grado de desprotección catalizada por ácido era dependiente del tiempo. Una incubación de 19 horas dio como resultado un 63 a un 71,5% de desprotección de los grupos tiofosfato.

Ejemplo 11 Inmovilización de anticuerpo anti-TSH en micropartículas de amino (a) Funcionalización del anticuerpo

Se dializa extensamente una alícuota de anticuerpo anti-TSH que contiene 5 mg (33 nmol) frente a tampón E y se pone en un vial. Se añaden a la solución de anticuerpo 0,22 mg (660 nmol) de SMCC disueltos en 100 \mul de DMF y se agita suavemente la mezcla resultante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se recupera el anticuerpo activado por cromatografía sobre una columna de 1 x 45 cm de Sephadex G-25. Se equilibra la columna y se eluye con tampón E. Se recogen fracciones de aproximadamente 1 ml cada una durante la elución y se determina la absorbancia a

\hbox{280
nm}

. Se juntan las fracciones pico y se calcula la concentración de anticuerpo en el pool por su absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción (E1cm1%) de 13,9.

Se añaden al pool de anticuerpo activado (4 mg ó 26,7 nmol) 20 \mul (0,2 mg ó 1,3 nmol) de una solución de ALP y 8 mg (133 nmol) de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (PM = 60.000; 25 grupos fosforotioato/poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)) disueltos en 0,8 ml de tampón E. Se agita suavemente la mezcla resultante durante la noche a 2-8ºC. Se guarda el anticuerpo funcionalizado con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) en hielo hasta el acoplamiento a micropartículas.

(b) Activación de las micropartículas de amino

Se suspende 1 ml de aminomicropartículas (diámetro = 0,25 \mum, % sólidos = 10) en 3 ml de agua destilada, seguido de la adición de 2 g de la resina de intercambio aniónico BIO-REX MSZ 501(D). Se gira la mezcla de resina/micropartícula un extremo sobre el otro durante 1 hora a temperatura ambiente y se vierte después en un embudo de vidrio sinterizado grosero. Se traccionan las micropartículas a través del embudo bajo un bajo vacío y se centrifugan a 18.000 rpm durante 30 minutos. Se decanta el sobrenadante cuidadosamente y se lavan las micropartículas con

\hbox{10 ml}

de agua y se centrifugan. Se decanta el sobrenadante y se suspenden las micropartículas lavadas en 4 ml de tampón E. Se disuelven 8 mg de STCM (preparado como en el Ejemplo 6) en 4 ml de DMF y se añaden a la suspensión de micropartículas. Se rota la mezcla un extremo sobre el otro durante una hora a temperatura ambiente y se vierte después en un tubo de centrífuga. Se añade tampón E a un volumen final de 32 ml y se centrifugan las micropartículas a 15.000 rpm durante 30 minutos. Se decanta el sobrenadante y se resuspenden las micropartículas en 30 ml de tampón E. Se repite el lavado con tampón E dos veces más y se resuspenden finalmente las micropartículas lavadas en 4 ml de tampón E. (c) Acoplamiento del anticuerpo a las micropartículas

Se combina el pool de anticuerpo funcionalizado con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (3 ml que contienen 4 mg) con las micropartículas activadas y se rota la suspensión resultante extremo sobre extremo durante la noche a 2-8ºC. Se vierten las micropartículas en un tubo de centrífuga y se añade tampón E que contiene 1 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA) hasta 35 ml. Se centrifugan las micropartículas y se resuspenden en 35 ml de tampón E que contiene BSA después de haber decantado el sobrenadante. Se lavan las partículas dos veces más para asegurar la eliminación de cualquier anticuerpo libre y se resuspenden después en un tampón de almacenamiento adecuado y se guardan a 2-8ºC.

Ejemplo 12 Fosfatasa alcalina (ALP) bovina entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) conjugada con especificidad de sitio con IgG anti-antígeno superficial de la hepatitis B (a) Derivatización del anticuerpo anti-antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg)

A 10 ml de IgG anti-antígeno superficial de la hepatitis B a 1,1 mg/ml se añadieron 10 ml de tampón de trietanolamina (TEA), NaCl 0,16 M, pH 8,0 (tampón I). Se concentró el anticuerpo a aproximadamente 1,5 ml usando un Centricon-30- Concentrator con un corte de PM de 30.000. Se rediluyó el concentrado a 20 ml usando tampón I y se reconstituyó luego a 1,5 ml. Se repitió este procedimiento de concentración/dilución tres veces. Se diluyó el volumen de la solución de anticuerpo concentrada final a 2 ml con tampón I y se puso en un vial ámbar. A 1,71 ml de la IgG lavada a 4,68 mg/ml (53,3 nmol), se añadieron 160 \mul de m-peryodato de sodio 200 mM (320 nmol) disuelto en tampón I. Se dejó reaccionar a esta mezcla durante una hora a temperatura ambiente rotando en un agitador rotatorio. Después de la incubación, se aplicó la anterior mezcla de reacción, que contenía anticuerpo oxidado, a la columna G-25 equilibrada que había sido preparada como antes usando tampón E. Se eluyó la columna con tampón E y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de 0,3 UA. Se concentró el pool de anticuerpo a 1 ml usando un Centricon-30-Concentrator con un corte de PM de 30.000. Se añadieron al pool de anticuerpo concentrado 250 \mul de diclorhidrato de cistamina 0,75 M (188 \mumol) disueltos en tampón E. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente con suave agitación, se añadieron 63 \mul de cianoborohidruro de sodio 0,3 M (18,9 \mumol) disueltos en tampón E y se dejó que la mezcla resultante reaccionara a temperatura ambiente durante la noche. Después de la incubación durante la noche, se aplicó la mezcla de reacción a una columna Sephadex G-25 que había sido preparada como antes usando fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,1 M, EDTA 2 mM, pH 7,0 (tampón J). Se eluyó la columna con tampón J y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de 0,3 UA. Se concentró el pool de anticuerpo a 1,5 ml usando un Centricon-30-Concentrator con un corte de PM de 30.000. Se añadieron al pool de anticuerpo concentrado 75 \mul de DTT 40 mM (30 nmol) disuelto en tampón J. Se dejó que esta mezcla reaccionara durante 15 minutos a temperatura ambiente mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio. Después de la reacción, se aplicó la mezcla a una columna Sephadex G-25 que había sido preparada como antes usando tampón J. Se eluyó la columna con tampón J y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de 0,3 UA. Se guardó el anticuerpo funcionalizado con Fc resultante con tioles libres en la región Fc en hielo hasta su conjugación.

(b) Derivatización de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)

A una alícuota de 2,27 ml de 2,62 mg/ml (40 nmol) de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (preparada como en el Ejemplo 2) se añadieron 100 \mul de NEM 0,16 M (16 \mumol). Se dejó incubar a la mezcla resultante durante una hora rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. A 50 \mul de DMF se añadieron 0,54 mg (831 nmol) de ligante STCM que había sido preparado como se ha descrito en el Ejemplo 6. Se añadió esta solución de ligante a 1,18 ml de ALP entrecruzada rematada con NEM a 2,53 mg/ml (20 nmol) y se dejó reaccionar durante una hora a temperatura ambiente mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio. Después de completarse la reacción, se aplicó la mezcla a una columna Sephadex G-25 que había sido preparada como antes, excepto por el hecho de que la columna estaba equilibrada con tres volúmenes de columna de tampón C. Se eluyó la columna con tampón C y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de 0,3 UA. Se guardó la ALP entrecruzada funcionalizada con el ligante en hielo hasta su conjugación.

(c) Conjugación de IgG anti-antígeno superficial de la hepatitis B derivatizada con Fc a ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)

A una alícuota de 0,52 ml de IgG anti-antígeno superficial de la hepatitis B derivatizada con Fc a 0,97 mg/ml (

\hbox{3,5 nmol}

) se añadieron 1,30 ml de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) rematada con NEM derivatizado con ligante STMC a 0,77 mg/ml (7 nmol). Se dejó que la mezcla resultante reaccionara durante la noche a 5ºC mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio para obtener el producto conjugado. Ejemplo 13 Conjugado de fosfatasa alcalina (ALP) bovina entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)/IgG anti-hCG derivatizada con especificidad de sitio Fc (a) Derivatización del anticuerpo anti-hCG

A 8 ml de IgG anti-hCG a 1,1 mg/ml se añadieron 10 ml de tampón I y se concentró el anticuerpo a aproximadamente 1,5 ml usando un Centricon-30- Concentrator. Se rediluyó el concentrado a 20 ml usando tampón I y se reconcentró luego a 1,5 ml. Se repitió este procedimiento de concentración/dilución tres veces. Se diluyó el volumen de la solución de anticuerpo a 2 ml con tampón I y se puso en un vial ámbar. A 2 ml de la IgG lavada a 4,0 mg/ml (

\hbox{53,3
nmol}

), se añadieron 220 ml (440 nmol) de m-peryodato de sodio 200 mM disuelto en tampón I. Se dejó reaccionar a esta mezcla durante una hora a temperatura ambiente rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio. Después de la incubación, se aplicó la anterior mezcla de reacción, que contenía anticuerpo oxidado, a una columna G-25 equilibrada que había sido preparada como antes usando tampón E. Se eluyó la columna con tampón E y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de 0,3 UA. Se concentró el pool de anticuerpo a 1 ml usando un Centricon-30-Concentrator. Se añadieron al pool de anticuerpo concentrado 300 ml de ligante 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilhidrazida (M_{2}C_{2}H) 15 mM (4,81 mmol) disuelto en tampón E. Se dejó que esta mezcla reaccionara durante tres horas a temperatura ambiente, mientras se rotaba a 100 rpm en un agitador rotatorio. Después de la incubación, se aplicó la anterior mezcla de reacción a una columna G-25 preparada como antes, excepto por el empleo de acetato de sodio 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 6,0 (tampón K) para eliminar el ligante no reaccionado. Se eluyó la columna con tampón K y se recogieron fracciones de 0,75 ml. Se juntaron las fracciones con una A_{280} mayor de 0,3 UA. Se guardó el anticuerpo funcionalizado con Fc resultante con maleimidas en la región Fc en hielo hasta su conjugación. (b) Conjugación de IgG anti-hCG derivatizada con Fc a ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)

A una alícuota de 1 ml de 2 mg/ml (13,3 nmol) de IgG anti-hCG derivatizada con Fc se añade 1 ml de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) (preparada según la técnica descrita en el Ejemplo 2). Se deja reaccionar a la mezcla resultante durante la noche a 5ºC rotando a 100 rpm en un agitador rotatorio para obtener el producto conjugado.

Ejemplo 14 Síntesis de difosfato de ditiotreitol

Se añade una solución de 1,4-dibromo-2,3-butanodiol (1,0 g, 4,0 mmol) en 5 ml de DMF a tiofosfato de sodio dodecahidrato (3,8 g, 10,1 mmol) en 20 ml de H_{2}O. Se agita la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Se añade una solución de nitrato de plata al 5% para precipitar el exceso de tiofosfato de sodio. Se filtra el precipitado y se seca el filtrado bajo un alto vacío. Se tritura el residuo sólido con metanol y se filtra para obtener 1,8 g (3,8 mmol) de bisfosforotioato de treitol tetrahidrato.

Ejemplo 15 Desprotección del difosfato de ditiotreitol

Cuando se desea la desprotección de fosforotioato del bisfosforotioato de treitol para activar su capacidad reductora, se consigue la escisión de los enlaces fosfato por adición de una solución 1 \muM de ALP. Debido a la naturaleza quelante del ditiotreitol, se añaden zinc y magnesio al medio de reacción para mantener la actividad catalítica de la ALP.

Ejemplo 16 (comparativo)

Síntesis de agentes heterobifuncionales de fosforotioato (a) Cisteamidofosforotioato 4,5-ditioheptil-1-carboxilato de N-hidroxisuccinimidilo

Se disolvieron 48,2 mg (269 \mumol) de cisteamina-S-fosfato en 2,5 ml de agua desionizada y se añadió la solución resultante a una solución de 330 mg (816 \mumol) de éster bisactivo del ácido 3,3'-ditiopropiónico en 2,5 ml de DMF. Se combinaron las dos soluciones mientras se agitaba a temperatura ambiente y se continuó agitando durante 3 minutos más después de combinarse las soluciones. Después del período de mezcla de 3 minutos, se evaporó la solución a presión reducida durante 18 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 20 ml de cloroformo al residuo blanco resultante y se agitó la mezcla durante 10 minutos. Se formó un precipitado blanco, que se separó del líquido sobrenadante y se secó a presión reducida, para obtener el cisteamidofosforotioato 4,5-ditioheptil-1-carboxilato de N-hidroxisuccinimidilo producto en polvo.

Los datos del espectro de masas FAB(-) indicaron la presencia de material de m/e-1 = 445; el m/e esperado del producto deseado es 446. Los datos del espectro FAB(+) también indicaron la presencia del ion apropiado (m/e+Na+).

(b) Cisteamidofosforotioato 3-oxibutil-1-carboxilato de N-hidroxisuccinimidilo

Se disolvieron 50 mg (279 \mumol) de cisteamina-S-fosfato en agua desionizada y se añadió la solución resultante a una solución de 370 mg (1,12 \mumol) de éster bisactivo del ácido diglicólico disuelto en DMF. Se mezclaron las soluciones a temperatura ambiente durante la adición y se continuó agitando durante 3 minutos más después de completarse la adición. Después de completarse el período de agitación, se evaporó la mezcla de reacción a presión reducida a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 35 ml de tetrahidrofurano (THF) al residuo blanco resultante y se agitó la mezcla resultante durante 10 minutos. Se formó un precipitado blanco y se separó del líquido sobrenadante y se secó a presión reducida, para obtener el cisteamidofosforotioato 3-oxibutil-1-carboxilato de N-hidroxisuccinimidilo como un polvo blanco.

Los datos del espectro de masas FAB(-) indicaron la presencia de material de m/e-1 = 369; el m/e esperado del producto deseado es 370. Los datos del espectro FAB(+) también indicaron la presencia del ion apropiado (m/e+Na+); sin embargo, la presencia de grandes cantidades de iones sodio producía un fuerte fondo.

(c) Cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinidilo 1-carboxilato de heptanoílo

Se disolvieron 50 mg (279 \mumol) de sal sódica de cisteamina-S-fosfato en 3 ml de agua desionizada y se añadieron a una solución de 400 mg (1,086 \mumol) del éster bisactivo del ácido subérico disuelto en 3 ml de DMF. Se realizó la adición a lo largo de 1 minuto a 5ºC. Se agitó la mezcla de reacción resultante a temperatura ambiente durante 1 hora y 45 minutos. Se evaporó entonces la mezcla de reacción a sequedad a presión reducida a temperatura ambiente durante 18 minutos y se trató el residuo sólido resultante con 10 ml de THF. Se formó un precipitado blanco y éste fue recogido y tratado de nuevo con 10 ml de THF. Se volvió a recoger un precipitado blanco y se secó a presión reducida, para obtener el cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinimidilo 1-carboxilato de heptanoílo producto.

Los datos de espectrometría de masas FAB(-) indicaron la presencia del ion molecular m/e-1 = 409, que corresponde al m/e del material deseado de m/e = 410.

(d) Cisteamidofosforotioato heptanoil-1-hidrazida

Se disuelven 0,10 g (250 \mumol) de cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinimidilo 1-carboxilato de heptanoílo en 2 ml de una solución 1:1 de DMF en agua desionizada y se añade la solución resultante a una solución de 1 mmol demonohidrato de hidrazina disuelta en 2 ml de una solución 1:1 de DMF en agua desionizada. Se incuba la mezcla de reacción resultante mientras se agita durante 10 minutos a 0ºC. Después de la incubación, se evapora la mezcla de reacción a sequedad a presión reducida. Se lava entonces el residuo sólido tres veces con 10 ml de THF por lavado. Se seca luego el precipitado formado después del último lavado a presión reducida.

(e) Cisteamidofosforotioato heptanoil-1-(amino-etil)carboxamida

Se disuelven 0,1 g (250 \mumol) de cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinimidilo 1-carboxilato de heptanoílo en una solución 1:1 de DMF en agua desionizada y se añade la solución resultante a una solución de 1 mmol de etilendiamina disuelta en 2 ml de una solución 1:1 de DMF en agua desionizada. Se incuba la mezcla de reacción resultante mientras se agita durante 10 minutos a 0ºC. Después de la incubación, se evapora la mezcla de reacción a sequedad a presión reducida. Se lava entonces el residuo sólido tres veces con 10 ml de THF por lavado. Se seca luego el precipitado formado después del último lavado a presión reducida.

(f) Cisteamidofosforotioato de p-nitrofenilo 1-carboxilato de heptanoílo

Se disuelven 250 \mumol de cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinimidilo 1-carboxilato de heptanoílo [del Ejemplo 16(c)] en 3 ml de agua desionizada. Se disuelve 1 mmol de p-nitrofenol en 3 ml de DMF y se añaden a la solución de cisteamidofosforotioato de N-hidroxisuccinimidilo 1-carboxilato de heptanoílo. Se agita la mezcla de reacción resultante a temperatura ambiente durante 2 horas y se evapora después a sequedad a presión reducida. Se lava entonces el residuo sólido tres veces con 10 ml de THF por lavado. Se seca después el precipitado formado después del último lavado a presión reducida.

Ejemplo 17 Control estequiométrico del tamaño de la fosfatasa alcalina (ALP) bovina entrecruzada con poli(fosforo-tioato) de poli(ácido glutámico) (a) Preparación de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico)

Se produjo una serie de preparaciones de ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) en un rango de razones de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a ALP. Utilizando las técnicas de entrecruzamiento expuestas en el Ejemplo 2, se emplearon razones de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) a ALP de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 y 6:1 para entrecruzar la ALP. Se evaluaron los productos de las reacciones de entrecruzamiento para determinar el efecto que la variación de la razón molar de reactivos tenía sobre el control del tamaño de la ALP entrecruzada.

(b) Caracterización de la ALP entrecruzada

Se evaluó la ALP entrecruzada con poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico) por cromatografía de exclusión por tamaños usando una columna Bio-Sil SEC-400. Se realizó la detección a 280 nm. La fase móvil era tampón E, que recorría a una velocidad de flujo de 1,0 ml/minuto. Por los cromatogramas de HPLC se calculó el porcentaje de producto con un tiempo de retención correspondiente a ALP entrecruzada en singlete. En la Figura 15 se muestran los resultados de esta evaluación. Tal como se muestra en la Figura 15, la cantidad de ALP entrecruzada monomérica producida por reacción de entrecruzamiento aumentaba en función del aumento de la cantidad de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico). Adicionalmente, la cantidad de multímeros producidos disminuía cuando aumentaba la cantidad de poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico). Por lo tanto, mediante manipulación estequiométrica, era posible modular el tamaño de la ALP entrecruzada.

Claims (9)

1. Un agente entrecruzante y conjugante consistente en un compuesto correspondiente a la fórmula (I): Q-(S-PO_{3}^{-2})_{n}\eqnum{(I)} donde n es al menos 2 y Q es un monómero, polímero u oligómero lineal o ramificado que tiene un peso molecular medio de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1.000.000 y donde, cuando n es 2, Q tiene al menos 1 funcionalidad reactiva adicional.

2. El agente entrecruzante y conjugante de la reivindicación 1, donde dicho monómero, polímero u oligómero es seleccionado entre el grupo consistente en poliestirenos, polisacáridos, poliacrilamidas, polipéptidos, cadenas de alquilo lineales o ramificadas C_{5}-C_{100.000} que tienen heteroátomos en dichas cadenas y cadenas de cicloalquilo C_{10}-C_{75.000}.

3. El compuesto de la reivindicación 1, seleccionado entre el grupo consistente en poli(fosforotioato) de carboximetilamilosa, poli(acrilamida)poliacriloil(2-(2-fosforotioetil)aminoetil]hidrazida, poli(fosforotioato) de poli(ácido glutámico), poli(fosforotioato) de poli(estireno), poli(fosforotioato) de poli(acrilamida) y poli(fosforotioato) de dextrano.

4. Un método de entrecruzamiento y conjugación de compuestos consistente en:

(a)

activar un compuesto correspondiente a la fórmula (I): Q-(S-PO_{3}^{-2})_{n}\eqnum{(I)} donde n es al menos 2 y Q es un monómero, polímero u oligómero lineal o ramificado que tiene un peso molecular medio de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1.000.000 y donde, cuando n es 2, Q tiene al menos 1 funcionalidad reactiva adicional;

(b)

poner en contacto dicho compuesto activado (I) con al menos un compuesto que exhibe un grupo electrofílico.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicho compuesto de fórmula (I) es seleccionado entre el grupo consistente en: poli(fosforotioato) de carboximetilamilosa, poli(acrilamida)poliacriloil(2-(2-fosforotio- etil)aminoetil]hidrazida, poli(fosforotioato) de poli-(ácido glutámico), poli(fosforotioato) de poli(estireno), poli(fosforotioato) de poli(acrilamida) y poli(fosforotioato) de dextrano.

6. El método de la reivindicación 5, donde la activación de dicho compuesto correspondiente a la fórmula (I) consiste en poner en contacto dicho compuesto con un miembro del grupo consistente en: una concentración de iones hidrógeno de entre aproximadamente pH 4,0 y aproximadamente pH 5,5 y una enzima fosfatasa.

7. Un conjugado consistente en al menos un miembro de unión y al menos un resto detectable, los dos de los cuales están unidos a un residuo Q-(S^{-})_{n}, cuyo residuo deriva de un compuesto de fórmula (I): Q-(S-PO_{3}^{-2})_{n}\eqnum{(I)} donde n es al menos 2 y Q es un monómero, polímero u oligómero lineal o ramificado que tiene un peso molecular medio de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1.000.000 y donde, cuando n es 2, Q tiene al menos 1 funcionalidad reactiva adicional, cuyo resto detectable es entrecruzado intramolecularmente y estabilizado por dicho compuesto de fórmula (I).

8. Un reactivo de fase sólida consistente en una fase sólida y al menos un miembro de unión, los dos de los cuales están unidos a un residuo Q-(S^{-})_{n} activado, cuyo residuo deriva de un compuesto de fórmula (I): Q-(S-PO_{3}^{-2})_{n}\eqnum{(I)} donde n es al menos 2 y Q es un monómero, polímero u oligómero lineal o ramificado que tiene un peso molecular medio de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 1.000.000 y donde, cuando n es 2, Q tiene al menos 1 funcionalidad reactiva adicional, cuyo miembro de unión es intramolecularmente entrecruzado y estabilizado por dicho compuesto de fórmula (I).

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9. Un agente reductor consistente en un compuesto de fórmula (Y):

1

donde (A) y (Z) pueden ser independientemente seleccionados entre alquileno C_{1}-C_{5} y CONH(CH_{2})_{p}, donde p es un número entero de entre 1 y 5.