ES2197492T3 - Derivados de oligosacaridos y procedimiento para su preparacion. - Google Patents
Derivados de oligosacaridos y procedimiento para su preparacion.Info
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Abstract
Derivado de oligosacáridos seleccionado de entre el grupo que consta de las siguientes fórmulas: **FORMULA** en las que "n¿ = 2 a 20.
Description
Derivados de oligosacáridos y procedimiento para
su preparación.
La presente invención se refiere a un derivado de
oligosacáridos y a un procedimiento para su preparación. Más
específicamente, la invención se refiere a un derivado de
oligofucosa u oligoramnosa, que es efectivo para la prevención y
tratamiento de la inflamación y ulceración en la mucosa de órganos
gástricos tales como el estómago y el duodeno.
Los agentes convencionales contra la úlcera
incluyen aquellos para controlar la secreción de jugos gástricos,
tales como bloqueantes de H_{2} e inhibidores de la bomba de
protones. Para el fin de un tratamiento terapéutico activo de la
gastritis y de las células de la mucosa gástrica, recientemente se
ha estudiado el uso de prostaglandinas o de factores de crecimiento
de fibroblastos básicos. Estos agentes farmacéuticos, por un lado,
ejercen efectos terapéuticos eficaces. Por otro lado, sin embargo,
estos agentes farmacéuticos provocan potencialmente el comienzo de
la úlcera, específicamente la aparición de úlcera de la que es
responsable una especie bacteriana específica, la Helicobacter
pylori. Por lo tanto, se subraya que las úlceras gástricas se
deberían tratar esencialmente, incluyendo la desinfección de la
especie bacteriana (Masahiro Asaka, ``Helicobacter pylori
and disorders of gastric mucosal membrane''
Sentan-Igaku-Sha (Top Medicine
Press), 1 julio 1995).
Se ha sabido adicionalmente que las células
microbianas de ciertas especies de bifidobacterias o bacterias del
ácido láctico, y los polisacáridos u oligosacáridos preparados a
partir de estas células microbianas, Phaeophyceae Chordariales
nemacystus o lechuga verde (Monostroma nitidum), son
efectivos no sólo en la prevención de la ulceración sino también en
la promoción de su curación, y de este modo son útiles como agentes
contra la úlcera (documentos
JP-A-6-247861;
JP-A-7-138166).
Estos polisacáridos y oligosacáridos comprenden principalmente
fucosa y/o ramnosa. Específicamente, el fucoidano, un polímero de
fucosa, ejerce efectos para prevenir la formación de la úlcera y
para promover la curación de la ulceración, y adicionalmente ejerce
una acción para inhibir la adhesión de H. pylori. No
obstante, estos polisacáridos y oligosacáridos per se no son
satisfactorios en términos de su actividad contra la úlcera.
Además, es difícil recuperar estos polisacáridos y oligosacáridos
en estados homogéneos, incluyendo la homogeneidad de sus pesos
moleculares.
Es un objeto principal de la invención
proporcionar un derivado de oligosacáridos que tiene mayor
homogeneidad y mayores efectos contra la úlcera que aquellos de los
polisacáridos convencionales anteriormente mencionados, y otro
objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento
para producirlo.
Según una realización de la presente invención,
se proporciona un derivado de oligosacárido representado por la
siguiente fórmula general:
en la que Y_{1} representa una oligofucosa con
un número de polimerización de 2 a 20, en la que los grupos
hidroxilo pueden estar parcialmente modificados o no en la forma de
éster de sulfato, y R representa un grupo fenilo, un grupo
alquilfenilo superior, un grupo alquilo superior o
-(CH_{2})_{n}-NHX en la que n es un
número entero de 1 a 10 y X representa un grupo alcanoilo superior
o un grupo alquilamino con o sin sustituyentes.
Según otra realización de la presente invención,
se proporciona también un derivado de oligosacáridos representado
por la siguiente fórmula general:
en la que Y_{2} representa una oligoramnosa con
un número de polimerización de 2 a 20, en la que los grupos
hidroxilo pueden estar parcialmente modificados o no en la forma de
éster de sulfato, y R representa un grupo fenilo, un grupo
alquilfenilo superior, un grupo alquilo superior o
-(CH_{2})_{n}-NHX en la que n es un
número entero de 1 a 10 y X representa un grupo alcanoilo superior
o un grupo alquilamino con o sin sustituyentes.
Estos derivados de oligosacáridos tienen diversas
propiedades, incluyendo un excelente efecto contra la úlcera.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para producir un derivado de oligosacáridos que
comprende las etapas de convertir el residuo de azúcar en el
extremo reductor de la oligofucosa u oligoramnosa a un grupo
aldehído mediante degradación oxidativa, generar una base de Schiff
permitiendo que el grupo aldehído reaccione con al menos una de las
alquilaminas y alilaminas correspondientes, y reducir la base de
Schiff para obtener un derivado de oligosacárido.
Es decir, en el procedimiento según la presente
invención, el fucoidano (polisacárido de fucosa) o ramnano
(polisacárido de ramnosa) se modifica en un oligosacárido (un
oligómero que comprende alrededor de 3 a 20 moléculas de fucosa o
ramnosa) mediante tratamiento con ácido, y entonces el
oligosacárido se somete a oxidación con peryodato, reacción con las
aminas correspondientes, y tratamiento reductor.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un inhibidor para H. pylori que comprende el
derivado de oligosacáridos, principalmente derivado de oligofucosa
y/o derivado de oligoramnosa según la presente invención.
Según aún otro aspecto de la presente invención,
se proporciona un agente para prevenir y tratar terapéuticamente la
úlcera gástrica, comprendiendo dicho agente al derivado de
oligosacáridos, principalmente derivado de oligofucosa y/o derivado
de oligoramnosa según la presente invención.
Según una realización de la presente invención,
el procedimiento para producir un derivado de oligosacáridos
comprende las siguientes etapas 1 a 8.
Etapa 1: Usando métodos de extracción conocidos,
se extraen polisacáridos de algas marinas (tales como
Phaeophyceae Chordariales nemacystus, Hydrilla, Fucus, y
Monostroma nitidum) que contienen fucoidano, ramnano o
sulfato de ramnano.
Etapa 2: Los polisacáridos recuperados se
disuelven en una disolución de ácido clorhídrico o trifluoroacetato
de alrededor de 0,075 N a 0,1 N; la mezcla se calienta a 100ºC
durante 10 a 20 minutos, para modificar los polisacáridos en la
forma de oligosacáridos. Tras el tratamiento, la mezcla de reacción
resultante se neutraliza con hidróxido sódico, seguido de adición
de NaBH_{4} para neutralizar la mezcla para el tratamiento
reductor a temperatura ambiente o 4ºC durante 16 horas.
Etapa 3: La disolución de los oligosacáridos en
forma de alditol, según se recupera mediante los procedimientos de
la etapa 2, se desala mediante diálisis (un peso molecular de
fraccionamiento de 500) o electrodiálisis, o usando una resina de
intercambio iónico.
Etapa 4: A la disolución recuperada en la etapa 3
se añade metaperyodato de sodio para reacción en una vasija
sumergida en un baño de hielo durante alrededor de una hora. Aquí,
un oligosacárido en una estructura tal que los azúcares, excepto los
azúcares en los extremos reductores o los extremos no reductores,
nunca se oxidan, por ejemplo (1 \rightarrow 3) oligosacárido, se
puede someter satisfactoriamente a la reacción durante un mayor
período de tiempo. A la disolución de la reacción se añade
etilenglicol en un volumen en exceso al ácido peryódico, para
reacción adicional durante alrededor de una hora. La disolución
resultante se somete a desalazón de la misma manera como en la etapa
3. Mediante el procedimiento, se puede recuperar un derivado de
oligosacáridos (en el estado líquido) con un grupo aldehído en el
extremo.
Etapa 5: Se añade ácido acético a la disolución
procedente de la etapa 4 hasta una concentración final de 0,5 M,
que se somete a reacción a temperatura ambiente durante 20 horas.
La disolución de la reacción se dializa frente a una membrana de
diálisis de un peso molecular de fraccionamiento de 500; la
disolución del residuo de diálisis interna se liofiliza para
recuperar un oligosacárido objetivo. Adicionalmente, la fracción de
oligosacárido se puede desalar mediante diálisis. Como alternativa,
la fracción de oligosacárido se puede fraccionar y desalar mediante
cromatografía en una columna de carbón activo y filtración en gel
para preparar la fracción de un peso molecular apropiado.
Etapa 6: La fracción de oligosacárido recuperada
en la etapa 5 se disuelve en una disolución acuosa que contiene 40%
a 50% de propanol, seguido de adición de alquilaminas o alilaminas,
para reacción a 45ºC durante 2 horas, para preparar una base de
Schiff. En este caso, se puede usar satisfactoriamente como
disolvente cualquier sustancia (dimetilsulfóxido, dimetilformamida),
capaz de disolver oligosacáridos y alquilaminas. Entonces, se puede
seleccionar cualquier alquilamina y cualquier alilamina, sin
limitación específica, para uso en la reacción; dándose preferencia
a anilinas con o sin sustituyentes, y alquilaminas superiores con o
sin sustituyentes, en las que los sustituyentes incluyen, por
ejemplo, grupos alquilo, grupos alcanoilamino y grupos
alquilamino.
Etapa 7: Se añade trimetilamina de Volan a la
disolución recuperada en la etapa 6, para reducir la base de Schiff
a 45ºC durante 20 horas. Se pueden usar apropiadamente agentes
reductores que satisfagan el fin (por ejemplo, dimetilamina de
Volan, NaCNBH_{4}, NaBH_{4}, etc.), además de trimetilamina de
Volan.
Etapa 8: Tras la terminación de la reducción en
la etapa 7, se separa el disolvente mediante destilación por medio
de un evaporador y similar; repartiendo subsiguientemente la
disolución resultante en una disolución mezcla de
cloroformo:metanol:agua = 2:1:1, y se recoge la fase acuosa
resultante. Enjuagando la fase acuosa en cloroformo y liofilizando
la fase acuosa, se puede recuperar un derivado de oligosacárido que
comprende un complejo de oligosacárido-alquilamina.
Dependiendo de las propiedades de la alquilamina, se pueden
seleccionar y usar disolventes apropiados para el reparto y la
extracción.
Se verifica que el derivado de oligosacáridos
según la presente invención ejerce el efecto de inhibir la adhesión
de H. pylori como una especie bacteriana causante de la
úlcera gástrica, y el efecto de tratar terapéuticamente la úlcera
inducida por ácido acético.
Según la presente invención, el agente
farmacéutico para prevenir y tratar terapéuticamente la úlcera
gástrica se puede preparar en formas de dosificación farmacéuticas
seleccionadas apropiadamente, que se pueden administrar en una
cantidad seleccionada apropiadamente. Sin embargo, generalmente, el
agente farmacéutico se mezcla con un vehículo farmacéuticamente
aceptable en estado líquido o sólido, seguido de adición de
disolventes, dispersantes, emulsionantes, tampones, estabilizantes,
excipientes, aglutinantes, disgregantes, y lubricantes y similares,
y la mezcla resultante se formula como comprimidos, gránulos,
polvos, formulaciones en polvo, cápsulas y similares para uso. La
dosis del agente farmacéutico oscila apropiadamente de alrededor de
0,1 a 10 mg/kg, preferiblemente de 0,3 a 3 mg/kg, para la mayoría
de los adultos, por día.
La Fig. 1 muestra un diagrama de RMN ^{13}C de
derivado dodecilanilínico de oligofucosa (OFDAD);
La Fig. 2 muestra un diagrama de IR de derivado
dodecilanilínico de oligofucosa (OFDAD); y
La Fig. 3 muestra un diagrama de flujo de los
procedimientos para inducir úlcera con ácido acético.
Ejemplo
1
Se suspendió Cladosiphon okamuranus Tokida
desalada en agua desionizada, a una relación de 1 kg de las algas
por un litro de agua desionizada. La suspensión se ajustó a pH 2
usando ácido clorhídrico. La suspensión resultante se calentó y se
extrajo a 100ºC durante 10 minutos, para filtrar y recuperar las
algas a través de una gasa; el filtrado se centrifugó a 9.000 rpm
durante 60 minutos para desechar las materias insolubles.
El sobrenadante resultante se neutralizó usando
NaOH, seguido de adición de metaperyodato de sodio hasta una
concentración final de 0,2 M, para descomponer el ácido algínico
contaminado, y la reacción subsiguiente en la oscuridad durante 20
horas; y entonces se añadió etilenglicol a la mezcla de reacción
para terminar la reacción. Se añadió borohidruro de sodio a
la disolución resultante hasta una concentración final de 0,2 M,
para una reacción a temperatura ambiente durante 16 horas. La
disolución se concentró mediante ultrafiltración (peso molecular de
fraccionamiento de 5.000), y subsiguientemente se dializó. Usando
ácido clorhídrico, la disolución del residuo de diálisis interna se
ajustó a pH 2 y se trató con calefacción a 100ºC durante 10 minutos.
La disolución resultante se dializó y se liofilizó para recuperar
fucoidano (4 g/1 kg de algas húmedas).
El fucoidano se disolvió hasta una concentración
final de 200 mg/ml, seguido de adición de ácido clorhídrico (o ácido
trifluoroacético) hasta una concentración final de 0,075 a 0,1 M.
La mezcla resultante se calentó a 100ºC durante 10 minutos, y
entonces se enfrió hasta temperatura ambiente. La disolución se
neutralizó con NaOH, seguido de adición de NaBH_{4} a una
relación de 200 mg por un gramo de fucoidano, para reacción a 4ºC
durante 20 horas. La disolución de la reacción se ajustó a pH 6
usando ácido acético, y se desaló mediante un aparato de
electrodiálisis (Microacilyzer™ con una membrana AC220; fabricado
por Asahi Chemicals, Co.). Tras desalar, se añadió NaIO_{4} a la
disolución de la muestra hasta una concentración de 0,2 M para
reacción en una vasija sumergida en un baño de hielo durante una
hora. Se añadió a la disolución de la reacción etilenglicol en una
cantidad correspondiente a 2 equivalentes de peryodato, para
reacción subsiguiente en la vasija sumergida en el baño de hielo
durante una hora. La disolución de la reacción se dializó a través
de una membrana de diálisis con un peso molecular de fraccionamiento
de 500 (fabricada por Spectrum Co.); la disolución del residuo de
diálisis interna resultante se liofilizó para recuperar una muestra
de oligosacárido (con un peso molecular medio de alrededor de 1.000
a 3.000, o un grado medio de polimerización de 8 a 14).
Se añadió NaIO_{4} a 100 ml de una disolución
al 2% de un oligosacárido de fucosa hasta una concentración final
de 0,2 M, para reacción en la vasija sumergida en el baño de hielo
durante una hora. Se añadió un volumen igual de etilenglicol a la
disolución de la reacción, para reacción en la vasija sumergida en
el baño de hielo durante una hora. La disolución de la reacción
resultante se cargó en una columna de 500 ml empaquetada con carbón
activo (carbón activo para cromatografía; fabricado por Wako Pure
Chemicals, Co., Ltd.); y entonces, se eluyeron las materias no
adsorbidas en 3 litros de agua. Se añadieron en la columna 3 litros
de etanol al 35% para recuperar la fracción adsorbida. La fracción
se concentró con un evaporador para recuperar un oligosacárido de
forma aldehídica (con un rendimiento de alrededor de 25%).
Se disolvió el derivado aldehídico del
oligosacárido según se ha producido anteriormente en
(1-2) en n-propanol al 50% en agua
hasta una relación final de 50 mg/ml, seguido de adición de
dodecilanilina a una relación de 10 mg/ml, para reacción
subsiguiente a 45ºC durante 2 horas; y se añadió después a la mezcla
de reacción resultante un complejo de dimetilamina de
Volan hasta una concentración final de 10 mg/ml durante 20 horas
de reacción a 45ºC. La disolución de la reacción resultante se secó
hasta un sólido a presión reducida. Tras añadir subsiguientemente
al residuo sólido resultante una disolución de mezcla de
cloroformo:metanol:agua = 2:1:1, se recogió la fase acuosa
resultante, a la que se añadió un volumen igual de cloroformo para
separación y enjuagado. El procedimiento se repitió dos veces. La
fase acuosa resultante se liofilizó para recuperar el derivado
dodecilanilínico de oligofucosa, OFDAD (con un rendimiento de
alrededor de 64%). La estructura del derivado se determinó según la
siguiente fórmula 1 en base a los resultados analíticos mediante
análisis de metilación y RMN. Adicionalmente, los grupos hidroxilo
en la posición 4 en los residuos de fucosa están parcialmente
modificados como ésteres de sulfato. La Fig. 1 muestra un diagrama
de RMN de ^{13}C de derivado dodecilanilínico de oligofucosa,
OFDAD; y la Fig. 2 muestra un diagrama de IR de derivado
dodecilanilínico de oligofucosa, OFDAD.
Se usaron alquilaminas tales como hexilanilina,
anilina o laurilamina, en vez de dodecilanilina, para la reacción
similar como en (1-3); la disolución de la reacción
se separó de forma similar para recuperar derivados de oligofucosa
tales como derivado hexilanilínico de oligofucosa (OFHAD) de la
fórmula 2, derivado anilínico de oligofucosa (OFAN) de la fórmula
3, y derivado laurilamínico de oligofucosa (OF-LA)
de la fórmula 4.
\newpage
Ejemplo
2
Se suspendió en agua algas secas de lechuga
brillante (Monostroma nitidum) de un volumen de 10 veces, y
se calentó a 100ºC durante 2 horas para sumergir el sulfato de
ramnano. La disolución resultante se centrifugó para desechar las
materias sólidas, seguido de adición de etanol para precipitar y
recoger polisacáridos, que entonces se disolvieron en agua; la
disolución resultante se sometió a diálisis para eliminar
componentes de bajo peso molecular; el sulfato de ramnano se
recuperó en la disolución del residuo de diálisis interna
resultante. Subsiguientemente, se añadió ácido clorhídrico a la
disolución de residuo de diálisis interna que contiene sulfato de
ramnano hasta una concentración final de 0,01 N, y la mezcla
resultante se calentó a 100ºC para inducir la desulfuración.
Después, la disolución resultante se dializó nuevamente para
recuperar ramnano en la disolución del residuo de diálisis
interna.
De la misma manera que para fucoidano descrito
anteriormente, el ramnano se sometió a descomposición con ácidos
débiles, reducción, y oxidación con peryodato, para recuperar un
derivado de oligosacárido en forma de aldehído (con un peso
molecular medio de alrededor de 1.000 a 1.500).
La fracción se conjugó con dodecilanilina de la
misma manera como se describe anteriormente, para recuperar un
derivado dodecilanilínico de oligoramnosa (OR- DA) de la fórmula 5
(con un rendimiento de alrededor de 10%).
Se produjeron derivados distintos de los de las
fórmulas 1 a 5, según se produjeron anteriormente en los Ejemplos 1
y 2, mediante el procedimiento anteriormente mencionado, según se
enumera en las siguientes fórmulas 6 a 10.
Ejemplo
3
Se analizó la acción de la dodecilanilina de
oligofucosa, recuperada en el Ejemplo 1, contra la úlcera, para
úlcera inducida por acetato. La Fig. 3 muestra un diagrama de flujo
de los procedimientos para inducir úlcera con ácido acético. Los
experimentos y la determinación de la eficacia se llevaron a cabo
según se muestra en la Fig. 3. Se inyectaron directamente 30 \mul
de ácido acético al 20% en los estómagos de ratas SD de 8 semanas en
el día 1; en los días 2 a 9 se administró oralmente 1 ml de la
disolución de muestra una vez por día a estas ratas. Durante la
duración del ensayo se dio alimento y agua a voluntad.
Tras la dosis final, se dejó morir de hambre a
estas ratas; y se les resecó los estómagos, que se fijaron en
formalina. El índice de la úlcera se determinó midiendo el diámetro
corto y el diámetro largo de cada lesión ulcerosa para examinar la
relación de curación. Cuando se observó un efecto a un
nivel de 5% de significancia o menos (p \leqq 0,05), comparado
con un grupo de control, se determinó que el efecto era
significativo. En este documento, la relación de curación, en %, se
determinó según lo siguiente:
Los resultados se muestran a continuación en la
Tabla 1.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|c|c|}\hline
\+ Índice de la úlcera \+ Relación de \\ \+ (media \pm SD)
\+ curación (%) \\\hline Grupo de control (11) \+ 11,3 \pm 2,6
\+ ---- \\\hline Grupo de ensayo \+ 6,2 \pm 1,5 ^{*} \+ 45,0
\\ 0,1 mg/rata/día x 8 (10) \+ \+ \\\hline Grupo de ensayo \+ 8,2
\pm 4,7 ^{*} \+ 27,8 \\ 0,5 mg/rata/día x 8 (10) \+ \+ \\\hline
Grupo de ensayo \+ 6,7 \pm 2,9 ^{*} \+ 41,4 \\ 1,0
mg/rata/día x 8 (10) \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{*}) p\leqq 0,05 comparada con el grupo de
control.
Ejemplo
4
Se realizó el ensayo similar de la acción contra
la úlcera usando los derivados alquilamínicos de oligofucosa
recuperados en el Ejemplo 1, en lugar de la disolución de ensayo
anterior. Más específicamente, se usaron el derivado hexilanilínico
de oligofucosa y el derivado laurilamínico de oligofucosa como las
disoluciones de muestra, para los mismos procedimientos como en el
Ejemplo 3, para examinar los efectos de la hexilanilina de
oligofucosa y la laurilamina de oligofucosa contra la úlcera
inducida por acetato.
Los resultados se muestran a continuación en las
Tablas 2 y 3.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|c|c|}\hline
\+ Índice de la úlcera \+ Relación de \\ \+ (media \pm SD)
\+ curación (%) \\\hline Grupo de control (10) \+ 11,6 \pm 4,3
\+ ---- \\\hline Grupo de ensayo \+ 7,5 \pm 2,8 ^{*} \+ 35,5
\\ 0,1 mg/rata/día x 8 (10) \+ \+ \\\hline Grupo de ensayo \+ 8,4
\pm 3,8 ^{*} \+ 27,5 \\ 0,3 mg/rata/día x 8 (10) \+ \+ \\\hline
Grupo de ensayo \+ 7,8 \pm 2,8 ^{*} \+ 33,5 \\ 1,0
mg/rata/día x 8 (10) \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{*}) p \leqq 0,05 comparada con el grupo de
control.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|c|}\hline
\+ Índice de la úlcera \+ Relación de \\ \+ (media \pm SD)
\+ curación (%) \\\hline Grupo de control \+ 10,3 \pm 3,8 \+
---- \\\hline Grupo de ensayo \+ 5,1 \pm 2,1 ^{*} \+ 50,4 \\
0,5 mg/rata/día x 8 (7) \+ \+ \\\hline Grupo de ensayo \+ 7,2
\pm 3,6 ^{*} \+ 30,3 \\ 2,0 mg/rata/día x 8 (10) \+ \+ \\\hline
Grupo de ensayo \+ 9,9 \pm 4,8 ^{*} \+ 4,6 \\ 5,0 mg/rata/día
x 8 (10) \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{*}) p \leqq 0,05 comparada con el grupo de
control.
Ejemplo
5
Para examinar el efecto del derivado
dodecilanilínico de oligofucosa previniendo la úlcera inducida por
NSAIDS y similares, se examinó su acción para analizar el efecto en
la prevención de trastornos inducidos por indometacina.
En cuanto a sus procedimientos específicos, la
dodecilanilina de oligofucosa disuelta en 1 ml de una disolución al
0,5% de carboximetilcelulosa se administró oralmente a ratas que
fueron sometidas a ayuno durante 18 horas (alimento) y 2 horas
(agua). Al grupo de control sólo se le administró la disolución de
carboximetilcelulosa. Después de 2 horas de la dosificación de la
muestra, se administró a estas ratas 1 ml de 50 mg/ml de
indometacina, para inducir daños en la mucosa gástrica. Después de 2
horas de la inducción del daño, se resecaron los estómagos de estas
ratas, que se fijaron en formalina, para medir la longitud y
anchura de una lesión con daño (lesión hemorrágica), y determinar el
área, calculando de ese modo la relación de supresión de la
aparición del daño. De este modo, se evaluó el efecto de la
dodecilanilina de oligofucosa para prevenir el daño gástrico
inducido por indometacina. Los resultados se muestran a
continuación en la Tabla 4.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|l|c|c|}\hline
\+ Índice de la úlcera \+ Relación de \\ \+ (media \pm SD)
\+ sanación (%) \\\hline Grupo de control \+ 46,06 \pm 24,72 \+
---- \\\hline Grupo de ensayo \+ 25,33 \pm 14,57 ^{*} \+ 45,0
\\ 0,5 mg/rata/día x 8 (7) \+ \+ \\\hline Grupo de ensayo \+
19,23 \pm 14,67 ^{*} \+ 58,2 \\ 2,0 mg/rata/día x 8 (10) \+ \+
\\\hline Grupo de ensayo \+ 4,29 \pm 4,48 ^{*} \+ 90,7 \\ 5,0
mg/rata/día x 8 (10) \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{*}) p \leqq 0,05 comparada con el grupo de
control.
Ejemplo
6
La H. pylori ha estado atrayendo la
atención en años recientes como una especie bacteriana causante de
úlcera gástrica. Se sugiere que debido a que la frecuencia de la
recidiva de úlcera gástrica es alta en pacientes infectados con la
especie bacteriana pero baja en los pacientes tratados en un
procedimiento desinfectante de la especie bacteriana usando dosis
elevadas de antibióticos, la desinfección de la especie bacteriana o
la profilaxis de la infección con la especie bacteriana es
significativamente importante en términos de la prevención de la
recidiva de la úlcera gástrica. En un sentido práctico, las pautas
terapéuticas de la úlcera en países europeos y en los Estados Unidos
de América enumeran la desinfección de la especie bacteriana; en
Japón, también se demandará un efecto sobre la especie bacteriana
de un agente terapéutico contra la úlcera a partir de ahora, debido
a que la relación de la infección con la especie bacteriana aumenta
con el transcurso del envejecimiento.
La especie bacteriana se puede desinfectar de
forma efectiva mediante el tratamiento terapéutico con una dosis
elevada de antibióticos e inhibidores de la bomba de protones, en
combinación, pero se considera que se desarrolla esencialmente otro
tratamiento terapéutico desde el punto de vista de la aparición de
bacterias resistentes. En cuanto al mecanismo de la infección con
la especie bacteriana, ésta se transfiere desde la capa de la
mucosa gástrica vía el movimiento de flagelos a las células
epidérmicas gástricas, en las que la bacteria reconoce
específicamente y se adhiere al residuo de fucosa de las cadenas de
azúcares tipo Louise b (Leb) en las células epidérmicas gástricas.
Un informe advierte que el ácido siálico, la sulfatida y laminina
están implicados en la adhesión de la bacteria, pero se considera
que la fucosa funciona como un sitio de reconocimiento significativo
para la adhesión específica sobre las células epidérmicas
gástricas.
Se indica que el fucoidano derivado de
Phaeophyceae Chordariales nemacystus no sólo ejerce los
efectos contra la úlcera sino también inhibe el proceso de la
adhesión. Debido a que se predijo que el derivado alquilamínico del
oligosacárido podía servir para la prevención de la infección de
H. pylori y de la recidiva de la úlcera gástrica, además de
para la promoción de la curación de la úlcera, si el derivado
alquilamínico de oligosacárido pudiera inhibir la adhesión de H.
pylori, se examinó el efecto del mismo sobre la inhibición de
la adhesión. Adicionalmente, también se examinó el efecto del mismo
sobre la inhibición de la proliferación.
En cuanto a los procedimientos específicos, se
oxidó con peryodato el extremo reductor de una cadena de azúcar tipo
Leb, para preparar un oligosacárido con el extremo oxidativo
resultante según el método de P. W. Tang, et al. (Biochem.
Biophys. Res. Commun., Vol. 132, 1985, p. 474-480).
El oligosacárido se conjugó con diaminohexano y se fijó
subsiguientemente en una microplaca (Covalink Plate™; fabricada por
NUNC Co.) para uso en la fijación de grupos amino. Se colocó en la
placa H. pylori marcada con biotina, para reacción a
temperatura ambiente durante una hora. Entonces, se dejó que el
derivado dodecilanilínico de oligofucosa estuviera presente de forma
apropiada concomitantemente. La disolución de la reacción se
enjuagó en un tampón para eliminar las bacterias que nunca se
adhieren.
Subsiguientemente, se añadió a cada pocillo 100
\mul de una disolución de estreptoavidina de 50 \mug/ml, para
reacción a temperatura ambiente durante una hora, con lo que la
estreptoavidina se unió selectivamente a las bacterias que
permanecían en los pocillos. El exceso de estreptoavidina se
eliminó por aclarado. Entonces se añadió a cada pocillo 100 \mul
de una disolución de 2,5 \mug/ml de biotina marcada con
peroxidasa. Tras la reacción a temperatura ambiente durante 30
minutos, se eliminó el exceso de la biotina marcada con la enzima.
Mediante el procedimiento, la biotina marcada con la enzima se unió
selectivamente a la bacteria biotinilada. Se detectó y se analizó la
actividad de la enzima, añadiendo 100 \mul de una disolución
sustrato (sistema de sustrato de peroxidasa ABTS; fabricado por KPL
Co.) durante 10 minutos de reacción. El ensayo se realizó midiendo
la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm. Debido a que la
absorbancia medida indica la cantidad de la bacteria que reconoce y
se une a la cadena de azúcar de tipo Leb, la relación de la
disminución de la absorbancia debido a la adición de dodecilanilina
de oligofucosa indica la relación de la inhibición de la
adhesión.
En la co-presencia del derivado
dodecilanilínico de oligofucosa en un intervalo de 10 a 100
\mug/ml, el incremento del derivado dodecilanilínico de
oligofucosa añadido disminuye la absorbancia, según se muestra a
continuación en la Tabla 5, que da los resultados de la actividad
de inhibición del derivado dodecilanilínico de oligofucosa sobre la
adhesión de H. pylori a la cadena de azúcar de tipo Leb. De
este modo, se indica que la unión entre H. pylori y la
cadena de azúcar de tipo Leb está inhibida por el derivado
dodecilanilínico de oligofucosa.
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|c|}\hline
Concentración de la muestra ( \mu g/ml) \+ Absorbancia (a 405 nm)
\\\hline 0 \+ 1,015 \\ 10 \+ 0,855 \\ 100 \+ 0,486 \\ 1000
\+ 0,080
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Subsiguientemente, se examinó el efecto de
dodecilanilina de oligofucosa sobre la inhibición de la
proliferación de H. pylori. Una cepa de aislado clínico de
H. pylori6-34 (1,5 x 10^{8} CFU/ml),
cultivada en un medio de cultivo de brucela que contiene
\beta-ciclodextrina al 0,1%, se suspendió hasta un
volumen de 100 \mul en 1 ml del mismo medio de cultivo, seguido
de adición de 10 \mul de la disolución de muestra (dodecilanilina
de oligofucosa), para cultivo durante 72 horas. El efecto se juzgó
según lo siguiente: basándose en la turbidez (densidad óptica, OD
600 nm) de la disolución de muestra con respecto a la turbidez del
grupo de control, se determinó mediante la siguiente fórmula la
relación de la inhibición de la proliferación. En consecuencia, la
relación de la inhibición de la proliferación fue 71,8%.
Como se ha descrito anteriormente, según la
presente invención, se proporciona un agente farmacéutico que tiene
una acción para promover la curación de la úlcera y una acción para
inhibir la adhesión de H. pylori, y que es efectivo para la
profilaxis y tratamiento terapéutico de la inflamación de la
mucosa gástrica que progresa potencialmente a úlcera o cáncer. Una
dosis muy baja de la sustancia anteriormente mencionada ejerce un
efecto de curación de la úlcera gástrica, y un efecto de prevención
del daño a la mucosa; y adicionalmente, la sustancia se puede
preparar fácilmente como un oligosacárido más homogéneo que los
polisacáridos en términos de propiedades fisicoquímicas y de
actividad. Por tanto, la sustancia se puede usar fácilmente como un
agente farmacéutico.
Claims (4)
1. Derivado de oligosacáridos seleccionado de
entre el grupo que consta de las siguientes fórmulas:
en las que ``n'' = 2 a
20.
2. Procedimiento para la preparación de un
derivado de oligosacáridos según la reivindicación 1, en el que
dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:
- convertir el residuo de azúcar en el extremo reductor de oligofucosa u oligoramnosa a un grupo aldehído mediante degradación oxidativa;
- generar una base de Schiff permitiendo que el grupo aldehído reaccione con al menos una de las alquilaminas y alilaminas correspondientes; y
- reducir la base de Schiff para obtener un derivado de oligosacáridos.
3. Inhibidor para Helicobacter pylori, que
contiene un derivado de oligosacáridos según la reivindicación
1.
4. Agente profiláctico o agente para el
tratamiento terapéutico de la úlcera gástrica, que contiene un
derivado de oligosacáridos según la reivindicación 1.
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