ES2198151T3 - Hongo mucorales para emplear en la preparacion de productos alimenticios. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de una sustancia proteínica comestible, apropiada para su utilización en un producto alimenticio, que comprende células fúngicas, comprendiendo dicho procedimiento: a. fermentar células fúngicas del orden Mucorales en un líquido acuoso contenido en un recipiente fermentador, comprendiendo el líquido una fuente de nitrógeno (N) asimilable y un fuente de carbono (C) asimilable, y mezclar el líquido y las células durante la fermentación; b. reducir el contenido de RNA de las células fúngicas por debajo de 4, 0% en peso (%p); c. antes o después de (b), retirar al menos parte del agua de la mezcla de células fúngicas y líquido acuoso, y d. procesar las células fúngicas para obtener una sustancia comestible.

Description

Hongo Mucorales para emplear en la preparación de productos alimenticios.

Campo del invento

El presente invento se refiere a la preparación de sustancias comestibles (proteínicas) utilizando células fúngicas del orden Mucorales y a la utilización de estas sustancias en productos alimenticios, en particular en sustitutivos de carne.

Introducción

La carne animal se considera una parte importante de la dieta de los humanos, no sólo debido a las vitaminas y nutrientes que proporciona, sino también debido a su sabor (particularmente al cocinarla) y, de forma importante, a su textura. Sin embargo, un creciente número de personas están optando por dietas vegetarianas/vegetarianas estrictas, en ninguna de las cuales se incluye la carne o los productos derivados de la carne. Dichas dietas pueden deberse a un número de factores, pero normalmente se deben a falta de gusto por la carne (bien por su textura o por su sabor) o a consideraciones éticas o morales (por ejemplo, la opinión de que resulta un error matar animales para alimentar humanos).

El desplazamiento hacia dietas vegetarianas/vegetarianas estrictas se ha incrementado en los últimos años debido a la aparición de la BSE (Encefalopatía Espongiforme Bovina), también conocida como ``enfermedad de las vacas locas'', un enfermedad que afecta al sistema nervioso de las vacas y que se piensa que es el resultado de alimentar al ganado con partes de oveja infectadas con una enfermedad similar conocida como ``encefalopatía espongiforme ovina''. La BSE se ha relacionado con una condición de los humanos conocida como CJD (enfermedad de Creutzfeldt-Jacob).

Aparte de determinados hongos comestibles (por ejemplo champiñones), se conocen alimentos proteínicos que contienen hongos. Un ejemplo es la comida fermentada tradicional de Indonesia, tempeh. Normalmente, se prepara por fermentación del hongo Rhizopus sobre semillas de soja (y sus partes) que actúan como sustrato sólido húmedo. Las semillas (u otro sustrato vegetal) se inoculan con el hongo y se dejan fermentar durante 24 a 36 horas. Las semillas se unen por medio de la proteína fúngica del micelio producida, para obtener un producto firme que a continuación puede cortarse en láminas antes de comerlo (normalmente no se lleva a cabo ningún otro procesado adicional antes del consumo). De este modo, los hongos se utilizan para hidrolizar un sustrato de lo contrario no comestible y, aparte de perder de manera inherente mucho sabor o aroma, el tempeh es relativamente seco y carece de la textura fibrosa y jugosa asociada a la carne. Los hongos representan sólo una pequeña cantidad del producto y por ello el contenido de la proteína fúngica es bajo. Por ello no es un sustituto de la carne no resulta particularmente apetecible, al menos para los occidentales.

En los últimos años se ha propuesto un número de sustitutivos comestibles de la carne. Las compañías americanas y japonesas comercializan productos basados en la soja, en particular la soja sometida a extrusión, pero éstos no tienen un sabor o una textura particularmente similar a la de la carne, de hecho tanto la soja como el gluten pueden tener un sabor ``a caducado'' o astringente.

Los documentos GB-A-2007077 y US 4265915 (Maclennan/BioEnterprises) proponen un proceso similar a la preparación del tempeh, salvo que en vez de semillas de soja el sustrato sólido es un alimento que contiene almidón tal como sagú, cereales o patatas. No obstante, un prerrequisito de estos productos alimenticios (y el tempeh) es que los alimentos sólidos o ingredientes son necesarios como sustrato para los microorganismos de la fermentación. El documento US 3.885.048 (Liggett) también se refiere a un producto alimenticio fermentado que se prepara utilizando un sustrato a base de almidón sólido.

Más recientemente, los trabajadores han propuesto la producción de sustancias que contienen proteínas comestibles utilizando la proteína del micelio producida por el hongo Fusarium graminearum. Estas sustancias se han utilizado de manera creciente como sustitutivas de la carne, y se incluyen en los productos alimenticios comercializados en el Reino Unido y otros países europeos. El documento WO 97/36996 (Gist-Brocades B.V.) se refiere a gránulos de biomasa microbiana seca, a partir de los cuales pueden extraerse compuestos interesantes tales como ácidos grasos poli-insaturados.

Breve descripción del invento

De acuerdo con un primer aspecto del invento, se proporciona un proceso para la preparación de una sustancia comestible (por ejemplo proteínica), apropiada para su uso en un producto alimenticio que comprende células fúngicas, que comprende:

a.

fermentar células fúngicas del orden Mucorales en un líquido acuoso contenido en un recipiente de fermentación, comprendiendo el líquido una fuente nitrógeno asimilable (N) y una fuente de carbono asimilable (C), y mezclar (y preferiblemente airear) el líquido y las células durante la fermentación;

b.

reducir el contenido de RNA de las células fúngicas por debajo de 4,0% en peso (% en peso);

c.

antes o después de (b), retirar al menos parte del agua de la mezcla de células fúngicas y líquido acuoso; y

d.

procesar las células fúngicas para obtener una sustancia comestible.

Mediante la utilización de hongos Mucorales (no tóxicos) (por ejemplo los utilizados en los productos alimenticios fermentados asiáticos) resulta posible evitar cualquier micotoxina que puedan producir otros organismos (por ejemplo la técnica anterior). De esta forma, puede reducirse o evitarse la identificación sistemática de organismos que sean seguros desde el punto de vista de su inclusión en los productos alimenticios. Esto significa que los productos preparados por el invento son más adecuados para la ingestión o para su utilización en productos alimenticios. En general, los organismos Mucorales no producen micotoxinas (o lo hacen en cantidades insignificantes o no detectables), aspecto claramente ventajoso, dado que estos organismos se incorporan a los productos alimenticios, lo que puede significar que las técnicas de procesado pueden ser más eficaces ya que no es necesario eliminar las micotoxinas. Esto puede solucionar el problema que se presenta con los organismos Fusarium que pueden producir micotoxinas no deseadas (Desjardins et al, Microbiological Reviews, 57(3): 595-604, Septiembre de 1993).

Las micotoxinas que aquí se anticipan son las de tipo aflatoxina, mevinolina, terreina y tricotecenos (éstos últimos producidos por algunas especies Fusarium). Resulta improbable que se permita el empleo de un hongo que produzca cualquiera de estas micotoxinas en la producción de alimentos, incluso en el caso de que el fabricante lleve a cabo etapas para eliminar las micotoxinas. Por tanto, es particularmente importante escoger hongos que no produzcan estas micotoxinas en ninguna etapa del proceso.

Una ventaja de la utilización de hongos Mucorales es existe una variedad relativamente amplia de microorganismos disponibles, dependiendo de las características de la sustancia proteínica que se deseen. Esto puede permitir diferentes características físicas (tales como naturaleza fibrosa, o sensación en la boca) o características químicas (sabor, etc). Se ha comprobado que los hongos utilizados en el presente invento confieren propiedades similares a las de la carne mejoradas, por ejemplo una textura más fibrosa y/o jugosa. Asimismo, estos hongos pueden variar en cuanto a textura y jugosidad y por tanto pueden ser utilizados en una amplia gama de productos alimenticios. Por tanto, escogiendo el microorganismo, es posible proporcionar distintas características deseadas de acuerdo con el producto alimenticio a preparar (empleando diferentes técnicas de procesado). Además, diferentes microorganismos pueden conferir diferentes colores, y ya que resulta posible preparar una sustancia de color blanco, también se pueden preparar sustancias que tengan distintos colores, tales como del amarillo al marrón o incluso de aspecto verde, lo que puede resultar deseable para determinados productos alimenticios.

Los hongos pueden ser de la familia Choanephoracea, tal como los del género Blakeslea o Gilbertella, por ejemplo de las especies Blakeslea trispora o Gilbertella persicaria. Las otras tres familias incluidas en el orden Mucorales son Cunninghamellaceae, Mortierellaceae (tal como los hongos del género Mortierella, y en particular las especies de Mortierella alpina) y, especialmente, Mucoraceae. Normalmente, los hongos apropiados son comestibles (y digeribles) por los humanos o animales.

Hongos preferidos son los saprofíticos (esto es, hongos simples) en vez de los parasíticos (que son mas complejos). Normalmente, se prefieren los hongos ``simples'' porque están mejor adaptados hacia un crecimiento en forma de hifas, mientras que los organismos parasíticos se concentran en tomar nutrientes procedentes de sus organismos anfitriones.

Preferiblemente, las células fúngicas son del género Rhizopus, Rhizomucor, Mucor o Mortierella perteneciendo todas ellas a la familia Mucoraceae. Hongos apropiados del género Rhizopus, Mucor o Rhizomucor incluyen Rhizopus stolonifer, Rhizopus miehei, Rhizopus pusillus, Rhizopus oligosporus y, en particular, Rhizopus oryzae, Mucor biemalis y Mucor rouxii; y Rhizomucor meihei. Otras cepas celulares preferidas incluyen las del género Absidia o Phycomyces, tales como Absidia psedocylindrospora o Phyzcomyces blakesleeanus.

Los hongos preferidos pueden tener una pared celular que comprende, o contiene fundamentalmente, quitina y chitosàn. Las paredes celulares pueden contener uno o más de las azúcares glucosamina (tales como D-glucosamina) y/o fucosa, tales como L-fucosa, y pueden estar considerablemente libres de galactosa.

Preferiblemente, los hongos utilizados en el presente invento no tienen tabique, a diferencia de los del grupo Fusarium. Además, los hongos preferidos para su utilización en el invento tienen ramificación, de nuevo a diferencia de los organismos Fusarium que presentan escasa o nula ramificación (en la hifa). De hecho, la técnica implica la utilización de mutantes sin ramificación (EP-A-0.123.434). La hifa de los hongos utilizados en el invento puede tener un diámetro de 1 a 20 \mum, tal como de 2 a 10 \mum, y de forma óptima de 2 a 8 \mum.

El hongo puede ser de origen natural, puede haber sido escogido utilizando técnicas conocidas para la lograr determinadas propiedades deseadas, o puede ser el resultado de ingeniería genética.

Generalmente se emplearán hongos del orden Mucorales, son también del grupo perfecti (en otras palabras, no pertenecen a la clase imperfecti), que son capaces de reproducirse sexualmente. Los hongos utilizados en el invento también pueden ser filamentosos.

Como se apreciará, el proceso del primer aspecto es una fermentación líquida, en otras palabras el líquido acuoso (por ejemplo una disolución) sirve como medio de cultivo. Esto contrasta con los procesos de la técnica anterior en los que los hongos se cultivan sobre un sustrato sólido, siendo dicho sustrato, por ejemplo, arroz, semilla de soja o productos que contienen almidón tales como cereales o patatas. En el invento, el proceso de fermentación líquida de (a) se lleva a cabo preferiblemente en ausencia de un sustrato sólido, tal como el que es en sí mismo un producto alimenticio (esto incluye no sólo material vegetal o leguminosas sino también carne y almidón sólido natural o sustancias que contienen hidratos de carbono tales como cereales, semillas de soja, semillas de sésamo o harina).

De esta forma, un segundo aspecto del presente invento se refiere a una sustancia comestible (por ejemplo proteínica), apropiada para su uso en un producto alimenticio, que comprende células fúngicas del orden Mucorales que tienen un contenido de RNA inferior a 4,0% en peso. Esta sustancia puede prepararse mediante un proceso del primer aspecto. Puede ser biomasa o torta de filtración, o dicha biomasa o torta de filtración que haya sido molida o volteada.

Un tercer aspecto del presente invento se refiere a un proceso para la preparación de un producto comestible (con textura) que comprende añadir uno o más componentes comestibles a una sustancia comestible proteínica que comprende células fúngicas del orden Mucorales que tienen un contenido de RNA inferior a 4.0% en peso y (si es necesario) conferir textura a la mezcla.

Un tercer aspecto también incluye un proceso para la preparación de un producto comestible (con textura) que comprende mezclar no o más componente(s) comestibles con una sustancia comestible proteínica que comprende células fúngicas del orden Mucorales que tienen un contenido de RNA inferior a 4.0% en peso y conferir textura para formar un producto, en el cual al menos el 5% son células fúngicas en una base en peso de materia seca.

Preferiblemente, las células fúngicas permanecen sanas (o la totalidad) no sólo durante el proceso de fermentación, sino también durante las etapas posteriores del procesado, incluyendo la eliminación de agua, la reducción del contenido de RNA y cualquier proceso para conferir textura. De esta forma, la sustancia (o producto con textura) contendrá células fúngicas sanas (y no muertas), y durante la mayoría, si no todas, de las etapas de preparación de la sustancia o del producto, se llevarán a cabo etapas para minimizar el daño y la lisis de las células o de las membranas celulares. No obstante, durante el procesado algunos compuestos pueden abandonar la célula (de forma que la membrana celular puede sufrir ciertas ``fugas''). Por supuesto, se pretende que el proceso del invento implique la eliminación de parte del RNA (y si es necesario también el agua) de las células fúngicas.

La sustancia (y con ello también el producto con textura) contiene la proteína fúngica producida por las células fúngicas. Normalmente, esta proteína es intracelular y/o se encuentra dentro de la membrana celular. Pueden estar presentes proteínas extracelulares, pero éstas se eliminan a menudo durante el procesado (por ejemplo la eliminación de agua, dado que la proteína extracelular puede estar presente en el líquido acuoso). De esta forma, la sustancia proteínica, por ejemplo la biomasa, puede ser una que se prepare mediante el proceso del primer aspecto.

Preferiblemente, la sustancia proteínica tiene al menos 40%, por ejemplo al menos 50% o incluso 60% o más de células fúngicas. No obstante, estas cantidades pueden ser mucho mayores y las células pueden constituir al menos 70%, tal como al menos 80%, y de forma óptima al menos 90% ó 95% de la sustancia proteínica (en peso de materia seca). Con un contenido tan elevado del células fúngicas es posible obtener una sustancia (y, posteriormente un producto con textura) que sea más jugosa, fibrosa y de mejor sabor. Incluso después del proceso para conferir textura, el producto comestible resultante (por ejemplo, con textura) puede tener un contenido de células fúngicas igual al citado para la sustancia proteínica. Estos porcentajes se basan en el peso de las células en la materia seca, en otras palabras primero se seca la sustancia o producto y, sobre la base de la materia seca obtenida, se calcula el porcentaje (en peso) de esa materia que representan las células fúngicas.

Por tanto, la sustancia puede consistir esencialmente sólo de células fúngicas (que pueden incluir la proteína producida por (por ejemplo en el interior) esas células). Durante la fermentación, por tanto, normalmente no habrá extracción o aislamiento de ningún compuesto(s) o sustancia(s) en particular bien contenidas en o bien producidas por los hongos como las células fúngicas. De hecho, en los procesos del invento, es preferible que el RNA (o cualquiera de sus productos de degradación o compuestos no deseados durante el procesado) sea el único compuesto(s) que se retire de las células. La proteína extracelular puede retirarse por lavado de las células y de esta forma puede no estar presente.

La sustancia proteínica del tercer aspecto y el producto con textura del cuarto aspecto son comestibles en el sentido de que pueden incluirse en un producto alimenticio o de que son compatibles con la utilización en alimentos. Aunque la sustancia proteínica puede comerse como tal, la intención es que ésta es, de hecho, un intermedio en la preparación del producto con textura.

La sustancia proteínica puede tener, como único material comestible, las células fúngicas y por tanto puede no estar presente, aparte de en las células fúngicas, en las sustancias comestibles. No obstante, a continuación distintos componentes comestibles pueden mezclarse con o añadirse a la sustancia proteínica del tercer aspecto para producir el producto con textura del cuarto aspecto. En la preparación del producto alimenticio, puede añadirse un componente(s) adicional(es) al producto con textura.

De esta forma, un cuarto aspecto del presente invento es el producto con textura. Este resulta adecuado para su inclusión en un producto alimenticio (puede ser comestible, y digerible de forma adecuada, bien por humanos o por animales) y puede comprender células del orden Mucorales que bien tengan un contenido de RNA inferior a 4,0% en peso o en las que al menos el 40% del producto (en peso de materia seca) sean células fúngicas. El porcentaje de células fúngicas (en peso de materia seca) puede ser el mismo que el mencionado anteriormente para la sustancia proteínica (del segundo aspecto). No obstante, dado que el producto del cuarto aspecto puede prepararse añadiendo un componente(s) comestible(s) a la sustancia proteínica del segundo aspecto, debe notarse que el contenido de células fúngicas del primero normalmente es menor que el del segundo. El producto con textura puede comprender pellets, gránulos o láminas, y puede prepararse mediante un proceso que implique la extrusión (y por tanto puede ser un producto extruido), puede comprender una masa, una pasta o trozo similar a la carne, o puede tener forma cilíndrica (tal como enrollar la sustancia si está en forma de lámina).

Un quinto aspecto del presente invento se refiere a un proceso para la preparación del producto alimenticio, que comprende formar un producto alimenticio con, o incluyéndolo en un producto alimenticio ya existente, una sustancia comestible de acuerdo con el segundo aspecto (por ejemplo preparada mediante un proceso del primer aspecto) o un producto con textura del cuarto aspecto (tal como el preparado mediante un proceso del tercer aspecto). Esto puede suponer añadir uno o más componentes comestibles adicionales bien a ala sustancia o bien al producto, o puede comprender un proceso posterior para conferir textura. Por tanto, este proceso incluye no sólo la preparación de un producto alimenticio utilizando bien la sustancia o el producto, sino que también supone la complementar un producto alimenticio bien con la sustancia o bien con el producto.

De esta forma, el producto alimenticio proporciona un sexto aspecto del presente invento. Esto puede comprender bien la sustancia del segundo aspecto o el producto del cuarto aspecto. El producto alimenticio se prepara mediante un proceso del quinto aspecto.

El producto alimenticio puede ser salchichas, empanada, hamburguesa, productos para untar, piensos o puede incluir composiciones farmacéuticas comestibles tales como comprimidos.

Preferiblemente, el producto alimenticio comprende al menos 5%, por ejemplo al menos 8 ó 10%, y de forma óptima 15 ó 20% de células fúngicas (en peso de materia seca). El contenido fúngico puede ser tan elevado como el descrito para el producto con textura, pero dado que el producto alimenticio puede estar preparado a partir de ese producto el contenido fúngico puede ser menor, por ejemplo las células fúngicas pueden únicamente constituir al menos el 25 ó 30% del producto alimenticio (de nuevo, basado en cálculo en peso de materia seca).

Descripción detallada del invento

El proceso de fermentación del primer aspecto se lleva a cabo de forma adecuada en un recipiente de fermentación adaptado para contener el líquido acuoso, tal como una cuba, y este recipiente puede estar presurizado. También puede estar adaptado para permitir el aporte continuo o continuado de las fuentes de carbono y/o nitrógeno asimilable. Por tanto, preferiblemente la etapa (a) y las etapas posteriores se llevan a cabo de forma aséptica. Aunque la fermentación puede ser un proceso continuo, con retirada o recogida regular de las células fúngicas (y de la proteína que las acompaña), el proceso puede ser un proceso por tandas si se desea, tal como un proceso por tandas de alimentación repetida (una o más adiciones de C y/o fuentes después de que la fermentación haya comenzado). De esta forma, el proceso de fermentación puede pararse o detenerse, y pueden retirarse las células fúngicas del recipiente, antes de que comience otra fermentación o una fermentación fresca.

De manera adicional, el recipiente puede estar adaptado para llevar a cabo, o permitir que se lleve a cabo, la aireación y/o mezcla de las células y el líquido, tal como la agitación de la disolución que puede lograrse por medios mecánicos.

Las fuentes de carbono y nitrógeno pueden proporcionarse en composiciones separadas. Esto es debido a que las diferentes fuentes pueden estar sujetas a diferentes condiciones de esterilización, y además de esta forma se permite una variación en las cantidades relativas de carbono y nitrógeno durante la fermentación.

Las fuentes de carbono y/o nitrógeno pueden aportarse (o añadirse) por separado, o aportarse de forma simultánea, a aportarse en forma de preparación combinada. De esta forma, pueden estar presentes en la misma composición (si se estimase necesario) que es preferiblemente un líquido. Las fuentes de C y/o N pueden añadirse (al recipiente de fermentación) bien antes de añadir las células fúngicas (al recipiente), en otras palabras antes de inocular, o bien durante la fermentación.

Si el aporte es continuado (o intermitente), es preferible que para cada instante del aporte (por ejemplo ``dosis'' o adiciones) la adición de ambas fuentes de carbono y/o nitrógeno sea la misma.

Relaciones de C:N (en peso) preferidas son al menos de 6:1, pero pueden variar de 10:1 a 150:1, tal como de 15:1 a 50:1, y de forma óptima de 25:1 a 40:1.

Para el aporte continuado, preferiblemente el tiempo durante el cual se aportan las fuentes de nitrógeno y/o carbono es mayor que el tiempo durante el cual no se aportan. De esta forma, durante la fermentación el aporte es ventajoso durante al menos 50% del tiempo. Si el aporte de una o ambas fuentes es intermitente, entonces debe haber al menos 2, preferiblemente al menos 5, y de forma óptima al menos 10 adiciones al líquido acuoso de la fuente de nitrógeno y/o carbono. Para aporte continuo o adiciones posteriores es preferible que la relación C:N en las fuentes se mantenga (aproximadamente) en la misma relación que cuando comenzó la fermentación.

Las fuentes de carbono y/o nitrógeno pueden ser fuentes complejas, o compuestos individuales o aislados. Se prefieren las fuentes no complejas (estas pueden tener o producir menos micotoxinas) y por eso en los dos últimos casos éstas pueden añadirse con un alto grado de pureza, y pueden ser sustancias químicas comunes (o disponibles a nivel comercial). Preferiblemente, ambas fuentes de C y/o N son no sólidas, y de manera apropiada ambas son líquidas.

Fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen amoníaco e iones amonio. La ventaja aquí es que el amoníaco puede actuar como regulador de pH. Este puede aportarse en forma de sal de amonio, tal como nitrato, sulfato o fosfato o en forma de iones de amonio por sí mismos, por ejemplo una disolución acuosa de hidróxido de amonio.

También pueden utilizarse otras fuentes de nitrógeno inorgánico, tales como nitrato de sodio, urea o un aminoácido tal como asparagina o glutamina.

Otras fuentes complejas incluyen hidrolisatos de levaduras, levaduras primarias, harina de semilla de soja, hidrolisatos de caseína, levaduras, extracto de levadura o salvado de arroz.

La fuente de carbono puede comprender (fuentes complejas tal como) maltodextrina, harina de avena, molasas, aceite vegetal (por ejemplo de semilla de soja), extracto de malta o almidón. Fuentes de carbono preferidas (no-complejas) incluyen hidratos de carbono o azúcares, tales como fructosa, maltosa, sacarosa, xilosa, manitol, glucosa, lactosa, citrato, acetato, glicerol o etanol.

Las fuentes de nitrógeno y/o carbono preferidas son las solubles en agua o miscibles en agua.

De manera adicional, el líquido acuoso puede contener otras sustancias que contribuyan en la fermentación, por ejemplo agentes quelantes (por ejemplo ácido cítrico), agentes anti-espumantes (por ejemplo aceite de soja), vitaminas (por ejemplo tiamina y/o riboflavina), cualesquiera metales catalíticos (por ejemplo, metales de las tierras raras tales como magnesio o calcio, o zinc o hierro y/o otros metales tales como cobalto o cobre), fósforo (por ejemplo fosfato) y/o azufre (por ejemplo sulfato). Preferiblemente, el líquido acuoso tiene un bajo contenido en azufre, por ejemplo menos de 3,0 g, preferiblemente menos de 2,0 g o 1,0 g, de azufre por litro de líquido acuoso.

Preferiblemente, se controlan el pH, la temperatura y/o el contenido de oxígeno (del líquido acuoso) durante la fermentación. Esto puede consistir en mantener el pH, la temperatura y/o el contenido de O_{2} constantes o dentro de un intervalo deseado. En este sentido, el recipiente de fermentación puede tener sensores de pH, temperatura y/o contenido de O_{2}.

El pH del líquido acuoso durante la fermentación puede estar entre 2 y 8, tal como entre 3 y 7, y de forma óptima entre 4 y 6.

La temperatura del líquido acuoso durante la fermentación no es un aspecto particularmente crítico, puede estar entre 20 y 50ºC, tal como entre 25 y 40ºC, y de forma óptima entre 30 y 35ºC.

Es importante que exista mezcla durante la fermentación. En otras palabras, que el líquido acuoso y las células fúngicas se mezclen o agiten de manera adecuada. Esto puede conseguirse si se proporciona aireación, en otras palabras burbujeando aire en el líquido acuoso. Esto puede satisfacer el requisito adicional de proporcionar oxígeno a las células fúngicas: de esta forma la fermentación es preferiblemente aerobia.

Otro medio de agitación o mezcla incluye la agitación, por ejemplo, utilizando una rueda de paletas. Esta puede ser de diseño de flujo axial o puede diseñarse con el fin de que se produzca el desplazamiento radial del medio acuoso hacia el exterior de la rueda de paletas (como una turbina). Incluso si no existe agitación, es preferible que se proporcione oxígeno a los hongos durante la fermentación, y por ello la aireación resulta ventajosa (por ejemplo burbujeando aire, O_{2} u otro gas que contenga oxígeno). La aireación puede ser de 0,1 a 2,0, tal como de 0,5 a 1,0 vvm.

Una de las ventajas de la aireación y/o agitación es que el contenido de oxígeno del líquido acuoso puede mantenerse relativamente elevado. Este puede ser de al menos 105, tal como al menos 15%, y de forma óptima de al menos 20% (en términos de saturación de aire). Esto permite un proceso de formación más eficaz, y de esta forma puede dar como resultado un contenido más rápido o más elevado de células fúngicas y/o de proteína fúngica. Esto resulta particularmente ventajoso para las células fúngicas utilizadas en el invento porque estas son suficientemente robustas para permitir tolerar la agitación y/o mezcla durante la fermentación. No obstante, esto no siempre es posible con células fúngicas (las más sensibles) del grupo Fusarium, dado que la técnica muestra la utilización de fermentadores aéreos, que carecen de agitadores mecánicos, con tales organismos. De esta forma, con la mayoría de organismos Mucorales no se requiere el uso de equipamiento caro, tal como fermentadores aéreos, desarrollado para otros organismos (menos robustos), lo que significa que la sustancia comestible puede producirse de forma más barata.

La fermentación puede durar de 1 a 12 días, tal como de 2 a 6 ó de 7 a 10 días, y de forma óptima de 2 a 4 días. Una fermentación más corta tiende en sí misma hacia un proceso de fermentación por tandas, en vez de continuo.

Una vez que ha finalizado la fermentación, o se ha parado, puede retirarse el agua de la combinación de células fúngicas y el líquido circundante producido. En la técnica, esta combinación de líquido acuoso y células fúngicas se denomina normalmente ``caldo''. Durante la fermentación el recipiente debe contener únicamente este caldo, y éste es de manera preferible enteramente líquido (y por tanto debe evitarse cualquier material sólido). Las células pueden lavarse, tal como con un líquido acuoso por ejemplo agua, antes o después de esta etapa de eliminación de agua, y si se desea una de ellas o ambas pueden dar como resultado la separación de las células de la materia extracelular (por ejemplo la proteína). Si fuese preciso, el proceso para eliminar los gránulos (dispersión o minimización de cualquier gránulo en el líquido) puede llevarse a cabo antes de eliminar el agua (por ejemplo mediante tratamiento por ultrasonidos o mediante mezcla por corte).

Preferiblemente, la eliminación de agua se hace por medios mecánicos o mediante técnicas mecánicas. Estas incluyen diferentes técnicas de separación sólido-líquido tales como desecado mecánico, filtración, centrifugación (preferida), sedimentación (en otras palabras, se deja depositar el material por gravedad), calentamiento o secado.

Tras este desecado el contenido de agua puede ser de 50 a 90%, tal como 60 a 87%, y de forma óptima de 75 a 85%.

Después de este desecado (opcional), a continuación el contenido de RNA de las células fúngicas puede reducirse por debajo de 4% en peso. Esto puede conseguirse por métodos químicos y/o físicos. El método preferido es la utilización, y de esta forma aprovechamiento, de una o más enzimas que ya se encuentran en el interior de las células fúngicas para digerir el RNA. Esto puede dar lugar a que algunas moléculas de RNA (pequeñas) (o sus productos de degradación) pasen a través, y con ello salgan, de la membrana celular. De manera apropiada, los nucleótidos (no deseados) del interior de la célula se fragmentan en 2, 3 y 5 nucleótidos; de esta forma puede ser que estos nucleótidos sean transportados a través de la membrana celular. Asimismo el desecado también puede eliminar otros compuestos no deseados durante el procesado posterior, tales como glucosa (por ejemplo debido a tratamiento térmico posterior).

Un método preferido para eliminar el RNA es el tratamiento térmico, en otras palabras calentar las células fúngicas. Esto puede tener dos efectos. En primer lugar, la célula se hace más permeable, permitiendo la salda del RNA y otras moléculas. También puede aumentar la actividad de las nucleasas, tales como RNAasas, en el interior de las células fúngicas. Otra ventaja es que dicho tratamiento térmico puede inactivar algunas enzimas no deseadas del interior de las células fúngicas. De manera alternativa o al mismo tiempo pueden proporcionarse o añadirse (ribo)nucleasas y/o RNAasas, en vez de confiar en las enzimas del interior de las células.

Por tanto, la técnica preferida para la reducción del RNA implica la transferencia del RNA del interior al exterior de la célula fúngica, por ejemplo al interior de un líquido acuoso circundante (por ejemplo el caldo). Posteriormente las células pueden separarse o ser retiradas de este líquido acuoso.

Si se utiliza el tratamiento térmico para la reducción del RNA, las células fúngicas pueden calentarse hasta una temperatura de 40 a 80ºC, preferiblemente de 50 a 70ºC, y de manera óptima de 55 a 65ºC. Esto puede ser durante un tiempo de 20 a 50 minutos, preferiblemente de 25 a 40 minutos, y de forma óptima de 25 a 35 minutos. La temperatura del tratamiento térmico para permitir la reducción del RNA y el período de tiempo durante el cual se mantiene esta temperatura pueden ser importantes. Si la temperatura es demasiado baja, puede que las enzimas del interior de las células que reducen el RNA no se activen. De manera similar, si la temperatura es demasiado elevada, entonces se producirá la desnaturalización o por el contrario la inactivación de dichas enzimas. Por tanto, es necesario que se alcance un equilibrio, y que se escoja una temperatura entre estos dos extremos. De este modo, preferiblemente, las condiciones son aquellas en las se produce la activación de la enzima(s) del interior de las células o en las que se permite a ésta(s) la reducción del contenido de RNA de dichas células. Puede que el simple hecho de elevar la temperatura desde, por ejemplo, 30 a 100ºC no sea suficiente, porque al hacer eso puede que las células no duren lo suficiente a una temperatura intermedia que permita a las enzimas del interior reducir el contenido de RNA. De esta forma, dependiendo del organismo en cuestión, se escogen una temperatura y un tiempo con el fin de que tenga lugar la reducción del RNA: aunque existen descripciones anteriores acerca del calentamiento de células fúngicas, estas condiciones pueden no ser adecuadas para llevar a cabo la reducción del RNA (ya que bien la temperatura o bien el tiempo durante el cual se mantiene esa temperatura no permitan la reducción de contenido de RNA por parte de las enzimas del interior de las células).

Otro método para la eliminación del RNA consiste en someter a las células fúngicas a un pH ácido o alcalino. Si se proporciona un pH ácido, éste puede ser de 3 a 4,5, tal como de 3,5 a 4,2. Este tratamiento ácido puede durar de 15 a 120 minutos, tal como 30 a 60 minutos. Si fuese necesario, puede combinarse con el tratamiento térmico, tal como de 40 a 60ºC, tal como de 50 a 60ºC. Ácidos apropiados incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y/o ácido sulfúrico. También puede utilizarse un fungicida para matar las células, en vez de o además de los métodos mencionados.

Si se proporciona un pH alcalino, éste puede ser desde un pH 8 a 12, tal como de 9 a 11, y de forma óptima a un pH de 8 a 10. El agente alcalino puede proporcionarse en forma de amoníaco, óxido de metales de las tierras alcalinas, hidróxidos o carbonatos. El tratamiento alcalino puede durar el mismo tiempo que se ha especificado para el tratamiento ácido, y de manera opcional también puede ir acompañado de tratamiento térmico como se ha descrito para el tratamiento ácido. No obstante, en algunos casos una temperatura menos elevada puede resultar más apropiada, por ejemplo de 40 a 80ºC, tal como de 60 a 70ºC, y de manera óptima de 62 a 68ºC.

Las células fúngicas pueden someterse a ambos tratamientos ácido y alcalino, cualquiera de los cuales puede combinarse con el tratamiento térmico. Preferiblemente, la reducción del RNA es un proceso de una etapa. La disolución ácida o alcalina empleada para entrar en contacto con las células fúngicas puede descartarse, reutilizarse o reciclarse.

Si fuese necesario, la eliminación del RNA puede estar seguida de pasterización o tratamiento por choque térmico. Esto puede suponer temperaturas particularmente elevadas, tal como 100 a 150ºC ó 40 a 120ºC, y de manera óptima 130 a 140ºC ó 40 a 60ºC. Esto sólo puede durar 30 a 200 segundos, tal como 80 a 120 segundos. Para los intervalos de temperaturas más elevados: puede ser de 5 a 120, por ejemplo de 20 a 50 minutos para las temperaturas más bajas. Este tratamiento por choque térmico puede proporcionarse después del tratamiento ácido y/o alcalino.

De esta forma, para la eliminación del RNA puede llevarse a cabo el tratamiento térmico y/o pasterización además del calentamiento. Esto puede resultar necesario si la eliminación del RNA no mata todas las células. De manera alternativa, esta etapa podría entenderse como la esterilización o inactivación de las proteínas o enzimas no deseados, por ejemplo proteasas, lipasas, amilasa, fosfolipasas y/o lipoxigenasas. Esta etapa (como con la reducción del RNA) puede llevarse a cabo tanto si las células fúngicas se encuentran todavía en el líquido acuoso (por ejemplo el caldo, por ejemplo mientras se encuentran todavía en el recipiente de fermentación) como si (preferiblemente) han sido sometidas a una o más etapas de eliminación de agua. Aquí, el tratamiento térmico puede bien reducir el contenido de agua y/o hacer que las células fúngicas sean más insolubles en agua.

Independientemente de la técnica(s) de reducción del contenido de RNA que se emplee, es deseable que las células fúngicas permanezcan íntegras, o enteras, en otras palabras que no experimenten lisis. De esta forma, las células deben estar íntegras pero no vivas (por ejemplo muertas o no ser viables).

Tras la reducción del RNA, las células fúngicas tienen un contenido de RNA inferior a 4,0 ó 2,0%, tal como de 0,1 a 2,0%, preferiblemente de 0,5 a 1,5%. De manera óptima, el contenido de RNA es de 0,4 a 0,8%. Estos porcentajes están basados en peso seco de las células. De esta forma, las células con un contenido de RNA reducido puede presentar un contenido inferior al que presentan los hongos de origen natural o los hongos utilizados en el proceso de fermentación (etapa (a) del primer aspecto).

La proteína producida puede localizarse en diferentes partes de la célula fúngica. Puede representar hasta 30%, tal como hasta 40% y de manera óptima hasta 50% de la propia célula fúngica (basado en peso seco). La proteína fúngica puede estar en el interior de la célula (intracelular) o en el interior de la pared celular. La primera puede incluir dos ``tipos'' de proteínas diferentes, por ejemplo proteínas estructurales (las relacionadas con el DNA; ribosomas, membranas etc) y proteínas catalíticas (por ejemplos enzimas). Los proteínas de la pared celular incluyen no sólo las que están en el interior o forman parte de la pared celular, sino también pueden estar fuera de la pared celular pero permanecer enlazadas a ella. Esto es contrario a lo que sucede con las proteínas segregadas (por ejemplo extracelulares) que no están enlazadas a la pared, y que normalmente son descartadas o frecuentemente se pierden durante el procesado. A continuación, el material que contiene las células fúngicas puede someterse, si es necesario, a una etapa (posterior) de eliminación de agua, o desecado. Preferiblemente, esto reduce el contenido de agua hasta 50-90%, tal como 60-85%, y de forma óptima 75-85%. Esto puede ser después de uno o más tapas de enjuague o lavado (por ejemplo con agua, por ejemplo agua del grifo). El material resultante puede tener un contenido de materia seca de 10 a 40%, preferiblemente de 15 a 35%, y de forma óptima de 20 a 30%.

Preferiblemente, el líquido eliminado contiene el RNA, los productos de degradación del RNA y cualquier otra sustancia no deseada eliminada a partir de las células o transferida del interior al exterior de las células, en la etapa(s) previa de reducción del RNA o calentamiento. Los procedimientos para la eliminación de agua aquí son los mismos que los descritos para la etapa anterior opcional de eliminación que sigue a la fermentación. No obstante, en esta etapa se prefiere la filtración, tal como filtración a vacío.

En esta etapa del proceso, es posible haber producido la sustancia proteínica que es el objeto del tercer aspecto del invento. Puede estar en forma (por ejemplo acuosa) de pasta, biomasa o torta de filtro. Puede llevarse a cabo un procesado posterior, en particular un proceso para conferir textura, por ejemplo utilizando métodos mecánicos, con el fin de producir el producto con textura (proteínico) del cuarto aspecto. Otras técnicas de procesado pueden incluir tratamiento químico, físico y/o enzimático.

Uno o más componentes comestibles pueden añadirse o mezclarse con la sustancia del segundo aspecto. Estos pueden ser para añadir textura y/o sabor. Componentes preferidos incluyen hidrocoloides, por ejemplo pectina, almidón, carragenina o alginato. Esto puede ser antes o después de la etapa(s) de procesado mecánico tal como molienda, desmenuzado, corte, amasado y/o homogeneización.

También se contemplan como proteínas, por ejemplo la proteína de la leche tal como caseína, ovoproteína tal como albúmina de huevo o los propios huevos (yema y/o clara de huevo), proteínas vegetales tales como soja, o proteínas de cereales, tales como gluten, o enzimas (por ejemplo proteasas, fosfodiesterasas).

Otros componentes comestibles incluyen potenciadores del sabor tales como sal, azúcar, IMP y/o GMP (aunque en este caso es preferible que la cantidad de RNA no exceda la mencionada anteriormente para las células fúngicas), agentes aromatizantes tales como especias, hierbas, proteínas (por ejemplo de 2 a 5% tal como proteína de la leche, por ejemplo caseína, una proteína vegetal, una ovoproteína, por ejemplo albúmina), hidrocoloides (por ejemplo de 5 a 20% tal como pectina, carragenina, agar, xantán, gellan, ácidos galactourónico o manurónico o sus sales), agentes formadores de gel (tales como albúmina de huevo, proteína de suero lácteo y alginato), polisacáridos (tales como de 0 a 10%, por ejemplo almidón o pectina), agentes colorantes, material vegetal (cebollas, zanahorias, soja, guisantes, judías o cereales tales como trigo, avena, cebada) y agentes emulsionantes. También puede incluir aromatizantes similares a la carne, tal como aromatizantes de ternera, cerdo o aves de corral (pollo o pavo) u otros productos no cárnicos. Pueden proporcionarse componentes adicionales para mejorar el sabor (propiedades organolépticas), la fijación de agua, la fijación de grasas, las propiedades emulsionantes, la textura, el volumen, la viscosidad, el sabor, aroma y/o el color (colorantes, carotenoides, etc.). Puede incluirse albúmina de huevo para mejorar la capacidad para batir, el color o como agente de fijación de otras proteínas. Puede usarse yema de huevo para emulsionar, conferir color o sabor. Puede utilizarse proteína de soja para fijar el agua, fijar las grasas o para mejorar la textura. También puede incluirse gelatina para la mejorar la formación de gel. Proteína de la leche o sus sales para la fijación de agua o grasas, sabor o textura y gluten de trigo para la fijación de agua, textura o sabor. Por tanto, puede utilizarse el producto proteínico comestible para reemplazar o puede proporcionarse junto con uno o más de los siguientes: proteínas vegetales, clara de huevo, gelatina, agentes espumantes proteínicos comestibles y proteínas de la leche. También pueden incluirse materiales fibrosos (por ejemplos vegetales tales como cebollas).

El proceso de texturización pretende proporcionar al producto una textura similar a la de la carne y/o una sensación en la boca similar a la de la carne. De esta forma, puede tener un aspecto fibroso o similar al de la carne.

Preferiblemente, la texturización es por uno o más medios mecánicos. Estos incluyen molienda, desmenuzado, picado, formación de rebanadas, corte (por ejemplo en bolas, rebanadas o capas), amasado, formación de capas, estiramiento, formación de láminas y/o extrusión. Preferiblemente, puede tener como resultado la alineación de las proteínas fúngicas dando lugar a fibras, lo que puede contribuir a dar al producto el aspecto similar al de la carne.

No obstante, el proceso de texturización puede comprender métodos físicos, por ejemplo calentamiento y/o congelación. Ambas técnicas pueden también dar como resultado la posterior eliminación de agua. En particular, la congelación puede contribuir a la alineación de las células fúngicas dando lugar a un aspecto fibroso.

El moldeado mecánico puede incluir colocar la mezcla de células fúngicas y del componente(s) comestible en un molde u otro recipiente de forma deseada, y a continuación enfriar (tal como congelar) y/o calentar (por ejemplo de 70 a 100ºC, para provocar la formación de un gel, por ejemplo) mediante diferentes métodos tales como vaporización, cocción y/o fritura. Si es necesario puede aplicarse presión. A continuación, el material puede sacarse del molde o recipiente, y puede retener la forma de dicho recipiente.

El producto moldeado por ejemplo puede presentar formas de animales, pájaros o pescados, letras del alfabeto, números, etc que pueden se particularmente apropiadas para los productos alimenticios destinados a niños.

El producto con textura también puede presentar forma de polvo seco, que puede incluirse en un producto alimenticio para mejorar la sensación en la boca o para aumentar la viscosidad.

Un proceso de texturización particularmente preferido implica la granulación, por ejemplo para producir partículas granulares. Antes de cualquier texturización, las células fúngicas combinadas y la proteína fúngica pueden tener un contenido medio de agua de 15 a 85%. Después de la texturización (por ejemplo granulación), los gránulos resultantes pueden tener un contenido medio de agua inferior a 30%, por ejemplo menos de 20%, y de manera opcional menos de 10%.

Preferiblemente, la granulación se logra mediante extrusión. Se prefiere ésta porque las condiciones de extrusión pueden ajustarse para minimizar la disgregación de las células fúngicas. Por tanto, la extrusión puede llevarse a cabo sin calor, por ejemplo de 15 a 85ºC. Durante la extrusión, los gránulos pueden formarse de manera natural, cayendo por su propio peso (a partir de la hilera para estirar, tal como por gravedad) o se puede utilizar un cortador, tal como una cuchilla rotatoria, para cortar los largos cordones de ``espaguetti'' producidos por la extrusión. Después de la extrusión, los gránulos preferiblemente tienen un contenido de agua menor de 15%, tal como menos de 10%, y de forma óptima de 3 a 7%. Los gránulos pueden tener un diámetro de 0,3 a 10 mm, tal como de 0,7 a 5 mm, y de forma óptima de 1 a 3 mm.

De esta forma, la extrusión puede utilizarse para formar productos alargados similares a los ``spaghetti'' (éstos pueden ser cilíndricos y/o de corte transversal circular), cuando se hace pasar el producto a través de una hilera para estirar (por ejemplo, con orificios circulares o cuadrados). No obstante, pueden formarse por ejemplo láminas o capas haciendo pasar (por ejemplo utilizando la extrusión) el producto a través de una o más ranuras. También pueden prepararse estas formas mediante la utilización de una o más superficies móviles, tal como un rodillo(s) o un cilindro(s). Éstos pueden moverse en la misma dirección o en sentido de rotación inverso y pueden ser una, dos o hasta cinco superficies.

Por tanto, el producto proteínico puede tener varias formas. Por ejemplo, puede tener forma de bolas, por ejemplo bolas de carne, masas, láminas, gránulos, producto extraído, rebanadas o puede tener forma de capas. Estas formas pueden estar secas o congeladas. El producto puede incluirse en el producto alimenticio sin procesado adicional. Pueden reconocerse como bolas en el producto alimenticio, y pueden tener el aspecto de la carne.

De esta forma, pueden incluirse en los productos alimenticios como sustitutos de la carne, y productos alimenticios que se contemplan incluyen pasteles, comidas para preparación en microondas, aperitivos salados, salchichas, empanadas, hamburguesas, productos para untar y paté, polvo seco (por ejemplo para sopas).

El producto con textura puede tener forma de pellets o gránulos, y éstos también pueden secarse o congelarse. Pueden adaptarse para deshidratación antes de su consumo. Estos productos pueden incluirse en sopas o salsas. El producto (por ejemplo pellets o gránulos) puede incluirse en hamburguesas o salchichas con un aglutinante (por ejemplo comestible). La solicitud de patente Internacional nº. PCT/EP99/02795 presentada el 26 de Abril de 1999 en nombre de Gist-brocades B.V. describe un proceso apropiado de preparación de salchichas así como una máquina para hacer salchichas.

Por tanto, un proceso particularmente preferido del presente invento puede comprender:

1.

fermentar células fúngicas del orden Mucorales, por ejemplo en un líquido acuoso contenido en un recipiente de fermentación, comprendiendo el líquido fuentes de carbono y nitrógeno asimilable. El líquido y las células pueden mezclarse y/o airearse durante la fermentación y, si fuese necesario, puede llevarse a cabo un proceso para eliminar las pellets.

2.

eliminar opcionalmente el agua, por ejemplo eliminar el líquido, o el agua, del líquido acuoso, preferiblemente utilizando técnicas mecánicas tal como filtración, centrifugación (por ejemplo una o dos), sedimentación y/o secado;

3.

reducir el contenido de RNA de las células fúngicas, por ejemplo mediante tratamiento(s) físico, químico y/o enzimático, pero preferiblemente mediante tratamiento térmico por ejemplo de 60 a 75ºC durante 25 a 35 minutos;

4.

tratar térmicamente, pasteurizar o matar las células o en caso contrario (por ejemplo químicamente) inactivar las proteínas no deseadas o las enzimas del interior de las células fúngicas;

5.

opcionalmente, eliminar el agua (por ejemplo si no se ha hecho en la etapa 2), de forma que se proporcione la sustancia comestible (por ejemplo proteínica);

6.

añadir uno o más componentes comestibles a las células fúngicas (o a la sustancia comestible);

7.

texturizar las células fúngicas (bien antes (por ejemplo molienda o desmenuzado) o después (por ejemplo amasado o extrusión) de la adición del componente comestible en la etapa 6), por ejemplo utilizando el procesado mecánico;

8.

someter a las células fúngicas a tratamientos físicos tal como calentamiento (por ejemplo cocción, vaporización, fritura) y/o congelación, o en caso contrario eliminar el agua;

9.

opcionalmente antes o después de la etapa 8, conferir forma y/o en caso contrario procesar mecánicamente (si fuese necesario) para dar un producto texturizado; y

10.

incluir o procesar el producto comestible en un producto alimenticio o complementar un producto alimenticio con el producto.

El producto alimenticio puede comprender un producto comestible texturizado bien del cuarto aspecto o susceptible de preparación mediante un proceso del tercer aspecto. Como cabe esperar, el producto alimenticio puede contener, además de las células fúngicas, uno o más ingredientes o componentes comestibles adicionales o ingredientes. Éstas pueden ser las mismas que las descritas anteriormente con relación al producto proteínico.

El producto texturizado puede incluirse en el producto alimenticio como tal, en otras palabras puede ser utilizado simplemente para complementar un producto alimenticio ya existente o puede utilizarse en la preparación de un producto alimenticio. Puede calentarse primero para generar mejor sabor o para dorar el producto.

Productos alimenticios preferidos incluyen comidas fáciles de preparar o ya preparadas, o comidas para preparación en microondas, hamburguesas, pasteles, empanadas, salchichas y sopas. El producto puede utilizarse como sustituto de carnes tales como cerdo, ternera, aves de corral, caza, jamón, ternero o incluso pescado.

Por supuesto, los productos alimenticios están destinados para consumo humano, aunque también se contemplan productos alimenticios para animales, en particular mascotas (tales como perros y gatos), tal como productos alimenticios enlatados, o para animales de granja (cerdos, vacas, ovejas, etc).

Pueden incluirse otros alimentos como componentes o ingredientes, por ejemplo arroz y pasta.

Las características y propiedades preferidas de un aspecto del invento son aplicables a otro aspecto con los cambios necesarios.

A continuación se describirá el invento, a modo de ejemplo, haciendo referencia a los Ejemplos adjuntos, que se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no se consideran como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo comparativo 1

Selección de los microorganismos apropiados

Es preciso que el microorganismo sea de calidad alimenticia y que la sustancia contenga proteínas ``de valor''. Preferiblemente, deben estar presentes los nutrientes esenciales como en la carne. Las morfología/estructura de la biomasa tiene que ser apropiada para producir un producto enriquecido con micro-proteínas con un ``bocado'' y una sensación organoléptica propia de productos similares a la carne.

Los Ejemplos demuestran que es posible preparar alimentos fúngicos a partir de hongos Mucorales y que, dentro del orden Mucorales, se prefieren las familias más ``primitivas''.

Las ventajas de los hongos Mucorales incluyen:

1.

escasa o nula producción de micotoxinas;

2.

producción simple y barata de biomasa; buena proliferación hacia concentraciones elevadas en medios transparentes (formados por sales, una fuente de N compleja bien definida y glucosa u oligosacáridos);

3.

son aceptables los procedimientos de procesado aguas-abajo para los productos alimenticios; y

4.

buena calidad del producto final.

Experimentos en matraz

En los experimentos en matraz, se realizaron ensayos con varias cepas celulares de Choanephoraceae, Mucoraceae y Mortierellaceae de las familias Mucorales, para comprobar su proliferación celular en medios simples y transparentes.

Se ensayó la proliferación en diferentes medios que incluían los dos medios semi-definidos:

Compuesto	Concentración
Extracto de levadura o peptona	5 g/kg
Glucosa	30 g/kg
Fosfato de potasio	0,10 M
Sulfato de amonio	0,1 M
Sulfato de magnesio	1,25 mM
Sulfato de cinc	0,03 mM
Sulfato de manganeso	0,2 mM
Cloruro de hierro	0,09 mM
Sulfato de cobre	0,03 mM

Los componentes se disolvieron en agua desionizada, y se esterilizaron durante 20 minutos a 120ºC: la glucosa se esterilizó por separado. El pH después de la esterilización fue de 6,0.

Los experimentos se llevaron a cabo en matraces erlenmeyer (100/500 ml). La inoculación tuvo lugar con una suspensión de esporas preparada recientemente haciendo proliferar las cepas durante varios días sobre una superficie de agar de malta, lavando las esporas de la superficie y almacenándolas en un congelador. Los erlenmeyer se incubaron entre 25 y 35ºC durante 2 a 4 días en un agitador orbital (con un recorrido de 2,5 cm a 250 rpm).

Se ensayaron las siguientes cepas:

Especies	familia	fuente
Blakeslea trispora	Choanephoraceae	CBS 130.59
Gilbertella persicaria	Choanephoraceae	CBS 247.59
Absidia pseudocylindrospora	Mucoraceae	CBS 100.2
Phycomyces blakesleeanus	Mucoraceae	CBS 226.92,
		NRRL 1555
Rhizopus oryzae*	Mucoraceae	Propia cepa clínica*
Mucor hiemalis	Mucoraceae	CBS 242.35
Rhizomucor miebei*	Mucoraceae	Propia cepa clínica*
Mucor rouxii	Mucoraceae	CBS 416.77
Mortierella alpina*	Mortierellaceae	Propia cepa clínica*

* Las cepas están disponibles a nivel comercial, por ejemplo a partir de CBS (Central Bureau loor Schimmelcultures, Delft, The Netherlands).

Todas las cepas proliferaron bien durante varios días, normalmente en forma mezclada a partir tanto del micelio filamentoso como de pellets. En todos los casos se pudo obtener al menos 5 g de biomasa/litro de caldo durante el curso de la incubación, medidos filtrando la biomasa y pesándola tras secado durante 24 horas a 105ºC sobre un papel de filtro pre-pesado. Se comprobó la presencia de pellets de manera visual.

Ejemplo comparativo 2

Experimentos con el fermentador

Como parte del proceso a escala, todas las cepas del Ejemplo 1 se sometieron a experimentos de fermentador a escala de laboratorio. El objetivo era ensayar su proliferación en medios simples, proliferación hacia una concentración elevada de biomasa que permita una proliferación y unos procedimientos de escala posteriores adecuados para la inclusión en un producto alimenticio.

La configuración experimental fue la siguiente, comenzando por la preparación del inóculo.

Se preparó la suspensión de esporas como se ha descrito en el Ejemplo anterior. Con esta suspensión de esporas se inició un cultivo de inóculo, empleando un medio basado en harina de semilla de soja para facilitar el crecimiento de las hifas (harina de soja 15 g/kg, extracto de levadura 5 g/kg, K_{2}HPO_{4} 1g/kg glucosa. H_{2}O 20g/kg). El medio se esterilizó durante 45 minutos a 120ºC en matraces erlenmeyer a pH 6. Tan pronto como se alcanzó la proliferación total, el cultivo fue transferido a un fermentador de laboratorio, que contenía un medio que se preparó empleando los siguientes componentes:

Componente	Concentración (g/kg)
Extracto de levadura	1
Glucosa	20
Sulfato de amonio	6
Sulfato de magnesio \cdot 7 H_{2}O	2
Cloruro de calcio	0,5
Monofosfato de potasio	3
Sulfato de cinc \cdot 7 H_{2}O	0,0144
Sulfato de hierro \cdot 7 H_{2}O	0,15
Sulfato de manganeso \cdot 1 H_{2}O	0,0228
Sulfato de cobre \cdot 5 H_{2}O	0,0024
Sulfato de cobalto \cdot 7 H_{2}O	0,0038
Tiamina HCl	0,004
Ácido nicotínico	0,002

Todos los compuestos se disolvieron en agua desionizada y se mezclaron, excepto la glucosa y el fosfato que se prepararon por separado. El pH se ajustó a 6,0 ó 4,5 empleando NaOH, y el medio se esterilizó en el fermentador durante 45 minutos a 121ºC en un autoclave. Tras una esterilización durante 20 minutos a 120ºC, se añadieron la disolución de glucosa y la disolución de fosfato, la primera tras acidificar a pH 5 con ácido fosfórico.

Después del medio de partida se proporcionó un producto alimenticio de hidratos de carbono que consistió en glucosa a una concentración de 500 g/kg. La preparación fue la descrita para la disolución de glucosa del medio de partida.

El fermentador estaba equipado con controles de temperatura, pH y espuma. Para ajustar el pH, se utilizaron disoluciones de amoníaco y ácido sulfúrico. Se midieron la concentración de oxígeno disuelto y la composición del gas liberado. El cultivo se aireó empleando 1 volumen de aire por cada volumen de caldo por minuto. Se mezcló intensamente utilizando turbinas Rushton y deflectores. El producto alimenticio de glucosa se aplicó con un caudal entre 1 y 5 g de glucosa/kg de caldo/hora y comenzó cuando la concentración de glucosa en el caldo había disminuido hasta una concentración inferior a 5 g/kg.

Se tomaron 2 muestras cada 24 horas para el análisis por separado de las concentraciones de sustrato no utilizado, biomas y sub-productos. También se llevó a cabo el examen microscópico.

Se escogieron las siguientes cepas, ensayadas de este modo en matraces para los experimentos en fermentadores a escala de laboratorio:

Rhizopus oryzae, Mortierella alpina, Blakeslea trispora, Gilbertella persicaria y Absidia pseudocylindrospora.

En todos los casos la biomasa se acumuló hasta concentraciones de 20 a 50 g/kg en 80 horas de cultivo.

De esta forma, todas las cepas mostraron capacidad para producir biomasa en un medio simple y a bajo coste cuando se sometió el proceso a escala.

Ejemplo comparativo 3

Análisis de morfología

De acuerdo con los procedimientos dados en el Ejemplo 1, se cultivaron varios microorganismos en matraces de agitación. Se examinó la morfología de la biomas por métodos microscópicos de luz. La Tabla 1 muestra las características encontradas. La morfología de los organismos Mucorales fue diferente a la de las especies Fusarium.

TABLA 1

Cepa	Ramificada
Fusarium graminearum (ahora
reclasificada como F. venenatum, IMI	No
145425)
Mortierella alpina	Si
Gilbertella persicaria	Si
Rhizopus oryzae	Si
Absidia pseudocylindrospora	Si

Ejemplos 4 y 5 y Ejemplos comparativo 6

Fermentación a escala de laboratorio y análisis de biomasa

En el Ejemplo 4, se utilizaron fermentadores a escala de laboratorio para cultivar tres microorganismos (Absidia pseudocylindropora, Gilbertella persicaria y Mortierella alpina) de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 y se emplearon las mismas condiciones para cultivar Fusarium venenatum (Ejemplo comparativo 6).

En el Ejemplo 5, se cultivó Rhizopus oryzae en un a escala de producción (para más detalles véase Ejemplo 8: se utilizó una parte del caldo para el análisis siguiente).

Con el fin de preparar primero una torta de filtración de biomasa, se empleó el siguiente procedimiento de recuperación:

\bullet centrifugación y lavado de la biomasa (para eliminar los componentes del medio en exceso como la glucosa);

\bullet tratamiento térmico a 65ºC para reducir la actividad enzimática y para reducir el RNA;

\bullet tratamiento térmico a 90ºC para pasteurizar el caldo;

\bullet filtración sobre filtros prensa de laboratorio, incluyendo lavado con agua del grifo; y

\bullet envasado y almacenamiento.

Centrifugación. Se centrifugaron porciones de 1 litro de biomasa en un centrifugador Beckmann (tipo J-6M/E) durante 5 minutos a 5000 rpm. Se decantó el sobrenadante y se descartó. La bolita se re-suspendió en agua del grifo y se re-centrifugó. De nuevo se decantó el sobrenadante. La bolita lavada se re-suspendió en agua del grifo.

Tratamiento térmico (reducción del RNA): se calentó el caldo a 65ºC y se mantuvo a esta temperatura durante 30 minutos.

Tratamiento térmico (para matar las enzimas): después de calentó el caldo a 90ºC y se mantuvo a esta temperatura durante 30 minutos.

Filtración: el caldo caliente se filtró en un filtro prensa de 2 litros (de tipo Seitz Enzinger Noll, Alemania) equipado con un paño filtrante de polipropileno a una presión inicial de 50 KPa (0,5 bares).

La torta resultante se lavó con volúmenes de agua del grifo. Después de lavar la torta se secó con aire a 200 KPa (2 bares) durante 5 minutos. Se recogió la torta para posterior tratamiento. Se analizaron la materia seca, el RNA, las proteínas brutas (Kjeldahl-N) y las grasas de la torta. Las Tablas 2 y 3 muestran los datos resultantes del análisis.

TABLA 2

Ejemplo	Cepa	Volumen	Torta	Materia	Proteínas	Grasas	RNA
		inicial	total	seca de	(Nx6,25)%	(%)	(g/Kg)
		(ml)	(g)	la torta (%)
4	Mortierella alpina	3250	282	26	13,0	4,46	2,85
4	Gilbertella persicaria	3700	1135	15,3	5,3	2,54	0,77
4	Absidia	3400	284	20,6	9,9	3,44	4,45
	pseudocylindrospora
4	Gilbertella persicaria	2940	349	16,5	7,2	2,07	3,68
5	Rhizopus orzyae	10000	682	16,1	6,9	1,95	4,82
6 (comp)	Fusarium graminearum	3500	552	24,6	16,1	2,12	13,1

TABLA 3 (calculado en materia seca)

Ejemplo	Cepa	Proteínas	Grasas	RNA
		(% peso/peso)	(% peso/peso)	(% peso/peso)
4	Mortierella alpina	50,0	17,1	1,1
4	Gilbertella persicaria	34,6	16,6	0,50
4	Absidia	48,1	16,7	2,1
	pseudocylindrospora
4	Gilbertella persicaria	43,6	12,5	2,2
5	Rhizopus orzyae	43,3	12,2	0,3
6 (comp)	Fusarium graminearum	65,5	8,6	5,3

Ejemplo 7 Producción en planta piloto

Se sometieron a escala las fermentaciones de la cepa Rhizopus orzyae utilizadas en el Ejemplo 2 en un fermentador de planta piloto con un volumen de trabajo de 3 m^{3} a partir de las condiciones descritas en el Ejemplo 4. Tras la fermentación, se enfrió el caldo a 5-10ºC y se recolectó.

Se centrifugó una parte del caldo (100 litros) en un separador de discos Westfalia NA7 tras diluir con agua del grifo hasta 500 litros. La centrifugadora estaba equipada con 4 boquillas de pulverización de 1 mm de diámetro cada una. Se obtuvieron dos corrientes de líquidos. Se descartó el sobrenadante (400 litros) y se retuvo una corriente de concentrado que contenía la biomas (células fúngicas). Se diluyó el concentrado al volumen original con una disolución de K_{2}HPO_{4} 100 mM.

La mezcla se re-centrifugó y se descartó el sobrenadante.

A continuación, la biomas concentrada y lavada se calentó a 65ºC durante 30 minutos. Después se calentó la biomasa concentrada a 90-95ºC y se mantuvo a esa temperatura durante 30 minutos.

Parte del caldo resultante (1,35 m^{3}) se filtró en un filtro prensa de membrana Schule con un área de filtración de 6 m^{2} y a una presión de 30-200 KPa (0,3-2 bares). La torta de filtro obtenida se lavó con agua del grifo (5- 10ºC). Se escurrió la torta de filtro mediante membranas a una presión de 600 KPa (6 bares). Esto dio como resultado 73 kg de torta de filtro con un contenido de materia seca de 24,8%.

Ejemplo 8A

Preparación de la biomasa comestible

Se llevaron a cabo tres fermentaciones de producción de la cepa de Rhizopus oryzae utilizada en el Ejemplo 2 en un fermentador de producción estándar con un volumen de trabajo de 30 m^{3}. El fermentador contaba con control de pH, una turbina Rushton de velocidad ajustable, aporte de aire, control de espuma y control de temperatura. Durante la recogida se mataron los microorganismos producidos y el contenido de RNA se redujo calentando la biomasa a 50-55ºC con vapor directo en presencia de 1g/l de ácido benzoico a pH 4,5-5,0. Tras alcanzar los 50-55ºC, el caldo se enfrió por debajo de 20ºC. Se transfirió el caldo a otro recipiente, se diluyó con agua del grifo fría y a continuación se enfrió a 4-6ºC. Posteriormente, el caldo frío se filtró en filtro prensa de membrana Schenk con un volumen de torta de trabajo de 2,5 m^{3} y se lavó la torta con 20 m^{3} de agua del grifo fría. La torta se escurrió aplicando agua a presión en un sistema de membrana (400 a 900 Kpa (4-9 bares)). Se retiró la torta del filtro prensa y parte de ella se desmenuzó, se empaquetó en bolsas y se congeló en frío a una temperatura entre -15 y -20ºC. Parte de la biomasa congelada se cortó en partículas que tenían un tamaño entre 1 y 3 mm y se tomaron dos o tres muestras de cada una de las tres fermentaciones para realizar el siguiente análisis (Tabla 4).

TABLA 4

		Presión de		% de materia
Fermentación Nº	Muestra Nº	escurrido	Torta total (kg)	seca
		(Kpa)*		(peso/peso)
1	1	900 (9)	362	50-55
1	2	900 (9)	383	50-55
2	1	400 (4)	385	45-50
2	2	400 (4)	404	42-46
2	3	400 (4)	437	42-46
3	1	400 (4)	449	42-46
3	2	400 (4)	392	36-40
* Entre paréntesis se proporcionan los valores en bares.

Posteriormente, se analizaron las muestras químicamente (RNA, proteínas brutas (como Kjeldahl-N), grasas, micotoxinas y otros componentes) con los siguientes resultados (Tabla 5).

TABLA 5

Fermentación Nº - Muestra Nº
	1-1	1-2	2-2	2-3	3-1
Materia seca (%)	52,1	52,1	42,5	42,9	41,1
Ceniza (%)	1,6	1,6	1,3	1,1	1,8
Fibras brutas totales (%)	30,1	30,1	27,4	27,5	27,0
Proteína (como Nx6,25) (%)	43,2	43,2	39,7	40,1	43,3
Grasas totales (%)	12,7	12,7	16,8	16,8	12,2
RNA (mg/kg)	4222	nd	1132	nd	2518
RNA (%)	0,4	nd	0,1	nd	0,3
Hidratos de carbono	12,5	12,5	14,9	14,5	15,8
% calculado de aminoácidos	26,11	nd	23,90	nd	25,13
totales
% calculado de grasas totales	11,9	nd	15,7	nd	11,5
Micotoxina (\mug/kg)
Aflatoxina B1	< 2,0	< 2,1	< 2,3	< 2,3	< 2,4
Aflatoxina B2	< 2,0	< 2,1	< 2,3	< 2,3	< 2,4
Aflatoxina G1	< 2,0	< 2,1	< 2,3	< 2,3	< 2,4
Aflatoxina G2	< 2,0	< 2,1	< 2,3	< 2,3	> 2,4
Ocratoxina A	< 2,0	< 2,1	< 2,3	< 2,3	< 2,4
Toxina T2	< 200	< 210	< 230	< 230	< 240
Zearaleona	< 20	< 2,1	< 23	< 23	< 24
[nd = no realizado]

Composición de aminoácidos

TABLA 6

Fermentación Nº - Muestra Nº
Aminoácidos (%)	1-1	2-2	3-1
Metionina	0,56	0,52	0,54
Lisina	1,92	2,06	2,07
Cisteina	0,44	0,35	0,36
Asparagina (ácido)	2,99	2,55	2,51
Treonina	1,52	1,39	1,44

TABLA 6 (continuación)

Fermentación Nº - Muestra Nº
Aminoácidos (%)	1-1	2-2	3-1
Leucina	2,15	2,10	2,17
Isoleucina	1,38	1,42	1,44
Serina	1,50	1,25	1,31
Glutamina	3,20	2,69	2,87
Glicina	1,25	1,13	1,24
Alanina	1,55	1,49	1,65
Valina	1,67	1,75	1,70
Tirosina	1,13	1,06	1,12
Fenilalanina	1,34	1,23	1,36
Histidina	0,67	0,61	0,68
Arginina	1,36	1,04	1,14
Prolina	1,04	0,83	0,97
Triptófano	0,44	0,43	0,46

Ejemplo 8B

Biomasa seca

Se secó la biomasa cortada en forma de partículas restante del Ejemplo 8A en porciones de 30-50 kg en un desecador de lecho fluido Aeromatic T4 con un área de placa de base de 0,26 m^{2}, por medio de aire a una temperatura de

\hbox{55-65ºC}

. El secado concluyó a una temperatura de lecho de 38-40ºC. Las muestras de biomasa seca presentaron los siguientes contenidos de materia seca (Tabla 8). TABLA 7

Fermentación Nº	Muestra Nº	Contenido de materia seca (%)
2	2	93,2
3	1	95,5

Ejemplos 9A, 9B y 9C

Laminado, formación de capas y estiramiento

Se molió y desmenuzó la torta de filtración del Ejemplo 8A en porciones de aproximadamente 25 kg por medio de un mezclador de alto corte Lödige durante 5 minutos. Se añadió 1 kg de albúmina de huevo (Ejemplo 9A) a la torta desmenuzada y se amasó la mezcla. Se repitió el procedimiento con un poco de agua y especias, mezclándolas primero con la albúmina de huevo (Ejemplo 9B).

Mediante el equipo de estiramiento, se formaron láminas de 1 mm con la mezcla.

Las láminas se calentaron a 80ºC en un horno ventilado o túnel. Se formaron capas con las láminas, se enrollaron con la forma de un ``rollo suizo'' y se congeló el rollo a -20ºC empleando dióxido de carbono líquido.

Se repitió el mismo procedimiento sustituyendo la albúmina de huevo por 1 kg de pectina (Ejemplo 9C).

Ejemplos 10A a D

Hamburguesas

Se añadieron aditivos colorantes y productos para potenciar el sabor (especias, verduras y cebollas) a la biomasa de los Ejemplos 8A y 8B. A continuación, se homogeneizó la mezcla en un amasador y a partir de la mezcla homogeneizada se formaron hamburguesas, se pasteurizaron y se empaquetaron. Se repitieron ambos procedimientos mezclando primero la albúmina de huevo con agentes potenciadores del sabor.

Ejemplos 11A a D

Salchichas

Se añadieron aditivos colorantes, especias y verduras (cebollas) a la biomasa de los Ejemplos 8A y B. Se homogeneizó la mezcla en un amasador. Se extruyó la mezcla homogeneizada en un tubo continuo (con objeto de formar el interior de las salchichas) al tiempo que se produjo la co-extrusión de un material formador de piel (vegetal) utilizando un sistema continuo para preparar salchichas (Store). Se repitieron los dos procedimientos mezclando primero la albúmina de huevo con los aditivos colorantes y las especias.

Ejemplos 12A y B

Gránulos

Se molió y desmenuzó la torta de filtración del Ejemplo 8A en porciones de aproximadamente 25 kg mediante un mezclador de alto corte Lödige durante 5 minutos. Se añadió 1 kg de albúmina de huevo a la torta desmenuzada y se amasó la mezcla. Se extruyó la mezcla amasada con un dispositivo de extrusión de hélices con una hilera para estirar con orificios de 1 mm. La fracción extruida se transportó mediante una cinta y se secó en un desecador de lecho fluidizado (temperatura de aire de 50ºC) para formar gránulos. Para el Ejemplo 12B, se utilizó pectina en vez de albúmina en la misma cantidad.

Ejemplos 13A a D

Hamburguesas

Se mezcló un lote de 25 kg de la fracción extruida de cada uno de los Ejemplos 12A y B con 60 kg de agua del grifo. Se añadieron a esta mezcla los aditivos utilizados en el Ejemplo 10 (tanto con albúmina como sin ella), se amasó la mezcla y se formaron hamburguesas, se pasteurizaron, se empaquetaron y se congelaron.

Ejemplos 14A a D

Salchichas

Se mezcló un lote de 25 kg de la fracción extruida de cada uno de los Ejemplos 12A y B con 60 kg de agua del grifo. Se añadieron a esta mezcla los aditivos utilizados en el Ejemplo 11 (tanto con albúmina como sin ella) y se formaron salchichas a partir de la mezcla como se ha descrito en el Ejemplo 11.

Ejemplos 15A a B

Hamburguesas

Se añadieron aditivos colorantes y productos para potenciar el sabor (especias, verduras y cebollas) a 25 kg de biomasa de cada uno de los Ejemplos 8A y 8B. Se añadió 1 kg de fibras vegetales (fibras de celulosa con una longitud media de fibra de 300-1000 \mum) a la mezcla y se homogeneizó en un amasador. Se formaron hamburguesas a partir de la mezcla homogeneizada, se empaquetaron, se pasteurizaron y se congelaron.

Ejemplos 16A a B

Salchichas

Se añadieron aditivos colorantes, especias, verduras y cebollas a la biomasa (25 kg) de cada uno de los Ejemplos 8A y B. Se añadió 1 kg de fibras vegetales (fibras de celulosa de una longitud media de fibra de 300-1000 \mum) a la mezcla resultante y se homogeneizó en un amasador. Se extruyó la mezcla homogeneizada para formar salchichas mediante la co-extrusión con una piel vegetal como se ha descrito en el Ejemplo 11.

\newpage

Ejemplos 17A a B

Gránulos para sopas

Se molió y desmenuzó la torta de filtración de los Ejemplos 8A y B en porciones de aproximadamente 25 kg mediante un mezclador de alto corte Lödige durante 5 minutos. Se añadió una mezcla de 1 kg de albúmina de huevo y 1 kg de fibras vegetales (fibras de celulosa con un longitud media de fibra de 300-1000 \mum) a la mezcla desmenuzada. Se amasó la mezcla y a continuación se extruyó en un dispositivo de extrusión de hélices con una hilera para estirar con orificios de 1 mm. La fracción extruida se transportó con una cinta y se secó en un desecador de lecho fluidizado (temperatura de aire de 65 a 80ºC), para formar gránulos. A continuación, éstos se añadieron a una sopa y se secaron para formar sopa en polvo (que por rehidratación forma sopa).

Ejemplos 18A a B

Hamburguesas

Se mezcló un lote de 25 kg de la fracción extruida seca de los Ejemplos 17A y B con 60 kg de agua del grifo. Se añadieron a la mezcla los aditivos descritos en el Ejemplo 15, se amasó la mezcla y se utilizó para preparar hamburguesas como se ha descrito en el Ejemplo 15.

Ejemplos 19A a B

Salchichas

Se mezcló un lote de 25 kg de la fracción extruida seca de los Ejemplos 17A y B con 60 kg de agua del grifo. Se añadieron a la mezcla los ingredientes descritos en el Ejemplo 16, se amasó la mezcla y se utilizó para formar salchichas como se ha descrito en el Ejemplo 16.

Ejemplos 20 a 35 y Ejemplos Comparativos 36 a 38

Empanadas, salchichas y mini-hamburguesas

Se preparó una masa mezclando y cortando la biomasa preparada en los Ejemplos 4 y 5 en un procesador de alimentos a escala de laboratorio (Braun Combi de tipo 700). Se añadieron agua y diferentes ingredientes comestibles (en las cantidades dadas anteriormente) y se mezclaron con la biomasa en el procesador de alimentos. Se colocó la masa en moldes (empanadas o hamburguesas) o se utilizó para rellenar tripas (salchichas).

Se calentaron las masas con forma a 80ºC (temperatura interna de la masa) tanto por vaporización (empanadas), cocción en un baño de agua (salchichas) o fritura (mini-hamburguesas). A continuación se enfriaron los productos a 4-7ºC durante 2 horas y se mantuvieron durante 1 semana en un congelador a -20ºC.

Se prepararon las siguientes formulaciones de masa (los datos están en gramos).

TABLA 8

Ingrediente	Empanadas	Mini-hamburguesa	Salchicha
Biomasa (25% de peso seco, 75% de
agua)*	53	53	53
Agua*	35	35	35
Proteína de suero lácteo		2,0	2,0
Albúmina de huevo	6	2,0	2,0
Almidón de patata		1,0	0,5
Extracto de malta		0,5	0,2
Dextrosa		0,4	0,5
Aromatizante de ternera		1,0	0,5
Aromatizante de cerdo			0,5

TABLA 8 (continuación)

Ingrediente	Empanadas	Mini-hamburguesa	Salchicha
Aromatizantes (mezcla de pimienta negra,
nuez moscada, cilantro y ajo en polvo			0,5
Aceite de soja	4,55	4,55	5,3
Pectina		0,55
Aromatizante de pollo	1

*Nota: la cantidad de agua en la biomasa obtenida de las diferentes fermentaciones varió de tal forma que la relación de materia seca: agua se ajustó de forma que en todos los casos estuvieran presentes 13-14 g de biomasa seca y

\hbox{39-40 g}

de agua.

En algunos casos se añadió pectina extra:

Empanadas: Mortierella, 1,5 g por cada 101 g de masa;

Salchichas: Mortierella, 1,5 g por cada 101 g de masa; y

Hamburguesas: Mortierella, 2,5 g por cada 102 g de masa.

Se apreciaron varias propiedades físicas que se muestran en las Tablas 9 a 11. Se utilizaron los productos alimenticios de Rhizopus oryzae como valores de referencia (por eso los valores son cero) y se establecieron comparaciones para los otros productos alimenticios (+ significa más, - significa menos). En cuanto a la granulometría, + significa más granular (es decir menos fibroso).

Ejemplos 20 a 25

Empanadas TABLA 9

Biomasa	Color de la	Masa	Estructura:	Jugosidad	Firmeza
	Empanada		granulometría
Rhizopus oryzae	Crema/marrón claro	Firme	0	0	0
Mortierella alpina	Marrón claro	Húmeda	+ + +	+ +	- -
Absidia
Pseudocylindrospora	Gris oscuro	Húmeda	+ + +	+ +	- -
Gilbertella persicaria	Marrón claro	Firme	+ +	+	+
Gilbertella persicaria	Marrón claro	Firme	+ +	+	-

\newpage

Ejemplos 26 a 30

Salchichas TABLA 10

Biomasa	Color de la	Masa de	Estructura:	Jugosidad	Firmeza
	salchicha	la salchicha	granulometría
Rhizopus oryzae	Crema/marrón claro	Firme	0	0	0
Mortierella alpina	Marrón claro	Húmeda	+ + +	+ +	- - -
Absidia
Pseudocylindrospora	Gris oscuro	Húmeda	+ + +	+ +	- -
Gilbertella persicaria	Marrón claro	Firme	+	+	+
Gilbertella persicaria	Marrón claro	Firme	+	+	+

Ejemplos 31 a 35

Mini-hamburguesas TABLA 11

Biomasa	Color de la	Masa	Estructura:	Jugosidad	Firmeza
	mini-hamburguesa		granulometría
Rhizopus oryzae	Crema/marrón claro	Firme	0	0	0
Mortierella alpina	Marrón claro	Húmeda	+ + +	+ +	- -
Absidia
Pseudocylindrospora	Gris oscuro	Húmeda	+ + +	+ +	- -
Gilbertella persicaria	Marrón claro	Firme	+ +	+	+
Gilbertella persicaria	Marrón claro	Firme	+ +	+	-

Como resulta aparente, pueden prepararse diferentes productos alimenticios con distintas texturas utilizando distintos organismos del grupo Mucorales. A modo de comparación, se prepararon empanadas, salchichas y mini-hamburguesas (Ejemplos 36 a 38) utilizando la misma receta anterior pero empleando biomasa de Fusarium graminearum. Los tres productos fueron de color negro.

Claims (16)

1. Un procedimiento para la preparación de una sustancia proteínica comestible, apropiada para su utilización en un producto alimenticio, que comprende células fúngicas, comprendiendo dicho procedimiento:

a.

fermentar células fúngicas del orden Mucorales en un líquido acuoso contenido en un recipiente fermentador, comprendiendo el líquido una fuente de nitrógeno (N) asimilable y un fuente de carbono (C) asimilable, y mezclar el líquido y las células durante la fermentación;

b.

reducir el contenido de RNA de las células fúngicas por debajo de 4,0% en peso (%p);

c.

antes o después de (b), retirar al menos parte del agua de la mezcla de células fúngicas y líquido acuoso, y

d.

procesar las células fúngicas para obtener una sustancia comestible.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el líquido y el fermentador están desprovistos de un sustrato insoluble (para las células).

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que las células fúngicas constituyen al menos 60% de la sustancia proteínica (en base de materia seca) o las células fúngicas constituyen al menos 70% de la sustancia.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células fúngicas son del género Rhizopus o Gilbertella.

5. Una sustancia proteínica comestible, apropiada para ser utilizada en un producto alimenticio, que comprende células fúngicas del orden Mucorales que tienen un contenido de RNA inferior a 4,0% en peso.

6. Una sustancia comestible de acuerdo con la reivindicación 5, que puede producirse mediante un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Una sustancia comestible de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, que es biomasa o torta de filtración (opcionalmente molida y/o desmenuzada).

8. Un procedimiento para la preparación de un producto texturizado comestible, que comprende mezclar uno o más componente(s) comestibles con una sustancia proteínica comestible que comprende células fúngicas del orden Mucorales que tienen un contenido de RNA inferior a 4,0% y texturizar mecánicamente la mezcla.

9. Un procedimiento para la preparación de un producto texturizado comestible, que comprende mezclar uno o más componente(s) comestibles con una sustancia proteínica comestible que comprende células fúngicas del orden Mucorales que tienen un contenido de RNA inferior a 4,0% en peso y texturizar para formar un producto, en el que al menos el 5% son células fúngicas (en peso de materia seca).

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que la sustancia proteínica es según la reivindicación 5 ó 6 o se prepara mediante un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. Un producto texturizado comestible, apropiado para ser utilizado en un producto alimenticio, en el que al menos 40% en peso son células fúngicas del orden Mucorales (en peso de materia seca) que tienen un contenido de RNA inferior a 4,0%.

12. Un producto de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende pellets, gránulos, una lámina, o es un producto de extrusión, masa, rollo, pasta o trozo similar a la carne.

13. Un producto texturizado de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, que puede producirse mediante un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 10.

14. Un procedimiento para la preparación de un producto alimenticio que comprende formar un producto alimenticio, o incluir en un producto alimenticio ya existente, una sustancia comestible de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 7 o un producto texturizado de acuerdo con la reivindicación 11, 12 ó 13.

15. Un producto alimenticio que comprende bien una sustancia proteínica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o bien un producto comestible de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o se puede producir mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14.

\newpage

16. Un producto alimenticio de acuerdo con la reivindicación 15, que es una salchicha, empanada, hamburguesa, productos para untar, paté, pienso, comprimido, pastel, aperitivos salados o comida para preparar en el horno.