ES2198415T3 - El flk-1 es un receptor para el factor de crecimiento endotelial vascular. - Google Patents

El flk-1 es un receptor para el factor de crecimiento endotelial vascular.

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ES2198415T3
ES2198415T3 ES94900810T ES94900810T ES2198415T3 ES 2198415 T3 ES2198415 T3 ES 2198415T3 ES 94900810 T ES94900810 T ES 94900810T ES 94900810 T ES94900810 T ES 94900810T ES 2198415 T3 ES2198415 T3 ES 2198415T3
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cells
vegf
receptor
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Axel Ullrich
Werner Risau
Birgit Millauer
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Abstract

EL PRESENTE INVENTO SE REFIERE AL EMPLEO DE LIGANDOS PARA EL RECEPTOR FLK - 1 PARA LA MODULACION DE LA ANGIOGENESIS Y VASCULOGENESIS. EL INVENTO ESTA BASADO, EN PARTE, EN LA DEMOSTRACION DE QUE LA PRESENCIA DEL RECEPTOR DE QUINASA DE TIROSINA FLK - 1 ESTA ASOCIADO CON LAS CELULAS ENDOTELIALES Y LA IDENTIFICACION DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) COMO EL LIGANDO DE ALTA AFINIDAD DE FLK - 1. ESTOS RESULTADOS INDICAN UN MAYOR PAPEL DEL FLK - 1 EN EL SISTEMA DE TRANSMISION DURANTE LA VASCULOGENESIS Y ANGIOGENESIS. SE DESCRIBE LA INGENIERIA DE CELULAS HUESPED QUE PRESENTAN FLK - 1 Y LOS EMPLEOS DE FLK - 1 PRESENTE PARA EVALUAR Y PROTEGER MEDICAMENTOS Y ANALOGOS DE VEGF IMPLICADOS EN LA MODULACION DE FLK - 1 POR ACTIVIDADES ANTAGONISTAS O FAVORECEDORAS. EL INVENTO TAMBIEN SE REFIERE AL EMPLEO DE LIGANDOS FLK - 1, INCLUYENDO VEGF, ANTAGONISTAS Y FAVORECEDORES, EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES, INCLUYENDO EL CANCER, MODULANDO LA VASCULOGENESIS Y ANGIOGENESIS.

Description

El Flk-1 es un receptor para el factor de crecimiento endotelial vascular.
1. Introducción
La presente invención se refiere al uso de un vector recombinante que comprende una secuencia nucleótida codificadora del receptor Flk-1 con una mutación en el dominio citoplasmático de la quinasa, para la modulación de la angiogénesis y de la vasculogénesis. La invención se basa, en parte, en la demostración de que la expresión del receptor de la tirosina quinasa Flk-1 está asociada con las células endoteliales, y en la identificación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como ligando de gran afinidad del Flk-1. Estos resultados indican una función importante del Flk-1 en el sistema de señales durante la vasculogénesis y la angiogénesis. Se describe la ingeniería de las células huéspedes que expresan el Flk-1 y los usos del Flk-1 para evaluar y seleccionar medicamentos y análogos del VEGF implicados en la modulación del Flk-1 mediante actividades agonistas o antagonistas.
2. Antecedentes de la invención
Las tirosinas quinasas receptoras comprenden una gran familia de receptores transmembranales para los factores del crecimiento polipeptídicos con diversas actividades biológicas. La función intrínseca de la tirosina quinasa se activa por el enlace con el ligando, lo que produce la fosforilación del receptor y de múltiples substratos celulares, y posteriormente, una variedad de respuestas celulares (Ullrich A. y Schlessinger, J., 1990, Cell 61:203-212).
Un ADNc receptor de la tirosina quinasa denominado quinasa de hígado fetal 1 (Flk-1), fue donado a partir de poblaciones de células de ratón enriquecidas en células madre y progenitoras hematopoyéticas. Se sugirió la implicación del receptor en la renovación de la célula madre hematopoyética (Matthews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030). El análisis secuencial del clon del Flk-1 reveló una homología considerable con la subfamilia de las quinasas receptoras c-Kit y, en particular, con el producto genético Flt. Todos estos receptores tienen en común un dominio extracelular que contiene estructuras del tipo de la inmunoglobulina.
La formación y el crecimiento de vasos sanguíneos, llamadas vasculogénesis y angiogénesis respectivamente, tienen una función importante en una variedad de procedimientos fisiológicos como, por ejemplo, el desarrollo embrionario, la cicatrización de una herida, la regeneración de los órganos y los procesos de reproducción femeninos, tales como el desarrollo del folículo en el cuerpo lúteo durante la ovulación y el crecimiento de la placenta tras el embarazo. La angiogénesis descontrolada puede ser patológica, tal y como sucede en el crecimiento de tumores sólidos que dependen de la vascularización para su crecimiento.
La angiogénesis implica la proliferación, migración e infiltración de células endoteliales vasculares, y puede ser regulada por factores de crecimiento polipeptídicos. Se han identificado varios polipéptidos con actividad promotora del crecimiento de las células endoteliales in vitro. Algunos ejemplos son el factor de crecimiento fibroblástico ácido y básico, el factor de crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento placentario. Aunque se han caracterizado cuatro receptores diferentes para los diferentes miembros de la familia FGF (factor de crecimiento fibroblástico), hasta el momento no se ha observado que ninguno ellos se exprese en los vasos sanguíneos in vivo.
Mientras que los FGFs parecen ser mitógenos para una gran variedad de células diferentes, se ha publicado recientemente que el VEGF es un mitógeno específico de la célula endotelial (Ferrara, N. and Henzel, W.J. 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:851-858). Recientemente, se ha observado que el receptor de la tirosina de tipo fms, llamado flt, tiene afinidad con el VEGF (DeVries, C. et al. 1992, Science 255:989-991).
3. Resumen de la invención
La presente invención se refiere al uso de un vector recombinante que comprende una secuencia nucleótida codificadora de un receptor Flk-1 que presenta una mutación en el dominio citoplasmático de la quinasa, para la modulación de la angiogénesis y de la vasculogénesis. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el receptor de la tirosina quinasa Flk-1 se expresa en la superficie de las células endoteliales y en la identificación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como un ligando de Flk-1 de gran afinidad. El papel de la proliferación y la migración de células endoteliales durante la angiogénesis y la vasculogénesis indica una función importante del Flk-1 en estos procesos. La invención se describe mediante el ejemplo del Flk-1 murino, no obstante, se pueden aplicar los principios a otras especies, seres humanos incluidos.
La invención se refiere a sistemas de expresión diseñados para producir la proteína de Flk-1 y/o líneas celulares que expresan el receptor Flk-1, según la invención. Se puede emplear la expresión de la proteína soluble de Flk-1 recombinante para seleccionar las bibliotecas péptídicas de las moléculas que inhiben la interacción Flk-1/VEGF. Las líneas celulares creadas por ingeniería genética que expresan Flk-1 en su superficie pueden ser empleadas de forma ventajosa para seleccionar e identificar los agonistas y antagonistas de VEGF.
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4. Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Comparación de la secuencia de aminoácidos de Flk-1 con los RTK relacionados. Comparación de la secuencia de aminoácidos de Flk-1 con el KDR humano y el TKr-C de rata. Se compara una sección de la secuencia conocida de los tres receptores y sólo se muestran las diferencias con la secuencia de Flk-1.
Fig. 2. Análisis de "Northern Blof" de la expresión del gen Flk-1. (A) Expresión del ARN de Flk-1 en embriones de ratón de entre 9.5 días y 18.5 días. Se analizaron muestras (10 \mug) del ARN total de unos embriones de ratón enteros en cada pasillo. Las posiciones de los ARN ribosomales 28S y 18S está marcadas. (B) Expresión del ARNm del Flk-1 en un cerebro postnatal de 4 días y en el de un adulto, en comparación con los fragmentos capilares del cerebro postnatal de 4 días. Se colocó 1 \mug de ARN poli (A+) en cada pasillo. Se usaron 5' 2619 pares de bases (bp) del ADNc del Flk-1 como sonda. Se muestra la hibridación de control con una sonda de ADNc de GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) en el panel inferior.
Fig. 3. Abundante expresión genética de Flk-1 en tejidos embrionarios. Análisis de la hibridación in situ de la expresión de Flk-1 en un embrión de ratón de 14.5 días. (A) Iluminación del campo luminoso de una sección parasagital a través del embrión entero hibridizado con una sonda antisentido marcada con ^{35}S (52619 bp). (B) Iluminación del campo oscuro de la misma sección. (C) Hibridación de control de una sección adyacente con una sonda sentido. Abreviaturas: Ao. aorta; At, atrio; L, pulmón; Li, hígado; Ma, mandíbula; Mn, meninges; Ms, mesencéfalo; T, telecéfalo; V, ventrículo; Vt, vértebras.
Fig. 4. La expresión del ARN de Flk-1 en órganos embrionarios está restringida a células específicas. Expresión del ARN de Flk-1 en un embrión de ratón de 14.5 días con una amplificación superior. (A) La zona del corazón fue explorada con una sonda antisentido marcada con ^{35}S. (B) Una sección adyacente hibridizada con una sonda sentido. (C) Parte de la pared de la aorta mostrada en el nivel celular. La capa de células endoteliales se indica con una flecha. (D) El pulmón, explorado con la sonda antisentido del Flk-1. (E) Hibridación de control de una sección adyacente hibridizada con la sonda sentido. Abreviaturas: At, atrio; B, bronquio; Ed, capa celular endotelial; En, endocardio; L, pulmón, Li, hígado; Lu, lúmina de la aorta; MI, muscular; My, miocardio.
Fig. 5. Expresión de genes de Flk-1 en un cerebro de ratón en desarrollo. Análisis de la hibridación in situ de la expresión de genes de Flk-1 en el cerebro en las distintas fases del desarrollo. Todas las secciones fueron exploradas con la sonda antisentido de Flk-1. (A) Sección sagital del telencéfalo de un embrión de ratón de 11.5 días. Un único vaso sanguíneo que expresa el Flk-1, el cual brota de las meninges en el neuroectodermo, es indicado por una flecha. (B) Secciones sagitales del cerebro del embrión a los 14.5 días y (C) de uno postnatal de 4 días. Se indican con una flecha regiones del mesencéfalo. Se indican los capilares ramificados y los vasos sanguíneos que expresan el Flk-1. (D) Sección sagital de un cerebro adulto; se muestra una región del mesencéfalo. Las células que expresan el Flk-1 están indicadas por una flecha. Abreviaturas: M, meninges; V, ventrículo;
Fig. 6. Expresión de Flk-1 en el plexo coroideo de un cerebro adulto. (A) Iluminación del campo oscuro del plexo coroideo del cerebro de un ratón adulto hibridizado con una sonda antisentido de Flk-1. (B) Plexo coroideo mostrado con mayor amplificación. Las flechas indican células individuales, las cuales muestran una fuerte expresión de Flk-1. Abreviaturas: CP, plexo coroideo; E, ependimo; Ep, células epiteliales; V, ventrículo.
Fig. 7. Flk-1 expresado en los glomérulos renales. (A) Sección parasagital de un riñón posnatal de 4 días hibridado con la sonda antisentido de Flk-1. La señal de hibridación se acumula en los glomérulos, tal y como indican las flechas. (B) Hibridación de control de una sección adyacente con la sonda sentido. (C) Sección sagital de un riñón adulto sondada con Flk-1. Las flechas señalan los glomérulos. (D) Glomérulo de un riñón adulto con una amplificación mayor. Las flechas en (A) y (D) indican células alineadas en cadenas en la región yuxtaglomerular que expresa el Flk-1.
Fig. 8. Análisis de la hibridación in situ de la expresión de Flk-1 en embriones tempranos y tejidos extraembrionarios. (A) Sección sagital de un embrión de ratón de 8.5 días en la decidua maternal examinada con Flk-1. (B) Mayor ampliación de la decidua. Las flechas indican el endotelio de los vasos sanguíneos maternos que expresan con más fuerza el ARN del Flk-1. (C) Gran ampliación del saco vitelino y del trofectodermo de un embrión de ratón de 9.5 días. (D) Gran ampliación del saco vitelino. Abreviaturas: A, alantoide; Bi, islote sanguíneo; Bv, vaso sanguíneo materno; D, decidua; En, capa endodérmica del saco vitelino; M, mesenquima; Ms, capa mesodérmica del saco vitelino; NF, pliegue neural; T, trofoblasto; Y, saco vitelino.
Fig. 9. El Flk-1 es un receptor de VEGF. (A) Un reticulado de ^{125}I-VEGF con células COS que expresan transitoriamente el receptor Flk-1 y unas células de control fueron incubados con ^{125}I-VEGF a 4°C durante la noche, luego se lavaron dos veces con suero salino tamponado con fosfato (PBS) y se expusieron a 0.5 mM del agente de reticulación DSS en PBS durante 1 hora a 4°C. Las células fueron lisadas, el receptor de Flk-1 inmunoprecipitado, y se realizó un análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida seguido de una autoradiografía. Los marcadores del tamaño molecular se indican en kilodaltones. (B) Enlace específico de ^{125}I-VEGF con células COS que expresan Flk-1. Se sacaron de la placa las células COS que expresaban transitoriamente Flk-1 y se volvieron a suspender en un medio de enlace (DMEM: Medio MEM modificado por Dulbeco, 25 mM Hepes, 0.15% gelatina). El enlace se llevó a cabo a 15°C durante 90 minutos en un volumen total de 0.5 ml conteniendo 2x10^{5} células, 15,000 cpm ^{125}I-VEGF, y las concentraciones indicadas de ligando no marcado. Se lavaron las células dos veces con PBS/0.1% BSA y se contaron en un contador gamma.
Fig. 10. Autofosforilación del Flk-1 inducida por VEGF. Las células COS que expresan transitoriamente el receptor Flk-1 y células de control fueron subalimentadas durante 24 horas en DMEM con un contenido del 0.5% de suero de ternero fetal y luego fueron estimuladas con VEGF durante 10 minutos, tal como se indica. Las células fueron solubilizadas, el receptor Flk-1 inmunoprecipitado con un anticuerpo policlonal contra su C-terminal, separado por electroforesis en gel de poliacrilamida, y transferido a nitrocelulosa. La transferencia fue examinada con anti-anticuerpos de fosfotirosina (5B2). Las bandas proteínicas fueron visualizadas usando un anticuerpo secundario acoplado a una peroxidasa de rábano y un ensayo de detección BCL™ (Amersham).
Fig. 11. Secuencia nucleótida de Flk-1 Murino.
Fig. 12. Mapas plásmidos de las construcciones del vector retrovírico. pLXSN Flk-1 TM Cl.1 y pLXSN Flk-1 TM cl.3 contienen aminoácidos Flk-1, de 1 a 806. pNTK-cfms-TM contiene los 541 aminoácidos N-terminales de c-fms.
Fig. 13. Inhibición del crecimiento tumoral del glioblastoma C6 por inhibición transdominante negativa de Flk-1. Las células C6 fueron implantadas solas o coimplantadas con células productoras de virus. El número de células es el indicado en cada panel. Se usaron dos líneas celulares productoras de virus diferentes: una que expresaba el mutante TM (transdominante negativo) de Flk-1 y una que expresaba un mutante c-fms transdominante negativo (c-fms TM) como control. Comenzando en el momento de aparición de los primeros tumores, se midieron los volúmenes tumorales cada 2 a 3 días para obtener una curva de crecimiento. Cada grupo está representado por cuatro ratones.
Fig. 14. Inhibición del crecimiento tumoral del glioblastoma C6 por inhibición transdominante negativa de Flk-1. Las células C6 fueron implantadas solas o coimplantadas con células productoras de virus. El número de células equivale al indicado en cada panel. Se usaron dos líneas celulares productoras de virus diferentes: una que expresaba el mutante TM (transdominante negativo) de Flk-1 y una que expresaba un mutante c-fms transdominante negativo (cfms TM) como control. Comenzando en el momento de aparición del primer tumor, se midieron los volúmenes tumorales cada 2 a 3 días para obtener una curva de crecimiento. Cada grupo está representado por cuatro ratones.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al uso de vectores recombinantes que contienen una secuencia nucleótida codificadora de un receptor Flk-1 que tiene una mutación en el dominio citoplasmático de la quinasa, para modular la angiogénesis y/o la vasculogénesis.
La invención, se basa, en parte, en los resultados de la hibridación in situ y de los análisis de Northern Blot que indican que el Flk-1 es una célula endotelial específica del RTK. Además, los experimentos de reticulación han mostrado que el Flk-1 es un receptor de gran afinidad para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), lo que indica que el Flk-1 tiene un papel crucial en el desarrollo y en la diferenciación del hemangioblasto y en el posterior crecimiento de la célula endotelial durante la vasculogénesis y la angiogénesis.
La invención está basada en el descubrimiento de que la expresión de una forma mutante transdominante negativa de la molécula de Flk-1 puede inhibir la actividad biológica del Flk-1 endógeno natural. Se describen aquí experimentos en los que se mezclaron células tumorales y células productoras de un retrovirus recombinante codificador de un receptor de Flk-1 truncado y se inyectó a ratones. Se observó la inhibición de la vasculogénesis y del crecimiento de las células tumorales inyectadas a los ratones que expresaban la forma truncada del receptor Flk-1. La expresión de las formas transdominantes negativas de la molécula de Flk-1 puede ser útil para el tratamiento de las enfermedades ocasionadas por la proliferación anormal de vasos sanguíneos, tales como: artritis reumatoide, retinopatías y el crecimiento de tumores sólidos.
Como se explica en los ejemplos de funcionamiento posteriores, se usó el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar las nuevas tirosinas quinasas receptoras expresadas específicamente en los embriones de post-implantación y en las células endoteliales. Se descubrió que este clon codificaba un RTK con una homología secuencial prácticamente idéntica al clon de ADNc previamente identificado aislado de poblaciones de células enriquecidas para células hematopoyéticas y denominado como kinasa- 1 de hígado fetal (Flk-1) (Mattews et al., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88:9026-9030) (Fig. 11).
Para mayor claridad de la explicación, la invención se describe en las subsecciones siguientes tomando como ejemplo el Flk-1 murino. No obstante, los principios se pueden aplicar análogamente para clonar y expresar el Flk-1 de otras especies, seres humanos incluidos.
5.1. Secuencia de codificación de Flk-1
La secuencia de codificación de nucleótidos y la secuencia deducida de aminoácidos del gen de Flk-1 murino se ilustran en la Figura 11 (sec. ID N°. 1) y ha sido descrita recientemente en Mattews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:9026-9030. De acuerdo con la invención, la secuencia nucleótida de la proteína de Flk-1 o su equivalente funcional en los mamíferos, incluidos los seres humanos, puede utilizarse para generar moléculas recombinantes que controlen la expresión del Flk-1; en adelante se hará referencia a este receptor como "Flk-1", siendo indiferente la especies de la cual proceda.
En una forma de realización específica aquí descrita, se aisló el gen de Flk-1 murino mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos grupos de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñados basándose en unas secuencias muy conservadas dentro del dominio de las tirosinas quinasas receptoras (Hanks et al., 1988). El ADN de una biblioteca de ADNc de \lambdagt10 preparado a partir de embriones de ratón de 8.5 días fue empleado como molde. En una realización paralela, se utilizaron unos cebadores similares para amplificar las secuencias de ADNc del RTK a partir de células capilares endoteliales aisladas de cerebros de ratones post-natales de 4-8 días. Se trata de un período en el que la proliferación de células endoteliales en el cerebro es máxima. Ambos tratamientos produjeron secuencias de ADNc que codificaban el RTK de hígado fetal anteriormente descrito, es decir, el Flk-1 (Mattews et al., 1991). Basándose en la homología del aminoácido, este receptor pertenece a la subclase de tipo III de los RTK (Ullrich y Schlessinger), los cuales contienen repeticiones del tipo de la inmunoglobulina en sus dominios extracelulares (Figura. 1).
La invención también se refiere a los genes de Flk-1 aislados de otras especies, incluyendo seres humanos, en las que se produce actividad Flk-1. Los miembros de la familia Flk-1 se definen aquí como receptores que se enlazan al VEGF o a fragmentos del péptido. Tales receptores pueden mostrar aproximadamente un 80% de homología en el nivel de los aminoácidos en longitudes sustanciales de la secuencia de ADN. Se puede seleccionar una biblioteca de ADNc bacteriófago, en condiciones de rigidez reducida, utilizando un fragmento marcado radioactivamente del clon del Flk-1 de ratón. De forma alternativa, la secuencia de Flk-1 de ratón puede utilizarse para diseñar las sondas oligonucleótidas degeneradas o completamente degeneradas que pueden utilizarse como sondas para la PCR o para seleccionar las bibliotecas de ADNc bacteriófago. Se puede utilizar una estrategia basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para clonar el Flk-1 humano. Dos grupos de oligonucleótidos degenerados correspondientes a motivos conservados entre el Flk-1 de ratón y las tirosinas quinasas receptoras pueden servir como cebadores de una reacción PCR. El molde para la reacción consiste en ADNc obtenido a partir de la transcripción inversa del ARNm preparada a partir de líneas celulares o de tejido que se sabe que expresan el Flk-1 humano. El producto de la PCR puede ser subclonado y secuenciado para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de Flk-1. Se puede utilizar el fragmento de PCR para aislar un clon de ADNc de Flk-1 de longitud total marcando radioactivamente el fragmento amplificado y seleccionando una biblioteca de ADNc bacteriófago. De forma alternativa, el fragmento marcado puede ser utilizado para seleccionar una biblioteca genómica. Para revisar las estrategias de clonación que pueden ser utilizadas, ver por ejemplo, Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
También se puede conseguir el aislamiento del ADNc de Flk-1 humano mediante la construcción de una biblioteca de ADNc en un vector de expresión de un mamífero, por ejemplo el pcADN1, que contiene un origen SV4O de secuencias de replicación que permiten una expresión de un número elevado de copias de plásmidos cuando se transfieren a las células COS. La expresión de Flk-1 en la superficie de las células COS modificadas puede detectarse de varias maneras, incluso con la utilización de un ligando marcado, como el VEGF o un agonista del VEGF marcado por radiomarcaje, con una marca fluorescente o con una enzima. Las células que expresan el Flk-1 humano pueden ser enriquecidas sometiendo las células modificadas a una separación FACS (separador de células activado por fluorescencia).
Según la invención, con el fin de generar moléculas de ADN recombinante en células huéspedes apropiadas, se pueden utilizar las secuencias nucleótidas de Flk-1 que codifican el Flk-1, los fragmentos péptidos de Flk-1, las proteínas de fusión de Flk-1 o los equivalentes funcionales de estas. De forma alternativa, también se pueden utilizar las secuencias nucleótidas que hibridan con partes de la secuencia de Flk-1 en ensayos de hibridación del ácido nucleico, el análisis de Southern y Northem Blot, etc.
Debido a la degeneración inherente del código genético, en la práctica de la invención se pueden utilizar otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente una secuencia de aminoácidos idéntica o funcionalmente equivalente, para la clonación y la expresión de la proteína de Flk-1. Estas secuencias de ADN incluyen aquellas que son capaces de hibridar la secuencia de Flk-1 murino en condiciones rigurosas.
Las secuencias alteradas de ADN que pueden ser usadas según la invención incluyen las eliminaciones, adiciones o sustituciones de residuos de nucleótidos diferentes que producen secuencias codificadoras de un producto genético idéntico o funcionalmente equivalente. El propio producto genético puede contener eliminaciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de Flk-1 que produzcan un cambio "silencioso" y por lo tanto un Flk-1 funcionalmente equivalente. Tales sustituciones de aminoácidos pueden realizarse basándose en la similitud de la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobia, la hidrofilia, y/o en la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo: los aminoácidos con carga negativa comprenden ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva comprenden lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga con unos valores similares de hidrofilia comprenden: leucina, isoleucina, valina; glicina, analina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Un Flk-1 funcionalmente equivalente, según se utiliza en este caso, se refiere a un receptor que se enlaza con el VEGP o con fragmentos, pero que no tiene necesariamente la misma afinidad de enlace que su Flk-1 nativo equivalente.
Las secuencias de ADN de la invención pueden ser modificadas por ingeniería genética con el objetivo de alterar la secuencia de codificación del Flk-1 para una variedad de fines que incluyen, pero sin descartar otros, alteraciones que modifican el tratamiento y la expresión del producto genético. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida, para introducir nuevos lugares de restricción, para alterar los modelos de glicosilación, fosforilación, etc. Por ejemplo, en determinados sistemas de expresión, como la levadura, las células huéspedes pueden glicosilar en exceso el producto genético. Cuando se usan tales sistemas de expresión sería preferible alterar la secuencia de codificación del Flk-1 para eliminar cualquier sitio de N-glicosilación.
En una forma de realización alternativa de la invención, la secuencia de codificación de Flk-1 podría ser sintetizada por completo o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Caruthers, et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea and Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10):2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; y Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817. De forma alternativa, la propia proteína podría ser producida mediante métodos químicos para sintetizar en parte o completamente la secuencia de aminoácidos de Flk-1. Por ejemplo, los péptidos pueden ser sintetizados mediante técnicas de fase sólida, desprendidos de la resina y purificados por cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa. (P. ej., Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principies, W.H Freeman and Co., N.Y. págs. 50-60). La composición de los péptidos sintéticos puede ser confirmada mediante el análisis de los aminoácidos o por secuenciación (p. ej., con el procedimiento de degradación de Edman; ver Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman and Co., N.Y., págs. 34-49.
5.2. Expresión del receptor Flk-1 y generación de líneas celulares que expresan Flk-1
Con el objetivo de expresar un Flk-1 biológicamente activo, la codificación de la secuencia nucleótida de Flk-1 o un equivalente funcional, tal y como se describe en la Sección 5.1 arriba mencionada, es insertada en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para transcribir y traducir la secuencia de codificación insertada. Los productos genéticos de Flk-1, así como las células huéspedes o las líneas celulares modificadas o transformadas con los vectores de expresión recombinantes de Flk-1 se pueden utilizar con una variedad de objetivos. Estos objetivos incluyen, aunque sin descartar otros, la generación de anticuerpos (es decir, monoclonales o policlonales) que se enlazan al receptor, incluyendo aquellos que inhiben competitivamente el enlace del VEGF y "neutralizan" la actividad de Flk-1, y la detección y selección de análogos del VEGF o de medicamentos que actúan a través del receptor Flk-1; etc.
5.2.1. Sistemas de expresión
Se pueden utilizar métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia de codificación de Flk-1 y las señales de control transcripcionales/traduccionales apropiadas. Estos métodos comprenden técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo / recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology: Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
Se pueden utilizar distintos sistemas de vectores de expresión de huéspedes para expresar la secuencia de codificación del Flk-1. Estos comprenden, aunque sin descartar otros, microorganismos tales como bacterias transformadas con ADN bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plásmido o de ADN cósmido que contienen la secuencia de codificación de Flk-1; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen la secuencia de codificación de Flk-1; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen la secuencia de codificación de Flk-1; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plásmidos recombinantes (p.ej. plásmido Ti) que contienen la secuencia de codificación de Flk-1; o sistemas de células animales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p.ej., adenovirus, virus vaccinia) incluyendo líneas celulares creadas por ingeniería genética para contener múltiples copias del ADN del Flk-1 amplificadas de forma estable (CHO/dhfr) o inestable en cromosomas "de doble minuto" (p.ej. líneas celulares murinas).
Los elementos de expresión de estos sistemas varían en resistencia y especificidad. Dependiendo del sistema huésped/vector empleado, se puede utilizar cualquiera de los elementos adecuados de transcripción y de traducción del vector de expresión, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando la clonación se realiza en sistemas bacterianos, se pueden emplear promotores inducibles como el pL de \lambda bacteriófago, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares; cuando la clonación se realiza en sistemas de células de insectos, se pueden emplear promotores como el promotor del la polihedrina del baculovirus; cuando la clonación se realiza en sistemas de células vegetales, se pueden emplear promotores derivados del genoma de las células vegetales (p. ej., promotores de choque térmico; el promotor para la subunidad pequeña de la RUBISCO; el promotor para la proteína de enlace de la clorofila a/b) o de virus vegetales (p. ej., el promotor de ARN 35S de CaMV; el promotor de la proteína de revestimiento TMV); cuando la clonación se realiza en sistemas de células mamíferas, se pueden emplear los promotores derivados del genoma de las células mamíferas (p.ej. el promotor de la metalotioneina) o de virus mamíferos (p. ej., el promotor tardío del adenovirus ; el promotor del virus vaccinia 7.5K); cuando se generan líneas celulares que contienen múltiples copias del ADN de Flk-1, se pueden utilizar los vectores con base SV4O, BPV y EBV con un marcador seleccionable apropiado.
En los sistemas bacterianos se pueden seleccionar varios vectores de expresión de forma ventajosa, dependiendo del uso que se pretenda para el Flk-1 expresado. Por ejemplo, cuando se deben producir grandes cantidades de Flk-1 para la generación de anticuerpos o para seleccionar bibliotecas peptídicas, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresión de niveles elevados de productos de proteínas de fusión que se purifican rápidamente. Tales vectores comprenden, aunque sin descartar otros, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el cual la secuencia de codificación de Flk-1 puede estar enlazada en el vector enmarcando la zona de codificación de lac Z de modo que se produce un híbrido de la proteína AS-lac Z; los vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares. También se pueden emplear los vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños, como las proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas a partir de células lisadas por adsorción a nódulos de glutationa-agarosa seguido de la elución en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir trombina o sitios de disociación de la proteasa de factor Xa de modo que el polipéptido clonado en cuestión pueda ser liberado de la región de GST.
En la levadura, se pueden utilizar varios vectores conteniendo promotores constitutivos o inducibles. Para una revisión ver, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988; Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzynology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; and Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II.
En los casos en los que se utilizan vectores de expresión vegetales, la expresión de la secuencia de codificación del Flk-1 puede ser controlada por cualquiera de un grupo de promotores. Por ejemplo, se pueden emplear promotores víricos tales como los promotores 35S ARN y 19S ARN de CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514), o el promotor de la proteína de revestimiento de TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307-311); de forma alternativa, se pueden emplear promotores vegetales como, por ejemplo, la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi et al., 1984; EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843); o promotores de choque térmico p.ej. , el hsp17.5-E o el hsp17.3-B de soja (Gurley et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Estas construcciones pueden ser introducidas en las células vegetales utilizando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisar tales técnicas ver, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, págs. 421-463; y Grierson & Corey, 1988: Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Cap. 7-9.
Un sistema de expresión alternativo para la expresión del Flk-1, es por ejemplo un sistema de insectos. En un sistema de este tipo, se emplea el virus de la polihidrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación de Flk-1 puede ser clonada en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y puesta bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina). Una inserción satisfactoria de la secuencia de codificación del Flk-1 provocará la inactivación del gen de la polihedrina y producirá un virus recombinante no ocluido (es decir, un virus carente de revestimiento proteínico codificado por el gen de la polihedrina). Estos virus recombinantes son usados después para infectar las células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado (Ver p. ej. Smith et al., 1983, J. Viol. 46:584; Smith, Patente U.S. N°. 4,215,051).
En las células huéspedes mamíferas, se pueden utilizar varios sistemas de expresión víricos. En los casos en los que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de codificación de Flk-1 puede unirse a un grupo de control de transcripción/traducción del adenovirus, como el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Luego, este gen quimérico se puede insertar en el genoma del adenovirus mediante una recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (p. ej., la región El o E3) producirá un virus recombinante capaz de expresar el Flk-1 en huéspedes infectados. Ver por ejemplo Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 81:3655-3659). De forma alternativa, se puede usar el promotor de la vaccinia 7.5K. (Ver, por ejemplo, Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Viral. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).
También se pueden precisar señales de iniciación específicas para una traducción eficaz de las secuencias de codificación de Flk-1 insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que el gen de Flk-1 completo, incluyendo su propio codón de inicio y sus secuencias adyacentes, es insertado en el vector de expresión apropiado, no será necesaria ninguna señal de control traduccional adicional. No obstante, en los casos donde sólo se inserta una parte de la secuencia de codificación de Flk-1, se deberán proporcionar señales de control traduccionales exógenas, incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar sincronizado con el marco de lectura de la secuencia de codificación del Flk-1 para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales exógenas de control traduccional y codones de iniciación pueden ser de muchos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede ser mejorada por la inclusión de elementos apropiados potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. (ver Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
Además, se puede elegir una cepa de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto genético en la forma específica deseada. Tales modificaciones (p. ej. la glicosilación) y tratamientos (p. ej. la disociación) de los productos proteínicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células huéspedes tienen características y mecanismos específicos para el tratamiento postraduccional y para la modificación de proteínas. Se pueden seleccionar líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados para asegurar la correcta modificación y tratamiento de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden utilizar células huéspedes eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el tratamiento apropiado de la transcripción primaria, la glicosilación y la fosforilación del producto genético. Tales células huéspedes mamíferas incluyen pero sin descartar otras, CHO, VERO, BHK, HeLa it, COS, MDCK, 293, W138, etc.
Para una producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, se pueden crear mediante ingeniería genética líneas celulares que expresen de manera estable el Flk-1. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células huéspedes se pueden transformar con el ADN de Flk-1 controlado por unos elementos apropiados de control de la expresión (p. ej., el promotor, un potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, lugares de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción de ADN extraño, se puede permitir que las células creadas por ingeniería genética se desarrollen durante 1-2 días en uno medio enriquecido, cambiándolas después a uno medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido con sus cromosomas y crezcan para formar unos focos que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Este método puede utilizarse de forma ventajosa para crear por ingeniería genética líneas celulares que expresen el Flk-1 en la superficie de la célula, y que respondan a la transducción de la señal mediada por el VEGF. Estas líneas celulares creadas por ingeniería genética son particularmente útiles para seleccionar análogos del VEGF.
Se pueden usar diferentes sistemas de selección incluyendo, pero sin descartar otros, la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), con la posibilidad de utilizar genes de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) y de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) en células tK{-}, hgprt{-} o aprt{-}, respectivamente. Además, se puede utilizar la resistencia a la antimetabolita como base para la selección del dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); del gpt que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); del neo que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); del hygro que confiere resistencia a los genes de higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147). Recientemente, se han descrito otros genes seleccionables, como el trpB que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; el hisD que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA :8047); y el ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa: 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DEMO (McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
5.2.2. Identificación de transfectantes o transformantes que expresan el Flk-1
Las células huéspedes que contienen la secuencia de codificación y que expresan el producto genético biológicamente activo pueden ser identificadas a través de al menos cuatro enfoques generales; (a) hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de las funciones del gen "marcador"; (c) evaluación del nivel de transcripción medido por la expresión de las transcripciones de ARNm de Flk-1 en la célula huésped; y (d) detección del producto genético medido por inmunoensayo o por su actividad biológica.
En el primer enfoque, la presencia de la secuencia de codificación del Flk-1 insertada en el vector de expresión se puede detectar por hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN mediante sondas que comprenden secuencias nucleótidas homólogas a la secuencia de codificación del Flk-1, respectivamente, o a partes o derivadas de las mismas.
En el segundo enfoque, el sistema de expresión huésped / vector recombinante puede ser identificado y seleccionado basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, la actividad de la timidina quinasa, la resistencia a los antibióticos, la resistencia al metotrexato, el fenotipo de transformación, la formación de un cuerpo de oclusión en el baculovirus, etc.). Por ejemplo, si la secuencia de codificación del Flk-1 se inserta dentro de una secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contengan la secuencia de codificación de Flk-1 podrán ser identificados por la ausencia de la función del gen marcador. De forma alternativa, un gen marcador se puede colocar a continuación de la secuencia de Flk-1 bajo el control del mismo promotor o de uno diferente empleado para controlar la expresión de la secuencia de codificación de Flk-1. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o a la selección indica la expresión de la secuencia de codificación del Flk-1.
En el tercer enfoque, la actividad transcripcional de la región de codificación del Flk-1 se puede evaluar mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, se puede aislar y analizar el ARN mediante la técnica de Northern Blot utilizando una sonda homóloga a la secuencia de codificación del Flk-1 o a algunas partes de la misma. De forma alternativa, los ácidos nucleicos totales de la célula huésped pueden ser extraídos y analizados por la hibridación con tales sondas.
En el cuarto enfoque, la expresión del producto proteínico del Flk-1 puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo mediante la técnica de Western Blot, por inmunoensayos tales como la radioinmunoprecipitación o los inmunoensayos enzimáticos y similares. La prueba definitiva del éxito del sistema de expresión, no obstante, implica la detección del producto genético de Flk-1 biológicamente activo. Se pueden emplear varios ensayos para detectar la actividad receptora entre los que se incluyen, pero sin descartar otros, ensayos del enlace del VEGF y ensayos biológicos del VEGF, utilizando líneas celulares creadas por ingeniería genética como substrato de la prueba.
5.3. Usos del receptor de Flk-1 y de las líneas celulares, creadas por ingeniería genética
La angiogénesis, es decir, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares, es necesaria para varios procesos fisiológicos que abarcan desde la cicatrización de una herida y la regeneración de órganos y tejidos, a la formación de la placenta tras el embarazo y el desarrollo embrionario. Una proliferación anormal de vasos sanguíneos es un aspecto importante de una variedad de enfermedades como la artritis reumatoide, las retinopatías y la psoriasis. La angiogénesis constituye también un factor importante en el crecimiento y en la actividad metastática de los tumores sólidos que dependen de la vascularización. En consecuencia, los inhibidores de la angiogénesis se usan terapéuticamente para el tratamiento de enfermedades ocasionadas o acompañadas de un crecimiento anormal de los vasos sanguíneos, y para el tratamientos de la malignidad que rodea al crecimiento y desarrollo de tumores sólidos.
5.4. Uso de los mutantes dominantes negativos del Flk-1 en la terapia génica
Se cree que la dimerización receptora inducida por ligandos proporciona una señal reguladora alostérica que sirve para juntar la unión de ligandos y la estimulación de la actividad de la quinasa. Los receptores defectuosos pueden funcionar como mutaciones dominantes negativas al suprimir la activación y la respuesta de los receptores normales mediante la formación de heterodímeros no productivos. En consecuencia, los receptores defectuosos pueden ser manipulados por ingeniería genética en vectores víricos recombinantes y usados en la terapia génica de individuos que expresa el Flk-1 de forma inadecuada.
En una forma de realización de la invención, las formas mutantes de la molécula del Flk-1 con efectos dominantes negativos se pueden identificar mediante la expresión en células seleccionadas. Los mutantes de deleción o sin sentido del Flk-1 que conservan la capacidad para formar dímeros con la proteína del Flk-1 de tipo salvaje, pero que no pueden funcionar en la transducción de señales, pueden ser usados para inhibir la actividad biológica del Flk-1 endógeno de tipo salvaje. Por ejemplo, se puede eliminar el dominio citoplasmático de la quinasa de Flk-1 lo que da como resultado una molécula de Flk-1 truncada que mantiene la capacidad de realizar la dimerización con receptores endógenos de tipo salvaje, pero que es incapaz de realizar la transducción de una señal.
La proliferación anormal de los vasos sanguíneos es un aspecto importante de muchos trastornos patógenos, tales como la artritis reumatoide, las retinopatías y la psoriasis. La angiogénesis descontrolada también representa un factor importante en el crecimiento y en la metástasis de tumores sólidos. Se pueden manipular virus recombinantes por ingeniería genética para expresar formas dominantes negativas del Flk-1, las cuales pueden ser empleadas para inhibir la actividad del Flk-1 endógeno de tipo salvaje. Estos virus se pueden emplear terapéuticamente para el tratamiento de enfermedades ocasionadas por una expresión o actividad aberrante del Flk-1.
Se pueden usar vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino, para depositar el Flk-1 recombinante en la población celular objetivo. Se pueden utilizar métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores víricos recombinantes que contengan una secuencia de codificación del Flk-1. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1989: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. De forma alternativa, se pueden reconstruir moléculas de Flk-1 recombinantes en los liposomas para el depósito en las células objetivo.
En una forma de realización específica de la invención, un mutante de deleción del receptor Flk-1 fue modificado por ingeniería genética en un vector retrovírico recombinante. Dos aislados clonales denominados pLXSN Flk-1 TM cl.1 y pLXSN Flk-1 TM cl.3 contienen un receptor de Flk-1 truncado carente de los aminoácidos terminales 561 COOH. Con el fin de obtener virus productores de líneas celulares, se modificaron las células PA37 con los vectores recombinantes y, posteriormente, se utilizaron medios acondicionados que contenían virus para infectar las células GPE.
Para comprobar si la expresión de los mutantes de señalización defectuosa inhiben la actividad receptora del Flk-1 endógeno, se mezclaron células de gliobastoma C6 de rata (células tumorales) y células de ratón productoras del retrovirus recombinante, y se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Normalmente, la inyección de células tumorales en ratones desnudos debería ocasionar la proliferación de células tumorales y la vascularización de la masa tumoral resultante. Puesto que se piensa que el Flk-1 es esencial para la formación de vasos sanguíneos, el bloqueo de la actividad del Flk-1 mediante la expresión de un receptor truncado podría funcionar para inhibir la vascularización del tumor en desarrollo e inhibir así su crecimiento. Tal y como se ilustra en las Figuras 13 y 14, la coinyección de virus productores de células, las cuales expresan un receptor truncado del Flk-1, inhibe de forma significativa el crecimiento del tumor en comparación con los controles que recibieron únicamente células tumorales.
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6. Ejemplo Clonación y modelos de expresión del flk-1 un receptor de gran afinidad para el VEGF
La siguiente subsección describe la clonación y la caracterización del clon del ADNc de Flk-1. El análisis de Northern Blot y la hibridación in sítu indican que el Flk-1 se expresa en las células endoteliales. Los experimentos de reticulación y de unión de ligandos indican además que el Flk-1 es un receptor de gran afinidad del VEGF
6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Clonación del ADNc de Flk-1
El ADN extraído de una biblioteca de ADNc de \lambdagt10 de embriones de ratones de 8.5 días (Fahrner et al., 1987, EMBO. J. 6: 1497-1508) se empleó como molde para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki, R.K. et al., 1985 Science 230:1350-1354). En una realización independiente, se empleó el ADNc de las células endoteliales capilares aisladas del cerebro de ratones posnatales de 4-8 días para la amplificación (Risau, W., 1990 In: development of the Vascular system. Issues Biomed. Basel Karger 58-68 and Schnürch et al., inédito). Los iniciadores degenerados fueron diseñados basándose en la gran homología de los aminoácidos dentro del dominio de la quinasa compartido por todos los RTK (Wilks, A.F, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 1603-1607).
Se aislaron clones de ADNc de longitud total del Flk-1 de otra biblioteca de ADNc de un embrión de ratón de 8.5 días, preparado según el método de Okaiama y Berg (1983) y de una biblioteca de \lambdagt11 de un embrión de ratón de 11.5 días (Clonetech) usando el fragmento de PCR de2l0bp marcado con ^{32}P (Feinberg, A.P. y Vogelstein, B. 1983 Anal. Biochen. 132:6-13).
6.1.2. Embriones de ratón
Se aparearon ratones balb/c durante la noche y la mañana en que se detectó el tapón vaginal se definió como el 1/2 día de gestación. Para el análisis por Northem Blot, los embriones congelados se homogeneizaron en 5 M de tiocianato de guanidinio y se aisló el ARN tal como se ha descrito (Ullrich, A. et al., 1985, Nature 313:756-761). Para la hibridación in situ, los embriones fueron empapados con Tissue-Tek (Miles), congelados en la superficie de nitrógeno líquido y almacenados a -70°C antes del uso.
6.1.3. Preparación de sondas
Los 2619 bp localizados en la posición 5' del ADNc del receptor fueron subclonados en el vector pGem3Z (Promega) como un fragmento EcoR1/BamH1. La sonda para la hibridación de Northern Blot fue preparada mediante la marcación del fragmento de ADNc con \alpha-^{32}PdATP (Amersham) mediante el cebado aleatorio de hexanucleótidos (Boehringer; Feinberg, A. P and Vogelstein, B., 1983 Anal. Biochem. 132:6-13).
Para la hibridación in situ, se preparó una sonda antisentido de ADN monocatenario, tal y como describen Schnürch y Risau (Development, 1991 111:1143-54). El plásmido fue linearizado en el extremo 3' del ADNc y se sintetizó una transcripción de sentido utilizando el ARN polimerasa SP6 (Boehringer). El ADN fue degradado mediante una ADNasa (preparación libre de la ARNasa, Boehringer Mannheim). Con la transcripción, se realizó una síntesis del ADNc cebado aleatoriamente con \alpha-^{35}S dATP (Amersham) mediante transcripción inversa con la transcriptasa inversa del MMLV (virus de la leucemia murina de Moloney) (BRL). Para obtener fragmentos pequeños de ADNc de aproximadamente 100 bp de media, adecuados para la hibridación in sítu, se utilizó el cebador en gran exceso. Posteriormente, la transcripción del ARN fue parcialmente hidrolizada en 100 mM de NaOH durante 20 minutos a 70°C, y la sonda fue neutralizada con la misma cantidad de HCl y purificada con una columna Sephadex C50. Tras la precipitación del etanol, la sonda fue disuelta con una actividad final específica de 5x10^{5} cpm. Para controlar la hibridación, se preparó una sonda sentido con el mismo método.
6.1.4. Extracción del ARN y análisis de Northern
Se aisló el ARN citoplásmico total según el método del fenol ácido de Chromczynski y Sacchi (1987). Las partes alícuotas del ARN Poli(A^{+}) fueron sometidas a electroforesis en geles 1.2% de formaldehido-agarosa (Sambrook, J. et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell). Se realizaron las hibridaciones durante una noche en un 50% de formamida, 5 x SSC (750mM de cloruro sódico, 75mM de citrato sódico), 5 x Denhardt's (0.1% de Ficoll 400, 0.1% de polivinilpirrolidona, 0.1% de BSA) y -0.5% de SDS a 42°C con 1-3x10^{6} cpm-ml-^{1} de una sonda de ADN cebada aleatoriamente con ^{32}P, seguido de lavados muy rigurosos en 0.2 x SSC, 0.5% de SDS a 52°C. Las filtros fueron expuestos durante un período de 4 a 8 días.
6.1.5. Hibridación in situ
La post-fijación y la hibridación de la subclonación se realizó esencialmente según Hogan et al. (1986). Se cortaron 10 \mum de secciones gruesas a una temperatura de -18°C en un criostato Leitz. Para el tratamiento de prehibridación no se realizó ninguna incubación con 0.2M de HCl para eliminar las proteínas básicas. Las secciones se incubaron con la sonda de ADNc ^{35}S (5x104cpm/ml) a 52°C en un tampón de formamida 50%, 300 mM de NuCI, 10 mM de tris-HCl, 10 mM de NaPO_{4}(pH 6.8), 5 mM de EDTA (ácido etilendiamino tetraacético), Ficoll 400 0.02%, polivinilprolidona 0.01%, BSA 0.02%, 10 m/ml de ARN de levadura, sulfato de dextrana 10%, y 10 mM de NaCI, 10 mM de tris-HCl, 10 mM de NaPO4 (pH 6.8), 5 mM de EDTA, 10 Mm de DTT (ditiotreitol) a 52°C. Para la autorradiografía, se cubrieron las láminas con una película de emulsión Kodak NTB2 y se expusieron durante ocho días. Después del desarrollo, se realizó una coloración de contraste con azul de toluidina o May-Grinwald.
6.1.6. Preparación de antisueros
Se subclonó el fragmento de EcoRV/Hindll cebado en 3' que comprendía 128 aminoácidos C-terminales de Flk-1 en el vector de expresión de la proteína de fusión pGEX3X (Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1990 Gen. 67:31-40; Pharmacia). La proteína de fusión fue purificada tal y como se ha descrito y se usó para inmunizar conejos. Después de la segunda alimentación, los conejos fueron desangrados y se utilizó el antisuero para la inmunoprecipitación.
6.1.7. Expresión transitoria de Flk-1 en células COS-1
La transfección de células COS-1 se realizó esencialmente tal y como describen Chen y Okayama (1987 Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752) y Gorman et al. (1989 Virology 171:377-385). En resumen, las células fueron sembradas con una densidad de 1.0 x 10^{6} por cada placa de 10cm e incubadas durante la noche en DMEM con un contenido de suero de ternero fetal (Gibco) del 10%. Se mezclaron 20 Mg del receptor de ADNc clonado en un vector de expresión dirigido por el promotor del citomegalovirus en 0.5 ml de CaCa_{2} 0.25 M, 0.5 ml de 2 x BBS (280 mM de NaCI, 1.5 mM de Na_{2}HPO_{4}, 50 mM de BES, pH 6.96 y se incubaron durante 30 min. a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la solución de fosfato de calcio/ADN a las células, se agitó suavemente, y se incubó durante 18 horas a 37°C en CO_{2} al 3%. Para los experimentos de unión de ligandos se eliminaron las células de la placa y se trataron tal como se describe a continuación.
Con el fin de obtener unos medios acondicionados de VEGF, las células se transfectaron en placas de 15-cm. Transcurridas 48 h se recogió el medio y el VEGF fue purificado parcialmente por cromatografía de afinidad usando columnas de MT High Trap de heparina (Pharmacia) y concentrado por ultrafiltración (Ferrara, N. and Henzel, W.J. 1989 Biochem. Biofis. Res. Comm. 161:851-858). La concentración de VEGF fue determinada por un ensayo de competición de ligandos con células bovinas endoteliales aórticas.
Para los ensayos de autofosforilación, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos (2x10^{5} células por pocillo), transfectadas según el modo descrito anteriormente y subalimentadas durante 24 h en DMEM con un contenido del 0.5% de suero de ternero fetal. A continuación, las células fueron tratadas con 500 pM de VEGF durante 10 min. a 37°C, o bien permanecieron sin tratar y posteriormente fueron lisificadas según se describe en Kris et al. (1985). El Flk-1 fue inmunoprecipitado con un antisuero desarrollado en conejos contra el C-terminal del receptor. Los inmunoprecipitados fueron separados en un gel SDS de poliacrilamida al 7.5%, transferidos a nitrocelulosa e incubados con un anticuerpo de ratón monoclonal dirigido contra la fosfotirosina (5E2; Fendly, B.M. et al., 1990 Cancer Research 50: 1550-1558). Se visulizaron las bandas proteínicas utilizando un anticuerpo de cabra anti-ratón acoplado a peroxidasa de rábano, y el sistema de detección de ECL™ (Amersham).
6.1.8. Radioyodación del VEGF
Un VEGF recombinante humano (5 \mug; proporcionado por gentileza del Dr. H. Welch) fue disuelto en 110 \mul de un tampón de fosfato sódico de pH 76 y fue yodado por el procedimiento de Hunter y Greenwood (1962). Los productos reactivos fueron separados de la proteína marcada pasándolos por una columna de sephadex G50 pre-equilibrada con suero salino tamponado con fosfato (PBS) con un contenido del 0.7% de albúmina de suero bovino (BSA), y las partes alícuotas de las fracciones recogidas fueron contadas antes y después de la precipitación con ácido tricloroacético al 20%. Se estimó que la pureza del producto yodado era superior al 90%, tal como se determinó por la electroforesis en gel, y la actividad específica fue de 77000 cpm/ng. La bioactividad del VEGF yodado fue confirmada por comparación con las bioactividades del VEGF nativo a través del ensayo de introducción del factor tisular descrito por Clauss, M. et al. (1990 J. Exp. Med. 172:1535-1545).
6.1.9. Reticulación del VEGF al Flk-1
Las células COS-1 que expresan transitoriamente el Flk-1 y las células COS-1 no modificadas fueron incubadas con 200 pM ^{125}I-VEGF a 4°C durante la noche, luego fueron lavadas dos veces con PBS y expuestas a 0.5 mM de disuccinimidilo suberato (DSS) en PBS durante 1 h a 4°C. Las células fueron lisadas y el Flk-1 inmunoprecipitado y analizado por electroforesis en un de gel politarcilamida al 7% seguido de una autorradiografía.
6.1.10. Unión del VEGF
Se realizaron experimentos de unión de ligandos tal y como se ha descrito previamente (Schumacher, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:19288-19295). Las células COS-1 fueron cultivadas en una placa de cultivo de 15-cm en DMEM durante 48h tras la transfección. A continuación, se lavaron las células cuidadosamente con PBS y se incubaron con 5 ml de EDTA 25 mM en PBS durante 10 min. A continuación se eliminaron las células de la placa, se lavaron una vez con un tampón de unión (DMEM, HEPES 25 mM, pH 7.5, gelatina 0.15%) y se suspendieron de nuevo en 5 ml de un tampón de unión para determinar el número de células. En un volumen total de 500 ml, se incubó esta suspensión celular durante 90 min. a 15°C con 10 pM ^{125}I-VEGF y una concentración en aumento del ligando no marcado (de 0 a 7 x 10^{-9}), purificado parcialmente desde el medio acondicionado de células COS-1 que expresan transitoriamente el VEGF (forma de 164 aminoácidos; Breier et al., 1992). Tras la incubación, se lavaron las células con PBS con el 0.1% de PBS frío. El ligando libre se eliminó por centrifugación repetida y por resuspensión en un tampón de unión. Finalmente, se determinó mediante un contador gamma (Riastar) la radioactividad ^{125}I unida a las células. Los datos obtenidos fueron analizados de acuerdo con el método de Munson, P.J. y Rodbard, D. (1980 Anal. Biochem. 107:220-235).
6.1.11. Vectores retrovíricos que codifican mutantes transdominantes negativos del Flk-1
Se construyeron vectores retrovíricos recombinantes que contenían la zona de codificación de los aminoácidos del 1 al 806 del receptor Flk-1 (pLX Flk-1 cI.1 y cl.3, Figura 12). Se utilizó un virus recombinante que contenía un mutante receptor de c-fms truncado (pNTK cfms TM cl.7) a modo de control. Con el fin de obtener virus productores de células, se infectaron células GPE de ratón unos medios acondicionados con un virus anfotrófico de células PA317 transfectadas con ADN retrovírico recombinante. Se implantaron células tumorales del gliobastoma C6 en ratones desnudos, solas o coimplantadas con virus productores de células. A continuación se indica el número de células inyectadas para los dos conjuntos de experimentos. Comenzando en el momento de aparición de los primeros tumores, se midieron los volúmenes tumorales cada 2 a 3 días para obtener una curva de crecimiento.
Experimento N°.1
Número de Número de Línea celular Número de
ratones células C6 productora de virus células víricas
4 5 x 10^{5} pLXSN Flk-1 TM 1 x 10^{7}
cl.3
4 5 x 10^{5} Ninguna 0
4 5 x 10^{5} pNTK cfms TM cl.7 5 x 10^{6}
Experimento N°.2
Número de Número de Línea celular Número de
ratones células C6 productora de virus células víricas
4 2 x 10^{6} pLXSN Flk-1 TM cl.1 2 x 10^{7}
4 2 x 10^{6} pLXSN Flk-1 TM cl.3 2 x 10^{6}
4 2 x 10^{6} Ninguna 0
4 2 x 10^{6} pNTK cfms TM cl.7 2 x 10^{6}
6.2. Resultados 6.2.1. Aislamiento del Flk-1
Para identificar los RTKs expresados durante el desarrollo del ratón, se realizaron ensayos de PCR usando dos grupos de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñados en base a secuencias muy conservadas dentro del dominio de la quinasa de los RTKs (Hanks, S.K. et al. 1988, Science 241:42-52). Se utilizó el ADN extraído de una biblioteca de ADNc de \lambdagt10 de embriones de ratón de 8.5 días (Fahrner, K. et al., 1987, EMBO. J., 6:1497-1508), una fase del desarrollo del ratón en la cual se inician muchos procedimientos de diferenciación fue usada como molde en los ensayos de PCR. En una realización paralela, con la intención de identificar los RTKs reguladores de la angiogénesis, se utilizaron precursores similares para la amplificación de secuencias de ADNc del RTK de células capilares endoteliales aisladas de cerebros de ratones posnatales de 4-8 días, periodo en el cual la proliferación de las células endoteliales cerebrales es máxima (Robertson, Pl. et al., 1985, Devel. Brain Res. 23:219-223). Ambas realizaciones produjeron secuencias de ADNc (Fig. 11, Secuencia. ID N°.:) codificadoras del RTK de hígado fetal recientemente descrito: el Flk-1 (Mattews, W. et al., 1991: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9026-9030). Basándose en la homología de los aminoácidos, este receptor es un elemento de la subclase de RTK de tipo III (Ullrich, A. y Schlessinger, J. 1990, Cell 61:203-212) y está relacionado estrechamente con el flt humano, el cual también contiene siete repeticiones de tipo inmunoglobina en su dominio extracelular, a diferencia de otros RTK de esta subfamilia, que contienen únicamente cinco estructuras de repetición de este tipo (Mattews, W. et al., 1991, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 88: 9026-9030). Las comparaciones de las secuencias del Flk-1 con el KDR (Terman, B.I. et al., 1991, Oncogene 6:1677-1683) y el TKr-C (Sarzani, R. et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 186:706-714) sugieren que éstos son los homólogos del Flk-1 en el ser humano y en la rata, respectivamente (Figura 1).
6.2.2. Expresión del ARNm de Flk-1 durante el desarrollo embrionario
Como una primera fase hacia la elucidación de la función biológica del Flk-1, se analizó la expresión del ARNm de Flk-1 en embriones de ratón en diferentes fases del desarrollo. Los experimentos de hibridación de Northern Blot indicaron una expresión abundante de un ARNm importante de 5.5 kb entre el día 9.5 y el día 18.5, con un aparente descenso hacia el final de la gestación (Figura 2A). En el Flk-1 de los capilares del cerebro posnatales de 4-8 días, el ARNm resultó estar altamente enriquecido en comparación con el ARNm total del cerebro (Figura 2B).
Se realizaron unos experimentos de hibridación in situ para obtener más información detallada acerca de la expresión del Flk-1 durante las diferentes fases embrionarias. Se utilizó una sonda antisentido de ADN monocatenario de 2619 nucleótidos comprendiendo el dominio extracelular de Flk-1, debido a que genera la mayor parte de las señales de hibridación específicas. Como ejemplo, se muestra una sección parasagital de un embrión de 14.5 días en la figura 3. Se detectaron unos niveles de hibridación elevados en el ventrículo del corazón, en el pulmón y en las meninges; otros tejidos como el cerebro, el hígado y la mandíbula parecían tener un menor contenido de células que expresaban el ARNm de Flk-1. También se observaron cadenas finas en la expresión del Flk-1 en las regiones intersegmentales de las vértebras y en la superficie interna del atrio y de la aorta. Una ampliación más grande mostró que la expresión del Flk-1 parecía estar restringida a los vasos capilares y sanguíneos. Por ejemplo, un estudio más exhaustivo del corazón mostró señales positivas sólo en los capilares ventriculares y en el revestimiento endotelial del atrio (Figura 4A). En el pulmón, se detectó la expresión del Flk-1 en los capilares peribronquiales, pero no se vio en el epitelio bronquial (Figura 4D). La aorta mostró una fuerte hibridación en las células endoteliales, pero no en la capa muscular (Figura 4C).
6.2.3. Expresión del Flk-1 durante la angiogénesis de un órgano
El neuroectodermo en el telencéfalo de un embrión de ratón de 11.5 días es muy avascular; los primeros brotes vasculares empiezan a invadir radialmente el órgano que se origina del plexo vascular perineural (Bar, J., 1980, Adv. Anat. Embriol. Cell. Biol. 59:1-62; Risau, W. and Lemmon, V. 1988, Dev. Biol. 125:441-450). En esta fase, la expresión del Flk-1 es elevada en el plexo perineural vascular y en los brotes vasculares invasores, como se indica en la figura 5A. Los análisis de hibridación in situ indican que las células endoteliales en proliferación de un brote angiogénico expresan el ARNm de Flk-1. En el día 14.5, cuando el neuroectodermo ya está bien vascularizado, muchos vasos radiales, así como ramificaciones de los vasos del plexo intraneural, contienen grandes cantidades de ARNm de Flk-1 (Figura 5B). En el 4° día postnatal, cuando la brotación y la proliferación de células endoteliales están al máximo, se observó una fuerte expresión del ARNm de Flk-1 en las células endoteliales (Figura 5C). Al contrario, cuando cesa la angiogénesis en el cerebro adulto, la expresión del Flk-1 es muy baja (Figura 5D) y parece estar limitada principalmente al plexo coroideo (Figura 6). En el plexo coroideo, las células en la capa vascular interna expresan el ARNm de Flk-1, mientras que las células epiteliales no lo hacen (Figura 6A, B).
El riñón embrionario es vascularizado mediante un proceso angiogénico (Ekblom, P. et al. 1982, Cell Diff. 11:35-39). Los capilares glomerulares y peritubulares se desarrollan de forma sincronizada con la morfogénesis epitelial. En el riñón posnatal de 4 días, además de en otros capilares, se observa una expresión prominente de Flk-1 en los presuntos capilares glomerulares (Figura 7A). Esta expresión persiste en el riñón adulto (Figura 7C y D) aunque parece estar más limitada al glomerular en comparación con el riñón posnatal temprano.
6.2.4. Expresión del Flk-1 en los progenitores de las células endoteliales
Con el fin de investigar la posible implicación del Flk-1 en las fases tempranas del desarrollo vascular, se realizaron análisis de los embriones en diferentes fases durante la formación de islotes sanguíneos. En una sección sagital de la decidua de un embrión de ratón de 8.5 días, se detectó expresión de Flk-1 en los vasos sanguíneos maternos en la decidua, en el saco vitelino y en el trofectodermo. También se encontró ARNm de Flk-1 en el alantoide y dentro del embrión, localizado sobretodo en la parte donde se encuentra el mesenquima (Figura 8A). Al realizar una amplificación mayor de la decidua materna, se observaron niveles elevados de expresión del ARNm de Flk-1 en el revestimiento interno de los vasos sanguíneos, consistente en células endoteliales (Figura 8B). En el saco vitelino, las señales de hibridación se limitaron a la capa mesodermal, en la que se distinguen los hemangioblastos (Figura 8C). La Figura 8D muestra un islote sanguíneo con un aumento mayor, donde los angioblastos periféricos expresaban un nivel de ARNm de Flk-1 elevado.
6.2.5. El Flk-1 es un receptor de gran afinidad para el VEGF
Un estudio detallado de los resultados de la hibridación in situ y una comparación con los del VEGF recientemente realizado por Breier, G. et al. (1992, Development 114:521-532) reveló una similitud destacable en el modelo de expresión. Además, la expresión del Flk-1 en el endotelio glomerular y del VEGF en las células epiteliales circundantes (Breier, C. et al., 1992, Development 114:521-532) sugirió la posibilidad de una relación paracrina entre estos tipos de células y sugirió, en consecuencia, una relación de recepción de ligandos para el VEGF y el Flk-1, respectivamente. Con el objetivo de probar esta hipótesis, se clonó toda la longitud del ADNc de Flk-1 en el vector de expresión mamífero pCMV, el cual contiene elementos de control transcripcional del citomegalovirus humano (Gorman, CM. et al., 1989, Virology 171:377-385). Para una expresión transitoria del receptor, el plásmido de expresión Flk-1 fue posteriormente transfectado en fibroblastos COS-1.
El enlace específico del VEGF al RTK Flk-1 se demostró mediante experimentos de enlace por reticulación y competición. El VEGF purificado marcado con ^{125}I fue incubado con células COS-1 transfectadas con el vector de expresión pCMV-Flk-1. La reticulación con DSS y el posterior análisis de inmunoprecipitación, PAGE, y una autorradiografía, revelaron una banda de aproximadamente 220 kD que no se detectó en el experimento de control con células COS-1 no transfectadas y que puede representar el complejo receptor VEGF/Flk-1 (Figura 9A). Además, el VEGF compitió con la unión del ^{125}I-VEGF y las células COS-1 que expresan el Flk-1 (Figura 9B), mientras que las células COS-1 no transfectadas no se unieron al ^{125}I-VEGF. La interacción del VEGF con el receptor en células transfectadas fue específica, cuando el PDGF-BB no competía con la unión del ^{125}I-VEGF. El análisis de los datos de unión reveló un Kd de aproximadamente 10^{-10} M, lo cual sugiere que el Flk-1 es un receptor de gran afinidad del VEGF. Este hallazgo, junto con los resultados de la hibridación in situ del Flk-1 y del VEGF sugieren sin duda que el Flk-1 es un receptor del VEGF fisiológicamente relevante.
Se realizó un ensayo de autofosforilación para confirmar la relevancia biológica de la unión del VEGF al receptor Flk-1. Células COS-1 que expresan el Flk-1 de forma transitoria, fueron subalimentadas en DMEM con un contenido del 0.5% de suero de ternero fetal durante 24h, y estimuladas con 0.5mM de VEGF, y lisadas. Los receptores fueron inmunoprecipitados con el anticuerpo policlonal específico de Flk-1, CT128, y luego analizados mediante PAGE SOS y posteriormente inmunotransferidos mediante el anticuerpo de antifosfotiroxina 5E2 (Fendly, B.M. et al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558). Según se muestra en la Figura 10, la estimulación por VEGF de las células que expresan Flk-1 condujo a una inducción significativa de la fosforilación de la tirosina del receptor Flk-1 de 180 kD.
6.2.6. Inhibición de crecimiento tumoral por inhibición transdominante negativa de Flk-1
Se cree que el receptor Flk-1 tiene un papel principal en la vasculogénesis y la angiogénesis. Por lo tanto, la inhibición de la actividad del Flk-1 podría inhibir la vasculogénesis de un tumor en desarrollo e inhibir así su crecimiento. Para probar esta hipótesis, se mezclaron células tumorales (glioblastoma C6 de rata) y células de ratón productoras de un retrovirus recombinante codificador de un receptor Flk-1 truncado y se implantaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Las células de glioblastoma C6 implantadas segregan VEGF que se enlazará y activará los receptores Flk-1 expresados en la superficie de las células endoteliales del ratón. En ausencia de inhibidores de la vasculogénesis, las células endoteliales proliferarían y emigrarían hacia las células tumorales. De forma alternativa, si en el momento de la inyección las células tumorales se co-inyectan con células productoras de retrovirus recombinantes codificadoras del Flk-1 dominante negativo, las células endoteliales que se desarrollan hacia las células tumorales implantadas serán infectadas con el retrovirus recombinante, lo que podría producir una expresión mutante del Flk-1 dominante negativo y la inhibición de la señalización del Flk-1 endógeno. La supresión de la proliferación y la migración de las células endoteliales provocarán la incapacidad de las células tumorales implantadas para ser vascularizadas, lo cual conducirá a la inhibición del crecimiento tumoral. Según se indica en las Figuras 12 y 13, el crecimiento tumoral se inhibe significativamente en los ratones que han recibido implantes de células productoras de un receptor Flk-1 truncado, lo que indica que la expresión de un receptor Flk-1 truncado puede actuar de forma dominante negativa para inhibir la actividad del Flk-1 endógeno de tipo salvaje.
La presente invención no debe considerarse limitada completamente por las formas de realización ejemplificadas, destinadas a ilustrar algunos aspectos únicos de la invención, y cualquier clon, ADN o secuencias de aminoácidos funcionalmente equivalentes están incluidos en el campo de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las aquí descritas aparecen como evidentes para los expertos en la técnica gracias a la precedente descripción y a los dibujos anexos. Tales modificaciones forman parte del campo de las reivindicaciones anexas.
También debe entenderse que todas los tamaños en pares de bases proporcionados para los nucleótidos son aproximados y se usan sólo con el propósito de la descripción.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Ullrich, et al
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: EL Flk-1 ES UN RECEPTOR PARA EL FACTOR DE CRECIMIENTO VASCULAR ENDOTELIAL
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Pennie & Edmonds
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 1155 Avenue of the Americas
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Nueva York
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Nueva York
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: E.E.U.U.
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10036-2711
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMATO INFORMÁTICO:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS-MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE APLICACIÓN: Por asignar
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-MAR-1993
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Coruzzi, Laura A.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 30,742
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7683-034-999
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212) 790-9090
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (212) 869-8864/9741
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TÉLEX: 66141 PENNIE
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID N°:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5470 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocida
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
RASGO:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 286..4386
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA 10 N°:1:
27
28
29
30
31
32
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID N°:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1367 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SECUENCIA ID N°:2:
34
35
36
37

Claims (14)

1. Vector recombinante que comprende una secuencia nucleótida codificadora de un receptor Flk-1 que carece del dominio citoplasmático de la quinasa C-terminal, donde dicho receptor Flk-1 tiene una actividad dominante negativa que inhibe los efectos celulares del enlace del VEGF.
2. Vector recombinante según la reivindicación 1, el cual contiene una secuencia nucleótida codificadora de los aminoácidos del 1 al 806 del Flk-1, pero no de los aminoácidos del 807 al 1367 de Flk-1.
3. Vector recombinante que comprende una secuencia nucleótida que codifica un receptor Flk-1 con una mutación en el dominio citoplasmático de la quinasa del receptor Flk-1, donde dicho receptor Flk-1 tiene una actividad dominante negativa que inhibe los efectos celulares del enlace del VEGF.
4. Vector recombinante según las reivindicaciones 1, 2 o 3, donde el vector es un vector vírico.
5. Vector recombinante según la reivindicación 4, donde el vector vírico es un vector retrovírico.
6. Línea celular creada por ingeniería genética que contiene el vector recombinante según la reivindicación 4.
7. Línea celular creada por ingeniería genética que contiene el vector recombinante según la reivindicación 5.
8. Utilización de una cantidad eficaz de los vectores recombinantes de las reivindicaciones 1, 2 o 3 en la preparación de una composición para modular los efectos celulares del VEGF en mamíferos.
9. Utilización según la reivindicación 8, en la que los vectores se reconstruyen en liposomas.
10. Utilización de una cantidad eficaz del vector recombinante según la reivindicación 4 en la preparación de una composición para modular los efectos celulares del VEGF en mamíferos.
11.Utilización de una cantidad eficaz del vector recombinante según la reivindicación 5 en la preparación de una composición para modular los efectos celulares del VEGF en mamíferos.
12. Utilización de una cantidad eficaz de un receptor Flk-1 truncado en la preparación de una composición para modular los efectos celulares del VEGF en mamíferos, en la cual dicho receptor Flk-1 tiene una actividad dominante negativa que inhibe los efectos celulares del enlace del VEGF.
13. Utilización de una cantidad eficaz de un receptor Flk-1 truncado con una mutación en el dominio citoplasmático de la quinasa del receptor Flk-1, en la preparación de una composición para modular los efectos celulares del VEGF en mamíferos, en la cual dicho receptor Flk-1 tiene una actividad dominante negativa que inhibe los efectos celulares del enlace del VEGF.
14. Utilización según la reivindicación 8 o la 9, en la cual el receptor Flk-1 se reconstruye en liposomas.
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