ES2242960T3 - Hu-b1.219, un nuevo receptor humano de la hematopoyetina. - Google Patents

Hu-b1.219, un nuevo receptor humano de la hematopoyetina.

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ES2242960T3 ES95931007T ES95931007T ES2242960T3 ES 2242960 T3 ES2242960 T3 ES 2242960T3 ES 95931007 T ES95931007 T ES 95931007T ES 95931007 T ES95931007 T ES 95931007T ES 2242960 T3 ES2242960 T3 ES 2242960T3
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Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende: (a) nucleótidos 97 a 2770 de SEQ ID NO: 6; (b) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a (a); o (c) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con (a) o (b).

Description

Hu-B1.219, un nuevo receptor humano de la hematopoyetina.
1. Introducción
La presente invención se refiere a un nuevo miembro de la familia del receptor de la hematopoyetina, al que se hace referencia en la presente memoria como Hu- B1.219. En particular, la invención se refiere a secuencias de nucleótidos y vectores de expresión que codifican el producto del gen Hu-B1.219. Las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que expresan la secuencia codificante de Hu-B1.219 se pueden utilizar para evaluar y realizar un cribado en búsqueda de ligandos o fármacos implicados en la interacción y regulación de Hu-B1.219. Puesto que se ha detectado en ciertos tejidos de fetos humanos y células cancerosas expresión de Hu-B1.219, las sondas moleculares diseñadas a partir de su secuencia de nucleótidos pueden ser útiles para los ensayos prenatales y el diagnóstico del cáncer.
2. Antecedentes de la invención
Diversas enfermedades, incluidos los tumores malignos y la inmunodeficiencia, están relacionadas con disfunciones dentro del sistema linfo-hematopoyético. Algunos de estos estados podrían aliviarse y/o curarse repoblando el sistema hematopoyético con células progenitoras, que, cuando se desencadenara su diferenciación, permitirían superar la deficiencia del paciente. Por ello, la capacidad de iniciar y regular la hematopoyesis es de gran importancia (McCune et al., 1988, Science 241:1632).
Se ha demostrado que el proceso de formación de células sanguíneas, mediante el cual un pequeño número de células madre que se autorrenuevan da lugar a células progenitoras de un linaje específico que posteriormente experimentan proliferación y diferenciación para producir las células sanguíneas circulantes maduras, está regulado al menos en parte por hormonas específicas. Estas hormonas se conocen colectivamente como factores de crecimiento hematopoyéticos o citoquinas (Metcalf, 1985, Science 229:16; Dexter, 1987, J. Cell Sci. 88:1; Golde y Gasson, 1988, Scientific American, Julio:62; Tabbara y Robinson, 1991, Anti-Cancer Res. 11:81; Ogawa, 1989, Environ. Health Presp. 80:199; Dexter, 1989, Br. Med. Bull. 45:337).
Con la llegada de la tecnología del DNA recombinante, se han clonado a nivel molecular los genes que codifican una cierta cantidad de estas moléculas y se han expresado de forma recombinante (Souza et al., 1986, Science 232:61; Gough et al., 1984, Nature 309:763; Yokota et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:1070; Kawasaki et al, 1985, Science 230:291). De estas citoquinas se ha estudiado su estructura, biología e incluso su potencial terapéutico. Algunos de los factores mejor caracterizados incluyen la eritropoyetina (EPO), factor de las células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), y las interleuquinas (IL-1 a IL-14).
Estos factores actúan sobre diferentes tipos de células en diferentes estadios durante el desarrollo de las células sanguíneas, y sus usos potenciales en medicina son de gran alcance, incluyendo transfusiones sanguíneas, transplante de médula ósea, corregir trastornos inmunosupresoras, terapia del cáncer, cicatrización de heridas y activación de la respuesta inmune. (Golde y Gasson, 1988, Scientific American, Julio: 62).
Además de inducir la proliferación y la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas, se ha demostrado que tales citoquinas activan numerosas funciones de las células sanguíneas maduras (Stanley et al., 1976, J. Exp. Med. 143:631; Schrader et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:323; Moore et al., 1980, J. Immunol. 125:1302; Kurland et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:2326; Handman y Burgess, 1979, J. Immunol. 122:1134; Vadas et al., 1983, Blood 61:1232; Vadas et al., 1983, J. Immunol. 130:795), incluyendo influir sobre la migración de células hematopoyéticas maduras (Weibart et al., 1986, J. Immunol. 137:3584).
Las citoquinas ejercen sus efectos sobre células diana uniéndose a receptores específicos de la superficie celular. Se han identificado numerosos receptores de citoquinas y se han clonado a nivel molecular los genes que los codifican. Varios receptores de citoquinas han sido clasificados recientemente en la superfamilia del receptor de la hematopoyetina (HR). El agrupamiento de estos receptores se basó en la conservación de motivos de aminoácidos clave en los dominios extracelulares (Bazan, 1990, Immunology Today 11:350) (Figura 1). La familia del HR está definida por tres motivos conservados en el dominio extracelular de estos receptores. El primero es un motivo Trp-Ser-X-Trp-Ser (caja WSXWS) que está altamente conservado y localizado en la zona amino-terminal del dominio transmembrana. La mayor parte de los miembros de la familia del HR contienen este motivo. El segundo consiste en cuatro residuos conservados de cisteína localizados en la mitad amino-terminal de la región extracelular. El tercero es un dominio conservado de fibronectina Tipo III (FN III) que está localizado entre la caja WSXWS y las cisteínas. Los miembros de la familia del HR incluyen receptores de ligandos tales como la eritropoyetina (EPO), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) (Fukunaga, 1990, Cell 61:341), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interleuquina-3 (IL-3), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 e IL-2 (subunidad \beta) (Cosman, 1990, TIBS 15:265).
Los ligando del HR están implicados de manera crítica en la maduración y diferenciación de células sanguíneas. Por ejemplo, la IL-3 promueve la proliferación de células madre pluripotentes tempranas multilinaje, y colabora de modo sinérgico con la EPO para producir glóbulos rojos. La IL-6 y la IL-3 colaboran de modo sinérgico para inducir la proliferación de precursores hematopoyéticos tempranos. Se ha demostrado que el GM-CSF induce la proliferación de granulocitos así como que incrementa la función de los macrófagos. La IL-7 es una citoquina derivada de la médula ósea que juega un papel en la producción de linfocitos T y B inmaduros. La IL-4 induce la proliferación de células B activadas por antígenos y células T específicas de antígeno. Así, miembros de esta familia de receptores están implicados en la regulación del sistema hematopoyético.
3. Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo miembro de la familia del HR, al que se hace referencia como Hu-B1.219. En particular, se refiere a las secuencias de nucleótidos, vectores de expresión, células hospedadoras que expresan el gen Hu-B1.219, y proteínas codificadas por las secuencias.
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los solicitantes de un clon de cDNA, Hu-B1.219, aislado de una genoteca de cDNA de hígado de feto humano. Aunque la secuencia de nucleótidos de este clon comparte cierta homología con otros genes HR, también es única en su estructura. Se han identificado tres formas de Hu-B1.219, y difieren en su secuencia sólo en los extremos 3'. Las secuencias se expresan en ciertas células de fetos humanos y células tumorales. Por ello, la presente invención abarca una amplia variedad de usos, incluyendo pero sin limitarse a, el diagnóstico del cáncer, el marcaje de tejidos fetales, y el cribado en busca de ligandos y compuestos que se unen a la molécula receptora codificada por Hu-B1.219.
Para los propósitos de la presente invención, la denominación Hu-B1.219 hace referencia a la secuencia completa de cDNA descrita en las Figuras 2A-2G. Además, Hu-B1.219 también hace referencia a las secuencias codificantes parciales dentro de la secuencia de cDNA de las Figuras 2A-2G.
4. Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Un dibujo esquemático de regiones conservadas compartidas por miembros de la familia del HR.
Figura 2A-2G. Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida de Hu-B1.219.
Figura 3A. Comparación de las secuencias de nucleótidos de los extremos 3' de las tres formas de Hu-B1.219.
Figura 3B. Comparación de las secuencias de aminoácidos de los extremos 3' de las tres formas de Hu-B1.219. El símbolo * indica un codón de parada.
Figura 4. Comparación del espaciamiento de aminoácidos conservados en el dominio FN III entre los genes HR y Hu-B1.219.
Figura 5. Comparación de motivos conservados entre moléculas HR y Hu-B1.219 en el "Bloque 3".
Figura 6. Comparación de motivos conservados entre moléculas HR y Hu-B1.219 en el "Bloque 6".
5. Descripción detallada de la invención 5.1. La secuencia codificante de Hu-B1.219
La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de un nuevo miembro de la familia del HR. En una realización específica a modo de ejemplo, en la Sección 6, más adelante, se clonó y caracterizó un nuevo miembro de esta familia del HR de receptores. La secuencia de nucleótidos codificante y la secuencia de aminoácidos deducida del nuevo receptor son únicas, y se hace referencia al receptor como Hu-B1.219. De acuerdo con la invención, cualquier secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del producto del gen Hu-B1.219 puede utilizarse para generar moléculas recombinantes que dirijan la expresión del gen Hu-B1.219.
El análisis de la secuencia de Hu-B1.219 reveló una homología significativa con el dominio FN III de la familia del HR, indicando que era un miembro de la familia del HR de receptores. La homología compartida por Hu-B1.219 y otros miembros de la familia HR se discute en la Sección 6.2, más adelante. Sin embargo, este receptor también contiene regiones de secuencias únicas de nucleótidos de las que no se había informado previamente.
El análisis por hibridación con una transferencia tipo Northern indica que el mRNA de Hu-B1.219 se expresa de forma elevada en células de origen hematopoyético. Además, la secuencia de Hu-B1.219 se expresa en ciertas células tumorales.
Con el fin de clonar la secuencia del cDNA de longitud completa que codifica el cDNA completo de Hu-B1.219 o para clonar formas variantes de la molécula, pueden utilizarse sondas marcadas de DNA preparadas a partir de fragmentos de ácidos nucleicos correspondientes a cualquier porción del cDNA parcial descrito en la presente memoria para rastrear la genoteca de cDNA de hígado de feto humano. Más específicamente, pueden utilizarse oligonucleótidos correspondientes tanto al extremo 5' como al 3' de la secuencia parcial de cDNA para obtener secuencias de nucleótidos más largas. Brevemente, puede plaquearse la genoteca para obtener un máximo de 30.000 ufp por cada 150 mm de placa. Pueden cribarse aproximadamente 40 placas. Las placas se incuban a 37ºC hasta que las placas de lisis alcanzan un diámetro de 0,25 mm o están justamente comenzando a establecer contacto unas con otras (3-8 horas). Se colocan filtros de Nylon sobre la parte superior blanda de la agarosa y, después de 60 segundos, se separan los filtros y se dejan flotando sobre una solución desnaturalizante de DNA que consiste en hidróxido sódico 0,4 N. Los filtros se sumergen luego en una solución neutralizante que consiste en Tris HCl, 1 M, pH 7,5, antes de dejar que se sequen al aire. Los filtros se prehibridan en tampón de hibridación con caseína que contiene sulfato de dextrano al 10%, NaCl 0,5 M, Tris HCl 50 mM, pH 7,5, pirofosfato sódico al 0,1%, caseína al 1%, SDS al 1%, y DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 0,5 mg/ml durante 6 horas a 60ºC. La sonda marcada radiactivamente se desnaturaliza entonces calentándola a 95ºC durante 2 minutos y se añade luego a la solución de prehibridación que contiene los filtros. Los filtros se hibridan a 60ºC durante 16 horas. Los filtros se lavan entonces en mezcla de lavado 1X (la mezcla de lavado 10X contiene NaCl 3 M, Tris base 0,6 M, y EDTA 0,02 M) dos veces durante 5 minutos cada vez a temperatura ambiente, y luego en mezcla de lavado 1X que contiene SDS al 1% a 60ºC durante 30 minutos, y finalmente en mezcla de lavado 0,3X que contiene SDS al 0,1% a 60ºC durante 30 minutos. Los filtros se secan entonces al aire y se exponen a una película de rayos X para su autorradiografía. Después de revelar, la película se alinea con los filtros para seleccionar una placa positiva. Si no se puede obtener una única placa positiva aislada, se extraerá el bloque de agar que contiene las placas y se colocará en tampón de dilución de lambda que contiene NaCl 0,1 M, sulfato magnésico 0,01 M, Tris HCl 0,035 M, pH 7,5, gelatina 0,01%. El fago puede entonces replaquearse y recribarse para obtener placas positivas únicas bien aisladas. Pueden aislarse las placas positivas y secuenciar los clones de cDNA utilizando cebadores basados en la secuencia de cDNA conocida. Esta etapa se puede repetir hasta que se obtiene un cDNA de longitud completa.
Puede ser necesario cribar múltiples genotecas de cDNA de diferentes tejidos para obtener un cDNA de longitud completa. En caso de que sea difícil identificar clones de cDNA que codifiquen la región codificante terminal de 5' completa, una situación que se encuentra a menudo en la clonación de cDNA, puede utilizarse la técnica RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends: amplificación rápida de extremos de cDNA). La RACE es una estrategia comprobada, basada en la PCR, para amplificar el extremo 5' de cDNA incompletos. A nivel comercial (Clontech), se dispone del cDNA 5'-RACE-Ready, sintetizado a partir de hígado de feto humano, que contiene una única secuencia de anclaje. Para obtener el extremo 5' del cDNA, se lleva a cabo una PCR sobre el cDNA 5'- RACE-Ready utilizando el cebador de anclaje proporcionado y el cebador de 3'. Luego se lleva a cabo una reacción secundaria de PCR utilizando el cebador anclado y un cebador anidado en 3' según las instrucciones del fabricante. Una vez obtenida, la secuencia de cDNA de longitud completa se puede traducir a su secuencia de aminoácidos y examinar en ella ciertos hitos tales como un marco abierto de lectura continuo flanqueado por sitios de iniciación y terminación de la traducción, una secuencia señal y un dominio transmembrana potenciales, y finalmente una similitud estructural global con genes HR conocidos.
5.2. Expresión de la secuencia de Hu-B1.219
De acuerdo con la invención, la secuencia polinucleotídica Hu-B1.219 que codifica la proteína Hu-B1.219, los fragmentos peptídicos de Hu-B1.219, las proteínas de fusión de Hu-B1.219 o equivalentes funcionales suyos, pueden utilizarse para generar moléculas recombinantes de DNA que dirijan la expresión de la proteína Hu-B1.219, un fragmento peptídico de Hu-B1.219, proteínas de fusión o un equivalente funcional suyo, en células hospedadoras apropiadas. Tales secuencias polinucleotídicas de Hu-B1.219, así como otros polinucleótidos que hibridan de forma selectiva con al menos una parte de tales polinucleótidos de Hu-B1.219 o sus complementarios, pueden utilizarse también en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, análisis con transferencias tipo Southern o Northern, etc.
Debido a la degeneración inherente al código genético, otras secuencias de DNA que codifiquen sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos equivalente funcionalmente, pueden utilizarse en la práctica de la invención para la clonación y la expresión de la proteína Hu-B1.219. Tales secuencias de DNA incluyen las que son capaces de hibridar con las secuencias humanas de Hu-B1.219 en condiciones estrictas. La expresión "condiciones estrictas", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a aquellas condiciones de hibridación que (1) emplean una fuerza iónica baja y alta temperatura para lavar, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/ SDS 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 0,75 M, pirofosfato sódico 0,075 M, solución de Denhardt 5 x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2 x y SDS al 0,1%.
Las secuencias alteradas de DNA que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes residuos nucleotídicos que dan como resultado una secuencia que codifica el mismo o un producto del gen equivalente funcionalmente. El producto del gen en sí mismo puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de Hu-B1.219, que den como resultado un cambio silencioso, produciendo así una proteína Hu-B1.219 equivalente funcionalmente. Tales sustituciones de aminoácidos se pueden hacer sobre la base de similitudes en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina, histidina y arginina; los aminoácidos con grupos con cabezas polares no cargadas que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina; y los aminoácidos con grupos de cabezas no polares incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, metionina, triptófano.
Las secuencias de DNA de la invención se pueden transformar por ingeniería genética para alterar una secuencia codificante de Hu-B1.219 con diversos fines, incluyendo pero sin limitarse a alteraciones que modifiquen el procesamiento y la expresión del producto del gen. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida, para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar patrones de glicosilación, fosforilación, etc.
En otra realización de la invención, se puede ligar una secuencia de Hu-B1.219 o una secuencia de Hu-B1.219 modificada a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para realizar el rastreo de genotecas de péptidos en busca de inhibidores o estimuladores de la actividad de Hu-B1.219, puede ser útil codificar una proteína Hu-B1.219 quimérica que exprese un epítopo heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo comercialmente disponible. También se puede obtener por ingeniería genética una proteína de fusión que contiene un sitio de escisión localizado entre una secuencia de Hu-B1.219 y la secuencia de la proteína heteróloga, de forma que la Hu-B1.219 se pueda escindir del resto heterólogo.
En una realización alternativa de la invención, se podría sintetizar, en todo o en parte, la secuencia codificante de una Hu-B1.219, utilizando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233; Crea y Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10):2331; Matteucci y Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719; y Chow y Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817. Alternativamente, podría producirse la proteína misma utilizando métodos químicos para sintetizar una secuencia de aminoácidos de Hu-B1.219 en todo o en parte. Por ejemplo, se puede sintetizar péptidos mediante técnicas en fase sólida, escindirlos de la resina, y purificarlos por cromatografía líquida preparativa de alta eficacia (por ejemplo, véase Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pags. 50-60). La composición de los péptidos sintéticos se puede confirmar mediante el análisis o la secuenciación de los aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., pags. 34-49).
Con el fin de expresar una Hu-B1.219 biológicamente activa, la secuencia de nucleótidos codificante de Hu-B1.219, o un equivalente funcional, se inserta en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada. Los productos del gen Hu-B1.219, así como las células hospedadoras o líneas celulares transfectadas o transformadas con vectores de expresión con Hu-B1.219 recombinante, pueden utilizarse para diversos propósitos. Estos incluyen, pero no se limitan a, generar anticuerpos (es decir, monoclonales o policlonales) que inhiban de forma competitiva la actividad de una Hu-B1.219 y neutralicen su actividad; y anticuerpos que mimeticen la actividad de ligandos de Hu-B1.219 de estimulación del receptor para transmitir una señal intracelular. Para detectar y cuantificar los niveles de expresión de Hu-B1.219 en células y tejidos puede utilizarse anticuerpos anti-Hu-B1.219.
5.3. Sistemas de expresión
Se pueden utilizar métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan la secuencia codificante de Hu-B1.219 y señales apropiadas de control de la transcripción/traducción. Estos métodos incluyen técnicas in vitro de DNA recombinante, técnicas de síntesis y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y.
Se pueden utilizar diversos sistemas hospedador-vector de expresión para expresar la secuencia codificante de Hu-B1.219. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores recombinantes de expresión con DNA de bacteriófago, DNA de plásmido o DNA de cósmido que contienen la secuencia codificante de Hu-B1.219; levaduras transformadas con vectores recombinantes para la expresión en levaduras que contienen la secuencia codificante de Hu-B1.219; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión recombinantes derivados de virus (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia codificante de Hu-B1.219; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión recombinantes derivados de virus (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión recombinantes derivados de plásmidos (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen la secuencia codificante de Hu-B1.219; o sistemas de células animales. Los elementos de expresión de estos sistemas varían en fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, se pueden utilizar en el vector de expresión cualesquiera de entre numerosos elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden utilizarse promotores inducibles tales como pL del bacteriófago \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y otros similares; cuando se clona en sistemas de células de insectos, pueden utilizarse promotores tales como el promotor de la polihedrina de baculovirus; cuando se clona en sistemas de células de plantas, pueden utilizarse promotores derivados del genoma de células de plantas (por ejemplo, promotores de choque térmico; el promotor de la subunidad menor de la RUBISCO; el promotor de la proteína de unión a clorofila \alpha/\beta) o de virus de plantas (por ejemplo, el promotor del RNA de 35S del CaMV; el promotor de la proteína de la envuelta del TMV); cuando se clona en sistemas de células de mamífero, pueden utilizarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia); cuando se generan líneas celulares que contienen múltiples copias del DNA de Hu-B1.219, pueden utilizarse vectores basados en SV40, BPV y EBV con un marcador apropiado que permita la selección.
En sistemas bacterianos se pueden seleccionar numerosos vectores de expresión de forma ventajosa, dependiendo del uso previsto para la Hu-B1.219 expresada. Por ejemplo, cuando se han de producir grandes cantidades de Hu-B1.219 para la generación de anticuerpos o para el rastreo de genotecas de péptidos, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión en E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la secuencia codificante de Hu-B1.219 puede estar ligada en el vector en marco con la región codificante de lac Z, de forma que se produce una proteína híbrida AS-lac Z; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y otros similares. También puede utilizarse vectores pGEX para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con la glutation-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante la adsorción a perlas de glutation-agarosa seguida de la elución en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión por proteasas de trombina o del factor Xa, de forma que el polipéptido clonado de interés se pueda liberar del resto GST.
En las levaduras pueden utilizarse numerosos vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para su revisión véanse, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. y Wiley Interscience, capítulo 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Enzymology, Eds. Wu y Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., vol. 153, pags. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., capítulo 3; y Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzimology, Eds. Berger y Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pags. 673-684; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II.
En los casos en que se utilizan vectores para la expresión en plantas, la expresión de la secuencia codificante de Hu-B1.219 puede estar dirigida por cualquiera de entre numerosos promotores. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores virales tales como los promotores de los RNA 35S y 19S del CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310:511-514), o el promotor de la proteína de la envuelta del TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311); alternativamente, pueden utilizarse promotores de plantas tales como el de la subunidad menor de la RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843); o promotores de choque térmico, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Estas construcciones pueden introducirse en células de plantas utilizando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa del DNA, microinyección, electroporación, etc. Para las revisiones de tales técnicas véanse, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pags. 421-463; y Grierson y Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2ª ed., Blackie, Londres, capítulos 7-9.
Un sistema de expresión alternativo que podría utilizarse para expresar la Hu-B1.219 es un sistema de insectos. En uno de tales sistemas, se utiliza el virus de la polihidrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes ajenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de Hu-B1.219 se puede clonar en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarla bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina). La inserción exitosa de la secuencia codificante de Hu-B1.219 dará como resultado la inactivación del gen de la polihedrina y la producción de virus recombinante sin ocluir (es decir, virus que carecen de la cubierta proteica codificada por el gen de la polihedrina). Estos virus recombinantes se utilizan luego para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado (por ejemplo, véase Smith et al., 1983, J. Viol. 46:584; Smith, Patente de EE.UU. Nº 4.215.051).
En las células hospedadoras de mamíferos, pueden utilizarse numerosos sistemas de expresión basados en virus. En los casos en que se utiliza como vector de expresión un adenovirus, la secuencia codificante de Hu-B1.219 se puede ligar a un complejo para el control de transcripción/traducción, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar luego en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar Hu-B1.219 en hospedadores infectados. (Por ejemplo, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Alternativamente, puede utilizarse el promotor 7.5K de vaccinia. (Véase, por ejemplo, Mackett et al., 1982, Proc. Natl Acad. Sci. USA 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931).
Pueden requerirse también señales específicas de iniciación para la traducción eficiente de las secuencias codificantes de Hu-B1.219 insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que se inserte en el vector de expresión apropiado el gen Hu-B1.219 completo, incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, puede que no se necesiten señales adicionales de control de la traducción. Sin embargo, en los casos en que sólo se inserte una porción de la secuencia codificante de Hu-B1.219, se deben aportar señales exógenas para el control de la traducción, incluyendo el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante de Hu-B1.219 para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales para el control de la traducción y codones de iniciación exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede incrementar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (véase Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
Además, se puede elegir una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto del gen de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. La presencia de varios sitios de consenso para la N-glicosilación en el dominio extracelular de Hu-B1.219 apoya la posibilidad de que una modificación apropiada puede ser importante para la función de Hu-B1.219. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccionales de las proteínas. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína ajena expresada. Con esta finalidad, pueden utilizarse células hospedadoras eucarióticas que poseen la maquinaria celular para un adecuado procesamiento del transcrito primario, glicosilación, y fosforilación del producto del gen. Tales células hospedadoras de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc.
Para la producción prolongada y con alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden obtener por ingeniería genética líneas celulares que expresen de forma estable la Hu-B1.219. Más que utilizar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, las células hospedadoras pueden transformarse con el DNA de Hu-B1.219 controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras, potenciadoras de la expresión, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador que permite la selección. Tras la introducción del DNA exógeno, las células obtenidas por ingeniería genética se pueden dejar crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador que permite la selección del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren el plásmido de forma estable en sus cromosomas y crezcan hasta formar focos que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas celulares. Este método se puede utilizar de forma ventajosa para obtener por ingeniería genética líneas celulares que expresen la Hu-B1.219 en la superficie de la célula. Tales líneas celulares obtenidas por ingeniería genética son particularmente útiles para realizar cribados en busca de ligandos o fármacos que afecten a la función de Hu-B1.219.
Pueden utilizarse numerosos sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitarse a, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) que se pueden emplear en células tk^{-}, hgprt^{-} o aprt^{-}, respectivamente. También puede utilizarse la resistencia a antimetabolitos como base para la selección con respecto a los genes dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol.. 150:1); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre, et al., , 1984, Gene 30:147). Recientemente, se han descrito genes adicionales que permiten la selección, que son: trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047); y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue L., 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.).
5.4. Identificación de células que expresan Hu-B1.219
Las células hospedadoras que contienen la secuencia codificante y que expresan el producto del gen biológicamente activo se pueden identificar mediante al menos cuatro estrategias generales; (a) hibridación de DNA-DNA o DNA-RNA; (b) la presencia o ausencia de funciones del gen "marcador"; (c) evaluar el nivel de transcripción medido mediante la expresión de transcritos de mRNA de Hu-B1.219 en la célula hospedadora; y (d) detección del producto del gen medido mediante inmunoensayo o mediante su actividad biológica. Antes de la identificación de la expresión del gen, las células hospedadoras pueden ser mutagenizadas primero en un esfuerzo para incrementar el nivel de expresión de Hu-B1.219, especialmente en líneas celulares que producen bajas cantidades de Hu-B1.219.
En la primera estrategia, la presencia de la secuencia codificante de Hu-B1.219 insertada en el vector de expresión se puede detectar mediante hibridación de DNA-DNA o DNA-RNA utilizando sondas que comprenden secuencias de nucleótidos que sean homólogas a la secuencia codificante de Hu-B1.219, respectivamente, o porciones o derivados de la misma.
En la segunda estrategia, puede identificarse y seleccionarse el sistema recombinante de expresión vector/hospeda-
dor basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, resistencia a metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.). Por ejemplo, si la secuencia codificante de Hu-B1.219 está inserta dentro de una secuencia de un gen marcador del vector, los recombinantes que contienen la secuencia codificante de Hu-B1.219 se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, se puede colocar un gen marcador en tándem con la secuencia de Hu-B1.219 bajo el control del mismo o de un promotor diferente que se utiliza para controlar la expresión de la secuencia codificante de Hu-B1.219. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o la selección indica la expresión de la secuencia codificante de Hu-B1.219.
En la tercera estrategia, se puede evaluar la actividad transcripcional de la región codificante de Hu-B1.219 mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, se puede aislar RNA y analizarlo mediante una transferencia tipo Northern utilizando una sonda homóloga a la secuencia codificante de Hu-B1.219 o porciones concretas de la misma. Alternativamente, se pueden extraer los ácidos nucleicos totales de la célula hospedadora y ensayar en ellos la hibridación con tales sondas.
En la cuarta estrategia, se puede evaluar inmunológicamente la expresión del producto proteico Hu-B1.219, por ejemplo, mediante transferencias tipo Western, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos con enzimas ligadas y otros similares.
5.5. Usos de líneas celulares con Hu-B1.219 obtenidas por ingeniería genética
En una realización que no forma parte de la invención reivindicada, se pueden utilizar el receptor Hu-B1.219 y/o líneas celulares que expresan el receptor Hu-B1.219 para realizar un cribado en busca de anticuerpos, péptidos, u otros ligando que actúen como agonistas o antagonistas del receptor Hu-B1.219. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos anti-Hu-B1.219 para inhibir o estimular la función del receptor Hu-B1.219. Alternativamente, el cribado de genotecas de péptidos con la proteína Hu-B1.219 soluble expresada de forma recombinante o líneas celulares que expresen la proteína Hu-B1.219 puede ser útil para la identificación de moléculas terapéuticas que funcionen inhibiendo o estimulando la actividad biológica de Hu-B1.219. Los usos del receptor Hu-B1.219 y líneas celulares obtenidas por ingeniería genética, descritos en las subsecciones que aparecen más adelante, pueden emplearse igualmente bien para otros miembros de la familia del HR.
En una realización que no forma parte de la invención reivindicada, líneas celulares obtenidas por ingeniería genética que expresen la mayor parte de la región codificante de Hu-B1.219 o su dominio de unión al ligando o su dominio de unión al ligando fusionado con otra molécula tal como la región constante de las inmunoglobulinas (Hollenbaugh y Aruffo, 1992, Current Protocols in Immunology, Unidad 10.19; Aruffo et al., 1990, Cell 61:1303) pueden ser utilizadas para producir un receptor soluble para realizar el cribado en busca de e identificar antagonistas del ligando así como agonistas. La proteína Hu-B1.219 soluble o la proteína de fusión se pueden utilizar para identificar un ligando en ensayos de unión, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, transferencia tipo Western, y otros similares. Alternativamente, el dominio de unión al ligando de Hu-B1.219 se puede fusionar con la secuencia codificante de las regiones transmembranal y citoplásmica del receptor del factor de crecimiento epidérmico. Esta estrategia proporciona el uso de la ruta de transducción de la señal del receptor del factor de crecimiento epidérmico como un medio para detectar ligandos que se unen a Hu-B1.219 de manera capaz de desencadenar una señal intracelular. Compuestos sintéticos, productos naturales, y otras fuentes de materiales potencialmente activos desde el punto de vista biológico pueden ser sometidos a un cribado de numerosas maneras.
Las genotecas de péptidos al azar que consisten en todas las posibles combinaciones de aminoácidos unidas a un soporte en fase sólida se pueden utilizar para identificar péptidos que son capaces de unirse al sitio de unión al ligando de un receptor dado u otros dominios funcionales de un receptor tales como los dominios quinasa (Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84). El cribado de genotecas de péptidos puede tener valor terapéutico para el descubrimiento de agentes farmacéuticos que estimulen o inhiban la actividad biológica de receptores a través de sus interacciones con el receptor dado.
La identificación de moléculas que son capaces de unirse a la Hu-B1.219 se puede conseguir realizando el cribado de una genoteca de péptidos con la proteína Hu-B1.219 soluble recombinante. Métodos para la expresión y purificación de Hu-B1.219 están descritos en la Sección 5.2, situada más atrás, y se pueden utilizar para expresar una Hu-B1.219 recombinante de longitud completa o fragmentos de Hu-B1.219 dependiendo de los dominios funcionales de interés. Por ejemplo, los dominios de unión al ligando citoplásmicos y extracelulares de Hu-B1.210 se pueden expresar de forma separada y utilizarse para realizar el cribado de genotecas de péptidos.
Para identificar y aislar el péptido/soporte en fase sólida que interacciona y forma un complejo con Hu-B1.219, es necesario marcar o "etiquetar" la molécula de Hu-B1.219. La proteína Hu-B1.219 se puede conjugar con enzimas tales como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano o con otros reactivos tales como marcas fluorescentes que pueden incluir isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) o rodamina. La conjugación de cualquier marca dada con Hu-B1.219 se puede llevar a cabo utilizando técnicas que son rutinarias en la técnica. Alternativamente, se pueden obtener por ingeniería genética vectores de expresión de Hu-B1.219 para expresar una proteína quimérica de Hu-B1.219 que contiene un epítopo para el cual existe un anticuerpo comercialmente disponible. El anticuerpo específico para el epítopo se puede etiquetar utilizando métodos bien conocidos en la técnica que incluyen marcaje con enzimas, colorantes fluorescentes o perlas coloreadas o magnéticas.
El conjugado de Hu-B1.219 "etiquetado" se incuba con la genoteca de péptidos al azar durante de 30 minutos a una hora a 22ºC para permitir la formación del complejo entre Hu-B1.219 y las especies de péptidos de la genoteca. La genoteca se lava luego para retirar cualquier proteína Hu-B1.219 no unida. Si la Hu-B1.219 se ha conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano, la genoteca completa se vierte en una placa Petri que contiene sustratos o para la fosfatasa alcalina o para la peroxidasa, por ejemplo, 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato (BCIP) o 3,3',4',4''-diaminobenzidina (DAB), respectivamente. Después de incubar durante varios minutos, el complejo péptido/fase sólida-Hu-B1.219 cambia de color, y se puede identificar fácilmente y aislar físicamente en un microscopio de disección con un micromanipulador. Si se ha utilizado una molécula de Hu-B1.219 etiquetada fluorescente, los complejos se pueden aislar mediante clasificación fluorescente activada. Si se ha utilizado una proteína Hu-B1.219 quimérica que expresa un epítopo heterólogo, la detección del complejo péptido/Hu-B1.219 se puede conseguir utilizando un anticuerpo específico para el epítopo marcado. Una vez aislado, la identidad del péptido unido al soporte en fase sólida se puede determinar mediante secuenciación del péptido.
Además de utilizar moléculas solubles de Hu-B1.219, en otra realización, es posible detectar péptidos que se unen a receptores de la superficie celular utilizando células intactas. El uso de células intactas se prefiere para el uso con receptores que están formados por multisubunidades o que son lábiles o con receptores que requieren que el dominio lipídico de la membrana celular sea funcional. Métodos para generar líneas celulares que expresan Hu-B1.219 se describen en la Sección 5.3. Las células utilizadas en esta técnica pueden ser células vivas o fijadas. Las células se pueden incubar con la genoteca de péptidos al azar y unirse a ciertos péptidos de la genoteca para formar una "roseta" entre las células diana y el soporte en fase sólida/péptido relevante. La roseta puede aislar después de esto mediante centrifugación diferencial o retirarse físicamente bajo un microscopio de disección.
Como alternativa a los ensayos con células completas para el caso de receptores unidos a membrana o receptores que requieren que el dominio lipídico de la membrana celular sea funcional, las moléculas receptoras se pueden reconstituir en forma de liposomas, donde se puede unir una marca o "etiqueta".
Para la producción de anticuerpos frente a epítopos del receptor Hu-B1.219 producido de forma recombinante se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena única, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. Se prefieren especialmente para el diagnóstico y la terapia los anticuerpos neutralizantes, es decir, aquellos que compiten por el sitio de unión al ligando del receptor.
Los anticuerpos monoclonales que se unen a Hu-B1.219 se pueden marcar radiactivamente permitiendo que se siga su localización y distribución en el cuerpo después de la inyección. Los anticuerpos etiquetados con radioisótopos se pueden utilizar como una herramienta de diagnóstico no invasiva para la obtención de imágenes de células de novo de tumores y metástasis.
También se pueden diseñar inmunotoxinas que dirijan agentes citotóxicos a sitios específicos del cuerpo. Por ejemplo, se pueden formar complejos covalentes entre anticuerpos monoclonales específicos con alta afinidad por Hu-B1.219 y toxinas de bacterias o plantas, tales como la toxina diftérica, abrina o ricina. Un método general de preparación de moléculas híbridas/anticuerpo puede implicar el uso de reactivos de reticulación mediante tioles tales como SPDP, que atacan los grupos amino primarios del anticuerpo y, mediante intercambio de disulfuro, unen la toxina al anticuerpo. Los anticuerpos híbridos se pueden utilizar para eliminar específicamente células tumorales que expresen Hu-B1.219.
Para la producción de anticuerpos, se puede inmunizar diversos animales hospedadores mediante inyección de la proteína Hu-B1.219 que incluyen, pero no se limitan a, conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, incluyendo, pero sin limitarse a, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes potencialmente útiles en seres humanos tales como BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos monoclonales frente a Hu-B1.219 se pueden preparar utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de los hibridomas originalmente descrita por Kohler y Milstein, (Nature, 1975, 256:495-497), la técnica de los hibridomas de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030) y la técnica del hibridoma con el EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96). Además, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrisson et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) mediante el corte y empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de una especificidad apropiada por el antígeno junto con genes de una molécula de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada. Alternativamente, se pueden adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una única cadena (patente de EE.UU. 4.946.778) para producir anticuerpos de una única cadena específicos para Hu-B1.219.
Los fragmentos de anticuerpo que contienen sitios específicos para la unión de Hu-B1.219 se pueden generar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los fragmentos F(ab')_{2} que se pueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula del anticuerpo y los fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. Alternativamente, se pueden construir genotecas de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por Hu-B1.219.
5.6. Usos del polinucleótido de Hu-B1.219
Un polinucleótido de Hu-B1.219 se puede utilizar con propósitos diagnósticos y/o terapéuticos. Para los propósitos diagnósticos, se puede utilizar un polinucleótido de Hu-B1.219 para detectar la expresión del gen Hu-B1.219 o la expresión aberrante del gen Hu-B1.219 en estados clínicos, es decir, leucemia mielógena crónica. Incluidas en el alcance de la invención están secuencias de oligonucleótidos, que incluyen moléculas de RNA y DNA antisentido y ribozimas, que funcionan para inhibir la traducción de un Hu-B1.219.
5.6.1. Usos diagnósticos de un polinucleótido de Hu-B1.219
Un polinucleótido de Hu-B1.219 puede tener numerosos usos para el diagnóstico de enfermedades que son el resultado de una expresión aberrante de Hu-B1.219. Por ejemplo, la secuencia de DNA Hu-B1.219 se puede utilizar en ensayos de hibridación de biopsias o autopsias para diagnosticar anormalidades en la expresión de Hu-B1.219; por ejemplo, análisis por Southern o Northern, incluyendo ensayos de hibridación in situ. Tales técnicas son bien conocidas en la técnica, y de hecho son la base de muchos kits diagnósticos comercialmente disponibles.
5.6.2. Usos terapéuticos de un polinucleótido de Hu-B1.219
Un polinucleótido de Hu-B1.219 puede ser útil en el tratamiento de diversas situaciones anormales. Introduciendo secuencias génicas en células, puede utilizarse terapia génica para tratar situaciones en las que las células no proliferan o no se diferencian con normalidad debido a la subexpresión de Hu-B1.219 normal o a la expresión de Hu-B1.219 anormal/inactiva. En algunos casos, el polinucléotido que codifica una Hu-B1.219 está pensado para reemplazar o actuar en lugar de un gen endógeno funcionalmente deficiente. Alternativamente, pueden tratarse situaciones anormales caracterizadas por una sobreproliferación utilizando las técnicas de terapia génica descritas más adelante.
La proliferación celular anormal es un componente importante de diversos estados clínicos. Los vectores recombinantes para terapia génica, tales como los vectores virales, pueden modificarse por ingeniería genética para expresar formas variantes, incompetentes para la señalización, de Hu-B1.219, que se pueden utilizar para inhibir la actividad de la Hu-B1.219 endógena presente en la naturaleza. Una forma incompetente para la señalización puede ser, por ejemplo, una forma truncada de la proteína que carece de la totalidad o de parte de su dominio de transducción de la señal. Tal forma truncada puede participar en la unión normal a un sustrato pero carecer de actividad de transducción de la señal. Así, pueden utilizarse vectores recombinantes para terapia génica con fines terapéuticos para el tratamiento de enfermedades que son el resultado de la expresión o la actividad aberrantes de una Hu-B1.219. De acuerdo con esto, la invención proporciona un método de inhibir los efectos de la transducción de la señal mediante una proteína Hu-B1.219 endógena en una célula que comprende administrar una molécula de DNA que codifica una forma incompetente para la señalización de la proteína Hu-B1.219 a la célula, de forma que la proteína Hu-B1.219 incompetente para la señalización se produce en la célula y compite con la proteína Hu-B1.219 endógena por el acceso a moléculas de la ruta de señalización de la proteína Hu-B1.219 que activan o son activadas por la proteína Hu-B1.219 endógena.
Puede utilizarse para la administración de Hu-B1.219 recombinante a la población de células diana vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus herpes, o el virus del papiloma bovino. Para construir vectores virales recombinantes que contengan una secuencia de polinucleótidos de Hu-B1.219 se puede utilizar métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica. Veánse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. Alternativamente, se pueden reconstituir moléculas recombinantes de Hu-B1.219 en forma de liposomas para su administración a las células diana.
Las secuencias oligonucleotídicas que incluyen moléculas de RNA y DNA antisentido y ribozimas que funcionan para inhibir la traducción de un mRNA de Hu-B1.219 están dentro de alcance de la invención. Las moléculas de RNA y DNA antisentido actúan para bloquear directamente la traducción del mRNA uniéndose a un mRNA diana e impidiendo la traducción de la proteína. Con respecto a los DNA antisentido, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo entre las regiones -10 y +10 de una secuencia de nucleótidos de Hu-B1.219.
Las ribozimas son moléculas de RNA enzimático capaces de catalizar la escisión específica del RNA. El mecanismo de acción de las ribozimas implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con el RNA diana complementario, seguida de la escisión endonucleolítica. Dentro del alcance de la invención están moléculas de ribozima con motivos de cabeza de martillo modificadas por ingeniería genética que catalizan específica y eficientemente la escisión endonucleolítica de secuencias de RNA de la Hu-B1.219.
Los sitios específicos de escisión por ribozimas dentro de cualquier diana potencial de RNA se identifican inicialmente mediante el escaneo de la molécula diana en busca de sitios de escisión por ribozimas que incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, se pueden evaluar secuencias cortas de RNA de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión, para predecir características estructurales tales como una estructura secundaria que pueda convertir en inadecuada la secuencia oligonucleotídica. La adecuabilidad de los candidatos a diana también se puede evaluar ensayando su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, utilizando ensayos de protección frente a ribonucleasas.
Tanto las moléculas de RNA y DNA antisentido como las ribozimas de la invención se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de RNA. Estos incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos bien conocidas en la técnica tales como, por ejemplo, síntesis química en fase sólida con fosforamidita. Alternativamente, pueden generarse moléculas de RNA mediante la transcripción
in vitro e in vivo de secuencias de DNA que codifican la molécula del RNA antisentido. Tales secuencias de DNA se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores adecuados de RNA polimerasas tales como los promotores de las polimerasas de T7 o SP6. Alternativamente, las construcciones de cDNA antisentido que sinteticen RNA antisentido de forma constitutiva o inducible, dependiendo del promotor utilizado, se pueden introducir de forma estable en líneas celulares.
En las moléculas de DNA pueden introducirse diversas modificaciones como un medio de incrementar la estabilidad intracelular y la semivida. Las modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a, la adición de secuencias flanqueantes de ribo o desoxinucleótidos a los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de uniones fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de uniones de fosfodiesterasas dentro del esqueleto de oligodesoxirribonucleótidos.
Los métodos para introducir polinucleótidos en tales células o tejidos incluyen métodos para la introducción in vitro de polinucleótidos tales como la inserción de un polinucleótido desnudo, es decir, mediante inyección en el tejido, la introducción de un polinucleótido de Hu-B1.219 en una célula ex vivo, es decir, para el uso en la terapia celular autóloga, el uso de un vector tal como un virus, retrovirus, fago o plásmido, etc. o técnicas tales como la electroporación que se pueden utilizar in vivo o ex vivo.
6. Ejemplo
Clonación molecular de un dna complementario de un nuevo receptor de la hematopoyetina 6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Análisis por transferencia tipo Northern
Con el fin de estudiar la expresión del gen Hu-B1.219, se hibridaron transferencias tipo Northern que contenían RNA obtenido de diversos tejidos humanos (Clontech, Palo Alto, CA) con una sonda de DNA marcada radiactivamente de 530 pares de bases (pb) correspondiente a los nucleótidos #578 a 1107 (véase la Figura 2A-2G). Brevemente, las transferencias se prehibridaron a 42ºC durante 3-6 horas en una solución que contenía SSPE 5X, solución de Denhardt 10X, 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón sometido a cizalladura y recién desnaturalizado, formamida al 50% (recién desionizada), y SDS al 2%. La sonda marcada radiactivamente se desnaturalizó por calor y se añadió a la mezcla de prehibridación y se dejó que hibridara a 42ºC durante 18-24 horas con agitación constante. Las transferencias se lavaron en SSC 2X, SDS al 0,05% varias veces a temperatura ambiente antes de transferirlas a una solución de lavado que contenía SSC 0,1X, SDS al 0,1% y se agitaron a 50ºC durante 40 minutos. Las transferencias se cubrieron luego con una envoltura de plástico, se colocaron sobre papel Whatman y se expusieron a una película de rayos X a -70ºC utilizando una pantalla intensificadora.
6.1.2. Transcripción inversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT/PCR)
Se aisló RNA total utilizando procedimientos estándar de laboratorio (Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Se sometió a transcripción inversa aproximadamente 1 \mug de RNA total y se amplificó el cDNA mediante PCR (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Las condiciones de amplificación por PCR fueron las mismas para el análisis de la expresión de la Hu-B1.219 y de la Forma 1. Fueron: 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos durante un total de 40 ciclos. Los productos amplificados (224 pb en el caso de Hu-B1.219 y 816 pb en el caso de la Forma 1) se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los amplímeros de la Hu-B1.219 fueron GGTTTGCATATGGAAGTC (superior) y CCTGAACCATCCAGTCTCT (inferior). Los amplímeros específicos para la Forma 1 fueron GACTCATTGTGCAGTGTTCAG (superior) y TAGTGGAGGGAGGGTCAGCAG (inferior). El amplímero superior fue compartido de manera común por las 3 formas, mientras que el amplímero inferior era específico para la Forma 1.
6.2. Resultados
Se aislaron numerosos clones de cDNA de una genoteca de cDNA de hígado de feto humano (Clontech, Palo Alto, CA) y se determinaron las secuencias del DNA de varios de estos clones. Estos clones (Hu-B1.219 #4, #33, #34, #1, #36, #8, #55, #60, #3, #57, #62) contenían secuencias solapantes, que se compilaron luego en una secuencia de nucleótidos contiguos. Tanto la secuencia del cDNA como la secuencia predicha para la proteína a partir del cDNA se muestran en la Figura 2A-2G. Esta secuencia de cDNA contiene dos dominios FN III, que contienen cada uno una "caja WS", que son características de los genes de la familia del HR. Sin embargo, la secuencia de Hu-B1.219 no es idéntica a ningún gen conocido. Así, este cDNA representa un nuevo miembro de la familia de genes HR, al que se hace referencia en la presente memoria como Hu-B1.219 (Tabla 1).
TABLA 1 Tamaños del dominio FN III de genes de receptores de citoquinas (pb)
Gen Hombre Ratón Rata
Hu-B1.219(5') 273
Hu-B1.219(3') 282
IL-2R\beta 291 288 291
IL-2R\gamma 273
IL-3R\alpha 246 252
IL-3R\betaAic2a 306 y 273
IL-3R\betaAic2b 306 y 282 303 y 276
IL-4R 294 291
IL-5R\alpha 276 273
IL-6R 288 285
gp130 288 291 288
IL-7R 294
IL-9R 321 321
mpl 270
G-CSFR 300 297
GM-CSFR 288
CNTFR 282 285
PRLR 288
EPOR 288 285 288
LIFR-1 321 y 297
Basándose en la secuencia del Hu-B1.219 que se presenta en la Figura 2A-2G, el sitio de iniciación de la traducción aparece en la posición #97. La secuencia codifica un marco abierto de lectura hasta el nucleótido #2970 inclusive. Se cree que la secuencia entre los nucleótidos #2614 y #2691 codifica un dominio transmembrana. La secuencia completa codifica una proteína de 958 aminoácidos.
Sin embargo, la secuencia de la Figura 2A-2G representa sólo una forma de la secuencia del cDNA del Hu-B1.219, a la que se hace referencia en la presente memoria como Forma 1. Esto es porque se descubrieron clones adicionales de lambda que contenía secuencias diferentes cerca del extremo 3' conocidas como Forma 2 y Forma 3. Estas tres formas contienen todas ellas idéntica secuencia hasta el nucleótido #2770 inclusive, luego divergen en el nucleótido #2771 y más allá (Figura 3A). En la Figura 3B se muestra un alineamiento de las secuencias deducidas de aminoácidos de las tres formas correspondientes al extremo 3' desde #2771 hasta un codón de parada. Dos de los clones de lambda aislados originalmente, #36 y #8, contienen las secuencias del extremo 3' de la Forma 1 y la Forma 2, respectivamente. Estas tres formas de Hu-B1.219 pueden derivar de un mRNA precursor común mediante un mecanismo de corte y empalme alternativo.
Es digno de mención que la secuencia de DNA de la Forma 1 desde el nucleótido #2771 hasta el final es idéntica en un 98% a la secuencia de un retrotransposón humano que se cree que deriva de una secuencia de DNA endógeno humano de un retrovirus (Singer, 1982, Cell 28:433; Weiner et al., 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:631; Lower et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4480). Con el fin de examinar la expresión de las diferentes formas de cDNA, se llevó a cabo RT/PCR utilizando varias líneas celulares humanas. Los resultados de la Tabla 2 muestran que la Forma 1 se expresaba como RNA en células K-562 y en una preparación de cDNA de hígado de feto humano. Puesto que Hu-B1.219 se clonó a partir de una genoteca de cDNA de hígado de feto humano, esto sirvió como control positivo. Sin embargo, en lo que respecta a otras varias líneas celulares humanas, la Forma 1 no se detectó, aunque la expresión de Hu-B1.219 era positiva. Por ejemplo, la Forma 1 no se expresaba en células KG1a, pero se expresaba la Forma 3. Así, es posible que estas tres formas de Hu-B1.219 no se expresen simultáneamente en las mismas células. Puede haber una expresión selectiva de ciertas formas en poblaciones concretas de células.
TABLA 2 Análisis por RT/PCR de la expresión de Hu-B1.219
Líneas celulares Hu-B1.219* Forma 1\Delta Forma 3\Delta
MRC5 (fibroblasto de pulmón) ++ +/- +
KG1a (linfoblasto) + - ++
Raji (linfoma de células B) + - +
Kit 225/K6 (célula T) +++ - +
K562 (leucemia mielógena) ++++ +++ ++++
Hígado de feto humano (control positivo) +++ +++ +++
* - Análisis por transferencias tipo Northern
\Delta - Análisis por RT/PCR
Se estudió el RNA de diversos tejidos humanos con un fragmento de Hu-B1.219 marcado radiactivamente correspondiente a los números de nucleótidos del #578 al #1107 como se describe en la Figura 2A-2G para los análisis por transferencia tipo Northern. Se detectaron dos mRNA de tamaños diferentes. Este resultado sugiere que puede haber otro gen homólogo o que hay corte y empalme alternativo de un único transcrito de RNA. La expresión de Hu-B1.210 fue con mucho la más fuerte en tejidos de feto humano, particularmente el hígado y el pulmón. Se encontraron niveles traza en varios tejidos de adulto. De forma interesante, una línea celular de leucemia mielógena crónica, K562, era fuertemente positiva para esta expresión, mientras que se detectó algo de expresión también en células A549, una línea celular de carcinoma de pulmón (Tabla 3).
TABLA 3 Resumen del análisis por transferencia tipo Northern de la expresión del gen Hu-B1.219
Tejidos humanos/líneas celulares Expresión
Feto Cerebro -
Pulmón +++
Hígado +++++
Riñón +
Adulto Corazón +
Cerebro -
Placenta +/-
Pulmón +
Hígado +
Músculo esquelético -
Riñón +/-
Páncreas -
Bazo -
Timo -
Próstata -
Testículo -
Ovario +
Intestino delgado -
Colon -
Leucocitos de sangre periférica -
TABLA 3 (continuación)
Tejidos humanos/líneas celulares Expresión
Cáncer HL-60 -
HeLa -
K-562 +++
MOLT-4 -
Raji -
SW480 -
A549 +
G361 -
Tomándolos en conjunto, los datos indican que el clon de cDNA Hu-B1.219 representa un nuevo miembro de la familia del receptor de la hematopoyetina humana. Un resumen de los datos que apoyan esta conclusión es el siguiente:
1. Las secuencias del DNA y de la proteína de Hu-B1.219 no coinciden por completo con ninguna secuencia conocida en las correspondientes bases de datos informáticas.
2. Hu-B1.219 comparte cierta homología en la secuencia de DNA con la IL-6R y la IL-4R.
3. Comparte cierta homología en la proteína con G-CSFR, IL-6R, la cadena beta de IL-3R, gp130, IL-12R y LIFR.
4. Contiene dos motivos de "caja WS" con el espaciamiento correcto de aminoácidos conservados en los dominios FN III (véase la Figura 4).
5. Contiene una secuencia anfipática en el bloque 3 de los dominios FN III (véase la Figura 5).
6. Contiene aminoácidos hidrófobos y básicos alternantes en el bloque 6 de los dominios FN III (véase la 
\hbox{Figura 6).}
7. Contiene cisteínas conservadas en estas regiones ricas en cisteínas situadas aguas arriba con respecto a los dominios FN III.
8. Se clonó originalmente de un tejido hematopoyético, hígado de feto.
9. Es expresado por ciertos tejidos fetales.
7. Depósito de microorganismos
Los siguientes organismos fueron depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC: American Type Culture Collection), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.
Denominación de la estirpe N^{o} de Acceso
HuB1.219, #1 75885
HuB1.219, #4 75886
HuB1.219, #8 75887
HuB1.219, #33 75888
HuB1.219, #34 75889
HuB1.219, #36 75890
HuB1.219, #55 75971
HuB1.219, #60 75973
HuB1.219, #3 75970
HuB1.219, #57 75972
HuB1.219, #62 75974
La presente invención no se ha de limitar en el alcance por las realizaciones ejemplificadas, que están pensadas como ilustraciones de aspectos individuales de la invención. A decir verdad, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente memoria serán aparentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos que la acompañan. Tales modificaciones está previsto que caigan dentro del alcance las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones citadas en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad.
<110> Progenitor, Inc.
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<120> Hu-B1.219, UN NUEVO RECEPTOR HUMANO DE LA HEMATOPOYETINA
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<130> 13718EP PNN 125 ND
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<140> EP 95931007.9
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<141> 30-08-1995
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<150> PCT/US95/10965
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<151> 30-08-1995
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/355,888
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<151> 14-12-1994
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<160> 33
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<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> SITIO
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<222> 3
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<223> Xaa = cualquier aminoácido
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<400> 1
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\sa{Trp Ser Xaa Trp Ser}
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<210> 2
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggtttgcata tggaagtc 
\hfill
18 
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<210> 3
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<211>19
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
cctgaaccat ccagtctct 
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19 
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<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
gactcattgt gcagtgttca g 
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21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagtggaggg agggtcagca g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2991
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(2991)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3
4
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Ala Thr Gln Val Pro Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ile Ser Ala}
\sac{Phe Gly Arg Val Gly Pro Pro Asp Gin Gly Val Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
6
7
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Lys Lys Lys Lye}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) ... (241)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210>11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Lys Lye Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) ... (130)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Asn Phe Gln Lys Lys Met Pro Gly Thr Lys Glu Leu Leu Gly}
\sac{Gly Gly Trp Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Met Leu Val Lys Leu Arg Pro Thr Ser Cys Ala Pro Ala Leu Pro}
\sac{Glu Val Cys Thr Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) ... (127)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211>11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Asn Phe Gin Lys Arg Thr Asp Ile Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Ile Met Ile Thr Thr Asp Glu Pro Asn Val Pro Thr Ser Gln}
\sac{Gln Ser Ile Glu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ile Phe Thr Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Tyr Leu Glu Phe Glu Ala Arg Arg Arg Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211>13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211>13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp His Cys Phe Asn Tyr Glu Leu Lys Ile Tyr Ann Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Thr His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Phe Pro Leu Gin Tyr Gln Val Lys Tyr Gln Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211>15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Val Lys Ala Gln Arg Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ser Lys Tyr Asp Val Gln Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211>15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Val Tyr Ala Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 906
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
13
14
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 896
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
16
17
18

Claims (35)

1. Un polinucleótido aislado que comprende:
(a)
nucleótidos #97 a #2770 de SEQ ID NO: 6;
(b)
una secuencia de nucleótidos que es complementaria a (a); o
(c)
una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con (a) o (b).
2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, que comprende (a) o (b).
3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #2771 a #2970 de SEQ ID NO: 6.
4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #2771 a #2991 de SEQ ID NO: 6.
5. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #21 a #64 de SEQ ID NO: 13.
6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #21 a #130 de SEQ ID NO: 13.
7. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #21 a #34 de SEQ ID NO: 16.
8. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #21 a #100 de SEQ ID NO: 16.
9. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #21 a #118 de SEQ ID NO: 16
10. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (a) incluye además en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #21 a #127 de SEQ ID NO: 16.
11. Un polinucleótido aislado que comprende:
(a)
una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos #97 a #2613 de SEQ ID NO: 6; o
(b)
una secuencia de nucleótidos que es complementaria a (a).
12. Un polinucleótido aislado de la reivindicación 11, que codifica un receptor.
13. Un polinucleótido aislado de la reivindicación 11, que codifica el dominio extracelular de un receptor.
14. Un receptor aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos #3 a #893 de SEQ ID NO: 8.
15. El receptor de la reivindicación 14, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos #3 a #960 de SEQ ID NO: 8.
16. El receptor de la reivindicación 14, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 32.
17. El receptor de la reivindicación 14, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 33.
18. Un receptor aislado que comprende:
(a)
una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos #3 a #841 de SEQ ID NO: 8;
(b)
SEQ ID NO: 25;
(c)
SEQ ID NO: 30; o
(d)
SEQ ID NO: 31.
19. El receptor aislado de la reivindicación 18, que es un receptor soluble.
20. El receptor aislado de la reivindicación 18, que es el dominio extracelular del receptor.
21. Una proteína de fusión que comprende el receptor de una cualquiera de las reivindicaciones 14-20, que está fusionado con otro polipéptido.
22. El receptor de la reivindicación 21, en el que el receptor está fusionado con la región constante de una inmunoglobulina.
23. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor de una cualquiera de las reivindicaciones 14-22.
24. Un vector de expresión para expresar un receptor que comprende un primer polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende el polinucleótido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 ó 23, en el que el primer polinucleótido está en asociación operativa con un segundo polinucleótido que controla la expresión del primer polinucleótido.
25. Una célula hospedadora modificada por ingeniería genética que comprende el vector de expresión de la reivindicación 24, o una progenie suya.
26. Una célula hospedadora o progenie de la reivindicación 25, que es un procariota.
27. Una célula hospedadora o progenie de la reivindicación 25, que es un eucariota.
28. Un método para producir un receptor, que comprende:
(a)
cultivar la célula hospedadora o progenie de la reivindicación 25 en condiciones en las que se exprese el receptor; y
(b)
recuperar el receptor de las células en cultivo o del medio de cultivo.
29. Un anticuerpo o un fragmento suyo que se une al receptor de cualquiera de las reivindicaciones 14-22.
30. El anticuerpo de la reivindicación 29, que es una cadena polipeptídica única.
31. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 29, que es un fragmento Fab, F(ab') o F(ab')_{2}.
32. El anticuerpo de la reivindicación 29, que es un anticuerpo policlonal.
33. El anticuerpo de la reivindicación 29, que es un anticuerpo monoclonal.
34. Un método para identificar un compuesto que se une a un receptor, que comprende las etapas de:
(a)
poner en contacto un receptor según una cualquiera de las reivindicaciones 14-22 con un compuesto;
(b)
determinar si el compuesto se une al receptor; y
(c)
determinar la identidad del compuesto.
35. Un método para identificar un compuesto que se une a un receptor, que comprende las etapas de:
(a)
poner en contacto una célula hospedadora modificada por ingeniería genética o progenie según la reivindicación 25 con un compuesto;
(b)
aislar un complejo célula-compuesto; y
(c)
determinar la identidad del compuesto unido.
ES95931007T 1994-09-14 1995-08-30 Hu-b1.219, un nuevo receptor humano de la hematopoyetina. Expired - Lifetime ES2242960T3 (es)

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US306231 1994-09-14
US355888 1994-12-14
US08/355,888 US5763211A (en) 1994-09-14 1994-12-14 Isolated nucleic acid encoding Hu-B1.219, a novel human hematopoietin

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