ES2198496T3 - Procedimiento para analisis in vitro de sustancias toxicas y alergenicas. - Google Patents

Procedimiento para analisis in vitro de sustancias toxicas y alergenicas.

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ES2198496T3 ES96925215T ES96925215T ES2198496T3 ES 2198496 T3 ES2198496 T3 ES 2198496T3 ES 96925215 T ES96925215 T ES 96925215T ES 96925215 T ES96925215 T ES 96925215T ES 2198496 T3 ES2198496 T3 ES 2198496T3
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Abstract

LA INVENCION HACE REFERENCIA A UN PROCESO PARA LA EVALUACION IN VITRO DE SUSTANCIAS POTENCIALMENTE ALERGENICAS O IRRITANTES PARA LOS TEJIDOS, CARACTERIZADO EN QUE SE CULTIVAN CELULAS SANGUINEAS EN PRESENCIA DE DILUCIONES SERIE DE LA SUSTANCIA, CON LO QUE SE DILUYE EN SERIE LA MAXIMA CONCENTRACION DE LA SUSTANCIA NO TOXICA PARA LAS CELULAS, SE MIDE LA PROLIFERACION DE CELULAS Y SE MIDE LA PRESENCIA DE CITOCINAS; LA PRESENCIA DE UNA O MAS DE LAS CITOCINAS DE ALARMA DE LA CLASE 0 ES SOLO UNA INDICACION DEL DAÑO DEL TEJIDO Y DE LOS EFECTOS TOXICOS QUIMICOS; LA PRESENCIA DE UNA O MAS CITOCINAS DE ALARMA DE LA CLASE 0 Y POSIBLEMENTE DE UNA O MAS CITOCINAS DE LA CLASE IV, PERO NO DE NEOPTERINA, ES UNA INDICACION DE HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO RETARDADO, POR EJEMPLO, INMUNIDAD CELULAR, ALERGIA RETARDADA Y ECCEMA DE CONTACTO, Y LA PRESENCIA DE UNA O MAS CITOCINAS DE ALARMA DE LA CLASE 0 Y AL MENOS NEOPTERINA Y POSIBLEMENTE UNA O MAS CITOCINAS DE LA CLASE I ES UNA INDICACION DE HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO INMEDIATO, POR EJEMPLO, ASMA, FIEBRE DEL HENO, URTICARIA Y RINITIS. LA INVENCION TAMBIEN HACE REFERENCIA AL USO DE NEOPTERINA E IL - 8 COMO SUSTANCIAS ANALITICAS PARA DISTINGUIR ENTRE LAS REACCIONES INMUNES TIPO I Y IV Y UN KIT PARA ANALISIS.

Description

Un procedimiento para análisis in vitro de sustancias tóxicas y alergénicas.
La presente invención se refiere a un procedimiento para análisis in vitro de sustancias tóxicas y alergénicas. Se analizan, en cuanto a reacciones adversas, sustancias destinadas a su utilización como productos farmacéuticos, aditivos de alimentos, productos cosméticos o higiénicos, productos químicos industriales y otras sustancias. Estas reacciones pueden ser reacciones alérgicas, efectos de irritación de la piel y efectos tóxicos.
Actualmente, estos ensayos se llevan a cabo in vivo utilizando animales. Los animales son caros de conseguir y de mantener. Además, algunos ensayos pueden conllevar sufrimiento para los animales.
La presente invención proporciona un procedimiento para análisis in vitro de los efectos adversos de sustancias. Los análisis de las sustancias se llevan a cabo sobre células sanguíneas de animales de sangre caliente. No se emplean animales experimentales ya que las sustancias se ensayan en células humanas, es decir, células de la misma especie que se va a tratar. Algunas sustancias pueden no tener el mismo efecto sobre especies diferentes, y los ensayos realizados en animales pueden llevar a resultados falsos. Por lo tanto, el ensayo se realiza preferiblemente con sangre humana.
Según esto, el método se ofrece como una alternativa a los ensayos sobre animales para aditivos de alimentos, productos cosméticos o higiénicos, productos químicos industriales, fármacos y otras sustancias donde han de evitarse reacciones adversas.
La evaluación in vitro de efectos tóxicos sobre el sistema inmune ha sido ensayado sobre esplenocitos de ratón ("Evaluación in vitro de efectos tóxicos inducidos por fármaco sobre el sistema inmune comprobados por ensayos de proliferación y producción de citocinas", M. Pallardy y col. Eur. Cytokine Net., Vol. 2 No. 3, mayo-junio 1991, páginas 201-206). El método era muy poco eficaz para detectar moléculas que inducen autoinmunidad e hipersensibilidad.
La Patente estadounidense 5.439.799 describe un método utilizado en la determinación de una citocina, neopterina, en fluidos corporales. Larsen y col. en "La reacción de hipersensibilidad tipo retardado es dependiente de IL-8. La inhibición de la reacción de la piel a tuberculina por un anticuerpo monoclonal anti-IL-8" (J. Inmunol. (Estados Unidos) 15 de agosto, 1995 (4) p. 2151-7, información que desaparece en la descripción garantizada), describe el papel de IL-8 en la reacción de tuberculina en la piel de conejos. Ninguna de estas publicaciones se refiere, sin embargo, al análisis de citocinas desarrolladas durante el contacto con sustancias que se ensayan para distinguir entre los diferentes tipos de reacciones inmunológicas adversas.
Ha resultado ahora que según la presente invención es posible analizar reacciones de tejidos adversas a sustancias extrañas in vitro por cultivo de las mismas con sangre humana completa, evitando la coagulación y analizando la citocina producida por las células humanas.
Antes de haber puesto en uso una sustancia y antes de que el grupo objetivo haya sido expuesto, el presente método ofrece la posibilidad de predecir si existe riesgo de reacciones adversas del tipo inflamatorio o alérgico.
La invención proporciona una clave interpretativa para la evaluación de reacciones de tejidos adversas a sustancias extrañas.
Compendio de la invención
El método se define en la reivindicación 1 y se basa en el cultivo in vitro de células de la sangre. La sustancia que se evalúa se añade al cultivo de sangre. Si las células reactivas de la sangre reconocen al material de ensayo como extraño o dañino, tiene lugar la producción de sustancias de señal inflamatoria, citocinas. La sangre contiene diferentes células blancas con diferentes funciones en respuesta a las sustancias extrañas. Los diferentes tipos de células inflamatorias secretan diferentes repertorios de citocinas. Los modelos (perfiles) de las citocinas secretadas indican cual es el compartimento del sistema inmune que ha sido activado. Por lo tanto, es posible también predecir la clase de reacción adversa que se puede esperar de una sustancia si se administra a humanos o animales experimentales. Algunas sustancias inducirán un perfil de citocinas típico que conduce al sistema inmune a una alergia mediada por IgE, indicando así un potencial de estas sustancias para provocar asma, fiebre del heno y urticaria. Otras sustancias inducirán un modelo de citocina que conduce al sistema inmune a inmunidad celular teniendo así el potencial de provocar un eccema de contacto como reacción adversa. Por último, resultará un efecto químico o tóxico de un modelo de citocina típico de reacciones de alarma vistas en lesiones de tejidos y operaciones. Según esto, el concepto en que se basa el presente método es el de utilizar una interpretación del modelo de citocina que puede inducir una sustancia en células de sangre in vitro para predecir si la sustancia tiene el potencial de causar alergia de diferentes tipos o es en general peligrosa para inducir daños de tejidos o efectos tóxicos.
Los autores clasifican las reacciones de tejidos adversas a sustancias extrañas como sigue.
Clase 0
Daño a tejido. Daño de producto químico no específico, daño mecánico o daño físico.
Clase I
Reacción inmune alérgica tipo I. Se conoce también como hipersensibilidad tipo inmediato y está mediada por anticuerpos IgE producidos específicamente ante una sustancia extraña. Se produce una reacción inflamatoria aguda, frecuentemente se produce histamina y ejemplos de síntomas son asma, fiebre del heno, urticaria y rinitis. Este tipo requiere que la sustancia pueda inducir una respuesta inmune completamente madura cuando participan todos los componentes del sistema inmune. Esto se considera también como reacción inmune de etapa final.
Clase IV
Reacción inmune inflamatoria tipo IV. Esta, que se conoce también como hipersensibilidad tipo retardado y está mediada por linfocitos T sensibilizados tipo TH-1, está considerada como una reacción inmune tipo primera etapa. La dermatitis de contacto alérgica es un ejemplo de este tipo de reacción.
Clase 0
Es la propia clasificación de los autores referente a daños no específicos al sistema inmune. Para la Clase I y la Clase IV véase ``Immunology'' por Ivan Roitt, Jonathan Brostoff y David Male, Gower Medical Publishing London - Nueva York, 1989, página 19,1-19,20 y 22,1-22,10
En el presente trabajo han sido identificados tres principales tipos de perfiles de citocinas.
Tipo Clase 0
Secreción de citocinas de alarma que indican daño en tejido conjuntivo, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales y células blancas de la sangre inflamatorias inespecíficas. Los miembros de este grupo son IL-1, IL-6, IL-12 y TNF.
Tipo Clase I
Secreción de citocinas de un tipo de respuesta inmune de linfocitos y células inflamatorias. Estas incluyen citocinas de Clase 0 y además IFN-gamma, neopterina, IL-2 e IL-10. Teóricamente, como se conoce por los estudios sobre animales in vivo, también se producirían aquí IL-4 e IL-5, pero estas sustancias son muy difíciles de determinar y no se incluyen por tanto en la rutina del protocolo de ensayo de los autores.
Tipo Clase IV
Secreción de las citocinas de Clase 0 tipo inespecífico y en adición IL-2, IL-8, IL-10 y IFN-gamma.
Un hallazgo que no podía ser predecido era que la respuesta inmune Clase I tipo final completa conduce a producción de neopterina mientras que la respuesta inmune tipo primario de Clase IV no estimula el sistema inmune tanto tiempo como para producir neopterina.
En los tres grupos de citocinas enumerados antes solo se da la lista de miembros representativos preferiblemente seleccionados. Los grupos pueden contener otras citocinas para ser utilizadas y la patente reivindica la utilización del análisis de todas las sustancias enumeradas en Cytokine Facts Book, Eds Callard R.E. y Gearing, A.J.H., Academic Press 1994 y futuros trabajos actualizados para predecir el grado de madurez de la respuesta que una sustancia puede provocar. Actualmente 50 sustancias.
Interleucinas
IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15
Otras citocinas (en orden alfabético)
BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, G-CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, \gammaLP-10, IFN- \alpha, IFN\beta, IFN\gamma, LIF, LT/TNF\beta, MCR-1, 2 y 3, M-CSF, MIF, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PDGF, PF-4, RANTES, SCF, TGF\alpha, TGF\beta, TNF\alpha, Tpo, VEGF.
Según la invención, la presencia de reacción inmune inflamatoria tipo IV se analiza preferiblemente utilizando IL-8. Esto es porque IL-8 se ha desarrollado y está presente en niveles elevados durante reacciones tipo IV.
El hecho de que la neopterina esté presente en cantidades más altas cuando se trata de reacción tipo I, permite que se pueda especialmente utilizar IL-8 y/o neopterina para distinguir entre el tipo IV de reacción inmune inflamatoria y tipo I de reacción inmune alérgica.
Basándose en el resultado del ensayo in vitro, el modelo de citocina inducido por la substancia bajo investigación, se hará una predicción respecto al potencial de la sustancia para causar reacción adversa si humanos o animales se exponen a ella. Se utiliza sangre completa, preferiblemente sangre venosa. Se previene la no coagulación de la sangre. Esto se puede hacer utilizando tubos de heparina libre de endotoxina. Se pueden utilizar también otros métodos tales como adición de EDTA o citrato. Alternativamente la sangre se puede agitar por sacudida con bolas de vidrio.
Los conteos de leucocitos en sangre sin diluir varían entre 3x10^{9} y 7x10^{9} por litro. Alrededor de un 30% de estos son linfocitos y 5-10% son monocitos, siendo el resto células polimorfonucleares. El número total de leucocitos y conteo diferencial se determina en un analizador de hematología Coulter de célula STKS antes de proceso posterior.
La sangre completa se diluye formando una serie de 1:1 1:1000, preferiblemente 1:2 -1:100 en un medio de cultivo, preferiblemente un medio de cultivo de tejido tal como RPMI 1640 suplementado con glutamina. Normalmente, se utiliza 1,5-5 mM, preferiblemente 2 mM. La sangre se diluye como caso más frecuente a 1:5, 1:10, 1:20 o se continúa con 1:40, 1:80, 1:100.
Preferiblemente se añaden antibióticos para evitar el crecimiento de microorganismos indeseados. Se puede añadir penicilina y estreptomicina a concentraciones de 25-100U/ml preferiblemente 50U/ml.
Se pueden utilizar mitógenos o sustancias con efectos conocidos sobre el sistema inmune como controles positivos para obtener mejores resultados. Se puede emplear un mitógeno como se menciona en Daniel P. Stites en Clinical Laboratory Methods for Detection of Antigens & Antibodies in. Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos California, 1984. Se emplea preferiblemente fitohemaglutinina (PHA-L) disuelta en el medio a una concentración final en los pocillos de 250 \mug por ml.
El ensayo se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo en tubos o preferiblemente en pocillos de placas de microvaloración.
Para provocar la producción de citocina in vitro, la concentración de células tiene importancia crítica. Si el ensayo se realiza solamente a una concentración de células, solo se detectarán óptimamente algunas de las citocinas de interés. Si se utilizan series de concentraciones de células, quedará revelado el cuadro completo del modelo de citocina predicho antes en "Compendio de la invención".
Para ensayar las sustancias en cuanto a los efectos en el sistema, se añaden concentraciones diferentes a la sangre. La concentración más alta de la sustancia que no es tóxica para las células indicada por el examen al microscopio empleando tinción vital, por ejemplo azul de tripano, se utiliza como concentración inicial. La dilución en serie de la sustancia se lleva a cabo entonces a una dilución de al menos 1:1000 y preferiblemente descendiendo a 1:10000. 1:100000 ó 1:1 000 000.
En los casos en que la sustancia se diluye en RPMI 1640 el control apropiado es medio únicamente. Cuando se emplean otros diluyentes, se utilizan controles del diluyente apropiado a las correspondientes concentraciones.
Las vasijas se incuban a 25-40ºC, preferiblemente a 37ºC a una humedad de 50-95%, preferiblemente 90% y preferiblemente en presencia de 2-15% de CO_{2}, preferiblemente 5%. Se prepara un número apropiado de tubos o de placas de microvaloración y se sacan a intervalos de la incubadora para su ensayo. Los intervalos de tiempo normalizados son de 1 hora, hasta 10 días; preferiblemente de 1 hora 1 día, 2 días y 4-6 días.
El ensayo de proliferación se puede llevar a cabo como sigue. Se utiliza un juego de placas para estimar la actividad proliferativa de las células de donante espontáneamente (=medio) o controles de disolvente de sustancia, en respuesta a mitógenos y en respuesta a muestras de sustancias de ensayo a varias concentraciones. Esto puede hacerse como sigue o por cualquier otro método adecuado. Las placas se ensayan a intervalos de tiempo, y a cada pocillo de la placa se añade precursor de ácido nucleico marcado tal como ^{3}H-timidina disuelta en el medio. Las placas se incubaron durante 4 horas adicionales a 37ºC en cuanto a incorporación de precursor de ácido nucleico marcado. Las células se recogieron entonces utilizando un colector de células Skatron (Skatron, Lier, Norway) y filtros de papel Titertek o cualquier otro método adecuado. El resultado de este procedimiento es que el ADN de las células es captado por el papel de filtro, mientras que la ^{3}H-timidina no incorporada al ADN pasa a través del filtro y se va con el agua residual de lavado. La radioactividad de los papeles de filtro es así proporcional a la síntesis de ADN que tiene lugar durante las cuatro horas precedentes al proceso de recolección. La radiactividad de los papeles de filtro se determina en un contador de centelleo de líquidos Packard, y la incorporación de timidina se expresa como conteos por minuto (cpm). La radiactividad o cualquier otro marcador del precursor se puede medir en el ADN recogido por cualquier otra vía mecánica o química y medirse por un instrumento isotópico o químico adecuado.
Ensayo de citocinas
Se prepara otro juego de placas con el mismo diseño que el anterior "Protocolo de Cultivo". Aquí también, las placas se sacan de la incubadora a intervalos regulares de tiempo, y se liberan las citocinas de las células cultivadas en los sobrenadantes obtenidos después de centrifugación de las placas a 650 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se pueden ensayar inmediatamente o almacenarse a -20ºC hasta el ensayo. Para las determinaciones de citocinas, se utilizan estuches (kits) de diagnóstico de diversas fuentes. En la Patente se reivindica este procedimiento utilizando cualquier ensayo de los que ya se dispone o de nueva construcción que utilice determinación cuantitativa de citocina incluyendo bioensayos, inmunoensayos o ensayos químicos u otros.
Se siguen las instrucciones del fabricante. Todos estos ensayos son inmunoensayos con enzima (EIA). El principio consiste en que los pocillos de la placa de microvaloración se marcan con un anticuerpo de captura específica de citocina. Si la citocina está presente en las muestras añadidas a los pocillos ésta será capturada por el fondo del pocillos. Para determinar cuantitativamente la cantidad de citocina que ha sido capturada se añade a los pocillos un segundo anticuerpo marcado con una enzima. Se mide después la reacción como color desarrollado después de la adición de substrato para la enzima. Los valores de los pocillos de ensayo se comparan con curvas normalizadas obtenidas a partir de una serie de cantidades conocidas de citocina. Los valores para los pocillos control, sin sustancia añadida a las células, se emplean como niveles de referencia para los ensayos. Cuando se obtienen valores por encima de 2 SD de la variación se registran indicaciones positivas.
La invención se refiere también a un estuche de equipo que comprende uno o más reactivos que reconocen las citocinas de alarma de la clase cero y/o las citocinas del tipo Clase I y/o las citocinas de Clase IV. Ejemplos de estas citocinas se mencionan en los dos últimos párrafos de la página 4 y en el primer párrafo de la página 5. Se prefieren los reactivos que reaccionan a la presencia de neopterina e IL-8.
Estos reactivos pueden ser anticuerpos o cualquier otro reactivo que sea sensible a estas sustancias. Los reactivos pueden ir sobre un soporte tal como una tira, placas de valoración, placas de microvaloración, placas de ELISA, tubos de ensayo, etc. Los soportes pueden ser de tamaños diferentes. El material del soporte puede ser un material sólido o semisólido que no interfiera con la reacción entre el reactivo y la citocina. El soporte puede tomar diversidad de formas y composiciones, incluyendo micropartículas, perlas, tiras y membranas porosas e impermeables, la superficie interior de los recipientes de reacción tales como tubos de ensayo y placas de microvaloración, y similares. Las placas de microvaloración y perlas pueden ser de plástico, tal como polímeros de estireno o acrílicos, o vidrio. Se puede emplear nitrocelulosa, preferiblemente en la forma de filtros, tiras o discos. Los medios de unir la pareja de reacción deseada a un soporte sólido seleccionado será una cuestión de rutina para cualquier especialista en la técnica. Es posible también utilizar citómetro de flujo.
La invención se describirá ahora con más detalle con los siguientes ejemplos no-limitativos.
Ejemplo Donantes de sangre y recogida de sangre
Se emplearon cinco donantes de sangre sanos de ambos sexos de edades comprendidas entre los 25 y los 55 años. La sangre se recogió por punción venosa en tubos de heparina libre de endotoxina (Coatech, LJungby, Suecia) conteniendo 120 UI de heparina y se llenaron con 4 ml de sangre. No se permitió en ninguno de los donantes de sangre una historia de alergia o eccema atópico o indicación alguna de tener enfermedad de ninguna clase.
Análisis de células
Se midieron los conteos de células blancas de la sangre totales y diferenciales con un equipo Coulter STKS. Los cinco donantes tuvieron conteos totales de células blancas de la sangre de 9,8; 7,1; 9,8; 6,9; 5,8.10^{9}/1
Protocolo de cultivo
Se diluye la sangre completa en una serie 1:2, 1:3, 1:20, 1:4, y 1:10 en medio de cultivo de tejidos, RPMI 1640 suplementado con glutamina 2 mM, 50U/ml de penicilina y 50Ug/ml de estreptomicina. Se añaden 100 \mul de sangre a los pocillos de placas de microvaloración Nunclon. Se disuelve el mitógeno fitohemaglutinina (PHA-L) (L-4144, Sigma St Louis EEUU) en RPMI 1640 y se añaden 50 \mul de la solución a los pocillos de manera que se alcanza una cantidad final de 25 \mug por pocillo.
Para el ensayo de las sustancias en cuanto a los efectos en el sistema, se añaden diferentes concentraciones a la sangre. La concentración más alta de la sustancia que no es tóxica para las células, indicada por su exámen al microscopio con tinción vital, por ejemplo azul de tripano, se utiliza como la concentración inicial. Se emplean las siguientes sustancias y concentraciones:
0 = Triton x 100 a concentraciones de 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000, 1:32000, 1:64000, 1:128000
IV = NiCl_{2}, 100 \mug, 10 \mug, 1 \mug, 0,1 \mug, 0,01 \mug y 0,001 \mug por ml
I = extracto de ácaro (1:10, 1:20, 1:40, 1:80
Pos = PHA 25 \mug por pocillo (200 \mul)
En los casos en que la sustancia se diluye en RPMI 1640, el control apropiado es medio únicamente. Cuando se emplean otros diluyentes, se utilizan controles del apropiado diluyente a las concentraciones correspondientes.
Incubación
Las placas de microvaloración se incuban a 37ºC a 90% de humedad y con 5% de CO_{2}. Se prepara un número apropiado de placas idénticas y se sacan de la incubadora para ensayarlas a intervalos de 1 día, 2 días y 6 días.
Ensayo de proliferación
Se utiliza un juego de placas para estimación de la actividad proliferativa de las células de donante espontáneamente (= medio o controles de disolvente de sustancia), en respuesta a PHA, y en respuesta a muestras de sustancias de ensayo a varias concentraciones. La más alta concentración de la sustancia no tóxica a las células , indicada por examen microscópico en presencia de tinción vital (por ejemplo, azul de tripano) se utiliza como concentración incial. Se hacen entonces diluciones en serie de la sustancia como se ha establecido antes.
A cada pocillo de la placa se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham International, Amersham UK; 50 Ci/mM) en 50 \muL de RPMI 1640. Las placas se incubaron durante 4 horas adicionales a 37ºC. Las células se recogieron entonces utilizando un colector de células Skatron (Skatron, Lier, Norway) y filtros de papel Titertek. El resultado de este procedimiento fue que el ADN de las células se fijó al papel de filtro, mientras que la ^{3}H-timidina no incorporada al ADN pasa a través del filtro y se va con el agua residual de lavado. La radiactividad del papel de filtro es según esto proporcional a la síntesis de ADN que tenía lugar durante las cuatro horas precedentes al proceso de recolección. La radiactividad del papel de filtro se determina en un contador de centelleo de líquidos Packard, y la incorporación de timidina se expresó como conteos por minuto (cpm),
Ensayos de citocinas
Se prepara otro juego de placas con el mismo diseño que el anterior "Protocolo de Cultivo". Se miden las citocinas liberadas de las células cultivadas en los sobrenadantes obtenidos después de la centrifugación de las placas a 650 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se ensayaron inmediatamente o se almacenaron a -20ºC hasta su ensayo.
Aquí se menciona, solamente con propósito de informar, que en los ensayos realizados se utilizaron los siguientes estuches de equipo y fabricantes:
IL-1beta: Immunotech, Chromgenix
IL-2: Immunotec Chromgenix
IL-4: R&D Systems
Neopterina: Henning Berlin
IL-6: Immunotech, Chromgenix
IL-8: Assay Res. Inc
gamma-Interferon: Genzyme
CD8: T Cell Diagnostics
sIL-2R Immunotech
TNF: Medgenix
IL-10: Medgenix
Se siguieron las instrucciones del fabricante. Todos estos ensayos son inmunoensayos con enzima (EIA). El principio consiste en que los pocillos de la placa de microvaloración se marcan con un anticuerpo de captura específica de citocina. Si la citocina está presente en las muestras añadidas a los pocillos ésta será captada por el fondo del pocillo. Para determinar cuantitativamente la cantidad de citocina que ha sido capturada se añade a los pocillos un segundo anticuerpo marcado con una enzima. La reacción se mide después por el color desarrollado tras la adición de un substrato para la enzima. Los valores de los pocillos de ensayo se comparan con curvas normalizadas obtenidas a partir de una serie de cantidades conocidas de citocina. Los valores obtenidos para los pocillos control, sin sustancia añadida a las células, se emplean como valores de referencia para niveles de citocina y proliferación medida por incorporación de ^{3}H-timidina. Cuando se obtienen valores por encima de 2 SD de variación de los controles se registran indicaciones positivas.
Los resultados del ensayo de tres sustancias con propiedades conocidas por experiencia clínica previa, pero no ensayadas antes con el método son las siguientes:
0. Triton X-100. Este es un detergente con efectos dañinos para el tejido: Disuelve las membranas celulares.
I. Antígeno de polvo de ácaros (Soluprick, ALK Sverige AB). Esta preparación está hecha de un extracto de ácaros en polvo y se utiliza clínicamente para ensayo de alergia tipo inmediato por inyección intracutánea.
IV. Cloruro de níquel (Sigma St Louis, EE UU). Este metal es muy conocido como causa de alergia tipo retrasado (eccema de contacto) en seres humanos y animales experimentales.
Plus. Indicador positivo de respuestas del sistema, el calibrador era mitógeno PHA (Sigma, St. Louis EEUU)
TABLA I Ensayo realizado in vivo
Valores para proliferación de 11 citocinas ^{3}H-timidina. Obtenidos después de la estimulación de sangre de 5 personas sanas. Todos los valores son con respecto al control de medio al que se da el valor de 100
IL-1 TNF IL-6 IL-8 IL-2 STL-2R SCD8 IL-10 IL-4 IFN\gamma Neop- Indice
terina Prolif.
0 630 400 460 200 85 115 95 95 85 120 110 200
IV 1165 225 660 380 445 130 110 800 80 1220 90 1340
I 320 240 250 100 900 120 85 640 900 800 560 120
Plus 690 420 1620 780 750 1820 940 1250 820 800 440 2600
El valor más alto comparando con control de medio obtenido en cualquier momento o concentración para cada sustancia se utiliza como valor indicador en la Tabla y es con respecto al control de medio al que se da el valor de índice 100.
Resultados
A continuación se da un resumen de los resultados de un ejemplo de realización observándose que los efectos de estimulación eran bastante diferentes para los diferentes compuestos.
0. Triton X-100 inducía proliferación. Se inducían Citocinas del grupo tóxico para tejido inespecífico, es decir, IL-1. IL-6 y TNF. Es un irritante de tejidos positivo
I. Acaros en polvo: Inducía respuesta no proliferativa. Las substancias secretadas en los sobrenadantes eran los inflamatorios no específicos IL-1, TNF e IL-6 y de la clase de linfocitos inmunes IL-2, IL-4,IL-10 y gamma-IFN. Además la neopterina típica para inducción de respuestas inmunes específicas de un estadio maduro avanzado. Hay un potencial para producción de anticuerpo e IgE.
IV. Cloruro de níquel: Inducia una respuesta proliferativa baja. Las citocinas inducidas eran el mediador antiinflamatorio inespecífico IL-1, IL-6, TNF e IL-8. De la clase de inmuno linfocitos eran inducidos gamma-IFN, IL-2, e IL-10, pero, notablemente, no se inducía neopterina.
Plus. PHA: Inducía una fuerte respuesta proliferativa indicada por incorporación de ^{3}H-timidina y también se inducían tipos de células de citocinas. Las sustancias secretadas en el sobrenadante incluía: citocinas del tipo inflamatorio primario como IL-1, IL-6, TNF e IL-8. Eran inducidas citocinas de los tipos típicos para respuestas inmunes específicas tanto tempranas como avanzadas como neopterina, gamma-IFN, IL-2 e IL-4 e IL-10 típica de ambas respuestas temprana y avanzada.

Claims (11)

1. Un procedimiento para evaluación in vitro de una sustancia potencialmente alergénica o irritante para tejido, caracterizado porque se cultivan células de la sangre en presencia de la sustancia, y se mide la presencia de citocinas, con lo que:
la presencia de una o más citocinas de alarma (clase 0) solamente seleccionadas entre IL-1, IL-6, IL-12 y TNF, es una indicación de daño a tejido inespecífco o la presencia de efectos químicos o tóxicos sobre tejido conjuntivo, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales y células blancas de la sangre inflamatorias inespecíficas;
la presencia de una o más citocina de alarma de clase 0 seleccionadas entre IL-1, IL-6, IL-12 y TNF y la presencia de altos niveles de IL-8 a neopterina es una indicación de inmunidad de celulas T mediada por células clase IV e hipersensibilidad tipo retardado tal como inmunidad celular, alergia retardada y eccema de contacto y
la presencia de una o más citocinas de alarma de clase 0 seleccionadas entre IL- 1, IL-6, IL-12 y TNF y la presencia de altos niveles de neopterina a IL-8, es una indicación de un tipo de repuesta inmune de clase I de linfocitos T y b y células inflamatorias e hipersensibilidad tipo inmediato tal como asma, fiebre del heno, urticaria y rinitis.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración más alta de la sustancia que no es tóxica para las células se diluye en serie.
3. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque se mide la proliferación de células.
4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-3 caracterizado porque:
se miden también citocinas de tipo clase IV conectadas con inmunidad de células T mediada por célula seleccionadas entre IL-2, IL-8, IL-10, gamma-IFN, IL-4, IL- 5, y productos solubles tales como sCD8 y sIL-2R;
se miden también citocinas de tipo clase I de respuesta inmune de linfocitos T y B y células inflamatorias seleccionadas entre gamma-IFN, IL-2, IL-10, IL-4, IL-5 y productos solubles tales como sCD8 y sIL-2R.
5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la sustancia que se ensaya se presenta en la concentración más alta que no es tóxica en una dilución en serie de la misma de al menos 1:1000.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la dilución en serie se realiza en sentido descendente de al menos 1:10000 a 1:1000 000.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la sangre se diluye en serie de 1:1 a 1:1000, preferiblemente de 1:2 a 1:100.
8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque se trata la sangre completa para que no se coagule, se diluye 1:2-1:100 en medio de cultivo de tejido preferiblemente suplementado con glutamina y/0 un antibiótico, se añade, un precursor de ácido nucleico marcado, la sustancia que se va a ensayar se diluye en serie en orden decreciente a una dilución de 1:1000 a 1:1000000 desde la concentración más alta de la sustancia que no es tóxica para las células preferiblemente como queda indicado por el examen al microscopio en presencia de tinción vital y se añade a diferentes concentraciones y se incuba a 25C-40C, y se ensaya a intervalos de 1 hora a 6 días, por
certificando que la proliferación ha tenido lugar preferiblemente por recogida de las células sobre papel de filtro o recogiendo ácido nucleico por cualquier otro método mecánico o químico y analizando el precursor de ácido nucleico marcado y
analizando citocinas por estimación que la presencia de una o más de las citocinas de alarma de clase 0 solamente es una indicación del daño del tejido y efectos tóxicos químicos,
una o más citocinas de alarma de clase 0 y una o más citocinas de tipo clase IV pero no neopterina es una indicación de hipersensibilidad tipo retardado tal como inmunidad celular, alergia retardada y eccema de contacto y
una o más citocinas de alarma de clase 0 y al menos neopterina y posiblemente una o más citocinas de clase I es una indicación de hipersensibilidad de tipo inmediato tal como asma, fiebre del heno y urticaria.
9. Un procedimiento para evaluación in vitro de una sustancia potencialmente alergénica o irritante para tejido, caracterizado porque se cultivan células de sangre en la presencia de diluciones en serie de la sustancia y es analizada la presencia de neopterina, donde la presencia de neopterina es una indicación de la hipersensibilidad tipo inmediato tal como asma, fiebre del heno y urticaria.
10. La utilización de IL-8 y neopterina para distinguir entre perfiles de citocinas de clase I y clase IV.
11. Un estuche de reactivos para utilizarlo en el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque comprende reactivos que reconocen específicamente cada una de entre IL-8 y neopterina.
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