ES2198496T5 - Un procedimiento para analisis in vitro de sustancias toxicas y alergenicas. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION HACE REFERENCIA A UN PROCESO PARA LA EVALUACION IN VITRO DE SUSTANCIAS POTENCIALMENTE ALERGENICAS O IRRITANTES PARA LOS TEJIDOS, CARACTERIZADO EN QUE SE CULTIVAN CELULAS SANGUINEAS EN PRESENCIA DE DILUCIONES SERIE DE LA SUSTANCIA, CON LO QUE SE DILUYE EN SERIE LA MAXIMA CONCENTRACION DE LA SUSTANCIA NO TOXICA PARA LAS CELULAS, SE MIDE LA PROLIFERACION DE CELULAS Y SE MIDE LA PRESENCIA DE CITOCINAS; LA PRESENCIA DE UNA O MAS DE LAS CITOCINAS DE ALARMA DE LA CLASE 0 ES SOLO UNA INDICACION DEL DAÑO DEL TEJIDO Y DE LOS EFECTOS TOXICOS QUIMICOS; LA PRESENCIA DE UNA O MAS CITOCINAS DE ALARMA DE LA CLASE 0 Y POSIBLEMENTE DE UNA O MAS CITOCINAS DE LA CLASE IV, PERO NO DE NEOPTERINA, ES UNA INDICACION DE HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO RETARDADO, POR EJEMPLO, INMUNIDAD CELULAR, ALERGIA RETARDADA Y ECCEMA DE CONTACTO, Y LA PRESENCIA DE UNA O MAS CITOCINAS DE ALARMA DE LA CLASE 0 Y AL MENOS NEOPTERINA Y POSIBLEMENTE UNA O MAS CITOCINAS DE LA CLASE I ES UNA INDICACION DE HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO INMEDIATO, POR EJEMPLO, ASMA, FIEBRE DEL HENO, URTICARIA Y RINITIS. LA INVENCION TAMBIEN HACE REFERENCIA AL USO DE NEOPTERINA E IL - 8 COMO SUSTANCIAS ANALITICAS PARA DISTINGUIR ENTRE LAS REACCIONES INMUNES TIPO I Y IV Y UN KIT PARA ANALISIS.
Description
Un procedimiento para análisis in vitro
de sustancias tóxicas y alergénicas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para análisis in vitro de sustancias tóxicas y
alergénicas. Se analizan, en cuanto a reacciones adversas,
sustancias destinadas a su utilización como productos farmacéuticos,
aditivos de alimentos, productos cosméticos o higiénicos, productos
químicos industriales y otras sustancias. Estas reacciones pueden
ser reacciones alérgicas, efectos de irritación de la piel y efectos
tóxicos.
Actualmente, estos ensayos se llevan a cabo
in vivo utilizando animales. Los animales son caros de
conseguir y de mantener. Además, algunos ensayos pueden conllevar
sufrimiento para los animales.
La presente invención proporciona un
procedimiento para análisis in vitro de los efectos adversos
de sustancias. Los análisis de las sustancias se llevan a cabo
sobre células sanguíneas de animales de sangre caliente. No se
emplean animales experimentales ya que las sustancias se ensayan en
células humanas, es decir, células de la misma especie que se va a
tratar. Algunas sustancias pueden no tener el mismo efecto sobre
especies diferentes, y los ensayos realizados en animales pueden
llevar a resultados falsos. Por lo tanto, el ensayo se realiza
preferiblemente con sangre
humana.
humana.
Según esto, el método se ofrece como una
alternativa a los ensayos sobre animales para aditivos de alimentos,
productos cosméticos o higiénicos, productos químicos industriales,
fármacos y otras sustancias donde han de evitarse reacciones
adversas.
La evaluación in vitro de efectos tóxicos
sobre el sistema inmune ha sido ensayado sobre esplenocitos de
ratón ("Evaluación in vitro de efectos tóxicos inducidos
por fármaco sobre el sistema inmune comprobados por ensayos de
proliferación y producción de citocinas", M. Pallardy y col.
Eur. Cytokine Net., Vol. 2 No. 3, mayo-junio
1991, páginas 201-206). El método era muy poco
eficaz para detectar moléculas que inducen autoinmunidad e
hipersensibilidad.
La Patente estadounidense 5.439.799 describe un
método utilizado en la determinación de una citocina, neopterina, en
fluidos corporales. Larsen y col. en "La reacción de
hipersensibilidad tipo retardado es dependiente de
IL-8. La inhibición de la reacción de la piel a
tuberculina por un anticuerpo monoclonal
anti-IL-8" (J. Inmunol.
(Estados Unidos) 15 de agosto, 1995 (4) p. 2151-7,
información que desaparece en la descripción garantizada), describe
el papel de IL-8 en la reacción de tuberculina en la
piel de conejos. Ninguna de estas publicaciones se refiere, sin
embargo, al análisis de citocinas desarrolladas durante el contacto
con sustancias que se ensayan para distinguir entre los diferentes
tipos de reacciones inmunológicas adversas.
Ha resultado ahora que según la presente
invención es posible analizar reacciones de tejidos adversas a
sustancias extrañas in vitro por cultivo de las mismas con
sangre humana completa, evitando la coagulación y analizando la
citocina producida por las células humanas.
Antes de haber puesto en uso una sustancia y
antes de que el grupo objetivo haya sido expuesto, el presente
método ofrece la posibilidad de predecir si existe riesgo de
reacciones adversas del tipo inflamatorio o alérgico.
La invención proporciona una clave
interpretativa para la evaluación de reacciones de tejidos adversas
a sustancias extrañas.
El método se define en la reivindicación 1 y se
basa en el cultivo in vitro de células de la sangre. La
sustancia que se evalúa se añade al cultivo de sangre. Si las
células reactivas de la sangre reconocen al material de ensayo
como extraño o dañino, tiene lugar la producción de sustancias de
señal inflamatoria, citocinas. La sangre contiene diferentes células
blancas con diferentes funciones en respuesta a las sustancias
extrañas. Los diferentes tipos de células inflamatorias secretan
diferentes repertorios de citocinas. Los modelos (perfiles) de las
citocinas secretadas indican cual es el compartimento del sistema
inmune que ha sido activado. Por lo tanto, es posible también
predecir la clase de reacción adversa que se puede esperar de una
sustancia si se administra a humanos o animales experimentales.
Algunas sustancias inducirán un perfil de citocinas típico que
conduce al sistema inmune a una alergia mediada por IgE, indicando
así un potencial de estas sustancias para provocar asma, fiebre del
heno y urticaria. Otras sustancias inducirán un modelo de citocina
que conduce al sistema inmune a inmunidad celular teniendo así el
potencial de provocar un eccema de contacto como reacción adversa.
Por último, resultará un efecto químico o tóxico de un modelo de
citocina típico de reacciones de alarma vistas en lesiones de
tejidos y operaciones. Según esto, el concepto en que se basa el
presente método es el de utilizar una interpretación del modelo de
citocina que puede inducir una sustancia en células de sangre in
vitro para predecir si la sustancia tiene el potencial de causar
alergia de diferentes tipos o es en general peligrosa para inducir
daños de tejidos o efectos tóxicos.
Los autores clasifican las reacciones de tejidos
adversas a sustancias extrañas como sigue.
Clase 0: Daño a tejido. Daño de producto
químico no específico, daño mecánico o daño físico.
Clase I: Reacción inmune alérgica tipo I.
Se conoce también como hipersensibilidad tipo inmediato y está
mediada por anticuerpos IgE producidos específicamente ante una
sustancia extraña. Se produce una reacción inflamatoria aguda,
frecuentemente se produce histamina y ejemplos de síntomas son asma,
fiebre del heno, urticaria y rinitis. Este tipo requiere que la
sustancia pueda inducir una respuesta inmune completamente madura
cuando participan todos los componentes del sistema inmune. Esto se
considera también como reacción inmune de etapa final.
Clase IV: Reacción inmune inflamatoria
tipo IV. Esta, que se conoce también como hipersensibilidad tipo
retardado y está mediada por linfocitos T sensibilizados tipo
TH-1, está considerada como una reacción inmune tipo
primera etapa. La dermatitis de contacto alérgica es un ejemplo de
este tipo de reacción.
Clase 0: Es la propia clasificación de
los autores referente a daños no específicos al sistema inmune. Para
la Clase I y la Clase IV véase "Immunology" por Ivan Roitt,
Jonathan Brostoff y David Male, Gower Medical Publishing London -
Nueva York, 1989, página 19,1-19,20 y
22,1-22,10.
En el presente trabajo han sido identificados
tres principales tipos de perfiles de citocinas.
Tipo Clase 0: Secreción de citocinas de alarma
que indican daño en tejido conjuntivo, fibroblastos, células
endoteliales, células epiteliales y células blancas de la sangre
inflamatorias inespecíficas. Los miembros de este grupo son
IL-1, IL-6, IL-12 y
TNF.
Tipo Clase I: Secreción de citocinas de un tipo
de respuesta inmune de linfocitos y células inflamatorias. Estas
incluyen citocinas de Clase 0 y además IFN-gamma,
neopterina, IL-2 e IL-10.
Teóricamente, como se conoce por los estudios sobre animales in
vivo, también se producirían aquí IL-4 e
IL-5, pero estas sustancias son muy difíciles de
determinar y no se incluyen por tanto en la rutina del protocolo de
ensayo de los autores.
Tipo Clase IV: Secreción de las citocinas de
Clase 0 tipo inespecífico y en adición IL-2,
IL-8, IL-10 y
IFN-gamma.
Un hallazgo que no podía ser predecido era que
la respuesta inmune Clase I tipo final completa conduce a producción
de neopterina mientras que la respuesta inmune tipo primario de
Clase IV no estimula el sistema inmune tanto tiempo como para
producir neopterina.
En los tres grupos de citocinas enumerados antes
solo se da la lista de miembros representativos preferiblemente
seleccionados. Los grupos pueden contener otras citocinas para ser
utilizadas y la patente reivindica la utilización del análisis de
todas las sustancias enumeradas en Cytokine Facts Book, Eds Callard
R.E. y Gearing, A.J.H., Academic Press 1994 y futuros trabajos
actualizados para predecir el grado de madurez de la respuesta que
una sustancia puede provocar. Actualmente 50 sustancias.
IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-13, IL-14,
IL-15
BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF,
G-CSF, GM-CSF,
I-309/TCA-3,
\gammaLP-10, IFN-\alpha,
IFN\beta, IFN\gamma, LIF, LT/TNF\beta, MCR-1,
2 y 3, M-CSF, MIF, MIP-1\alpha,
MIP-1\beta, MIP-2, NGF,
NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PDGF,
PF-4, RANTES, SCF, TGF\alpha, TGF\beta,
TNF\alpha, Tpo, VEGF.
Según la invención, la presencia de reacción
inmune inflamatoria tipo IV se analiza preferiblemente utilizando
IL-8. Esto es porque IL-8 se ha
desarrollado y está presente en niveles elevados durante reacciones
tipo IV.
El hecho de que la neopterina esté presente en
cantidades más altas cuando se trata de reacción tipo I, permite que
se pueda especialmente utilizar IL-8 y/o neopterina
para distinguir entre el tipo IV de reacción inmune inflamatoria y
tipo I de reacción inmune alérgica.
Basándose en el resultado del ensayo in
vitro, el modelo de citocina inducido por la substancia bajo
investigación, se hará una predicción respecto al potencial de la
sustancia para causar reacción adversa si humanos o animales se
exponen a ella. Se utiliza sangre completa, preferiblemente sangre
venosa. Se previene la no coagulación de la sangre. Esto se puede
hacer utilizando tubos de heparina libre de endotoxina. Se pueden
utilizar también otros métodos tales como adición de EDTA o
citrato. Alternativamente la sangre se puede agitar por sacudida
con bolas de vidrio.
Los conteos de leucocitos en sangre sin diluir
varían entre 3x10^{9} y 7x10^{9} por litro. Alrededor de un 30%
de estos son linfocitos y 5-10% son monocitos,
siendo el resto células polimorfonucleares. El número total de
leucocitos y conteo diferencial se determina en un analizador de
hematología Coulter de célula STKS antes de proceso posterior.
La sangre completa se diluye formando una serie
de 1:1 1:1000, preferiblemente 1:2 -1:100 en un medio de cultivo,
preferiblemente un medio de cultivo de tejido tal como RPMI 1640
suplementado con glutamina. Normalmente, se utiliza
1,5-5 mM, preferiblemente 2 mM. La sangre se diluye
como caso más frecuente a 1:5, 1:10, 1:20 o se continúa con 1:40,
1:80, 1:100.
Preferiblemente se añaden antibióticos para
evitar el crecimiento de microorganismos indeseados. Se puede
añadir penicilina y estreptomicina a concentraciones de
25-100 U/ml preferiblemente 50 U/ml.
Se pueden utilizar mitógenos o sustancias con
efectos conocidos sobre el sistema inmune como controles positivos
para obtener mejores resultados. Se puede emplear un mitógeno como
se menciona en Daniel P. Stites en Clinical Laboratory Methods for
Detection of Antigens & Antibodies in. Basic and Clinical
Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos California, 1984.
Se emplea preferiblemente fitohemaglutinina (PHA-L)
disuelta en el medio a una concentración final en los pocillos de
250 \mug por ml.
El ensayo se puede llevar a cabo en cualquier
recipiente adecuado, por ejemplo en tubos o preferiblemente en
pocillos de placas de microvaloración.
Para provocar la producción de citocina in
vitro, la concentración de células tiene importancia crítica. Si
el ensayo se realiza solamente a una concentración de células,
solo se detectarán óptimamente algunas de las citocinas de interés.
Si se utilizan series de concentraciones de células, quedará
revelado el cuadro completo del modelo de citocina predicho antes
en "Compendio de la invención".
Para ensayar las sustancias en cuanto a los
efectos en el sistema, se añaden concentraciones diferentes a la
sangre. La concentración más alta de la sustancia que no es tóxica
para las células indicada por el exámen al microscopio empleando
tinción vital, por ejemplo azul de tripano, se utiliza como
concentración inicial. La dilución en serie de la sustancia se
lleva a cabo entonces a una dilución de al menos 1:1000 y
preferiblemente descendiendo a 1:10000. 1:100000 ó 1:1 000 000.
En los casos en que la sustancia se diluye en
RPMI 1640 el control apropiado es medio únicamente. Cuando se
emplean otros diluyentes, se utilizan controles del diluyente
apropiado a las correspondientes concentraciones.
Las vasijas se incuban a
25-40ºC, preferiblemente a 37ºC a una humedad de
50-95%, preferiblemente 90% y preferiblemente en
presencia de 2-15% de CO_{2}, preferiblemente 5%.
Se prepara un número apropiado de tubos o de placas de
microvaloración y se sacan a intervalos de la incubadora para su
ensayo. Los intervalos de tiempo normalizados son de 1 hora, hasta
10 días; preferiblemente de 1 hora 1 día, 2 días y
4-6 días.
El ensayo de proliferación se puede
llevar a cabo como sigue. Se utiliza un juego de placas para estimar
la actividad proliferativa de las células de donante
espontáneamente (=medio) o controles de disolvente de sustancia, en
respuesta a mitógenos y en respuesta a muestras de sustancias de
ensayo a varias concentraciones. Esto puede hacerse como sigue o
por cualquier otro método adecuado. Las placas se ensayan a
intervalos de tiempo, y a cada pocillo de la placa se añade
precursor de ácido nucleico marcado tal como
^{3}H-timidina disuelta en el medio. Las placas
se incubaron durante 4 horas adicionales a 37ºC en cuanto a
incorporación de precursor de ácido nucleico marcado. Las células
se recogieron entonces utilizando un colector de células Skatron
(Skatron, Lier, Norway) y filtros de papel Titertek o cualquier otro
método adecuado. El resultado de este procedimiento es que el ADN
de las células es captado por el papel de filtro, mientras que la
^{3}H-timidina no incorporada al ADN pasa a
través del filtro y se va con el agua residual de lavado. La
radioactividad de los papeles de filtro es así proporcional a la
síntesis de ADN que tiene lugar durante las cuatro horas precedentes
al proceso de recolección. La radiactividad de los papeles de
filtro se determina en un contador de centelleo de líquidos
Packard, y la incorporación de timidina se expresa como conteos por
minuto (cpm). La radiactividad o cualquier otro marcador del
precursor se puede medir en el ADN recogido por cualquier otra vía
mecánica o química y medirse por un instrumento isotópico o químico
adecuado.
Ensayo de citocinas: Se prepara otro
juego de placas con el mismo diseño que el anterior "Protocolo de
Cultivo". Aquí también, las placas se sacan de la incubadora a
intervalos regulares de tiempo, y se liberan las citocinas de las
células cultivadas en los sobrenadantes obtenidos después de
centrifugación de las placas a 650 g durante 10 minutos. Los
sobrenadantes se pueden ensayar inmediatamente o almacenarse a -20ºC
hasta el ensayo. Para las determinaciones de citocinas, se utilizan
estuches (kits) de diagnóstico de diversas fuentes. En la Patente
se reivindica este procedimiento utilizando cualquier ensayo de los
que ya se dispone o de nueva construcción que utilice determinación
cualtitativa de citocina incluyendo bioensayos, inmunoensayos o
ensayos químicos u otros.
Se siguen las instrucciones del fabricante.
Todos estos ensayos son inmunoensayos con enzima (EIA). El principio
consiste en que los pocillos de la placa de microvaloración se
marcan con un anticuerpo de captura específica de citocina. Si la
citocina está presente en las muestras añadidas a los pocillos ésta
será capturada por el fondo del pocillos. Para determinar
cuantitativamente la cantidad de citocina que ha sido capturada se
añade a los pocillos un segundo anticuerpo marcado con una enzima.
Se mide después la reacción como color desarrollado después de la
adición de substrato para la enzima. Los valores de los pocillos de
ensayo se comparan con curvas normalizadas obtenidas a partir de
una serie de cantidades conocidas de citocina. Los valores para los
pocillos control, sin sustancia añadida a las células, se emplean
como niveles de referencia para los ensayos. Cuando se obtienen
valores por encima de 2 SD de la variación se registran indicaciones
positivas.
La invención se refiere también a un estuche de
equipo que comprende uno o más reactivos que reconocen las
citocinas de alarma de la clase cero y/o las citocinas del tipo
Clase I y/o las citocinas de CLase IV. Ejemplos de estas citocinas
se mencionan en los dos últimos párrafos de la página 4 y en el
primer párrafo de la página 5. Se prefieren los reactivos que
reaccionan a la presencia de neopterina e IL-8.
Estos reactivos pueden ser anticuerpos o
cualquier otro reactivo que sea sensible a estas sustancias. Los
reactivos pueden ir sobre un soporte tal como una tira, placas de
valoración, placas de microvaloración, placas de ELISA, tubos de
ensayo, etc. Los soportes pueden ser de tamaños diferentes. El
material del soporte puede ser un material sólido o semisólido que
no interfiera con la reacción entre el reactivo y la citocina. El
soporte puede tomar diversidad de formas y composiciones,
incluyendo micropartículas, perlas, tiras y membranas porosas e
impermeables, la superficie interior de los recipientes de reacción
tales como tubos de ensayo y placas de microvaloración, y
similares. Las placas de microvaloración y perlas pueden ser de
plástico, tal como polímeros de estireno o acrílicos, o vidrio. Se
puede emplear nitrocelulosa, preferiblemente en la forma de
filtros, tiras o discos. Los medios de unir la pareja de reacción
deseada a un soporte sólido seleccionado será una cuestión de
rutina para cualquier especialista en la técnica. Es posible también
utilizar citómetro de flujo.
La invención se describirá ahora con más detalle
con los siguientes ejemplos no-limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Donantes de sangre y recogida de sangre:
Se emplearon cinco donantes de sangre sanos de ambos sexos de edades
comprendidas entre los 25 y los 55 años. La sangre se recogió por
punción venosa en tubos de heparina libre de endotoxina (Coatech,
LJungby, Suecia) conteniendo 120 UI de heparina y se llenaron con
4 ml de sangre. No se permitió en ninguno de los donantes de sangre
una historia de alergia o eccema atópico o indicación alguna de
tener enfermedad de ninguna clase.
Análisis de células: Se midieron los
conteos de células blancas de la sangre totales y diferenciales con
un equipo Coulter STKS. Los cinco donantes tuvieron conteos totales
de células blancas de la sangre de 9,8; 7,1; 9,8; 6,9;
5,8.10^{9}/1.
Protocolo de cultivo: Se diluye la sangre
completa en una serie 1:2, 1:3, 1:20, 1:4, y 1:10 en medio de
cultivo de tejidos, RPMI 1640 suplementado con glutamina 2 mM, 50
U/ml de penicilina y 50 Ug/ml de estreptomicina. Se añaden 100
\mul de sangre a los pocillos de placas de microvaloración
Nunclon. Se disuelve el mitógeno fitohemaglutinina
(PHA-L) (L-4144, Sigma St Louis
EEUU) en RPMI 1640 y se añaden 50 \mul de la solución a los
pocillos de manera que se alcanza una cantidad final de 25 \mug
por pocillo.
Para el ensayo de las sustancias en cuanto a los
efectos en el sistema, se añaden diferentes concentraciones a la
sangre. La concentración más alta de la sustancia que no es tóxica
para las células, indicada por su exámen al microscopio con tinción
vital, por ejemplo azul de tripano, se utiliza como la concentración
inicial. Se emplean las siguientes sustancias y concentraciones:
0 = Triton x 100 a concentraciones de 1:2000,
1:4000, 1:8000, 1:16000, 1:32000, 1:64000, 1:128000
IV = NiCl_{2}, 100 \mug, 10 \mug, 1
\mug, 0,1 \mug, 0,01 \mug y 0,001 \mug por ml
I = extracto de ácaro (1:10, 1:20, 1:40,
1:80
Pos = PHA 25 \mug por pocillo (200 \mul)
\vskip1.000000\baselineskip
En los casos en que la sustancia se diluye en
RPMI 1640, el control apropiado es medio únicamente. Cuando se
emplean otros diluyentes, se utilizan controles del apropiado
diluyente a las concentraciones correspondientes.
Incubación: Las placas de microvaloración
se incuban a 37ºC a 90% de humedad y con 5% de CO_{2}. Se prepara
un número apropiado de placas idénticas y se sacan de la incubadora
para ensayarlas a intervalos de 1 día, 2 días y 6
días.
días.
Ensayo de proliferación: Se utiliza un
juego de placas para estimación de la actividad proliferativa de las
células de donante espontáneamente (= medio o controles de
disolvente de sustancia), en respuesta a PHA, y en respuesta a
muestras de sustancias de ensayo a varias concentraciones. La más
alta concentración de la sustancia no tóxica a las células, indicada
por examen microscópico en presencia de tinción vital (por ejemplo,
azul de tripano) se utiliza como concentración inicial. Se hacen
entonces diluciones en serie de la sustancia como se ha establecido
antes.
A cada pocillo de la placa se añadió 1 \muCi
de ^{3}H-timidina (Amersham International,
Amersham UK; 50 Ci/mM) en 50 \muL de RPMI 1640. Las placas se
incubaron durante 4 horas adicionales a 37ºC. Las células se
recogieron entonces utilizando un colector de células Skatron
(Skatron, Lier, Norway) y filtros de papel Titertek. El resultado
de este procedimiento fue que el ADN de las células se fijó al papel
de filtro, mientras que la ^{3}H-timidina no
incorporada al ADN pasa a través del filtro y se va con el agua
residual de lavado. La radiactividad del papel de filtro es según
esto proporcional a la síntesis de ADN que tenía lugar durante las
cuatro horas precedentes al proceso de recolección. La radiactividad
del papel de filtro se determina en un contador de centelleo de
líquidos Packard, y la incorporación de timidina se expresó como
conteos por minuto (cpm).
Ensayos de citocinas: Se prepara otro
juego de placas con el mismo diseño que el anterior "Protocolo de
Cultivo". Se miden las citocinas liberadas de las células
cultivadas en los sobrenadantes obtenidos después de la
centrifugación de las placas a 650 g durante 10 minutos. Los
sobrenadantes se ensayaron inmediatamente o se almacenaron a -20ºC
hasta su ensayo.
Aquí se menciona, solamente con propósito de
informar, que en los ensayos realizados se utilizaron los siguientes
estuches de equipo y fabricantes:
IL-1beta: Immunotech,
Chromgenix
IL-2: Immunotec Chromgenix
IL-4: R&D Systems
Neopterina: Henning Berlin
IL-6: Immunotech, Chromgenix
IL-8: Assay Res. Inc
gamma-Interferon: Genzyme
CD8: T Cell Diagnostics
sIL-2R Immunotech
TNF: Medgenix
IL-10: Medgenix
\vskip1.000000\baselineskip
Se siguieron las instrucciones del fabricante.
Todos estos ensayos son inmunoensayos con enzima (EIA). El
principio consiste en que los pocillos de la placa de
microvaloración se marcan con un anticuerpo de captura específica
de citocina. Si la citocina está presente en las muestras añadidas a
los pocillos ésta será captada por el fondo del pocillo. Para
determinar cuantitativamente la cantidad de citocina que ha sido
capturada se añade a los pocillos un segundo anticuerpo marcado con
una enzima. La reacción se mide después por el color desarrollado
tras la adición de un substrato para la enzima. Los valores de los
pocillos de ensayo se comparan con curvas normalizadas obtenidas a
partir de una serie de cantidades conocidas de citocina. Los
valores obtenidos para los pocillos control, sin sustancia añadida a
las células, se emplean como valores de referencia para niveles de
citocina y proliferación medida por incorporación de
^{3}H-timidina. Cuando se obtienen valores por
encima de 2 SD de variación de los controles se registran
indicaciones positivas.
Los resultados del ensayo de tres sustancias con
propiedades conocidas por experiencia clínica previa, pero no
ensayadas antes con el método son las siguientes:
0. Triton X-100. Este es un
detergente con efectos dañinos para el tejido: Disuelve las
membranas celulares.
I. Antígeno de polvo de ácaros (Soluprick,
ALK Sverige AB). Esta preparación está hecha de un extracto de
ácaros en polvo y se utiliza clínicamente para ensayo de alergia
tipo inmediato por inyección intracutánea.
IV. Cloruro de níquel (Sigma St Louis, EE
UU). Este metal es muy conocido como causa de alergia tipo
retrasado (eccema de contacto) en seres humanos y animales
experimentales.
Plus. Indicador positivo de respuestas del
sistema, el calibrador era mitógeno PHA (Sigma, St. Louis EEUU)
\newpage
Valores para proliferación de 11 citocinas
^{3}H-timidina. Obtenidos después de la
estimulación de sangre de 5 personas sanas. Todos los valores son
con respecto al control de medio al que se da el valor de 100
El valor más alto comparando con control de
medio obtenido en cualquier momento o concentración para cada
sustancia se utiliza como valor indicador en la Tabla y es con
respecto al control de medio al que se da el valor de índice
100.
Resultados: A continuación se da un
resumen de los resultados de un ejemplo de realización observándose
que los efectos de estimulación eran bastante diferentes para los
diferentes compuestos.
0. Triton X-100 inducía
proliferación. Se inducían Citocinas del grupo tóxico para tejido
inespecífico, es decir, IL-1. IL-6
y TNF. Es un irritante de tejidos positivo.
I. Ácaros en polvo: Inducía respuesta no
proliferativa. Las substancias secretadas en los sobrenadantes eran
los inflamatorios no específicos IL-1, TNF e
IL-6 y de la clase de linfocitos inmunes
IL-2, IL-4,IL-10 y
gamma-IFN. Además la neopterina típica para
inducción de respuestas inmunes específicas de un estadio maduro
avanzado. Hay un potencial para producción de anticuerpo e IgE.
IV. Cloruro de níquel: Inducia una respuesta
proliferativa baja. Las citocinas inducidas eran el mediador
antiinflamatorio inespecífico IL-1,
IL-6, TNF e IL-8. De la clase de
inmuno linfocitos eran inducidos gamma-IFN,
IL-2, e IL-10, pero, notablemente,
no se inducía neopterina.
Plus. PHA: Inducía una fuerte respuesta
proliferativa indicada por incorporación de
^{3}H-timidina y también se inducían tipos de
células de citocinas. Las sustancias secretadas en el sobrenadante
incluía: citocinas del tipo inflamatorio primario como
IL-1, IL-6, TNF e
IL-8. Eran inducidas citocinas de los tipos típicos
para respuestas inmunes específicas tanto tempranas como avanzadas
como neopterina, gamma-IFN, IL-2 e
IL-4 e IL-10 típica de ambas
respuestas temprana y avanzada.
Claims (10)
-
\global\parskip0.970000\baselineskip
1. Un procedimiento para evaluación in vitro de una sustancia potencialmente alergénica o irritante para tejido, caracterizado porque se cultivan células de la sangre en presencia de disoluciones en serie de la sustancia, porque la concentración mas alta de la sustancia que no es tóxica para las células se diluye en serie, porque se mide la proliferación de células y la presencia de citocinas, con lo que:la presencia de una o más citocinas de alarma (clase 0) solamente seleccionadas entre IL-1, IL-6, IL-12 y TNF, es una indicación de daño a tejido inespecífco o la presencia de efectos químicos o tóxicos sobre tejido conjuntivo, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales y células blancas de la sangre inflamatorias inespecíficas;la presencia de una o más citocina de alarma de clase 0 seleccionadas entre IL-1, IL-6, IL-12 y TNF y la presencia de altos niveles de IL-8 a neopterina es una indicación de inmunidad de células T mediada por células clase IV e hipersensibilidad tipo retardado tal como inmunidad celular, alergia retardada y eccema de contacto yla presencia de una o más citocinas de alarma de clase 0 seleccionadas entre IL-1, IL-6, IL-12 y TNF y la presencia de altos niveles de neopterina a IL-8, es una indicación de un tipo de repuesta inmune de clase I de linfocitos T y b y células inflamatorias e hipersensibilidad tipo inmediato tal como asma, fiebre del heno, urticaria y rinitis. - 2. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque:se miden también citocinas de tipo clase IV conectadas con inmunidad de células T mediada por célula seleccionadas entre IL-2, IL-8, IL-10, gamma-IFN, IL-4, IL-5, y productos solubles tales como sCD8 y sIL-2R;se miden también citocinas de tipo clase I de respuesta inmune de linfocitos T y B y células inflamatorias seleccionadas entre gamma-IFN, IL-2, IL-10, IL-4, IL-5 y productos solubles tales como sCD8 y sIL-2R.
- 3. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la sustancia que se ensaya se presenta en la concentración más alta que no es tóxica en una dilución en serie de la misma de al menos 1:1000.
- 4. Un procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la dilución en serie se realiza en sentido descendente de al menos 1:10000 a 1:1000 000.
- 5. Un procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la sangre se diluye en serie de 1:1 a 1:1000, preferiblemente de 1:2 a 1:100.
- 6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque se trata la sangre completa para que no se coagule, se diluye 1:2-1:100 en medio de cultivo de tejido preferiblemente suplementado con glutamina y/0 un antibiótico, se añade, un precursor de ácido nucleico marcado, la sustancia que se va a ensayar se diluye en serie en orden decreciente a una dilución de 1:1000 a 1:1000000 desde la concentración más alta de la sustancia que no es tóxica para las células preferiblemente como queda indicado por el exámen al microscopio en presencia de tinción vital y se añade a diferentes concentraciones y se incuba a 25C-40C, y se ensaya a intervalos de 1 hora a 6 días, porcertificando que la proliferación ha tenido lugar preferiblemente por recogida de las células sobre papel de filtro o recogiendo ácido nucleico por cualquier otro método mecánico o químico y analizando el precursor de ácido nucleico marcado yanalizando citocinas por estimación que la presencia de una o más de las citocinas de alarma de clase 0 solamente es una indicación del daño del tejido y efectos tóxicos químicos,una o más citocinas de alarma de clase 0 y una o más citocinas de tipo clase IV pero no neopterina es una indicación de hipersensibilidad tipo retardado tal como inmunidad celular, alergia retardada y eccema de contacto yuna o más citocinas de alarma de clase 0 y al menos neopterina y posiblemente una o más citocinas de clase I es una indicación de hipersensibilidad de tipo inmediato tal como asma, fiebre del heno y urticaria.
- 7. Un procedimiento para evaluación in vitro de una sustancia potencialmente alergénica o irritante para tejido, caracterizado porque se cultivan células de sangre en la presencia de diluciones en serie de la sustancia y es analizada la presencia de neopterina, donde la presencia de neopterina es una indicación de la hipersensibilidad tipo inmediato tal como asma, fiebre del heno y urticaria.
- 8. La utilización de IL-8 y neopterina para distinguir entre perfiles de citocinas de clase I y clase IV.
- 9. Un estuche de reactivos para utilizarlo en el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque comprende a) un reactivo que reconoce IL-8 y b) un reactivo que reconoce neopterina.
- 10. Un estuche de reactivos según la reivindicación 9, donde el reactivo en a) es un anticuerpo que reconoce IL8 y el reactivo en B) es un anticuerpo que reconoce neopterina.
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