ES2198549T3 - Procedimiento para la recuperacion de natamicina. - Google Patents
Procedimiento para la recuperacion de natamicina.Info
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Abstract
PROCESO PARA LA RECUPERACION DE NATAMICINA PROCEDENTE DE CALDO DE FERMENTACION CONTENIENDO BIOMASA Y NATAMICINA, QUE INCLUYE: (A) DESINTEGRACION DE LA BIOMASA; Y (B) SEPARACION DE LA NATAMICINA DE CALDO DE FERMENTACION ASI TRATADO.
Description
Procedimiento para la recuperación de
natamicina.
La natamicina, también conocida como pimaricina o
tenecetina, es un antibiótico poliénico conocido desde finales de
los cincuenta (Struyk y otros, Antibiot. Ann.
1957-1958, 878).
Durante más de 20 años, la natamicina se ha
utilizado para impedir el crecimiento de moho y levadura en quesos y
embutidos. Se han descrito desarrollos más recientes en el uso de la
natamicina en los documentos WO 93/00913 (Uso de natamicina para el
tratamiento y la prevención de la micosis en aves de corral), WO
93/01720 (Tratamiento con natamicina de grano entero seco), WO
93/00911 (Uso de natamicina para el control y la prevención de la
aspergilosis en aves de corral) y WO 93/00912 (Uso de natamicina
para la prevención y el control de la dactilariosis en aves de
corral). La natamicina se prepara mediante procesos de fermentación,
tales como los dados a conocer en el documento
GB-A-844289, que utilizan
Streptomyces natalensis, o los dados a conocer en los
documentos GB-A-846933, WO 93/03169,
WO 93/03170 y WO 93/03171, que utilizan Streptomyces
gilvosporeus. Una vez producida la natamicina, por ejemplo
mediante el proceso de fermentación arriba indicado, la natamicina
se recupera mediante procesos de extracción, tales como los
descritos en los documentos
GB-A-844289,
GB-A-846933, WO 92/10580, WO
95/07998 o WO 95/27073. Todos estos procesos de recuperación
requieren grandes cantidades de disolvente orgánico. Los procesos de
recuperación descritos más recientemente (por ejemplo los dados a
conocer en los documentos WO 92/10580, WO 95/07998 y WO 95/27073)
utilizan un procedimiento en el que un disolvente orgánico se añade
al caldo y el pH del caldo se ajusta para solubilizar la natamicina.
Después, los sólidos suspendidos se eliminan mediante filtración.
Por último, el pH del filtrado se reajusta para precipitar la
natamicina y la natamicina precipitada se extrae del líquido
remanente.
Tanto WO 92/10580 como WO 95/07998 utilizan
metanol como disolvente orgánico. El pH del caldo se ajusta a
1-4,5 para solubilizar la natamicina, el caldo se
filtra y la natamicina se precipita de nuevo aumentando el pH a
6-9.
En el documento WO 95/27073 se utiliza
isopropanol como disolvente orgánico. El isopropanol se añade
después de ajustar el pH a 10-11, y posteriormente
se eliminan los sólidos insolubles mediante una filtración en
corriente cruzada y la natamicina se precipita mediante un ajuste
del pH a 5,5-7,5. En los procesos de recuperación
arriba descritos hay una eliminación (parcial) de agua antes de
comenzar el proceso de recuperación, con el fin de reducir al mínimo
la cantidad de disolvente orgánico requerida. Para eliminar el agua
se describen técnicas de secado y separación sólido/líquido. Todos
estos procesos de recuperación utilizan disolventes orgánicos, lo
que tiene como resultado costes de recuperación altos y desventajas
con respecto al medio ambiente.
Se ha descubierto ahora que es posible recuperar
natamicina de gran pureza de un caldo de fermentación utilizando un
procedimiento de recuperación que no requiere el uso de disolventes
orgánicos.
La presente invención proporciona un
procedimiento para recuperar natamicina de un caldo de fermentación
que contiene una biomasa y natamicina en forma sólida, que
comprende:
- (a)
- desintegrar la biomasa; y
- (b)
- separar la natamicina en forma sólida del caldo de fermentación así tratado.
Las fermentaciones que producen natamicina tienen
normalmente como resultado un caldo de fermentación que contiene
natamicina, sólidos de biomasa, nutrientes disueltos o suspendidos,
otros productos de fermentación y agua.
El caldo de fermentación contiene por lo general
como mínimo 2 g/l de natamicina, preferentemente como mínimo 7 g/l
de natamicina. La concentración de natamicina en el caldo de
fermentación puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 7 g/l según
lo revelado en el documento WO 93/03170. Dado que la natamicina es
muy poco soluble en agua, la natamicina se presenta principalmente
en forma sólida en el caldo de fermentación. Natamicina sólida
significa 'natamicina no disuelta en agua'. La forma sólida de la
natamicina presente en el caldo de fermentación puede comprender
preferentemente partículas de natamicina. Las partículas de
natamicina son cristales de natamicina que, por ejemplo, pueden
tener las siguientes formas: cristales en forma de aguja, cristales
en forma de disco o similares. Durante la fermentación se producen
partículas de natamicina. Las partículas de natamicina tienen
normalmente diámetros de 0,5-20 micrómetros. El
diámetro de la partícula de natamicina es la mayor distancia de una
parte de la partícula al otro extremo de la partícula. Se han
hallado partículas de natamicina en forma de aguja con diámetros de
más de 40 micrómetros. Los diámetros pueden determinarse utilizando
un microscopio.
La biomasa de los organismos Streptomyces
utilizada en la producción de natamicina consiste por lo general en
grupos (micelios) de filamentos, aunque también pueden estar
presentes otras formas de biomasa, por ejemplo las, así llamadas,
"pellas". En estos filamentos (hifas) hay compartimentos, en
los que se localizan actividades celulares. El tamaño de estos
filamentos, tal como se presentan en los grupos, es por lo general
de 10-30 micrómetros (diámetros entre
0,5-1,0 micrómetros).
Hasta la fecha no era posible separar la
natamicina de la biomasa y otras impurezas sin utilizar un
disolvente orgánico.
Sorprendentemente hemos descubierto que si se
reduce el tamaño de las partículas de la biomasa, ésta puede
separarse después eficazmente de las partículas de natamicina en la
fase acuosa.
Así pues, en la presente invención el caldo de
fermentación se trata, tras la fermentación, para desintegrar la
biomasa. La desintegración de la biomasa puede tener como resultado
la lisis, la solubilización de materia celular y la fragmentación
(reducción de tamaño) de los grupos y filamentos. La desintegración
de la biomasa puede comprobarse observando ésta con un microscopio
(aumentos 400 x). La desintegración se ha completado si resulta
difícil hallar grupos o filamentos de la biomasa con un microscopio.
La desintegración de la biomasa también puede determinarse midiendo
la viscosidad del caldo de fermentación. Por ejemplo, durante la
desintegración de una biomasa de tipo grupo, la viscosidad
disminuye. Si la viscosidad no disminuye sensiblemente con la
continuación del tratamiento, la biomasa se habrá desintegrado lo
suficiente. Aunque diferentes condiciones de fermentación o
diferentes organismos Streptomyces utilizados en la
producción de natamicina pueden tener como resultado formas algo
distintas de biomasa presente al concluir la fermentación, el
técnico en la materia será capaz de hallar una duración adecuada
para la desintegración de la biomasa de cualquier caldo de
fermentación.
Para desintegrar la biomasa pueden utilizarse por
ejemplo, solos/as o en combinación, técnicas de homogeneización, de
mezcla de alto cizallamiento y ultrasónicas o tratamientos térmicos,
de pH (alcalino) o enzimáticos o tratamientos con agentes
tensioactivos. Las técnicas de desintegración se eligen de modo que
se logre la desintegración sin influir sensiblemente en la
natamicina. La mayoría de la natamicina, como mínimo el 80% y
preferentemente hasta un 100%, conservará su forma sólida y la
actividad de la natamicina no se reducirá sensiblemente. Además,
para el técnico en la materia será evidente que las técnicas de
desintegración no deben influir sensiblemente en el tamaño de
partícula de la natamicina. Si el tamaño de partícula de la
natamicina se reduce como el tamaño de partícula de la biomasa,
resultará difícil separar la natamicina de la biomasa. Un ejemplo de
desintegración eficaz es la utilización de un tratamiento térmico,
opcionalmente combinado con un tratamiento de pH.
El tratamiento térmico puede aplicarse al caldo
de fermentación al final de la fermentación (por ejemplo en el
fermentador, una vez concluidas todas las alimentaciones (por
ejemplo fuentes de oxígeno, carbono o nitrógeno)). El tratamiento
térmico puede efectuarse, por ejemplo, durante 1 a 8 horas y, por
ejemplo, a una temperatura entre 30 y 50ºC. El tratamiento térmico
puede efectuarse preferentemente a una temperatura entre 30 y 35ºC.
Temperaturas mayores pueden tener como consecuencia floculación,
precipitación y coagulación, lo que puede influir negativamente en
la separación de la biomasa y las partículas de natamicina.
El tratamiento de pH durante, por ejemplo, 1 a 8
horas y, por ejemplo, con un pH de 8 o menos de aproximadamente 10
puede realizarse también fácilmente al final de la fermentación en
el fermentador. Con un pH por encima de 10, la natamicina se volverá
más soluble y más vulnerable a la inactivación, lo que influiría
negativamente en el rendimiento de recuperación y la pureza de la
natamicina final. Para aumentar el pH puede utilizarse hidróxido
sódico o cualquier otro material cáustico compatible, por ejemplo
hidróxido amónico o hidróxido potásico. Después de la incubación
alcalina, el caldo se neutraliza mediante ácido clorhídrico u otro
ácido compatible, por ejemplo ácido fosfórico, ácido sulfúrico o
ácido acético. La neutralización se realiza preferentemente después
de separar la natamicina del caldo de fermentación.
Los tratamientos enzimáticos pueden implicar la
incubación con enzimas de descomposición de pared celular y/o
descomposición de polímero orgánico tales como la lisozima,
xilanasa, celulasa, proteasa, glucanasa, lipasa y amilasa. Las
enzimas, solas o como mezclas de enzimas, se incuban por lo general
en condiciones óptimas para su actividad. Las enzimas contribuyen a
la lisis de las células y la solubilización de polímeros
orgánicos.
La homogeneización puede requerir el uso de un
homogeneizador de tipo Manton-Gaulin. El caldo de
fermentación se inyecta a través de un orificio. Debido a las
fuerzas de presión, la biomasa se desintegra.
La desintegración de la biomasa por técnicas
ultrasónicas puede lograrse aplicando ondas ultrasónicas al caldo de
fermentación, lo que ocasionará una oscilación del líquido celular
que las células no podrán soportar.
La desintegración de la biomasa mediante mezcla
de alto cizallamiento requiere aplicar grandes fuerzas de
cizallamiento a la biomasa. Dichas grandes fuerzas de cizallamiento
pueden obtenerse mediante cualquier tipo de agitación mecánica.
Ciertos fermentadores pueden equiparse, por ejemplo, con
dispositivos de agitación que sean capaces de proporcionar las
grandes fuerzas de cizallamiento necesarias para desintegrar la
biomasa. Durante la fermentación, la agitación se adaptará a las
condiciones óptimas de crecimiento o producción de natamicina para
la biomasa. Después de la fermentación, la agitación se adaptará a
la desintegración de la biomasa, por ejemplo aplicando grandes
velocidades de agitación. La mezcla de alto cizallamiento puede
realizarse también, por ejemplo, utilizando mezcladores Waring (u
otros) de alto cizallamiento.
La desintegración de la biomasa mediante un
tratamiento con agentes tensioactivos puede requerir, por ejemplo,
la utilización de compuestos de
octil-fenoxi-polietoxi-etanol,
tales como los compuestos tipo Triton. El caldo de fermentación
puede incubarse con, por ejemplo, un 0,01 a un 1% de, por ejemplo,
Triton X-100 durante, por ejemplo, 1 a 24 horas.
Después de la etapa de desintegración, la natamicina en forma sólida
se separa de la biomasa. Debido al tratamiento de desintegración, la
biomasa consiste ahora principalmente en pequeñas partículas sólidas
y/o materia solubilizada. Mientras que las técnicas de separación
convencionales utilizadas en los procesos de recuperación para
productos de fermentación se usan principalmente para separar la
fase sólida de la líquida, las técnicas de separación utilizadas en
la presente invención separan preferentemente partículas sólidas de
otras partículas sólidas, por ejemplo sobre la base de diferencias
de tamaño o diferencias de densidad. Las técnicas de separación
utilizadas en la presente invención no tendrán como resultado una
fase líquida transparente, sino que su resultado será una fase
líquida turbulenta que contiene la mayoría de las partículas sólidas
más pequeñas o menos densas (que comprenden principalmente la
biomasa desintegrada).
Para separar la biomasa de las partículas de
natamicina, el caldo de fermentación puede, por ejemplo, tratarse
utilizando una técnica de separación por gradiente de gravedad. La
técnica de separación por gradiente de gravedad separa las
partículas de natamicina tanto de las impurezas solubles como de las
insolubles. Las técnicas de separación por gradiente de gravedad
incluyen, por ejemplo, la centrifugación en gradiente de gravedad, y
pueden utilizar, por ejemplo, columnas de flujo ascendente e
hidrociclones. Las técnicas de separación por gradiente de gravedad
aplican el principio de que las partículas de distinta densidad y/o
tamaño pueden separarse si dichas partículas de distinta densidad
y/o tamaño se someten a fuerzas de gravedad o equivalentes.
Durante la desintegración de la biomasa, las
partículas de la misma se hacen más pequeñas. Esto permite separar
la biomasa de las partículas de natamicina. Con la técnica de
separación por gradiente de gravedad, normalmente es posible
eliminar más de un 90% de la biomasa desintegrada y otras impurezas.
La eficacia de la separación puede aumentarse añadiendo agua y/o una
sal (por ejemplo cloruro de sodio) al caldo.
El uso de técnicas de separación por gradiente de
gravedad tiene la ventaja de que permite modificar o dirigir
fácilmente el proceso de acuerdo con la pureza y producción del
producto final deseadas. Modificando las condiciones de trabajo es
posible aumentar la pureza o la producción. En general, si la pureza
aumenta la producción disminuye y viceversa. El procedimiento según
la invención puede proporcionar por ejemplo natamicina con
aproximadamente un 70% p/p de pureza (base anhidra) en relación con
la materia seca, con un rendimiento de aproximadamente un 90%.
Utilizando distintos parámetros de proceso, el procedimiento de la
presente invención permite obtener también natamicina con
aproximadamente un 90% p/p de pureza (base anhidra) en relación con
la materia seca y un rendimiento de aproximadamente un 80%. Incluso
es posible producir diversos productos de distintas calidades a
partir de un caldo de fermentación.
Las técnicas de separación por gradiente de
gravedad tendrán mejores resultados, por ejemplo mayores purezas y/o
rendimientos, si se aumenta la diferencia de densidad y/o tamaño
entre las partículas de producto y las impurezas. Por lo tanto, es
preferible que el caldo de fermentación contenga partículas de
natamicina con un diámetro medio de partículas de, como mínimo, 2
micrómetros. El diámetro medio de las partículas de natamicina es
preferentemente de, como mínimo, 5 micrómetros y con mayor
preferencia de, como mínimo, 10 micrómetros. Se han observado caldos
de fermentación que contenían partículas de natamicina con un
diámetro medio de aproximadamente 25 micrómetros. Dado que la
natamicina puede estar presente en el caldo de fermentación con
diámetros que oscilan entre menos de 0,05 micrómetros y
aproximadamente 40 micrómetros, para el técnico en la materia será
evidente que las partículas más pequeñas pueden perderse durante la
separación. Además, para el técnico en la materia será evidente que,
mediante la técnica de separación por gradiente de gravedad, es
posible obtener fracciones de partículas de natamicina con diámetros
grandes de gran pureza. Las condiciones en las que se realiza la
técnica de separación por gradiente de gravedad determinan qué
fracción de la natamicina se recuperará. En general, es posible
obtener partículas de natamicina más grandes, por ejemplo,
utilizando condiciones de bajo cizallamiento durante la
fermentación, o sembrando la fermentación con partículas de
natamicina pequeñas o prolongando la fermentación.
La centrifugación en gradiente de gravedad puede
simularse a escala de laboratorio utilizando una centrífuga en carga
discontinua durante menos tiempo o con un número menor de
revoluciones por minuto que en el funcionamiento estándar de la
centrífuga, lo que tendrá como resultado una separación clara de los
sólidos y los líquidos.
A escala de producción, la centrífuga se hace
funcionar normalmente de forma continua. En relación con el
funcionamiento estándar de este tipo de centrífuga, el tiempo de
mantenimiento en la centrífuga se disminuye para separar la
natamicina de la biomasa desintegrada. Cuanto menor es el tiempo de
mantenimiento, tanto mayor es la pureza y menor la producción de la
natamicina obtenida. El técnico en la materia será capaz de hallar
el tiempo de mantenimiento adecuado correspondiente a una relación
pureza: producción óptima o deseada. Después de la etapa de
separación, la suspensión de natamicina puede, por ejemplo, secarse
para obtener un producto seco. Puede utilizarse cualquier técnica de
secado oportuna, por ejemplo secado al vacío, secado por conducción
o secado por convección. Dado que la natamicina es estable en su
forma cristalina [natamicina.3H_{2}O], es crítico no secar el
producto hasta un contenido de humedad inferior al 7%. El secado al
vacío se realiza con preferencia a aproximadamente 40ºC.
Después de la etapa de separación, la suspensión
de natamicina puede purificarse aun más, si se desea, mediante una
segunda etapa de desintegración, seguida de una segunda etapa de
separación. Este proceso puede repetirse varias veces para obtener
natamicina con aproximadamente un 90% p/p de pureza (base anhidra)
en relación con la materia seca, con un rendimiento de
aproximadamente un 80%. En los ejemplos siguientes se describe la
invención más detalladamente.
Un caldo de fermentación de Streptomyces
natalensis, que contenía natamicina con un diámetro medio de
partículas de aproximadamente 10 micrómetros, se incubó a una
temperatura de 30ºC durante 3 horas. Este caldo sometido a
tratamiento térmico se trató después por una centrifugación en
gradiente de gravedad. Se utilizó una centrífuga de tobera estándar
Alfa-Laval tipo Feux, en condiciones tales que se
eliminase parte de los sólidos de la biomasa junto con el
sobrenadante. Este tratamiento tuvo como resultado una suspensión de
natamicina de un 70% p/p de natamicina (base anhidra) en relación
con la materia seca. El rendimiento en natamicina fue de
aproximadamente un 97%.
A 20 litros del producto final del ejemplo 1, que
contenían 3,2 kg de natamicina, se añadió hidróxido sódico para
ajustar el pH a 9,5 con el fin de desintegrar las impurezas
restantes.
Se añadieron 10 litros de agua a la suspensión
alcalina para reducir la viscosidad y aumentar la eficacia de la
etapa de centrifugación en gradiente de gravedad subsiguiente.
La suspensión alcalina diluida se centrifugó dos
veces mediante centrifugación en gradiente de gravedad para eliminar
las impurezas restantes y para concentrar la suspensión de
natamicina. Para la centrifugación en gradiente de gravedad se
utilizó una centrífuga Beckmann tipo J-6M/E, con un
rotor tipo JS 5.2, a 3.500 rpm y durante 3 minutos. Tras la
centrifugación se eliminó el sobrenadante y el residuo que contenía
la natamicina se resuspendió en agua.
El pH de la suspensión de natamicina purificada
se ajustó a 7 mediante la adición de ácido clorhídrico a la misma.
La suspensión se secó.
Se obtuvo un producto activo seco, que tenía una
pureza de un 92% p/p de natamicina (base anhidra) en relación con la
materia seca.
El rendimiento de recuperación total de los
procesos combinados de los ejemplos 1 y 2 fue de aproximadamente un
85%.
El pH de un caldo de fermentación de
Streptomyces natalensis que contenía partículas de natamicina
se ajustó a 9,5 mediante la adición de un 25% en peso de una
solución de NaOH y se incubó durante dos horas a una temperatura de
30ºC.
La fermentación así tratada se centrifugó
mediante centrifugación en gradiente de gravedad utilizando una
centrífuga Beckmann (tipo J-6M/E; con un rotor tipo
JS 5.2) durante 3 minutos a 3.500 rpm.
El sobrenadante se desechó y la pella que
contenía partículas de natamicina se resuspendió en agua con un pH
de 9,5. Después de la resuspensión, la suspensión se centrifugó como
anteriormente.
Después de una segunda centrifugación se eliminó
el sobrenadante y se ajustó el pH de la pella que contenía
partículas de natamicina a 7,0 mediante la adición de una solución
de HCl al 25% en peso.
La pella se secó durante 10 horas bajo vacío a
una temperatura de 40ºC. Se obtuvo un producto activo seco que
contenía un 90% en peso de natamicina (sobre base anhidra).
Un caldo de fermentación de Streptomyces
natalensis que contenía partículas de natamicina se diluyó con
agua.
El caldo de fermentación diluido se dividió en
dos partes:
La parte A se incubó durante dos horas a
30ºC con un pH de 9,5, con lo que se obtuvo una biomasa
desintegrada. El caldo así obtenido se dividió en dos partes (A1 y
A2)
La parte B se dividió directamente en dos
partes (B1 y B2).
De la parte A y la parte B, las primeras partes
(A1 y B1) se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 minutos y las
segundas partes (A2 y B2) se centrifugaron a 3.500 rpm durante 5
minutos.
Después de la centrifugación se determinaron la
producción de natamicina y el contenido en natamicina de las pellas.
Los resultados se muestran en la tabla 1. La centrifugación se
realizó utilizando una centrífuga Beckmann tipo
J-6M/E y un rotor tipo JS5.2.
| Condiciones de la | % de natamicina | % de natamicina en relación | ||
| centrífuga | producido | con la materia seca | ||
| velocidad del | tiempo | |||
| recipiente (rpm) | (min) | |||
| A1 | 5.000 | 10 | 96 | 43 |
| A2 | 3.500 | 5 | 93 | 68 |
| B1 | 5.000 | 10 | 99 | 29,6 |
| B2 | 3.500 | 5 | 97 | 31,0 |
La centrifugación a 5.000 rpm durante 10 minutos
tuvo como resultado sobrenadantes transparentes, mientras que la
centrifugación a 3.500 rpm durante 5 minutos tuvo como resultado
sobrenadantes turbios.
Las muestras A1 y A2 correspondientes a caldos de
fermentación con biomasa desintegrada mostraron mayores purezas de
natamicina que las muestras B1 y B2 correspondientes a los caldos de
fermentación diluidos originales.
La muestra A2, obtenida tras la centrifugación de
la biomasa desintegrada en condiciones de centrifugación en
gradiente de gravedad que causaron una separación sólido/sólido,
presentaba un aumento notable en la pureza de la natamicina.
Claims (10)
1. Procedimiento para recuperar natamicina de un
caldo de fermentación que contiene biomasa y natamicina en forma
sólida, que comprende:
- (a)
- desintegrar la biomasa; y
- (b)
- separar la natamicina en forma sólida del caldo de fermentación así tratado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la natamicina sólida comprende partículas de natamicina.
3. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la desintegración de la
biomasa comprende una, o una combinación, de las técnicas y/o
tratamientos siguientes: homogeneización, mezcla de alto
cizallamiento, ultrasonicación, calentamiento, tratamiento alcalino,
tratamiento enzimático o tratamiento con un agente tensioactivo.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la separación de la
natamicina comprende una técnica de separación por gradiente de
gravedad.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que la técnica de separación por gradiente de gravedad es una
técnica de centrifugación en gradiente de gravedad o utiliza una
columna de flujo ascendente o un hidrociclón.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el caldo de fermentación
contiene, como mínimo, 2 g/l de natamicina.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el caldo de fermentación contiene, como mínimo, 7 g/l de
natamicina.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el caldo de fermentación
contiene partículas de natamicina con un diámetro medio de partícula
de, como mínimo, 2 micrómetros.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el
que las partículas de natamicina tienen un diámetro medio de
partícula de, como mínimo, 5 micrómetros.
10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9,
en el que las partículas de natamicina tienen un diámetro medio de
partícula de, como mínimo, 10 micrómetros.
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