ES2237436T3 - Procedimiento para la preparacion de derivados de glicosidos esteroideos de i ruscus aculeatus/i. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de desglucodesramnoruscina que comprende la hidrólisis de los enlaces heterosídicos de ramnosa/arabinosa de los glicósidos esteroideos de Ruscus aculeatus, a través de la fermentación de un sustrato que contiene dichos glicósidos por medio de hongos de la especie Aspergillus niger obtenidos mediante selección en un medio de cultivo en el que se ha sustituido o suplementado la fuente de carbono convencional por ruscósido o desglucoruscósido.

Description

Procedimiento para la preparación de derivados de glicósidos esteroideos de i Ruscus aculeatus/i.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de derivados de glicósidos esteroideos de Ruscus aculeatus (ruscosaponinas).

De manera más particular, la invención se refiere a la preparación de desglucodesramnoruscina mediante hidrólisis de ruscósido y/o desglucoruscósido a través de la vía de la fermentación.

La desglucoramnoruscina y las agliconas libres correspondientes, ruscogenina y neuruscogenina, que se pueden obtener fácilmente mediante hidrólisis ácida a partir de desglucodesramnoruscina, son valiosos principios farmacéuticamente activos que tienen actividades antiinflamatorias y protectoras del tejido conector.

La preparación química de dichos principios activos a partir de ruscósido o desglucoruscósido, debido a que requiere condiciones drásticas, tales como hidrólisis con ácidos fuertes, y etapas operativas complejas, que dan como resultado una mezcla muy heterogénea de intermedios y productos.

El Documento DE 22 02 393A describe la extracción e hidrólisis de las saponinas de Ruscus aculeatus mediante un enzima glicosídico (celulasa o takadiastasa); uno de los productos de hidrólisis es la desglucodesramnoruscina y la fuente de takadiastasa es Aspergillus oryzae.

Perepelitsa, E. D. y col. (Prikladnaya Biokhimiya I Mikrobiologiya, vol. 11, 1975, p. 901-905) describen la hidrólisis de protodioscina, el principal glicósido de Tríbulus terrestris, para dar dioscina y trilina mediante Aspergillus niger BKMt-33.

Sería por tanto altamente deseable proporcionar un procedimiento para la preparación de la desglucodesramnoruscina que supere los inconvenientes anteriormente mencionados en conexión con los procedimientos químicos conocidos.

La presente invención satisface dicha necesidad, proporcionando un procedimiento para la preparación de la desglucodesramnoruscina que comprende la hidrólisis de los glicósidos esteroideos de Ruscus aculeatus (ruscosaponinas) a través de la fermentación de un sustrato que contiene los mencionados glicósidos, por medio de hongos de las especies de Aspergillus niger.

Se usa típicamente un caldo de cultivo como sustrato complejo nutriente.

La fermentación se lleva a cabo por lo general a una temperatura de 25-30ºC, de manera preferible 27ºC, con agitación y aireación con el fin de alcanzar una pO_{2} más alto que o igual a 50%.

La concentración de los glicósidos esteroideos de partida oscila usualmente entre 5 y 15% p/v, de manera preferible entre 8 y 10% p/v y el pH del medio de cultivo oscila entre 4 y 6, de manera preferible 4,5-5,5.

El procedimiento biotecnológico de la presente invención permite llevar a cabo la secuencia total de reacciones en una etapa de fermentación única, en la que el microorganismo, seleccionado con técnicas microbiológicas adecuadas, es capaz de expresar las actividades enzimáticas necesarias para llevar a cabo toda la secuencia de reacciones de transformación, desde el complejo heteroglicósido de partida hasta el monoglicósido o la aglicona final. Dichas transformaciones de la hidrolasa comprenden de hecho una secuencia de reacciones de \beta-glucosidasa, \alpha-ramnosidasa sobre los intermedios que se liberan de manera sucesiva durante el procedimiento. Una reacción de \alpha-arabinosidasa adicional permite obtener la aglicona libre (ruscogenina).

Dicha hipótesis es completamente nueva, porque no se pueden encontrar en la bibliografía ejemplos funcionales de dicho procedimiento para la preparación de los mencionados productos.

Los microorganismos adecuados para llevar a cabo las transformaciones implicadas se obtienen mediante selección en medio sintético o semisintético, añadidos con los mismos sustratos que se van a transformar, de manera adicional a o en lugar de las fuentes de carbono convencionales (glucosa, sacarosa, y similares). Los sustratos que interesan (ruscósido, desglucoruscósido) se pueden añadir en este caso incluso a altas concentraciones por ejemplo 90-100 g/L. El medio agarizado de aislamiento comprende las formulaciones usuales para microbiología, tales como Agar Malta y Agar de Czapek, o formulaciones similares, en las que la fuente de nitrógeno está representada por peptonas, urea, nitrato de amonio, y similares, mientras que la fuente convencional de carbono (glucosa, sacarosa) se ha sustituido o suplementado por ruscósido o desglucoruscósido. El mencionado medio se puede añadir de manera adicional con sales minerales de potasio, magnesio, manganeso, zinc, etc., tales como fosfatos, sulfatos y/o cloruros. El pH del medio d aislamiento puede oscila entre 4 y 6, de manera preferible entre 4,5 y 5,5.

Los microorganismos adecuados para las biotransformaciones requeridas se recuperan mediante reducción escalar y plaqueado de muestras de suelo, humus, extractos vegetales y otras fuentes orgánicas similares.

Los cultivos microbianos seleccionados tal como se ha descrito anteriormente se aíslan en tubos de ensayo de microbiología que contienen el mismo medio de cultivo, y se usan para la biotransformación de ruscósido y desglucoruscósido, añadidos en altas concentraciones (hasta 100 g/L) al medio líquido de cultivo que contiene las mismas fuentes de nitrógeno que se habían usado en el medio de aislamiento, tales como urea o peptona, con la adición de fosfatos y otras sales minerales, tal como se ha descrito anteriormente, a un pH que oscila entre 4 y 6, de manera preferible 4,5 - 5,5.

Siguiendo los procedimientos descritos, se ha encontrado que los cultivos seleccionados de Aspergillus niger son capaces de transformar ruscósido y desglucoruscósido en desglucodesramnoruscina, un precursor directo de las ruscogeninas, mediante una secuencia de reacciones enzimáticas con \beta-glucosidasa y \alpha-ramnosidasa.

Una reacción posterior con \alpha-arabinosidasa proporciona la saponina en forma aglicónica (ruscogenina - neuruscogenina).

El cultivo seleccionado es capaz de operar las mencionadas transformaciones creciendo en condiciones controladas (termostáticas), a temperaturas óptimas que oscilan entre 25ºC y 30ºC, bajo agitación en una plataforma rotatoria (200 - 300 rpm). Dicha fermentación se puede también llevar a cabo en un bioreactor adecuado, a una escala diferente de niveles, para la producción industrial de los derivados de saponina deseados.

Los microorganismos usados para la mencionada biotransformación son capaces de mantener continuamente la actividad catalítica, incluso durante repetidos ciclos de fermentación, en procedimientos continuos o discontinuos.

El presente procedimiento proporciona importantes ventajas tales como etapas menos complejas para la separación y recuperación del producto, y es también fácil de llevar a cabo, además de ahorrar costes.

Los microorganismos seleccionados se pueden congelar para el almacenamiento a largo plazo, en suspensiones enriquecidas con crioconservantes, tales como glicerol, peptona y similares, a temperaturas que oscilan entre -80ºC y -196ºC (en nitrógeno líquido) o se someten a tratamiento de secado por congelación.

El progreso de la bioconversión se puede monitorizar mediante análisis TLC y HPLC del medio de cultivo, usando los siguientes procedimientos analíticos:

Análisis TLC

- 60 placas de gel de sílice F250, de Merck

- Eluyentes:

A) Acetato de etilo - Metanol 9:1

B) Acetato de etilo - Metanol - Agua 100:15:10

- Detección: reacción con ácido sulfúrico al 10% y calentamiento a 120ºC durante 5 minutos, a continuación detección en el visible y en UV.

Análisis HPLC

- Columna: Supelcosil LC18, 250 x 4,6 mm, 5 \mum

- Eluyente: acetonitrilo - agua 60:40

- Longitud de onda: 200 nm

- Volumen de inyección: 10 \mul

- Caudal: 1 mL/min.

Se pueden recuperar los productos finales de la biotransformación, tales como desglucodesramnoruscina, mediante extracción del medio de cultivo con n-butanol, etapas de purificación subsiguientes con solventes clorados (tales como tricloroetano), y cromatografía en gel de sílice. Finalmente, el producto se puede cristalizar en diferentes solventes, tales como isopropanol, acetato de etilo, cloroformo, acetona y metanol. De manera adicional al producto principal, se pueden obtener desglucodesramnoruscinas esterificadas en C-2', por ejemplo con ácido 2-hidroxi-3-metilpentanoico.

Se obtienen saponinas en forma aglicólica (ruscogeninas) mediante hidrólisis ácida de los productos de fermentación descritos anteriormente.

Los siguientes ejemplos describen la invención con mayor detalle.

Ejemplo 1

2 matraces de medio de cultivo (caldo maltosado, 250 mL por matraz) se inocularon con esporas de un cultivo de Aspergillus niger sobre Agar de Malta, obtenidas mediante selección en medio maltosado de agar modificado (añadido con ruscósido al 2% ). Los matraces se incubaron durante 48 h a +27ºC, en un agitador orbital a 250 rpm. Tras la incubación, se transfirió el precultivo al bioreactor, que contenía aproximadamente 7 L de caldo de producción RO90 estéril, que tiene la siguiente composición (valores referidos a un litro de agua desionizada): extracto seco de ruscósido (90 g), urea (1 g), peptona (1 g), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (5 g), KCl (1,5 g), KH_{2}PO_{4} (1 g), MnSO_{4}\cdotH_{2}O (0,2 g), ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,1 g), antiespumante P2000 (1,5 mL), y aproximadamente pH 5.

La fermentación se levó a cabo en función del porcentaje de oxígeno disuelto (pO_{2}), aumentando progresivamente la velocidad de agitación y el caudal de aire, para obtener un valor de pO_{2} superior al 50%. El progreso de la bioconversión se monitorizó mediante análisis HPLC y TLC. Después de 5 días de incubación a +27ºC, la fermentación quedó finalizada. Los análisis TLC y HPLC del caldo muestran que el ruscósido ha desaparecido mientras que la desglucodesramnoruscina está presente como producto principal, con trazas de ruscogenina.

El caldo de cultivo se extrajo de manera exhaustiva con n-butanol. El extracto de butanol se concentró hasta sequedad bajo vacío a +60ºC, se redisolvió en metanol al 70% y se extrajo posteriormente con tricloroetano. La solución clorada se concentró hasta un sólido bajo vacío. Tras la redisolución en una mezcla de cloroformo-metanol, el producto se purificó mediante cromatografía en columna (Kieselgel, Merck) con acetato de etilo-cloroformo 9:1 como eluyente. Las fracciones se chequearon mediante análisis con TLC o HPLC. La fracción purificada de producto se concentró bajo vacío, se redisolvió a continuación en acetona y se cristalizó. Una cristalización adicional en metanol dio como resultado aproximadamente 7 g de producto, identificado mediante análisis espectroscópico como desglucodesramnoruscina. De manera adicional al producto principal, se obtuvo una desglucodesramnoruscina esterificada con ácido 2-hidroxi-3-metilpentanoico en menor cantidad (aproximadamente 800 mg).

La hidrólisis ácida de los productos de fermentación descritos anteriormente da como resultado las saponinas en forma aglicónica (ruscogeninas).

Ejemplo 2

Operando en un fermentador tal como se ha descrito en el ejemplo 1, se llevó a cabo un primer ciclo de biotransformación, después de que se tomara el 90% del caldo de cultivo para ser extraído para obtener el producto; el 10% restante del caldo de fermentación se añadió en el fermentador con medio RO90 fresco hasta un volumen final de aproximadamente 7 L. Este segundo ciclo de fermentación se llevó a cabo con los mismos parámetros y controles analíticos tal como se ha descrito anteriormente. Después de aproximadamente 5 días de incubación a +27ºC, se completó la fermentación.

Los caldos de cultivo de los dos ciclos de fermentación se trataron tal como se ha descrito en el ejemplo 1 para la extracción y recuperación del producto. Al término de la etapa final, se obtuvieron aproximadamente 14 g de desglucodesramnoruscina.

Claims (8)

1. Un procedimiento para la preparación de desglucodesramnoruscina que comprende la hidrólisis de los enlaces heterosídicos de ramnosa/arabinosa de los glicósidos esteroideos de Ruscus aculeatus, a través de la fermentación de un sustrato que contiene dichos glicósidos por medio de hongos de la especie Aspergillus niger obtenidos mediante selección en un medio de cultivo en el que se ha sustituido o suplementado la fuente de carbono convencional por ruscósido o desglucoruscósido.

2. Un procedimiento tal como el que se reivindica en la reivindicación 1, en el que el mencionado sustrato es un caldo de cultivo.

3. Un procedimiento tal como el que se reivindica en la reivindicación 2, en el que la mencionada fermentación se lleva a cabo a una temperatura de 25-30ºC, bajo agitación y burbujeo de aire con el fin de alcanzar una pO_{2} superior que, o igual al, 50%.

4. Un procedimiento tal como el que se reivindica en la reivindicación 3 en el que la temperatura es de 27ºC.

5. Un procedimiento tal como el que se reivindica en la reivindicación 3 en el que la concentración de partida de los mencionados glicósidos esteroideos oscila entre 5 y 15% p/v.

6. Un procedimiento tal como el que se reivindica en la reivindicación 5, en el que la mencionada concentración oscila entre 8 y 10% p/v.

7. Un procedimiento tal como el que se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el pH del caldo de cultivo oscila entre 4 y 6.

8. Un procedimiento tal como el que se reivindica en la reivindicación 7, en el que el pH del caldo de cultivo oscila entre 4,5 y 5,5.