ES2199358T3 - Uso de clotrimazol y compuestos relacionados en el tratamiento de la diarrea. - Google Patents
Uso de clotrimazol y compuestos relacionados en el tratamiento de la diarrea.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES Y A SU USO FARMACEUTICO O VETERINARIO DE COMPUESTOS AROMATICOS PARA LA PREVENCION O EL TRATAMIENTO DE LA DIARREA. LOS COMPUESTOS SE CORRESPONDEN CON LA FORMULA (I) Y MAS PREFERIBLEMENTE SON CLOTRIMAZOLA O SUS METABOLITOS (PARTICULARMENTE 2-CLORO-FENIL-BISFENIL-METANOL) O SON MICONAZOLA O ECONAZOLA.
Description
Uso de clotrimazol y compuestos relacionados en
el tratamiento de la diarrea.
Las diarreas agudas y crónicas representan un
problema médico importante en muchas áreas del mundo. La diarrea es
un factor importante en la malnutrición y la principal causa de
muerte (5_{1}000.000 muertes/año) en niños menores de cinco
años. Las diarreas secretoras son también un estado peligroso en
pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y con
enfermedad inflamatoria crónica intestinal (IBD) (del inglés,
`` Inflammatory Bowel Disease'').
Dieciséis millones de personas que viajan a países en vías de
desarrollo desde naciones industrializadas todos los años,
manifiestan diarrea, variando la gravedad y el número de casos de
diarrea dependiendo del país y área del viaje. Las principales
consecuencias médicas de las enfermedades diarreicas incluyen
deshidratación, acidosis, muerte y trastornos del crecimiento.
La diarrea en animales de establo y mascotas
tales como vacas, cerdos y caballos, ovejas, cabras, gatos y
perros, conocida también como disentería, es una causa importante
de muerte en estos animales. La diarrea puede ser el resultado de
cualquier cambio importante, tal como el destete o movimiento
físico. Una de las formas de la diarrea se caracteriza por una
diarrea en respuesta a una infección bacteriana o vírica y
generalmente se presenta en las primeras horas de la vida del
animal.
Aunque las principales consecuencias de las
enfermedades diarreicas son muy similares, existen numerosas causas
de diarrea. La diarrea secretora y la diarrea exudativa están
causadas principalmente por infecciones bacterianas o víricas. La
bacteria más común causante de diarrea es la E. coli
enterotoxinógena (ETEC) que lleva el antígeno K99 pilus. Los virus
comúnmente causantes de diarreas incluyen los rotavirus y los
coronavirus. Otros agentes infecciosos incluyen
cryptosporodium, giardia lamblia y salmonella,
entre otros.
El tratamiento de la diarrea depende del paciente
y de la fuente de infección. La diarrea encontrada en personas que
viajan a naciones industrializadas (diarrea del viajero) suele
estar causada por patógenos bacterianos que se han adquirido a
través de la ingestión de alimentos y/o agua con contaminación
fecal. Aproximadamente 50%-75% de estos casos son atribuidos a ETEC.
Aunque la diarrea del viajero es dolorosa, por lo general no es
potencialmente mortal y a menudo los síntomas duran sólo
3-5 días. Los síntomas incluyen diarrea urgente,
espasmos abdominales, nauseas y fiebre. El método de tratamiento
más efectivo para la diarrea del viajero es la administración de
antibióticos junto con la rehidratación oral. Se ha demostrado que
la administración profiláctica de antibióticos disminuye
drásticamente el número de viajeros que experimentan síntomas de
diarrea. Sin embargo, la administración periódica de antibióticos
no es aconsejada porque puede hacer que se desarrollen cepas
resistentes. Otros métodos de tratamiento incluyen la
administración de subsalicilato de bismuto, con frecuencia tomado
en forma de Pepto-Bismal, difenoxilato y
loperamida.
La diarrea en pacientes con SIDA es un estado muy
grave que produce agotamiento y puede ser un factor importante en
el empeoramiento de estos pacientes. Los pacientes con SIDA con
frecuencia manifiestan diarrea debido a infecciones entéricas
contra las que su sistema inmunitario es incapaz de luchar, pero los
pacientes con SIDA pueden también presentar diarrea producida por
la enteropatía asociada al SIDA. La enteropatía asociada al SIDA
es un trastorno caracterizado por diarrea sin implicación de
infecciones secundarias. Está causada por la infección de las
células de la mucosa del intestino delgado y de células de la
mucosa del colon, con el virus de la inmunodeficiencia humana
(HIV). El agente infeccioso más común causante de la diarrea debida
a una infección entérica en pacientes con SIDA es
cryotosporidium. Los métodos para el tratamiento de la
diarrea en pacientes con SIDA incluyen la administración de
antibióticos y la administración de inmunoglobulinas o de una
fracción de calostro bovino, enriquecida con inmunoglobulinas. El
calostro, que es la primera leche producida por mamíferos después
del alumbramiento, está enriquecida con anticuerpos.
La diarrea aguda o disentería, es una de las
principales causas de muerte en muchos animales de establo recién
nacidos, tales como terneros y cerdos. La disentería suele estar
causada por la ETEC que lleva un antígeno K99 pilus. La infección
con la ETEC produce una hipersecreción de fluidos y electrolitos. La
hipersecreción a su vez causa deshidratación y desequilibrio del
pH, lo que puede producir la muerte del ternero o cerdo recién
nacido.
Los animales de establo recién nacidos son
también susceptibles a agentes infecciosos víricos causantes de
disentería. Las infecciones con rotavirus y coronavirus son
comunes en terneros y cerdos recién nacidos. La infección con
rotavirus suele tener lugar dentro de las 12 horas después del
nacimiento. Los síntomas de la infección con rotavirus incluyen la
excreción de heces líquidas, deshidratación y debilidad. El
coronavirus, que origina una enfermedad más grave en los animales
recién nacidos, tiene una tasa de mortalidad más alta que la de la
infección con rotavirus. Con frecuencia, sin embargo, un animal
joven puede ser infectado con más de un único virus o con una
combinación microorganismos víricos y bacterianos al mismo tiempo.
Esto aumenta de manera espectacular la gravedad de la
enfermedad.
Generalmente, la mejor protección para un animal
de establo recién nacido frente infecciones víricas o bacterianas
es el consumo de calostro. Si el animal madre ha estado expuesto a
estos agentes infecciosos, el calostro contendrá anticuerpos, los
cuales suelen ser suficientes para proteger al recién nacido de
contraer las enfermedades. Sin embargo, a veces esto no es
suficiente y los animales necesitan una protección adicional. Un
método común de tratamiento incluye la administración de una
disolución concentrada de calostro o de una fracción de
inmunoglobulina aislada de una disolución de calostro. Este
tratamiento oral puede combinarse con sales de rehidratación.
Aunque estos métodos han mejorado la tasa de morbilidad y
mortalidad de animales recién nacidos que presentan disentería,
sigue existiendo la necesidad de tratamientos más efectivos.
Algunos imidazoles, tales como el clotrimazol,
son agentes que se han utilizado como antifúngicos tanto por vía
tópica como por vía sistémica. Más recientemente, unos estudios han
identificado otros usos de esos imidazoles. La Patente de EE.UU.
n.º 5.273.992 reveló que estos imidazoles regulan los canales de
K^{+} activados por Ca^{++} en eritrocitos, y de este modo son
útiles en el tratamiento de la anemia de células falciformes, que
implica la inhibición del transporte de potasio. También se ha
encontrado que estos imidazoles son efectivos en la inhibición de
la proliferación de células de músculo liso endoteliales y/o
vasculares. Los resultados de este descubrimiento se encuentran
descritos en la Patente de EE.UU. n.º 5.358.959 y en el documento
US, n.º de serie 08/018.840, que describen el uso de clotrimazol
para tratar estados ateroscleróticos y angiogénicos,
respectivamente. Metabolitos y análogos no imidazólicos de los
siguientes compuestos se han descrito también como útiles en el
tratamiento de los estados anteriormente mencionados (véanse los
documentos US, n.º de serie 08/307.874 y 08/307.887).
El presente invento proporciona métodos y
productos para tratar la diarrea y la disentería. Se ha descubierto
que compuestos aromáticos son efectivos en el tratamiento de
pacientes con diarrea. Estos compuestos son potentes inhibidores de
la secreción transepitelial y electrógena de cloruro, estimulada
por secretagogos en células intestinales.
Según uno de los aspectos del invento, se
proporciona un método para tratar diarreas de etiología diversa. El
método comprende administrar a un sujeto que necesita ese
tratamiento, un compuesto aromático del invento en una cantidad
efectiva para inhibir la diarrea. Preferiblemente el compuesto se
administra por vía oral junto con fluidos de rehidratación oral.
Los compuestos aromáticos útiles en el invento tienen la siguiente
fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \hskip-3mm Ar ^{1} \cr \+
\hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm X\cr \+
\hskip-2mm |\cr Ar ^{2} --- \+
\hskip-3mm C---O _{p} ---(CH _{2} ) _{n} R'\cr
\+ \hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm Ar ^{3} \cr}
en la que n = 0-3; en la que p =
0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por
(CH_{2})_{m} (m=1,2 ó 3), CH=CH, C\equivC, SCH_{2},
OCH_{2} y NOCH_{2}; en la que R' se selecciona entre el grupo
constituido por H, OH, SH, NO_{2}, CN, CHO, ONH_{2}, COR'',
CO_{2}H, CO_{2}R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', furanilo,
piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR''(OCH_{3}); en
la que Ar^{1} se selecciona entre el grupo constituido por
fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar^{2} se
selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo
sustituido; en la que Ar^{3} se selecciona entre el grupo
constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y
naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el
grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO_{2}, CN,
CF_{3}, NR''R'', y CO_{2}R; en la que R se selecciona entre el
grupo constituido por un alquilo lineal de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo lineal sustituido de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo ramificado de C_{Z}
(Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de
C_{Z} (Z=1-5); en la que el sustituyente del
alquilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, Br, F, I,
OH, OCH_{3}, SH, SH_{3}, NH_{2}, NHCH_{3} y
N(CH_{3})_{2}; y en la que R'' se selecciona
entre el grupo constituido por hidrógeno y
R.
Un grupo heteroarilo incluye, pero no se limita a
ellos, furanilo, imidazol, piridinilo, tiofenilo, indolilo,
imidazolilo y quinolilo.
En una realización preferida del invento, el
compuesto aromático es un metabolito del clotrimazol.
En una de las realizaciones del invento, los
compuestos aromáticos anteriormente mencionados pueden
administrarse en combinación con otros agentes antidiarreicos. En
otras realizaciones, los compuestos aromáticos pueden administrarse
en combinación con otros agentes antidisentéricos.
Según una de las realizaciones del invento, el
sujeto que necesita ese tratamiento es un sujeto que presenta
síntomas de diarrea o disentería. En otra realización del invento,
el sujeto que necesita ese tratamiento es un sujeto con riesgo de
desarrollar diarrea o disentería.
Según otro aspecto del invento, se proporcionan
preparaciones farmacéuticas. Estas preparaciones farmacéuticas
incluyen los compuestos aromáticos del invento junto con un agente
antidiarreico. En una de las realizaciones, los compuestos
aromáticos útiles según el invento, tienen la fórmula general
anteriormente proporcionada. En otra realización más, los
compuestos aromáticos útiles según el invento tienen la fórmula
general anteriormente descrita, pero en la que R' y Ar^{1} no
incluyen imidazoles. Preferiblemente, la composición farmacéutica
del invento puede administrarse por vía oral.
Según otro aspecto del invento, se proporcionan
preparaciones veterinarias. Estas preparaciones veterinarias
incluyen los compuestos aromáticos útiles según el invento junto
con una preparación antidisentérica. En una de las realizaciones,
los compuestos aromáticos del invento tienen la fórmula general
anteriormente proporcionada. En otra realización más, los
compuestos aromáticos útiles según el invento tienen la fórmula
general anteriormente descrita, pero en la que R' y Ar^{1} no
incluyen imidazoles.
El invento también proporciona los compuestos
aromáticos del invento en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de la diarrea. En una de las realizaciones, los
compuestos aromáticos del invento tienen la fórmula general
anteriormente descrita, pero no incluyen clotrimazol. En otra
realización, los compuestos aromáticos útiles en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento de la diarrea tienen la fórmula
general anteriormente descrita, pero en la que R' y Ar^{1} no
incluyen imidazoles.
El invento también proporciona los compuestos
aromáticos del invento en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de disentería. En una de las realizaciones, los
compuestos aromáticos del invento tienen la fórmula general
anteriormente descrita, pero no incluyen clotrimazol.
En otra realización, los compuestos aromáticos
útiles en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
disentería tienen la fórmula general anteriormente descrita, pero
en la que R' y Ar^{1} no incluyen imidazoles.
La Figura 1 es un diagrama de barras que
representa el efecto del clotrimazol en la inhibición de la
secreción de Cl^{-} dependiente de cAMP y Ca^{++} en células
T84.
La Figura 2 es una gráfica que muestra el efecto
de clotrimazol sobre la inhibición del valor de base y la efusión
de ^{86}Rb estimulada por Ca^{++} en monocapas de células
T84.
El invento implica el uso de un producto para
disminuir los síntomas de la diarrea o para prevenir la diarrea en
un sujeto con riesgo de manifestarla. Los compuestos del invento
son compuestos aromáticos. Los compuestos aromáticos útiles según
el invento se proporcionan en una preparación farmacéutica y en una
preparación veterinaria. Los compuestos aromáticos del invento son
también útiles en un método para tratar diarrea y disentería así
como en un método para prevenir diarrea y disentería.
Los compuestos aromáticos que se sabe que son
útiles en el invento tienen la siguiente fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \hskip-3mm Ar ^{1} \cr \+
\hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm X\cr \+
\hskip-2mm |\cr Ar ^{2} --- \+
\hskip-3mm C---O _{p} ---(CH _{2} ) _{n} R'\cr
\+ \hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm Ar ^{3} \cr}
en la que n = 0-3; en la que p =
0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por
(CH_{2})_{m} (m=1,2 ó 3), CH=CH, C\equivC, SCH_{2},
OCH_{2} y NOCH_{2}; en la que R' se selecciona entre el grupo
constituido por H, OH, SH, NO_{2}, CN, CHO, ONH_{2}, COR'',
CO_{2}H, CO_{2}R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', furanilo,
piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR''(OCH_{3}); en
la que Ar^{1} se selecciona entre el grupo constituido por
fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar^{2} se
selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo
sustituido; en la que Ar^{3} se selecciona entre el grupo
constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y
naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el
grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO_{2}, CN,
CF_{3}, NR''R'', y CO_{2}R; en la que R se selecciona entre el
grupo constituido por un alquilo lineal de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo lineal sustituido de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo ramificado de C_{Z}
(Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de
C_{Z} (Z=1-5); en la que el sustituyente del
alquilo se selecciona entre el grupo constituido por Cl, Br, F, I,
OH, OCH_{3}, SH, SH_{3}, NH_{2}, NHCH_{3} y
N(CH_{3})_{2}; y en la que R'' se selecciona
entre el grupo constituido por hidrógeno y
R.
Un grupo heteroarilo incluye, pero no se limita a
ellos, furanilo, imidazol, piridinilo, tiofenilo, indolilo,
imidazolilo y quinolilo.
Los compuestos que se cree son útiles según el
invento son metabolitos del clotrimazol, que tienen la siguiente
estructura química:
Los compuestos aromáticos del invento se
encuentran comercialmente disponibles, derivan de compuestos
comercialmente disponibles, o se sintetizan de novo
utilizando procedimientos rutinarios de síntesis química conocidos
por los que tienen una experiencia normal en la técnica.
Diarrea, según aquí se utiliza, indica un
síndrome médico que está caracterizado por los síntomas de diarrea
o disentería. La diarrea puede dividirse en tres categorías
basándose en el mecanismo subyacente: exudativa, por malabsorción y
secretora. Las diarreas exudativas son el resultado de procesos
inflamatorios que conducen a una absorción colónica alterada y al
vertido de células y coloides producido por esos trastornos tales
como colitis ulcerosa, shigelosis y amebiasis. Los trastornos de
malabsorción incluyen alteraciones osmóticas, anatómicas y
trastornos de motilidad. La diarrea osmótica puede producirse como
resultado de anormalidades digestivas tales como la intolerancia a
la lactosa. La alteración anatómica da como resultado una
superficie de absorción disminuida causada por procedimientos tales
como la colectomía subtotal y la fístula gastrocólica. Los
trastornos de motilidad son el resultado de un tiempo de contacto
disminuido resultante de enfermedades tales como el hipertiroidismo
y el síndrome del intestino irritable. La diarrea secretora se
caracteriza por la hipersecreción de líquidos y electrolitos por
las células de la pared intestinal. En la forma clásica, la
hipersecreción es debida a cambios que son independientes de la
permeabilidad, capacidad de absorción y gradientes osmóticos,
generados de manera exógena dentro del intestino. No obstante,
todas las formas de diarrea pueden manifestar un componente
secretor.
Los métodos y productos del invento son
particularmente útiles en el tratamiento de la diarrea que es
secretora. Sin embargo, los métodos y productos del invento pueden
también ser útiles en combinación con otros métodos de tratamiento
que son conocidos en la técnica para tratar la diarrea causada por
malabsorción o inflamación. Los compuestos del invento están
implicados en la regulación de la secreción de Cl^{-} y son
capaces de actuar solos o cuando se usan en combinación con otros
métodos de tratamiento para disminuir la secreción neta de líquidos
incluso cuando ésta es debida principalmente a anormalidades en la
absorción o a inflamación.
Los métodos y productos del invento son útiles
para prevenir la diarrea y disentería en sujetos con riesgo de
desarrollar estos trastornos. Los sujetos con riesgo de
desarrollar diarrea y disentería son aquellos sujetos que tienen una
alta probabilidad de exposición a los microorganismos bacterianos
y víricos que causan estos síntomas. Por ejemplo, aproximadamente
1/3 de las personas que viajan a países en vías de desarrollo,
padecerán diarreas; la infección con rotavirus es una de las causas
productoras de muerte en niños de países en vías de desarrollo;
los pacientes con HIV tienen una probabilidad mayor que el 50% de
manifestar diarrea, y muchos terneros y cerdos recién nacidos
desarrollan disentería. Los pacientes con enfermedad inflamatoria
intestinal manifiestan diarreas recurrentes.
Los métodos y productos del invento son también
útiles en el tratamiento de sujetos que ya exhiben los síntomas de
diarrea y disentería. Una vez que un sujeto se ha expuesto a un
microorganismo causante de los síntomas, el sujeto puede ser
tratado con los métodos y productos del presente invento con el fin
de disminuir los síntomas. Los síntomas de la diarrea incluyen
irregularidad intestinal, fluido fecal rico en sodio y potasio,
heces líquidas, deshidratación fiebre, pérdida de peso corporal,
dolor de cabeza, anorexia, vómitos, malestar y mialgia. Los
síntomas de la disentería incluyen pérdida de peso corporal o
retraso del crecimiento, deshidratación, heces malolientes, heces
líquidas, heces que contienen trozos de leche o de material
semisólido parcialmente digeridos y heces de color blanco
amarillento o pardo.
Uno de los productos del invento es una
preparación veterinaria de un compuesto aromático del invento,
utilizado solo o mezclado con un agente antidisentérico. Un agente
antidisentérico es una composición que se sabe que es útil para
prevenir o inhibir los síntomas de la disentería. Las composiciones
conocidas incluyen, por ejemplo, extractos de calostro, tales como
los descritos en la Patente de EE.UU. n.º 4.377.569 y Patente de
Canadá n.º 1.175.352, y composiciones de amplia disponibilidad
comercial (p. ej., Soluble Colostrum Powder, fabricado por
VedCo, Inc., St. Joseph MO; Colostrum Bolus II, fabricado por
RX Veterinary Products, Kansas City MO, etc.); una
preparación inmunológica de calostro aislada de mamíferos
productores de leche que pueden haberse inmunizado contra
determinados microorganismos causantes de diarreas, como las
descritas en la Patente de EE.UU. n.º 4.834.974, Patente de
Australia n.º 39340/89, Patente de Australia n.º 52547/90, y
Patente de Alemania n.º 1.560.344; preparaciones inmunológicas
específicas de microorganismos, que incluyen anticuerpos
monoclonales derivados de hibridomas y específicos de
microorganismos, tales como los descritos en Sherman y col.,
Infection and Immunity, Vol. 42(2), Págs.
653-658 (1983) y una fracción de inmunoglobulina
bovina preparada a partir de plasma bovino o de suero bovino
purificado, tal como la fracción descrita en la Patente de EE.UU.
n.º 3.984.539; fluidos de rehidratación oral y/o composiciones de
reposición de electrolitos que tienen una amplia disponibilidad
comercial en forma de composiciones secas o de disoluciones
liquidas, preparadas para administración oral o intravenosa (p. ej.,
Electrolyte H, fabricada por Agri-Pet
Inc., Aubrey TX; Electrolyte Powder 8x, fabricada por
Phoenix Pharmaceutical Inc. St. Joseph MO; Electrolyte
Solution Rx, fabricada por Lextron Inc., Greeley CO, ProLabs
LTD, St. Joseph MO, y VetTeK Inc., Blue Springs
MO; Calf Rehydrate, fabricada por Durvet Inc., Blue
Springs MO, etc., y composiciones antibióticas que se
encuentran comercialmente disponibles (p. ej., BIOSOL®
Liquid, fabricado por The UpJohn Company Animal Health
Division, Kalamazoo MI; AMOXIBOL®, fabricada por
SmithKline-Beecham Animal Health, Exton PA;
5-WAY CALF SCOUR BOLUS™, fabricada por
Agro Laboratories LTD, St. Joseph MO;
1-A-DAY CALF SCOUR BOLUS,
fabricada por A.H.A.; GARACIN® PIG PUMP, fabricada por
Schering-Plough Animal Health Corporation,
Kenilworth NJ, etc.).
En una de las realizaciones, los compuestos
aromáticos útiles en la preparación veterinaria incluyen los
compuestos aromáticos de la fórmula general anteriormente
proporcionada.
En otra realización, los compuestos aromáticos
útiles en la preparación veterinaria incluyen los compuestos
aromáticos de la fórmula general anteriormente proporcionada, pero
en la que Ar^{1} no incluye imidazol.
En una de las realizaciones, la preparación
veterinaria es una preparación seca del compuesto aromático del
invento y de un agente antidisentérico. La preparación seca puede
administrarse directamente o puede hidratarse y/o diluirse en una
disolución líquida antes de la administración. En otra realización,
la preparación veterinaria es una disolución líquida del compuesto
del invento y un agente antidisentérico.
Otro producto del invento es una preparación
farmacéutica de un compuesto aromático del invento y un agente
antidiarreico. Un agente antidiarreico incluye, por ejemplo, una
preparación de inmunoglobulinas procedentes de calostro bovino;
lomotil; un fluido de rehidratación intravenosa u oral; una
composición salina seca de rehidratación; una composición de
reposición de electrolitos (en forma seca o líquida); una
disolución o composición seca de azúcares y electrolitos, para
administración oral o intravenosa; un antibiótico tal como
tetraciclina, trimetropima o sulfametoxazol; un fármaco derivado
de quinolonas tal como norfloxacino o ciprofloxacino, subsalicilato
de bismuto, difenoxilato; y loperamida.
En una de las realizaciones, los compuestos
aromáticos útiles en la preparación farmacéutica incluyen los
compuestos aromáticos de la fórmula general anteriormente
proporcionada.
En otra realización, los compuestos aromáticos
útiles en la preparación farmacéutica incluyen los compuestos
aromáticos de la fórmula general anteriormente proporcionada, pero
en la que Ar^{1} no incluye imidazol.
En una de las realizaciones, la preparación
farmacéutica es una preparación seca del compuesto aromático del
invento y de un agente antidiarreico. La preparación seca puede
administrarse directamente o puede hidratarse y/o diluirse en una
disolución líquida antes de la administración. En otra realización,
la preparación farmacéutica es una disolución líquida del
compuesto del invento y un agente antidiarreico.
Un sujeto, según aquí se utiliza, significa seres
humanos, primates, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cabras, gatos y
perros.
El momento de la administración de los compuestos
aromáticos útiles según el invento varía dependiendo del propósito
de la administración. Cuando los compuestos del invento se
administran con el fin de prevenir la aparición de diarrea en
sujetos que viajan a áreas con alto riesgo de exposición a agentes
infecciosos, o en sujetos expuestos por otros motivos a agentes
causantes de diarrea, los compuestos deben administrarse durante
el tiempo que el sujeto está expuesto al riesgo o se encuentra en
el área de alto riesgo. Cuando los compuestos se administran a los
sujetos con el fin de prevenir la aparición de disentería, la
preparación veterinaria debe administrarse en las primeras 12
horas después del nacimiento, y preferiblemente en las primeras 4
horas después del nacimiento. Cuando los compuestos del invento se
utilizan para tratar a sujetos que presentan síntomas de diarrea o
disentería, los compuestos pueden administrarse en cualquier
momento en el que el sujeto esté experimentando los síntomas, y
preferiblemente tan pronto como los síntomas se manifiestan.
Cuando se administran, las formulaciones del
invento se aplican en cantidades farmacéuticamente aceptables y en
composiciones farmacéuticamente aceptables. Esas preparaciones
normalmente pueden contener sales, tampones, conservantes,
excipientes compatibles, y opcionalmente otros componentes
terapéuticos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser
farmacéuticamente aceptables, pero sales no farmacéuticamente
aceptables pueden utilizarse de manera conveniente para preparar
sus sales farmacéuticamente aceptables, y no están excluidas del
alcance del invento. Esas sales farmacológica y farmacéuticamente
aceptables incluyen, sin limitarse a ellas, las sales preparadas a
partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico,
sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico,
p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico,
metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico,
naftalén-2-sulfónico y
bencenosulfónico. Asimismo, las sales farmacéuticamente aceptables
pueden prepararse en forma de sales de metales alcalinos o
alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio, del
grupo de los ácidos carboxílicos.
Los tampones adecuados incluyen: tampones de
ácido acético y una sal (al 1%-2% p/v), ácido cítrico y una sal (al
1%-3% p/v); ácido bórico y una sal (al 0,5%-2,5% p/v); y ácido
fosfórico y una sal (al 0,8%-2% p/v).
Los conservantes adecuados incluyen cloruro de
benzalconio (al 0,003%-0,03% p/v); clorobutanol (al 0,3%-0,9% p/v),
parabenos (al 0,01%-0,25% p/v) y timerosal (al 0,004%-0,02%
p/v).
Los principios activos del presente invento
pueden ser composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad
terapéuticamente efectiva de un compuesto aromático de la fórmula
general anteriormente proporcionada, en combinación con un agente
antidiarreico, opcionalmente incluido en un excipiente
farmacéuticamente aceptable. Los principios activos del presente
invento también pueden ser composiciones veterinarias que contienen
una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto aromático
de la fórmula general anteriormente proporcionada, en combinación
con un agente antidisentérico, opcionalmente incluido en un
excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión ``excipiente
farmacéuticamente aceptable'' según aquí se utiliza, significa,
una o más sustancias de relleno, diluyentes o sustancias de
encapsulado, sólidas o líquidas, y compatibles, que son adecuadas
para la administración a un ser humano u otro animal. El término
``excipiente'' indica un componente orgánico o inorgánico, natural
o sintético, con el que el principio activo se mezcla para
facilitar su aplicación. Los componentes de las composiciones
farmacéuticas también son capaces de mezclarse con el compuesto del
presente invento, con los agentes antidiarreicos o
antidisentéricos, y entre ellos mismos, de manera tal que no
existe interacción alguna que altere sustancialmente la eficacia
farmacéutica deseada.
Un vehículo común de administración (p. ej.,
pastillas, comprimidos, bolo, polvo o disolución para dilución,
bomba Pig, implante, disolución inyectable, etc.) contendría los
dos componentes útiles en este invento y el agente antidiarreico o
el agente antidisentérico. Por lo tanto, el presente invento
proporciona composiciones farmacéuticas o veterinarias, para uso
médico o veterinario, que comprenden los principios activos del
invento junto con uno o más excipientes farmacéuticamente
aceptables para ellos y otros componentes terapéuticos.
Las formulaciones del invento se administran en
cantidades efectivas. Una cantidad efectiva es una cantidad
suficiente para inhibir la secreción de Cl^{-} de las células
del epitelio intestinal, disminuyendo con ello de manera efectiva la
respuesta secretora, y produciendo por lo tanto una disminución de
la diarrea o disentería y/o de sus síntomas. Las cantidades
efectivas dependerán, evidentemente, del estado particular que
está siendo tratado; de la gravedad de ese estado; de los parámetros
individuales del paciente que incluyen edad, estado físico, tamaño
y peso; tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento; y el
modo de administración. Estos factores son muy conocidos por los
expertos en la técnica y pueden manejarse con una experimentación
no mayor que la habitual. En general se prefiere utilizar una dosis
máxima, es decir, la dosis inocua más alta conforme a un criterio
médico razonable, en particular si la diarrea o disentería agudas
son la manifestación clínica dominante.
La dosificación puede ajustarse de manera
apropiada para alcanzar los niveles plasmáticos deseados del
fármaco. En general, dosis orales diarias de los principios
activos serán desde aproximadamente 0,01 miligramos/kg por día hasta
1.000 miligramos/kg por día. Se espera que dosis orales en el
intervalo de 50 a 500 miligramos/kg, en una o varias
administraciones por día, produzcan los resultados deseados. En
caso de que la respuesta de un sujeto sea insuficiente a esas
dosis, pueden emplearse dosis incluso más altas (o dosis efectivas
más altas administradas por una vía de suministro diferente, más
localizada) en la medida en que la tolerancia del paciente lo
permita. Se contempla que dosis múltiples por día alcanzan los
niveles sistémicos apropiados de los compuestos.
Pueden utilizarse diversas vías de
administración. El modo particular seleccionado dependerá
evidentemente, del fármaco concreto seleccionado, de la gravedad de
la diarrea o disentería que está siendo tratada y de la dosificación
requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de este
invento, hablando en sentido amplio, pueden llevarse a la práctica
utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente
aceptable, lo que significa cualquier modo que produzca niveles
efectivos de los principios activos sin producir efectos adversos
clínicamente inaceptables. Esos modos de administración incluyen
las vías oral, rectal, tópica, nasal, transdérmica o parenteral.
El término ``parenteral'' incluye la vía subcutánea, intramuscular o
por infusión. Las vías intravenosa e intramuscular no son
particularmente adecuadas para una terapia y profilaxis a largo
plazo. Sin embargo estas vías pueden ser las preferidas en
situaciones de urgencia. La administración oral será la preferida
para el tratamiento profiláctico debido a la comodidad para el
sujeto así como para la pauta posológica.
Las composiciones pueden ir presentadas
convenientemente en forma de dosis unitarias y pueden prepararse
mediante cualquiera de los métodos perfectamente conocidos en la
técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar
los principios activos con un excipiente que constituye uno o más
componentes accesorios. En general, las composiciones se preparan
asociando los principios activos de manera uniforme e íntima con
un excipiente líquido, un excipiente sólido finamente dividido, o
ambos, y luego, en caso necesario, dando forma al producto.
Las composiciones adecuadas para la
administración oral pueden presentarse en forma de unidades
discretas tales como cápsulas, sellos, comprimidos o tabletas,
conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada del
principio activo. Otras composiciones incluyen suspensiones y
licores acuosos o líquidos no acuosos tales como un jarabe, un
elixir o una emulsión. Los principios activos administrados por vía
oral pueden estar en cualquiera de las formas adecuadas para la
administración oral, p. ej., pastilla, comprimido, bolo, disolución
bebible, composición líquida o en polvo para ser diluida o
mezclada con alimento, bomba Pig, etc.
Las composiciones adecuadas para administración
parenteral comprenden convenientemente una preparación
acuosa estéril del principio activo, que preferiblemente es isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede formularse conforme a métodos conocidos utilizando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo, una disolución de 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la disolución de Ringer y la disolución isotónica de cloruro sódico. Además, como disolvente o medio de suspensión convencionalmente se emplean aceites no volátiles estériles. Para este propósito puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico, son útiles en la preparación de inyectables. Formulaciones de excipientes adecuadas para administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc., pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Easton, PA.
acuosa estéril del principio activo, que preferiblemente es isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede formularse conforme a métodos conocidos utilizando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo, una disolución de 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la disolución de Ringer y la disolución isotónica de cloruro sódico. Además, como disolvente o medio de suspensión convencionalmente se emplean aceites no volátiles estériles. Para este propósito puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico, son útiles en la preparación de inyectables. Formulaciones de excipientes adecuadas para administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc., pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Easton, PA.
Otros sistemas de suministro pueden incluir
sistemas de suministro de liberación por tiempos, retardada o
prolongada. Esos sistemas son capaces de evitar las
administraciones repetidas de los principios activos del invento,
aumentando la comodidad para el sujeto y para el médico. Los
expertos con una capacitación normal en la técnica conocen y
pueden disponer de muchos tipos de sistemas de suministro y
liberación. Estos sistemas incluyen sistemas basados en polímeros
tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico),
polianhídridos y policaprolactona; sistemas no poliméricos que son
lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de
colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como
monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos; sistemas de
liberación que utilizan hidrogeles; sistemas que utilizan
Silastic; sistemas basados en péptidos; revestimientos con cera,
comprimidos que usan agentes aglutinantes y excipientes
convencionales, implantes parcialmente fusionados y sistemas
similares. Algunos ejemplos específicos incluyen, sin limitarse a
ellos: (a) sistemas de erosión en los que el polisacárido está
contenido en una forma incluida en una matriz, encontrados en las
Patentes de EE.UU. números 4.452.775 (Kent); 4.667.014 (Nestor y
col.,); y 4.748.034 y 5.239.660 (Leonard) y (b) sistemas de
difusión en los que un principio activo se infiltra a través de un
polímero a una velocidad controlada, encontrados en las Patentes
de EE.UU. números 3.832.253 (Higuchi y col.,) y 3.854.480
(Zaffaroni). Además, puede utilizarse sistemas de suministro con un
soporte físico basado en una bomba, algunos de los cuales se han
adaptado para ser implantados.
El uso de un implante de liberación prolongada a
largo plazo puede ser particularmente adecuado para el tratamiento
de la diarrea en pacientes inmunodeficientes, que necesitan una
administración continua de las composiciones del invento.
Liberación ``a largo plazo'', según aquí se utiliza, significa que
el implante se construye y se dispone para que suministre los
niveles terapéuticos del principio activo durante al menos 30
días, y preferiblemente durante al menos 60 días. Los implantes de
liberación prolongada a largo plazo son muy conocidos por los
expertos en la técnica e incluyen algunos de los sistemas de
liberación anteriormente descritos.
La base bioquímica de la diarrea secretora
implica la secreción intestinal de Cl^{-} en las células
intestinales de las criptas. En condiciones normales, los iones
Cl^{-} están guardados en el interior de las células intestinales
de las criptas en unos niveles por encima de su potencial
electroquímico por la acción de mecanismos de transporte activo
primarios y secundarios, tales como las bombas de Na/K ATPasa y los
cotransportadores de Na/K/2Cl. El Cl^{-} es transportado hacia el
lumen desde las células intestinales de las criptas a través de
canales apicales de Cl^{-}. Los niveles intracelulares de
K^{+}, cAMP, cGMP y Ca^{++} están todos ellos implicados en la
regulación de la respuesta secretora.
Se utilizaron células T84 para determinar si el
clotrimazol regula la secreción de Cl^{-} en células intestinales
de las criptas. Las células T84 forman monocapas confluentes de
epitelio cilíndrico que exhiben resistencias transepiteliales
elevadas, membranas apicales y basolaterales polarizadas, y rutas
secretoras de Cl^{-} reguladas por cAMP y Ca^{++}, análogas a
las encontradas en el intestino normal.
Células T84, obtenidas procedentes de la ATCC,
se cultivaron y se hicieron pases en parte iguales de medio de Eagle
modificado por Dulbeco (DMEM), (D-glucosa, 1
g/litro) y mezcla nutritiva F-12 de Ham,
complementados con suero de ternera recién nacida al 5%, HEPES 15
mM, NaHCO_{3} 14 mM, penicilina 40 mg/l, ampicilina 8 mg/l,
estreptomicina 0,90 mg/l. Las células se sembraron en densidad
confluente sobre inserciones Transwell de 0,33 cm^{2} o 5
cm^{2} (Costar, Cambridge, MA) revestidas con una disolución
diluida de colágeno de rata, de la manera previamente descrita
(Lencer y col., J. Clin. Invest.,
92:2941-2951 (1993); Lencer y col., J. Cell.
Biol. 117:1197-1209 (1992). Las resistencias
transepiteliales alcanzan niveles estables (>1.000
Ohmios\cdotcm^{2}) pasados 7 días. El desarrollo de altas
resistencias transepiteliales se correlacionó con la formación de
las monocapas confluentes que tenían uniones apretadas y bien
formadas, según se estableció mediante análisis morfológico, y con
la capacidad de las monocapas para secretar Cl^{-} (Madara y
col., Gastro, 92:1133-1145 (1987)).
Las monocapas confluentes se transfirieron a
Disolución Salina Tamponada de Hank (HBSS) (del inglés,
`` Hanks Buffered Salt Solution'')
que contenía CaCl_{2} 0,185 g/l, MgSO_{4} 0,098 g/l, KCl 0,4
g/l, KH_{2}PO_{4} 0,06 g/l, NaCl 8 g/l, Na_{2}HPO_{4} 0,048
g/l, glucosa 1 g/l y HEPES 10 nM, pH 7,4. Los reservorios de la
serosa y de la mucosa se pusieron en contacto con electrodos de
calomelanos y de Ag-Ag Cl a través de puentes de
agar al 5% preparados con tampón de Ringer. Las resistencias
transepiteliales se midieron utilizando una pinza de doble
voltaje, para aplicar pulsos de corriente de 25 ó 50 \muA. La
corriente de cortocircuito (Isc) (del inglés, ``short circuit
current'') se calculó utilizando la ley de Ohm de la manera
previamente descrita (Lencer y col., J. Clin. Invest.
92:2941-2951) (1993); Lencer y col., J. Cell
Biol. 117:1197-1209 (1992).
Estudios previos han demostrado que la secreción
de Cl^{-} en células T84 está controlada con rutas de efusión de
K^{+} que son biofísica y farmacológicamente distintas entre sí.
Una de las rutas participa en la respuesta secretora frente a
agonistas dependientes de cAMP y muestra sensibilidad a sales de
Ba^{++} (McRoberts y col., J. Biol. Chem.
260:14163-14172 (1985); Reenstra, Am. J.
Physiol. 264:C161-168 (1993)). La otra ruta
media en la respuesta a agonistas dependientes de Ca^{++}, y es
insensible a Ba^{++}. Varios agonistas de canales de K^{+},
específicos de una ruta, son útiles para determinar si un compuesto
particular está actuando a través de una ruta específica de cAMP o
de Ca^{++}. Por ejemplo, el péptido intestinal vasoactivo (VIP)
y la toxina del cólera son agonistas del canal de K^{+} mediados
por cAMP, mientras que el carbacol es un agonista dependiente de
Ca^{++}, que es agonista de los canales de K^{+} regulados por
Ca^{++}. La ruta a través de la que actúa un inhibidor
particular de la secreción de Cl^{-} en células T84 puede
identificarse midiendo la capacidad del inhibidor para modificar
las resistencias transepiteliales en células T84 que han sido
tratadas con VIP o con carbacol para estimular la secreción de
Cl^{-}.
Las células T84 se cultivaron como se ha descrito
anteriormente y la secreción de Cl^{-} se estimuló mediante la
adición al medio de carbacol (100 \muM) o VIP (5 nM). Las
células se trataron luego con BaCl (3 mM), caribdotoxina (100 nM),
o clotrimazol (33 \muM). La corriente de cortocircuito (Isc) se
determinó para los diferentes tratamientos con inhibidor, en forma
de un porcentaje del control en ausencia de inhibidor (Fig. 1). El
BaCl inhibió fuertemente la respuesta secretora frente al agonista
VIP mediado por cAMP, pero no tuvo un efecto claro sobre la
respuesta secretora provocada por el agonista carbacol dependiente
de Ca^{++}. Por el contrario, la caribdotoxina de veneno de
escorpión inhibió fuertemente la respuesta secretora provocada por
el carbacol, pero tuvo unos efectos mínimos sobre la secreción de
Cl^{-} provocada por VIP. Sin embargo, el clotrimazol inhibió las
respuestas secretoras de Cl^{-} frente a ambos agonistas. La
inhibición de la secreción de Cl^{-} producida por el
clotrimazol fue totalmente reversible
(96% \pm 2%, n=4) después de una recuperación de 60 minutos en presencia de albúmina de suero bovino, 0,01 mg/ml.
(96% \pm 2%, n=4) después de una recuperación de 60 minutos en presencia de albúmina de suero bovino, 0,01 mg/ml.
Para estudiar los posibles efectos del
clotrimazol sobre la sinergia entre los agonistas mediados por cAMP
y los agonistas mediados por Ca^{++}, se dejó que las monocapas,
inicialmente estimuladas con VIP, alcanzaran los niveles de
secreción del estado de equilibrio estacionario y después se
expusieron además a carbacol (100 \muM). El clotrimazol fue
algo más efectivo en la inhibición de la respuesta secretora
frente al carbacol que frente a cAMP, con valores de IC50 3 \muM y
8 \muM, respectivamente. Cuando los efectos del clotrimazol sobre
las rutas secretoras dependientes de cAMP y Ca^{++} se estudiaron
en esas mismas monocapas, se encontró que la inhibición de la
respuesta sinergística a VIP más carbacol era paralela a la
inhibición de la secreción promovida por agonistas dependientes de
Ca^{++} en solitario. A dosis bajas (= 10^{-7} o inferiores),
el clotrimazol potenció ligeramente (en un 5%-10%) las respuestas
secretoras de Cl^{-} frente a cada uno de los agonistas. El
clotrimazol inhibió de manera efectiva la respuesta secretora
frente a la toxina del cólera (20 nM, un agonista dependiente de
cAMP) y frente a la toxina termoestable de E. coli (100 nM,
un agonista dependiente de cGMP) (valores de IC50 10 \muM y 15
\muM, respectivamente).
El efecto del clotrimazol sobre las conductancias
de K^{+} se examinó también mediante estudios de flujo isotópico
utilizando ^{86}Rb. Las células T84 se cultivaron en presencia
de un agonista mediado por cAMP, el VIP, o de un agonista mediado
por Ca^{++} (la Tapsigargina). Se añadió clotrimazol y se midió la
efusión de ^{86}Rb. El clotrimazol inhibió de manera
significativa el valor de base y la efusión de ^{86}Rb
estimulada por Ca^{++} en presencia de los dos agonistas, el
mediado por cAMP y el mediado por Ca^{++}, en comparación con
las células que no habían sido tratadas con clotrimazol.
Se encontró que otros compuestos aromáticos del
invento inhibían la secreción de cloruro. Aunque el clotrimazol fue
el más potente de los inhibidores ensayados de la secreción de
Cl^{-} provocada por cAMP y Ca^{++}, el ketoconazol, econazol,
miconazol y
2-clorofenil-bis-fenil-metanol
también fueron efectivos en la inhibición de la secreción de
cloruro.
Considerados en su conjunto, estos estudios
indican que el clotrimazol inhibe la secreción de Cl^{-}
provocada por los canales de K^{+} mediados por cAMP o Ca^{++}
en células T84.
Para determinar el sitio en el que el clotrimazol
actúa, los efectos del pretratamiento con clotrimazol se estudiaron
en monocapas estimuladas con agonistas que inician la secreción de
Cl^{-} en etapas secuenciales de la cascada de señalización
dependiente de cAMP. Las monocapas de células T84 se preincubaron
con HBSS, en presencia o ausencia de clotrimazol (33 \muM), y
luego se estimularon o con VIP 5 nM (que activa la
adenilato-ciclasa a través de receptores de
superficie celular ligados a la GTPasa heterotrimérica), o con
forskolina 10 \muM (que activa la
adenilato-ciclasa directamente), o con
8Br-cAMP 3 mM (un estimulador directo de la
proteína-quinasa A). El clotrimazol inhibió la
respuesta secretora de cada uno de estos agonistas. Estos datos
proporcionan la evidencia de que el clotrimazol actúa en una etapa
distal para la activación de la proteína-quinasa
A.
La señalización intracelular dependiente de
Ca^{++} en células T84 y en otras células no excitables implica
el abastecimiento de los almacenes intracelulares de Ca^{++}
dependientes de trifosfato de inositol (IP3) (del inglés,
`` Inositol TrisPhosphate'') (Halm y Frizzell,
Textbook of Secretory Diarrhea, Raven Press,
47-58 (1990); Mandel y col., J. Biol. Chem.
267:704-712 (1986); Halm y col., Am. J.
Physiol. (Cell Physiol. 23)
254:C505-C511 (1988)), y la posterior activación de
rutas de entrada de Ca^{++} por la membrana plasmática (Barrett,
Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 34):
C859-C868 (1993)). Los eventos que tienen lugar
aguas abajo pueden estar mediados por [Ca^{++}]i, IP3,
diacilglicerol, o por factores difusibles hasta la fecha no
identificados (Putney y Bird, Cell
75:199-201 (1993)). Para estudiar el sitio en el que
actúa clotrimazol en solitario en esta cascada de procesos de
señalización, las monocapas de células T84 pretratadas en
presencia o ausencia de clotrimazol (33 \muM), se estimularon con
los agonistas dependientes de Ca^{++}, carbacol (100 \muM, que
provoca señales dependientes de Ca^{++} e IP3), tapsigargina (5
\muM, que eleva el nivel de Ca^{++} citoplásmico, a través de
la inhibición de la ERCa^{++}-ATPasa) (Vandorpe y
col., Biophys. J. 66:46-58 (1994)), o el
ionóforo de Ca^{++} ionomicina (10 \muM). El clotrimazol inhibió
fuertemente la respuesta secretora de Cl^{-} frente a cada uno
de estos reactivos. Estos datos sugieren que el clotrimazol actúa
en la respuesta secretora en etapas distales con respecto a la
liberación de los almacenes intracelulares de Ca^{++}.
Las monocapas confluentes dispuestas sobre
inserciones Transwell de 5 cm^{2} se utilizaron
10-14 días después de la siembra. El ^{125}I se
midió como indicador de la actividad de los canales apicales de
Cl^{-} y de los canales basolaterales de K^{+} de la manera
descrita con anterioridad (Venglarik, y col., Am. J. Physiol.
(Cell Physiol. 28):C358-C364 (1990)). Las
monocapas se preincubaron a 37ºC con ^{125}I, 4 \muCi/ml, en
HBSS durante 90 minutos, en presencia o ausencia de clotrimazol 33
\muM durante los últimos 30 minutos de este período de
preincubación de 90 minutos. El pretratamiento con clotrimazol no
alteró la carga de ^{125}I de estas células. Después de lavar dos
veces con HBSS de nueva aportación, cada dos minutos se obtuvieron
muestras de 0,5 ml procedentes del reservorio apical y se
repusieron con HBSS de nueva aportación. Después de obtener 4
muestras del valor de base, las células se trataron (a t=8
minutos) con péptido intestinal vasoactivo (VIP, 5 nM) o con
tapsigargina (5 \muM) para estimular la secreción de Cl^{-} y
se obtuvieron 15 muestras adicionales a distintos tiempos. Por
último, la monocapa de células se lavó, se cortó con su soporte
separándola del anillo de poliestireno, y se determinó la
radioactividad residual asociada a las células. Las monocapas se
mantuvieron a 37ºC al aire a lo largo de todo el estudio. La medida
de las cuentas de ^{125}I se realizó en un contador gamma y se
normalizó con respecto al porcentaje de incorporación total, según
se ha descrito con anterioridad (Venglarik, y col., Am. J.
Physiol. (Cell Physiol. 28): C358-C364
(1990)).
Las monocapas confluentes sobre inserciones
Transwell de 5 cm^{2}, se incubaron durante 30 minutos en HBSS a
37ºC. Un grupo de monocapas de control y un grupo de monocapas
tratadas con CLT (33 \muM, durante 30 min) se trataron con
bumetanida (10 \muM, durante 12 min). Todas las monocapas se
trataron luego con VIP (5 nM) y se trasladaron a HBSS que contenía
^{86}Rb, 1 \muCi/ml, durante 3 minutos a 37ºC. Se puso fin a
la incorporación de ^{86}Rb lavando las inserciones en una
disolución enfriada en hielo que contenía MgCl_{2} 100 mM, y
Tris-Cl 10 mM, pH 7,4. Las monocapas se cortaron
de sus inserciones, se dispusieron en el interior de viales de
centelleo, y la medida de las cuentas se realizó utilizando métodos
estándar.
Se llevaron a cabo estudios para determinar si la
inhibición de la secreción electrógena de Cl^{-} podría tener
lugar mediante el bloqueo de los canales de Cl^{-} de la
membrana apical, o mediante el bloqueo de cotransportadores de
NaK2Cl situados en la membrana basolateral. Para determinar si el
clotrimazol afectaba la conductancia de iones a través de los
canales de Cl^{-} de la membrana apical, se estudió el transcurso
de la efusión de ^{125}I en monocapas de células T84 pretratadas,
en presencia o en ausencia de clotrimazol (Venglarik, y col.,
Am. J. Physiol. (Cell Physiol.
28):C358-C364 (1990)). El clotrimazol tuvo un efecto
escaso o nulo sobre el transcurso de la efusión de ^{125}I desde
las monocapas tratadas con VIP. Las constantes de velocidad
correspondientes a la efusión de ^{125}I desde las monocapas
tratadas o no tratadas con clotrimazol fueron indistinguibles
(0,0637% frente a 0,0645% de incorporación/minuto, n=2 en
duplicado). El clotrimazol presentó una falta de efecto similar
sobre la efusión de ^{125}I estimulado por tapsigargina.
Seguidamente se ensayó el efecto del clotrimazol
sobre los cotransportadores de NaK2Cl de la membrana basolateral,
determinado por medio de la incorporación de ^{86}Rb sensible a
bumetanida (Matthews y col., J. Biol. Chem.
269:15703-15709 (1994)). El tratamiento con
clotrimazol disminuyó de cantidad total de incorporación de
^{86}Rb en un 53,6% \pm 5,8% (media \pm SEM, n=6), pero no
ejerció efecto alguno sobre el componente fraccional que era
sensible a bumetanida (88% \pm 3,2% frente a 75,2% \pm 12,7%
de la incorporación total, media \pm SEM). Considerados en su
conjunto, estos datos sugieren con fuerza que el clotrimazol no
tiene efecto sobre la secreción de Cl^{-} en células T48 a través
de la inhibición de ni de los canales de Cl^{-} de la membrana
apical, no de los cotransportadores de NaK2Cl de la membrana
basolateral.
Las monocapas confluentes dispuestas sobre
inserciones Transwell de 5 cm^{2} se utilizaron
10-14 días después de la siembra. El flujo de
^{86}Rb se midió como indicador de la actividad de los canales
apicales de Cl^{-} y de los canales basolaterales de K^{+} de
la manera previamente descrita (Venglarik, y col., Am. J.
Physiol. (Cell Physiol. 28):C358-C364
(1990)). Las monocapas se preincubaron a 37ºC con ^{86}Re, 4
\muCi/ml, en HBSS durante 90 minutos, en presencia o ausencia de
clotrimazol 33 \muM durante los últimos 30 minutos de este
período de preincubación de 90 minutos. El pretratamiento con
clotrimazol no alteró la carga de ^{86}Rb de las células. Se
obtuvieron muestras de 1 ml del reservorio basolateral y se repuso
el volumen. Después de obtener 4 muestras del valor de base, las
células se trataron (a t=8 minutos) con péptido intestinal
vasoactivo (VIP, 5 nM) o con tapsigargina (5 \muM) para estimular
la secreción de Cl^{-}, y se obtuvieron 15 muestras adicionales a
distintos tiempos. Por último, la monocapa de células se lavó, se
cortó con su soporte separándola del anillo de poliestireno, y se
determinó la radioactividad residual asociada a las células. Las
monocapas se mantuvieron a 37ºC al aire a lo largo de todo el
estudio. Se determinó el número de cuentas de ^{86}Rb por
centelleo líquido y se normalizó con respecto al porcentaje de
incorporación total, según se ha descrito previamente (Venglarik, y
col., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28):
C358-C364 (1990)).
La actividad de los canales de K^{+} se estimó
midiendo la efusión de ^{86}Rb. Se encontró que el clotrimazol
inhibía de manera significativa la velocidad de efusión de
^{86}Rb después del tratamiento con el agonista VIP (5 nM)
dependiente de cAMP. La constante de velocidad correspondiente a
la efusión de ^{86}Rb estimulada por VIP se redujo en el 87% en
las monocapas tratadas con clotrimazol (0,0062% frente a 0,0465%
de la incorporación/minuto, n=2 en triplicado). El clotrimazol
inhibió en un grado similar la efusión de ^{86}Rb desde las
monocapas estimuladas con tapsigargina (recuadro B, constantes de
velocidad 0,011% frente a 0,048% de la incorporación/minuto, n=2),
lo que sugiere que el clotrimazol es capaz de inhibir la secreción
de Cl^{-} por medio del bloqueo del transporte de K^{+} a
través de canales sensibles tanto a Ba^{++} como a
caribdotoxina.
Permeabilización selectiva de membrana y
medida de la conductancia de potasio de la membrana
basolateral. La conductancia de potasio de la membrana
basolateral se midió utilizando la técnica desarrollada por Dawson y
colaboradores. En primer lugar se estableció un gradiente de
potasio (desde la mucosa hasta la serosa) a través de la monocapa
utilizando tampones con concentraciones asimétricas en la mucosa y
en la serosa, que contenían K^{+} como único ion permeable. La
adición de anfotericina B (20 \muM) al reservorio de la mucosa
forma poros conductivos en la membrana apical, y de este modo
elimina toda resistencia al movimiento transepitelial de potasio a
través de esta membrana. Así, en las condiciones del experimento,
en las que la corriente en la monocapa está interrumpida SHORT
CIRCUITED (es decir, VOLTAGE-CLAMPED el voltaje se
ha fijado a potencial cero) y el gradiente transepitelial de
potasio es constante, la Isc dependiente de anfotericina se
convierte en una medida de la velocidad de flujo transepitelial de
potasio a través de las membranas basolaterales. Los cambios en la
corriente de cortocircuito (Isc), representan por lo tanto cambios
en las conductancias de K^{+} (gK) en la membrana basolateral. La
Isc y las conductancias de K^{+} se midieron utilizando
electrodos de calomelanos, puentes de agar-KCl 3M,
y una pinza de voltaje (Universidad de Iowa, Iowa City). Para
generar una interrelación voltaje-corriente en los
canales, se generaron corrientes aplicando potenciales de prueba
desde -80 hasta +80 mV en incrementos de 10 mV en la disolución
asimétrica de alta concentración en gluconato de K^{+}.
Cálculo de la permeabilidad de K^{+} por la
membrana basolateral: Las permeabilidades de la membrana se
calcularon según la fórmula:
^{P}K = (cm/s) = \
^{J}K(mM/cm^{2}\cdot s)/ \Delta
[K^{+}](mM/cm^{3})
en la que \Delta[K^{+}] es igual a la
diferencia en la concentración de K^{+} (135 mM) entre las
disoluciones de lavado asimétricas de la membrana apical y de la
membrana basolateral. Los valores máximos de la Isc se convirtieron
en flujos de K^{+} dividiendo por la constante de Faraday F
(96.500 culombios/mol), según se ha descrito previamente (Huflejt y
col., J. Clin. Invest. 93:1900-1910
(1994)).
El transporte basolateral de K^{+} se estudió
en monocapas de células T48 permeabilizadas en la membrana apical
mediante pretratamiento con anfotericina B. Los tampones de las
membranas apical y basolateral contenían K^{+} como único ion
permeable. Todos los estudios se realizaron con un gradiente de
K^{+} que tenía una diferencia entre las de 135 mM, dirigido
hacia la membrana basolateral. Este método se ha utilizado con
anterioridad para estudiar el transporte tanto de Cl^{-} como de
K^{+} en células T84 y en células HT29-Cl.16E.
Brevemente expuesto, las conductancias iónicas en las membranas
luminal o basolateral de las monocapas de células T84 confluentes
pueden determinarse por separado permeabilizando de manera selectiva
la membrana apical o la membrana basolateral utilizando el ionóforo
anfotericina B. Este ionóforo elimina de manera artificial toda
resistencia eléctrica al transporte de iones a través de la
membrana plasmática que contiene poros formados por la anfotericina
B. Como resultado de ello, la membrana plasmática contralateral
intacta se vuelve limitadora de la velocidad de transporte iónico
transepitelial. Los cambios en las conductancias iónicas,
dependientes de la acción de agonistas, pueden ser determinados de
manera directa ya sea en forma de la corriente transepitelial de
cortocircuito (Isc) en presencia de gradientes iónicos
establecidos, o en forma de la conductancia transepitelial (G) en
presencia de potenciales transepiteliales establecidos.
El transporte de K^{+} se midió en el valor de
base y después de las adiciones ordenadas de agonistas dependientes
de cAMP y Ca^{++}. La permeabilización inicial con anfotericina
B se asoció con un incremento del 49% \pm 19% en la conductancia.
Los poros formados por la anfotericina B mostraron una selectividad
para cationes monovalentes. El Ca^{++} permaneció relativamente
no permeable como se evidenció por el pequeño aumento en Isc y
G_{K} en la situación de equilibrio estacionario, causado por la
permeabilización apical con anfotericina B. Dado este bajo valor de
base de Isc y G_{K}, las permeabilidades del K^{+} (PK), tanto
la sensible a cAMP como la sensible a Ca^{++}, se pusieron
pronto de manifiesto después de la estimulación con los agonistas.
El tratamiento con el agonista forskolina (10 \muM), dependiente
de cAMP, produjo un incremento rápido en el transporte de K^{+}
a través de una ruta(s) aparentemente de baja conductancia,
como se evidencia por incrementos simétricos en Isc y G. El
carbacol también incrementó las corrientes de K^{+}. La magnitud
de la Isc_{K} inducida por carbacol, sin embargo, fue similar
tanto si el carbacol se añadía solo como si se añadía después de
la forskolina (111,7% \pm 7,4 \muA/cm^{2} frente a 180,7 \pm
15,7 \muA/cm^{2}, respectivamente). Por lo tanto, no hubo una
clara evidencia de sinergia entre las rutas de K^{+} mediadas
por cAMP y mediadas por Ca^{++}, como cabría esperar en un
sistema celular permeabilizado en la membrana apical. Igual que en
los descubrimientos previos de los autores del invento en
monocapas intactas de células T84, los cambios en la Isc inducidos
por forskolina fueron prolongados mientras que el efecto del
carbacol fue de poca duración. Tanto la Isc_{K} como G_{K}
retornaron a los valores del valor de base en los 5 min
posteriores a la adición de carbacol.
Se definieron cocientes formales
corriente/voltaje (I/V) antes y después de la estimulación con los
agonistas para confirmar que ambas corrientes, la dependiente de
cAMP y la dependiente de Ca^{++}, se provocaban a potenciales de
membrana fisiológicos. En estos estudios se utilizó tapsigargina en
lugar de carbacol como agonista dependiente de Ca^{++}, debido a
que las transiciones de K^{+} provocadas por tapsigargina
alcanzan conductancias en el estado de equilibrio estacionario de
duración mucho más larga, lo mismo que sucede en monocapas intactas.
Se encontró que en condiciones en las que se utilizan gradientes de
K^{+} dirigidos hacia la membrana basolateral, tanto la
forskolina como la tapsigargina activan las corrientes macroscópicas
rectificadas hacia el exterior (desde la mucosa hacia la serosa) a
voltajes transepiteliales positivos. Los cocientes experimentales
(I/V) obtenidos después de la estimulación con forskolina y
tapsigargina mostraron potenciales inversos (-40 mV) que se
aproximaban al potencial de Nernst calculado (-85 mV, calculado como
RT/zQolog[Na]_{fuera}/[Na]_{dentro}). Estos
resultados concuerdan con la activación de las diferentes
conductancias de K^{+} en la membrana basolateral, la sensible a
cAMP y la sensible a Ca^{++}, junto con una o más derivaciones
iónicas transepiteliales e inespecíficos, que posiblemente tienen
lugar a través de las apretadas uniones intercelulares o de
``pérdidas'' por la membrana basolateral.
Para confirmar que los cambios observados en la
Isc y G representaban el transporte de K^{+} a través de rutas
selectivas de K^{+}, el efecto de la forskolina y el carbacol
sobre las conductancias de la monocapa de células T84 se estudió
utilizando tampones que contenían Na^{+} como único catión
permeable. Estos estudios se realizaron utilizando un gradiente de
cationes (Na^{+}) con una diferencia entre las concentraciones de
135 mM, dirigido hacia la membrana basolateral. No se pudieron
detectar incrementos en la Isc ni en G en ausencia de K^{+}. Por
lo tanto, los incrementos en las conductancias catiónicas inducidas
por estimulación con agonistas son específicos del transporte de
K^{+}.
Dos rutas de efusión de K^{+},
farmacológicamente diferentes, se han identificado previamente en
células T84 intactas. Una de las rutas participa en la respuesta
secretora frente a agonistas dependientes de cAMP y muestra
sensibilidad a sales de Ba^{++}. La otra ruta de efusión de
K^{+} media en la respuesta a agonistas dependientes de
Ca^{++}, y es insensible a Ba^{++}. Estos descubrimientos se
confirmaron en el modelo que utiliza células permeabilizadas. La
I_{K} sensible a cAMP (provocada mediante tratamiento con
forskolina 10 \muM) se inhibió en una proporción mayor que 70%
mediante la adición de BaCl_{2} (3 mM) a los reservorios
basolaterales. El Ba^{++}, sin embargo, no tuvo efecto detectable
alguno sobre el transporte de K^{+} inducido por la posterior
adición de carbacol (100 \muM) a las mismas monocapas. Por el
contrario, cuando las monocapas permeabilizadas se trataron primero
con carbacol, la I_{K} inducida sensible a Ca^{++}, se inhibió
en el 50% mediante pretratamiento con caribdotoxina de veneno de
escorpión (100 nM). La caribdotoxina, sin embargo no tuvo efecto
detectable alguno sobre el transporte de K^{+} inducido por la
posterior adición de forskolina. Por lo tanto en células
permeabilizadas, la sensibilidad diferencial del transporte de
K^{+} frente a la inhibición ejercida por bloqueadores de los
canales de K^{+}, BaCl_{2} y caribdotoxina, igualó exactamente
el efecto de estos inhibidores selectivos de canal, sobre el
transporte de K^{+} en células intactas (medido indirectamente en
forma de corriente de Cl^{-}).
Considerados en su conjunto, estos estudios
definen el modelo en células T84 permeabilizadas, y proporcionan una
importante evidencia de que en las condiciones definidas, tanto Isc
como G representan el transporte de K^{+} a través de canales de
K^{+} diferentes en la membrana basolateral, el sensible a cAMP y
el sensible a Ca^{++}.
A continuación se probó la hipótesis de que el
clotrimazol puede inhibir directamente los canales de K^{+} de la
membrana basolateral en células T84 de intestino humano, al igual
que hace en los glóbulos rojos. El clotrimazol inhibió de manera
significativa el transcurso la duración del transporte de K^{+}
después del tratamiento con el agonista forskolina (10 \muM)
dependiente de cAMP, y con el agonista carbacol (100 \muM)
dependiente de Ca^{++}. Los cocientes I/V formales, obtenidos en
la situación de equilibrio estacionario después de la estimulación
con cAMP o con Ca^{++}, confirman que el clotrimazol afectó a
ambos canales, el sensible a cAMP y el sensible a Ca^{++}. Se
obtuvieron resultados casi idénticos con
2-clorofenil-bis-fenil-metanol.
El clotrimazol y su metabolito
2-clorofenil-bis-fenil-metanol
inhiben directamente ambos canales intestinales de K^{+}, el
sensible a cAMP y el sensible a Ca^{++}, lo que indica que la
estructura en anillo en ausencia del anillo de imidazol es
suficiente (y quizá necesaria) para esta actividad biológica.
Para examinar las conductancias de Cl^{-} en la
membrana apical, el Cl^{-} se utilizó como único ion permeable
utilizando disoluciones tampón idénticas en la membrana apical y en
la membrana basolateral. La monocapas se permeabilizaron en la
membrana basolateral mediante la adición de Anfotericina B 100
\muM al reservorio de la serosa. La generación de curvas de
voltaje-corriente de las corrientes de los canales
se provocó aplicando potenciales de prueba de 1 s desde -80 mV
hasta +80 mV, en incrementos de 10 mV, en tampones simétricos con
alto contenido en
Colina Cl^{-}.
Colina Cl^{-}.
Se llevaron a cabo estudios para determinar si el
objetivo principal del clotrimazol se localizaba en las superficies
celulares basolaterales o apicales. La inhibición más rápida se
consiguió mediante incubación con clotrimazol a ambos lados de la
monocapa. Sin embargo, la aplicación basolateral sola fue casi igual
de efectiva que la incubación a ambos lados. De manera adicional,
se encontró que la potencia real de la inhibición del clotrimazol
en un punto de tiempo determinado, era mayor cuando se aplicaba en
la membrana basolateral que cuando se aplicaba en la membrana
apical. Esta acción preferencial del clotrimazol en la superficie
basolateral de la célula, concuerda con la hipótesis de que sus
objetivos principales son los canales basolaterales de K^{+}.
Para confirmar estos descubrimientos, se estudió
el transporte de Cl^{-} en monocapas de células T84
permeabilizadas en la membrana basolateral formando poros con
anfotericina B. Estos estudios se llevaron a cabo con Cl^{-} como
único anión permeable, y con concentraciones de Cl^{-} (142 mM)
simétricas en la membrana apical y en la membrana basolateral. En
las monocapas no tratadas con clotrimazol, la adición de forskolina
(10 \muM) a los reservorios basolaterales incrementó de manera
significativa las conductancias de Cl^{-} de los reservorios
basolaterales, en relación con el valor de base, presumiblemente a
través de la activación del canal de Cl^{-} del regulador de
transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) (del inglés,
`` Cystic Fibrosis Transmembrane
Regulator''). En contraste con los claros efectos
inhibitorios del clotrimazol sobre las conductancias basolaterales
de K^{+}, sin embargo, el clotrimazol no tuvo efecto detectable
alguno ni sobre las conductancias de Cl^{-} estimuladas por
forskolina ni sobre las estimuladas por tapsigargina. Los cocientes
I/V correspondientes al transporte de Cl^{-} fueron casi
idénticos en las monocapas tratadas o no tratadas con clotrimazol.
Estos datos proporcionan una evidencia adicional de que el
clotrimazol inhibe la secreción de Cl^{-} en monocapas de células
T48 intactas, afectando de manera específica los canales
basolaterales de K^{+}. Los canales de Cl^{-} de la membrana
apical no se inhiben.
Cuatro conejos macho, de raza New Zealand (2,5
kg) se anestesiaron con una inyección intravenosa de pentobarbital
(0,5 ml/kg). Se extirpó una longitud de 15 cm del colon distal y se
abrió en sentido longitudinal. Las capas musculares externas se
separaron por disección roma y se montaron preparaciones de mucosa
de colon en una cámara de Ussing (DCTSYS; Precision Instrument
Design, CA; 10,3 cm^{2} de superficie) y se incubaron con una
disolución tampón que contenía: NaCl 122,0 mM, CaCl_{2} 2,0 mM;
MgSO_{4} 1,3 mM; KCl 5,0 mM; glucosa 20 mM; NaHCO_{3} 25,0 mM
(pH cuando se gaseó con O_{2} al 95%/CO_{2} al 5%; la
temperatura se mantuvo a 37ºC), con y sin clotrimazol
(30 \muM). El volumen de fluido a cada uno de los lados de la mucosa fue de 7 ml.
(30 \muM). El volumen de fluido a cada uno de los lados de la mucosa fue de 7 ml.
La diferencia de potencial y la Isc se detectaron
de manera continua y se registraron cada 10 minutos. Las
disoluciones tampón del lumen y de la serosa se pusieron en contacto
a través de electrodos de Ag-AgCl
(Voltage/Current Clamp, Modelo VCC600, Physiologic
Instruments, Inc. San Diego, CA, USA) y un puente de disolución
de Ringer/agar hasta la pinza de voltaje (modelo
DVC-1000; Voltage/Current Clamp, World Precision
Instruments, Inc.). La resistencia (R) se calculó utilizando la
ley de Ohm y la Isc se expresa en \Omegaxcm^{2}. Una vez
obtenidos los valores estables de resistencia e Isc del valor de
base, las preparaciones de la mucosa se incubaron en presencia o
ausencia de clotrimazol en la serosa (30 \muM) durante 30 min, y
a continuación se estimularon mediante adición de forskolina
(10 \muM) o carbacol (10 \muM) en el reservorio de la serosa.
(10 \muM) o carbacol (10 \muM) en el reservorio de la serosa.
Para determinar la capacidad del clotrimazol para
bloquear los canales de K^{+} y con ello la secreción de Cl^{-}
en tejido intestinal normal, se montaron preparaciones aisladas de
mucosa de colon de conejo en cámaras de Ussing que contenían
disolución de Ringer modificada con o sin clotrimazol (30 \muM).
Una vez que la Isc se hubo estabilizado, a los reservorios de la
serosa se aplicaron adiciones sucesivas de forskolina (10 \muM) y
luego de carbacol (10 \muM), y la Isc y G se detectaron de manera
continua. El clotrimazol inhibió fuertemente el transcurso de la Isc
inducida por forskolina. El carbacol no tuvo ningún efecto
adicional sobre la Isc en este sistema.
A ratones tratados y ratones de control no
tratados, se les administró por sonda nasogástrica o clotrimazol
(150 mg/kg/día, dividido en dos dosis iguales, disuelto en aceite
de cacahuete en una concentración de 20 mg/ml), o un vehículo de
control, durante un período de administración de 7 días. Los ratones
a continuación fueron sometidos a una estimulación inmunológica
administrándoles por sonda nasogástrica 25 \mug de toxina del
cólera purificada (Calbiochem, San Diego, CA) en PBS, o un vehículo
de control solo (PBS sin toxina del cólera), o toxina del cólera en
PBS que contenía clotrimazol 30 \muM. Los animales fueron
sacrificados pasadas 5 horas en una campana de CO_{2} sin estar
amontonados. El animal muerto se pesó, el abdomen se abrió, y se
ataron ligaduras en el duodeno proximal y en el recto distal. El
bloque intestinal se diseccionó liberándolo de las estructuras de
soporte, y se separó en forma de una única unidad y se pesó. Los
segmentos de intestino delgado y de intestino grueso se normalizaron
con respecto al peso corporal (peso del intestino/peso del animal
muerto) en cada uno de los animales.
Para estudiar si el clotrimazol puede inhibir la
secreción intestinal in vivo, se utilizó un modelo murino de
diarrea secretora. A ratones Balb/C se les administró clotrimazol
por sonda nasogástrica, 150 mg/kg/día, dividido en dos dosis
iguales, o un vehículo de control, cada 12 h durante 7 días, y
después fueron sometidos a una estimulación inmunológica por vía
oral con toxina del cólera purificada (25 \mug). Cinco horas
después del tratamiento con la toxina del cólera, los ratones
fueron sacrificados y la secreción de fluidos intestinales se
determinó por gravimetría. El pretratamiento con clotrimazol redujo
en el 86% la secreción de fluidos intestinales inducida por la
toxina del cólera. El clotrimazol no tuvo efecto sobre la secreción
intestinal de fluidos, inducida por la toxina del cólera. El
clotrimazol no tuvo efecto sobre la secreción intestinal en
ausencia de la toxina del cólera. Por lo tanto, el clotrimazol
trató de manera efectiva la diarrea secretora in vivo,
presumiblemente inhibiendo los canales de K^{+} de la membrana
basolateral de las células epiteliales de las criptas.
Habiendo descrito las realizaciones hasta la
fecha preferidas, de acuerdo con el presente invento, debe
entenderse que el presente invento está únicamente limitado por las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (14)
1. El uso de un compuesto aromático para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de diarrea o
disentería, en el que el compuesto aromático tiene la fórmula
general:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \hskip-3mm Ar ^{1} \cr \+
\hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm X\cr \+
\hskip-2mm |\cr Ar ^{2} --- \+
\hskip-3mm C---O _{p} ---(CH _{2} ) _{n} R'\cr
\+ \hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm Ar ^{3} \cr}
en la que n = 0-3; en la que p =
0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por
(CH_{2})_{m} (m=1,2 ó 3), CH=CH, C\equivC, SCH_{2},
OCH_{2} y NOCH_{2}; en la que R' se selecciona entre el grupo
constituido por H, OH, SH, NO_{2}, CN, CHO, ONH_{2}, COR'',
CO_{2}H, CO_{2}R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', furanilo,
piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR''(OCH_{3}); en
la que Ar^{1} se selecciona entre el grupo constituido por
fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar^{2} se
selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo
sustituido; y en la que Ar^{3} se selecciona entre el grupo
constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y
naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el
grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO_{2}, CN,
CF_{3}, NR''R'' y CO_{2}R; en la que R se selecciona entre el
grupo constituido por un alquilo lineal de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo lineal sustituido de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo ramificado de C_{Z}
(Z=1-5), y alquilo sustituido de C_{Z}
(Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se
selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, OH,
OCH_{3}, SH, SCH_{3}, NH_{2}, NHCH_{3} y N(CH_{3});
y en la que R'' se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno y
R.
2. Un uso según la reivindicación 1, en la que el
compuesto aromático se selecciona entre el grupo constituido
por:
3. Un uso según la reivindicación 1, en el que el
compuesto aromático se administra por vía oral.
4. Un uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es para el tratamiento de la diarrea en seres humanos, o
en el que el medicamento es para el tratamiento de la disentería en
caballos, vacas, cerdos o cabras.
5. Un uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es para el tratamiento de la diarrea y comprende además
un agente antidiarreico, preferiblemente un fluido de rehidratación
oral.
6. Un uso según la reivindicación 1, en el que el
medicamento es para el tratamiento de la disentería y comprende
además un agente antidisentérico.
7. Un uso según la reivindicación 1, en el que el
compuesto aromático es
2-clorofenil-bis-fenil-metanol
y tiene la siguiente fórmula:
8. El uso de un compuesto aromático para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diarrea o
disentería, en el que el compuesto aromático se selecciona entre el
grupo constituido por miconazol y econazol.
9. Una preparación veterinaria que comprende:
un compuesto aromático en una cantidad efectiva
para inhibir disentería en un sujeto, teniendo el compuesto
aromático la fórmula general:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \hskip-3mm Ar ^{1} \cr \+
\hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm X\cr \+
\hskip-2mm |\cr Ar ^{2} --- \+
\hskip-3mm C---O _{p} ---(CH _{2} ) _{n} R'\cr
\+ \hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm Ar ^{3} \cr}
en la que n = 0-3; en la que p =
0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por
(CH_{2})_{m} (m=1,2 ó 3), CH=CH, C\equivC, SCH_{2},
OCH_{2} y NOCH_{2}; en la que R' se selecciona entre el grupo
constituido por H, OH, SH, NO_{2}, CN, CHO, ONH_{2}, COR'',
CO_{2}H, CO_{2}R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', furanilo,
piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR''(OCH_{3}); en
la que Ar^{1} se selecciona entre el grupo constituido por
fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar^{2} se
selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo
sustituido; y en la que Ar^{3} se selecciona entre el grupo
constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y
naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el
grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO_{2}, CN,
CF_{3}, NR''R'' y CO_{2}R; en la que R se selecciona entre el
grupo constituido por un alquilo lineal de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo lineal sustituido de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo ramificado de C_{Z}
(Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de C_{Z}
(Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se
selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, OH,
OCH_{3}, SH, SCH_{3}, NH_{2}, NHCH_{3} y N(CH_{3});
y en la que R'' se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno y R;
y
un agente antidisentérico.
10. Una preparación veterinaria según la
reivindicación 9, en la que agente antidisentérico es un extracto de
calostro, una preparación inmunológica de calostro, una preparación
inmunológica específica de un microorganismo, un fluido de
rehidratación oral, una composición de reposición de electrolitos o
una composición antibiótica.
11. Una preparación veterinaria según la
reivindicación 9, en la que la preparación veterinaria es una
preparación seca.
12. Una preparación farmacéutica que
comprende:
un compuesto aromático en una cantidad efectiva
para inhibir diarrea, teniendo el compuesto aromático la fórmula
general:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ \hskip-3mm Ar ^{1} \cr \+
\hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm X\cr \+
\hskip-2mm |\cr Ar ^{2} --- \+
\hskip-3mm C---O _{p} ---(CH _{2} ) _{n} R'\cr
\+ \hskip-2mm |\cr \+
\hskip-3mm Ar ^{3} \cr}
en la que n = 0-3; en la que p =
0 ó 1; en la que X se selecciona entre el grupo constituido por
(CH_{2})_{m} (m=1,2 ó 3), CH=CH, C\equivC, SCH_{2},
OCH_{2} y NOCH_{2}; en la que R' se selecciona entre el grupo
constituido por H, OH, SH, NO_{2}, CN, CHO, ONH_{2}, COR'',
CO_{2}H, CO_{2}R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', furanilo,
piridinilo, tiofenilo, indolilo, quinolilo y CONR''(OCH_{3}); en
la que Ar^{1} se selecciona entre el grupo constituido por
fenilo, fenilo sustituido y heteroarilo; en la que Ar^{2} se
selecciona entre el grupo constituido por fenilo y fenilo
sustituido; y en la que Ar^{3} se selecciona entre el grupo
constituido por fenilo, fenilo sustituido, bifenilo, bibencilo y
naftilo; en la que el sustituyente del fenilo se selecciona entre el
grupo constituido por Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO_{2}, CN,
CF_{3}, NR''R'' y CO_{2}R; en la que R se selecciona entre el
grupo constituido por un alquilo lineal de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo lineal sustituido de C_{Z}
(Z=1-5), alquilo ramificado de C_{Z}
(Z=1-5), y alquilo ramificado sustituido de C_{Z}
(Z=1-5); en la que el sustituyente del alquilo se
selecciona entre el grupo constituido por Cl, F, Br, I, OH,
OCH_{3}, SH, SCH_{3}, NH_{2}, NHCH_{3} y N(CH_{3});
y en la que R'' se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno y R;
y
un agente antidiarreico.
13. Una preparación farmacéutica según la
reivindicación 12, en la que el agente antidiarreico es un fluido de
rehidratación oral, un antibiótico, una composición electrolítica,
una preparación de inmunoglobulinas procedente de calostro bovino o
una disolución oral de azúcares y electrolitos.
14. Una preparación según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 12, en la que el compuesto aromático es
2-clorofenil-bis-fenil-metanol
y tiene la siguiente fórmula:
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