ES2199498T3

ES2199498T3 - Procedimiento para la salificacion y purificacion de oligopeptidos en una etapa.

Info

Publication number: ES2199498T3
Application number: ES99105639T
Authority: ES
Inventors: Kurt Dr. Gunther; Franz-Rudolf Dr. Kunz; Karlheinz Prof. Dr. Drauz; Thomas Dr. Muller
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2019-03-19
Also published as: CA2267084C; EP0955308B1; DK0955308T3; DE19813849A1; ATE239033T1; US6258933B1; JPH11310595A; CA2267084A1; DE59905279D1; EP0955308A1; JP4414503B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA UNA RESALINIZACION EN UNA SOLA ETAPA Y PURIFICACION DE OLIGOPEPTIDOS. LOS OLIGOPEPTIDOS NO APARECEN FRECUENTEMENTE EN SU SINTESIS DE MANERA DIRECTA COMO ACETATOS. LAS SALES DE ACETATO DE OLIGOPEPTIDOS SON DESEABLES OBTENERLAS COMO COMPUESTOS ACTIVOS EN MEDICINAS Y FORMULACIONES. DE LOS PROCEDIMIENTOS CONOCIDOS DEL ESTADO DE LA TECNICA SE TRABAJABA HASTA AHORA SOLO CON DOS ETAPAS SEPARADAS O CON COMPUESTOS ELUYENTES QUE CONTIENEN PIRIDINA. DE ACUERDO CON LA INVENCION SE PUEDE REALIZAR LA RESALINIZACION Y PURIFICACION EN UNA ETAPA, Y SE PUEDE EVITAR LA UTILIZACION DE PIRIDINA COMO ELUYENTE, SI EL OLIGOPEPTIDO SE PURIFICA EN FORMA DE SU SAL DE CLORURO CON UN ELUYENTE QUE CONTIENE ACETATO SEGUN PROCEDIMIENTOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA.

Description

Procedimiento para la salificación y purificación de oligopéptidos en una etapa.

La presente invención se refiere a un procedimiento en una etapa para salificación y purificación de oligopéptidos.

Frecuentemente los oligopéptidos despliegan una acción bioactiva y por ello encuentran aplicaciones como agentes terapéuticos. Como ejemplo sean mencionados agonistas y antagonistas de LHRH que, entre otras, encuentran aplicacion para combatir determinadas enfermedades cancerosas.

La producción del oligopéptido a purificar puede realizarse por procedimientos del estado de la técnica. Es oportuna, entre otras, la síntesis de péptidos de Merrifield en materiales soporte sólidos o la clásica síntesis en solución. Tanto en la síntesis de Merrifield en fases sólidas como también en la síntesis en solución es esencial dotar de grupos protectores determinadas zonas de la molécula, grupos que se escinden nuevamente al final de la preparación. En la síntesis en fases sólidas es necesario, además, separar el oligopéptido del soporte sólido. Para otras aclaraciones sobre la síntesis de péptidos se remite a la pertinente bibliografía conocida (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, tomo 15/1 y 15/2; M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 1984).

Si el péptido a producir es un fármaco, con frecuencia se desea que el oligopéptido esté en forma de su sal acetato para no tener que aplicar acompasadamente al paciente cuerpos extraños u otras sustancias críticas al administrar el medicamento.

Frecuentemente acaece que el opligopéptido, por circunstancias de la síntesis, no resulta como sal acetato, sea porque, para la escisión final de los grupos protectores se debe recurrir a ácidos que no son el ácido acético, sea porque no es posible o es posible sólo con dificultad producir la forma libre del péptido y no se consigue una simple conversión en el acetato mediante ácido acético. Para la escisión de los grupos protectores o para la escisión del péptido de la resina necesaria para la síntesis, en la mayoría de los casos se ha de recurrir a ácidos más fuertes tales como ácido trifluoroacético, ácido clorhídrico o ácido bromhídrico. Para más detalles que conciernen a estas escisiones se remite nuevamente a los libros de texto (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, tomo 15/1 y 15/2; M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 1984).

Por ejemplo, en Peptide Research 1992, 5(5), 293-299 se describe la escisión de grupos protectores mediante HCl.

Para la producción de un acetato del correspondiente oligopéptido necesario para la aplicación en un animal o en personas, en los casos anteriores se está forzado a salificar el oligopéptido.

En la patente GB 2152059 se producen oligopéptidos por síntesis de péptidos de Merrifield. La escisión de los oligopéptidos de la resina se realiza aquí mediante HF que, no obstante, se debe eliminar en corriente de nitrógeno, antes de la subsiguiente purificación cromatográfica, con eluyentes que contienen acetato.

Aquí se realiza de esta manera una reacción que por lo menos no es en una etapa.

El oligopéptido comercial a ensayar como sustancia activa o como agente terapéutico debe satisfacer exigencias especiales en cuanto a su pureza. En la mayoría de los casos, a falta de un adecuado método clásico de purificación, se aplica una purificación de la mezcla del producto de síntesis mediante cromatografía, en especial cromatografía de líquidos a alta presión. Para ello es necesario recibir el oligopéptido, antes de aportarlo a la columna, en la mezcla de disolventes del eluyente escogido.

Hasta ahora se han descrito en la bibliografía varios procedimientos cuyo objetivo es la salificación y purificación de oligopéptidos. Según Gabriel (Int. J. Peptide Protein Res. 1987, 30, 40-43) se puede convertir en el acetato el oligopéptido GRF (1-44)-NH_{2} a partir de su trifluoroacetato mediante cromatografía de líquidos a alta presión utilizando eluyentes que contienen piridina y ácido acético. En cuanto a los restos de piridina, que inevitablemente permanecen en el oligopéptido después de un procedimiento de este tipo, existen no obstante reservas respecto a las propiedades toxicológicas de este material. También, por razones de seguridad del trabajo, parece inconveniente un procedimiento de purificación que trabaja con grandes cantidades de la peligrosa piridina.

Eludiendo el sistema eluyente que contiene piridina, Hoeger y otros (BioChromatography 1987, 2, 134-142) ensayaron salificar los GnRH-péptidos y purificarlos. A partir de las sales fluoruro, se realiza aquí una cromatografía en fase inversa en dos etapas al modo de gradientes en tampones de fosfato de trietilamonio (TEAP) y trifluoroacetato (TFA) con acetonitrilo como modificador. Después de liofilizar las fracciones de péptidos purificadas, sigue la conversión a sales acetato mediante cromatografía de intercambio aniónico con ácido acético diluido o cromatografía en fase inversa en gradientes de acetato amónico/acetonitrilo.

La patente EP 0145258 describe, entre otras, la purificación de sales de HF de nonapéptidos y decapéptidos del grupo de agonistas de LHRH. También aquí se realiza la salificación separadamente de la etapa de purificación, primeramente mediante cromatografía de intercambio aniónico con posterior purificación final en una fase de gel de sílice octadecilsilanada mediante un eluyente que consta de acetato amónico y acetonitrilo en condiciones de alta presión.

Es cometido de la presente invención proporcionar otro procedimiento para la salificación y purificación de oligopéptidos, que armonice estas dos etapas de trabajo en una combinada y se realice sin utilizar piridina.

Son objeto de la parte de características de la reivindicación 1, estos y otros cometidos no caracterizados más detalladamente que, sin embargo, a partir del estado de la técnica son fácilmente evidentes para el especialista. Son objeto de las reivindicaciones secundarias subordinadas a la reivindicación 1, realizaciones preferentes del procedimiento conforme a la invención.

Por purificar el oligopéptido a salificar o apurar como su sal hidrocloruro por cromatografía de líquidos mediante un eluyente que contiene acetato, se llega de forma extraordinariamente sencilla y, no obstante, ventajosa, a acetatos de oligopéptidos purificados prácticamente exentos de cloruros. Así pues, con el procedimiento conforme a la invención se logra unir en una sola etapa de trabajo, sin añadir piridina, la purificación y salificación de los oligopéptidos en consideración, antes sólo realizable en dos etapas o con empleo de la toxicológicamente sospechosa piridina. Las fracciones de producto obtenibles por el presente procedimiento se combinan ventajosamente y se secan por liofilización. Se obtiene el acetato a partir del cloruro con un rendimiento de aproximadamente 85%. El acetato de oligopéptido así obtenido, con una pureza de hasta aproximadamente 99,5%, se puede utilizar como sustancia activa después de formulación para una terapia medicamentosa.

Para el presente procedimiento es necesario que se empleen los oligopéptidos en forma de sus cloruros. El camino más fácil para lograr esto es el empleo de ácido clorhídrico para la escisión de los grupos protectores. Por otra parte, empero, la hidrólisis del péptido y otras reacciones secundarias en las funcionalidades de las cadenas laterales por la fuerza del ácido del agente de escisión, son determinadas reacciones concurrentes no deseadas. Por estos y otros motivos (como, por ejemplo, la solubilidad del péptido en TFA), para las desprotecciones de esta clase con frecuencia se recurre a ácidos menos fuertes exentos de agua como, por ejemplo, ácido trifluoroacético o mezclas de ácidos fuertes exentas de agua como, por ejemplo, HBr/ácido acético glacial.

Se puede también desproteger con ácido clorhídrico concentrado acuoso oligopéptidos protegidos, y las sales de los oligopéptidos resultantes de ello presentan una proporción de subproductos claramente menor frente a la escisión usual con el menos fuerte ácido trifluoroacético exento de agua eventualmente mezclado con disolventes orgánicos, o con el sistema HBr/ácido acético glacial.

En la escisión descrita de los grupos protectores del oligopéptido se trabaja preferentemente en un intervalo de temperaturas de -25 a 30ºC, prefiriéndose especialmente el intervalo de -10 a 10ºC y, muy especialmente, de 0 a 5ºC.

La sal cloruro del oligopéptido puede emplearse para la purificación mediante cromatografía de líquidos como su solución acuosa concentrada con ácido clorhídrico. Pero se prefiere aislar la sal cloruro después de la desprotección, por ejemplo mediante liofilización, y seguidamente disolverla primeramente en el sistema de elución de la cromatografía de líquidos o en ácido clorhídrico y aportarla a la columna.

Como método de cromatografía de líquidos, para la purificación de los oligopéptidos se utiliza preferentemente la cromatografía de líquidos a alta presión. Como mezclas de disolventes para la elución en gradiente se utilizan eluyentes de la composición siguiente:

	Eluyente A		Eluyente B

i.	De 85 a 98% de agua	i.	De 20 a 48% de agua
ii.	De 2 a 10% de ácido acético	ii.	De 2 a 10% de ácido acético
iii.	De 0 a 5% de acetonitrilo	iii.	De 50 a 70% de acetonitrilo

o

	Eluyente A		Eluyente B

i.	De 85 a 98% de agua	ii.	De 0 a 10% de agua
ii.	De 2 a 10% de ácido acético	ii.	De 2 a 10% de ácido acético
iii.	De 0 a 5% de metanol	iii.	De 80 a 98% de metanol

Para trabajar en gradiente se prefiere una mezcla de disolventes que consta de:

	Eluyente A		Eluyente B

i.	92% de agua	i.	28% de agua
ii.	5% de ácido acético	ii.	5% de ácido acético
iii.	3% de acetonitrilo	iii.	67% de acetonitrilo

o

	Eluyente A		Eluyente B

i.	90% de agua	i.	5% de agua
ii.	5% de ácido acético	ii.	5% de ácido acético
iii.	5% de acetonitrilo	iii.	90% de acetonitrilo

La purificación se realiza preferentemente a una temperatura en la columna de 5 a 50ºC, siendo especialmente preferidas temperaturas de 15 a 35ºC y muy especialmente preferidas las de 20 a 30ºC. La presión en la columna debe estar entre 5 y 100 bar, preferentemente entre 20 y 80 bar y, muy preferentemente, entre 30 y 60 bar. En principio, como fase estacionaria se pueden admitir todos los materiales para purificación usuales para el especialista. Es especialmente adecuado un material para fase inversa. Como material para fase inversa se entienden rellenos de columna que descansan en materiales soporte como gel de sílice o un polímero orgánico. En el caso de geles de sílice, se pueden modificar las superficies hidrófilas con organosilanos. Para ello son adecuados, junto a otras, las modificaciones C-2, C-8 ó C-18. Es especialmente preferido el empleo de una fase RP-18 modificada como C-18, siendo especialmente preferidos Nucleosil® 300-7-C_{18} de la firma Macherey & Nagel o Purospher® RP 18 (10 \mum) de la firma Merck.

Como oligopéptidos se entienden en la presente solicitud péptidos con 5 a 25 aminoácidos. Se prefiere el intervalo de oligopéptidos con 8 a 12 aminoácidos. Muy preferiblemente se emplean oligopéptidos con 10 aminoácidos.

El método de cromatografía de líquidos antes descrito para salificar y purificar los oligopéptidos se puede realizar tanto por el método denominado de lecho móvil simulado como también mediante cromatografía cíclica.

Es extraordinariamente ventajoso el empleo del procedimiento de acuerdo con la invención en una síntesis para la obtención de los antagonistas de LHRH Cetrorelix (1) y Antarelix (2)

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2} \cdot 2CH_{3}COOH

\hskip3.4cm

1

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Lys (\varepsilon-isopropilo)-Pro-D-Ala-NH_{2} \cdot 2CH_{3}COOH

\hskip1.4cm

2

Se ha demostrado especialmente la eficacia en la síntesis de la introducción de grupos protectores t-butilo en la cadena lateral de serina y tirosina. Para la obtención del producto final deben nuevamente escindirse estos grupos protectores en condiciones ácidas (TFA o HCl). En la escisión de los grupos t-butilo con ácido clorhídrico, se forman manifiestamente menos subproductos que cuando se usa TFA.

El procedimiento optimizado de separación es adecuado para cromatografía de proceso y permite el empleo de columnas de HPLC preparativa con diámetros interiores de más de 30 cm y cantidades de inyección de más de 200 g por paso de cromatografía.

De esta manera, el presente procedimiento es causal para preparar ventajosamente y, por ello, económicamente, por ejemplo los oligopéptidos antes mencionados a escala de multikilogramos.

Las sustancias de partida para la invención aquí descrita se pueden obtener por métodos conocidos en sí por el especialista. Se hace referencia a tratados de la especialidad (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, tomos 15/1 y 15/2; M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag 1984).

Ejemplo 1 Obtención de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2} \cdot 2HCl (1a) (Hidrocloruro de Cetrorelix)

Se añaden 50 g (31,65 mmol) de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser (^{t}Bu)-Tyr(^{t}Bu)-D-Cit-LeuArg(HCl)-Pro-D-Ala-NH_{2}, agitando fuertemente, a 200 ml de ácido clorhídrico concentrado enfriado con hielo. Se agita durante aproximadamente 1 h a 0-5ºC, la mezcla de reacción se añade a una mezcla agitada de 0,75 l de n-butanol y 0,5 kg de hielo, se separan las fases después de añadir 120 ml de agua, se ajusta con sosa el pH de la fase orgánica a aproximadamente 2 y se evapora en vacío la solución butanólica. El residuo se pone en suspensión en 0,5 l de t-butil metil éter, se filtra por succión, se lava con 0,5 l de t-butil metil éter y se seca en vacío.

Producto de 1a: 49 g (103%; la sustancia contiene aprox. 4% en peso de NaCl). Pureza según HPLC 94,4% sobre superficie. (véase Fig. 6).

Ejemplo 2 Obtención de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2} \cdot 2TFA (1b) (trifluoroacetato de Cetrorelix)

Se disuelve en 10 ml de ácido trifluoroacético 1 g (0,633 mmol) de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser(^{t}Bu)-Tyr(^{t}Bu)-D-Cit-Leu Arg(HCl)-Pro-D-Ala-NH_{2}, se agita la solución durante 5 h y seguidamente se añade a 100 ml de diisopropil éter enfriado con hielo. El producto 1b se filtra por succión, se lava con diisopropil éter y se seca en vacío.

Producto de 1b: 1,05 g (100%). Pureza según HPLC 89,6% sobre superficie. (véase Fig. 7).

Ejemplo 3 Obtención de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Lys (\varepsilon-isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2}\cdot2HCl (2a) (Hidro- cloruro de Antarelix)

Se añaden a 400 ml de ácido clorhídrico concentrado enfriado con hielo, con fuerte agitación, 77,3 g (46,2 mmol) de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser(^{t}Bu)-Tyr(^{t}Bu)-D-Hcl-Leu-Lys (\varepsilon-Boc)(\varepsilon-isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2}. Después de 1 h aproximadamente se vierte la mezcla de reacción sobre una mezcla de 0,85 l de agua/0,85 kg de hielo, la solución acuosa se somete a extracción dos veces, cada vez con 0,9 l de n-butanol, se ajusta con solución acuosa saturada de bicarbonato sódico a aproximadamente 2 el pH de las fases butanólicas combinadas y se evapora la fase orgánica en vacío. El residuo se digiere con 2 l de t-butil metil éter, se filtra por succión, se lava con t-butil metil éter y se seca en vacío. Se obtienen 72 g de producto (104%; la sustancia contiene aprox. 2% en peso de NaCl y restos de butanol). Pureza según HPLC 94,0% (véase Fig. 8).

Ejemplo 4 Obtención de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Hcl-Leu-Lys (\varepsilon-isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2}\cdot 2TFA (2b) (Tri-fluoroacetato de Antarelix)

Se disuelve en 10 ml de ácido trifluoroacético 1 g (0,6 mmol) de Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser(^{t}Bu)-Tyr-(^{t}Bu)- D-Hcl-Leu-Lys (\varepsilonBoc) (\varepsilon-isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2}, se agita la solución durante aprox. 1,5 h y seguidamente se añade a 100 ml de diisopropil éter enfriado con hielo. Se succiona el producto 1b, se lava con diisopropil éter y se seca en vacío.

Producto de 1b: 1,01 g (100%). Pureza según HPLC 89,4% sobre superficie. (véase Fig. 9).

Ejemplo 5 Purificación preparativa de Cetrorelix a partir del producto en bruto de la síntesis clásica en solución (Ejemplo 1)

Se disuelven en 500 ml de ácido acético al 30% 18 g del producto en bruto de un procedimiento del Ejemplo 1 y, después de filtración (sobre filtro K-700 de Seitz), se aplican a la columna (longitud 250 mm, diámetro interior 100 mm). Como fase estacionaria se puede emplear alternativamente Nucleosil 300-7-C_{18} de la firma Macherey & Nagel o Purospher RP 18 (10 mm) de la firma Merck. La columna se acondiciona primeramente durante 20 minutos con una mezcla de disolventes de 95% de la fase móvil A (970 ml de agua muy pura + 50 ml de ácido acético al 100%) y 5% de la fase móvil B (700 ml de acetonitrilo + 300 ml de agua muy pura + 30 ml de acetonitrilo + 50 ml de ácido acético al 100%). Seguidamente se efectúa la cromatografía sobre la fase de Nucleosil según el siguiente programa de gradientes:

Tiempo (min)	Concentración de A	Concentración de B
	(% en volumen)	(% en volumen)
0	95	5
9	95	5
10	77	23
22	77	23
37	67	33
47	0	100
55	0	100

El caudal de eluyente es de 200 ml/min, formándose una presión en la columna de 38-60 bar según las condiciones de los gradientes.

Alternativamente, la cromatografía se realiza sobre el soporte Purospher según el siguiente programa de gradientes:

Tiempo (min)	Concentración de A	Concentración de B
	(% en volumen)	(% en volumen)
0	95	5
20	95	5
21	70	30
60	65	35
61	0	100
70	0	100

El caudal de eluyente en este caso es de 300 ml/min, formándose una presión en la columna de 35-50 bar según las condiciones de los gradientes.

La detección de los picos se realiza en la franja de radiación UV a 270 nm, efectuándose un fraccionamiento manual. Se separan del pico principal (pureza > 99,5%) flancos ascendentes y descendentes (pureza de aprox. 95%) que se reciclan. De las fracciones se elimina acetonitrilo hasta aprox. 1% en un evaporador rotatorio a aprox. 50ºC y en vacío de trompa de agua. Seguidamente se realiza la liofilización de los eluidos concentrados.

Análisis por HPLC del producto en bruto empleado

Representado en la Figura 1.

Especificación del producto en bruto

Pureza del péptido:	94,4%	\hskip-3mm sobre superficie
Contenido de cloruro:	6,2%

HPLC preparativa del producto en bruto de la síntesis de Cetrorelix sobre la fase Nucleosil

Representada en la Figura 2.

HPLC preparativa del producto en bruto de la síntesis de Cetrorelix sobre el soporte Purospher

Representada en la Figura 3.

Cromatograma de HPLC del producto final purificado

Representado en la Figura 4.

Especificación del producto final

Pureza del péptido:	99,75%
Contenido de cloruro:	220 ppm
Contenido de acetato:	6,5%

Ejemplo 6 Purificación preparativa de Antarelix a partir del producto en bruto de la síntesis clásica en solución

Se disuelven 15 g del producto en bruto en 500 ml de ácido acético al 30% y, después de filtrar (sobre filtro K-700 de Seitz), la solución se aplica a la columna (longitud 250 mm, diámetro interior 100 mm). Como fase estacionaria sirve Purospher RP 18 (10 mm) de la firma Merck. Se acondiciona la columna primeramente durante 20 minutos con una mezcla de disolventes de 95% de fase móvil A (970 ml de agua muy pura + 30 ml de acetonitrilo + 50 ml de ácido acético al 100%) y 5% de la fase móvil B (700 ml de acetonitrilo + 300 ml de agua muy pura + 50 ml de ácido acético al 100%). Seguidamente se realiza la cromatografía con el siguiente programa de gradientes:

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Tiempo (min)	Concentración de A	Concentración de B
	% en volumen	% en volumen
0	95	5
15	95	5
16	70	30
56	65	35
57	0	100
65	0	100

El caudal de eluyente es de 300 ml/min, con lo que, según las condiciones de los gradientes, se forma una presión en columna de 35-50 bar. La detección de picos se realiza en la región de la radiación UV a 270 nm, efectuándose un fraccionamiento manual. Se separan del pico principal (pureza > 99,5%) flancos ascendentes y descendentes (pureza de aprox. 95%) que se reciclan. De las fracciones se elimina en evaporador rotatorio, a aprox. 50ºC y vacío de trompa de agua, acetonitrilo hasta aprox. 1%. Seguidamente se efectúa la liofilización de los productos eluidos concentrados.

HPLC preparativa del producto de síntesis en bruto Antarelix sobre el soporte de Purospher

Representada en la Figura 5.

Especificación del producto final

Pureza del péptido:	99,39%
Contenido de cloruro:	< 200 ppm
Contenido de acetato:	7,5%

Ejemplo 7 Purificación preparativa de Cetrorelix en un sistema metanol/agua/ácido acético

Se disuelven 4 g del producto en bruto en 60 ml de ácido acético al 30% y, después de filtración (sobre papel de filtro K-700 de Seitz), se aplican a la columna (longitud 250 mm, diámetro interior 40 mm). Como fase estacionaria sirve Deltapak 300 \ring{A}, 15 mm, de la firma Millipore. La columna se acondiciona primeramente durante 20 minutos con fase móvil A (950 ml de agua muy pura + 50 ml de metanol + 60 ml de ácido acético al 100%). Seguidamente se realiza la cromatografía según el siguiente programa de gradientes (fase móvil B: 950 ml de metanol + 50 ml de agua muy pura + 60 ml de ácido acético al 100%):

Tiempo (min)	Concentración de A	Concentración de B
	% en volumen	% en volumen
0	100	0
10	100	0
11	70	30
40	30	70
41	0	100
50	0	100

El caudal del efluyente es de 60 ml/min, formándose según las condiciones del gradiente una presión en la columna de 20-30 bar. La detección de picos se realiza en la región de la radiación UV a 270 nm, efectuándose un fraccionamiento manual. Se separan del pico principal (pureza > 99,5%) flancos ascendentes y descendentes (pureza de aprox. 95%) que se reciclan. De las fracciones se elimina en evaporador rotatorio, a aprox. 50ºC y vacío de trompa de agua, el acetonitrilo hasta aprox. 1%. Seguidamente se efectúa la liofilización de los productos eluidos concentrados.

Especificación del producto final

Pureza del péptido:	99,60%
Contenido de cloruro:	220 ppm
Contenido de acetato:	7,1%

Claims

1. Procedimiento para la salificación y purificación de oligopéptidos, caracterizado porque el procedimiento se realiza en una etapa mediante cromatografía de líquidos con eluyentes que contienen acetato para la obtención del acetato de oligopéptido, empleándose para la purificación los oligopéptidos como sus sales hidrocloruro.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los precursores vías protegidos de los oligopéptidos se desprotegen con ácido clorhídrico concentrado.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la sal cloruro pura del oligopéptido se obtiene mediante liofilización de su solución ácida clorhídrica.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la sal cloruro del oligopéptido se emplea como su solución acuosa ácida clorhídrica concentrada.

5. Procedimiento según las reividicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sal cloruro pura se emplea después de disolución en el medio eluyente de la cromatografía de líquidos o después de disolución en ácido acético.

6. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque se trabaja a una temperatura de -25 a 30ºC.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como cromatografía de líquidos se utiliza la cromatografía de líquidos a alta presión.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque se trabaja con una mezcla de disolventes de la composición siguiente:

o

Eluyente A Eluyente B i. De 85 a 98% de agua i. De 0 a 10% de agua ii. De 2 a 10% de ácido acético ii. De 2 a 10% de ácido acético iii. De 0 a 5% de metanol iii. De 80 a 98% de metanol

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque se trabaja con una mezcla de disolventes de la composición siguiente:

o

10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque se trabaja a una temperatura de 5 a 50ºC.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque se trabaja a una presión de 5 a 100 bar.

12. Procedimiento según las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque como fase estacionaria se usa material de columna de fase inversa.

\newpage

13. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como oligopéptido se emplea un péptido de como mínimo cinco y como máximo veinticinco aminoácidos.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque como oligopéptido se emplea un péptido de ocho a doce aminoácidos.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque como oligopéptido se emplea un péptido de diez aminoácidos.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de líquidos se realiza por el método de lecho móvil simulado o mediante cromatografía cíclica.