JPS6168499A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産１」Ｊｌｔ肚盆■一 本発明は鎮痛剤、催眠剤等の医薬としての使用が期待で
きる新規のペプチドに関する。

従迷Ｊ目支五− 牛乳力ゼインペプトンからはオピオイド活性（モルヒネ
様活性）のあるペプチド、β−カシモルフイン７が単離
されている（Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ’ｓＺ　、　Ｐ
　ｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、３６０．１２１１お
よび１２１）、１９７９年参照）が、本発明におけるよ
うな、オピオイド活性を有するペプチドに関する報告は
見当たらない。

明が　　しようとする　　ヴ 鎮痛剤、催眠剤等の医薬として使用可能なペプチドの開
発およびその製造が期待されている。

σを　　　るための 本発明者は、一般式 ％式％ るペプチド、そのアミドおよびエステル誘導体を新規に
合成することに成功し、かつこれら新規ペプチドがオピ
オイド活性を有し、前記医薬への使用が期待できること
を見出し、この発見に基づいて本発明を完成するに到っ
た。

本発明の新規ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端および側鎖官
能基はペプチド合成に一般に使用されている保護基で保
護されていてもよい。また、構成するアミノ酸はＬ一体
、Ｄ一体のいずれであってもよい。

本発明の新規ペプチドは後述の実施例に基づき、さらに
慣用のペプチド合成法を利用して（例えば泉屋ら者、合
成化学シリーズ「ペプチド合成」丸善（株）発行、昭和
５０年参照。）製造することができる。保護基による保
護方法あるいはその脱離方法についても同様である。

本発明の新規ペプチドのうちアミド誘導体は慣用法例え
ばＣ末端となるアミノ酸の代わりにそのアミドを使用し
て同様にペプチド合成を行う方法あるいは対応するペプ
チドエステルをアンモニアで処理してアミド化する方法
によって製造することができる。

本発明の新規ペプチドを有効成分として鎮痛剤あるいは
催眠剤として使用するときには、ｉｎ形または製薬上容
認される無毒性の塩および酸付加塩とすることができる
。

本発明においで、製薬上容認しうる無毒性塩には、一般
に使用されている有機および無機の酸付加塩、例えば塩
酸、硫酸、スルホン酸、クエン酸、リン酸、安息香酸に
よる付加塩を採用すればよい。

また、一方、Ｎａ、になどのアルカリ金属塩やアンモニ
ウム塩が含まれる。

本発明の新規ペプチドはヒトを包含するは乳動物に対す
る鎮痛剤あるいは催眠剤として有効であり、例えば胆石
仙痛、腎石仙痛、癌などの痛み、術後側における痛みな
ど種々の苦痛の除去のみならず、その催眠作用ｌこより
催眠薬などとしても有効である。

投与に際しては、経口投与として錠剤、カプセル剤また
はエリキシル剤のような調剤でまたは非経口投与として
無菌溶剤液または懸濁液剤で処方することもできる。

また、生理学的に認められるベクヒル、担体、賦形剤、
結合剤、防腐剤、安定剤、香味剤などとともに一般に認
められた製剤実施に要求される単位用形態で混和、投与
することももちろんできる。

これらの組成物または製剤における活性物質の使用量は
指示された範囲の適当な用量が得られるようにするもの
である。

有効成分の投与量は患者の病気の重さ、体重および年令
あるいはその他の要因を考慮して決められる。

本明細書における略号は次の如（である。

Ｔ　ｙｒ：チロシン、Ｐｒｏニブロリン、Ｐｈｅ：フェ
ニル７？ニン、Ｖ　ａｌ：バリン、Ｇｌｕ：グルタミン
酸、Ｉ　ｌｅ：イソロイシン、Ｂｏａ：ｔ−ブチルオキ
シカルボニル、０Ｂｚｌ：ペンシルオキシ、 Ｃｌ２−Ｂｚｌ：　２，８−１９ｃｌｋペン’）７、Ｔ
ＦＡ：）リフルオロ酢酸、ＯＤＳ：オクタデシルシラン
、ＨＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’　−２−エタンスルレフオン酸Ｘ厘上 以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例Ｉ　　Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ
−Ｐｒ。

お上りＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ　−１１ｅ−Ｐｒｏの合成 １、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏのクロロメチル樹脂への導入２
ｇのＢ　ｏｃ−Ｌ　−Ｐ　ｒｏに１２論２のエタノール
および４ｍｌの水を加え溶解した後、重炭酸セシウム水
溶液で中和、乾固し、ゼシウム塩を得た。これを８５ｍ
１のジメチルホルムアミドに溶解し７．２ｇのクロロメ
チルポリスチレン樹脂（１，２８＋ｅｑ、　ＣＩ／　ｇ
）を加えて５０℃にて一夜攪袢した。反応終了後樹脂を
３００ｍＮのジメチルホルムアミド、３００ｍ、ｉ！の
９０％ジメチルホルムアミド、３００ｍ１のジメチルホ
ルムアミドお上び６００Ｊ！のエタノールにて順次洗浄
し、Ｂｏａ−Ｌ−Ｐｒｏ　　ｔＭ脂（０，８６ｍｍｏｌ
Ｐｒｏ／ｇ）を得た。

２、Ｂｏａ−Ｌ−Ｐｒｏ樹脂上でのペプチド鎖の延長上
記Ｂｏａ−Ｌ−Ｐｒｏ樹脂１．６ｇを４０ｍ１の脱Ｂｏ
ａ化剤（５５％ＴＦＡ、５％アニソール、４０％塩化メ
チレン混液、各ｖ／ｖ％）中で室温にて３０分しんとう
し、Ｂｏａ基を除去した後６０ｍ１の３３％ジオキサン
、次いで６７％塩化メチレン混液にて洗浄し、２０ｍ１
の１０％トリエチルアミン９０％塩化メチレン混液にて
中和、１００ｄの塩化メチレンにて洗浄した。Ｐｒｏ樹
脂の１０倍当量に相当する１３．８−ｍｏｌのジシクロ
へキシルカルボジイミドを１３．８ｍｍｏｌのＢｏｃ−
Ｌ−Ｉｌｅを１６ｍ１の塩化メチレンに溶解し、Ｐｒｏ
樹脂に加え室温にて一夜しんとうした。

反応終了後樹脂を塩化メチレンにて洗浄し、ニンヒドリ
ン反応にて未反応のアミ７基がないことを確認し、以降
同様にＢｏａ−Ｌ−Ｐｒｏ、　Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇ　１ｕ（
ＯＢｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｌ　−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｌ　−Ｐ
ｈｅＳ　Ｂｏａ−Ｌ−Ｐｒｏ、Ｂｏａ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｃ
ｌｚ−Ｂ　ｚｌ）をこの順序で結合させ、オクタペプチ
ド−樹脂を得た。

また、別にＢｏａ−Ｌ−Ｐｒｏ樹脂に、Ｂｏａ−Ｌ−Ｇ
　１ｕ（ＯＢｚｌ）、Ｂｏａ−Ｌ−Ｖａｌ、Ｂｏａ−Ｌ
−Ｐｈｅ。

Ｂｏａ−Ｌ−Ｐｒｏ　　Ｂｏａ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｃ１，−
Ｂｚｌ）をこの順序で結合させ、ヘキサペプチド樹脂を
得た。

３、樹脂からのペプチドの切断および保護基の除去 上記オクタペプチド樹脂に１．２５ｇに１，１ａ＋Ｎの
ｍ　−クレゾールシト１０＠１の１Ｍトリ７ルオロメタ
ンスル７オン 液を加え０℃の３０分間、次いで室温にて、２時間反応
させた後、１９０＋Ｊ！のエーテルを加え遠心を行った
．得られた沈澱に上記同様の操作を加えた後吸引濾過し
、濾液を得た．これに１９０ｍＮのエーテルを加え、ペ
プチドを沈澱させ回収し、水に溶解、アンモニアにて中
和の後、凍結乾燥した。ヘキサペプチドの場合も同様の
処理を行った。

４、ペプチドの精製 上記の如く得たペプチドを０．１Ｍ酢酸アンモニアにて
平衡化したバイオゲルＰ−２カラムによるゲル濾過を行
い最も早く溶出される画分を得た。

この両分をＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　５　Ｃ　
＋ｓ）による逆相クロマトグラフィーにかけ０．１％Ｔ
ＦＡを含むアセトニトリルグラジェントで溶出した。オ
クタペプチド、ヘキサペプチドいづれの場合も２８０ｎ
ｍに吸収を持った一個の主ピークが得られ、それぞれ２
９％および２６．５％アセトニトリルで溶出された。こ
れらのピークを濃縮遠心にて乾燥しアミノ酸分析を行っ
たところ、それぞれ予測されたアミノ酸組成を示した。

収ｔ：オクタベプチド３００ｍｇ、ヘキサペプチド２５
０ｍｇ。

５、ヘキサペプチドのカルボキシペプチダーゼ処理によ
るペンタペプチドの調製 上記の如く得たヘキサペプチド５０ｍｇを１０ａ＋，１
１の１００ｍＭ　Ｈ　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し０．５ＢのカルボキシペプチダーゼＹ（オ
リエンタル酵母社製、１３０ｕｎｉｔ／　ｍｇ）を加え
５分間後に１０　０　”Ｃにてグラジェントで展開した
．２４％アセト１トリルにより溶出されるピークはＴ　
ｙｒ：Ｐ　ｒｏ：　Ｐ　ｈｅ：　Ｖ　ａｌ：Ｇｌｕ＝　
１　：１　：１　：１　：１というアミノ酸組成を有し
ており目的のペンタペプチドであった。

６、物理化学的性質 Ｔ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ比施光度［α
］ｔ，＝ー４９，３°（Ｃ＝０．３、メタノール）Ｕ　
Ｖ　Ａ　ａ＋ａｘ＝２７７、５ｎｍｓ　　Ｅｘ”ｙ．ｓ
ｎｍ＝２０．２（メタノール） アミノ酸組成（６Ｎ　Ｈ　Ｃ　１，１１０℃２４時間加
水分解）二Ｇ　ｌｕ（１）０．９８、Ｐｒｏ（２）２．
０４、Ｖ　ａｌ（１）１．００、Ｔｙｒ（１）０，９フ
、　Ｐｈｅ（１）１．０３ＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓ
ｉｌ　５　Ｃ＋ｓ，４，６Ｘ１５０ｍｍ，牛丼化学製）
からの溶出： ０、１％ＴＦＡを含む０〜５０％アセトニトリル直線グ
ラシュエン）１５０ｍ，ｌ！に於いて２９％アセトニト
リルで溶出 Ｔ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｔ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒ。

比施光度［ｆｆ　］。＝　−６４．０”　（Ｃ　＝０．
３、メタノール）ＵＶλ−ａｘ＝２７７、５ｎｍ，　　
］１１ｇ′４７．１ｎｍ＝１７．．６（メタノール） アミノ酸組成（上記同一条件で加水分解）Ｇ　ｌｕ（１
）０，９９、Ｐ　ｒｏ（２）２．０２、Ｖ　ａｌ（１）
１，００１Ｔ　ｙｒ（１）０，９９、Ｐ　ｈｅ（１）１
．０２ＯＤＳカラムからの溶出： 上記同一条件下に於いて３１％アセトニトリルで溶出 Ｔ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−　
Ｉ　ｌｅ−Ｐｒ。

比施光度［ａ　］ｌ）＝−７２．１°（Ｃ＝０．３、メ
タノール）ＵＶλ−ａｘ−２７７、５ｎｍｑ　　Ｅｚ？
ｔ．ｓ＝１３，フ（メタノール）アミノ酸組成（上記同
一条件下で加水分解）Ｇ　ｌｕ（１）０．９８、Ｐ　ｒ
ｏ（３）２，９５、Ｖ　ａｌ（１）１．００、Ｉ　ｌｅ
（１）１，０２、Ｔ　ｙｒ（１）０，９８、Ｐ　ｈｅ（
１）１．０２ＯＤＳカラムからの溶出： 上記同一条件下に於いて３５％アセトニトリルで溶出 実施例２　ラット脳オビオイドレセプターアッセイの測
定 （１）実験方法 前記実施例で製造したペプチドのオピオイド活性をスナ
イグー（Ｓ　ｎｙｄｅｒ）らの方法（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ
　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ、、７０，２２４３（１
９７３）参照。）に準じて測定した。

雄ウィスター系ラット（１００〜２００ｇ）の大脳（１
，１〜１．３ｇ）を摘出し、これをＰｏｔｔｅｒホモノ
ナイザーを使用して、　１０ｍ、ｌ！の５０ｍＭ）リス
ー塩ＲｖＬ衝液（ｐＨ７，４）Ｏ’Ｃ下ホモジナイズし
た。これを同一緩衝液で層重量の１００倍に希釈した後
、遠心（１，ＯＯＯｒｐｍ、５分、０℃）して沈澱を除
去した。

得られた溶液１．７ｍｌに試料あるいは塩酸モルヒネ（
武田薬品工業社製）を加えて、３５℃で５分間インキュ
ベートした。続いて、［３Ｈ］−ナロクソン（ＮＥＮ、
３７，７Ｃｉ／　＋１１０１０１）で最終濃度１ｎＭ（
３４，０００ｃ、ｐ、ｍ、）となるように加え、再び３
５℃で１５５分間インキュベートた。

グラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ　　Ｇ　Ｆ　／　Ｂ
　ｙ２．４ｃｍ）を使用して減圧濾過を行い、レセプタ
ーの存在する膜成分をフィルター上に保持し、フィルタ
ーを４ｍｌの緩衝液で４回手早く洗浄した（所有時間３
０秒）、このフィルターを計画ヴアイフルに入れ、ｌｌ
１１１の１０％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を加
えて３０分以上放置した。その後、１０−のＰＳＣ（Ａ
ｍａｒｓｈａｍ社製）を加えてよく振とうし、液体シン
チレーションカウンターで計測した。ただし、大過剰の
非放射性ナロクソン存在下でらみられる結合量を差し引
いたものを特異的結合量とした。試料の活性は［３Ｈ１
−ナロクソンの特異的結合を５０％阻害するに必要な試
料の温度（Ｉ　Ｃｓ。）で表示した。

（２）結果 −・　　　　　　　　　　ＩＣ，ｏμＭペンタペプチド
　　　　　　　　　　６００ヘキサペプチド　　　　　
　　　　　５４０オクタペプチド　　　　　　　　　１
３００以上から明らかな如く、本発明の新規ペプチドは
温和なモルヒネ様鎮痛活性を有し、医薬品として期待で
きる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）一般式 Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−（Ｒ）ｎで
   示されるペプチド、そのアミドおよびエステル誘導体。 ただし、式中、ｎは０または１を、ＲはＰｒｏまたはＰ
   ｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを、それぞれ表す。